АНТИСМЫСЛОВЫЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ К АЛЬФА-СИНУКЛЕИНУ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2022 года по МПК C12N15/113 C07K14/47 A61K48/00 A61P25/16 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее раскрытие относится к антисмысловым олигомерным соединениям (АСО), которые нацелены на транскрипт альфа-синуклеина (SNCA) в клетке, приводя к пониженной экспрессии белка альфа-синуклеина (SNCA). Уменьшение экспрессии белка SNCA может быть полезным для целого ряда медицинских расстройств, таких как множественная системная атрофия, болезнь Паркинсона, деменция при болезни Паркинсона (PDD) и деменция с тельцами Леви.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Альфа-синуклеин (SNCA) - член семейства белков синуклеинов - представляет собой маленький растворимый белок, который экспрессируется, главным образом, в пределах нервных тканей. См. Marques О. et al., Cell Death Dis. 19: е350 (2012). Он экспрессируется во многих типах клеток, но преимущественно локализуется в пределах пресинаптических окончаний нейронов. В то время как точная функция все еще должна быть полностью выяснена, предполагали, что SNCA играет важную роль в регуляции синаптической передачи. Например, SNCA функционирует в качестве молекулярного шаперона при образовании комплексов SNARE, которые опосредуют докинг синаптических везикул с предсинаптическими мембранами нейронов. SNCA также может взаимодействовать с другими белками, подобными ассоциированному с микротрубочками белку тау, что помогает стабилизировать микротрубочки и регулировать транспорт везикул.

Из-за роли SNCA в регуляции синаптической передачи, изменения экспрессии и/или функции SNCA могут нарушать критически важные биологические процессы. Полагали, что такие нарушения способствуют α-синуклеинопатиям, которые представляют собой нейродегенеративные заболевания, отличающиеся ненормальным накоплением агрегатов белка SNCA в пределах мозга. Соответственно, нерастворимые включения неправильно свернутого, агрегированного и фосфорилированного белка SNCA являются патологическим признаком таких заболеваний, как болезнь Паркинсона (PD), деменция при болезни Паркинсона (PDD), деменция с тельцами Леви (DLB) и множественная системная атрофия (MSA). См. Galvin JE et al., Archives of Neurology 58: 186-190 (2001); и Valera E et al., J Neurochem 139 Suppl 1: 346-352 (Oct. 2016).

α-Синуклеинопатии, такие как болезнь Паркинсона, являются широкораспространенными прогрессирующими нейродегенеративными расстройствами мозга, особенно среди пожилых. См. Recchia A et al., FASEB J. 18: 617-26 (2004). Оценивается, что приблизительно от семи до десяти миллионов человек в мире живут с такими расстройствами с примерно 60000 новых случаев каждый год в одних Соединенных Штатах. Затраты на лекарственные средства для индивидуального человека легко могут превышать 2500$ в год, а терапевтическая хирургия может стоить вплоть до 100000$ на пациента. Следовательно, очень нужны более надежные и экономически эффективные возможности лечения.

В US 2008/0003570 описаны трансляционные энхансерные элементы на альфа-синуклеине и способы идентификации соединений, которые модулируют альфа-синуклеин.

В WO 2012/068405 раскрыты модифицированные антисмысловые олигонуклеотиды, нацеленные на альфа-синуклеин.

Во всех из WO 2005/004794, WO 2005/045034, WO 2006/039253, WO 2007/135426, US 2008/0139799, WO 2008/109509, WO 2009/079399, WO 2012/027713 описываются молекулы нуклеиновых кислот, действующие через комплекс RISC в цитоплазме, такие как молекулы миРНК (малые интерферирующие нуклеиновые кислоты). Такие молекулы не способны к нацеливанию на интроны в транскрипте SNCA.

В WO 2011/041897, WO 2011/131693 и WO 2014/064257 описываются конъюгаты молекул нуклеиновых кислот для доставки в ЦНС (центральная нервная система) для модуляции в ЦНС молекул-мишеней, причем одной из них является альфа-синуклеин.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее раскрытие направлено на антисмысловой олигонуклеотид (АСО), содержащий непрерывную нуклеотидную последовательность из 10-30 нуклеотидов в длину, где данная непрерывная нуклеотидная последовательность является по меньшей мере на 90% комплементарной области нуклеиновой кислоты интрона в пределах транскрипта альфа-синуклеина (SNCA). В некоторых воплощениях транскрипт SNCA содержит SEQ ID NO: 1, и АСО по настоящему раскрытию способен ингибировать экспрессию человеческого транскрипта SNCA в клетке, которая экспрессирует человеческий транскрипт SNCA.

В некоторых воплощениях область интрона выбрана из интрона 1, соответствующего нуклеотидам 6336-7604 SEQ ID NO: 1; интрона 2, соответствующего нуклеотидам 7751-15112 SEQ ID NO: 1; интрона 3, соответствующего нуклеотидам 15155-20908 SEQ ID NO: 1; или интрона 4, соответствующего нуклеотидам 21052-114019 SEQ ID NO: 1.

В других воплощениях антисмысловые олигонуклеотиды (АСО) содержат непрерывную нуклеотидную последовательность из 10-30 нуклеотидов в длину, где данная непрерывная нуклеотидная последовательность является по меньшей мере на 90% комплементарной последовательности нуклеиновой кислоты в пределах транскрипта альфа-синуклеина (SNCA), где данная последовательность нуклеиновой кислоты выбрана из группы, состоящей из: i) нуклеотидов 21052-29654 SEQ ID NO: 1; ii) нуклеотидов 30931-33938 SEQ ID NO: 1; iii) нуклеотидов 44640-44861 SEQ ID NO: 1; iv) нуклеотидов 47924-58752 SEQ ID NO: 1; v) нуклеотидов 4942-5343 SEQ ID NO: 1; vi) нуклеотидов 6336-7041 SEQ ID NO: 1; vii) нуклеотидов 7329-7600 SEQ ID NO: 1; viii) нуклеотидов 7751-7783 SEQ ID NO: 1; ix) нуклеотидов 8277-8501 SEQ ID NO: 1; x) нуклеотидов 9034-9526 SEQ ID NO: 1; xi) нуклеотидов 9982-14279 SEQ ID NO: 1; xii) нуклеотидов 15204-19041 SEQ ID NO: 1; xiii) нуклеотидов 20351-20908 SEQ ID NO: 1; xiv) нуклеотидов 34932-37077 SEQ ID NO: 1; xv) нуклеотидов 38081-42869 SEQ ID NO: 1; xvi) нуклеотидов 38081-38303 SEQ ID NO: 1; xvii) нуклеотидов 40218-42869 SEQ ID NO: 1; xvii) нуклеотидов 46173-46920 SEQ ID NO: 1; xix) нуклеотидов 60678-60905 SEQ ID NO: 1; xx) нуклеотидов 62066-62397 SEQ ID NO: 1; xxi) нуклеотидов 67759-71625 SEQ ID NO: 1; xxii) нуклеотидов 72926-86991 SEQ ID NO: 1; xxiii) нуклеотидов 88168-93783 SEQ ID NO: 1; xxiv) нуклеотидов 94976-102573 SEQ ID NO: 1; xxv) нуклеотидов 104920-107438 SEQ ID NO: 1; xxvi) нуклеотидов 106378-106755 SEQ ID NO: 1; xxvii) нуклеотидов 106700-106755 SEQ ID NO: 1; xxviii) нуклеотидов 108948-114019 SEQ ID NO: 1 и xxix) нуклеотидов 114292-116636 SEQ ID NO: 1.

В некоторых воплощениях непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 1302 или SEQ ID NO: 1309-1353.

В некоторых воплощениях непрерывная нуклеотидная последовательность содержит по меньшей мере один нуклеотидный аналог. В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид представляет собой гэпмер. Данный гэпмер может состоять из формулы 5'-А-В-С-3', в которой (i) область В представляет собой непрерывную последовательность из по меньшей мере 6 звеньев ДНК, которые способны рекрутировать РНКазу; (ii) область А представляет собой последовательность первого крыла из 1-10 нуклеотидов, где данная последовательность первого крыла содержит один или более чем один нуклеотидный аналог и, возможно, одно или более чем одно звено ДНК, и где по меньшей мере один из нуклеотидных аналогов расположен на 3'-конце А; и (iii) область С представляет собой последовательность второго крыла из 1-10 нуклеотидов, где данная последовательность второго крыла содержит один или более чем один нуклеотидный аналог и, возможно, одно или более чем одно звено ДНК, и где по меньшей мере один из нуклеотидных аналогов расположен на 5'-конце С.

В некоторых воплощениях нуклеотидный аналог или аналоги представляют собой высокоаффинные аналоги, такие как нуклеозиды, модифицированные 2'-сахаром, выбранные из группы, состоящей из запертой нуклеиновой кислоты (LNA); 2'-O-алкил-РНК; 2'-амино-ДНК; 2'-фтор-ДНК; арабинонуклеиновой кислоты (ANA); 2'-фтор-АМА, гекситольной нуклеиновой кислоты (HNA), интеркалирущей нуклеиновой кислоты (INA), затрудненного этилнуклеозида (cEt), 2'-O-метилнуклеиновой кислоты (2'-ОМе), 2'-O-метоксиэтилнуклеиновой кислоты (2'-МОЕ) и их любой комбинации. В некоторых воплощениях нуклеотидный аналог или аналоги содержат бициклический сахар. В некоторых воплощениях данный бициклический сахар содержит cEt, 2',4'-затрудненный-2'-O-метоксиэтил (сМОЕ), LNA, α-L-LNA, β-D-LNA, 2'-O,4'-С-этилен-мостиковые нуклеиновые кислоты (ENA), амино-LNA, окси-LNA или тио-LNA. В некоторых воплощениях нуклеотидный аналог или аналоги содержит LNA.

В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид имеет переносимость in vivo, меньшую чем или равную общему баллу 4, где общий балл представляет собой сумму единичных баллов пяти категорий, которыми являются 1) гиперактивность; 2) пониженная активность и активация; 3) моторная дисфункция и/или атаксия; 4) ненормальное положение и дыхание; и 5) тремор и/или судороги, и где единичный балл для каждой категории измеряется по шкале 0-4. В некоторых воплощениях переносимость in vivo меньше чем или равна общему баллу 3, общему баллу 2, общему баллу 1 или общему баллу 0.

В некоторых воплощениях нуклеотидная последовательность антисмысловых олигонуклеотидов содержит, по существу состоит или состоит из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 1302 или SEQ ID NO: 1309-1353, с конструкцией, выбранной из группы, состоящей из конструкций на Фиг. 1А-1С, где заглавная буква представляет собой нуклеозид с модифицированным сахаром, и строчная буква представляет собой ДНК. В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или его непрерывная нуклеотидная последовательность имеет химическую структуру, выбранную из группы, состоящей из ASO-008387; ASO-008388; ASO-008501; ASO-008502; ASO-008529; ASO-008530; ASO-008531; ASO-008532; ASO-008533; ASO-008534; ASO-008535; ASO-008536; ASO-008537; ASO-008543; ASO-008545; ASO-008584; ASO-008226 и ASO-008261.

Также в данном документе предложена фармацевтическая композиция, содержащая антисмысловой олигонуклеотид или его конъюгат, как раскрыто в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель.

Согласно настоящему раскрытию дополнительно предложен набор, содержащий антисмысловой олигонуклеотид, его конъюгат или композицию, как раскрыто в данном документе.

В данном документе предложен способ лечения синуклеинопатии у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение эффективного количества антисмыслового олигонуклеотида, его конъюгата или композиции по настоящему раскрытию. В некоторых воплощениях синуклеинопатия выбрана из группы, состоящей из болезни Паркинсона, деменции при болезни Паркинсона (PDD), множественной системной атрофии, деменции с тельцами Леви и их любых комбинаций.

В данном документе также предложено применение антисмыслового олигонуклеотида, его конъюгата или композиции по настоящему раскрытию для изготовления лекарственного средства. Согласно настоящему раскрытию также предложено применение антисмыслового олигонуклеотида, его конъюгата или композиции для изготовления лекарственного средства для лечения синуклеинопатии у субъекта, нуждающегося в этом. В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид, его конъюгат или композиция по настоящему раскрытию предназначены для применения в терапии синуклеинопатии у субъекта, нуждающегося в этом. В других воплощениях антисмысловой олигонуклеотид, его конъюгат или композиция по настоящему раскрытию служат для применения в терапии.

В некоторых воплощениях субъектом является человек. В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид, его конъюгат или композиции вводятся перорально, парентерально, подоболочечно, интрацеребровентрикулярно, легочно, местно или интравентрикулярно.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг. 1А-1С показаны типичные ASO, нацеленные на область пре-мРНК SNCA. На ФИГ. 1А приведены типичные ASO, которые нацелены на мРНК SNCA дикого типа (SEQ ID NO: 2). На ФИГ. 1 В приведены типичные ASO, которые нацелены на вариант мРНК SNCA («вариант 4»/SEQ ID NO: 5; или «вариант 2»/SEQ ID NO: 3). На ФИГ. 1С приведены типичные ASO, которые нацелены на другой вариант мРНК SNCA («вариант 3»/SEQ ID NO: 4). В каждом столбце ФИГ. 1А-1С показан идентификационный номер последовательности (SEQ ID No.), предназначенный только для данной последовательности, целевые положения начала и конца на последовательности пре-мРНК SNCA, целевые положения начала и конца на последовательности мРНК SNCA, номер конструкции (DES No.), последовательность ASO с конструкцией, номер ASO (ASO No.) и последовательность ASO с химической структурой. В данных графических материалах аннотация химии ASO является следующей: бета-D-окси нуклеотиды LNA обозначаются ОхуВ, где В обозначает такое нуклеотидное основание, как тимин (Т), уридин (U), цитозин (С), 5-метилцитозин (МС), аденин (А) или гуанин (G), и, таким образом, включает ОхуА, ОхуТ, ОхуМС, ОхуС и OxyG. Нуклеотиды ДНК обозначаются DNAb, где строчная b обозначает такое нуклеотидное основание, как тимин (Т), уридин (U), цитозин (С), 5-метилцитозин (Мс), аденин (А) или гуанин (G), и, таким образом, включает DNAa, DNAt, DNA и DNAg. Буква М перед С или с указывает 5-метилцитозин. Буква s представляет собой фосфоротиоатную межнуклеотидную связь.

На Фиг. 2 показаны ASO, нацеленные на пре-мРНК SNCA, с типичной модификацией конструкции крыла. В каждом столбце ФИГ. 2 показан идентификационный номер последовательности (SEQ ID No.), предназначенный только для данной последовательности, целевые положения начала и конца на последовательности пре-мРНК SNCA, номер конструкции (DES No.), последовательность ASO с конструкцией, номер ASO (ASO No.) и последовательность ASO с идентифицированными химической структурой и модификацией конструкции крыла. DES-287033, DES-287041, DES-287053, DES-287965, DES-288902, DES-288903, DES-288905, DES-290315 и DES-292378 демонстрируют разные возможные конструкции ASO для SEQ ID NO: 1467. DES-286762, DES-286785 и DES-286783 демонстрируют разные возможные конструкции ASO для SEQ ID NO: 1764. Для конструкций ASO заглавные буквы показывают нуклеотидные аналоги (например, LNA или 2'-O-Метил (ОМе)), и строчные буквы показывают ДНК. Заглавные буквы с подчеркиваниями или без указывают то, что две данные буквы могут представлять собой разные нуклеотидные аналоги, например, LNA или 2'-O-Метил. Например, подчеркнутые заглавные буквы могут представлять собой 2'-O-метил, тогда как заглавные буквы без подчеркивания представляют собой LNA. В ASO в столбце с химической структурой ОМе представляет собой 2'-O-метилнуклеотид, L представляет собой LNA, D представляет собой ДНК, и числа с последующими L или D означают число LNA или ДНК.

На Фиг. 3 показан относительный уровень экспрессии мРНК SNCA (как процентная доля от контроля в виде носителя) у яванских макаков после введения ASO-003179. Животные получали контроль в виде носителя (кружок), 8 мг ASO-003179 (квадрат) или 16 мг ASO-003179 (треугольник) посредством ICV (интрацеребровентрикулярной - внутрь желудочков головного мозга) инъекции. Животных затем умерщвляли в 2 недели после дозирования, и уровни экспрессии мРНК SNCA оценивали в следующих тканях: медулла (верхняя левая панель), дорсальный стриатум (верхняя средняя панель), варолиев мост (верхняя правая панель), мозжечок (нижняя левая панель), поясничный отдел спинного мозга (нижняя средняя панель) и лобная кора (нижняя правая панель). Показаны и данные для индивидуальных животных, и среднее. Горизонтальная линия маркирует эталонное значение 100% (т.е. значение, при котором экспрессия мРНК SNCA была бы эквивалентной уровню экспрессии, наблюдаемому в группе контроля в виде носителя).

На Фиг. 4 показано влияние ASO-003092 на уровень экспрессии мРНК SNCA в тканях мозга яванских макаков. Животным дозировали либо 4 мг (квадрат), либо 8 мг (треугольник) ASO-003092, и затем уровень экспрессии мРНК SNCA в разных тканях мозга оценивали в 2 недели после дозирования. Животных, получающих контроль в виде носителя, использовали в качестве контролей (кружок). Уровень экспрессии мРНК SNCA оценивали в следующих тканях: медулла (верхняя левая панель), дорсальный стриатум (верхняя средняя панель), варолиев мост (верхняя правая панель), мозжечок (нижняя левая панель), поясничный отдел спинного мозга (нижняя средняя панель) и лобная кора (нижняя правая панель). Уровни экспрессии мРНК SNCA нормировали к GAPDH (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа) и затем демонстрировали в виде процентной доли от контроля в виде носителя. Показаны и данные для индивидуальных животных, и среднее. Горизонтальная линия маркирует эталонное значение 100% (т.е. значение, при котором экспрессия мРНК SNCA была бы эквивалентной уровню экспрессии, наблюдаемому в группе контроля в виде носителя).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I Определения

Следует понимать то, что термин «элемент» в единственном числе относится к одному или более чем одному данному элементу; например, понятно то, что «нуклеотидная последовательность» представляет одну или более чем одну нуклеотидную последовательность. Термины «один», «один или более чем один» и «по меньшей мере один», как таковые, можно использовать в данном документе взаимозаменяемо.

Кроме того, термин «и/или» при его использовании в данном документе следует принимать как конкретное раскрытие каждой из двух определенных характеристик или компонентов с другим или без него. Таким образом, подразумевается то, что термин «и/или» в том виде, в котором он используется во фразе, такой как «А и/или В», включает «А и В», «А или В», «А» (один) и «В» (один). Подобным образом, подразумевается то, что термин «и/или» в том виде, в котором он используется в такой фразе, как «А, В и/или С», охватывает каждый из следующих аспектов: А, В и С; А, В или С; А или С; А или В; В или С; А и С; А и В; В и С; А (один); В (один) и С (один).

Понятно то, что во всех случаях, если аспекты описываются в данном документе формулировкой «содержащий», также предлагаются в иных отношениях аналогичные аспекты, описанные в терминах «состоящий из» и/ил и «по существу состоящий из».

Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое же значение, которое обычно понятно обычному специалисту в области, к которой относится данное раскрытие. Например, the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2^nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3^rd ed., 1999, Academic Press и the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press дают специалисту общий словарь многих терминов, используемых в данном раскрытии.

Единицы, префиксы и символы обозначаются в их принятой International de Unites (SI) форме. Числовые интервалы включают числа, ограничивающие данный интервал. Если не указано иное, нуклеотидные последовательности пишутся слева направо в ориентации от 5' к 3'. Аминокислотные последовательности пишутся слева направо в ориентации от амино до карбокси. Предложенные в данном документе заголовки не являются ограничениями разных аспектов данного раскрытия, которые можно иметь посредством ссылки на описание изобретения в целом. Соответственно, термины, определенные сразу ниже, являются более понятными посредством ссылки на описание изобретения во всей его полноте.

Термин «примерно» используется в данном документе для обозначения приблизительно, грубо, около или в областях. При использовании термина «примерно» в сочетании с числовым интервалом он модифицирует данный интервал посредством расширения границ выше и ниже изложенных числовых значений. В общем, термин «примерно» может модифицировать числовое значение выше и ниже утверждаемого значения на отклонение, например, 10 процентов вверх или вниз (выше или ниже). Например, если утверждается то, что «ASO уменьшает экспрессию белка SNCA в клетке после введения ASO по меньшей мере примерно на 60%», подразумевается то, что уровни SNCA уменьшаются в интервале от 50% до 70%.

Термин «антисмысловой олигонуклеотид» (ASO) относится к олигомеру или полимеру нуклеозидов, таких как встречающиеся в природе нуклеозиды или их модифицированные формы, которые ковалентно связываются друг с другом через межнуклеотидные связи. Полезный для данного раскрытия ASO включает по меньшей мере один нуклеозид, не встречающийся в природе. ASO является комплементарным нуклеиновой кислоте-мишени таким образом, что данный ASO гибридизуется с последовательнстью нуклеиновой кислоты-мишени. Термины «антисмысловой ASO», «ASO» и «олигомер» в том виде, в котором они используются в данном документе, являются взаимозаменяемыми с термином «ASO».

Подразумевается то, что термин «нуклеиновые кислоты» или «нуклеотиды» охватывает многочисленные нуклеиновые кислоты. В некоторых воплощениях термин «нуклеиновые кислоты» или «нуклеотиды» относится к последовательности-мишени, например, пре-мРНК, мРНК или ДНК in vivo или in vitro. Когда данный термин относится к нуклеиновым кислотам или нуклеотидам в последовательности-мишени, данные нуклеиновые кислоты или нуклеотиды могут быть последовательностями, встречающимися в природе в клетке. В других воплощениях термины «нуклеиновые кислоты» или «нуклеотиды» относятся к последовательности в ASO по данному раскрытию. Когда данный термин относится к последовательности в ASO, нуклеиновые кислоты или нуклеотиды не являются встречающимися в природе, т.е. являются химически синтезированными, полученными ферментативно, полученными рекомбинантно или любой их комбинацией. В одном воплощении нуклеиновые кислоты или нуклеотиды в ASO получают синтетически или рекомбинантно, но они не представляют собой встречающуюся в природе последовательность или ее фрагмент. В другом воплощении нуклеиновые кислоты или нуклеотиды в ASO не являются встречающимися в природе, так как они содержат по меньшей мере один нуклеотидный аналог, который не встречается в природе. Термин «нуклеиновая кислота» или «нуклеозид» относится к одному отрезку нуклеиновой кислоты, например, ДНК, РНК или их аналогу, присутствующему в полинуклеотиде. «Нуклеиновая кислота» или «нуклеозид» включает встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты или не встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты. В некоторых воплощениях термины «нуклеотид», «звено» и «мономер» используются взаимозаменяемо. Будет понятно то, что при ссылке на последовательность нуклеотидов или мономеров делается ссылка на последовательность оснований, таких как А, Т, G, С или U и их аналогов.

Термин «нуклеотид» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к гликозиду, содержащему сахарную группировку, группировку основания и ковалентно связанную группу (связывающую группу), такую как фосфатная или фосфоротиоатная межнуклеотидная связывающая группа, и охватывает и встречающиеся в природе нуклеотиды, такие как ДНК или РНК, и не встречающиеся в природе нуклеотиды, содержащие модифицированный сахар и/или основание, которые также называются в данном документе «нуклеотидными аналогами». В данном документе один нуклеотид (звено) также может называться мономером или звеном нуклеиновой кислоты. В некоторых воплощениях термин «нуклеотидные аналоги» относится к нуклеотидам, имеющим модифицированные сахарные группировки. Неограничивающие примеры нуклеотидов, имеющих модифицированные сахарные группировки (например, LNA), раскрываются в данном документе в других местах. В других воплощениях термин «нуклеотидные аналоги» относится к нуклеотидам, имеющим модифицированные группировки нуклеиновых оснований. Нуклеотиды, имеющие модифицированные группировки нуклеиновых оснований, включают 5-метилцитозин, изоцитозин, псевдоизоцитозин, 5-бромурацил, 5-пропинилурацил, 6-аминопурин, 2-аминопурин, инозин, диаминопурин и 2-хлор-6-аминопурин.

Термин «нуклеозид» в том виде, в котором он используется в данном документе, используется для ссылки на гликозид, содержащий сахарную группировку и группировку основания, которые могут быть ковалентно связанными межнуклеотидными связями между нуклеозидами ASO. В области биотехнологии термин «нуклеозид» часто используется для ссылки на мономер или звено нуклеиновой кислоты. В контексте ASO термин «нуклеозид» может относиться к одному основанию, т.е. последовательности нуклеиновых оснований, содержащей цитозин (ДНК и РНК), гуанин (ДНК и РНК), аденин (ДНК и РНК), тимин (ДНК) и урацил (РНК), в которой подразумевается присутствие сахарного остова и межнуклеотидных связей. Подобным образом, особенно в случае олигонуклеотидов, где модифицируется одна или более чем одна межнуклеотидная связывающая группа, термин «нуклеотид» может относиться к «нуклеозиду». Например, термин «нуклеотид» может использоваться даже при точном определении присутствия или природы связей между нуклеозидами.

Термин «длина нуклеотида» в том виде, в котором он используется в данном документе, означает общее число нуклеотидов (мономеров) в данной последовательности. Например, последовательность ctaacaacttctgaacaaca (SEQ ID NO: 1436) имеет 20 нуклеотидов; таким образом, длина нуклеотида данной последовательности составляет 20. Термин «длина нуклеотида», следовательно, используется в данном документе взаимозаменяемо с термином «число нуклеотидов».

Как было бы известно обычному специалисту в данной области, 5'-концевой нуклеотид олигонуклеотида не содержит 5'-межнуклеотидную связывающую группу, хотя он может содержать 5'-концевую группу.

Термин «кодирующая область» или «кодирующая последовательность» в том виде, в котором он используется в данном документе, представляет собой часть полинуклеотида, которая состоит из кодонов, транслируемых в аминокислоты. Хотя «терминирующий кодон» (TAG, TGA или ТТА) типично не транслируется в аминокислоту, он может рассматриваться частью кодирующей области, но любые фланкирующие последовательности, например, промоторы, сайты связывания рибосомы, терминаторы транскрипции, интроны, нетранслируемые области («UTR») и тому подобные не являются частью кодирующей области. Границы кодирующей области типично определяются инициирующим кодоном на 5'-конце, кодирующим амино конец образующегося полипептида, и кодоном-терминатором трансляции на 3'-конце, кодирующим карбоксильный конец образующегося полипептида.

Термин «некодирующая область» в том виде, в котором он используется в данном документе, означает нуклеотидную последовательность, которая не является кодирующей областью. Примеры некодирующих областей включают промоторы, сайты связывания рибосомы, терминаторы транскрипции, интроны, нетранслируемые области («UTR»), некодирующие экзоны и тому подобное, но не ограничиваются ими. Некоторые экзоны целиком или частично могут быть 5'-нетранслируемой областью (5' UTR) или 3'-нетранслируемой областью (3' UTR) каждого транскрипта. Нетранслируемые области являются важными для эффективной трансляции транскрипта и для осуществления контроля скорости трансляции и времени полужизни транскрипта.

Термин «область», при использовании в контексте нуклеотидной последовательности, относится к отрезку данной последовательности. Например, фраза «область в пределах нуклеотидной последовательности» или «область в пределах комплементарной цепи нуклеотидной последовательности» относится к более короткой последовательности, чем нуклеотидная последовательность, но длиннее, чем по меньшей мере 10 нуклеотидов, расположенных в пределах конкретной нуклеотидной последовательности или комплементарной цепи нуклеотидной последовательности соответственно. Термин «подпоследовательность» или «область-мишень» также может относиться к области нуклеотидной последовательности.

Термин «ниже», при отнесении к нуклеотидной последовательности, означает то, что нуклеиновая кислота или нуклеотидная последовательность расположена 3' по отношению к эталонной нуклеотидной последовательности. В некоторых воплощениях расположенные ниже нуклеотидные последовательности относятся к последовательностям, которые следуют после точки начала транскрипции. Например, кодон инициации трансляции гена расположен ниже сайта начала транскрипции.

Термин «выше» относится к нуклеотидной последовательности, которая расположена 5' по отношению к эталонной нуклеотидной последовательности.

Если не указано иное, приведенные в данном документе последовательности перечисляются от 5'-конца (слева) до 3'-конца (справа).

Термин «регуляторная область» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к нуклеотидным последовательностям, расположенным выше (5'-некодирующие последовательности), в пределах или ниже (3'-некодирующие последовательности) кодирующей области, и которая влияет на транскрипцию, процессинг РНК, стабильность или трансляцию ассоциированной кодирующей области. Регуляторные области могут включать промоторы, лидерные последовательности трансляции, интроны, последовательности распознавания полиаденилирования, сайты процессинга РНК, сайты связывания эффектора, UTR и структуры типа «стебель-петля». Если кодирующая область предназначена для экспрессии в эукариотической клетке, сигнал полиаденилирования и последовательность терминации транскрипции обычно будут находиться 3' к кодирующей последовательности.

Термин «транскрипт» в том виде, в котором он используется в данном документе, может относиться к первичному транскрипту, который синтезируется посредством транскрипции ДНК и становится матричной РНК (мРНК) после процессинга, т.е. к предшественнику матричной РНК (пре-мРНК), и к самой подвергнувшейся процессингу мРНК. Термин «транскрипт» может взаимозаменяемо использоваться с «пре-мРНК» и «мРНК». После транскрипции нитей ДНК до первичных транскриптов вновь синтезированные первичные транскрипты модифицируются несколькими способами для превращения в их зрелые функциональные формы, такие как мРНК, тРНК, рРНК, ИнкРНК, миРНК и другие. Таким образом, термин «транскрипт» может включать экзоны, интроны, 5'-UTR и 3'-UTR.

Термин «экспрессия» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к способу, посредством которого полинуклеотид продуцирует продукт гена, например, РНК или полипептид. Он включает, без ограничения, транскрипцию полинуклеотида в матричную РНК (мРНК) и трансляцию мРНК в полипептид. Экспрессия дает «продукт гена». «Продукт гена» в том виде, в котором данный термин используется в данном документе, может представлять собой либо нуклеиновую кислоту, например, матричную РНК, продуцированную транскрипцией гена, либо полипептид, который транслируется от транскрипта. Продукты генов, описанные в данном документе, дополнительно включают нуклеиновые кислоты с посттранскрипционными модификациями, например, полиаденилированием или сплайсингом, или полипептиды с посттрансляционными модификациями, например, метилированием, гликозилированием, присоединением липидов, ассоциацией с другими белковыми субъединицами или протеолитическим расщеплением.

Термины «идентичный» или процент «идентичности» в контексте двух или более чем двух нуклеиновых кислот относятся к двум или более чем двум последовательностям, которые являются одинаковыми или имеют точно определенную процентную долю нуклеотидов или аминокислотных остатков, которые являются такими же при сравнении и выравнивании (введении, если необходимо, пробелов) на максимальное соответствие, не рассматривая любые консервативные аминокислотные замены как часть идентичности последовательности. Процент идентичности может быть измерен с использованием программы или алгоритмов для сравнения последовательностей или посредством визуальной проверки. В данной области известны разные алгоритмы и программы, которые можно использовать для получения выравниваний аминокислотных или нуклеотидных последовательностей.

Одним таким неограничивающим примером алгоритма выравнивания последовательностей является алгоритм, описанный в Karlin et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Set, 87:2264-2268, как модифицировано в Karlin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90:5873-5877, и включенный в программы NBLAST и XBLAST (Altschul et al., 1991, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402). В некоторых воплощениях можно использовать Gapped BLAST, как описано в Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. BLAST-2, WU-BLAST-2 (Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology, 266:460-480), ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, Калифорния) или Megalign (DNASTAR) представляют собой дополнительные общедоступные программы, которые можно использовать для выравнивания последовательностей. В некоторых воплощениях процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями определяется с использованием программы GAP в программном пакете GCG (например, с использованием матрицы NWSgapdna.CMP, веса пробела 40, 50, 60, 70 или 90 и веса длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6). В некоторых альтернативных воплощениях для определения процента идентичности между двумя аминокислотными последовательностями можно использовать программу GAP в программном пакете GCG, которая включает алгоритм Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) (например, с использованием либо матрицы BLOSUM 62, либо матрицы РАМ250 и веса пробела 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4, и веса длины 1, 2, 3, 4, 5). В качестве альтернативы, в некоторых воплощениях процент идентичности между нуклеотидными и аминокислотными последовательностями определяется с использованием алгоритма Myers and Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)). Например, процент идентичности может определяться с использованием программы ALIGN (версия 2,0) и с использованием РАМ120 с таблицей остатков, штрафом за длину пробела 12 и штрафом за пробел 4. Специалист в данной области может определять подходящие параметры для максимального выравнивания посредством конкретной программы выравнивания. В некоторых воплощениях используются параметры по умолчанию программы для выравнивания.

В некоторых воплощениях процентная доля идентичности «X» первой нуклеотидной последовательности со второй нуклеотидной последовательностью рассчитывается как 100 × (Y/Z), где Y представляет собой число аминокислотных остатков, подсчитанных как идентичные соответствия при выравнивании первой и второй последовательностей (при выравнивании посредством визуальной проверки или конкретной программы выравнивания последовательностей), и Z представляет собой общее число остатков во второй последовательности. Если длина первой последовательности больше, чем второй последовательности, процент идентичности первой последовательности со второй последовательностью будет выше, чем процент идентичности второй последовательности с первой последовательностью.

Разные области в пределах целевой последовательности одного полинуклеотида, которые выравниваются с эталонной последовательностью полинуклеотида, могут иметь каждая их собственный процент идентичности последовательности. Отмечается то, что значение процента идентичности последовательности округляется до ближайшей десятой. Например, 80,11; 80,12; 80,13 и 80,14 округляются до меньшего значения 80,1; тогда как 80,15; 80,16; 80,17; 80,18 округляются вплоть до 80,2. Также отмечается то, что значение длины всегда будет целым числом.

Термины «гомологичный» и «гомология» в том виде, в котором они используются в данном документе, являются взаимозаменяемыми с терминами «идентичность» и «идентичный».

Термин «его встречающийся в природе вариант» относится к вариантам полипептидной последовательности SNCA или последовательности нуклеиновой кислоты SNCA (например, транскрипта), которые существуют в природе в пределах определенной таксономической группы, такой как млекопитающее, такое как мышь, обезьяна и человек. Типично при ссылке на «встречающиеся в природе варианты» полинуклеотида данный термин также может охватывать любой аллельный вариант геномной ДНК, кодирующей SNCA, который находится в хромосомном положении 17q21 посредством хромосомной транслокации или дупликации, и РНК, такой как мРНК, образующаяся из нее. «Встречающиеся в природе варианты» также могут включать варианты, полученные в результате альтернативного сплайсинга мРНК SNCA. При ссылке на конкретную полипептидную последовательность, например, данный термин также включает встречающиеся в природе формы белка, которые, следовательно, могут подвергаться процессингу, например, посредством ко- или посттрансляционных модификаций, таких как отщепление сигнального пептида, протеолитическое расщепление, гликозилирование и т.д.

При определении степени «комплементарности» между ASO по данному раскрытию (или его областями) и областью-мишенью нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок SNCA млекопитающего (например, ген SNCA), такой как области-мишени, раскрытые в данном документе, степень «комплементарности» (также «гомологии» или «идентичности») выражается как процентная доля идентичности (или процентная доля гомологии) между последовательностью ASO (или его областью) и последовательностью области-мишени (или обратным комплементом области-мишени), которая лучше всего выравнивается с ним. Данная процентная доля рассчитывается подсчетом числа выровненных оснований, которые являются идентичными между двумя данными последовательностями, деля на общее число смежных мономеров в ASO и умножая на 100. При таком сравнении, если существуют пробелы, предпочтительно, чтобы такие пробелы просто были несоответствиями, а не областями, где число мономеров в пределах пробела отличается между ASO по данному раскрытию и областью-мишенью.

Термин «комплемент» в том виде, в котором он используется в данном документе, указывает последовательность, которая является комплементарной эталонной последовательности. Хорошо известно то, что комплементарность является основным принципом репликации и транскрипции ДНК, так как она представляет собой общее свойство между двумя последовательностями ДНК или РНК, таким образом, что при их антипараллельном выравнивании друг с другом нуклеотидные основания в каждом положении в данных последовательностях будут комплементарными, что очень похоже на то, как смотреть в зеркало и видеть обратное отражение вещи. Следовательно, например, комплемент последовательности 5'''ATGC''3' может быть записан как 3'''TACG''5' или 5'''GCAT''3'. Термины «обратный комплемент», «обратно комплементарный» и «обратная комплементарность» в том виде, в котором они используются в данном документе, являются взаимозаменимыми с терминами «комплемент», «комплементарный» и «комплементарность».

Термин «% комплементарности» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к доле нуклеотидов (в процентах) непрерывной нуклеотидной последовательности в молекуле нуклеиновой кислоты (например, олигонуклеотиде), которые по данной непрерывной нуклеотидной последовательности являются комплементаными эталонной последовательности (например, последовательности-мишени или мотиву последовательности). Процентная доля комплементарности, таким образом, рассчитывается посредством подсчета числа выровненных нуклеиновых оснований, которые являются комплементарными (из пар оснований по Уотсону-Крику) между двумя последовательностями (при выравнивании с последовательностью-мишенью 5'-3' и олигонуклеотидной последовательностью от 3'-5'), деля это число на общее число нуклеотидов в олигонуклеотиде и умножая на 100. При таком сравнении нуклеиновое основание/нуклеотид, который не выравнивается (образует пару оснований) называется несоответствием. Вставки и делеции не допускаются в расчете % комплементарности непрерывной нуклеотидной последовательности. Будет понятно то, что при определении комплементарности химические модификации нуклеиновых оснований игнорируются при условии, что сохраняется функциональная способность нуклеинового основания к образованию пар оснований по Уотсону-Крику (например, 5'-метилцитозин считается идентичным цитозину для цели расчета % идентичности).

Термин «полностью комплементарный» относится к 100%-ной комплементарности.

Термины «соответствующий» и «соответствует», при ссылке на две отдельные нуклеиновые кислоты или нуклеотидные последовательности, можно использовать для прояснения областей последовательностей, которые соответствуют или являются аналогичными друг другу на основе гомологии и/или функциональности, хотя нуклеотиды специфических последовательностей могут быть пронумерованы по-разному. Например, разные изоформы транскрипта гена могут иметь аналогичные или консервативные части нуклеотидных последователностей, нумерация которых может отличаться в соответствующих изоформах на основе альтернативного сплайсинга и/или других модификаций. Кроме того, признается то, что при характеристике нуклеиновой кислоты или нуклеотидной последовательности могут использоватся разные системы нумерации (например, транскрипта гена и того, начинать ли нумерацию последовательности с кодона инициации трансляции или включать ли 5'UTR). Кроме того, признается то, что последовательность нуклеиновой кислоты или нуклеотидов разных вариантов гена или транскрипта гена может варьировать. Однако области вариантов, которые имеют гомологию последовательности нуклеиновой кислоты или нуклеотидов и/или функциональность в том виде, в котором они используются в данном документе, считаются «соответствующими» друг другу. Например, нуклеотидная последовательность транскрипта SNCA, соответствующая нуклеотидам X-Y SEQ ID NO: 1 («эталонная последовательность»), относится к последовательности транскрипта SNCA (например, пре-мРНК или мРНК SNCA), которая имеет идентичную последовательность или аналогичную последователность нуклеотидам X-Y SEQ ID NO: 1. Обычный специалист в данной области может индентифицировать соответствующие остатки X и Y в последовательности транскрипта SNCA посредством выравнивания последовательности транскрипта SNCA с SEQ ID NO: 1.

Подразумевается то, что термины «соответствующий нуклеотидный аналог» и «соответствующий нуклеотид» указывают то, что нуклеиновое основание в данном нуклеотидном аналоге и встречающийся в природе нуклеотид имеют одинаковую способность к образованию пары или гибридизации. Например, при связывании 2-дезоксирибозного звена нуклеотида с аденином «соответствующий нуклеотидный аналог» содержит звено пентозы (отличное от 2-дезоксирибозы), связанное с аденином.

Термин «номер DES» или «DES №» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к уникальному номеру, данному нуклеотидной последовательности, имеющей специфическую картину нуклеозидов (например, ДНК) и нуклеозидных аналогов (например, LNA). Конструкция ASO в том виде, в котором она здесь используется, показана комбинацией заглавных букв и строчных букв. Например, DES-003092 относится к последовательности ASO ctaacaacttctgaacaaca (SEQ ID NO: 1436) с конструкцией ASO LDDLLDDDDDDDDDDLDLLL (т.е. CtaACaacttctgaaCaACA), где L (т.е. заглавная буква) указывает нуклеозидный аналог (например, LNA), и D (т.е. строчная буква) указывает нуклеозид (например, ДНК).

Термин «номер ASO» или «ASO №» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к уникальному номеру, данному нуклеотидной последовательности, имеющей подробную химическую структуру компонентов, например, нуклеозидов (например, ДНК), нуклеозидных аналогов (например, бета-D-окси-LNA), нуклеиновых оснований (например, А, Т, G, С, U или МС) и структуру остова (например, фосфоротиоатный или фосфодиэфирный). Например, ASO-003092 относится к OxyMCs DNAts DNAas OxyAs OxyMCs DNAas DNAas DNAcs DNAts DNAts DNAcs DNAts DNAgs DNAas DNAas OxyMCs DNAas OxyAs OxyMCs OxyA.

«Эффективность» обычно выражается в виде значения IC₅₀ или ЕС₅₀ в мкМ, нМ или пМ, если не утверждается иное. Эффективность также может выражаться в показателях процента ингибирования. IC₅₀ представляет собой медианную ингибирующую концентрацию терапевтической молекулы. ЕС₅₀ представляет собой медианную эффективную концентрацию терапевтической молекулы относительно носителя или контроля (например, физиологического раствора). В функциональных анализах IC₅₀ представляет собой концентрацию терапевтической молекулы, которая уменьшает биологический ответ, например, транскрипцию мРНК или экспрессию белка, на 50% биологического ответа, который достигается данной терапевтической молекулой. В функциональных анализах ЕС₅₀ представляет собой концентрацию терапевтической молекулы, которая дает 50% биологического ответа, например, транскрипции мРНК или экспрессии белка. IC₅₀ или ЕС₅₀ может рассчитываться любым числом способов, известных в данной области.

Под «субъектом» или «индивидом», или «животным», или «пациентом», или «млекопитающим» подразумевается любой субъект, в частности, млекопитающий субъект, для которого желательными являются постановка диагноза, прогноз или терапия. Млекопитающие субъекты включают человека, домашних животных, сельскохозяйственных животных, спортивных животных и животных в зоопарках, включая, например, человека, приматов, не являющихся человеком, собак, кошек, морских свинок, кроликов, крыс, мышей, лошадей, крупный рогатый скот, медведей и так далее.

Термин «фармацевтическая композиция» относится к препарату, который находится в такой форме, чтобы обеспечивать эффективную биологическую активность активного ингредиента, и который не содержит дополнительных компонентов, которые являются неприемлемо токсичными для субъекта, которому вводилась бы композиция. Такая композиция может быть стерильной.

«Эффективное количество» ASO, как раскрыто в данном документе, представляет собой достаточное количество для осуществления конкретно изложенной цели. «Эффективное количество» может определяться эмпирически и традиционным способом в связи с изложенной целью.

Такие термины, как «осуществление лечения» или «лечение», или «лечить», или «осуществление облегчения», или «облегчать» относятся как к (1) терапевтическим мерам, которые излечивают, замедляют, уменьшают симптомы и/или останавливают прогрессирование диагностированного патологического состояния или расстройства, и к (2) профилактическим или предупредительным мерам, которые предупреждают и/или замедляют развитие целевого патологического состояния или расстройства. Таким образом, нуждающиеся в лечении включают тех, у кого уже есть расстройство; тех, кто склонен к тому, чтобы иметь расстройство; и тех, у кого следует предупреждать расстройство. В некоторых воплощениях субъекта успешно «лечат» против заболевания или состояния, раскрытых в данном документе в других местах, согласно способам, предложенным в данном документе, если данный пациент демонстрирует, например, общее, частичное или временное облегчение или устранение симптомов, ассоциированных с заболеванием или расстройством.

II. Антисмысловые олигонуклеотиды

В настоящем раскрытии используются антисмысловые олигонуклеотиды для применения в модуляции функции молекул нуклеиновых кислот, кодирующих α-Syn млекопитающих, таких как нуклеиновая кислота SNCA, например, транскрипт SNCA, включая пре-мРНК SNCA и мРНК SNCA или встречающиеся в природе варианты таких молекул нуклеиновых кислот, кодирующие α-Syn млекопитающих. Термин «ASO» в контексте настоящего раскрытия относится к молекуле, образованной ковалентной связью двух или более чем двух нуклеотидов (т.е. к олигонуклеотиду).

ASO содержит непрерывную нуклеотидную последовательность из от примерно 10 до примерно 30, как, например, 10-20, 16-20 или 15-25 нуклеотидов в длину. Термины «антисмысловой ASO», «антисмысловой олигонуклеотид» и «олигомер» в том виде, в котором они используются в данном документе, являются взаимозаменимыми с термином «ASO».

Ссылка на SEQ ID номер включает конкретную последовательность нуклеиновых оснований, но не включает какую-либо конструкцию или полную химическую структуру, показанную на ФИГ. 1А-1С или 2. Кроме того, ASO, раскрытые на Фиг. в данном документе, демонстрируют репрезентативную конструкцию, но не являются ограниченными конкретной конструкцией, показанной на Фиг., если не указано иное. В данном документе один нуклеотид (звено) также может называться мономером или звеном. Когда данное описание изобретения относится к конкретному номеру ASO, ссылка включает последовательность, конкретную конструкцию ASO и химическую структуру. Когда данное описание изобретения относится к конкретному номеру DES, ссылка включает последовательность и конкретную конструкцию ASO. Например, когда формула изобретения (или данное описание изобретения) относится к SEQ ID NO: 1436, она включает только нуклеотидную последовательность ctaacaacttctgaacaaca. Когда формула изобретения (или данное описание изобретения) относится к DES-003092, она включает нуклеотидную последовательность ctaacaacttctgaacaaca с конструкциями ASO, показанными на Фиг. (т.е. CtaACaacttctgaaCaACA). В качестве альтернативы, конструкция ASO-003092 также может быть записана как SEQ ID NO: 1436, где каждый 1-й нуклеотид, 4-ый нуклеотид, 5-й нуклеотид, 16-й нуклеотид и 18-20-й нуклеотиды с 5'-конца представляет собой модифицированный нуклеотид, например, LNA, и каждый из других нуклеотидов представляет собой немодифицированный нуклеотид (например, ДНК). Номер ASO включает последовательность и конструкцию ASO, а также конкретные подробности об ASO. Следовательно, ASO-003092, на который дается ссылка в данной заявке, указывает OxyMCs DNAts DNAas OxyAs OxyMCs DNAas DNAas DNAcs DNAts DNAts DNAcs DNAts DNAgs DNAas DNAas OxyMCs DNAas OxyAs OxyMCs OxyA, где «s» указывает фосфоротиоатную связь.

В разных воплощениях ASO по данному раскрытию не содержит РНК (звенья). В некоторых воплощениях ASO содержит одно или более чем одно звено ДНК. В одном воплощении ASO согласно данному раскрытию представляет собой линейную молекулу или синтезируется в виде линейной молекулы. В некоторых воплощениях ASO представляет собой одноцепочечную молекулу и не содержит короткие области, например, из по меньшей мере 3, 4 или 5 смежных нуклеотидов, которые являются комплементарными эквивалентным областям в пределах того же самого ASO (т.е. дуплексы) - в данном отношении ASO (по существу) не является двухцепочечным. В некоторых воплощениях ASO по существу не является двухцепочечным. В некоторых воплощениях ASO не представляет собой миРНК (малая интерферирующая РНК). В разных воплощениях ASO по данному раскрытию может целиком состоять из непрерывной нуклетидной области. Таким образом, в некоторых воплощениях ASO по существу не является комплеметарным самому себе.

В одном воплощении ASO по данному раскрытию может находиться в виде любых фармацевтически приемлемых солей. Термин «фармацевтически приемлемые соли» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к производным ASO по данному раскрытию, где ASO является модифицированным (например, добавлением катиона) посредством получения его солей. Такие соли сохраняют желательную биологическую активность ASO без придания нежелательных токсикологических эффектов. В некоторых воплощениях ASO по данному раскрытию находится в виде натриевой соли. В других воплощениях ASO находится в виде калиевой соли.

II.А. Мишень

Подходящим образом ASO по данному раскрытию способен осуществлять понижающую регуляцию (например, уменьшать или устранять) экспрессию мРНК SNCA или белка SNCA. В данном отношении ASO по данному раскрытию может осуществлять опосредованное ингибирование белка SNCA через уменьшение уровней мРНК SNCA, типично в клетке млекопитающего, такой как человеческая клетка, такой как нейрон. В частности, настоящее раскрытие направлено на ASO, которые нацелены на одну или более чем одну область пре-мРНК SNCA.

Синонимы SNCA известны и включают NACP - не А-бета компонент амилоида AD, PARK1, PARK4 и PD1. Последовательность гена SNCA может быть найдена под общедоступным номером доступа NC_000004.12, и последовательность транскрипта пре-мРНК SNCA может быть найдена под общедоступным номером доступа NG_011851.1 (SEQ ID NO: 1). Последовательность белка SNCA может быть найдена под общедоступными номерами доступа: Р37840, A8K2A4, Q13701, Q4JHI3 и Q6IAU6, каждый из которых включается в данный документ посредством ссылки во всей его полноте. Известны природные варианты гена SNCA. Например, природные варианты белка SNCA могут содержать одну или более чем одну аминокислотную замену, выбранную из: А30Р, E46K, H50Q, А53Т и любых их комбинаций. Следовательно, ASO по настоящему раскрытию может быть сконструирован для уменьшения или ингибирования экспрессии природных вариантов белка SNCA.

Известно то, что мутации в SNCA вызывают одно или более чем одно патологическое состояние. ASO по данному раскрытию можно использовать для уменьшения или ингибирования экспрессии SNP (однонуклеотидный полиморфизм) или транскрипта SNCA, подвергнувшегося альтернативному сплайсингу, содержащего одну или более чем одну мутацию, и, следовательно, для уменьшения образования мутировавшего белка SNCA. Примеры мутантов белка SNCA включают белок SNCA, содержащий одну или более чем одну мутацию, выбранную из: D2A, E35K, Y39F, Н50А, E57K, G67_V71del, V71_V82del, A76_V77del, A76del, V77del, A78del, A85_F94del, Y125F, Y133F, Y136F и их любой комбинации, но не ограничиваются ими. ASO по данному раскрытию может быть сконструирован для уменьшения или ингибирования экспрессии любых мутантов белков SNCA.

Примером последовательности нуклеиновой кислоты-мишени ASO является пре-мРНК SNCA. SEQ ID NO: 1 представляет геномную последовательность SNCA. SEQ ID NO: 1 является идентичной последовательности пре-мРНК SNCA, за исключением того, что нуклеотид «t» в SEQ ID NO: 1 показан как «и» в пре-мРНК. В некоторых воплощениях «нуклеиновая кислота-мишень» содержит область интрона нуклеиновых кислот, кодирующих белок SNCA, или его встречающиеся в природе варианты, и происходящие их них нуклеиновые кислоты РНК, например, пре-мРНК. В других воплощениях «нуклеиновая кислота-мишень» включает область экзона нуклеиновых кислот, кодирующих белок SNCA, или его встречающиеся в природе варианты, и происходящие их них нуклеиновые кислоты РНК, такие как мРНК, пре-мРНК и зрелая мРНК. В некоторых воплощениях, например, при использовании в исследовании или диагностике, «нуклеиновая кислота-мишень» может представлять собой кДНК или синтетический олигонуклеотид, полученный из приведенных выше нуклеиновых кислот-мишеней - ДНК или РНК. В одном воплощении геномная последовательность SNCA показана как № доступа GenBank NG_011851.1 (SEQ ID NO: 1). Зрелая мРНК, кодирующая белок SNCA, показана как SEQ ID NO: 2 (NM_000345.3). Варианты данной последовательности демонстрируются в SEQ ID NO: 3 (NM_001146054.1), SEQ ID NO: 4 (NM_001146055.1) и SEQ ID NO: 5 (NM_007308.2) - варианты 2-4 соответственно. Вариант 2 соответствует №доступа GenBank NM_001146054.1. Вариант 3 соответствует №доступа GenBank NM_001146055.1. Вариант 4 соответствует №доступа GenBank NM_007308.2. Последовательность белка SNCA, кодируемая мРНК SNCA (SEQ ID NO: 2), демонстрируется как SEQ ID NO: 6.

Последовательности нуклеиновых кислот-мишеней, которым комплементарны олигонуклеотиды по изобретению, обобщаются в таблице ниже:

Олигонуклеотид по изобретению, например, может быть нацелен на область экзона SNCA млекопитающего или, например, может быть нацелен на область интрона пре-мРНК SNCA, как показано в таблице ниже:

В одном воплощении ASO согласно данному раскрытию содержит непрерывную нуклеотидную последовательность из 10-30 нуклеотидов в длину, которая является комплементарной последовательности нуклеиновой кислоты в пределах транскрипта SNCA, например, области, соответствующей экзону, интрону или их любой комбинации SEQ ID NO: 1, или области в пределах SEQ ID NO: 2, 3, 4 или 5, где данная последовательность нуклеиновой кислоты соответствует (i) нуклеотидам 4942-5343 SEQ ID NO: 1; (ii) нуклеотидам 6326-7041 SEQ ID NO: 1; (iia) нуклеотидам 6336-7041 SEQ ID NO: 1; (iii) нуклеотидам 7329-7600 SEQ ID NO: 1; (iv) нуклеотидам 7630-7783 SEQ ID NO: 1; (iva) нуклеотидам 7750-7783 SEQ ID NO: 1; (v) нуклеотидам 8277-8501 SEQ ID NO: 1; (vi) нуклеотидам 9034-9526 SEQ ID NO: 1; (vii) нуклеотидам 9982-14279 SEQ ID NO: 1; (viii) нуклеотидам 15204-19041 SEQ ID NO: 1; (ix) нуклеотидам 20351-29654 SEQ ID NO: 1; (ixa) нуклеотидам 20351-20908 SEQ ID NO: 1; (ixb) нуклеотидам 21052-29654 SEQ ID NO: 1; (x) нуклеотидам 30931-33938 SEQ ID NO: 1; (xi) нуклеотидам 34932-37077 SEQ ID NO: 1; (xii) нуклеотидам 38081-42869 SEQ ID NO: 1; (xiii) нуклеотидам 44640-44861 SEQ ID NO: 1; (xiv) нуклеотидам 46173-46920 SEQ ID NO: 1; (xv) нуклеотидам 47924-58752 SEQ ID NO: 1; (xvi) нуклеотидам 60678-60905 SEQ ID NO: 1; (xvii) нуклеотидам 62066-62397 SEQ ID NO: 1; (xviii) нуклеотидам 67759-71625 SEQ ID NO: 1; (xix) нуклеотидам 72926-86991 SEQ ID NO: 1; (xx) нуклеотидам 88168-93783 SEQ ID NO: 1; (xxi) нуклеотидам 94976-102573 SEQ ID NO: 1; (xxii) нуклеотидам 104920-107438 SEQ ID NO: 1; (xxiii) нуклеотидам 108948-119285 SEQ ID NO: 1; (xxiiia) нуклеотидам 108948-114019 SEQ ID NO: 1; (xxiib) нуклеотидам 114292-116636 SEQ ID NO: 1; (xxiv) нуклеотидам 131-678 SEQ ID NO: 5; (xxv) нуклеотидам 131-348 SEQ ID NO: 3; (xxvi) нуклеотидам 1-162 SEQ ID NO: 4; (xxvii) нуклеотидам 126-352 SEQ ID NO: 2; (xxviii) нуклеотидам 276-537 SEQ ID NO: 2; (xxix) нуклеотидам 461-681 SEQ ID NO: 2 и (xxx) нуклеотидам 541-766 SEQ ID NO: 2.

В другом воплощении ASO согласно данному раскрытию содержит непрерывную нуклеотидную последовательность из 10-30 нуклеотидов, которая гибридизуется с или является комплементарной, как, например, по меньшей мере на 90% комплементарной, как, например, полностью комплементарной области в пределах интрона транскрипта SNCA, например, области, соответствующей интрону SEQ ID NO: 1 (например, интрону 1, 2, 3 или 4).

В некоторых воплощениях данный ASO содержит непрерывную нуклеотидную последовательность из 10-30 нуклеотидов в длину, которая является по меньшей мере на 90% комплементарной, как, например, полностью комплементарной области интрона, присутствующего в пре-мРНК человеческого SNCA, выбранного из интрона i0 (нуклеотиды 1-6097 SEQ ID NO: 1); i1 (нуклеотиды 6336-7604 SEQ ID NO: 1); i2 (нуклеотиды 7751-15112 SEQ ID NO: 1); i3 (нуклеотиды 15155-20908 SEQ ID NO: 1); i4 (нуклеотиды 21052-114019 SEQ ID NO: 1); i5 (нуклеотиды 114104-116636 SEQ ID NO: 1) или i6 (нуклеотиды 119199-121198 SEQ ID NO: 1).

В некоторых воплощениях данный ASO содержит непрерывную нуклеотидную последовательность из 10-30 нуклеотидов в длину, которая является по меньшей мере на 90% комплементарной, как, например, полностью комплементарной человеческому SNCA, где данная последовательность нуклеиновой кислоты соответствует нуклеотидам 21052-20351-29654 SEQ ID NO: 1; нуклеотидам 30931-33938 SEQ ID NO: 1; нуклеотидам 44640-44861 SEQ ID NO: 1 или нуклеотидам 47924-58752 SEQ ID NO: 1.

В частности, преимущество имеет ASO, комплементарный интрону 4 (нуклеотиды 21025-114019 SEQ ID NO: 1), как, например, областям интрона 4, выбранным из нуклеотидов 21052-29654 SEQ ID NO: 1; нуклеотидов 24483-28791 SEQ ID NO: 1; нуклеотидов 30931-33938 SEQ ID NO: 1; нуклеотидов 32226-32242 SEQ ID NO: 1; нуклеотидов 44640-44861 SEQ ID NO: 1; нуклеотидов 44741-44758 SEQ ID NO: 1; нуклеотидов 47924-58752 SEQ ID NO: 1 или нуклеотидов 48641-48659 SEQ ID NO: 1.

В другом воплощении ASO по данному раскрытию содержит непрерывную нуклеотидную последовательность из 10-30 нуклеотидов, которая гибридизуется с или является комплементарной, как, например, по меньшей мере на 90% комплементарной, как, например, полностью комплементарной последовательности нукленовой кислоты или области в пределах последовательности транскрипта SNCA, где данная последовательность нуклеиновой кислоты соответствует нуклеотидам 6426-6825; 18569-20555 или 31398-107220 SEQ ID NO: 1, и где данный ASO имеет одну из конструкций, описанных в данном документе (например, раздел II.G, например, конструкция гэпмера, например, конструкция гэпмера с флангами с чередованием), или химическую структуру, показанную в данном документе в других местах (например, ФИГ. 1А-1С и 2).

В другом воплощении область-мишень соответствует нуклеотидам 5042-5243 SEQ ID NO: 1.

В других воплощениях область-мишень соответствует нуклеотидам 6336-7604 SEQ ID NO: 1.

В других воплощениях область-мишень соответствует нуклеотидам 6336-7041 SEQ ID NO: 1.

В других воплощениях область-мишень соответствует нуклеотидам 6426-6941 SEQ ID NO: 1.

В некоторых воплощениях область-мишень соответствует нуклеотидам 7429-7600 SEQ ID NO: 1.

В некоторых воплощениях область-мишень соответствует нуклеотидам 7630-7683 SEQ ID NO: 1.

В других воплощениях область-мишень соответствует нуклеотидам 7751-15112 SEQ ID NO: 1.

В других воплощениях область-мишень соответствует нуклеотидам 7751-7783 SEQ ID NO: 1.

В одном воплощении область-мишень соответствует нуклеотидам 8377-8401 SEQ ID NO: 1.

В другом воплощении область-мишень соответствует нуклеотидам 9134-9426 SEQ ID NO: 1.

В одном воплощении область-мишень соответствует нуклеотидам 10082-14179 SEQ ID NO: 1.

В одном воплощении область-мишень соответствует нуклеотидам 15304-18941 SEQ ID NO: 1.

В одном воплощении область-мишень соответствует нуклеотидам 15155-20908 SEQ ID NO: 1.

В одном воплощении область-мишень соответствует нуклеотидам 20451-29554 SEQ ID NO: 1.

В одном воплощении область-мишень соответствует нуклеотидам 20351-20908 SEQ ID NO: 1.

В одном воплощении область-мишень соответствует нуклеотидам 21052-114019 SEQ ID NO: 1.

В одном воплощении область-мишень соответствует нуклеотидам 21052-29654 SEQ ID NO: 1

В одном воплощении область-мишень соответствует нуклеотидам 31031-33838 SEQ ID NO: 1.

В одном воплощении область-мишень соответствует нуклеотидам 30931-33938 SEQ ID NO: 1.

В некоторых воплощениях область-мишень соответствует нуклеотидам 35032-36977 SEQ ID NO: 1.

В некоторых воплощениях область-мишень соответствует нуклеотидам 38181-42769 SEQ ID NO: 1.

В одном воплощении область-мишень соответствует нуклеотидам 44640-44861 SEQ ID NO: 1.

В одном воплощении область-мишень соответствует нуклеотидам 44740-44761 SEQ ID NO: 1.

В некоторых воплощениях область-мишень соответствует нуклеотидам 46273-46820 SEQ ID NO: 1.

В одном воплощении область-мишень соответствует нуклеотидам 47924-58752 SEQ ID NO: 1.

В других воплощениях область-мишень соответствует нуклеотидам 48024-58752 SEQ ID NO: 1.

В некоторых воплощениях область-мишень соответствует нуклеотидам 60778-60805 SEQ ID NO: 1.

В некотором воплощении область-мишень соответствует нуклеотидам 62166-62297 SEQ ID NO: 1.

В одном воплощении область-мишень соответствует нуклеотидам 67859-71525 SEQ ID NO: 1.

В некоторых воплощениях область-мишень соответствует нуклеотидам 73026-86891 SEQ ID NO: 1.

В некоторых воплощениях область-мишень соответствует нуклеотидам 88268-93683 SEQ ID NO: 1.

В некотором воплощении область-мишень соответствует нуклеотидам 95076-102473 SEQ ID NO: 1.

В некоторых воплощениях область-мишень соответствует нуклеотидам 105020-107338 SEQ ID NO: 1.

В некоторых воплощениях область-мишень соответствует нуклеотидам 109048-119185 SEQ ID NO: 1.

В некоторых воплощениях область-мишень соответствует нуклеотидам 108948-114019 SEQ ID NO: 1.

В некоторых воплощениях область-мишень соответствует нуклеотидам 114292-116636 SEQ ID NO: 1.

В одном воплощении область-мишень соответствует нуклеотидам 231-248 или 563-578 SEQ ID NO: 5.

В другом воплощении область-мишень соответствует нуклеотидам 231-248 SEQ ID NO: 3.

В некоторых воплощениях область-мишень соответствует нуклеотидам 38-62 SEQ ID NO: 4.

В других воплощениях область-мишень соответствует нуклеотидам 226-252 SEQ ID NO: 2.

В одном воплощении область-мишень соответствует нуклеотидам 376-437 SEQ ID NO: 2.

В другом воплощении область-мишень соответствует нуклеотидам 561-581 SEQ ID NO: 2.

В одном воплощении область-мишень соответствует нуклеотидам 641-666 SEQ ID NO: 2.

В некоторых воплощениях ASO гибридизуются с или являются комплементарными, как, например, по меньшей мере на 90% комплементарными, как, например, полностью комплементарными области в пределах транскрипта SNCA, например, SEQ ID NO: 1, и имеют балл последовательности, равный или больший чем примерно 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 или 1,0. Способы подсчета балла последовательности раскрываются в данном документе в других местах.

В одном воплощении ASO согласно данному раскрытию содержит непрерывную нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется с областью в пределах экзона транскрипта SNCA, например, с областью, соответствующей экзону SEQ ID NO: 1, например, экзону 2, 4, 5 или 6. В другом воплощении ASO по данному раскрытию содержит непрерывную нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется с последовательностью нуклеиновой кислоты или областью в пределах последовательности транскрипта SNCA («область-мишень»), где данная последовательность нуклеиновой кислоты соответствует нуклеотидам 7630-7683; 20932-21032; 114059-114098 или 116659-119185 SEQ ID NO: 1, и где данный ASO имеет одну из конструкций, описанных в данном документе (например, раздел II.G, например, конструкция гэпмера, например, конструкция гэпмера с флангом с чередованием), или химическую структуру, показанную в данном документе в других местах (например, ФИГ. 1А-1С и 2).

В другом воплощении область-мишень соответствует нуклеотидам 7630-7683 SEQ ID NO: 1. В некоторых воплощениях область-мишень соответствует нуклеотидам 20932-21032 SEQ ID NO: 1. В определенных воплощениях область-мишень соответствует нуклеотидам 114059-114098 SEQ ID NO: 1. В одном воплощении область-мишень соответствует нуклеотидам 116659-119185 SEQ ID NO: 1. В другом воплощении область-мишень соответствует нуклеотидам 116981-117212 SEQ ID NO: 1. В некоторых воплощениях область-мишень соответствует нуклеотидам 116981-117019 SEQ ID NO: 1. В других воплощениях область-мишень соответствует нуклеотидам 117068-117098 SEQ ID NO: 1. В определенных воплощениях область-мишень соответствует нуклеотидам 117185-117212 SEQ ID NO: 1. В другом воплощении область-мишень соответствует нуклеотидам 118706-118725 SEQ ID NO: 1. В определенных воплощениях ASO гибридизуются с областью в пределах экзона транскрипта SNCA, например, SEQ ID NO: 1, и имеют балл последовательности, равный или больший чем примерно 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 или 1,0. Способы подсчета балла последовательности раскрываются в данном документе в других местах.

В других воплощениях область-мишень соответствует нуклеотидам 6426-6825 SEQ ID NO: 1 ± 10, ± 20, ± 30, ± 40, ± 50, ± 60, ± 70, ± 80 или ± 90 нуклеотидов на 3'-конце, 5'-конце или на обоих. В некоторых воплощениях область-мишень соответствует нуклеотидам 18569-20555 SEQ ID NO: 1 ± 10, ± 20, ± 30, ± 40, ± 50, ± 60, ± 70, ± 80 или ± 90 нуклеотидов на 3'-конце, 5'-конце или на обоих. В другом воплощении область-мишень соответствует нуклеотидам 20926-21032 SEQ ID NO: 1 ± 10, ± 20, ± 30, ± 40, ± 50, ± 60, ± 70, ± 80 или ± 90 нуклеотидов на 3'-конце, 5'-конце или на обоих. В других воплощениях область-мишень соответствует нуклеотидам 31398-31413 SEQ ID NO: 1 ± 10, ± 20, ± 30, ± 40, ± 50, ± 60, ± 70, ± 80, или ± 90 нуклеотидов на 3'-конце, 5'-конце или на обоих. В некоторых воплощениях область-мишень соответствует нуклеотидам 35032-35049 SEQ ID NO: 1 ± 10, ± 20, ± 30, ± 40, ± 50, ± 60, ± 70, ± 80 или ± 90 нуклеотидов на 3'-конце, 5'-конце или на обоих. В определенных воплощениях область-мишень соответствует нуклеотидам 68373-69827 SEQ ID NO: 1 ± 10, ± 20, ± 30, ± 40, ± 50, ± 60, ± 70, ± 80 или ± 90 нуклеотидов на 3'-конце, 5'-конце или на обоих. В другом воплощении область-мишень соответствует нуклеотидам 78418-78487 SEQ ID NO: 1 ± 10, ± 20, ± 30, ± 40, ± 50, ± 60, ± 70, ± 80 или ± 90 нуклеотидов на 3'-конце, 5'-конце или на обоих. В других воплощениях область-мишень соответствует нуклеотидам 91630-91646 SEQ ID NO: 1 ± 10, ± 20, ± 30, ± 40, ± 50, ± 60, ± 70, ± 80 или ± 90 нуклеотидов на 3'-конце, 5'-конце или на обоих. В некоторых воплощениях область-мишень соответствует нуклеотидам 100028-101160 SEQ ID NO: 1 ± 10, ± 20, ± 30, ± 40, ± 50, ± 60, ± 70, ± 80 или ± 90 нуклеотидов на 3'-конце, 5'-конце или на обоих. В определенных воплощениях область-мишень соответствует нуклеотидам 107205-107220 SEQ ID NO: 1 ± 10, ± 20, ± 30, ± 40, ± 50, ± 60, ± 70, ± 80 или ± 90 нуклеотидов на 3'-конце, 5'-конце или на обоих. В другом воплощении область-мишень соответствует нуклеотидам 114059-114098 SEQ ID NO: 1 ± 10, ± 20, ± 30, ± 40, ± 50, ± 60, ± 70, ± 80 или ± 90 нуклеотидов на 3'-конце, 5'-конце или на обоих. В других воплощениях область-мишень соответствует нуклеотидам 116659-119185 SEQ ID NO: 1 ± 10, ± 20, ± 30, ± 40, ± 50, ± 60, ± 70, ± 80 или ± 90 нуклеотидов на 3'-конце, 5'-конце или на обоих. В других воплощениях область-мишень соответствует нуклеотидам 7604-7620 SEQ ID NO: 1 ± 1, ± 2, ± 3, ± 4, ± 5, ± 6, ± 7, ± 8 или ± 9 нуклеотидов на 3'-конце, 5'-конце или на обоих.

В определенных воплощениях ASO по данному раскрытию способен гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью (например, с транскриптом SNCA) при физиологических условиях, т.е. условиях in vivo. В некоторых воплощениях ASO по данному раскрытию способен гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью (например, с транскриптом SNCA) in vitro. В некоторых воплощениях ASO по данному раскрытию способен гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью (например, с транскриптом SNCA) in vitro при жестких условиях. Жесткость условий для гибридизации in vitro зависит, среди прочих, от продуктивного поглощения клетками, доступности РНК, температуры, свободной энергии ассоциации, концентрации соли и времени (см., например, Stanley Т Crooks, Antisense Drug Technology: Principles, Strategies and Applications, 2^nd Edition, CRC Press (2007)). В общем, условия от высокой до умеренной жесткости используются для гибридизации in vitro для обеспечения гибридизации между по существу аналогичными нуклеиновыми кислотами, но не между несходными нуклеиновыми кислотами. Пример жестких условий гибридизации включает гибридизацию в 5× буфере на основе физиологического раствора-цитрата натрия (SSC) (0,75 М хлорид натрия/0,075 М цитрат натрия) в течение 1 часа при 40°С, с последующей промывкой образца 10 раз в 1× SSC при 40°С и 5 раз в 1× буфере SSC при комнатной температуре. Условия гибридизации in vivo заключаются во внутриклеточных условиях (например, физиологический рН и внутриклеточные ионные условия), которые управляют гибридизацией атисмысловых олигонуклеотидов с последовательностями-мишенями. Условия in vivo могут имитироваться in vitro посредством условий относительно низкой жесткости. Например, гибридизация может проводиться in vitro в 2× SSC (0,3 М хлорид натрия/0,03 М цитрат натрия), 0,1% SDS (додецилсульфат натрия) при 37°С. Промывочный раствор, содержащий 4× SSC, 0,1% SDS, можно использовать при 37°C с последней промывкой в 1× SSC при 45°С.

II.В. Последовательности ASO

ASO по данному раскрытию содержат непрерывную нуклеотидную последовательность, которая соответствует комплементарной цепи области транскрипта SNCA, например, нуклеотидной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 1.

В некоторых воплощениях в данном раскрытии предложен ASO, который содержит непрерывную нуклеотидную последовательность всего из 10-30 нуклеотидов, как, например, 10-25 нуклеотидов, как, например, 16-22, как, например, 10-20 нуклеотидов, как, например, 14-20 нуклеотидов, как, например, 17-20 нуклеотидов, как, например, 10-15 нуклеотидов, как, например, 12-14 нуклеотидов в длину, где данная непрерывная нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере примерно 85%-ную, по меньшей мере примерно 90%-ную, по меньшей мере примерно 95%-ную, по меньшей мере примерно 98%-ную или по меньшей мере примерно 99%-ную идентичность последовательности с областью в пределах комплементарной цепи транскрипта SNCA млекопитающего, такой как SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, или ее встречающийся в природе вариант (SEQ ID NO: 3, 4 или 5). Таким образом, например, ASO гибридизуется с одноцепочечной молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность SEQ ID NO: 1-5 или ее часть.

В некоторых воплощениях данный олигонуклеотид содержит непрерывную последовательность из 10-30 нуклеотидов, как, например, 10-25 нуклеотидов, как, например, 16-22, как, например, 10-20 нуклеотидов, как, например, 14-20 нуклеотидов, как, например, 17-20 нуклеотидов, как, например, 10-15 нуклеотидов, как, например, 12-14 нуклеотидов в длину, которая имеет по меньшей мере 90%-ную комплементарность, как, например, по меньшей мере 91%-ную, как, например, по меньшей мере 92%-ную, как, например, по меньшей мере 93%-ную, как, например, по меньшей мере 94%-ную, как, например, по меньшей мере 95%-ную, как, например, по меньшей мере 96%-ную, как, например, по меньшей мере 97%-ную, как, например, по меньшей мере 98%-ную или 100%-ную комплементарность с областью транскрипта SNCA млекопитающего, такой как SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 и/или 5.

ASO может содержать непрерывную нуклеотидную последовательность, которая является полностью комплементарной (совершенно комплементарной) эквивалентной области нуклеиновой кислоты-мишени, которая кодирует белок SNCA млекопитающего (например, SEQ ID NO: 1-5). Данный ASO может содержать непрерывную нуклеотидную последовательность, которая является полностью комплементарной (совершенно комплементарной) последовательности нуклеиновой кислоты-мишени или области в пределах данной последовательности, такой как область интрона, соответствующей нуклеотидам X-Y SEQ ID NO: 1, где X и Y представляют собой сайт начала пре-мРНК и сайт конца пре-мРНК NG_011851.1 соответственно. Примеры таких областей перечислены в разделе II.А «Мишень». Кроме того, данный ASO может иметь конструкцию, описанную в данном документе в других местах (например, раздел II.С, например, конструкция гэпмера, например, конструкция гэпмера с флангами с чередованием), или химическую структуру, показанную в данном документе в других местах (например, ФИГ. 1А-1С и 2). В некоторых воплощениях ASO содержит непрерывную нуклеотидную последовательность, которая является полностью комплементарной (совершенно комплементарной) последовательности нуклеиновой кислоты-мишени или области в пределах данной последовательности, соответствующей нуклеотидам X-Y SEQ ID NO: 2, где X и Y представляют собой сайт начала мРНК и сайт конца мРНК соответственно. Примеры таких областей перечислены в разделе II.А «Мишень». В других воплощениях ASO содержит непрерывную нуклеотидную последовательность, которая является полностью комплементарной (совершенно комплементарной) последовательности нуклеиновой кислоты-мишени или области в пределах данной последовательности, соответствующей нуклеотидам X-Y SEQ ID NO: 3, где X и Y представляют собой сайт начала мРНК и сайт конца мРНК соответственно. Примеры таких областей перечислены в разделе II.А «Мишень». В других воплощениях данный ASO содержит непрерывную нуклеотидную последовательность, которая является полностью комплементарной (совершенно комплементарной) последовательности нуклеиновой кислоты-мишени или области в пределах данной последовательности, соответствующей нуклеотидам X-Y SEQ ID NO: 4, где X и Y представляют собой сайт начала мРНК и сайт конца мРНК соответственно. Примеры таких областей перечислены в разделе II.А «Мишень». В других воплощениях данный ASO содержит непрерывную нуклеотидную последовательность, которая является полностью комплементарной (совершенно комплементарной) последовательности нуклеиновой кислоты-мишени или области в пределах данной последовательности, соответствующей нуклеотидам X-Y SEQ ID NO: 5, где X и Y представляют собой сайт начала мРНК и сайт конца мРНК соответственно. Примеры таких областей перечислены в разделе II.А «Мишень».

В некоторых воплощениях нуклеотидная последовательность ASO по данному раскрытию или данная непрерывная нуклеоидная последовательность имеет по меньшей мере примерно 80%-ную идентичность последовательности относительно последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 7-1878 (т.е. последовательностям на ФИГ. 1А-1С и 2), как, например, по меньшей мере примерно 85%-ную, по меньшей мере примерно 90%-ную, по меньшей мере примерно 91%-ную, по меньшей мере примерно 92%-ную, по меньшей мере примерно 93%-ную, по меньшей мере примерно 94%-ную, по меньшей мере примерно 95%-ную, по меньшей мере примерно 96%-ную идентичность последовательности, по меньшей мере примерно 97%-ную идентичность последовательности, по меньшей мере примерно 98%-ную идентичность последовательности, по меньшей мере примерно 99%-ную идентичность последовательности, как, например, примерно 100%-ную идентичность последовательности (гомологичная). В некоторых воплощениях ASO имеет конструкцию, описанную в данном документе в других местах (например, раздел II.G.I, например, конструкция гэпмера, например, конструкция гэпмера с флангами с чередованием), или химическую структуру нуклеозидов, показанную в данном документе в других местах (например, ФИГ. 1А-1С и 2).

В некоторых воплощениях нуклеотидная последовательность ASO по данному раскрытию или данная непрерывная нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере примерно 80%-ную идентичность последовательности относительно последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 1302 или SEQ ID NO: 1309-1353, как, например, по меньшей мере примерно 85%-ную, по меньшей мере примерно 90%-ную, по меньшей мере примерно 91%-ную, по меньшей мере примерно 92%-ную, по меньшей мере примерно 93%-ную, по меньшей мере примерно 94%-ную, по меньшей мере примерно 95%-ную, по меньшей мере примерно 96%-ную идентичность последовательности, по меньшей мере примерно 97%-ную идентичность последовательности, по меньшей мере примерно 98%-ную идентичность последовательности, по меньшей мере примерно 99%-ную идентичность последовательности, как, например, примерно 100%-ную идентичность последовательности (гомологичная). В некоторых воплощениях ASO имеет конструкцию, описанную в данном документе в других местах (например, раздел II.G.I, например, конструкция гэпмера, например, конструкция гэпмера с флангами с чередованием), или химическую структуру нуклеозидов, показанную в данном документе в других местах (например, ФИГ. 1А-1С и 2).

В другом воплощении нуклеотидная последовательность ASO по данному раскрытию или данная непрерывная нуклеотидная последовательность состоит из последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 1302 или SEQ ID NO: 1309-1353.

В одном воплощении нуклеотидная последовательность ASO по данному раскрытию или данная непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 276; 278; 296; 295; 325; 328; 326; 329; 330; 327; 332; 333; 331; 339; 341; 390; 522 и 559.

В некоторых воплощениях ASO по данному раскрытию содержит по меньшей мере один ASO с конструкцией (например, номером DES), раскрытой на ФИГ. 1А-1С и 2. В некоторых воплощениях ASO по данному раскрытию содержит по меньшей мере один ASO с конструкцией (например, номером DES), раскрытой на ФИГ. 1А-1С и 2, где данный ASO короче на 3'-конце на один нуклеотид, два нуклеотида, три нуклеотида или четыре нуклеотида, чем ASO, раскрытые на ФИГ. 1А-1С и 2. В других воплощениях ASO по данному раскрытию содержит по меньшей мере один ASO с конструкцией (например, номером DES), раскрытой на ФИГ. 1А-1С и 2, где данный ASO короче на 5'-конце на один нуклеотид, два нуклеотида, три нуклеотида или четыре нуклеотида, чем ASO, раскрытые на ФИГ. 1А-1С и 2. В других воплощениях ASO по данному раскрытию содержит по меньшей мере один ASO с конструкцией (например, номером DES), раскрытой на ФИГ. 1А-1С и 2, где данный ASO короче на 5'-конце и/или 3'-конце на один нуклеотид, два нуклеотида, три нуклеотида или четыре нуклеотида, чем ASO, раскрытые на ФИГ. 1А-1С и 2.

В одном воплощении данная непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности и конструкции, выбранной из группы, состоящей из:

TTCtctatataacatCACT (SEQ ID NO: 276)

TTTCtctatataacaTCAC (SEQ ID NO: 278);

AACTtttacataccACAT (SEQ ID NO: 296);

AACTtttacataccaCATT (SEQ ID NO: 295);

ATTAttcatcacaatCCA (SEQ ID NO: 325);

ATTAttcatcacaATCC (SEQ ID NO: 328);

CattattcatcacaaTCCA (SEQ ID NO: 326);

CATtattcatcacaATCC (SEQ ID NO: 329);

ACAttattcatcacaaTCC (SEQ ID NO: 330);

AcattattcatcacaaTCCA (SEQ ID NO: 327);

ACATtattcatcacAATC (SEQ ID NO: 332);

TACAttattcatcacAATC (SEQ ID NO: 333);

TAcattattcatcacaaTCC (SEQ ID NO: 331);

TTCaacatttttatttCACA (SEQ ID NO: 339);

ATTCaacatttttattTCAC (SEQ ID NO: 341);

ACTAtgatacttcACTC (SEQ ID NO: 390);

ACACattaactactCATA (SEQ ID NO: 522) и

GTCAaaatattcttaCTTC (SEQ ID NO: 559),

где заглавные буквы обозначают нуклеозидный аналог с модифицированным сахаром, а строчные буквы обозначают ДНК.

В других воплощениях ASO по данному раскрытию содержит по меньшей мере один ASO с химической структурой (например, номером ASO), раскрытым на ФИГ. 1А-1С и 2. В некоторых воплощениях ASO по данному раскрытию содержит по меньшей мере один ASO с химической структурой (например, номером ASO), раскрытой на ФИГ. 1А-1С и 2, где данный ASO короче на 3'-конце на один нуклеотид, два нуклеотида, три нуклеотида или четыре нуклеотида, чем ASO, раскрытые на ФИГ. 1А-1С и 2. В других воплощениях ASO по данному раскрытию содержит по меньшей мере один ASO с химической структурой (например, номером ASO), раскрытой на ФИГ. 1А-1С и 2, где данный ASO короче на 5'-конце на один нуклеотид, два нуклеотида, три нуклеотида или четыре нуклеотида, чем ASO, раскрытые на ФИГ. 1А-1С и 2. В других воплощениях ASO по данному раскрытию содержит по меньшей мере один ASO с химической структурой (например, номером ASO), раскрытой на ФИГ. 1А-1С и 2, где данный ASO короче на 5'-конце и/или 3'-конце на один нуклеотид, два нуклеотида, три нуклеотида или четыре нуклеотида, чем ASO, раскрытые на ФИГ. 1А-1С и 2.

В некоторых воплощениях ASO (или его непрерывная нуклеотидная часть) выбран из или содержит одну из последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7-1878, и область из по меньшей мере ее 10 смежных нуклеотидов, где данный ASO (или его непрерывная нуклеотидная часть) возможно может содержать одно, два, три или четыре несоответствия по сравнению с соответствующим транскриптом SNCA. Полезно, если имеется не больше чем 1 несоответствие или не больше чем 2 несоответствия.

В некоторых воплощениях ASO (или его непрерывная нуклеотидная часть) выбран из или содержит одну из последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 1302 или SEQ ID NO: 1309-1353 и области из по меньшей мере их 10 смежных нуклеотидов, где данный ASO (или его непрерывная нуклеотидная часть) возможно может содержать одно, два, три или четыре несоответствия по сравнению с соответствующим транскриптом SNCA. Полезно, если имеется не больше чем 1 несоответствие или не больше чем 2 несоответствия.

В одном воплощении данный ASO содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1436 (последовательность ASO-003092) и SEQ ID NO: 1547 (последовательность ASO-003179)).

В другом воплощении данный ASO содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из ASO-008387; ASO-008388; ASO-008501; ASO-008502; ASO-008529; ASO-008530; ASO-008531; ASO-008532; ASO-008533; ASO-008534; ASO-008535; ASO-008536; ASO-008537; ASO-008543; ASO-008545; ASO-008584; ASO-008226 и ASO-008261.

В некоторых воплощениях ASO по данному раскрытию связывается с последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени (например, транскрипт SNCA) и способен ингибировать или уменьшать экспрессию транскрипта SNCA по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 60%, по меньшей мере примерно на 70%, по меньшей мере примерно на 80%, по меньшей мере примерно на 90% или примерно на 100% в ткани (например, области мозга) мыши, экспрессирующей человеческий ген SNCA (например, А53Т-РАС), при введении in vivo в дозах 3,13 мкг, 12,5 мкг, 25 мкг, 50 мкг или 100 мкг по сравнению с контролем (например, внутренним контролем, таким как GAPDH (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа) или тубулин, или мышь, которой вводили один контроль в виде носителя), при измерении посредством анализа, например, количественной ПЦР (полимеразная цепная реакция) или анализа QUANTIGENE^®, раскрытого в данном документе.

В некоторых воплощениях ASO по данному раскрытию способен уменьшать экспрессию белка SNCA по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 60%, по меньшей мере примерно на 70%, по меньшей мере примерно на 80%, по меньшей мере примерно на 90% или примерно на 100% в ткани (например, области мозга) мыши, экспрессирующей человеческий ген SNCA (например, А53Т-РАС), при введении in vivo в дозах 3,13 мкг, 12,5 мкг, 25 мкг, 50 мкг или 100 мкг по сравнению с контролем (например, внутренним контролем, таким как GAPDH или тубулин, или мышь, которой вводили один контроль в виде носителя), при измерении посредством анализа, например, анализа высокого содержания, раскрытого в данном документе (см. Пример 2А).

В некоторых воплощениях ASO по данному раскрытию связывается с последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени (например, транскрипт SNCA) и способен ингибировать или уменьшать экспрессию транскрипта SNCA по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 60%, по меньшей мере примерно на 70%, по меньшей мере примерно на 80%, по меньшей мере примерно на 90% или примерно на 100% в ткани (например, области мозга) яванского макака, экспрессирующего ген SNCA дикого типа, при введении один или два раза in vivo в дозах 4 мг, 8 мг или 16 мг по сравнению с контролем (например, внутренний контроль, такой как GAPDH или тубулин, или яванский макак, которому вводили один контроль в виде носителя), при измерении посредством анализа, например, количественной ПЦР или анализа QUANTIGENE^®, раскрытого в данном документе.

В некоторых воплощениях ASO по данному раскрытию способен уменьшать экспрессию белка SNCA по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 60%, по меньшей мере примерно на 70%, по меньшей мере примерно на 80%, по меньшей мере примерно на 90% или примерно на 100% в ткани (например, области мозга) яванского макака, экспрессирующего ген SNCA дикого типа, при введении один или два раза in vivo в дозах 4 мг, 8 мг или 16 мг по сравнению с контролем (например, внутренний контроль, такой как GAPDH или тубулин, или яванский макак, которому вводили один контроль в виде носителя), при измерении посредством анализа, например, анализа высокого содержания, раскрытого в данном документе (см. Пример 2А).

В других воплощениях ASO по данному раскрытию способен уменьшать экспрессию мРНК SNCA in vitro по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 60%, по меньшей мере примерно на 70%, по меньшей мере примерно на 80%, по меньшей мере примерно на 90% или примерно на 100% в мышиных первичных нейронах, экспрессирующих полноразмерный человеческий ген SNCA (например, нейроны РАС), при нахождении данных нейронов в контакте с 5 мкМ, 3,3 мкМ, 1 мкМ, 4 нМ, 40 нМ или 200 нМ антисмыслового олигонуклеотида по сравнению с контролем (например, внутренний контроль, такой как GAPDH или тубулин, или мышиные первичные нейроны, экспрессирующие полноразмерный человеческий ген SNCA, в контакте с одним физиологическим раствором), при измерении посредством анализа, например, анализа QUANTIGENE^®, раскрытого в данном документе.

В других воплощениях ASO по данному раскрытию способен уменьшать экспрессию белка SNCA in vitro по меньшей мере примерно на 60%, по меньшей мере примерно на 70%, по меньшей мере примерно на 80%, по меньшей мере примерно на 90% или по меньшей мере примерно на 95% в мышиных первичных нейронах, экспрессирующих полноразмерный человеческий ген SNCA (например, нейроны РАС), при нахождении данных нейронов в контакте с 5 мкМ, 3,3 мкМ, 1 мкМ, 4 нМ, 40 нМ или 200 нМ антисмыслового олигонуклеотида по сравнению с контролем (например, внутренний контроль, такой как GAPDH или тубулин, или мышиные первичные нейроны, экспрессирующие полноразмерный человеческий ген SNCA, в контакте с одним физиологическим раствором), при измерении посредством анализа, например, анализа высокого содержания, раскрытого в данном документе (см. Пример 2А).

В некоторых воплощениях ASO по данному раскрытию способен уменьшать экспрессию мРНК SNCA in vitro по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 60%, по меньшей мере примерно на 70%, по меньшей мере примерно на 80%, по меньшей мере примерно на 90% или примерно на 100% в линии клеток человеческой нейробластомы (например, SK-N-BE(2)), экспрессирующей полноразмерный человеческий ген SNCA, при нахождении данных клеток нейробластомы в контакте с 25 мкМ антисмыслового олигонуклеотида по сравнению с контролем (например, внутренний контроль, такой как GAPDH или тубулин, или клетки нейробластомы, экспрессирующие полноразмерный человеческий ген SNCA, находящиеся в контакте с одним физиологическим раствором), при измерении посредством анализа, например, количественной ПЦР, раскрытой в данном документе.

В некоторых воплощениях ASO, раскрытый в данном документе, способен уменьшать экспрессию белка SNCA in vitro по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 60%, по меньшей мере примерно на 70%, по меньшей мере примерно на 80%, по меньшей мере примерно на 90% или примерно на 100% в линии клеток человеческой нейробластомы (например, SK-N-BE(2)), экспрессирующей полноразмерный человеческий ген SNCA, при нахождении данных клеток нейробластомы в контакте с 25 мкМ антисмыслового олигонуклеотида по сравнению с контролем (например, внутренний контроль, такой как GAPDH или тубулин, или клетки нейробластомы, экспрессирующие полноразмерный человеческий ген SNCA, находящиеся в контакте с одним физиологическим раствором), при измерении посредством анализа, например, анализа высокого содержания, раскрытого в данном документе (см. Пример 2А).

В некоторых воплощениях ASO по данному раскрытию связывается с транскриптом SNCA и ингибирует или уменьшает экспрессию мРНК SNCA по меньшей мере примерно на 10% или примерно на 20% по сравнению с нормальным (т.е. контрольным) уровнем экспрессии в клетке, например, по меньшей мере примерно на 30%, примерно на 40%, примерно на 50%, примерно на 60%, примерно на 70%, примерно на 80%, примерно на 90% или примерно на 95% по сравнению с нормальным уровнем экспрессии (таким как уровень экспрессии в отсутствие ASO или конъюгата(тов)) в клетке. В некоторых воплощениях ASO уменьшает экспрессию белка SNCA в клетке после введения ASO по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90% по сравнению с клеткой, не подвергавшейся воздействию ASO (т.е. контролем). В некоторых воплощениях ASO уменьшает экспрессию белка SNCA в клетке после введения данного ASO по меньшей мере примерно на 60%, по меньшей мере примерно на 70%, по меньшей мере примерно на 80% или по меньшей мере примерно на 90% по сравнению с клеткой, не подвергавшейся воздействию ASO (т.е. контролем).

В некоторых воплощениях ASO по данному раскрытию имеет по меньшей мере одно свойство, выбранное из следующих: (1) уменьшает экспрессию мРНК SNCA в клетке по сравнению с контрольной клеткой, которая не подвергалась воздействию ASO; (2) значимо не уменьшает колебания уровня кальция в клетке; (3) значимо не уменьшает интенсивность тубулина в клетке; (4) уменьшает экспрессию белка α-Syn в клетке и (5) их любые комбинации по сравнению с контрольной клеткой, которая не подвергалась воздействию ASO.

В некоторых воплощениях ASO по данному раскрытию значимо не уменьшает колебания уровня кальция в клетке, например, в нейронах. Если ASO значимо не уменьшает колебания уровня кальция в клетке, данное свойство ASO соответствует пониженной нейротоксичности ASO. В некоторых воплощениях колебания уровня кальция больше чем или равны 95%, больше чем или равны 90%, больше чем или равны 85%, больше чем или равны 80%, больше чем или равны 75%, больше чем или равны 70%, больше чем или равны 65%, больше чем или равны 60%, больше чем или равны 55% или больше чем или равны 50% колебаний в клетке, не подвергавшейся воздействию ASO.

Колебания уровня кальция важны для правильных функций нейронов. Было показано то, что сети кортикальных нейронов претерпевают спонтанные колебания уровня кальция, приводящие к высвобождению нейромедиатора глутамата. Колебания уровня кальция также регулируют взаимодействия нейронов с ассоциированной глией, помимо других ассоциированных нейронов в сети, с высвобождением других нейромедиаторов помимо глутамата. Регулируемые колебания уровня кальция требуются для гомеостаза нейронных сетей для нормальной функции мозга. (См. Shashank et al., Brain Research, 1006(1): 8-17 (2004); Rose et al., Nature Neurosci, 4:773-774 (2001); Zonta et al., J Physiol Paris., 96(3-4):193-8 (2002); Pasti et al., J. Neurosci., 21(2): 477-484 (2001).) Глутамат также активирует два отличных ионных канала: рецепторы α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты (АМРА) и рецепторы N-метил-D-аспартата (NMDA).

В некоторых воплощениях колебания уровня кальция, измеренные в настоящих способах, представляют собой АМРА-зависимые колебания уровня кальция. В некоторых воплощениях колебания уровня кальция представляют собой NMDA-зависимые колебания уровня кальция. В некоторых воплощениях колебания уровня кальция представляют собой колебания уровня кальция, зависимые от гамма-аминомасляной кислоты (GABA). В некоторых воплощениях колебания уровня кальция представляют собой комбинацию двух или более чем двух АМРА-зависимых, NMDA-зависимых или GABA-зависимых колебаний уровня кальция.

В некоторых воплощениях колебания уровня кальция, измеренные в настоящих способах, представляют собой АМРА-зависимые колебания уровня кальция. Для того чтобы измерить АМРА-зависимые колебания уровня кальция, колебания уровня кальция можно измерять в присутствии ионов Mg²⁺ (например, MgCl₂). В некоторых воплощениях данный способ дополнительно включат добавление ионов Mg²⁺ (например, MgCl₂) в количестве, которое обеспечивает выявление АМРА-зависимых колебаний уровня кальция. В некоторых воплощениях эффективная концентрация иона, обеспечивающая выявление АМРА-зависимых колебаний уровня кальция, составляет по меньшей мере примерно 0,5 мМ. В других воплощениях эффективная концентрация иона для индукции АМРА-зависимых колебаний уровня кальция составляет по меньшей мере примерно 0,6 мМ, по меньшей мере примерно 0,7 мМ, по меньшей мере примерно 0,8 мМ, по меньшей мере примерно 0,9 мМ, по меньшей мере примерно 1 мМ, по меньшей мере примерно 1,5 мМ, по меньшей мере примерно 2,0 мМ, по меньшей мере примерно 2,5 мМ, по меньшей мере примерно 3,0 мМ, по меньшей мере примерно 4 мМ, по меньшей мере примерно 5 мМ, по меньшей мере примерно 6 мМ, по меньшей мере примерно 7 мМ, по меньшей мере примерно 8 мМ, по меньшей мере примерно 9 мМ или по меньшей мере примерно 10 мМ. В конкретном воплощении полезная для данных способов концентрация ионов Mg²⁺ (например, MgCl₂) составляет 1 мМ. В некоторых воплощениях полезная для настоящих способов концентрация ионов Mg²⁺ (например, MgCl₂) составляет от примерно 1 мМ до примерно 10 мМ, от примерно 1 мМ до примерно 15 мМ, от примерно 1 мМ до примерно 20 мМ, от примерно 1 мМ до примерно 25 мМ. Ионы Mg²⁺ можно добавлять добавлением солей магния, таких как карбонат магния, хлорид магния, цитрат магния, гидроксид магния, оксид магния, сульфат магния и сульфат магния гептагидрат.

В некоторых воплощениях колебания уровня кальция измеряются в настоящем способе посредством применения флуоресцентных зондов, которые выявляют флуктуации внутриклеточных уровней кальция. Например, выявление внутриклеточного потока кальция может достигаться окрашиванием клеток флуоресцентными красителями, которые связываются с ионами кальция (известны как флуоресцентные индикаторы кальция) с возникающим в результате выявляемым изменением флуоресценции (например, красители Fluo-4 AM и Fura Red AM, доступные от Molecular Probes. Eugene, OR, Соединенные Штаты Америки).

В других воплощениях ASO по данному раскрытию значимо не снижают интенсивность тубулина в клетке. В некоторых воплощениях интенсивность тубулина больше чем или равна 95%, больше чем или равна 90%, больше чем или равна 85%, больше чем или равна 80%, больше чем или равна 75%, больше чем или равна 70%, больше чем или равна 65%, больше чем или равна 60%, больше чем или равна 55% или больше чем или равна 50% интенсивности тубулина в клетке, не подвергавшейся воздействию ASO (или подвергавшейся воздействию физиологического раствора).

В некоторых воплощениях такое свойство наблюдается при использовании от 0,04 нМ до 400 мкМ концентрации ASO по данному раскрытию. В том же самом или другом воплощении ингибирование или уменьшение экспрессии мРНК SNCA и/или белка SNCA в клетке приводит к меньше чем 100%, как, например, меньше чем 98%, меньше чем 95%, меньше чем 90%, меньше чем 80%, как, например, меньше чем 70% уровней мРНК или белка по сравнению с клетками, не подвергавшимися воздействию ASO. Модуляция уровня экспрессии может определяться посредством измерения уровней белка SNCA, например, такими способами, как SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия), с последующим вестерн-блоттингом с использованием подходящих антител, индуцированных против белка-мишени. В качестве альтернативы, модуляция уровней экспрессии может определяться посредством измерения уровней мРНК SNCA, например, норзерн-блоттингом или количественной ПЦР-ОТ (полимеразная цепная реакция, сопряженная с обратной транскрипцией). При измерении ингибирования посредством уровней мРНК уровень понижающей регуляции, при использовании подходящей дозировки, как, например, концентрации от примерно 0,04 нМ до примерно 400 мкМ, составляет в некоторых воплощениях типично уровень от примерно 10-20% нормальных уровней в клетке в отсутствие ASO.

В некоторых воплощениях ASO по данному раскрытию имеет переносимость in vivo, меньшую чем или равную общему баллу 4, где данный общий балл представляет собой сумму единичных баллов пяти категорий, которые представляют собой: 1) гиперактивность; 2) пониженную активность и возбуждение; 3) моторную дисфункцию и/или атаксию; 4) ненормальное положение и дыхание; и 5) дрожь и/или судороги, и где единичый балл для каждой категории измеряется по шкале 0-4. В некоторых воплощениях переносимость in vivo меньше, чем или равна общему баллу 3, общему баллу 2, общему баллу 1 или общему баллу 0. В некотором воплощении оценка переносимости in vivo определяется, как описано в примерах, приведенных ниже.

В некоторых воплощениях данный ASO может переносить 1, 2, 3 или 4 (или более) несоответствий при гибридизации с последовательностью-мишенью и все еще достаточно связывается с мишенью для демонстрации желательного эффекта, т.е. понижающей регуляции мРНК- и/или белка-мишени. Несоответствия, например, могут компенсироваться увеличенной длиной нуклеотидной последовательности ASO и/или увеличенным числом нуклеотидных аналогов, которые раскрываются в данном документе в других местах.

В некоторых воплощениях ASO по данному раскрытию содержит не больше чем 3 несоответствия при гибридизации с последовательностью-мишенью. В других воплощениях непрерывная нуклеотидная последовательность содержит не больше чем 2 несоответствия при гибридизации с последовательностью-мишенью. В других воплощениях непрерывная нуклеотидная последовательность содержит не больше чем 1 несоответствие при гибридизации с последовательностью-мишенью.

В некоторых воплощениях ASO согласно данному раскрытию содержит нуклеотидную последовательность или область в пределах данной последовательности согласно любой из SEQ ID NO: 7-1878, последовательности ASO с конструкцией, как описано на ФИГ. 1А-1С и 2, и последовательность ASO с химической структурой, как описано на ФИГ. 1А-1С и 2.

Однако понятно то, что в некоторых воплощениях нуклеотидная последовательность ASO может содержать дополнительные 5' или 3' нуклеотиды, как, например, 1-5, как, например, 2-3 дополнительных нуклеотида, как, например, независимо, 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных нуклеотидов. Данные дополнительные 5' и/или 3' нуклеотиды предпочтительно не являются комплементарными последовательности-мишени. В этом отношении ASO по данному раскрытию в некоторых воплощениях может содержать непрерывную нуклеотидную последовательность, которая фланкирована 5' и/или 3' дополнительными нуклеотидами. В некоторых воплощениях дополнительные 5' и/или 3' нуклеотиды представляют собой встречающиеся в природе нуклеотиды, такие как ДНК или РНК. В другом воплощении встречающиеся в природе нуклеотиды на 5'- или 3'-конце связываются фосфодиэфирными (РО) межнуклеотидными связями. Такие концевые РО связи являются расщепляемыми нуклеазами при поступлении в клетку-мишень, также называются биорасщепляемыми линкерами и подробно описываются в WO 2014/076195.

В некоторых воплощениях ASO по данному раскрытию имеет балл последовательности, больший или равный 0,2, где данный балл последовательности рассчитывается по формуле I:

В других воплощениях ASO по данному раскрытию имеет балл последовательности, больший чем или равный 0,2, где данный балл последовательности рассчитывается по формуле IA:

В данных воплощениях балл последовательности, больший чем или равный значению отсечения, соответствует пониженной нейротоксичности ASO.

В некоторых воплощениях ASO по данному раскрытию имеет балл последовательности, больший чем или равный примерно 0,1; 0,2; 0,25; 0,3; 0,35; 0,4; 0,45; 0,5; 0,55; 0,6; 0,65; 0,7; 0,75; 0,8; 0,85; 0,9; 0,95 или 1,0.

В одном воплощении ASO по данному раскрытию содержит непрерывную нуклеотидную последовательность, гибридизующуюся с некодирующей областью транскрипта SNCA, где балл последовательности ASO больше, чем или равен примерно 0,1; 0,2; 0,25; 0,3; 0,35; 0,4; 0,45; 0,5; 0,55; 0,6; 0,65; 0,7; 0,75; 0,8; 0,85; 0,9; 0,95 или 1,0.

В другом воплощении ASO по данному раскрытию содержит непрерывную нуклеотидную последовательность, гибридизующуюся с областью интрона транскрипта SNCA, где балл последовательности ASO больше, чем или равен примерно 0,1; 0,2; 0,25; 0,3; 0,35; 0,4; 0,45; 0,5; 0,55; 0,6; 0,65; 0,7; 0,75; 0,8; 0,85; 0,9; 0,95 или 1,0.

В другом воплощении ASO по данному раскрытию содержит непрерывную нуклеотидную последовательность, гибридизующуюся с соединением интрон-экзон транскрипта SNCA, где балл последовательности ASO больше, чем или равен примерно 0,1; 0,2; 0,25; 0,3; 0,35; 0,4; 0,45; 0,5; 0,55; 0,6; 0,65; 0,7; 0,75; 0,8; 0,85; 0,9; 0,95 или 1,0.

Во всех данных воплощениях, когда балл последовательности больше, чем или равен значению отсечения, считается, что ASO имеет пониженную нейротоксичность.

II.С. Длина ASO

Данные ASO могут содержать непрерывную нуклеотидную последовательность всего из 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 смежных нуклеотидов в длину.

В некоторых воплощениях данные ASO содержат непрерывную нуклеотидную последовательность всего из примерно 10-22, как, например, 10-21, как, например, 12-20, как, например, 15-20, как, например, 17-20, как, например, 12-18, как, например, 13-17 или 12-16, как, например, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 смежного нуклеотида в длину.

В некоторых воплощениях данные ASO содержат непрерывную нуклеотидную последовательность всего из 10, 11, 12, 13 или 14 смежных нуклеотидов в длину.

В некоторых воплощениях данные ASO содержат непрерывную нуклеотидную последовательность всего из 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеотидов в длину.

В некоторых воплощениях ASO согласно данному раскрытию состоит из не более чем 22 нуклеотидов, как, например, не более чем 21 или 20 нуклеотидов, как, например, не более чем 18 нуклеотидов, как, например, 15, 16 или 17 нуклеотидов. В некоторых воплощениях ASO по данному раскрытию содержит меньше, чем 22 нуклеотида. Следует понимать то, что когда для ASO приводится интервал или длина непрерывной нуклеотидной последовательности, данный интервал включает наименьшую и наибольшую длину, приведенную в данном интервале, например, от (или между) 10-30 и включает и 10, и 30.

II.D. Нуклеозиды и нуклеозидные аналоги

В одном аспекте данного раскрытия ASO содержат один или более чем один не встречающийся в природе нуклеотидный аналог. «Нуклеотидные аналоги» в том виде, в котором данный термин используется в данном документе, представляют собой варианты природных нуклеотидов, таких как нуклеотиды ДНК или РНК, посредством модификаций в группировках сахара и/или основания. Аналоги, в принципе, могли бы быть просто «молчащими» или «эквивалентными» природным нуклеотидам в контексте олигонуклеотида, т.е. не имеют функционального влияния на способ, каким работает олигонуклеотид по ингибированию экспрессии гена-мишени. Такие «эквивалентные» аналоги, тем не менее, могут быть полезными, если, например, их легче или дешевле изготовлять, или они являются более стабильными при хранении или в условиях изготовления, или представляют собой метку. В некоторых воплощениях, однако, данные аналоги будут иметь функциональное влияние на способ, которым работает ASO по ингибированию экспрессии; например, посредством получения повышенной аффинности связывания с мишенью и/или повышенной устойчивости к внутриклеточным нуклеазам, и/или увеличенной легкости транспорта в клетку. Конкретные примеры нуклеозидных аналогов описываются, например, Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 и Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213, и иллюстрируются в разделе II.D.a и на Схеме 1 (раздел IID.2b).

II.D.1. Нуклеиновое основание

Термин «нуклеиновое основание» включает пуриновую (например, аденин и гуанин) и пиримидиновую (например, урацил, тимин и цитозин) группировку, присутствующую в нуклеозидах и нуклеотидах, которые образуют водородные связи при гибридизации нуклеиновых кислот. В контексте настоящего изобретения термин нуклеиновое основание также охватывает модифицированные нуклеиновые основания, которые могут отличаться от встречающихся в природе нуклеиновых оснований, но являются функциональными во время гибридизации нуклеиновых кислот. В некоторых воплощениях группировка нуклеинового основания модифицируется посредством модификации или замены нуклеинового основания. В данном контексте термин «нуклеиновое основание» относится и к встречающимся в природе нуклеиновым основаниям, таким как аденин, гуанин, цитозин, тимин, урацил, ксантин и гипоксантин, также как и к не встречающимся в природе вариантам. Такие варианты, например, описываются в Hirao et al. (2012) Accounts of Chemical Research, том 45, страница 2055 и Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1.

В некоторых воплощениях группировка нуклеинового основания модифицируется заменой пурина или пиримидина на модифицированный пурин или пиримидин, такой как замещенный пурин или замещенный пиримидин, как, например, нуклеиновое основание, выбранное из изоцитозина, псевдоизоцитозина, 5-метилцитозина, 5-тиозолоцитозина, 5-пропинилцитозина, 5-пропинилурацила, 5-бромурацил-5-тиазолоурацила, 2-тиоурацила, 2'-тиотимидина, инозина, диаминопурина, 6-аминопурина, 2-аминопурина, 2,6-диаминопурина и 2-хлор-6-аминопурина.

Группировки нуклеиновых оснований могут быть указаны буквенным кодом для каждого соответствующего нуклеинового основания, например, А, Т, G, С или U, где каждая буква возможно может включать модифицированные нуклеиновые основания с эквивалентной функцией. Например, в проиллюстрированных в качестве примеров олигонуклеотидах группировки нуклеиновых оснований выбраны из А, Т, G, С и 5-метилцитозина. Возможно для гэпмеров LNA можно использовать нуклеозиды 5-метилцитозин LNA (МС).

II.D.2. Модификация сахара

ASO по данному раскрытию может содержать один или более чем один нуклеозид, который имеет модифицированную сахарную группировку, т.е. модификацию сахарной группировки по сравнению с рибозной сахарной группировкой, находящейся в ДНК и РНК. Были получены многочисленные нуклеозиды с модификацией рибозной сахарной группировки, главным образом, с целью улучшения определенных свойств олигонуклеотидов, таких как аффинность и/или нуклеазоустойчивость.

Такие модификации включают модификации, где модифицируется структура рибозного кольца, например, посредством замены на гексозное кольцо (HNA) или бициклическое кольцо, которое типично имеет бирадикальный мостик между углеродами С2' и С4' на рибозном кольце (LNA), или на несвязанное рибозное кольцо, у которого типично отсутствует связь между углеродами С2' и С3' (например, UNA). Другие нуклеозиды с модифицированным сахаром включают, например, бициклогексозные нуклеиновые кислоты (WO 2011/017521) или трициклические нуклеиновые кислоты (WO 2013/154798). Модифицированные нуклеозиды также включают нуклеозиды, где сахарная группировка заменяется на несахарную группировку, например, в случае пептидных нуклеиновых кислот (PNA) или морфолинонуклеиновых кислот.

Модификации Сахаров также включают модификации, сделанные посредством изменения замещающих групп на рибозном кольце на группы, отличные от водорода или групп 2'-ОН, находящихся в природе в нуклеозидах РНК. Заместители, например, можно вводить в 2'-, 3'-, 4'- или 5'-положения. Нуклеозиды с модифицированными сахарными группировками также включают 2'-модифицированные нуклеозиды, такие как 2'-замещенные нукеозиды. В самом деле, было потрачено много внимания на разработку 2'-замещенных нуклеозидов, и обнаружили то, что многие 2'-замещенные нуклеозиды имеют полезные свойства при включении в олигонуклеотиды, такие как повышенная устойчивость нуклеозида и повышенная аффинность.

В некоторых воплощениях модификация сахара включает модификацию сахара, увеличивающую аффинность, например, LNA. Модификация сахара, увеличивающая аффинность, увеличивает аффинность связывания ASO с последовательностью РНК-мишени. В некоторых воплощениях ASO, содержащий модификацию сахара, раскрытую в данном документе, имеет аффинность связывания с последовательностью РНК-мишени, которая увеличивается по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 100% по сравнению с контролем (например, ASO без такой модификации сахара).

II.D.2.a 2'-модифицированные нуклеозиды

Нуклеозид, модифицированный 2'-сахаром, представляет собой нуклеозид, который имеет в положении 2' заместитель, отличный от Н или -ОН (2'-замещенный нуклеозид) или содержит 2'-связанный бирадикал, способный образовать мостик между 2' углеродом и вторым углеродом в рибозном кольце, как, например, нуклеозиды LNA (связанные 2'-4' бирадикальным мостиком).

В самом деле, было потрачено много внимания на разработку нуклеозидов с 2'-замещенным сахаром, и обнаружили то, что многие 2'-замещенные нуклеозиды имеют полезные свойства при включении в олигонуклеотиды. Например, 2'-модифицированный сахар может давать олигонуклеотиду повышенную аффинность связывания и/или повышенную нуклеазоустойчивость. Примерами 2'-замещенных модифицированных нуклеозидов являются 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, 2'-алкокси-РНК, 2'-O-метоксиэтил-РНК (МОЕ), 2'-амино-ДНК, 2'-фтор- РНК и 2'-F-ANA нуклеозид. Относительно дополнительных примеров, см., например, Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443; Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213 и Deleavey and Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937. Ниже приводятся иллюстрации некоторых 2'-замещенных модифицированных нуклеозидов.

В связи с настоящим изобретением модифицированные нуклеозиды с 2'-замещенным сахаром не включают нуклеозиды с 2'-мостиком, подобные LNA.

II.D.2.b Нуклеозиды запертых нуклеиновых кислот (LNA)

Нуклеозиды LNA представляют собой модифицированные нуклеозиды, которые содержат линкерную группу (именуемую бирадикал или мостик) между С2' и С4' рибозного сахарного кольца нуклеозида. Данные нуклеозиды также называются в литературе мостиковой нуклеиновой кислотой или бицикл и ческой нуклеиновой кислотой (BNA).

В некоторых воплощениях модифицированный нуклеозид или нуклеозиды ASO по данному раскрытию имеют общую структуру формулы II или III:

где W выбран из -О-, -S-, -N(R^a)-, -C(R^aR^b)-, таким образом, что в некоторых воплощениях -О-; В обозначает нуклеиновое основание или модифицированную группировку нуклеинового основания; Z обозначает межнуклеозидную связь с соседним нуклеозидом или 5'-концевую группу; Z* обозначает межнуклеозидную связь с соседним нуклеозидом или 3'-концевую группу; и X обозначает группу, выбранную из группы, состоящей из -C(R^aR^b)-, -C(R^a)=C(R^b)-, -C(R^a)=N-, -О-, -Si(R^a)₂-, -S-, -SO₂-, -N(R^a)- и >C=Z.

В некоторых воплощениях X выбран из группы, состоящей из: -О-, -S-, NH-, NR^aR^b, -СН₂-, CR^aR^b, -С(=СН₂)- и -C(=CR^aR^b)-. В некоторых воплощениях X представляет собой -О-.

В некоторых воплощениях Y обозначает группу, выбранную из группы, состоящей из -C(R^aR^b)-, -C(R^a)=C(R^b)-, -C(R^a)=N-, -О-, -Si(R^a)₂-, -S-, -SO₂, -N(R^a)- и >C=Z. В некоторых воплощениях Y выбран из группы, состоящей из: -СН₂-, - C(R^aR^b)-, -СН₂СН₂-, -C(R^aR^b)-C(R^aR^b)-, -CH₂CH₂CH₂, -C(R^aR^b)C(R^aR^b)C(R^aR^b)-, - C(R^a)=C(R^b) и -C(R^a)=N-.

В некоторых воплощениях Y выбран из группы, состоящей из: -СН₂-, -CHR^a-, -СНСН₃-, CR^aR^b-, и -X-Y- совместно обозначают двухвалентную линкерную группу (также именуемую радикал), обозначающую совместно двухвалентную линкерную группу, состоящую из 1, 2, 3 или 4 групп/атомов, выбранных из группы, состоящей из -C(R^aR^b)-, -C(R^a)=C(R^b)-, -C(R^a)=N-, -О-, -Si(R^a)₂-, -S-, -SO₂, -N(R^a)- и >C=Z.

В некоторых воплощениях -X-Y- обозначает бирадикал, выбранный из групп, состоящих из: -Х-СН₂-, -X-CR^aR^b-, -X-CHR^a-, -Х-С(НСН₃)^-, -O-Y-, -O-CH₂-, -S-СН₂-, -NH-CH₂-, -О-СНСН₃-, -СН₂-O-СН₂, -О-СН(СН₃СН₃)-, -O-СН₂-СН₂-, ОСН₂-СН₂-СН₂-, -O-СН₂ОСН₂-, -O-NCH₂-, -С(=СН₂)-СН₂-, -NR^a-CH₂-, N-O-CH₂, -S-CR^aR^b- и -S-CRa-.

В некоторых воплощениях -X-Y- обозначает -O-СН₂- или -O-СН(СН₃)-.

В некоторых воплощениях Z выбран из -О-, -S- и -N(R^a)-, и R^a, и, при наличии R^b, каждый независимо выбран из водорода, возможно замещенного C_1-6-алкила, возможно замещенного С_2-6-алкенила, возможно замещенного С_2-6-алкинила, гидрокси, возможно замещенного С_1-6-алкокси, С_2-6-алкоксиалкила, С_2-6-алкенилокси, карбокси, С_1-6-алкоксикарбонила, С_1-6-алкилкарбонила, формила, арила, арилоксикарбонила, арилокси, арилкарбонила, гетероарила, гетероарилоксикарбонила, гетероарилокси, гетероарилкарбонила, амино, моно- и ди(С_1-6-алкил)амино, карбамоила, моно- и ди(С_1-6-алкил)-амино-карбонила, амино-С_1-6-алкил-аминокарбонила, моно- и ди(С_1-6-алкил)амино-С_1-6-алкил-аминокарбонила, С_1-6-алкил-карбониламино, карбамидо, С_1-6-алканоилокси, сульфоно, С_1-6-алкилсульфонилокси, нитро, азидо, сульфанила, С_1-6-алкилтио, галогена, где арил и гетероарил возможно могут быть замещены, и где два геминальных заместителя R^a и R^b могут вместе обозначать возможно замещенный метилен (=СН₂), где для всех хиральных центров асимметрические группы могут находиться либо в R, либо в S ориентации.

В некоторых воплощениях R¹, R², R³, R⁵ и R^5* независимо выбраны из группы, состоящей из: водорода, возможно замещенного С_1-6-алкила, возможно замещенного С_2-6-алкенила, возможно замещенного С_2-6-алкинила, гидрокси, С_1-6-алкокси, С_2-6-алкоксиалкила, С_2-6-алкенилокси, карбокси, С_1-6-алкоксикарбонила, C_1-6-алкилкарбонила, формила, арила, арилокси-карбонила, арилокси, арилкарбонила, гетероарила, гетероарилокси-карбонила, гетероарилокси, гетероарилкарбонила, амино, моно- и ди(С_1-6-алкил)амино, карбамоила, моно- и ди(С_1-6-алкил)-амино-карбонила, амино-С_1-6-алкил-аминокарбонила, моно- и ди(С_1-6-алкил)амино-С_1-6-алкил-аминокарбонила, С_1-6-алкил-карбониламино, карбамидо, С_1-6-алканоилокси, сульфоно, С_1-6-алкилсульфонилокси, нитро, азидо, сульфанила, С_1-6-алкилтио, галогена, где арил и гетероарил возможно могут быть замещены, и где два геминальных заместителя могут вместе обозначать оксо, тиоксо, имино или возможно замещенный метилен.

В некоторых воплощениях R¹, R², R³, R⁵ и R^5* независимо выбраны из С_1-6-алкила, такого как метил, и водорода.

В некоторых воплощениях все R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода.

В некоторых воплощениях все R¹, R², R³ представляют собой атомы водорода, и либо R⁵, либо R^5* также представляет собой атом водорода, а другой из R⁵ и R^5* отличается от атома водорода, как, например, представляет собой С_1-6-алкил, такой как метил.

В некоторых воплощениях R^a представляет собой либо атом водорода, либо метил. В некоторых воплощениях R^b, при наличии, представляет собой либо атом водорода, либо метил.

В некоторых воплощениях один или оба из R^a и R^b представляют собой атом водорода.

В некоторых воплощениях один из R^a и R^b представляет собой атом водорода, а другой отличается от атома водорода.

В некоторых воплощениях один из R^a и R^b представляет собой метил, а другой представляет собой атом водорода.

В некоторых воплощениях оба из R^a и R^b представляют собой метил.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -O-CH₂-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие нуклеозиды LNA раскрыты в WO 99/014226, WO 00/66604, WO 98/039352 и WO 2004/046160, которые все включены тем самым посредством ссылки, и они включают то, что обычно известно как нуклеозиды бета-D-окси LNA и альфа-L-окси LNA.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -S-CH₂-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие нуклеозиды тио LNA раскрыты в WO 99/014226 и WO 2004/046160.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -NH-CH₂-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие нуклеозиды амино LNA раскрыты в WO 99/014226 и WO 2004/046160.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -O-СН₂-СН₂- или -O-CH₂-CH₂-CH₂-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие нуклеозиды LNA раскрыты в WO 00/047599 и Morita et al., Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12 73-76, которые тем самым включены посредством ссылки, и включают то, что обычно известно как нуклеиновые кислоты, связанные 2'-O-4'С-этиленовым мостиком (ENA).

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -O-CH₂-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³ и один из R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода, а другой из R⁵ и R^5* отличается от атома водорода, как, например, С_1-6алкил, такой как метил. Такие 5'-замещенные нуклеозиды LNA раскрыты в WO 2007/134181.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -O-CR^aR^b, где один или оба из R^a и R^b отличаются от атома водорода, как, например, метил, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³ и один из R⁵ и R^5* представляют собой атом водорода, а другой из R⁵ и R^5* отличается от атома водорода, как, например, С_1-6алкил, такой как метил. Такие бис-модифицированные нуклеозиды LNA раскрыты в WO 2010/077578.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- обозначает двухвалентную линкерную группу -O-СН(СН₂ОСН₃)-(2'O-метоксиэтилбициклическая нуклеиновая кислота - Seth at al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75(5) pp.1569-81). В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- обозначает двухвалентную линкерную группу -О-СН(СН₂СН₃)-(2'O-этилбициклическая нуклеиновая кислота - Seth et al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75(5), pp.1569-81). В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -O-CHR^a, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие 6'-замещенные нуклеозиды LNA раскрыты в WO 10036698 и WO 07090071.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -О-СН(СН₂ОСН₃)-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие нуклеозиды LNA также известны в данной области как циклические МОЕ (сМОЕ) и раскрыты в WO 07090071.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- обозначает двухвалентную линкерную группу -O-СН(СН₃)- либо в R-, либо в S-конфигурации. В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- вместе обозначает двухвалентную линкерную группу -O-CH₂-O-CH₂- (Seth et al., 2010, J. Org. Chem). В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -O-CH(CH₃)-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие 6'-метилнуклеозиды LNA также известны в данной области как сЕТ нуклеозиды и могут представлять собой либо (S)cET, либо (R)cET стереоизомеры, как раскрыто в WO 07090071 (бета-D) и WO 2010/036698 (альфа-L).

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -O-CR^aR^b-, в котором ни один из R^a или R^b не является атомом водорода, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. В некоторых воплощениях и R^a, и R^b представляют собой метил. Такие 6'-двухзамещенные нуклеозиды LNA раскрыты в WO 2009006478.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -S-CHR^a-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие 6'-замещенные нуклеозиды тио LNA раскрыты в WO 11156202. В некоторых воплощениях 6'-замещенных тио LNA R^a представляет собой метил.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -С(=СН₂)- C(R^aR^b)-, как, например, -С(=СН₂)-СН₂- или -С(=СН₂)-СН(СН₃)-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие винилкарбонуклеозиды LNA раскрыты в WO 08154401 и WO 09067647.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -N(-OR^a)-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. В некоторых воплощениях R^a представляет собой С_1-6алкил, такой как метил. Такие нуклеозиды LNA также известны как N-замещенные LNA и раскрываются в WO 2008/150729. В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- вместе обозначает двухвалентную линкерную группу -O-NR^a-CH₃- (Seth at al., 2010, J. Org. Chem). В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -N(R^a)-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. В некоторых воплощениях R^a представляет собой С_1-6алкил, такой как метил.

В некоторых воплощениях один или оба из R⁵ и R^5* представляют собой атом водорода, и, при замещении, другой из R⁵ и R^5* представляет собой С_1-6алкил, такой как метил. В таком воплощении все из R¹, R², R³ могут представлять собой атомы водорода, и бирадикал -X-Y- может быть выбран из -O-СН₂- или -О- C(HCR^a)-, такого как -О-С(НСН3)-.

В некоторых воплощениях бирадикал представляет собой -CR^aR^b-O-CR^aR^b-, такой как CH₂-O-CH₂-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. В некоторых воплощениях R^a представляет собой С_1-6алкил, такой как метил. Такие нуклеозиды LNA также известны как конформационно ограниченные нуклеотиды (CRN) и раскрываются в WO 2013036868.

В некоторых воплощениях бирадикал представляет собой -O-CR^aR^b-O-CR^aR^b-, такой как O-CH₂-O-CH₂-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. В некоторых воплощениях R^a представляет собой С_1-6алкил, такой как метил. Такие нуклеозиды LNA также известны как нуклеотиды СОС и раскрываются в Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009 37(4), 1225-1238.

Будет понятно то, что, если не определено, нуклеозиды LNA могут находиться в бета-D или альфа-L стереоизоформе.

Некоторые примеры нуклеозидов LNA представлены на Схеме 1.

Схема 1

Конкретные нуклеозиды LNA представляют собой бета-D-окси-LNA, 6'-метил-бета-D-окси LNA, как, например, (S)-6'-метил-бета-D-окси-LNA (ScET) и ENA.

Как проиллюстрировано в Примерах, в некоторых воплощениях данного раскрытия нуклеозиды LNA в олигонуклеотидах представляют собой нуклеозиды бета-D-окси-LNA.

Если одно из исходных веществ или соединений по изобретению содержит одну или более чем одну функциональную группу, которая является нестабильной или является реакционноспособной при условиях реакции одной или более чем одной стадий реакции, можно вводить подходящие защитные группы (как описано, например, в "Protective Groups in Organic Chemistry" by T.W. Greene and P.G.M. Wuts, 3^rd Ed., 1999, Wiley, New York) перед критической стадией применения способов, хорошо известных в данной области. Такие защитные группы могут быть удалены на более поздней стадии синтеза с использованием стандартных способов, описанных в литературе. Примерами защитных групп являются трет-бутокси карбон ил (Boc), 9-флуоренилметилкарбамат (Fmoc), 2- триметилсилилэтилкарбамат (Теос), карбобензилокси (Cbz) и п-метоксибензилоксикарбонил (Moz).

Соединения, описанные в данном документе, могут содержать несколько асимметрических центров и могут присутствовать в виде оптически чистых энантиомеров, смесей энантиомеров, таких как, например, рацематы, смесей диастереоизомеров, диастереоизомерных рацематов или смесей диастереоизомерных рацематов.

Термин «асимметрический атом углерода» означает атом углерода с четырьмя разными заместителями. Согласно соглашению Кана-Ингольда-Прелога асимметрический атом углерода может находиться в «R» или «S» конфигурации.

В настоящем описании термин «алкил», один или в комбинации, означает алкильную группу с прямой цепью или разветвленной цепью с 1-8 атомами углерода, в частности, алкильную группу с прямой или разветвленной цепью с 1-6 атомами углерода и, более конкретно, алкильную группу с прямой или разветвленной цепью с 1-4 атомами углерода. Примерами С₁-С₈ алкильных групп с прямой цепью и разветвленной цепью являются метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, трет-бутил, изомерные пентилы, изомерные гексилы, изомерные гептилы и изомерные октилы, в частности, метил, этил, пропил, бутил и пентил. Конкретными примерами алкила являются метил, этил и пропил.

Термин «циклоалкил», один или в комбинации, означает циклоалкильное кольцо с 3-8 атомами углерода и, в частности, циклоалкильное кольцо с 3-6 атомами углерода. Примерами циклоалкила являются циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил и циклооктил, более конкретно, циклопропил и циклобутил. Конкретным примером «циклоалкила» является циклопропил.

Термин «алкокси», один или в комбинации, означает группу формулы алкил-О-, в которой термин «алкил» имеет значение, приведенное ранее, как, например, метокси, этокси, н-пропокси, изопропокси, н-бутокси, изобутокси, втор-бутокси и трет-бутокси. Конкретным «алкокси» являются метокси и этокси. Метоксиэтокси является конкретным примером «алкоксиалкокси».

Термин «окси», один или в комбинации, означает группу -О-.

Термин «алкенил», один или в комбинации, означает прямоцепочечный или разветвленный углеводородный остаток, содержащий олефиновую связь и вплоть до 8, предпочтительно вплоть до 6, в частности, предпочтительно вплоть до 4 атомов углерода. Примерами алкенильных групп являются этенил, 1-пропенил, 2-пропенил, изопропенил, 1-бутенил, 2-бутенил, 3-бутенил и изобутенил.

Термин «алкинил», один или в комбинации, означает прямоцепочечный или разветвленный углеводородный остаток, содержащий тройную связь и вплоть до 8, предпочтительно вплоть до 6, в частности, предпочтительно вплоть до 4 атомов углерода.

Термины «галоген» или «галогено», одни или в комбинации, означают фтор, хлор, бром или йод и, в частности фтор, хлор или бром, более конкретно, фтор. Термин «галоген» в комбинации с другой группой обозначает замещение указанной группы по меньшей мере одним галогеном, в частности, замещение одним-пятью галогенами, в частности, одним-четырьмя галогенами, т.е. одним, двумя, тремя или четырьмя галогенами.

Термин «галогеноалкил», один или в комбинации, означает алкильную группу, замещенную по меньшей мере одним галогеном, в частности, замещенную одним-пятью галогенами, в частности одним-тремя галогенами. Примеры галогеноалкила включают монофтор-, дифтор- или трифторметил, -этил или - пропил, например, 3,3,3-трифторпропил, 2-фторэтил, 2,2,2-трифторэтил, фторметил или трифторметил. Фторметил, дифторметил и трифторметил представляют собой конкретные «галогеналкилы».

Термин «галогеноциклоалкил», один или в комбинации, означает циклоалкильную группу, как определено выше, замещенную по меньшей мере одним галогеном, в частности, замещенную одним-пятью галогенами, в частности, одним-тремя галогенами. Конкретный пример «галогеноциклоалкила» представляет собой галогеноциклопропил, в частности, фторциклопропил, дифторциклопропил и трифторциклопропил.

Термины «гидроксил» и «гидрокси», одни или в комбинации, означают группу-OH.

Термины «тиогидроксил» и «тиогидрокси», одни или в комбинации, означают группу -SH.

Термин «карбонил», один или в комбинации, означает группу -С(О)-.

Термин «карбокси» или «карбоксил», один или в комбинации, означает группу -COOH.

Термин «амино», один или в комбинации, означает первичную аминогруппу (-NH₂), вторичную аминогруппу (-NH-) или третичную аминогруппу (-N-).

Термин «алкиламино», один или в комбинации, означает аминогруппу, как определено выше, замещенную одной или двумя алкильными группами, как определено выше.

Термин «сульфонил», один или в комбинации, означает группу -SO₂.

Термин «сульфинил», один или в комбинации, означает группу -SO-.

Термин «сульфанил», один или в комбинации, означает группу -S-.

Термин «циано», один или в комбинации, означает группу -CN.

Термин «азидо», один или в комбинации, означает группу -N₃.

Термин «нитро», один или в комбинации, означает группу NO₂.

Термин «формил», один или в комбинации, означает группу -С(O)Н.

Термин «карбамоил», один или в комбинации, означает группу -C(O)NH₂.

Термин «карбамидо», один или в комбинации, означает группу -NH-C(O)-NH₂.

Термин «арил», один или в комбинации, означает одновалентную ароматическую карбоциклическую моно- или бициклическую кольцевую систему, содержащую от 6 до 10 атомов углерода кольца, возможно замещенную 1-3 заместителями, независимо выбранными из галогена, гидроксила, алкила, алкенила, алкинила, алкокси, алкоксиалкила, алкенилокси, карбоксила, алкоксикарбонила, алкилкарбонила и формила. Примеры арила включают фенил и нафтил, в частности фенил.

Термин «гетероарил», один или в комбинации, обозначает одновалентную ароматическую гетероциклическую моно- или бициклическую кольцевую систему из 5 до 12 атомов кольца, содержащую 1,2,3 или 4 гетероатома, выбранных из N, О и S, причем остальные атомы кольца представляют собой атомы углерода, возможно замещенную 1-3 заместителями, независимо выбранными из галогена, гидроксила, алкила, алкенила, алкинила, алкокси, алкоксиалкила, алкенилокси, карбоксила, алкоксикарбонила, алкилкарбонила и формила. Примеры гетероарила включают пирролил, фуранил, тиенил, имидазолил, оксазолил, тиазолил, триазолил, оксадиазолил, тиадиазолил, тетразолил, пиридинил, пиразинил, пиразолил, пиридазинил, пиримидинил, триазинил, азепинил, диазепинил, изоксазолил, бензофуранил, изотиазолил, бензотиенил, индолил, изоиндолил, изобензофуранил, бензмимидазолил, бензоксазолил, бензоизоксазолил, бензотиазолил, бензоизотиазолил, бензооксадиазолил, бензотиадиазолил, бензотриазолил, пуринил, хинолинил, изохинолинил, хиназолинил, хиноксалинил, карбазолил или акридинил.

Термин «гетероцикпил», один или в комбинации, означает одновалентную насыщенную или частично ненасыщенную моно- или бициклическую кольцевую систему из 4-12, в частности, 4-9 атомов кольца, содержащую 1, 2, 3 или 4 гетероатома кольца, выбранных из N, О и S, причем остальные атомы кольца представляют собой углерод, возможно замещенный 1-3 заместителями, независимо выбранными из галогена, гидроксила, алкила, алкенила, алкинила, алкокси, алкоксиалкила, алкенилокси, карбоксила, алкоксикарбонила, алкилкарбонила и формила. Примеры моноциклического насыщенного гетероциклила представляют собой азетидинил, пирролидинил, тетрагидрофуранил, тетрагидротиенил, пиразолидинил, имидазолидинил, оксазолидинил, изоксазолидинил, тиазолидинил, пиперидинил, тетрагидропиранил, тетрагидротиопиранил, пиперазинил, морфолинил, тиоморфолинил, 1,1-диоксо-тиоморфолин-4-ил, азепанил, диазепанил, гомопиперазинил или оксазепанил. Примерами бициклического насыщенного гетероциклоалкила являются 8-аза-бицикло[3.2.1]октил, хинуклидинил, 8-окса-3-аза-бицикло[3.2.1]октил, 9-аза-бицикло[3.3.1]нонил, 3-окса-9-аза-бицикло[3.3.1]нонил или 3-тиа-9-аза-бицикло[3.3.1]нонил. Примерами частично ненасыщенного гетероциклоалкила являются дигидрофурил, имидазолинил, дигидро-оксазолил, тетрагидро-пиридинил или дигидропиранил.

II.Е. Деградация, опосредованная нуклеазой

Термин «деградация, опосредованная нуклеазой» относится к олигонуклеотиду, способному опосредовать деградацию комплементарной нуклеотидной последовательности при образовании дуплекса с такой последовательностью.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид может функционировать посредством деградации нуклеиновой кислоты-мишени, опосредованной нуклеазой, где олигонуклеотиды по данному раскрытию способны рекрутировать нуклеазу, в частности, эндонуклеазу, предпочтительно эндорибонуклеазу (РНКазу), такую как РНКаза Н. Примерами конструкций олигонуклеотидов, которые работают посредством механизмов, опосредованных нуклеазой, являются олигонуклеотиды, которые типично содержат область из по меньшей мере 5 или 6 нуклеозидов ДНК и фланкированы на одной стороне или на обеих сторонах нуклеозидами, увеличивающими аффинность, например, гэпмеры.

II.F. Активность и рекрутирование РНКазы Н

Активность РНКазы Н антисмыслового олигонуклеотида относится к его способности при нахождении в дуплексе с комплементарной молекулой РНК рекрутировать РНКазу Н и индуцировать расщепление и последующую деградацию комплементарной молекулы РНК. В WO 01/23613 предложены способы in vitro для определения активности РНКазы Н, которые можно использовать для определения способности рекрутировать РНКазу Н. Типично олигонуклеотид считается способным рекрутировать РНКазу Н, если он, при предоставлении с комплементарной последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени, имеет исходную скорость, измеренную в пмоль/л/мин, по меньшей мере 5%, как, например, по меньшей мере 10% или больше чем 20% от исходной скорости, определенной при использовании олигонуклеотида, имеющего такую же последовательность оснований, что и тестируемый модифицированный олигонуклеотид, но содержащего только мономеры ДНК с фосфоротиоатными связями между всеми мономерами в олигонуклеотиде, и с использованием методологии, предложенной в Примерах 91-95 WO 01/23613.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид считается по существу не способным рекрутировать РНКазу Н, если он, при предоставлении с комплементарной нуклеиновой кислотой-мишенью, имеет исходную скорость РНКазы Н, измеренную в пмоль/л/мин, меньшую чем 20%, как, например, меньшую чем 10%, как, например, меньшую чем 5% от исходной скорости, определенной при использовании олигонуклеотида, имеющего такую же последовательность оснований, что и тестируемый олигонуклеотид, но содержащего только мономеры ДНК без 2' замещений с фосфоротиоатными связями между всеми мономерами в олигонуклеотиде, и с использованием методологии, предложенной в Примерах 91-95 WO 01/23613.

II.G. Конструкция ASO

ASO по данному раскрытию может содержать нуклеотидную последовательность, которая содержит и природные нуклеотиды, и нуклеотидные аналоги, и может находиться в виде гэпмера. Примеры конфигураций гэпмера, которые можно использовать с ASO по данному раскрытию, описываются в публикации заявки на патент США №2012/0322851.

Термин «гэпмер» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к антисмысловому олигонуклеотиду, который содержит область олигонукеотидов, рекрутирующих РНКазу Н (гэп), которая фланкирована 5' и 3' одним или более чем одним модифицированным нуклеозидом, увеличивающим аффинность (фланги). В данном документе описываются разные конструкции гэпмеров. Термин «LNA гэпмер» относится к гэпмерному олигонуклетиду, в котором по меньшей мере один модифицированный нуклеозид, увеличивающий аффинность, представляет собой нуклеозид LNA. Термин «гэпмер со смешанными крыльями» относится к LNA гэпмеру, в котором области флангов содержат по меньшей мере один нуклеозид LNA и по меньшей мере один нуклеозид ДНК или модифицированный нуклеозид, не являющийся LNA, такой как по меньшей мере один 2'-замещенный модифицированный нуклеозид, такой как, например, нуклеозид(ды) 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, 2'-O-алкокси-РНК, 2'-O-метоксиэтил-РНК (МОЕ), 2'-амино-ДНК, 2'-фтор-РНК и 2'-F-ANA. В некоторых воплощениях гэпмер со смешанными крыльями имеет один фланг, который содержит нуклеозиды LNA (например, 5' или 3'), и другой фланг (3' или 5' соответственно) содержит 2'-замещенный(ные) модифицированный(ные) нуклеозид (ды).

В некоторых воплощениях, помимо увеличения аффинности ASO в отношении области-мишени, некоторые нуклеозидные аналоги также опосредуют связывание и расщепление РНКазы (например, РНКазы Н). Поскольку мономеры α-L-LNA в некоторой степени рекрутируют активность РНКазы Н, в некоторых воплощениях области гэпа (например, область В, в том виде, в котором на нее дается ссылка в данном документе) ASO, содержащих мономеры α-L-LNA, состоит из меньшего числа мономеров распознаваемых и расщепляемых РНКазой Н, и вводится большая гибкость в конструкцию миксмера.

II.G.1. Конструкция гэпмера

В одном воплощении ASO по данному раскрытию представляет собой гэпмер. Гэпмерный ASO представляет собой ASO, который содержит непрерывный отрезок нуклеотидов, который способен рекрутировать РНКазу, такую как РНКаза Н, как, например, область из по меньшей мере 6 нуклеотидов ДНК, именуемую в данном документе область В (В), где область В фланкируется 5' и 3' областями нуклеотидных аналогов, усиливающих аффинность, как, например, 1-10 нуклеотидными аналогами 5' и 3' к непрерывному отрезку нуклеотидов, который способен рекрутировать РНКазу, - данные области называются областями А (А) и С (С) соответственно.

В некоторых воплощениях гэпмер представляет собой гэпмер с флангами с чередованием, примеры которого обсуждаются ниже. В некоторых воплощениях гэпмер с флангами с чередованием демонстрирует меньше связывания вне мишени, чем традиционный гэпмер. В некоторых воплощениях гэпмер с флангами с чередованием имеет лучшую долговременную переносимость, чем традиционный гэпмер.

Гэпмер с флангами с чередованием может содержать (поли)нуклеотидную последовательность формулы (от 5' к 3') А-В-С, в которой: область А (А) (5'-область или последовательность первого крыла) содержит по меньшей мере один нуклеотидный аналог, как, например, по меньшей мере одно звено LNA, как, например, 1-10 нуклеотидных аналогов, таких как звенья LNA, и; область В (В) содержит по меньшей мере шесть последовательных нуклеотидов, которые способны рекрутировать РНКазу (при образовании дуплекса с комплементарной молекулой РНК, такой как пре-мРНК- или мРНК-мишень), таких как нуклеотиды ДНК, и; область С (С) (3'-область или последовательность второго крыла) содержит по меньшей мере один нуклеотидный аналог, как, например, по меньшей мере одно звено LNA, как, например, 1-10 нуклеотидных аналогов, таких как звенья LNA; где области А и С могут включать в любом положении в А и С 1-3 вставки областей нуклеотидов ДНК (например, вставки ДНК), в которых каждая данная вставка ДНК может иметь 1-6 звеньев ДНК в длину.

В некоторых других воплощениях гэпмер, например, гэпмер с флангами с чередованием, содержит (поли)нуклеотидную последовательность формулы (от 5' к 3') А-В-С или, возможно, A-B-C-D или D-A-B-C, в которой: область А (А) (5'-область) содержит по меньшей мере один нуклеотидный аналог, как, например, по меньшей мере одно звено LNA, как, например, 1-10 нуклеотидных аналогов, таких как звенья LNA, и; область В (В) содержит по меньшей мере пять последовательных нуклеотидов, которые способны рекрутировать РНКазу (при образовании дуплекса с комплементарной молекулой РНК, такой как мРНК-мишень), таких как нуклеотиды ДНК, и; область С (С) (3'-область) содержит по меньшей мере один нуклеотидный аналог, как, например, по меньшей мере одно звено LNA, как, например, 1-10 нуклеотидных аналогов, таких как звенья LNA, и; область D (D), при наличии, содержит 1, 2 или 3 нуклеотидных звена, таких как нуклеотиды ДНК.

В некоторых воплощениях область А содержит 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидных аналогов, таких как звенья LNA, как, например, 2-5 нуклеотидных аналогов, как, например, 2-5 звеньев LNA, как, например, 2-5 нуклеотидных аналогов, как, например, 3-5 звеньев LNA; и/или область С состоит из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидных аналогов, таких как звенья LNA, как, например, 2-5 нуклеотидных аналогов, как, например, 2-5 звеньев LNA, как, например, 2-5 нуклеотидных аналогов, как, например, 3-5 звеньев LNA.

В некоторых воплощениях В содержит 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 последовательных нуклеотидов, которые способны рекрутировать РНКазу, или 6-14, 7-14, 8-14 или 7-10, или 7-9, как, например, 8, как, например, 9, как, например, 10 или как, например, 14 последовательных нуклеотидов, которые способны рекрутировать РНКазу. В некоторых воплощениях область В содержит по меньшей мере пять нуклеотидных звеньев ДНК, как, например, 5-23 звеньев ДНК, как, например, 5-20 звеньев ДНК, как, например, 5-18 звеньев ДНК, как, например, 6-14 звеньев ДНК, как, например, 8-14 звеньев ДНК, как, например, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 звеньев ДНК.

В некоторых воплощениях область А содержит 3, 4 или 5 нуклеотидных аналогов, таких как LNA, область В состоит из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 звеньев ДНК, и область С состоит из 3, 4 или 5 нуклеотидных аналогов, таких как LNA. Такие конструкции включают (А-В-С) 5-10-5, 3-14-3, 3-10-3, 3-10-4, 4-10-3, 3-9- 3, 3-9-4, 4-9-3, 3-8-3, 3-8-4, 4-8-3, 3-7-3, 3-7-4 и 4-7-3, и могут дополнительно включать область D, которая может иметь одно-3 нуклеотидных звена, таких как звенья ДНК.

В некоторых воплощениях ASO по данному раскрытию, например, гэпмер с флангами с чередованием, содержит формулу 5'-А-В-С-3', в которой

(i) область В представляет собой непрерывную последовательность из по меньшей мере 5, 6, 7 или 8, например, 5-18 звеньев ДНК, которые способны рекрутировать РНКазу;

(ii) область А представляет собой последовательность первого крыла из 1-10 нуклеотидов, где данная последовательность первого крыла содержит один или более чем один нуклеотидный аналог и, возможно, одно или более чем одно звено ДНК (например, вставка ДНК), и где по меньшей мере один из нуклеотидных аналогов расположен на 3'-конце А; и

(iii) область С представляет собой последовательность второго крыла из 1-10 нуклеотидов, где данная последовательность второго крыла содержит один или более чем один нуклеотидный аналог и, возможно, одно или более чем одно звено ДНК (например, вставка ДНК), и где по меньшей мере один из нуклеотидных аналогов расположен на 5'-конце С.

В некоторых воплощениях последовательность первого крыла (область А в формуле) содержит комбинацию нуклеотидных аналогов и звеньев ДНК, выбранную из (i) 1-9 нуклеотидных аналогов и 1 звена ДНК; (ii) 1-8 нуклеотидных аналогов и 1-2 звеньев ДНК; (iii) 1-7 нуклеотидных аналогов и 1-3 звеньев ДНК; (iv) 1-6 нуклеотидных аналогов и 1-4 звеньев ДНК; (v) 1-5 нуклеотидных аналогов и 1-5 звеньев ДНК; (vi) 1-4 нуклеотидных аналогов и 1-6 звеньев ДНК; (vii) 1-3 нуклеотидных аналогов и 1-7 звеньев ДНК; (viii) 1-2 нуклеотидных аналогов и 1-8 звеньев ДНК; и (ix) 1 нуклеотидный аналог и 1-9 звеньев ДНК.

В некоторых воплощениях последовательность второго крыла (область С в данной формуле) содержит комбинацию нуклеотидных аналогов и звеньев ДНК, выбранную из (i) 1-9 нуклеотидных аналогов и 1 звена ДНК; (ii) 1-8 нуклеотидных аналогов и 1-2 звеньев ДНК; (iii) 1-7 нуклеотидных аналогов и 1-3 звеньев ДНК; (iv) 1-6 нуклеотидных аналогов и 1-4 звеньев ДНК; (v) 1-5 нуклеотидных аналогов и 1-5 звеньев ДНК; (vi) 1-4 нуклеотидных аналогов и 1-6 звеньев ДНК; (vii) 1-3 нуклеотидных аналогов и 1-7 звеньев ДНК; (viii) 1-2 нуклеотидных аналогов и 1-8 звеньев ДНК; и (ix) 1 нуклеотидный аналог и 1-9 звеньев ДНК.

В некоторых воплощениях область А в формуле ASO имеет подформулу, выбранную из конструкции первого крыла любого ASO на ФИГ. 1А-1С и 2, и/или область С в формуле ASO имеет подформулу, выбранную из конструкции второго крыла любого ASO на ФИГ. 1А-1С и 2, где верхняя буква представляет собой нуклеотидный аналог (например, аналог с модифицированным сахаром, который также может быть записан как L), и нижняя буква представляет собой ДНК (которая также может быть записана как D).

В некоторых воплощениях ASO, например, гэпмер с флангами с чередованием, имеет формулу 5' А-В-С 3', в которой область В представляет собой непрерывную последовательность из 5-18 звеньев ДНК, область А имеет формулу LLDLL, LDLLL или LLLDL, и область С имеет формулу LLDLL или LDLDLL, и где L представляет собой звено LNA, и D представляет собой звено ДНК.

В некоторых воплощениях ASO имеет формулу 5' А-В-С 3', в которой область В представляет собой непрерывную последовательность из 10 звеньев ДНК, область А имеет формулу LDL, и область С имеет формулу LLLL, где L представляет собой звено LNA, и D представляет собой звено ДНК.

Другие конструкции гэпмера раскрываются в WO 2004/046160, которая является тем самым включенной посредством ссылки во всей ее полноте. WO 2008/113832, тем самым включенная посредством ссылки во всей ее полноте, относится к «шортмерным» гэпмерным ASO. В некоторых воплощениях ASO, представленные в данном документе, могут представлять собой такие шортмерные гэпмеры.

В некоторых воплощениях ASO, например, гэпмер с флангами с чередованием, содержит непрерывную нуклеотидную последовательность всего из 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидных звеньев, где данная непрерывная нуклеотидная последовательность имеет формулу (5'-3') А-В-С или возможно A-B-C-D или D-A-B-C, где область А состоит из 1, 2, 3, 4 или 5 звеньев нуклеотидных аналогов, таких как звенья LNA; область В состоит из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14 или 15 непрерывных нуклеотидных звеньев, которые способны рекрутировать РНКазу при образовании дуплекса с молекулой комплементарной РНК (такой как мРНК-мишень); и область С состоит из 1, 2, 3, 4 или 5 звеньев нуклеотидных аналогов, таких как звенья LNA. Область D, при наличии, состоит из одного звена ДНК.

В некоторых воплощениях А содержит 1 звено LNA. В некоторых воплощениях область А содержит 2 звена LNA. В некоторых воплощениях область А содержит 3 звена LNA. В некоторых воплощениях область А содержит 4 звена LNA. В некоторых воплощениях область А содержит 5 звеньев LNA. В некоторых воплощениях область С содержит 1 звено LNA. В некоторых воплощениях С содержит 2 звена LNA. В некоторых воплощениях область С содержит 3 звена LNA. В некоторых воплощениях область С содержит 4 звена LNA. В некоторых воплощениях область С содержит 5 звеньев LNA. В некоторых воплощениях область В содержит 6 нуклеотидных звеньев. В некоторых воплощениях область В содержит 7 нуклеотидных звеньев. В некоторых воплощениях область В содержит 8 нуклеотидных звеньев. В некоторых воплощениях область В содержит 9 нуклеотидных звеньев. В некоторых воплощениях область В содержит 10 нуклеозидных звеньев. В некоторых воплощениях область В содержит 11 нуклеозидных звеньев. В некоторых воплощениях область В содержит 12 нуклеозидных звеньев. В некоторых воплощениях область В содержит 13 нуклеозидных звеньев. В некоторых воплощениях область В содержит 14 нуклеозидных звеньев, область В содержит 15 нуклеозидных звеньев. В некоторых воплощениях область В содержит 7-23 мономера ДНК или 5-18 мономеров ДНК. В некоторых воплощениях область В содержит 6-23 звена ДНК, как, например, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 звена ДНК. В некоторых воплощениях область В состоит из звеньев ДНК. В некоторых воплощениях область В содержит по меньшей мере одно звено LNA, которое находится в альфа- L-конфигурации, как, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 звеньев LNA в альфа-L-конфигурации. В некоторых воплощениях область В содержит по меньшей мере одно звено альфа-L-окси LNA, или в которой все звенья LNA в альфа-L-конфигурации представляют собой звенья альфа-L-окси LNA.

В некоторых воплощениях число нуклеотидов, представленных в А-В-С, выбрано из (звенья нуклеотидных аналогов - область В - звенья нуклеотидных аналогов): 1-8-1, 1-8-2, 2-8-1, 2-8-2, 3-8-3, 2-8-3, 3-8-2, 4-8-1, 4-8-2, 1-8-4, 2-8-4 или 1-9-1, 1-9-2, 2-9-1, 2-9-2, 2-9-3, 3-9-2, 1-9-3, 3-9-1, 4-9-1, 1-9-4, 4-9-4, или 1-10-1, 1- 10-2, 2-10-1, 2-10-2, 1-10-3, 3-10-1 и 4-10-4, или 3-11-4, 4-11-3 и 4-11-4, или 3-12-4 и 4-12-4, или 3-13-3 и 3-13-4, или 1-14-4, или 1-15-4 и 2-15-3. В некоторых воплощениях число нуклеотидов в А-В-С выбрано из: 2-7-1, 1-7-2, 2-7-2, 3-7-3, 2-7- 3, 3-7-2, 3-7-4 и 4-7-3.

В других воплощениях ASO содержит 10 звеньев ДНК в В, LDLLL в А (первое крыло) и LLDLL в С (второе крыло). В других воплощениях ASO содержит 9 звеньев ДНК в В, LDDLL в А и LDLDLL в С. В других воплощениях ASO содержит 10 звеньев ДНК в В, LLDLL в А и LLDLL в С. В других воплощениях ASO содержит 9 звеньев ДНК в В, LLLLL в А и LDDLL в С. В некоторых воплощениях каждая из областей А и С содержит три мономера LNA, и область В состоит из 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 нуклеозидных мономеров, например, мономеров ДНК. В некоторых воплощениях и А, и С каждый состоит из двух звеньев LNA, и В состоит из 7, 8 или 9 нуклеотидных звеньев, например, звеньев ДНК. В разных воплощениях другие конструкции гэпмеров включают гэпмеры, где области А и/или С состоят из 3, 4, 5 или 6 нуклеозидных аналогов, таких как мономеры, содержащие сахар 2'-O-метоксиэтилрибозу (2'-МОЕ), или мономеры, содержащие сахар 2'-фтор-дезоксирибозу, и область В состоит из 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 нуклеозидов, таких как мономеры ДНК, где области А-В-С имеют 3-8-3, 3-9-3, 3-10-3, 5-10-5 или 4-12-4 мономеров. Дополнительные конструкции гэпмеров раскрываются в WO 2007/146511А2, включенной тем самым посредством ссылки во всей ее полноте.

В некоторых воплощениях ASO с флангами с чередованием имеет по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, содержащих область А, область В и область С (А-В-С), где область В содержит по меньшей мере 5 смежных нуклеозидных звеньев и фланкируется на 5' областью А из 1-8 смежных нуклеозидных звеньев и на 3' областью С из 1-8 смежных нуклеозидных звеньев, где область В, при образовании дуплекса с комплементарной РНК, способна рекрутировать РНКазу Н, и где область А и область С выбраны из группы, состоящей из следующих:

(i) область А содержит 5' нуклеозидное звено LNA и 3' нуклеозидное звено LNA, и по меньшей мере одно нуклеозидное звено ДНК между 5' нуклеозидным звеном LNA и 3' нуклеозидным звеном LNA, и область С содержит по меньшей мере два 3' нуклеозида LNA;

(ii) область А содержит по меньшей мере один 5' нуклеозид LNA и область С содержит 5' нуклеозидное звено LNA, по меньшей мере два концевых 3' нуклеозидных звена LNA и по меньшей мере одно нуклеозидное звено ДНК между 5' нуклеозидным звеном LNA и 3' нуклеозидными звеньями LNA, и

(iii) область А содержит 5' нуклеозидное звено LNA и 3' нуклеозидное звено LNA, и по меньшей мере одно нуклеозидное звено ДНК между 5' нуклеозидным звеном LNA и 3' нуклеозидным звеном LNA; и область С содержит 5' нуклеозидное звено LNA, по меньшей мере два концевых 3' нуклеозидных звена LNA и по меньшей мере одно нуклеозидное звено ДНК между 5' нуклеозидным звеном LNA и 3' нуклеозидными звеньями LNA.

В некоторых воплощениях область А или область С содержит 1, 2 или 3 нуклеозидных звена ДНК. В других воплощениях область А и область С содержит 1, 2 или 3 нуклеозидных звена ДНК. В других воплощениях область В содержит по меньшей мере пять последовательных нуклеозидных звеньев ДНК. В некоторых воплощениях область В содержит 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 последовательных нуклеозидных звеньев ДНК. В некоторых воплощениях область В имеет 8, 9, 10, 11 или 12 нуклеотидов в длину. В других воплощениях область А содержит два 5'-концевых нуклеозидных звена LNA. В некоторых воплощениях область А имеет формулу 5'[LNA]_1-3[DNA]_1-3[LNA]_1-3 или 5'[LNA]_1-2[DNA]_1-2[LNA]_1-2[DNA]_1-2[LNA]_1-2. В других воплощениях область С имеет формулу [LNA]_1-3[DNA]_1-3[LNA]_2-33' или [LNA]_1-2[DNA]_1-2[LNA]_1-2[DNA]_1-2[LNA]_2-33'. В других воплощениях область А имеет формулу 5'[LNA]_1-3[DNA]_1-3[LNA]_1-3 или 5'[LNA]_1-2[DNA]_1-2[LNA]_1-2[DNA]_1-2[LNA]_1-2, и область С содержит 2, 3, 4 или 5 последовательных нуклеозидных звеньев LNA. В некоторых воплощениях область С имеет формулу [LNA]_1-3[DNA]_1-3[LNA]_2-33' или [LNA]_1-2[DNA]_1-2[LNA]_1-2[DNA]_1-2[LNA]_2-33', и область А содержит 1, 2, 3, 4 или 5 последовательных нуклеозидных звеньев LNA. В других воплощениях область А имеет последовательность из нуклеозидов LNA и DNA, 5'-3', выбранных из группы, состоящей из L, LL, LDL, LLL, LLDL, LDLL, LDDL, LLLL, LLLLL, LLLDL, LLDLL, LDLLL, LLDDL, LDDLL, LLDLD, LDLLD, LDDDL, LLLLLL, LLLLDL, LLLDLL, LLDLLL, LDLLLL, LLLDDL, LLDLDL, LLDDLL, LDDLLL, LDLLDL, LDLDLL, LDDDLL, LLDDDL и LDLDLD, где L представляет нуклеозид LNA, и D представляет нуклеозид ДНК. В других воплощениях область С имеет последовательность из нуклеозидов LNA и ДНК, 5'-3', выбранных из группы, состоящей из LL, LLL, LLLL, LDLL, LLLLL, LLDLL, LDLLL, LDDLL, LDDLLL, LLDDLL, LDLDLL, LDDDLL, LDLDDLL, LDDLDLL, LDDDLLL и LLDLDLL. В другом воплощении область А имеет последовательность из нуклеозидов LNA и ДНК, 5'-3', выбранных из группы, состоящей LDL, LLDL, LDLL, LDDL, LLLDL, LLDLL, LDLLL, LLDDL, LDDLL, LLDLD, LDLLD, LDDDL, LLLLDL, LLLDLL, LLDLLL, LDLLLL, LLLDDL, LLDLDL, LLDDLL, LDDLLL, LDLLDL, LDLDLL, LDDDLL, LLDDDL и LDLDLD, и область С имеет последовательность из нуклеозидов LNA и ДНК, 5'-3', выбранную из группы, состоящей из LDLL, LLDL, LLLLL, LLDLL, LDLLL, LDDLL, LDDLLL, LLDDLL, LDLDLL, LDDDLL, LDLDDLL, LDDLDLL, LDDDLLL и LLDLDLL.

В некоторых воплощениях ASO с флангами с чередованием имеет смежные нуклеотиды, содержащие последовательность нуклеозидов 5-3', выбранную из группы, состоящей из

;

где L представляет нуклеозид LNA, и D представляет нуклеозид ДНК. В других воплощениях нуклеозид LNA представляет собой бета-D-окси LNA.

В других воплощениях ASO с флангами с чередованием имеет смежные нуклеотиды, содержащие последовательность с чередованием нуклеозидных звеньев LNA и ДНК, 5'-3', выбранную из группы, состоящей из: 2-3-2-8-2, 1-1-2-1-1- 9-2, 3-10-1-1-2, 3-9-1-2-2, 3-8-1-3-2, 3-8-1-1-1-1-2, 3-1-1-9-3, 3-1-1-8-1-1-2, 4-9-1-1-2, 4-8-1-2-2, 3-3-1-8-2, 3-2-1-9-2, 3-2-2-8-2, 3-2-2-7-3, 5-7-1-2-2, 1-1-3-10-2, 1-1-3-7-1-2-2, 1-1-4-9-2, 2-1-3-9-2, 3-1-1-10-2, 3-1-1-7-1-2-2, 3-1-2-9-2, 4-7-1-3-2, 5-9-1-1-2, 4-10-1-1-3-11-1-1-2, 2-1-1-10-1-1-2, 1-1-3-9-1-1-2, 3-10-1-2-2, 3-9-1-3-2, 3-8-1-1-1-2-2, 4-9-1- 2-2, 4-9-1-1-3, 4-8-1-3-2, 4-8-1-2-3, 4-8-1-1-1-1-2, 4-7-1-2-1-1-2, 4-7-1-1-1-2-2, 2-1-2- 11-2, 2-1-3-8-1-1-2, 3-1-1-11-2, 3-1-1-9-1-1-2, 3-1-1-8-1-2-2, 3-1-1-7-1-1-1-1-2, 4-9-2-1- 2, 4-7-1-3-3,5-9-1-1-3, 5-9-1-2-2, 4-10-2-1-2, 4-10-1-1-3, 4-10-1-2-2, 3-11-2-1-2, 3-11-1-1-3, 5-9-2-1-2, 3-11-1-2-2, 2-1-2-9-1-2-2, 3-1-1-10-1-1-2, 3-1-1-9-1-2-2, 4-9-1-1-1-1-2, 4- 8-2-1-1-1-2, 1-1-3-10-2-1-2, 2-1-2-10-2-1-2, 2-1-1-12-4, 2-2-1-11-4, 3-1-1-11-4, 2-1-1-13-2-1-2-11-4, 2-2-1-12-3, 3-11-1-2-3, 3-1-1-12-3, 2-1-2-12-3, 4-11-2-1-2, 4-10-2-2-2, 3-2-1-9-1-1-3, 2-2-1-1-1-9-4, 2-2-2-9-1-1-3, 3-1-1-9-1-1-1-1-2, 2-1-2-9-1-2-3, 3-1-1-10-1-1- 3, 2-1-1-2-1-9-4, 4-9-1-1-1-2-2, 3-1-1-9-1-2-3, 2-1-1-1-1-10-4, 2-1-2-10-1-1-3, 2-1-1-1-1-9-2-1-2, 2-2-2-9-2-1-2, 4-9-1-2-1-1-2, 3-2-1-9-2-1-2, 2-1-2-9-2-2-2, 2-1-1-1-1-9-1-1-3, 3-1-1-9-2-2-2, 2-2-2-10-4, 2-1-2-9-1-1-1-1-2, 4-10-1-2-3, 3-2-1-10-4, 3-1-1-10-2-1-2, 4-10- 1-1-1-1-2, 4-11-1-1-3, 3-12-4, 1-2-2-10-1-1-3 и 2-2-2-10-1-1-2; где первое число представляет число звеньев LNA, следующее - число звеньев ДНК и затем области с чередованием LNA и ДНК.

В других воплощениях ASO по данному раскрытию представлены в виде любого одного из чисел ASO, выбранных из ФИГ. 1А-1С и 2.

II.Н. Межнуклеотидные связи

Мономеры ASO, описанных в данном документе, связываются друг с другом посредством связывающих групп. Подходящим образом, каждый мономер связывается с 3' смежным мономером посредством связывающей группы.

Обычному специалисту в данной области было бы понятно, что, в контексте настоящего раскрытия, 5'-мономер на конце ASO не содержит 5'-связывающую группу, хотя он и может содержать или может не содержать 5'-концевую группу.

Подразумевается то, что термины «связывающая группа» и «межнуклеотидная связь» означают группу, способную ковалентно связывать друг с другом два нуклеотида. Конкретные и предпочтительные примеры включают фосфатные группы и фосфоротиоатные группы.

Нуклеотиды ASO по данному раскрытию или их непрерывная нуклеотидная последовательность связываются друг с другом посредством связывающих групп. Подходящим образом, каждый нуклеотид связывается с 3' смежным нуклеотидом посредством связывающей группы.

Подходящие межнуклеотидные связи включают связи, перечисленные в WO 2007/031091, например, межнуклеотидные связи, перечисленные в первом абзаце страницы 34 WO 2007/031091 (включенной посредством этого посредством ссылки во всей ее полноте).

Примеры подходящих межнуклеотидных связей, которые можно использовать с данным раскрытием, включают фосфодиэфирную связь (РО или подстрочный символ о), фосфотриэфирную связь, метилфосфонатную связь, фосфорамидатную связь, фосфоротиоатную связь (PS или подстрочный символ s) и их комбинации.

В некоторых воплощениях предпочтительно модифицировать межнуклеотидную связь от нормальной фосфодиэфирной связи до связи, которая является более устойчивой к атаке нуклеазой, такой как фосфоротиоатная или боранофосфатная - эти две связи, будучи расщепляемыми РНКазой Н, также обеспечивают путь антисмыслового ингибирования в уменьшении экспрессии гена-мишени.

Могут быть предпочтительными подходящие серо(S)содержащие межнуклеотидные связи в том виде, в котором они предложены в данном документе. Фосфоротиоатные межнуклеотидные связи также являются предпочтительными, особенно для области гэпа (В) гэпмеров. Фосфоротиоатные связи также могут использоваться для фланкирующих областей (А и С, и для связывания А или C с D, и в пределах области D, сообразно ситуации).

Области А, В и С, однако, могут содержать межнуклеотидные связи, отличные от фосфоротиоатных, такие как фосфодиэфирные связи, в частности, например, когда применение нуклеотидных аналогов защищает межнуклеотидные связи в пределах областей А и С от эндонуклеазной деградации - как, например, когда области А и С содержат нуклеотиды LNA.

Межнуклеотидные связи в ASO могут быть фосфодиэфирными, фосфоротиоатными или боранофосфатными так, чтобы обеспечивать расщепление РНКазой Н РНК-мишени. Фосфоротиоат является предпочтительным из-за улучшенной нуклеазоустойчивости и других причин, таких как легкость получения.

В некоторых воплощениях межнуклеотидные связи содержат одну или более чем одну стереоопределенную межнуклеотидную связь (например, такую как стереоопределенные модифицированные фосфатные связи, например, фосфодиэфирные, фосфоротиоатные или боранофосфатные связи с определенной стереохимической структурой). Термин «стереоопределенная межнуклеотидная связь» используется взаимозаменяемо с «хирально контролируемой межнуклеотидной связью» и относится к межнуклеотидной связи, в которой стереохимическое обозначение атома фосфора контролируется таким образом, что в пределах нити ASO присутствует конкретное количество межнуклеотидной связи R_p или S_p. Стереохимическое обозначение хиральной связи может определяться (контролироваться), например, асимметрическим синтезом. ASO, имеющий по меньшей мере одну стереоопределенную межнуклеотидную связь, может называться стереоопределенным ASO, который включает и полностью стереоопределенный ASO, и частично стереоопределенный ASO.

В некоторых воплощениях ASO является полностью стереоопределенным. Термин «полностью стереоопределенный ASO» относится к последовательности ASO, имеющей определенный хиральный центр (R_p или S_p) в каждой межнуклеотидной связи в данном ASO. В некоторых воплощениях ASO является частично стереоопределенным. Термин «частично стереоопределенный ASO» относится к последовательности ASO, имеющей определенный хиральный центр (R_p или S_p) в по меньшей мере одной межнуклеотидной связи, но не во всех межнуклеотидных связях. Следовательно, частично стереоопределенный ASO может включать связи, которые являются ахиральными или стереонеопределенными, помимо по меньшей мере одной стереоопределенной связи. Когда межнуклеотидная связь в ASO является стереоопределенной, желательная конфигурация - или R_p, или S_p - присутствует в по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или по существу 100% ASO.

В одном аспекте ASO по данному раскрытию нуклеотиды и/или нуклеотидные аналоги связываются друг с другом посредством фосфоротиоатных групп. С олигонуклеотидами по данному изобретению полезно использовать фосфоротиоатные межнуклеозидные связи.

Фосфоротиоатные межнуклеозидные связи являются особенно полезными из-за нуклеазоустойчивости, полезной фармакокинетики и легкости получения. В некоторых воплощениях по меньшей мере 50% межнуклеозидных связей в олигонуклеотиде или его непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой фосфоротиоат, как, например, по меньшей мере 60%, как, например, по меньшей мере 70%, как, например, по меньшей мере 75%, как, например, по меньшей мере 80% или как, например, по меньшей мере 90% межнуклеозидных связей в олигонуклеотиде или его непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой фосфоротиоат. В некоторых воплощениях все межнуклеозидные связи олигонуклеотида или его непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой фосфоротиоат.

Признается то, что включение фосфодиэфирных связей, как, например, одной или двух связей, в ином отношении фосфоротиоатный ASO, особенно между или рядом со звеньями нуклеотидных аналогов (типично в области А и/или С) может модифицировать биодоступность и/или биораспределение ASO - см. WO 2008/113832, тем самым включенную посредством ссылки.

В некоторых воплощениях, таких как воплощения, на которые дается ссылка выше, где это является подходящим и конкретно не указывается, все остальные связывающие группы представляют собой либо фосфодиэфирные, либо фосфоротиоатные, либо их смесь.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид по данному изобретению содержит и фосфоротиоатные межнуклеозидные связи, и по меньшей мере одну фосфодиэфирную связь, как, например, 2, 3 или 4 фосфодиэфирные связи, помимо фосфородитиоатной(ных) связи(зей). В гэпмерном олигонуклеотид е фосфодиэфирные связи, при наличии, подходящим образом не располагаются между смежными нуклеозидами ДНК в области гэпа - G.

В некоторых воплощениях все межнуклеотидные связывающие группы представляют собой фосфоротиоат.

При ссылке на конкретные олигонуклеотидые последовательности гэпмеров, такие как последовательности, предложенные в данном документе, будет понятно то, что, в разных воплощениях, когда связи представляют собой фосфоротиоатные связи, можно использовать альтернативные связи, такие как связи, раскрытые в данном документе, например, можно использовать фосфатные (фосфодиэфирные) связи, в частности, для связей между нуклеотидными аналогами, такими как звенья LNA. Подобным образом, при ссылке на конкретные олигонуклеотидые последовательности гэпмеров, такие как последовательности, предложенные в данном документе, когда остатки С аннотируются как цитозин, модифицированный 5'-метилом, в разных воплощениях один или более чем один присутствующий Cs в ASO может представлять собой немодифицированные остатки С.

Публикация США №2011/0130441, которая была опубликована 2 июня 2011 г. и включается в данный документ посредством ссылки во всей ее полноте, относится к соединениям ASO, имеющим по меньшей мере один бициклический нуклеозид, присоединенный к 3'- или 5'-концам нейтральной межнуклеозидной связью. ASO по данному раскрытию могут, следовательно, иметь по меньшей мере один бициклический нуклеозид, присоединенный к 3'- или 5'-концам нейтральной межнуклеозидной связью, такой как один или более чем один фосфотриэфир, метилфосфонат, MMI (3'-СН₂-N(CH₃)-O-5'), амид-3 (3'-СН₂-С(=O)-N(H)-5'), формацеталь (3'-О-СН₂-O-5') или тиоформацеталь (3'-S-СН₂-O-5'). Остальные связи могут представлять собой фосфоротиоат.

В некоторых воплощениях ASO по данному раскрытию имеют межнуклеотидные связи, описанные на ФИГ. 1А-1С и 2. В том виде, в котором они используются в данном документе, например, на ФИГ. 1А-1С и 2, фосфоротиоатные связи указываются как «s», а фосфодиэфирные связи указываются отсутствием «s».

II.I. Конъюгаты

Термин «конъюгат» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к олигонуклеотиду, который ковалентно связан с ненуклеотидной группировкой (конъюгатной группировкой или областью С, или третьей областью).

Конъюгирование олигонуклеотида по данному раскрытию с одной или более чем одной ненуклеотидной группировкой может улучшать фармакологию данного олигонуклеотида, например, влияя на активность, клеточное распределение, клеточное поглощение или стабильность данного олигонуклеотида. В некоторых воплощениях конъюгатная группировка модифицирует или улучшает фармакокинетические свойства олигонуклеотида посредством улучшения клеточного распределения, биодоступности, метаболизма, экскреции, проницаемости и/или клеточного поглощения данного олигонуклеотида. В частности, данный конъюгат может нацеливать олигонуклеотид в конкретный орган, ткань или тип клеток и, посредством этого, увеличивать эффективность олигонуклеотида в данном органе, ткани или типе клеток. В то же самое время конъюгат может служить для уменьшения активности олигонуклеотида в типах клеток, тканях или органах, не являющихся мишенями, например, активности вне мишени или активности в типах клеток, тканях или органах, не являющихся мишенями. В WO 93/07883 и WO 2013/033230 предложены подходящие конъюгатные группировки. Другими подходящими конъюгатными группировками являются группировки, способные к связыванию с рецептором асиалогликопротеина (ASGPr). В частности, для связывания с ASGPr подходят конъюгатные группировки трехвалентного N-ацетилгалактозамина, см., например, WO 2014/076196, WO 2014/207232 и WO 2014/179620.

Конъюгаты олигонуклеотидов и их синтез также были описаны во всеобъемлющих обзорах Manoharan в Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, ST. Crooke, ed., Ch. 16, Marcel Dekker, Inc., 2001 и Manoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103.

В одном воплощении ненуклеотидная группировка (конъюгатная группировка) выбрана из группы, состоящей из углеводов (например, GalNAc), лигандов рецептора поверхности клетки, лекарственных веществ, гормонов, липофильных веществ, полимеров, белков, пептидов, токсинов (например, бактериальных токсинов), витаминов, вирусных белков (например, капсиды) и их комбинаций.

В некоторых воплощениях коньюгатом является антитело или фрагмент антитела, который имеет специфичную аффинность в отношении рецептора трансферрина, например, как раскрыто в WO 2012/143379, включенной тем самым посредством ссылки. В некоторых воплощениях ненуклеотидная группировка представляет собой антитело или фрагмент антитела, как, например, антитело или фрагмент антитела, который облегчает доставку через гематоэнцефалический барьер, в частности, антитело или фрагмент антитела, нацеленный на рецептор трансферрина.

II.J. Активированные ASO

Термин «активированные ASO» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к ASO по данному раскрытию, который ковалентно связан (т.е. функционализирован) с по меньшей мере одной функциональной группировкой, которая обеспечивает ковалентную связь данного ASO с одной или более чем одной конъюгатной группировкой, т.е. группировками, которые сами не являются нуклеиновыми кислотами или мономерами, с образованием конъюгатов, описанных в данном документе. Типично функциональная группировка будет содержать химическую группу, которая способна к ковалентному связыванию с ASO, например, через 3'-гидроксильную группу или экзоциклическую NH2 группу аденинового основания, спейсер, который может быть гидрофильным, и концевую группу, которая способна к связыванию с конъюгатной группировкой (например, амино, сульфгидрильная или гидроксильная группа). В некоторых воплощениях данная концевая группа является незащищенной, например, представляет собой группу NH2. В других воплощениях данная концевая группа является защищенной, например, посредством любой подходящей защитной группы, такой как группы, описанные в "Protective Groups in Organic Synthesis" Theodora W Greene and Peter G.M. Wuts, 3^rd edition (John Wiley & Sons, 1999).

В некоторых воплощениях ASO по данному раскрытию функционализируются на 5'-конце для того, чтобы обеспечивать ковалентное присоединение конъюгатной группировки к 5'-концу ASO. В других воплощениях ASO по данному раскрытию могут быть функционализированы на 3'-конце. В других воплощениях ASO по данному раскрытию могут быть функционализированы вдоль остова или на группировке гетероциклического основания. В других воплощениях ASO по данному раскрытию могут быть функционализированы в более чем одном положении, независимо выбранном из 5'-конца, 3'-конца, остова и основания.

В некоторых воплощениях активированные ASO по данному раскрытию синтезируются посредством включения во время синтеза одного или более чем одного мономера, который ковалентно присоединяется к функциональной группировке. В других воплощениях активированные ASO по данному раскрытию синтезируются с мономерами, которые не были функционализированы, и данные ASO функционализируются при завершении синтеза.

III. Фармацевтические композиции и пути введения

ASO по данному раскрытию могут использоваться в фармацевтических препаратах и композициях. Подходящим образом, такие композиции содержат фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель, соль или адъювант.

ASO по данному раскрытию могут быть включены в единичиный препарат, как, например, в фармацевтически приемлемом носителе или разбавителе, в достаточном количестве для доставки пациенту терапевтически эффективного количества без вызова серьезных побочных эффектов у подвергающегося лечению пациента. Однако при некоторых видах терапии серьезные побочные эффекты могут быть приемлемыми в показателях обеспечения положительного исхода терапевтического лечения.

Лекарственное средство, полученное в лекарственной форме, может содержать фармацевтически приемлемые связывающие агенты и адъюванты. Капсулы, таблетки или пилюли могут содержать, например, следующие соединения: микрокристаллическая целлюлоза, камедь или желатин в качестве связывающих агентов; крахмал или лактоза в качестве эксципиентов; стеараты в качестве смазок; разные подсластители или корригенты. Для капсул единица дозировки может содержать жидкий носитель, подобный жирным маслам. Подобным образом, частью единицы дозирования может быть покрытие из сахара или энтеросолюбильных средств. Препараты олигонуклеотидов также могут представлять собой эмульсии активных фармацевтических ингредиентов и липида, образующего мицеллярную эмульсию.

Фармацевтические композиции по настоящему раскрытию могут вводиться целым рядом способов, в зависимости от того, является ли желательным местное или системное лечение, и от области, подлежащей лечению. Введение может быть (а) пероральным, (б) легочным, например, посредством ингаляции или вдувания порошков или аэрозолей, включая посредством небулайзера, внутритрахеально, интраназально, (в) местным, включая эпидермальное, чрескожное, глазное и на слизистные оболочки, включая вагинальную и ректальную доставку; (г) парентеральным, включая внутривенную, внутриартериальную, подкожную, внутрибрюшинную или внутримышечную инъекцию или инфузию; или внутричерепным, например, интратекальным, интрацеребровентрикулярным, интравитреальным или интравентрикулярным введением. В одном воплощении ASO вводится в.в. (внутривенно), в.б. (внутрибрюшинно), перорально, местно или в виде болюсной инъекции, или вводится непосредственно в орган-мишень. В другом воплощении ASO вводится интратекально или интрацеребровентрикулярно в виде болюсной инъекции.

Фармацевтические композиции и препараты для местного введения могут включать чрескожные пластыри, мази, лосьоны, кремы, гели, капли, спреи, суппозитории, жидкости и порошки.

Могут быть необходимыми или желательными традиционные фармацевтические носители, водные, порошковые или масляные основы. Примеры местных препаратов включают препараты, в которых ASO по данному раскрытию находятся в смеси со средством для местной доставки, таким как липиды, липосомы, жирные кислоты, сложные эфиры жирных кислот, стероиды, хелаторы и поверхностно-активные средства. Композиции и препараты для перорального введения включают порошки или гранулы, микрочастицы, наночастицы, суспензии или растворы в воде или неводных средах, капсулы, гелевые капсулы, пакетки, таблетки или минитаблетки, но не ограничиваются ими. Композиции и препараты для парентерального, интратекального, интрацеребровентрикулярного или интравентрикулярного введения могут включать стерильные водные растворы, которые также могут содержать буферы, разбавители и другие подходящие добавки, такие как усилители проникновения, соединения-носители и другие фармацевтически приемлемые носители или эксципиенты, но не ограничиваются ими.

Фармацевтические композиции по настоящему раскрытию включают растворы, эмульсии и препараты, содержащие липосомы, но не ограничиваются ими. Данные композиции могут быть получены из целого ряда компонентов и включают заранее приготовленные жидкости, самоэмульгирующие твердые вещества и самоэмульгирующие полутвердые вещества, но не ограничиваются ими. Доставка лекарственного средства в ткань-мишень может усиливаться доставкой, опосредованной носителем, включающей катионные липосомы, циклодекстрины, производные порфирина, дендримеры с разветвленной цепью, полимеры полиэтиленимина, наночастицы и микросферы (Dass CR. J Pharm Pharmacol 2002; 54(1):3-27).

Фармацевтические препараты по настоящему раскрытию, которые могут быть с удобством представлены в стандартной лекарственной форме, могут быть получены согласно традиционным методикам, хорошо известным в фармацевтической промышленности. Такие методики включают стадию приведения в ассоциацию активных ингредиентов с фармацевтическим(ми) носителем(лями) или эксципиентом(тами). В общем, данные препараты получают посредством однородного и тесного приведения в ассоциацию активных ингредиентов с жидкими носителями или мелко измельченными твердыми носителями, или и теми, и другими, и затем, если необходимо, формовки продукта.

Для парентерального, подкожного, внутрикожного или местного введения данный препарат может включать стерильный разбавитель, буферы, регуляторы тоничности или антибактериальные средства. Активные ASO могут быть получены с носителями, которые защищают против деградации или немедленного устранения из организма, включая импланты или микрокапсулы со свойствами контролируемого высвобождения. Для внутривенного введения носителями могут быть физиологический раствор или фосфатно-солевой буферный раствор. В международной публикации № WO 2007/031091 (А2), опубликованной 22 марта 2007 г., дополнительно предложены подходящие фармацевтически приемлемые разбавитель, носитель и адъюванты, которые тем самым включаются посредством ссылки.

Согласно данному изобретению также предложено применение олигонуклеотида или конъюгата олигонуклеотида по изобретению, как описано для изготовления лекарственного средства, где данное лекарственное средство находится в лекарственной форме для интратекального или интрацеребровентрикулярного введения.

IV. Диагностика

В данном раскрытии дополнительно предложен полезный диагностический способ во время постановки диагноза заболеваний, связанных с SNCA, например, синуклеинопатии. Неограничивающие примеры синуклеинопатии включают болезнь Паркинсона, деменцию при болезни Паркинсона (PDD), деменцию с тельцами Леви и множественную системную атрофию, но не ограничиваются ими.

ASO по данному раскрытию могут использоваться для измерения экспрессии транскрипта SNCA в ткани или жидкости организма от индивида и сравнения измеренного уровня экспрессии со стандартным уровнем экспрессии транскрипта SNCA в нормальной ткани или жидкости организма, при этом увеличение уровня экспрессии по сравнению со стандартом указывает на расстройство, поддающееся лечению ASO по данному раскрытию.

ASO по данному раскрытию можно использовать для анализа уровней транскрипта SNCA в биологическом образце с использованием любых способов, известных обычным специалистам в данной области. (Touboul et al., Anticancer Res. (2002) 22 (6A): 3349-56; Verjout et al., Mutat. Res. (2000) 640: 127-38); Stowe et al., J. Virol. Methods (1998) 75 (1): 93-91).

Под «биологическим образцом» подразумевается любой биологический образец, получаемый из индивида, линии клеток, культуры ткани или другого источника клеток, потенциально экспрессирующих транскрипт SNCA. Способы получения биопсий тканей и жидкостей организма от млекопитающих хорошо известны в данной области.

V. Наборы, содержащие ASO

В данном раскрытии дополнительно предложены наборы, которые содержат ASO по данному раскрытию, описанный в данном документе и который может быть использован для осуществления способов, описанных в данном документе. В некоторых воплощениях данный набор содержит по меньшей мере один ASO в одном или более чем одном контейнере. В некоторых воплощениях данные наборы содержат все необходимые и/или достаточные компоненты для осуществления анализа выявления, включая все контроли, руководства для осуществления анализов и любую необходимую программу для анализа и презентации результатов. Специалист в данной области легко узнает то, что раскрытый ASO может быть легко включен в один из установленных форматов наборов, которые хорошо известны в данной области.

VI. Способы применения

ASO по данному раскрытию могут использоваться для терапии и профилактики.

SNCA представляет собой белок из 140 аминокислот, предпочтительно экспрессируемый в нейронах на пресинаптических окончаниях, где он, как полагают, играет роль в регуляции синаптической передачи. Предполагают, что он существует в природе и как несвернутый мономер, и как стабильный тетрамер из α-спиралей, и было показано, что он подвергается нескольким посттрансляционным модификациям. Одной модификацией, которую широко исследовали, является фосфорилирование SNCA на аминокислоте серине 129 (S129). Обычно лишь небольшая процентная доля SNCA конститутивно фосфорилируется на S129 (pS129), тогда как подавляющее большинство SNCA, находящегося в патологических внутриклеточных включениях, представляет собой SNCA pS129. Данные патологические включения состоят из агрегировавших, нерастворимых скоплений неправильно свернутых белков SNCA и являются характерной чертой группы нейродегенеративных заболеваний, известных в совокупности как синуклеинопатии.

При синуклеинопатиях SNCA может образовать патологические агрегаты в нейронах, известные как тельца Леви, которые характерны и для болезни Паркинсона (PD), и для деменции при болезни Паркинсона (PDD), и для деменции с тельцами Леви (DLB). Настоящие ASO, следовательно, могут уменьшать число патологических агрегатов SNCA или предупреждать образование патологических агрегатов SNCA. Кроме того, в олигодендроцитах обнаруживаются ненормальные обогащенные SNCA поражения, именуемые глиальными цитоплазматическими включениями (GCI), и они представляют отличительный признак быстро прогрессирующей, смертельной синукленопатии, известной как множественная системная атрофия (MSA). В некоторых воплощениях ASO по данному раскрытию уменьшают число GCI или предупреждают образование GCI. Сообщения о либо невыявляемых, либо низких уровнях экспрессии мРНК SNCA в олигодендроцитах свидетельствуют о том, что некоторая патологическая форма SNCA распространяется из нейронов, где она высоко экспресируется, в олигодендроциты. В некоторых воплощениях ASO по данному раскрытию уменьшают или предупреждают распространение SNCA, например, патологической формы SNCA, из нейронов.

Данные ASO могут использоваться в исследованиях, например, для специфичного ингибирования синтеза белка SNCA (типично посредством деградации или ингибирования мРНК и, посредством этого, предотвращения образования белка) в клетках и экспериментальных животных, облегчая, посредством этого, функциональный анализ мишени или оценку ее полезности в качестве мишени для терапевтического вмешательства. Дополнительно предложены способы понижающей регуляции экспрессии мРНК SNCA и/или белка SNCA в клетках или тканях, включающие приведение клеток или тканей в контакт, in vitro или in vivo, с эффективным количеством одного или более чем одного ASO, конъюгата или композиции по данному раскрытию.

Для терапии животное или человека, подозреваемых в наличии заболевания или расстройства, которые можно лечить модулированием экспрессии транскрипта SNCA и/или белка SNCA, лечат введением соединений ASO согласно данному раскрытию. Кроме того, предложены способы лечения млекопитающего, как, например, лечения человека, подозреваемого в наличии или склонного к заболеванию или состоянию, ассоциированных с экспрессией транскрипта SNCA и/или белка SNCA, посредством введения терапевтически или профилактически эффективного количества одного или более чем одного ASO или композиций по данному раскрытию. ASO, конъюгат или фармацевтическую композицию согласно данному раскрытию типично вводят в эффективном количестве. В некоторых воплощениях ASO или конъюгат по данному раскрытию используется в терапии.

Согласно данному раскрытию дополнительно предложены ASO согласно раскрытию для применения в лечении одного или более чем одного заболевания, на которое дается ссылка в данном документе, такого как заболевание, выбранное из группы, состоящей из болезни Паркинсона, деменции при болезни Паркинсона (PDD), деменции с тельцами Леви, множественной системной атрофии и любых их комбинаций.

В данном раскрытии дополнительно предложен способ лечения α-синуклеинопатий, включающий введение эффективного количества одного или более чем одного ASO, их конъюгатов или фармацевтических композиций животному, нуждающемуся в этом (такому как пациент, нуждающийся в этом).

В некоторых воплощениях данное заболевание, расстройство или состояние ассоциировано со сверхэкспрессией транскрипта гена SNCA и/или белка SNCA.

Согласно данному раскрытию также предложены способы ингибирования (например, уменьшения) экспрессии транскрипта гена SNCA и/или белка SNCA в клетке или ткани, включающие приведение клетки или ткани в контакт in vitro или in vivo с эффективным количеством одного или более чем одного ASO, их конъюгатов или фармацевтических композиций по данному раскрытию для влияния на деградацию экспрессии транскрипта гена SNCA, посредством этого, уменьшая уровень белка SNCA.

В некоторых воплощениях ASO используются для уменьшения экспрессии мРНК SNCA в одном или более чем одном срезе мозга, например, гиппокампа, ствола мозга, стриатума или любых их комбинациях. В других воплощениях ASO уменьшают экспрессию мРНК SNCA, например, в стволе мозга и/или стриатуме до меньше чем 70%, меньше чем 60%, меньше чем 50%, меньше чем 40%, меньше чем 30%, меньше чем 20%, меньше чем 10% или меньше чем 5% по сравнению с экспрессией мРНК SNCA после введения или подвергания воздействию носителя (без ASO) в сутки 3, сутки 5, сутки 7, сутки 10, сутки 14, сутки 15, сутки 20, сутки 21 или сутки 25. В некоторых воплощениях экспрессия мРНК SNCA поддерживается на уровне меньше 70%, меньше 60%, меньше 50%, меньше 40%, меньше 30%, меньше 20%, меньше 10% или меньше 5% по сравнению с экспрессией мРНК SNCA после введения или подвергания воздействию носителя (без ASO) до суток 28, суток 30, суток 32, суток 35, суток 40, суток 42, суток 45, суток 49, суток 50, суток 56, суток 60, суток 63, суток 70 или суток 75.

В других воплощениях ASO по настоящему раскрытию уменьшают экспрессию мРНК SNCA и/или белка SNCA в медулле, дорсальном стриатуме, варолиевом мосту, поясничном отделе спинного мозга, лобной коре и/или любой их комбинации.

Согласно данному раскрытию также предложено применение ASO или конъюгата по данному раскрытию, как описано для изготовления лекарственного средства. Согласно данному раскрытию также предложена композиция, содержащая ASO или его конъюгат для применения в лечении расстройства, на которое дается ссылка в данном документе, или для способа лечения расстройства, на которое дается ссылка в данном документе. Согласно настоящему раскрытию также предложены ASO или конъюгаты для применения в терапии. Согласно настоящему раскрытию дополнительно предложены ASO или конъюгаты для применения в лечении синуклеинопатии.

Согласно данному раскрытию дополнительно предложен способ ингибирования белка SNCA в клетке, которая экспрессирует SNCA, включающий введение ASO или конъюгата согласно данному раскрытию в клетку таким образом, чтобы воздействовать на ингибирование белка SNCA в клетке.

Данное раскрытие включает способ уменьшения, снижения интенсивности, предупреждения или лечения нейрональной гипервозбудимости у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение ASO или конъюгата согласно данному раскрытию.

Согласно данному раскрытию также предложен способ лечения расстройства, на которое дается ссылка в данном документе, включающий введение ASO или конъюгата согласно данному раскрытию, как описано в данном документе, и/или фармацевтической композиции согласно данному раскрытию пациенту, нуждающемуся в этом.

ASO и другие композиции согласно данному раскрытию можно использовать для лечения условий, ассоциированных со сверхэкспрессией или экспрессией мутировавшей версии белка SNCA.

В данном раскрытии предложен ASO или конъюгат по данному раскрытию для применения в качестве лекарственного средства, как, например, для лечения α-синуклеинопатий. В некоторых воплощениях α-синуклеинопатия представляет собой заболевание, выбранное из группы, состоящей из болезни Паркинсона, деменции при болезни Паркинсона (PDD), деменции с тельцами Леви, множественной системной атрофии и их любых комбинаций.

В данном раскрытии дополнительно предложено применение ASO по данному раскрытию в изготовлении лекарственного средства для лечения заболевания, расстройства или состояния, на которое дается ссылка в данном документе. В некоторых воплощениях ASO или конъюгат по данному раскрытию используется для изготовления лекарственного средства для лечения α-синуклеинопатии, судорожного расстройства или их кобинации.

В общем говоря, один аспект данного раскрытия направлен на способ лечения млекопитающего, страдающего от или чувствительного к состояниям, ассоциированным с ненормальными уровнями SNCA, т.е. α-синуклеинопатии, включающий введение данному млекопитающему терапевтически эффективного количества ASO, нацеленного на транскрипт SNCA, который содержит одно или более чем одно звено LNA. Данный ASO, конъюгат или фармацевтическая композиция согласно данному раскрытию типично вводится в эффективном количестве.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид, конъюгат олигонуклеотида или фармацевтическая композиция по данному изобретению вводится в дозе 0,1-15 мг/кг, как, например, 0,2-10 мг/кг, как, например, 0,25-5 мг/кг. Введение может осуществляться один раз в неделю, каждую 2-ую неделю, каждую третью неделю или даже один раз в месяц.

Заболевание или расстройство в том виде, в котором на них дается ссылка в данном документе, в некоторых воплощениях может быть ассоциировано с мутацией в гене SNCA или гене, белковый продукт которого ассоциирован с или взаимодействует с белком SNCA. Следовательно, в некоторых воплощениях мРНК-мишень представляет собой мутировавшую форму последовательности SNCA.

Интересный аспект данного раскрытия направлен на применение ASO (соединения), как определено в данном документе, или конъюгата, как определено в данном документе, для получения лекарственного средства для лечения заболевания, расстройства или состояния, на которые дается ссылка в данном документе.

Способы по данному раскрытию можно использовать для лечения или профилактики против заболеваний, вызванных ненормальными уровнями белка SNCA. В некоторых воплощениях заболевания, вызванные ненормальными уровнями белка SNCA, представляют собой α-синуклеинопатии. В некоторых воплощениях α-синуклеинопатии включают болезнь Паркинсона, деменцию при болезни Паркинсона (PDD), деменцию с тельцами Леви и множественную системную атрофию.

Выражаясь альтернативно, в некоторых воплощениях данное раскрытие, кроме того, направлено на способ лечения ненормальных уровней белка SNCA, включающий введение ASO по данному раскрытию или конъюгата по данному раскрытию, или фармацевтической композиции по данному раскрытию пациенту, нуждающемуся в этом.

Данное раскрытие также относится к ASO, композиции или конъюгату, как определено в данном документе, для применения в качестве лекарственного средства.

Данное раскрытие дополнительно относится к применению соединения, композиции или конъюгата, как определено в данном документе, для изготовления лекарственного средства для лечения ненормальных уровней белка SNCA или экспрессии мутантных форм белка SNCA (таких как аллельные варианты, таких как аллельные варианты, ассоциированные с одним из заболеваний, на которые дается ссылка в данном документе).

Пациент, который нуждается в лечении, представляет собой пациента, страдающего или вероятно страдающего от данного заболевания или расстройства.

В практике настоящего раскрытия будут использоваться, если не указано иное, традиционные методики клеточной биологии, культивирования клеток, молекулярной биологии, трансгенной биологии, микробиологии, генной инженерии и иммунологии, которые находятся в пределах квалификации в данной области. Такие методики полностью объясняются в литературе. См., например, Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2^nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D.N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis et al. патент США №4683195; Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; монография, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 и 155; Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London); Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); Crooke, Antisense drug Technology: Principles, Strategies and Applications, 2^nd Ed. CRC Press (2007) и в Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.).

Все процитированные выше ссылки, а также все ссылки, процитированные в данном документе, включаются в данный документ посредством ссылки во всей их полноте.

ВОПЛОЩЕНИЯ

1. Антисмысловой олигонуклеотид, содержащий непрерывную нуклеотидную последовательность из 10-30 нуклеотидов в длину, которая является комплементарной последовательности нуклеиновой кислоты в пределах транскрипта альфа-синуклеина (SNCA), где данная последовательность нуклеиновой кислоты выбрана из группы, состоящей из (i) нуклеотидов 4942 - 5343 SEQ ID NO: 1; (ii) нуклеотидов 6326 - 7041 SEQ ID NO: 1; (iia) нуклеотидов 6336 - 7041 SEQ ID NO: 1; (iii) нуклеотидов 7329 - 7600 SEQ ID NO: 1; (iv) нуклеотидов 7630 - 7783 SEQ ID NO: 1; (iva) нуклеотидов 7750 - 7783 SEQ ID NO: 1; (v) нуклеотидов 8277 - 8501 SEQ ID NO: 1; (vi) нуклеотидов 9034 - 9526 SEQ ID NO: 1; (vii) нуклеотидов 9982 - 14279 SEQ ID NO: 1; (viii) нуклеотидов 15204 - 19041 SEQ ID NO: 1; (ix) нуклеотидов 20351 - 29654 SEQ ID NO: 1; (ixa) нуклеотидов 20351 - 20908 SEQ ID NO: 1; (ixb) нуклеотидов 21052 - 29654 SEQ ID NO: 1; (x) нуклеотидов 30931 - 33938 SEQ ID NO: 1; (xi) нуклеотидов 34932 - 37077 SEQ ID NO: 1; (xii) нуклеотидов 38081 - 42869 SEQ ID NO: 1; (xiii) нуклеотидов 44640 - 44861 SEQ ID NO: 1; (xiv) нуклеотидов 46173 - 46920 SEQ ID NO: 1; (xv) нуклеотидов 47924 - 58752 SEQ ID NO: 1; (xvi) нуклеотидов 60678 - 60905 SEQ ID NO: 1; (xvii) нуклеотидов 62066 - 62397 SEQ ID NO: 1; (xviii) нуклеотидов 67759 - 71625 SEQ ID NO: 1; (xix) нуклеотидов 72926 - 86991 SEQ ID NO: 1; (xx) нуклеотидов 88168 - 93783 SEQ ID NO: 1; (xxi) нуклеотидов 94976 - 102573 SEQ ID NO: 1; (xxii) нуклеотидов 104920 - 107438 SEQ ID NO: 1; (xxiii) нуклеотидов 108948 - 119285 SEQ ID NO: 1; (xxiiia) нуклеотидов 108948 - 114019 SEQ ID NO: 1; (xxiib) нуклеотидов 114292 - 116636 SEQ ID NO: 1; (xxiv) нуклеотидов 131 - 678 SEQ ID NO: 5; (xxv) нуклеотидов 131 - 348 SEQ ID NO: 3; (xxvi) нуклеотидов 1 - 162 SEQ ID NO: 4; (xxvii) нуклеотидов 126 - 352 SEQ ID NO: 2; (xxviii) нуклеотидов 276 - 537 SEQ ID NO: 2; (xxix) нуклеотидов 461 - 681 SEQ ID NO: 2 и (ххх) нуклеотидов 541 - 766 SEQ ID NO: 2.

2. Антисмысловой олигонуклеотид по воплощению 1, в котором последовательность нуклеиновой кислоты выбрана из группы, состоящей из (i) нуклеотидов 4992 - 5109 SEQ ID NO: 1; (ii) нуклеотидов 6376 - 6991 SEQ ID NO: 1; (iii) нуклеотидов 7379 - 7600 SEQ ID NO: 1; (iv) нуклеотидов 7630 - 7733 SEQ ID NO: 1; (v) нуклеотидов 8327 - 8451 SEQ ID NO: 1; (vi) нуклеотидов 9084 - 9476 SEQ ID NO: 1; (vii) нуклеотидов 10032 - 14229 SEQ ID NO: 1; (viii) нуклеотидов 15254 - 18991 SEQ ID NO: 1; (ix) нуклеотидов 20401 - 29604 SEQ ID NO: 1; (x) нуклеотидов 30981 - 33888 SEQ ID NO: 1; (xi) нуклеотидов 34982 - 37027 SEQ ID NO: 1; (xii) нуклеотидов 38131 - 42819 SEQ ID NO: 1; (xiii) нуклеотидов 44690 - 44811 SEQ ID NO: 1; (xiv) нуклеотидов 46223 - 46870 SEQ ID NO: 1; (xv) нуклеотидов 47974 - 58702 SEQ ID NO: 1; (xvi) нуклеотидов 60728 - 608555 SEQ ID NO: 1; (xvii) нуклеотидов 62116 - 62347 SEQ ID NO: 1; (xviii) нуклеотидов 67809 - 71575 SEQ ID NO: 1; (xix) нуклеотидов 72976 - 86941 SEQ ID NO: 1; (xx) нуклеотидов 88218 - 93733 SEQ ID NO: 1; (xxi) нуклеотидов 95026 - 102523 SEQ ID NO: 1; (xxii) нуклеотидов 104970 - 107388 SEQ ID NO: 1; (xxiii) нуклеотидов 108998 - 119235 SEQ ID NO: 1; (xxiv) нуклеотидов 181 - 628 SEQ ID NO: 5; (xxv) нуклеотидов 181 - 298 SEQ ID NO: 3; (xxvi) нуклеотидов 15 - 112 SEQ ID NO: 4; (xxvii) нуклеотидов 176 - 302 SEQ ID NO: 2; (xxviii) нуклеотидов 326 - 487 SEQ ID NO: 2; (xxix) нуклеотидов 511 - 631 SEQ ID NO: 2 и (ххх) нуклеотидов 591 - 716 SEQ ID NO: 2.

3. Антисмысловой олигонуклеотид по воплощению 1, в котором последовательность нуклеиновой кислоты выбрана из группы, состоящей из (i) нуклеотидов 5042 - 5243 SEQ ID NO: 1; (ii) нуклеотидов 6426 - 6941 SEQ ID NO: 1; (iii) нуклеотидов 7429 - 7600 SEQ ID NO: 1; (iv) нуклеотидов 7630 - 7683 SEQ ID NO: 1; (v) нуклеотидов 8377 - 8401 SEQ ID NO: 1; (vi) нуклеотидов 9134 - 9426 SEQ ID NO: 1; (vii) нуклеотидов 10082 - 14179 SEQ ID NO: 1; (viii) нуклеотидов 15304 - 18941 SEQ ID NO: 1; (ix) нуклеотидов 20451 - 29554 SEQ ID NO: 1; (x) нуклеотидов 31031 - 33838 SEQ ID NO: 1; (xi) нуклеотидов 35032 - 36977 SEQ ID NO: 1; (xii) нуклеотидов 38181 - 42769 SEQ ID NO: 1; (xiii) нуклеотидов 44740 - 44761 SEQ ID NO: 1; (xiv) нуклеотидов 46273 - 46820 SEQ ID NO: 1; (xv) нуклеотидов 48024 - 58752 SEQ ID NO: 1; (xvi) нуклеотидов 60778 - 60805 SEQ ID NO: 1; (xvii) нуклеотидов 62166 - 62297 SEQ ID NO: 1; (xviii) нуклеотидов 67859 - 71525 SEQ ID NO: 1; (xix) нуклеотидов 73026 - 86891 SEQ ID NO: 1; (xx) нуклеотидов 88268 - 93683 SEQ ID NO: 1; (xxi) нуклеотидов 95076 - 102473 SEQ ID NO: 1; (xxii) нуклеотидов 105020 - 107338 SEQ ID NO: 1; (xxiii) нуклеотидов 109048 - 119185 SEQ ID NO: 1; (xxiv) нуклеотидов 231 - 248 или 563 - 578 SEQ ID NO: 5; (xxv) нуклеотидов 231 - 248 SEQ ID NO: 3; (xxvi) нуклеотидов 38 - 62 SEQ ID NO: 4; (xxvii) нуклеотидов 226 - 252 SEQ ID NO: 2; (xxviii) нуклеотидов 376 - 437 SEQ ID NO: 2; (xxix) нуклеотидов 561 - 581 SEQ ID NO: 2 и (ххх) нуклеотидов 641 - 666 SEQ ID NO:2.

4. Антисмысловой олигонуклеотид по воплощению 1, в котором последовательность нуклеиновой кислоты соответствует нуклеотидам 21052 - 29654 SEQ ID NO: 1; нуклеотидам 30931 - 33938 SEQ ID NO: 1; нуклеотидам 44640 - 44861 SEQ ID NO: 1 или нуклеотидам 47924 - 58752 SEQ ID NO: 1.

5. Антисмысловой олигонуклеотид по воплощению 1 или 4, в котором последовательность нуклеиновой кислоты соответствует нуклеотидам 24483 - 28791 SEQ ID NO: 1; нуклеотидам 32225 - 32245 SEQ ID NO: 1; нуклеотидам 44740 - 44760 SEQ ID NO: 1 или нуклеотидам 48640 - 48660 SEQ ID NO: 1.

6. Антисмысловой олигонуклеотид по воплощению 1, в котором последовательность нуклеиновой кислоты соответствует (i) нуклеотидам 7502 - 7600 SEQ ID NO: 1; (ii) нуклеотидам 7630 - 7719 SEQ ID NO: 1; (iii) нуклеотидам 116881 - 117312 SEQ ID NO: 1 или (iv) нуклеотидам 118606 - 118825 SEQ ID NO: 1.

7. Антисмысловой олигонуклеотид по воплощению 1 или 6, в котором последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой нуклеотиды 116881 - 117119 SEQ ID NO: 1; нуклеотиды 116968 - 117198 SEQ ID NO: 1 или нуклеотиды 117085 - 117312 SEQ ID NO: 1.

8. Антисмысловой олигонуклеотид по воплощению 1, 6 или 7, в котором последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой (i) нуклеотиды 7552 - 7600 SEQ ID NO: 1; (ii) нуклеотиды 7630 - 7669 SEQ ID NO: 1; (iii) нуклеотиды 116931 - 117262 SEQ ID NO: 1 или (iv) нуклеотиды 118656 - 118775 SEQ ID NO: 1.

9. Антисмысловой олигонуклеотид по воплощению 8, в котором последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой нуклеотиды 116931 - 117069 SEQ ID NO: 1; нуклеотиды 117018 - 117148 SEQ ID NO: 1 или нуклеотиды 117135 - 117262 SEQ ID NO: 1.

10. Антисмысловой олигонуклеотид по воплощению 1, в котором последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой (i) нуклеотиды 116981 - 117212 SEQ ID NO: 1 или (ii) нуклеотиды 118706 - 118725 SEQ ID NO: 1.

11. Антисмысловой олигонуклеотид по воплощению 10, в котором последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой нуклеотиды 116981 - 117019 SEQ ID NO: 1; нуклеотиды 117068 - 117098 SEQ ID NO: 1 или нуклеотиды 117185 - 117212 SEQ ID NO: 1.

12. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из воплощений 1-11, который имеет от 10 до 24 нуклеотидов в длину или от 14 до 21 нуклеотида в длину.

13. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из воплощений 1-12, который имеет 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 нуклеотид в длину.

14. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из воплощений 1-13, где транскрипт SNCA содержит SEQ ID NO: 1.

15. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из воплощений 1-14, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность содержит SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 1878 с одним, двумя, тремя или четырьмя несоответствиями.

16. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из воплощений 1-15, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность содержит SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 1878.

17. Антисмысловой олигонуклеотид по воплощению 1 или 4, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность содержит последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 1302 или SEQ ID NO: 1309-1353 с не более чем 2 несоответствиями.

18. Антисмысловой олигонуклеотид по воплощению 1 или 17, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность состоит из последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 1302 или SEQ ID NO: 1309-1353.

19. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из воплощений 1, 4, 5, 11-18, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 276; 278; 296; 295; 325; 328; 326; 329; 330; 327; 332; 333; 331; 339; 341; 390; 522 и 559.

20. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из воплощений 1-19, где данный антисмысловой олигонуклеотид способен ингибировать экспрессию человеческого транскрипта SNCA в клетке, которая экспрессирует человеческий транскрипт SNCA.

21. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из воплощений 1-20, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность содержит по меньшей мере один нуклеотидный аналог.

22. Антисмысловой олигонуклеотид по воплощению 21, в котором нуклеотидный аналог представляет собой нуклеозид, модифицированный 2'-сахаром.

23. Способ по воплощению 22, в котором нуклеозид, модифицированный 2'-сахаром, представляет собой нуклеозид с модифицированным сахаром, увеличивающий аффинность.

24. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из воплощений 1-23, который представляет собой гэпмер.

25. Антисмысловой олигонуклеотид по воплощению 24, который представляет собой гэпмер с флангами с чередованием.

26. Антисмысловой олигонуклеотид по воплощению 24 или 25, который содержит формулу 5'-А-В-С-3', в которой:

а) область В представляет собой непрерывную последовательность из по меньшей мере 6 звеньев ДНК, которая способна рекрутировать РНКазу;

б) область А представляет собой последовательность первого крыла из 1-10 нуклеотидов, где данная последовательность первого крыла содержит один или более чем один нуклеотидный аналог и, возможно, одно или более чем одно звено ДНК, и где по меньшей мере один из нуклеотидных аналогов расположен на 3'-конце А; и

в) область С представляет собой последовательность второго крыла из 1 -10 нуклеотидов, где данная последовательность второго крыла содержит один или более чем один нуклеотидный аналог и, возможно, одно или более чем одно звено ДНК, и где по меньшей мере один из нуклеотидных аналогов расположен на 5'-конце С.

27. Антисмысловой олигонуклеотид по воплощению 26, в котором область А содержит 1-4 нуклеотидных аналога, область В состоит из 8-15 звеньев ДНК, и область С содержит 2-4 нуклеотидных аналога.

28. Антисмысловой олигонуклеотид по воплощению 26 или 27, в котором область А содержит комбинацию нуклеотидных аналогов и звеньев ДНК, выбранных из (i) 1-9 нуклеотидных аналогов и 1 звена ДНК; (ii) 1-8 нуклеотидных аналогов и 1-2 звеньев ДНК; (iii) 1-7 нуклеотидных аналогов и 1-3 звеньев ДНК; (iv) 1-6 нуклеотидных аналогов и 1-4 звеньев ДНК; (v) 1-5 нуклеотидных аналогов и 1-5 звеньев ДНК; (vi) 1-4 нуклеотидных аналогов и 1-6 звеньев ДНК; (vii) 1-3 нуклеотидных аналогов и 1-7 звеньев ДНК; (viii) 1-2 нуклеотидных аналогов и 1-8 звеньев ДНК и (ix) 1 нуклеотидного аналога и 1-9 звеньев ДНК.

29. Антисмысловой олигонуклеотид по воплощению 26 или 27, в котором область С содержит комбинацию нуклеотидных аналогов и звеньев ДНК, выбранных из (i) 1-9 нуклеотидных аналогов и 1 звена ДНК; (ii) 1-8 нуклеотидных аналогов и 1-2 звеньев ДНК; (iii) 1-7 нуклеотидных аналогов и 1-3 звеньев ДНК; (iv) 1-6 нуклеотидных аналогов и 1-4 звеньев ДНК; (v) 1-5 нуклеотидных аналогов и 1-5 звеньев ДНК; (vi) 1-4 нуклеотидных аналогов и 1-6 звеньев ДНК; (vii) 1-3 нуклеотидных аналогов и 1-7 звеньев ДНК; (viii) 1-2 нуклеотидных аналогов и 1-8 звеньев ДНК и (ix) 1 нуклеотидного аналога и 1-9 звеньев ДНК.

30. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из воплощений 26-29, в котором область А представляет собой первую конструкцию крыла, выбранную из любых ASO на ФИГ. 1А-1С и 2, и/или область С представляет собой вторую конструкцию крыла, выбранную из любых ASO на ФИГ. 1А-1С и 2, где верхняя буква представляет собой нуклеозидный аналог, и нижняя буква представляет собой ДНК.

31. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из воплощений 1-30, который содержит по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть, по меньшей мере семь, по меньшей мере восемь, по меньшей мере девять или по меньшей мере десять нуклеотидных аналогов.

32. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из воплощений 21-31, в котором нуклеотидный аналог или аналоги независимо выбраны из одного или более чем одного нуклеозида, модифицированного 2'-сахаром, выбранного из группы, состоящей из запертой нуклеиновой кислоты (LNA); 2'-O-алкил-РНК; 2'-амино-ДНК; 2'-фтор-ДНК; арабинонуклеиновой кислоты (ANA); 2'-фтор-ANA, гекситольной нуклеиновой кислоты (HNA), интеркалирущей нуклеиновой кислоты (INA), затрудненного этилнуклеозида (cEt), 2'-O-метилнуклеиновой кислоты (2'-ОМе), 2'-O-метоксиэтилнуклеиновой кислоты (2'-МОЕ) и их любой комбинации.

33. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из воплощений 1-32, в котором нуклеотидный аналог или аналоги содержат бициклический сахар.

34. Антисмысловой олигонуклеотид по воплощению 33, в котором бициклический сахар содержит cEt, 2'-O-затрудненный 2'-O-метоксиэтил (сМОЕ), α-L-LNA, β-D-LNA, 2'-O,4'-С-этилен-мостиковые нуклеиновые кислоты (ENA), амино-LNA, окси-LNA или тио-LNA.

35. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из воплощений 21-34, в котором нуклеотидный аналог или аналоги включают β-d-окси-lna.

36. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из воплощений 21-35, где данный антисмысловой олигонуклеотид содержит одно или более чем одно нуклеиновое основание 5'-метилцитозин.

37. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из воплощений 24-36, который содержит от двух до пяти LNA на 5'-области данного антисмыслового олигонуклеотида.

38. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из воплощений 24-37, который содержит от двух до пяти LNA на 3'-области данного антисмыслового олигонуклеотида.

39. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из воплощений 1-38, который содержит межнуклеозидную связь, выбранную из: фосфодиэфирной связи, фосфотриэфирной связи, метилфосфонатной связи, фосфорамидатной связи, фосфоротиоатной связи и их комбинаций.

40. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из воплощений 1-39, в котором 50% межнуклеозидных связей в пределах непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой фосфоротиоатные межнуклеозидные связи.

41. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из воплощений 1-40, в котором межнуклеозидная связь включает одну или более чем одну стереоопределенную, модифицированную фосфатную связь.

42. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из воплощений 1-40, в котором все межнуклеозидные связи в непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой фосфоротиоат.

43. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из воплощений 1-42, где данный антисмысловой олигонуклеотид имеет переносимость in vivo, меньшую чем или равную общему баллу 4, где общий балл представляет собой сумму единичных баллов пяти категорий, которыми являются 1) гиперактивность; 2) пониженная активность и активация; 3) моторная дисфункция и/или атаксия; 4) ненормальное положение и дыхание; и 5) тремор и/или судороги, и где единичный балл для каждой категории измеряется по шкале 0-4.

44. Антисмысловой олигонуклеотид по воплощению 43, где переносимость in vivo меньше чем или равна общему баллу 3, общему баллу 2, общему баллу 1 или общему баллу 0.

45. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из воплощений 1-44, который уменьшает экспрессию мРНК SNCA в клетке по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 60%, по меньшей мере примерно на 70%, по меньшей мере примерно на 80%, по меньшей мере примерно на 90% или примерно на 100% по сравнению с клеткой, не подвергавшейся воздействию антисмыслового олигонуклеотида.

46. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из воплощений 1-45, который уменьшает экспрессию белка SNCA в клетке по меньшей мере примерно на 60%, по меньшей мере примерно на 70%, по меньшей мере примерно на 80%, по меньшей мере примерно на 90% или по меньшей мере примерно на 95% по сравнению с клеткой, не подвергавшейся воздействию антисмыслового олигонуклеотида.

47. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из воплощений 1-46, который содержит нуклеотиды А, Т, С и G, по меньшей мере один аналог нуклеотидов А, Т, С и G, и имеет балл последовательности, больший чем или равный 0,2, где балл последовательности рассчитывается по формуле I:

48. Антисмысловой олигонуклеотид по воплощению 1-47, в котором нуклеотидная последовательность содержит, по существу состоит или состоит из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7-1878 с конструкцией, выбранной из группы, состоящей из конструкций на Фиг. 1А-1С и 2, где заглавная буква представляет собой нуклеозид с модифицированным сахаром, и строчная буква представляет собой ДНК.

49. Антисмысловой олигонуклеотид по воплощению 37, в котором нуклеотидная последовательность содержит, по существу состоит или состоит из SEQ ID NO: 1436 с конструкцией ASO-003092 и SEQ ID NO: 1547 с конструкцией ASO-003179, где заглавная буква представляет собой нуклеозидный аналог, и строчная буква представляет собой ДНК.

50. Антисмысловой олигонуклеотид по воплощению 1-48, в котором нуклеотидная последовательность содержит, по существу состоит или состоит из последовательности, выбранной из группы, где непрерывная нуклеотидная последовательность состоит из последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 1302 или SEQ ID NO: 1309-1353 с конструкцией, выбранной из группы, состоящей из конструкций на Фиг. 1А-1С, где заглавная буква представляет собой нуклеозид с модифицированным сахаром, и строчная буква представляет собой ДНК.

51. Антисмысловой олигонуклеотид по воплощению 50, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из конструкции, выбранной из группы, состоящей из:

и

где заглавные буквы указывают нуклеозидный аналог с модифицированным сахаром, и строчные буквы указывают ДНК.

52. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из воплощений 1-48, в котором нуклеотидная последовательность содержит, по существу состоит или состоит из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7-1878 с соответствующей химической структурой на ФИГ. 1А-1С и 2.

53. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из воплощений 1-52, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность имеет химическую структуру ASO-003092 или ASO-003179.

54. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из воплощений 1-52, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность имеет химическую структуру, выбранную из группы, состоящей из: ASO-008387; ASO-008388; ASO-008501; ASO-008502; ASO-008529; ASO-008530; ASO-008531; ASO-008532; ASO-008533; ASO-008534; ASO-008535; ASO-008536; ASO-008537; ASO-008543; ASO-008545; ASO-008584; ASO-008226 и ASO-008261.

55. Конъюгат, содержащий антисмысловой олигонуклеотид по любому из воплощений 1-53, в котором антисмысловой олигонуклеотид ковалентно присоединяется к по меньшей мере одной ненуклеотидной или неполинуклеотидной группировке.

56. Конъюгат по воплощению 55, в котором ненуклеотидная или неполинуклеотидная группировка содержит белок, цепь жирной кислоты, остаток сахара, гликопротеин, полимер или их любые комбинации.

57. Конъюгат по воплощению 55, где данный конъюгат представляет собой фрагмент антитела, который имеет специфичную аффинность в отношении рецептора трансферрина.

58. Фармацевтическая композиция, содержащая антисмысловой олигонуклеотид по любому из воплощений 1-57 или конъюгат по воплощению 55-57 и фармацевтически приемлемый носитель.

59. Композиция по воплощению 58, которая дополнительно содержит терапевтическое средство.

60. Композиция по воплощению 59, в которой терапевтическое средство представляет собой антагонист альфа-синуклеина.

61. Композиция по воплощению 60, в которой антагонист альфа-синуклеина представляет собой антитело против альфа-синуклеина или его фрагмент.

62. Набор, содержащий антисмысловой олигонуклеотид по любому из воплощений 1-57 или конъюгат по воплощению 55-57, или композицию по любому из воплощений 58-61 и инструкции для применения.

63. Диагностический набор, содержащий антисмысловой олигонуклеотид по любому из воплощений 1-57 или конъюгат по воплощению 55-57, или композицию по любому из воплощений 58-61 и инструкции для применения.

64. Способ ингибирования или уменьшения экспрессии белка SNCA в клетке, включающий введение антисмыслового олигонуклеотида по любому из воплощений 1-57 или конъюгата по воплощению 55-57, или композиции по любому из воплощений 58-61 в клетку, экспрессирующую белок SNCA, где экспрессия белка SNCA в клетке ингибируется или уменьшается после введения.

65. Способ по воплощению 64, в котором антисмысловой олигонуклеотид ингибирует или уменьшает экспрессию мРНК SNCA в клетке после введения.

66. Способ по воплощению 64 или 65, в котором экспрессия мРНК SNCA уменьшается по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 60%, по меньшей мере примерно на 70%, по меньшей мере примерно на 80%, по меньшей мере примерно на 90% или примерно на 100% после введения по сравнению с клеткой, не подвергавшейся воздействию антисмыслового олигонуклеотида.

67. Способ по любому из воплощений 64-66, в котором антисмысловой олигонуклеотид уменьшает экспрессию белка SNCA в клетке после введения по меньшей мере примерно на 60%, по меньшей мере примерно на 70%, по меньшей мере примерно на 80% или по меньшей мере примерно на 90% по сравнению с клеткой, не подвергавшейся воздействию антисмыслового олигонуклеотида.

68. Способ по любому из воплощений 64-67, в котором клетка представляет собой нейрон.

69. Способ лечения синуклеинопатии у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту эффективного количества антисмыслового олигонуклеотида по любому из воплощений 1-57 или конъюгата по воплощению 55-57, или композиции по любому из воплощений 58-61.

70. Применение антисмыслового олигонуклеотида по любому из воплощений 1-57 или конъюгата по воплощению 55-57, или композиции по любому из воплощений 58-61 для изготовления лекарственного средства.

71. Применение антисмыслового олигонуклеотида по любому из воплощений 1-57 или конъюгата по воплощению 55-57, или композиции по любому из воплощений 58-61 для изготовления лекарственного средства для лечения синуклеинопатии у субъекта, нуждающегося в этом.

72. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из воплощений 1-57 или конъюгат по воплощению 55-57, или композиция по любому из воплощений 58-61 для применения в терапии.

73. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из воплощений 1-57 или конъюгат по воплощению 55-57, или композиция по любому из воплощений 58-61 для применения в терапии синуклеинопатии у субъекта, нуждающегося в этом.

74. Способ по воплощению 64-69, применение по воплощению 70 или 71 или антисмысловой олигонуклеотид для применения по воплощению 72 или 73, где синуклеинопатия выбрана из группы, состоящей из болезни Паркинсона, деменции при болезни Паркинсона (PDD), множественной системной атрофии, деменции с тельцами Леви и их любых комбинаций.

75. Способ по воплощению 64-69, применение по воплощению 70 или 71 или антисмысловой олигонуклеотид для применения по воплощению 72 или 73, где субъект представляет собой человека.

76. Способ по любому из воплощений 64-69, применение по воплощению 70 или 71, или антисмысловой олигонуклеотид для применения по воплощению 72 или 73, где антисмысловой олигонуклеотид, конъюгат или композиция вводится перорально, парентерально, интратекально, интрацеребровентрикулярно, легочно, местно или интравентрикулярно.

77. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из воплощений 1-57 или конъюгат по воплощению 55-57, или композиция по любому из воплощений 58-61, набор по воплощению 62 или 63, способ по любому из воплощений 64-69, применение по воплощению 70 или 71, или антисмысловой олигонуклеотид для применения по воплощению 72 или 73, где нуклеотидный аналог содержит нуклеозид с модифицированным сахаром.

78. Способ по воплощению 64, в котором нуклеозид с модифицированным сахаром представляет собой нуклеозид с модифицированным сахаром, увеличивающий аффинность.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры предлагаются в качестве иллюстрации и не в качестве ограничения.

Пример 1: конструирование ASO

Антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в данном документе, конструировали для нацеливания на разные области в пре-мРНК SNCA, как показано в SEQ ID NO: 1 (последовательность геномного SNCA), или в кДНК SNCA, как показано в SEQ ID NO: 2, 3, 4 и 5. Например, данные ASO конструировали для нацеливания на области, обозначенные с использованием сайта начала пре-мРНКи сайта конца пре-мРНК NG_011851.1 (SEQ ID NO: 1) и/или сайта начала мРНК и сайта конца ее мРНК. Типичные последовательности данных ASO (например, SEQ ID NO) описываются на ФИГ. 1А-1С и 2. В некоторых воплощениях данные ASO были сконструированы как гэпмеры или гэпмеры с флангами с чередованием. См. номера DES.

На ФИГ. 1А-1С и 2 показаны неограничивающие примеры конструкции ASO для выбранных последовательностей. Такие же способы можно применять к любым другим последовательностям, раскрытым в данном документе. Данные гэпмеры были сконструированы так, чтобы содержать запертые нуклеиновые кислоты - LNA (заглавные буквы). Например, гэпмер может иметь бета-О-окси LNA на 5'-конце и 3'-конце, и иметь фосфоротиоатный остов. Но данные LNA также могут быть заменены любыми другими нуклеотидными аналогами, и остов может представлять собой другие типы остовов (например, фосфодиэфирную связь, фосфотриэфирную связь, метилфосфонатную связь, фосфорамидатную связь или их комбинации).

ASO синтезировали с использованием способов, хорошо известных в данной области. Типичные способы получения таких ASO описываются в Barciszewski et al., Chapter 10 - "Locked Nucleic Acid Aptamers" in Nucleic Acid and Peptide Aptamers: Methods and Protocols, vol. 535, Gunter Mayer (ed.) (2009), полное содержание которой тем самым прямо включается в данный документ посредством ссылки.

Пример 2А: анализ высокого содержания для измерения уменьшения уровня белка SNCA в первичных нейронах

ASO, нацеленные на SNCA, тестировали на их способность уменьшать экспрессию белка SNCA в первичных мышиных нейронах. Первичные культуры нейронов создавали из переднего мозга мышей PAC-Tg(SNCA^A53T)^+/+; SNCA^-/- ("РАС-А53Т"), несущих полный человеческий ген SNCA с мутацией А53Т на фоне мыши, нокаутированной по SNCA. См. Kuo Y et al., Hum Mol Genet., 19: 1633-50 (2010). Все процедуры с участием мышей проводили согласно Способам анализа животных (ATM), одобренных Комитетом по уходу за и применению животных Bristol-Myers Squibb (ACUC). Первичные нейроны получали посредством расщепления папаином согласно протоколу изготовителя (Worthington Biochemical Corporation, LK0031050). Выделенные нейроны промывали и ресуспендировали в нейробазальной среде (NBM, Invitrogen), дополненной В27 (Gibco), 1,25 мкМ Glutamax (Gibco), 100 единицами/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 25 мкг/мл амфотерицина В.

Клетки высеивали на многолуночные планшеты, покрытые поли-О-лизином, в плотности 5400 клеток/см² (например, в 384-луночные планшеты, 6000 клеток/лунку в 25 мкл NBM). ASO разводили в воде и добавляли к клеткам в DIV01 (т.е. 1 сутки после высаживания). ASO добавляли в 2х конечной концентрации в среде, затем вручную доставляли к клеткам. В качестве альтернативы, ASO в воде дозировали с использованием акустического дозатора Labcyte ECHO. Для дозирования ECHO 250 нл ASO в воде добавляли к клеткам в среде, с последующим добавлением равного объема аликвоты свежей аликвоты NBM. Для первичного скрининга ASO добавляли в конечных концентрациях 5 мкМ, 3,3 мкМ, 1 мкМ, 200 нМ или 40 нМ. Для определения эффективности получали 8-10-точечные титрования ASO из 0,75 мМ маточного раствора, затем доставляли к культивируемым клеткам для интервала конечных концентраций 2,7-4000 нМ или 4,5-10000 нМ. На каждый планшет включали ASO-000010 (TCTgtcttggctTTG, SEQ ID NO: 1879) и ASO-000838 (AGAaataagtggtAGT, SEQ ID NO: 1404) (5 мкМ), в качестве ингибиторов эталонного контроля для тубулина и SNCA соответственно. Клетки инкубировали с ASO в течение 14 суток для достижения стационарного уменьшения мРНК.

После 14-суточной инкубации клетки фиксировали добавлением в лунки фиксатора до конечных концентраций 4% формальдегида (J.T. Baker) и 4% сахарозы (Sigma). Клетки фиксировали в течение 15 минут, и затем фиксатор отсасывали из лунок. Затем клетки пермеабилизировали в течение 20 минут раствором фосфатно-солевого буферного раствора (PBS), содержащим 0,3% Triton-X 100 и 3% бычий сывороточный альбумин (BSA) или 3% нормальную козью сыворотку. Затем из лунок отсасывали пермеабилизирущий буфер, и клетки один раз промывали PBS. Затем первичные антитела разводили в PBS, содержащем 0,1% Triton-X 100 и 3% BSA. Использовали разведения 1:1000 кроличьего антитела против SNCA (Abcam) и 1:500 куриного антитела против тубулина (Abcam). Клетки инкубировали с первичными антителами от 2 часов до в течение ночи. После инкубации окрашивающий раствор первичных антител отсасывали, и клетки 2 раза промывали PBS. Добавляли в лунки вторичный окрашивающий раствор, содержащий разведение 1:500 антитела козы против куриного антитела, конъюгированного с Alexa 567, антитела козы против кроличьего антитела, конъюгированного с Alexa 488, и Hoechst (10 мкг/мл) в PBS, содержащем 0,1% Triton-X 100 с 3% BSA, и планшеты инкубировали в течение 1 часа. Затем из лунок отсасывали вторичный окрашивающий раствор, и клетки 3 раза промывали PBS. После промывки клеток в каждую лунку добавляли 60 мкл PBS. Планшеты затем хранили в PBS до визуализации.

Для визуализации планшеты сканировали на визуализаторе Thermo-Fisher (Cellomics) CX5 с использованием биоприложения Spot Detector (Cellomics) для количественного подсчета ядер (окрашивание Hoechst, канал 1), удлинений тубулина (Alexa 567, канал 2) и SNCA (Alexa 488, канал 3). Подсчет объектов (ядер) отслеживали, но не публиковали в базе данных. Общую площадь, покрытую тубулином, количественно измеряли как характеристику SpotTotalAreaCh2, и общую интенсивность окрашивания SNCA количественно измеряли в виде SpotTotalIntenCh3. Измерение тубулина включали для отслеживания токсичности. Для определения уменьшения уровня белка SNCA рассчитывали отношение интенсивности SNCA к площади окрашивания тубулина, и результаты нормировали в виде медианы % ингибирования с использованием медианы лунок, обработанных носителем, в качестве целого и лунок с ASO-000010 или ASO-000838 в качестве максимально ингибированных лунок для тубулина или SNCA соответственно. Результаты показаны в Таблице 1, 2 и 3 ниже.

В Таблице 1 показано процентное уменьшение экспрессии белка SNCA как в линии клеток человеческой нейробластомы SK-N-BE(2) («клетки SK»), так и в первичных нейронах, выделенных из трансгенных мышей А53Т-РАС («нейроны РАС»), после культивирования in vitro с разными ASO из Фиг. 1А-1С. Культивирование нейронов РАС описывается в Примере 2А, а в Примере 2Е описывается культивирование клеток SK. Для клеток SK данные клетки обрабатывали 25 мкМ ASO, и экспрессия мРНК SNCA (нормированная к GAPDH) показана как процент от контроля. Для нейронов РАС клетки обрабатывали либо 40 нМ, либо 5 мкМ ASO, и экспрессия белка SNCA (нормированная к тубулину) показана в виде процента ингибирования. Там, где значение не приводится, конкретный ASO не анализировали при конкретных условиях.

В Таблице 2 показана эффективность разных ASO в уменьшении экспрессии белка SNCA в первичных нейронах, выделенных из трансгенных мышей А53Т-РАС in vitro. Нейроны РАС культивировали in vitro с использованием 10-точечного титрования (показано выше) разных ASO, и эффективность (IC₅₀) ASO показана как отношение экспрессии SNCA к тубулину (мкМ).

В Таблице 3 показано влияние дополнительных типичных ASO из Фиг. 1А-1С на экспрессию белка SNCA в нейронах РАС при культивировании in vitro с 5 мкМ ASO. Экспрессию белка SNCA нормировали к экспрессии тубулина, и она показана как процент от контроля.

Пример 2В: измерение спонтанных колебаний уровня кальция

Ослабленные колебания внутриклеточной концентрации свободного кальция (колебания уровня кальция) соответствуют повышенной нейротоксичности и, следовательно, могут указывать на пониженную переносимость in vivo. Для измерения спонтанных колебаний уровня кальция первичных кортикальных нейронов первичные кортикальные нейроны крыс получали из эмбрионов крыс Sprague-Dawley (E19). Вкратце, кору мозга анатомировали и инкубировали при 37°С в течение 30-45 минут в растворе папаина/ДНКазы/сбалансированного солевого раствора Ерла (EBSS). После растирания и центрифугирования клеточного осадка реакцию останавливали инкубацией с EBSS, содержащим ингибиторы протеаз, бычий сывороточный альбумин (BSA) и ДНКазу. Клетки затем растирали и промывали Neurobasal (NB, Invitrogen), дополненным 2% В-27, 100 мкг/мл пенициллина, 85 мкг/мл стрептомицина и 0,5 мМ глутамина.

Клетки высаживали в концентрации 25000 клеток/лунку в 384-луночные покрытые поли-D-лизином планшеты для флуоресцентной визуализации (BD Biosciences) в 25 мкл/лунку дополненной нейробазальной (NB) среды (содержащей добавку В27 и 2 мМ глутамин). Данные клетки выращивали в течение 12 суток при 37°С в 5% CO₂ и подпитывали 25 мкл дополнительных сред в DIV04 (т.е. 4 суток после высаживания) и DIV08 (т.е. 8 суток после высаживания) для применения в DIV12 (т.е. 12 суток после высаживания).

В сутки эксперимента среды NB удаляли из планшета, и клетки один раз промывали 50 мкл/лунку буфера для анализа с температурой 37°С (сбалансированный солевой раствор Хэнкса, содержащий 2 мМ CaCl₂ и 10 мМ Hopes, pH 7,4). Колебания анализировали как в присутствии, так и в отсутствие 1 мМ MgCl₂. Клетки загружали постоянным флуоресцентным красителем на кальций для клеток- Fluo-4-AM (Invitrogen, Molecular Probes F14201). Fluo-4-AM готовили в концентрации 2,5 мМ в DMSO (диметилсульфоксид), содержащим 10% плюроника F-127, и затем разводили 1:1000 в буфере для анализа для конечной концентрации 2,5 мкМ. Клетки инкубировали в течение 1 ч с 20 мкл 2,5 мкМ Fluo-4-AM при 37°С в 5% CO₂. После инкубации добавляли дополнительные 20 мкл буфера для анализа с комнатной температурой, и давали клеткам уравновешиваться до комнатной температуры в темноте в течение 10 минут.

Планшеты считывали на флуоресцентном планшет-ридере FDSS 7000 (Hamamatsu) при длине волны возбуждения 485 нм и длине волны испускания 525 нм. Время записи общей флуоресценции составляло 600 секунд при скорости сбора данных 1 Гц для всех 384 лунок. Сигнал исходного уровня (измерение внутриклеточного кальция) устанавливался в течение 99 секунд до добавления ASO. ASO добавляли с использованием головки для 384 лунок в FLIPR в 20 мкл буфера для анализа в концентрации 75 мкМ для конечной концентрации 25 мкМ. В некоторых случаях в качестве контролей включали ASO, нацеленный на tau, такой как ASO-000013 (OxyAs OxyTs OxyTs DNAts DNAcs DNAcs DNAas DNAas DNAas DNAts DNAts DNAcs DNAas OxyMCs OxyTs OxyT; ATTtccaaattcaCTT, SEQ ID NO: 1880) или ASO-000010 (TCTgtcttggctTTG, SEQ ID NO: 1879).

Измерения интенсивности флуоресценции в последовательности во времени (описанные выше) экспортировали из ридера Hamamatsu, и переносили в созданное своими силами патентованное приложение в пакете IDBS E-Workbook для уменьшения размера данных и нормирования. В каждом 384-луночном планшете для скрининга анализировали максимум вплоть до 48 индивидуальных ASO в лунках в четверной повторности. 12 лунок подвергали воздействию позитивного контроля (ASP-000010), который значительно ингибирует колебания уровня кальция, подсчитанные на протяжении временных рамок сбора данных 300 с, и 12 лунок подвергали воздействию неактивного ASO (ASO-000013) негативного контроля, который не ингибирует наблюдение колебаний уровня кальция. Наконец, 24 лунки предназначали для контроля в виде носителя, состоящего из воды, не содержащей РНКазы-ДНКазы, используемой в той же самой концентрации, что и для разведения опытных ASO. Влияния опытных ASO в индивидуальных лунках на частоту колебаний уровня кальция (на протяжении периода 300 с) выражали как % от контроля медианного числа колебаний уровня кальция, подсчитанных в 24 лунках с контролем в виде носителя. Индивидуальные 384-луночные планшеты для анализа проходили стандарты QC (контроль качества), если ASO позитивного и негативного контролей (ASO-000010 и ASO-000013) демонстрировали хорошо охарактеризованную фармакологию с анализе Са, и если лунки носителя и фармакологического контроля давали минимум порядка 20 колебаний уровня кальция за экспериментальный период времени 300 с.

Пример 2С: анализ QUANTIGENE® (96-луночный анализ) для измерения уменьшения уровня РНК в человеческих нейронах

Способность ASO уменьшать уровень мРНК человеческого SNCA и/или возможных видов человеческих мРНК, не являющихся мишенями, измеряли in vitro посредством анализа QUANTIGENE®. Человеческие нейроны (Cellular Dynamics Inc., "iNeurons") оттаивали, высаживали на планшеты и культивировали согласно описаниям изготовителя. Данные iNeurons представляют собой высокочистую популяцию человеческих нейронов, полученную из индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток с использованием патентованных протоколов дифференциации и очистки от Cellular Dynamics.

Лизис: клетки высаживали на 96-луночные планшеты, покрытые поли-L-орнитином/ламинином, в количестве от 50000 до 100000 клеток на лунку (в зависимости от исследованной экспрессии вне мишени) и поддерживали в нейробазальной среде, дополненной В27, глутамаксом и пенициллином-стрептомицином. ASO разводили в воде и добавляли к клеткам в DIV01 (т.е. в 1 сутки после высаживания). Для одноточечных измерений типично использовали конечную концентрацию ASO 0,5 мкМ. Для определений IC₅₀ нейроны обрабатывали с использованием разведения 1:4, дающего семиточечный ответ на концентрацию, с наивысшей концентрацией 5 мкМ для определения IC₅₀. Клетки затем инкубировали при 37°С и 5% CO₂ в течение 6 суток для достижения стационарного снижения уровня мРНК.

После инкубации среды удаляли, клетки промывали 1 раз в DPBS и лизировали следующим образом. Измерение матричной РНК лизата проводили с использованием системы реактивов QUANTIGENE® 2.0 (AFFYMETRIX®), которая количественно измеряет РНК с использованием способа разветвленной ДНК-амплификации сигнала, зависимого от специфично сконструированного набора зондов для захвата РНК. Рабочий раствор лизисного буфера для клеток получали добавлением 50 мкл протеиназы K к 5 мл предварительно нагретой (37°С) лизисной смеси и разводили в dH₂O (дистиллированная вода) до конечного разведения 1:4. Рабочий лизисный буфер добавляли в планшеты (от 100 до 150 мкл/лунку, в зависимости от исследуемой экспрессии вне мишени), растирали 10 раз, запечатывали и инкубировали в течение 30 мин при 55°С. После лизиса в лунках осуществляли растирание еще 10 раз, и планшеты хранили при -80°С или анализировали немедленно.

Анализ: в зависимости от конкретного использованного захватывающего зонда (т.е. на SNCA, PROS1 или тубулин) лизаты разводили (или не разводили) в лизисной смеси. Затем лизаты добавляли в планшеты для захвата (96-луночный пол исти рольный планшет, покрытый захватывающим зондом) в общем объеме 80 мкл/лунку. Реактивы наборов рабочих зондов получали объединением воды, не содержащей нуклеаз (12,1 мкл), лизисной смеси (6,6 мкл), блокирующего реактива (1 мкл) и набора специфичного зонда 2.0 (0,3 мкл) (человеческий SNCA с каталожным № SA-50528, человеческий PROS1 с каталожным № SA-10542 или человеческий бета 3 тубулин с каталожным № SA-15628) согласно инструкциям изготовителя (QUANTIGENE® 2.0 AFFYMETRIX®). Затем 20 мкл реактивов набора рабочего зонда добавляли к 80 мкл разведения лизата (или 80 мкл лизисной смеси для образцов фона) на планшете для захвата. Планшеты центрифугировали при 240 g в течение 20 секунд и затем инкубировали в течение 16-20 часов при 55°С для гибридизации (захват РНК-мишени).

Амплификацию сигнала и выявление РНК-мишени начинали посредством промывки планшетов буфером 3 раза (30 мкл/лунку) для удаления любого несвязанного вещества. Затем добавляли гибридизационный реактив 2.0 Pre-Amplifier (100 мкл/лунку), инкубировали при 55°С в течение 1 часа, затем отсасывали, добавляли и отсасывали промывочный буфер 3 раза. Затем добавляли гибридизационный реактив 2.0 Amplifier (100 мкл/лунку), как описано, инкубировали в течение 1 часа при 55°С, и стадию промывки повторяли, как описано ранее. Затем добавляли гибридизационный реактив 2.0 Label Probe (100 мкл/лунку), инкубировали в течение 1 часа при 50°С, и стадию промывки повторяли, как описано ранее. Планшеты вновь центрифугировали при 240 g в течение 20 секунд для удаления любого избытка промывочного буфера и затем добавляли в планшеты 2.0 Substrate (100 мкл/лунку). Планшеты инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре, и затем данные планшеты сканировали на многометочном ридере PerkinElmer Envision в режиме люминометра в пределах 15 минут.

Определение данных: для интересующего гена средний сигнал фона анализа вычитали из среднего сигнала каждой технической повторности. Средние сигналы для интересующего гена с вычитанием фона затем нормировали к среднему сигналу с вычитанием фона для РНК тубулина домашнего хозяйства. Процент ингибирования для обработанного образца рассчитывали относительно контрольного обработанного лизата образца.

Пример 2D: анализ QUANTIGENE® (96-луночный анализ) для измерения уменьшения уровня мРНК в клетках Ramos

Для измерения возможного уменьшения уровня мРНК человеческого IKZF3, не являющегося мишенью (семейство IKAROS с цинковыми пальцами 3), использовали клетки Ramos (линия человеческих лимфоцитарных клеток). Поскольку клетки Ramos не экспрессируют SNCA, RB1 (транскрипционный корепрессор RB1), который экспрессируется в клетках Ramos, использовали в качестве позитивного контроля для оценки ASO-опосредованного нокдауна экспрессии мРНК IKZF3. Два ASO синтезировали для связывания с и нокдауна экспрессии мРНК человеческого RB1. Бета-2 микроглобулин (р2М) использовали в качестве контрольного гена домашнего хозяйства. Клетки Ramos выращивали в суспензии в средах RPMI, дополненных FBS (фетальная телячья сыворотка), глутамином и пенициллином/стрептомицином.

Лизис: клетки высаживали на 96-луночные планшеты, покрытые поли-L-орнитином/ламинином, в количестве 20000 клеток на лунку и поддерживали в нейробазальной среде, содержащей В27, глутамакс и пенициллин-стрептомицин.

ASO разводили в воде и добавляли к клеткам в 1 сутки после высаживания (DIV01) до конечной концентрации 1 мкМ. После обработки ASO клетки инкубировали при 37°С в течение 4 суток для достижения стационарного снижения уровня мРНК. После инкубации среду удаляли, и клетки лизировали следующим образом. Измерение матричной РНК лизата проводили с использованием системы реактивов QUANTIGENE® 2.0 (AFFYMETRIX®), которая количественно измеряла РНК с использованием способа разветвленной ДНК-амплификации сигнала, зависимого от специфично сконструированного набора зондов для захвата РНК. Лизисную смесь (QuantiGene 2.0 Affymetrix) предварительно нагревали в инкубаторе при 37°С в течение 30 минут. Для лизирования клеток в суспензии добавляли 100 мкл 3× лизисного буфера (с 10 мкл/мл протеиназы K) к 200 мкл клеток в суспензии. Клетки затем растирали 10 раз для лизирования, планшет запечатывали и инкубировали в течение 30 мин при 55°С. Затем лизаты хранили при -80°С или анализировали немедленно.

Анализ: в зависимости от конкретного использованного захватывающего зонда (т.е. на IKZF3, RB1 и р2М) лизаты разводили (или не разводили) в лизисной смеси. Затем лизаты добавляли в планшеты для захвата (96-луночный полистирольный планшет, покрытый захватывающим зондом) в общем объеме 80 мкл/лунку. Реактивы наборов рабочих зондов получали объединением воды, не содержащей нуклеаз (12,1 мкл), лизисной смеси (6,6 мкл), блокирующего реактива (1 мкл), набора специфичного зонда 2.0 (0,3 мкл) (человеческий IKZF3 с каталожным № SA-17027, человеческий RB1 с каталожным № SA-10550 или человеческий бета-2 микроглобулин с каталожным № SA-10012) согласно инструкциям изготовителя (QUANTIGENE® 2.0 AFFYMETRIX®). Затем 20 мкл реактивов наборов рабочих зондов добавляли к 80 мкл разведения лизата (или 80 мкл лизисной смеси для образцов фона) на планшете для захвата. Планшеты затем инкубировали в течение 16-20 часов при 55°С для гибридизации (захват РНК-мишени). Амплификацию сигнала и выявление РНК-мишени начинали посредством промывки планшетов буфером 3 раза (300 мкл/лунку) для удаления любого несвязанного вещества. Затем добавляли гибридизационный реактив 2.0 Pre-Amplifier (100 мкл/лунку), инкубировали при 55°С в течение 1 часа, затем отсасывали, добавляли и отсасывали промывочный буфер 3 раза. Затем добавляли гибридизационный реактив 2.0 Amplifier, как описано (100 мкл/лунку), инкубировали в течение 1 часа при 55°С, и стадию промывки повторяли, как описано ранее. Затем добавляли гибридизационный реактив 2.0 Label Probe (100 мкл/лунку), инкубировали в течение 1 часа при 50°С, и стадию промывки повторяли вновь, как описано ранее. Планшеты вновь центрифугировали при 240 g в течение 20 секунд для удаления любого избытка промывочного буфера и затем добавляли в планшеты 2.0 Substrate (100 мкл/лунку). Планшеты инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре, и затем данные планшеты сканировали на многометочном ридере PerkinElmer Envision в режиме люминометра в пределах 15 минут.

Определение данных: для интересующего гена средний сигнал фона анализа (т.е. без лизата - просто 1× лизисный буфер) вычитали из среднего сигнала каждой технической повторности. Средние сигналы для интересующего гена с вычитанием фона затем нормировали к среднему сигналу с вычитанием фона для мРНК домашнего хозяйства (для клеток Ramos это был бета-2-микроглобулин). Процент ингибирования для обработанного образца рассчитывали относительно среднего необработанного лизата образца.

Пример 2Е: анализ кПЦР (количественная полимеразная цепная реакция) для измерения уменьшения уровня мРНК SNCA в клетках SK-N-BE(2)

ASO, нацеленные на SNCA, тестировали на их способность уменьшать экспрессию мРНК SNCA в человеческих клетках нейробластомы SK-N-BE(2), приобретенных в АТСС (Американская коллекция типовых культур) (CRL-2271).

Клетки SK-N-BE(2) выращивали в среде для культуры клеток (MEM [Sigma, кат. № М2279], дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки [Sigma, кат. № F7524], 1× глутамаксом ТМ [Sigma, кат. №3050-038], 1х раствором заменимых аминокислот MEM [Sigma, кат. № М7145] и 0,025 мг/мл гентамицина [Sigma, кат. №G1397]). Клетки трипсинизировали каждые 5 суток посредством промывки фосфатно-солевым буферным раствором (PBS), [Sigma, кат. №14190-094], с последующим добавлением раствора 0,25% трипсина-EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) (Sigma, Т3924), 2-3-инкубации при 37°С и растирания перед посевом клеток. Клетки поддерживали в культуре в течение вплоть до 15 пассажей.

Для экспериментального применения 12500 клеток на лунку высевали в 96-луночные планшеты (Nunc, кат. №167008) в 100 мкл ростовой среды. Олигонуклеотиды получали из 750 мкМ маточного раствора. ASO, растворенный в PBS, добавляли приблизительно через 24 часа после посева клеток до конечной концентрации 25 мкМ для одноточечных исследований. Клетки инкубировали в течение 4 суток без какой-либо замены среды. Для определения эффективности готовили 8 концентраций ASO для конечного интервала концентрации 16-50000 нМ. ASO-004316 (CcAAAtcttataataACtAC, SEQ ID NO: 1881) и ASO-002816 (TTCctttacaccACAC, SEQ ID NO: 1882) включали в качестве контролей.

После инкубации клетки отбирали посредством удаления среды, с последующим добавлением 125 мкл лизисного буфера PureLink©Pro 96 (Invitrogen 12173.001А) и 125 мкп 70% этанола. РНК очищали согласно инструкции изготовителя и элюировали в конечном объеме 50 мкл воды, приводя к концентрации РНК 10-20 нг/мкп. РНК разводили в 10 раз в воде перед одноэтапной реакцией кПЦР. Для одноэтапной реакции кПЦР qPCR-mix (qScript TMXLE для 1-этапной кПЦР-ОТ TOUGHMIX®Low ROX от QauntaBio, кат. №95134-500) смешивали с двумя зондами Taqman в соотношении 10:1:1 (смесь для кПЦР: зонд 1:зонд 2) с получением мастер-микса. Зонды Taqman приобретали у LifeTechnologies: SNCA: Hs01103383_m1; PROS1: Hs00165590_m1: TBP: 4325803; GAPDH 4325792. Затем смешивали мастер-микс (6 мкл) и РНК (4 мкл, 1-2 нг/мкл) в планшете для кПЦР (MICROAMP® optical 384-луночный, 4309849). После высаживания планшет быстро центрифугировали - 1000 g в течение 1 минуты при RT (комнатная температура), переносили в систему ViiaTM 7 (Applied Biosystems, Thermo) и использовали следующие условия ПЦР: 50°С в течение 15 минут; 95°С в течение 3 минут; 40 циклов по: 95°С в течение 5 с, с последующим снижением температуры на 1,6°С/с, с последующими 60°С в течение 45 с. Данные анализировали с использованием программы QuantStudioTM Real_time PCR. Результаты показаны в Таблице 1 в Примере 2А.

Пример 3: анализ in vitro ASO-003092 и ASO-003179 по влиянию на снижение уровня мРНК человеческого SNCA

ASO-: 1436003092 (20 оснований, SEQ ID NO) и ASO-003179 (19 оснований, SEQ ID NO:1547) представляют собой ASO, модифицированные LNA, которые нацелены на область экзона 6 пре-мРНК человеческого SNCA (SEQ ID NO: 1).

Эффективность ASO-003092 и ASO-003179 в мышиных нейронах

С использованием способов, описанных выше в Примере 2А, ASO-003092 и ASO-003179 анализировали на их способность уменьшать экспрессию белка SNCA как последующий результат уменьшения уровня мРНК SNCA. Вкратце, первичные нейроны, полученные от мышей РАС-А53Т, обрабатывали ASO-003092, ASO-003179 или контрольным ASO в течение 14 суток. Клетки затем фиксировали, и уровни белка SNCA и белка тубулина измеряли посредством визуализации высокого содержания. Уровни тубулина измеряли для отслеживания токсичности и для нормирования снижения уровня белка SNCA.

Как показано в Таблице 4 ниже и в Таблице 1 в Примере 2А, инкубация клеток с 40 нМ ASO-003092 или ASO-003179 приводила к 76%-ному и 73%-ному снижению экспрессии белка SNCA соответственно. В отличие от этого оба ASO имели от минимального влияния до отсутствия влияния на уровень экспрессии белка тубулина.

Приведенные выше результаты демонстрируют то, что ASO-003092 и ASO-003179 эффективно уменьшают уровень мРНК SNCA, что, в свою очередь, опосредует уменьшение уровней белка SNCA. Данные ASO хорошо переносились и в мышиных, и в человеческих нейронах. Эти данные поддерживают непрерывную разработку SNCA-специфичных ASO (например, ASO-003092 и ASO-003179) в качестве модифицирующего заболевание терапевтического средства для лечения синуклеинопатий.

Пример 4: переносимость in vivo и уменьшение уровня мРНК SNCA in vivo

Переносимость in vivo отобранных ASO анализировали для того, чтобы понять, как данные ASO переносились при инъекцировании в разные животные модели (т.е. мыши и яванские макаки):

Мыши

Субъекты: самцов и самок (2-3-месячных) мышей РАС-Tg(SNCA^A53T)^+/+; SNCA^-/- ("РАС-А53Т"), несущих полный человеческий ген SNCA с мутацией А53Т на фоне нокаутной по SNCA мыши, использовали для краткосрочных, долговременных исследований и исследований эффективности PK/PD (фармакокинетика/фармакодинамика) in vivo. В некоторых случаях мышей дикого типа (WT) C57B/6 использовали для долговременной (т.е. 4 недели) оценки здоровья. Мышей содержали в группах из 4 или 5 в комнате для содержания с контролируемой температурой с пищей и водой, доступными без ограничений. Все процедуры с участием мышей проводили согласно способам анализа животных (ATM), одобренных Комитетом по уходу за и применению животных Bristol -Myers Squibb (ACUC).

Получение раствора для дозирования ASO: для получения растворов для дозирования использовали шприцы со стерильным физиологическим раствором (1 мл), оснащенные 0,2 мкм фильтрами от Whatman и центрифужные пробирки, не содержащие нуклеазы. Указанный объем воды или физиологического раствора добавляли в порошок ASO и встряхивали на вибромешалке (примерно 1 мин) для растворения порошка ASO. Данному раствору затем давали осаждаться в течение 10 мин и вновь встряхивали на вибромешалке в течение примерно 1 мин. Данные пробирки кратковременно центрифугировали для возвращения всей жидкости на дно пробирки, и затем раствор фильтровали через 0,2 мкм стерилизующий фильтр во 2-ю пробирку, не содержащую РНКазы. Маленькую аликвоту первичного маточного раствора разводили до 1 мг/мл для анализа концентрации с использованием Nanodrop. Аналитический образец встряхивали три раза с использованием переворачивания вручную для тщательного перемешивания. Затем дважды измеряли поглощение образца в УФ (ультрафиолетовая область) при 260 нм с использованием Nanodrop (основание промывали и протирали три раза перед нанесением образца). Опытный образец отбрасывали, как только анализ был завершен. Образец считали готовым для дозирования, если поглощение в УФ области составляло от 90 до 110% образца. Если поглощение в УФ области превышало 110% образца, готовили второе разведение; если поглощение было меньше 90%, образец готовили в более высокой исходной концентрации, и следовали аналогичным стадиям, как описано выше. Образцы хранили при 4°С до применения.

Интрацеребровентрикулярная (ICV) инъекция вручную: ICV инъекции проводили с использованием микрошприца Гамильтона, оснащенного иглой 27-го или 30-го калибра, согласно способу Haley и McCormick. Игла была оснащена полиэтиленовым ограничителем на расстоянии 2,5-3 мм от кончика для того, чтобы ограничивать ее проникновение в мозг. Мышей анестезировали с использованием изофлуранового анестетика (1-4%). Как только они были достаточно анестезированы, мышей держали за ненатянутую кожу задней стороны шеи большим пальцем и указательным пальцем одной руки. Посредством приложения нежного, но устойчивого давления голову животного затем делали неподвижной, придавливая ее относительно прочной плоской выровненной поверхности. Дозирование проводили с использованием 10 мкл шприцев Гамильтона, оснащенных иглой калибра 27%. Кончик иглы был затем вставлен через скальп и череп примерно в 1 мм латерально и 1 мм каудально относительно брегмы (т.е. справа от срединной линии, примерно в 3 мм назад при измерении от линии глаз). Сразу после установки иглы давали ASO в объеме 5 мкл в солевом носителе и инъецировали на протяжении примерно 30 секунд. Иглу оставляли на месте в течение 5-10 секунд перед удалением. Мышей возвращали в их домашнюю клетку и давали им восстанавливаться в течение примерно 2-4 мин. Мышей непрерывно наблюдали в течение 30 минут сразу после дозирования на предмет нежелательных поведенческих эффектов лекарственного средства и/или дозирования. На протяжении этого времени любую мышь, которая демонстрировала судороги более 3 отдельных раз, немедленно умерщвляли и присваивали ей автоматический балл 20. Переносимость лекарственного средства подвергали бальной оценке через 1 ч плюс/минус 15 мин после дозирования. Животных, которым были дозированы непереносимые соединения (балл переносимости больше 4), немедленно умерщвляли после 1 ч оценки.

Оценка переносимости ASO: животных, которым дозировали ASO, оценивали сразу после дозирования и отслеживали в течение 2 часов на любые нежелательные события. Для кратковременных исследований переносимости (AT) мышей оценивали во время дозирования и вновь в момент освобождения, т.е. через 3 суток после инъекции ASO. Для долговременной оценки здоровья мышей еженедельно взвешивали и отслеживали на предмет любых проблем со здоровьем и поведенческих проблем до завершения эксперимента. Мышей, которые имели потери массы больше чем 15% от их исходной массы тела или демонстрировали проблемы с переносимостью, удаляли из исследований и умерщвляли. Оценки здоровья и переносимости проводили согласно следующей схеме:

Отбор тканей: После последних оценок поведения и здоровья мышей обезглавливали на гильотине, и быстро удаляли мозги. Каждый мозг разделяли на полушария, и а) гиппокамп иссекали для измерений мРНК в 3-суточных кратковременных исследованиях переносимости; б) гиппокамп, ствол мозга и стриатум из одного полушария иссекали для измерений мРНК, тогда как такие же области из второго полушария иссекали для измерений белка/PK в динамических исследованиях PK/PD с определением ответа на дозу.

В некоторых исследованиях кровь и спинномозговую жидкость (CSF) также отбирали для измерений PK (кровь) и PK/белок (CSF). Для отбора крови и CSF мышей подвергали глубокой анестезии с использованием изофлурана (4%). Кровь отбирали посредством сердечной пункции с использованием иглы 23 калибра. Сразу после удаления кровь переносили в 2 мл пробирки BD Microtainer (K2EDTA BD #365974) и помещали на лед до переработки. Для переработки крови данные пробирки центрифугировали при 4500g в течение 10 мин при 4°С. Затем плазму удаляли, помещали в 0,5 мл пробирки Эппендорфа и хранили при -80°С до применения. Для отбора CSF открывали полость грудной клетки, экспонируя сердце, и откачивали так много крови, как возможно для того, чтобы избежать загрязнения CSF. Образцы CSF отбирали через заднюю мозжечково-мозговую цистерну с использованием микропипеток и помещали в пробирки Эппендорфа lo-bind protein. Затем данные пробирки центрифугировали при 4500g в течение 15 мин при 4°С. CSF аккуратно переносили в чистые 0,5 мл пробирки Эппендорфа lo-bind и хранили при -80°С до дальнейшего применения.

Данные по яванским макакам

Субъект: использовали самцов яванских макаков, весящих 3,5-10,0 кг в начале исследования. Каждому имплантировали интратекальный катетер для спинномозговой жидкости (CSF), входящий на уровне позвонков L3 или L4. Дистальный кончик полиуретанового катетера простирался в пределах интратекального пространства приблизительно до позвонка L1. Проксимальный конец был соединен с подкожным портом доступа, расположенным в нижней части спины животного. Животным давали залечивать раны в течение по меньшей мере двух недель до начала исследования. Уход за лабораторными животными осуществлялся согласно Политике Службы общественного здравоохранения по уходу за людьми и применению лабораторных животных и Руководству по уходу и применению лабораторных животных NRC (2011) (National Research Council: Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (The National Academies Collection:

Reports funded by National Institutes of Health). National Academies Press (US), Washington (DC)). Данный протокол был одобрен Комитетом Wallingford по уходу и применению животных Bristol-Myers Squibb Company.

Отбор крови и CSF: доступ к порту CSF был получен подкожно с использованием асептических методик, и CSF отбирали у животных в сознании, сидящих прямо в ограничивающем кресле для приматов. Приблизительно 0,1 мл CSF отбрасывали в начале сбора для очистки пустого пространства в катетере и порте. CSF собирали посредством тока под действием силы тяжести максимум до 0,5 мл CSF на образец. CSF центрифугировали при 2000g при 4°С в течение 10 мин. Супернатант замораживали на сухом льду или в жидком азоте и выдерживали при -90°С до анализа.

Кровь отбирали из доступной вены - типично подкожной вены. Образцы крови готовили целым рядом методик, в зависимости от конкретного рассматриваемого измерения. Для получения плазмы кровь отбирали в пробирки, обработанные EDTA. Для получения сыворотки кровь отбирали в пробирки для отделения сыворотки и давали ей сворачиваться в течение по меньшей 30 мин до центрифугирования. Для измерений свертывания и факторов свертывания кровь отбирали в пробирки, обработанные цитратом, и для анализа РНК кровь отбирали в пробирки, содержащие RNAIater. После переработки образцы замораживали на сухом льду или в жидком азоте и хранили замороженными до анализа.

Интратекальное дозирование: животных тренировали для получения дозирования в сознательном состоянии и с использованием модифицированных имеющихся в продаже ограничивающих кресел, животных поддерживали в положении лежа на животе. Нацеленные на SNCA антисмысловые олигонуклеотиды (ASO) растворяли в физиологическом растворе, стерилизовали фильтрованием и вводили со скоростью 0,33 мл/мин в объеме 1,0 мл, с последующей промывкой 0,5 мл стерильной воды. Общее время инфузии составляло 4,5 мин. Животные оставались в положении лежа на животе в течение 30 мин после инфузии.

Некропсия: яванским макакам вводили подходящий объем имеющегося в продаже умерщвляющего раствора при анестезии кетамином и/или изофлураном.

Ткани некропсии, получали немедленно после этого, и мозг переносили во влажный лед для препарирования. Интересующие области препарировали с использованием 4-6 мм срезов в ASI Cyno Brain Matrix, а также с использованием методик вручную. Образцы помещали свежими в RNAIater или замораживали на сухом льду для анализа позднее. Ткань ЦНС (центральная нервная система) быстро препарировали из яванских макаков, и кусочки не длиннее, чем 4 мм по любой оси собирали и помещали в 5 мл RNAIater. Образцы хранили при 4°С в течение ночи, затем переносили в -20°С для хранения до анализа.

Проанализированные области мозга включали медуллу, варолиев мост, средний мозг, мозжечок, дорсальный стриатум (левый и правый), гиппокамп (левый и правый), лобную кору (левую и правую), височную кору (левую и правую), теменную кору (левую и правую), затылочную кору (левую и правую) и белое вещество коры. Дополнительно отбирали спинной мозг в шейной, грудной и поясничной областях. Образцы также отбирали из печени, почки и сердца. В некоторых случаях отбирали образцы ядер тройничного нерва, большеберцового нерва и аорты для проверки фармакологии вне мишени в данных областях.

Количественное измерение ELISA концентрации ASO в ткани, плазме и CSF мышей или обезьян

Ткань гомогенизировали с плазмой и водой в соотношении 1:1. Получали стандартную кривую посредством 2-кратного последовательного разведения от 5000 до 4,9 нМ в плазме (для плазмы и CSF) и в плазме:воде (для образцов тканей), и затем дополнительно разводили всего в 5000 раз с использованием одного 5×SSCT (750 мМ NaCl и 75 мМ цитрат натрия, рН 7,0, содержащий 0,05% (об./об.) Tween-20) и в 5×SSCT, содержащего 35 нМ захватывающих и 35 нМ выявляющих реактивов для получения стандартного интервала 1-1000 пМ. Использованная степень разведения варьировала в зависимости от ожидаемого концентрационного интервала образца. Захватывающий зонд представлял собой AAAGGAA с 3'-биотином (Exiqon), и выявляющий зонд представлял собой 5" DigN-изопропил 18 линкер-СТСТССТ (Exiqon).

Экспериментальные образцы и стандарты добавляли в лизисный буфер Clarity (Phenomenex, кат. № AL0-8579) в соотношении 1:1 перед разведением буфером для захвата и выявления, и перед переносом на планшет ELISA. Образцы CSF разводили плазмой (в 2 раза) перед добавлением лизисного буфера. Планшет, покрытый стрептавидином (Thermo 15119), 3 раза промывали 5×SSCT буфером. Добавляли 100 мкл образцов и инкубировали в течение 60 мин при комнатной температуре. Добавляли выявляющий зонд - 100 мкл фрагмента Fab против Dig, конъюгированного с АР (щелочная фосфатаза), разведенного 1:4000 в PBS, содержащем 0,05% Tween-20 (Roche Applied Science, кат. №11093274910), и инкубировали в течение 60 мин при комнатной температуре. После промывки планшета 2×SSCT буфером добавляли 100 мкл субстрата Tropix CDP-star Sapphire II (Applied Biosystems) в течение 30 мин при комнатной температуре. Концентрации антисмысловых олигонукпеотидов измеряли посредством люминесценции (Enspire-PerkinElmer).

Измерения белка альфа-синуклеина:

Образцы ткани мозга гомогенизировали в соотношении 10 мл/г ткани в буфере RIPA (50 мМ Tris HCl, 150 мМ NaCl, 1% NP-40, 0,5% дезоксихалат натрия, 0,1% додецилсульфат натрия) с использованием шарового гомогенизатора Qiagen Tissuelyser II при 25 циклах/с с использованием 5 мм шарика из нержавеющей стали всего в течение 2 мин. Гомогенизированные образцы инкубировали 30 мин на льду. 50 мкп аликвоту каждого образца сохраняли для анализа РК. Остальные образцы центрифугировали при 20800 g в течение 60 мин, 4°С. Супернатант сохраняли и использовали для анализа. Общий уровень белка измеряли с использованием набора для анализа белка Pierce BCA (23227).

Экстракты тканей мозга: белок SNCA измеряли с использованием ELISA MJFR1+4B12. Вкратце, планшеты ELISA (Costar) покрывали 100 мкп антитела против SNCA MJFR1 (Abeam) в концентрации 0,1 мкг/мл, разведенного в карбонатно-бикарбонатном буфере ВирН, рН 9,4 (Thermo Scientific), в течение ночи (O/N) при 4°С. На следующие сутки планшеты 4 раза промывали PBS Дульбекко (Life Technologies) и блокировали 3% BSA (бычий сыворотчный альбумин, не содержащий протеазы, Фракция V, Roche Diagnostic) в PBS в течение 2-3 ч при комнатной температуре (RT) или в течение ночи при 4°С. И стандарты, и образцы мозга разводили 1% BSA/0,05% Tween/PBS, содержащим ингибитор протеаз Roche (Roche 11836145001, 1 пеллет/25 мл) и ингибитор фосфатаз 2&3 (Sigma, 1:100). В качестве стандарта использовали SNCA дикого типа (rPeptide). Образцы загружали в двойной повторности (50 мкп/лунку) и инкубировали O/N при 4°С. Затем планшеты уравновешивали до RT, в каждую лунку добавляли 50 мкп выявляющего антитела 4 В12 (Biolegend) (разведенное 1:4000 в 1% BSA/0,1% Tween/DPBS) и совместно инкубировали с образцами при RT в течение приблизительно 2 часов.

Выявляющее антитело предварительно конъюгировали с щелочной фосфатазой (набор АР от Novus Biologicals). Планшеты затем 4 раза промывали 0,05% Tween/PBS и проявляли с использованием 100 мкл субстрата щелочной фосфатазы (готовый к применению Tropix CDP Star с Sapphire II, Т-2214, Life Technologies) в течение 30 минут. Счет люминесценции измеряли с использованием Perkin Elmer EnVision (2102 многометочный ридер). Во время анализа планшеты выдерживали при постоянном встряхивании (шейкер планшетов для титрования, скорость 3). Данные анализировали с использованием GraphPad Prism. Общий белок в ткани мозга измеряли с использованием набора для анализа белка Micro (Thermofisher #23235) согласно инструкциям изготовителя.

Цереброспинальная жидкость (CSF): белок SNCA измеряли с использованием набора для человеческого SNCA U-PLEX: (кат. № K151WKK-2, Meso Scale Discovery) согласно инструкциям изготовителя. Образцы CSF разводили в 10 раз. Гемоглобин измеряли в образцах CSF с использованием набора ELISA для мышиного гемоглобина от Abeam (ab157715). Для измерений гемоглобина образцы CSF разводили в 40 раз.

Измерения мРНК посредством кПЦР-ОТ

Области мозга отбирали и помещали в 1,5 мл пробирки для защиты ткани RNAIater (Qiagen, кат. №76514), которые были предварительно заполнены RNAIater - раствором для стабилизации РНК. Ткань в растворе RNAIater можно хранить при 4°С в течение 1 месяца или при -20°С, или -80°С бесконечно.

Выделение РНК: набор RNeasy Plus Mini: РНК из мышиного гиппокампа и коры выделяли с использованием набора RNeasy Plus Mini (Qiagen cat#74134). Образцы ткани гомогенизировали в объеме 600 мкл или 1200 мкл буфера RLT Plus, содержащего 10 мкп/мл 2-меркаптоэтанола и 0,5% реактива Dx. 600 мкл лизисного буфера использовали, если масса образца ткани была меньше 20 мг, 1200 мкл лизисного буфера использовали для образцов ткани больше 20 мг. Для гомогенизации образец ткани переносили в 2,0 мл круглодонную пробирку Эппендорфа Safe-Lock (Eppendorf, кат. №022600044), содержащую 600 мкл буфера RLT Plus (плюс 10 мкп/мл 2-меркаптоэтанола и 0,5% реактива Dx) и 5 мм шарик из нержавеющей стали (Qiagen, кат. №69989). Образцы гомогенизировали с использованием прибора TissueLyser II от Qiagen. Образцы обрабатывали в течение 2,0 мин при 20 Гц, образцы переворачивали на 180° и обрабатывали в течение еще 2,0 мин при 20 Гц. Образцы затем обрабатывали в течение 2,0 мин при 30 Гц, образцы переворачивали на 180° и обрабатывали в течение еще 2,0 мин при 30 Гц. Более длительная гомогенизация и/или гомогенизация при более высокой частоте используется, если переработка не завершена. 600 мкл лизата ткани затем переносили в колонку для центрифугирования gDNA Eliminator в 2,0 мл пробирке для сбора, и образцы центрифугировали в течение 30 с при 10000 g. Все стадии центрифугирования проводили при RT. Элюат собирали, добавляли равный объем 70%-ного этанола и перемешивали. 600 мкл переносили в колонку для центрифугирования RNeasy в 2,0 мл пробирке для сбора, и образцы центрифугировали в течение 15 с при 10000 g. Элюат отбрасывали, и остающиеся 600 мкл образца добавляли в колонку для центрифугирования. Колонки для центрифугирования центрифугировали, и элюат отбрасывали. Колонки промывали 700 мкл промывочного буфера RW1, центрифугировали в течение 15 с при 10000 g, и элюат отбрасывали. Колонки затем 2 раза промывали 500 мкл буфера RPE, содержащего 4 объема этанола, как описано в протоколе набора. Колонки сперва центрифугировали в течение 15 с при 10000 g для первой промывки и затем в течение 2,0 мин при 10000 g для второй промывки. После второй промывки колонки центрифугировали один раз в течение 1,0 мин при 10000 g для сушки мембран. Колонки затем переносили в новую 1,5 мл пробирку для сбора, и 30 мкл воды, не содержащей РНКазы, непосредственно добавляли в центр мембраны. Мембранам давали инкубироваться в течение 10 мин при RT. Затем колонки центрифугировали в течение 1,0 мин при 10000 g для элюции РНК. Элюат, содержащий РНК, собирали и хранили на льду, пока концентрации РНК не могли были быть определены по поглощению в УФ с использованием спектрофотометра NanoDrop (Thermo). Образцы РНК хранили при -80°С.

Выделение РНК: набор RNEASY® Plus Universal Mini: РНК из всех других образцов ткани яванского макака, мыши и крысы выделяли с использованием набора RNEASY® Plus Universal Mini (Qiagen cat#73404). Для гомогенизации 50 мкг или меньше образца ткани переносили в 2,0 мл круглодонную пробирку Эппендорфа Safe-Lock (Eppendorf, кат. №022600044), содержащую 900 мкл лизирующего реактива QIAZOL® и 5 мм шарик из нержавеющей стали (Qiagen, кат. №69989). Образцы гомогенизировали с использованием прибора TissueLyser II от Qiagen. Образцы обрабатывали в течение 2,0 мин при 20 Гц, образцы переворачивали на 180° и обрабатывали в течение еще 2,0 мин при 20 Гц. Образцы затем обрабатывали в течение 2,0 мин при 30 Гц, образцы переворачивали на 180° и обрабатывали в течение еще 2,0 мин при 30 Гц. Более длительная гомогенизация и/или гомогенизация при более высокой частоте используется, если переработка не завершена. Гомогенизированный лизат ткани затем переносили в новую 2,0 мл круглодонную пробирку Эппендорфа Safe-Lock и оставляли при RT на 5,0 мин. В каждую пробирку добавляли 100 мкл раствора gDNA Eliminator, и пробирки энергично встряхивали в течение 30 с. В каждую пробирку добавляли 180 мкл хлороформа (Sigma, кат. №496189), и пробирки энергично встряхивали в течение 30 с. Пробирки оставляли при RT на 3 мин. Пробирки центрифугировались при 12000g в течение 15 мин при 4°С. После центрифугирования верхнюю водную фазу переносили в новую в 2,0 мл круглодонную пробирку Эппендорфа Safe-Lock - порядка 500 мкл. Добавляли равный объем 70% этанола и перемешивали. Все будущие стадии центрифугирования проводили при RT. 500 мкл переносили в колонку для центрифугирования RNeasy, помещенную в 2,0 мл пробирку для сбора, и образцы центрифугировали в течение 15 с при 10000g. Элюат отбрасывали, и остающиеся 500 мкл образца добавляли в колонку для центрифугирования. Колонки для центрифугирования центрифугировали, элюат отбрасывали, и колонки промывали 700 мкл промывочного буфера RWT, содержащего 2 объема этанола. Колонки центрифугировали в течение 15 с при 10000 g, и элюат отбрасывали. Колонки затем 2 раза промывали 500 мкл буфера RPE, содержащего 4 объема этанола, как описано в протоколе набора. Колонки сперва центрифугировали в течение 15 с при 10000g для первой промывки и затем в течение 2,0 мин при 10000 g для второй промывки. После второй промывки колонки центрифугировали один раз в течение 1,0 мин при 10000 g для сушки мембран. Колонки затем переносили в новую 1,5 мл пробирку для сбора, и 30 мкл воды, не содержащей РНКазы, непосредственно добавляли в центр мембраны. Мембранам давали инкубироваться в течение 10 мин при RT. Колонки центрифугировали в течение 1,0 мин при 10000 g для элюции РНК. Элюаты, содержащие РНК, собирали и хранили на льду, пока концентрация РНК не была определена по поглощению в УФ с использованием спектрофотометра NanoDrop (Thermo). Образцы РНК хранили при -80°С.

Синтез кДНК посредством обратной транскрипции: 300 нг РНК разводили до конечного объема 10,8 мкл с использованием воды, не содержащей нуклеаз (Invitrogen, кат. №10977-015), в микропланшете PCR-96-AB-C (Axygen, кат. №321-65-051). В каждую лунку добавляли 6,0 мкл реакционной смеси 1, содержащей следующее: 2,0 мкп 50 мкМ случайных декамеров (Ambion, кат. № AM5722G) и 4,0 мкл 1× смеси дНТФ (дезоксинуклеотидтрифосфаты) (Invitrogen, кат. №10297-018). Данный планшет запечатывали оптической запечатывающей лентой (Applied Biosystems, кат. №4360954) и центрифугировали в течение 1,0 мин при 1000 g при RT. Затем данный планшет нагревали в течение 3,0 мин при 70°С с использованием системы 96-луночного термоциклера GeneAmp PCR (Applied Biosystems). Планшет затем полностью охлаждали на льду. Затем в каждую из лунок добавляли 3,25 мкл реакционной смеси 2 (содержащей 2 мкл 10× буфера для синтеза комплементарной нити ДНК, 1,0 мкл 200 U/мкл фермента обратной транскриптазы MMLV-RT (Ambion, кат. №2044) и 0,25 мкл 40 U/мкл ингибитора РНКаз (Ambion, кат. № АМ2682)). Планшет запечатывали оптической запечатывающей лентой и центрифугировали в течение 1,0 мин при 1000 g при RT. С использованием 96-луночного термоциклера планшет нагревали при 42°С в течение 60 мин, переходили к 95°С на 10 мин. Затем данные планшеты охлаждали на льду. Планшеты с кДНК хранили при -20°С, пока они не были готовы для применения для анализа ПЦР.

кПЦР для амплификации и количественного измерения экспрессии мРНК альфа-синуклеина и GAPDH: кДНК разводили в 5 раз в воде, не содержащей нукпеазы, в микропланшете PCR-96-AB-C. В каждую лунку 384-луночного оптического ПЦР-планшета (Applied Biosystems, кат. №4483315) добавляли 16 мкл раствора мастер-микса, состоящего из следующего: 10 мкл 2× мастер-микса для экспрессии генов Taqman (Applied Biosystems, кат. №4369016), 1,0 мкп 20× набора праймер-зонд Taqman (Applied Biosystems) и 5,0 мкл воды, не содержащей нуклеазы. В каждую лунку 384-луночного оптического ПЦР-планшета добавляли 4,0 мкл разведенной кДНК. Планшет запечатывали оптической запечатывающей лентой и центрифугировали в течение 1,0 мин при 1000 g при RT. ПЦР проводили на системе ПЦР в реальном времени Applied Biosystems 700 НТ Fast с использованием следующих параметров в стандартном режиме: 50°С в течение 2,0 мин, 95°С в течение 10 мин, с последующими 40 циклами при 95°С в течение 15 с и 60°С в течение 1,0 мин.

Наборы праймер-зонд для кПЦР-ОТ: наборы праймер-зонд от Applied Biosystems (Thermo Fisher) включали следующее:

Человеческий альфа-синуклеин (кат. № Hs01103383_m1), меченный FAM

Человеческий PROS1 (кат. № HS00165590_m1), меченный FAM

Альфа-синуклеин яванского макака (кат. № Mf02793033_m1), меченный FAM

GAPDH яванского макака (кат. № Mf04392546_g1), меченная FAM

GAPDH яванского макака (кат. № Mf 04392 546_g1), меченная VIC Primer Limited

Крысиный альфа-синуклеин (кат. № Rn01425141_m1), меченный FAM

Крысиная GAPDH (кат. № Rn01775763-g1), меченная FAM

Крысиная GAPDH (кат. № 4352338Е), меченная VIC Primer Limited

Мышиная GAPDH (кат. № Mm99999915-g1), меченная FAM

Мышиная GAPDH (кат. №4352339Е), меченная VIC Primer Limited.

В Таблице 6 показан балл переносимости («балл Тох») и процентное снижение (или нокдаун, «KD») и экспрессии мРНК SNCA, и белка SNCA в обработанных ASO A53T-PAC трансгенных мышах или мышах WT (дикого типа). Баллы переносимости приводятся для суток 1 (1D) и 28 (28D) после введения ASO. Процентное снижение экспрессии мРНК SNCA и белка SNCA показано для суток 3 (3D) и 28 (28D) после введения ASO в гиппокампе (Hippo), стволе мозга (BS) и стриатуме (Str).

Пример 5: анализ активности и переносимости in vivo антисмысловых олигонуклеотидов (ASO), нацеленных на SNCA, у яванских макаков

Для оценки активности и переносимости ASO in vivo разработали модель яванского макака с интратекальным портом (Cyno IT). Данная модель обеспечивает оценку ASO-003092- или ASO-003179-опосредованного нокдауна SNCA и белка альфа-синуклеина SNCA.

Как описано выше в Примере 3, каждому животному имплантировали интратекальный катетер спинномозговой жидкости (CSF), входящий на уровне позвонка L3 или L4. ASO-003179 и ASO-003092 растворяли в физиологическом растворе и вводили животным, инфундировали в течение 4,5 мин с использованием IT порта (2 животных на группу дозы). Каждое из животных получало одно из следующего: (i) ASO-003179 (всего 8 или 16 мг) и (ii) ASO-003092 (всего 4 или 8 мг). Животных затем умерщвляли в разные моменты времени после дозирования, затем ткани отбирали для анализа воздействия и активности ASO. Проанализирванные области мозга включали медуллу (Med), варолиев мост (V-Pons), мозжечок (CBL), дорсальный стриатум (левый и правый) (CauP), гиппокамп (левый и правый) (Hip), лобную кору (левую и правую) (FrC), височную кору (левую и правую) (ТеС), затылочную кору (левую и правую) (РаС), теменную кору (левую и правую) (ОсС) и кортикальное белое вещество (WM). Дополнительно спинной мозг отбирали в шейной (CSC), грудной (TSC) и поясничной (LSC) областях. Также отбирали образцы из печени, почки, сердца, ядер тройничного нерва, большеберцового нерва и аорты для проверки фармакологии вне мишени в данных областях.

Данные ASO хорошо переносились у яванских макаков без наблюдаемых нежелательных явлений (данные не показаны). И как показано на Фиг. 3 и 4, и в Таблице 7 ниже, введение ASO-003179 приводило к уменьшению экспрессии мРНК SNCA во всех проанализированных тканях мозга в 2 недели после дозирования и в дозе 8 мг, и 16 мг (Фиг. 3). Для ASO-003092 уменьшение наблюдали в лобной коре и поясничной части спинного мозга, но не в других тканях в 2 недели после дозирования (Фиг. 4).

Результаты, представленные в данном документе, демонстрируют то, что SNCA-специфичные ASO, раскрытые в данном документе (например, ASO-003092 и ASO-003179), эффективно снижают мРНК SNCA и хорошо переносятся в нейронах и в исследованиях у доклинических видов in vivo. Кроме того, результаты от нейронов А53Т-РАС подтверждают то, что опосредованные ASO-003092 и ASO-003179 уменьшения уровня мРНК приводят к уменьшениям уровней белка SNCA in vitro и in vivo. В целом эти данные поддерживают продолжающуюся разработку SNCA-специфичных ASO в качестве модифицирующего заболевание терапевтического средства для лечения синуклеинопатий.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Roche Innovation Center Copenhagen A/S

<120> АНТИСМЫСЛОВЫЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ К АЛЬФА-СИНУКЛЕИНУ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

<130> P34685-WO

<150> US 62/616,944

<151> 2018-01-12

<160> 1882

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 121198

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

gcacatacaa ctttaacttc aatattttaa tgacgaaatt taaggataat ttaaatagaa 60

atggactcag aaaagaatca gtaagactta gtgaaggatc attgtctatt atagagaagt 120

tgatttaaga ttaacttatt agtaatattt aacatatata aagaattatt agactgggta 180

tatagacaag cgttttattc ttggaagaca aaaagaagaa aaattgaatt caaccgatgt 240

atacgaaaat aaaaagtaac agtaaattaa aaatagataa ttaaataaat atatgataca 300

gtataacgtt ttatagccaa gatgatgtta caaatccata tttattgaca tggatatgtt 360

tttatactaa agtgtttatc aaatagccat taagagataa cttctttgaa taatttgctt 420

tctaaatttc ttaactacat aaatttccag ctttatatgg aacaccaagt tttcaaacca 480

ttagtgatgt gctttttata tggtgttaaa aagtttcttt ctttcttttt tctttttccc 540

ccaagatgga gtcttgctct gtcgcccagg ctggagcgca gtagtgcgat ctcggctcag 600

tgcaacaacc acctcctggg tacaagcaat tctcctgcct cagcccccca agtagctggg 660

attacaggca cctgccacca cgtccagctg atttttgtat ttttagtaga gacggggttt 720

taccatcttg gccaggctgg tctctaactc ctgacctcag gtaatctgcc cacctcagcc 780

tcccaaagtg ctgagattac aggcgtgagc caccatgccc gacctaaaaa gtttcttaaa 840

cgtcacttta tactctcaaa ttatctagaa aggaaaacgt attagattcc tggatatttt 900

ggatattgta aggaacatac ttatttgctg tatatactct gtttgtaaca gtattgtaac 960

ttcagttcaa aacaatacac aaaacattac aagttcccgt gatattttaa aaattcattt 1020

attttcttcc tttctgaata caaatgctgt tcagtctgtt gattcttcac taatctgaaa 1080

tattagggac tgatttctga attggatatt cattctgaag cctttcagag ccactggcac 1140

aaagggtctg tcaaacttgg aacaccattt gttgtatcat tttatttttt tctcttggca 1200

aatccacata attcatacag gactatgcca gtgtcttttg aaagaaacaa ggtttaagaa 1260

agtaaaaatg ttaataaaga tagtgaatgt taattctgtc attgttactg tatttcttca 1320

agctgtggct gcaaactgct ttgagtgatg ttattgtaac tcgcacatta gggagagaaa 1380

gagatgtttg gtagattttt aattaatgat ccctatcaat gctccttgag ctttcccact 1440

ctatctctcc acaacttcca tccctggttg gaaatttttt gcttacccat actaagtgag 1500

agttattgat gggaaggcat cagatatctc acgtgtgttg ctggtgggat gggagactgt 1560

ggaggatggg aacaggtgga aatctactgc aatggaaaaa aaaaaaaagc atgtcctagg 1620

acacccaaaa catggaggct agataataac aatagctact tgtactgaga gcttccactc 1680

tgcctggctc tttgctatga gccacattat tcattcctta caacaatcaa acaagacaag 1740

taaaatatca tgcccatttt ttaatgagaa aactagagat tagagaggtt atagatactt 1800

gctctgagtc actagtaatg agtagtagag ctttaataag tccctgaatt taggttgtat 1860

ctagtacatt tactcttaga agtctatcat gctcaccaga gttgcagagt tgcgtgtatt 1920

tcttgggctc attaatgtgt ttttttcttt ctaaaactaa agtcatttga acttgttaga 1980

ttttgaaata tttaaatatc ttttctatct ggctttaaca tctttaatct tggaatcttg 2040

catgccttca tattcttagg accacgaaac cacaggaata tttaaaatga tatctagtgg 2100

aaacaatatg aagttggcca tggggtcaaa ttagagaatc tgaatactat gcttctcctt 2160

gattgctctt cccatttctt cagagtaacc ctattccccc atctcatgct cacccccttt 2220

ccaaaatcat acataatgat ctcccaacag tatgcattag gctttctcta ctctacccac 2280

tatgaaatta cacaagaagc ctatcgcaat ctcactacct cgtctctctc acaggtttac 2340

agaaggtgag aggaaggtgc agatagagaa taagaagcag gtggctccag catcaacatt 2400

acatcacccc ttgtgttcac aacaaatacg gaatattatc caaagataat aaacgttgta 2460

ttttcttaac ttaaacacat taaatcagtc ctctctttaa tcaattgtta atgggcagca 2520

tctttatttt catgccattc tactctgctg tctttgctat agcacaagtt taccacatac 2580

catacctaaa aattcagttg ttctatgggg gtaaacaaag tctaggttaa gcatatattt 2640

catagaatgt taatctatag caaaattaat gaattaaatc cagataaaag aatcctatta 2700

tggtctggta aaatatttat atttcactta gcaaagagaa aacaaaacat gaatattgta 2760

gttatgaaca gaatatgcat gttagtaatg cttccaaata tgttattact tcataacttc 2820

atatttctta tgaggtacaa gccattcaat tagtttaacg ttatattcag agaggctaaa 2880

gatttactga agaccatgct gtccatcaat aatgaaaaga aaaattaaaa aaactttatt 2940

ttaacttcta gttcccttct ttgtacttga gcagctttcc ctccttaaga atacagacct 3000

agaacatatg caatatcact atcaatatta tgtgtaatta aaagttcatt ggatgtttac 3060

tgtgttcaag gcattttaag gagtgacaag agttaaacat atagttgtaa ttcaaaatga 3120

caacgaaatt agtttacagt tttctttttt tgtaggtagt aagaaatcat ctccccctat 3180

tgaggaatac caatatagaa aaggcaaaac tttaaatatg aatgaactgt ttcataataa 3240

cataagttct tcttgatttc cattgtcaca tccaaatttg aaggctattt ctaacacagc 3300

tgggttctac ctttttcctt ctcactcttt accacaccca atctgtgagg cttcagacac 3360

aaactgctaa ttcaggagac aattgtgcct tctgtaacag tttctgctaa attgtctcag 3420

ctctgccact taaaatagct aggtgatctc agcatatcac caaaactctt ggagctcagt 3480

ttctctgtct ataaaagtta cataaaatgt aattgatctg cttgttatga ctaaataaca 3540

tagtacatta gtcctttgcc aaaggactaa caaattacca aataaaagtt tggaatcatg 3600

ttaaacgttt ataagaagtg caactgtcca gaaataattc tctcacattg gtctgttgta 3660

atgagaccta aaatatctca ttttatttac ctctttgact taaagcacta ggtctcaagg 3720

aggtcatggt tatactataa atatgtcatg tgaaataata tattaaataa ttgttgtaat 3780

actctattga gatactagtt gtaaagaggc acaatggaaa acttatacta ttaacagtag 3840

taaaaagaaa caacaaaaag caataaaaaa caaaacaccc attcatgcaa cgacatgaac 3900

gaacctcaca aatattatac tgagtaaaag aagtcagaca aatataaaac aaagtttata 3960

ctacgtgatt agatctttat gacattctag aatatgcaca tgaaggtaca aggtaactgt 4020

ctggaatgat gaaaatgtcc tgtgtcttca aaatagtgtg ggttacacta atgcatggct 4080

ttttcaaaac tgatttaaag ggacacaaca tctgagcatt tccctaggtg taaattacac 4140

tgcaatttta aagaatcatc taatgatatt gtggttattt ttaaacagtc cttaaatttt 4200

gtggatgcat actgaatgtt tacagctgaa aagatatata taaagcttga atttggtaaa 4260

aaaaaaaaaa aaagagggag gattggtagt gataaagtga gtggacttat ggatgagaca 4320

tgatcagcca tgcattgaaa aaatgtaaaa gttggatgat cttcacatga gagtccttta 4380

ttctgtctac ttttgcatat gtttgaatat ttcccataac aaaaagttga aaatagagtg 4440

atcacatgag ttaatctcct aatttacaaa aaagaaaact ggaaacagaa ggagaacaaa 4500

acttgttcaa ggtctcaaag ccagacagca aactagctcc caagtccaac cttcttgctc 4560

tggtcctaag caaacaaaaa atattaatat gagctactgc attaaggaaa gtctgctttt 4620

ccaaagggca gaccaatagt tcaaggaaga gtttaaataa taaatatttg tgatcttact 4680

ttcatgcttt tctattttcc actgaacaca tatgcattat cttctatatg tcttttatgt 4740

ataatcattt gcttcctgtt ccttgtggtt ttaaagttgt tttgtatgtt taaatttgat 4800

tttactcaaa tttcagaacc caaattagcg caagaatcag acaaagcata actttctata 4860

aatataaaaa caattaaaaa aaaaacatac agcaaaaacg agttgttgtt tcccccctcc 4920

tcttccagtg cttaactaat cttccgaatc caggcacaga aagcaaaggc tttctgctag 4980

tgggaggagc ttgcttctcc attctggtgt gatccaggaa cagctgtctt ccagctctga 5040

aagaggtgaa aatgtgttaa gcgatgcaaa aattgtcttg aagttcgcgt gtgtatgtct 5100

gtgtgcatgt gcgtgtggtg ggtgggggga gagaaaaggg ggtgtcaatt ctgagggcaa 5160

cgagaatcag aagtcagaaa ggtgagtggt gtgtagcatc tccctttcag aaggggctga 5220

agaagaaatt ggatatgatg gtccggtagg ctaaatcacg ctggatttgt ctcccagata 5280

aagggaggtc tgcaaagtaa gtcccatttc tagagcgaaa agccttagga ccgcttgttt 5340

tagacggctg gggaatattt attccttgtt ccactgatgg gaaaatcagc gtctggcagg 5400

cgctgattgg tggaaaggaa aatggtgata gtggcgtgga aagaggattt gctgagcctt 5460

ctcctgcctc ctcaacctgt gactcttcct tagtagtctc cctttcaccc tcaggaccct 5520

ttccggctct tcctagatta agagcaaacg aaaaccttga agatatttga actaaagcga 5580

cccctaacgt tgtaacctgt gaccgtgatt aaatttcagc gatgcgaggg caaagcgctc 5640

tcggcggtgc ggtgtgagcc acctcccggc gctgcctgtc tcctccagca gctccccaag 5700

ggataggctc tgcccttggt ggtcgaccct caggccctcg gctctcccag ggcgactctg 5760

acgaggggta gggggtggtc cccgggagga cccagaggaa aggcggggac aagaagggag 5820

gggaagggga aagaggaaga ggcatcatcc ctagcccaac cgctcccgat ctccacaaga 5880

gtgctcgtga ccctaaactt aacgtgaggc gcaaaagcgc ccccactttc ccgccttgcg 5940

cggccaggca ggcggctgga gttgatggct caccccgcgc cccctgcccc atccccatcc 6000

gagataggga cgaggagcac gctgcaggga aagcagcgag cgccgggaga ggggcgggca 6060

gaagcgctga caaatcagcg gtgggggcgg agagccgagg agaaggagaa ggaggaggac 6120

taggaggagg aggacggcga cgaccagaag gggcccaaga gagggggcga gcgaccgagc 6180

gccgcgacgc ggaagtgagg tgcgtgcggg ctgcagcgca gaccccggcc cggcccctcc 6240

gagagcgtcc tgggcgctcc ctcacgcctt gccttcaagc cttctgcctt tccaccctcg 6300

tgagcggaga actgggagtg gccattcgac gacaggttag cgggtttgcc tcccactccc 6360

ccagcctcgc gtcgccggct cacagcggcc tcctctgggg acagtccccc ccgggtgccg 6420

cctccgccct tcctgtgcgc tccttttcct tcttctttcc tattaaatat tatttgggaa 6480

ttgtttaaat ttttttttta aaaaaagaga gaggcgggga ggagtcggag ttgtggagaa 6540

gcagagggac tcaggtaagt acctgtggat ctaaacgggc gtctttggaa atcctggaga 6600

acgccggatg ggagacgaat ggtcgtgggc accgggaggg ggtggtgctg ccatgaggac 6660

ccgctgggcc aggtctctgg gaggtgagta cttgtccctt tggggagcct aaggaaagag 6720

acttgacctg gctttcgtcc tgcttctgat attcccttct ccacaagggc tgagagatta 6780

ggctgcttct ccgggatccg cttttccccg ggaaacgcga ggatgctcca tggagcgtga 6840

gcatccaact tttctctcac ataaaatctg tctgcccgct ctcttggttt ttctctgtaa 6900

agtaagcaag ctgcgtttgg caaataatga aatggaagtg caaggaggcc aagtcaacag 6960

gtggtaacgg gttaacaagt gctggcgcgg ggtccgctag ggtggaggct gagaacgccc 7020

cctcgggtgg ctggcgcggg gttggagacg gcccgcgagt gtgagcggcg cctgctcagg 7080

gtagatagct gagggcgggg gtggatgttg gatggattag aaccatcaca cttgggcctg 7140

ctgtttgcct gagtttgaac cacaccccga gtgagcagtt agttctgttg cctacgcctt 7200

tccaccatca acctgttagc cttcttctgg gattcatgtt aaggataccc ctgaccctaa 7260

gcctccagct tccatgcttc taactcatac tgttaccctt tagaccccgg gaatttaaaa 7320

aaggggttaa tcttttcatg caactccact tctgaaatgc agtaataaca actcagagga 7380

ttcatcctaa tccgtggtta ggtggctaga cttttactag ccaagatgga tgggagatgc 7440

taaattttta atgccagagc taaaaatgtc tgctttgtcc aatggttaaa tgagtgtaca 7500

cttaaaagag tctcacactt tggagggttt ctcatgattt ttcagtgttt tttgtttatt 7560

tttccccgaa agttctcatt caaagtgtat tttatgtttt ccagtgtggt gtaaaggaat 7620

tcattagcca tggatgtatt catgaaagga ctttcaaagg ccaaggaggg agttgtggct 7680

gctgctgaga aaaccaaaca gggtgtggca gaagcagcag gaaagacaaa agagggtgtt 7740

ctctatgtag gtaggtaaac cccaaatgtc agtttggtgc ttgttcatga gtgatgggtt 7800

aggataatca atactctaaa tgctggtagt tctctctctt gattcatttt tgcatcattg 7860

cttgtcaaaa aggtggactg agtcagaggt atgtgtaggt aggtgaatgt gaacgtgtgt 7920

atttgagcta atagtaaaaa atgcgactgt ttgcttttcc agatttttaa ttttgcccta 7980

atatttatga ctttttaaaa atgaatgttt ctgtacctac ataattctat ttcagagaac 8040

agttttaaaa actcatagtc ttttaaaaaa taatcaagaa tattcttaag aatcaaaatc 8100

attgatggat ctgtgatttc ttttaccatc atgaaaaatg tttgtcaatt ttaatccatt 8160

ctgattttta aaatatgact ttgatatgcc cctgtgatgt gtataaagag acctatttgt 8220

ggccctaaaa tggaaagaac agattagtct ttgatagagt tacttcatgt gatcatttgg 8280

tctctgtgaa cactgaggac agagaaaagt gcttgagggc tgctactaat ctctcagaaa 8340

catttgtata gttcatccat caaatgacac acatactaaa agaataaaga aattgatgct 8400

tattacctac ttgttcctaa agttccacct tggggtatac acccaaactc tgactctctt 8460

ttctgtaact tgaactgtat tcaattgagt gttattttac aaaccacttt gaattccttg 8520

gaaaagaata gacacacact ctcatccaca ggcatagaca cacacactca acacagacac 8580

attgcccatt cttcctctct tctttctcct ctgagctttt tcacattctc tggtggcaac 8640

tatagcagta agagtcacag gatgaacagt caggtggagg atgaccacat tgagttgcct 8700

agctgaaaca tgtgctccgt ctatgtctgc aaagtgaaag aaagctacac tatctcttca 8760

acatagatca gtgggggaaa ttttatactt gggatgattt atatgaatgc atctcatcaa 8820

agttcacaac acattttttt ttcagttttt tattttcagt ttttagagtc agggccttgc 8880

tctgtcgccc aggctggact gcagtgatgc tatcatagct cactgcatcc ttgaattcct 8940

gggctcaagt catgccccca cctcagcctc ctgagtagcc aggattatag gcatgtgcca 9000

ctgcctcatt atttagactt ttcttatgtt gacttaatct tcccacaaat cttcaattaa 9060

attacttttt ttctacctta aaacatattt tcagaaagtc attgaaatag ggtgttacaa 9120

gaggaaaaaa ttgatgagtt aattttaaat attttatgaa gtgtgaatta taccttttta 9180

gatggaattt ggaatactga atcagtgaca tgcagtttat caatatcttt ccgtttgtcc 9240

tcagatttcc aagttctgca agcacaagtt tctttgactt agttaccttt taactgttca 9300

ttgaaatcat tttcaatgtc tctcatggca tttaacacat agcacattct ataaattttt 9360

tattggttac attctgagtt ctaattgaga gttgaactta cacacagaat ttaagataaa 9420

aaatgaccat gtgaagacac aatagtatag tccagggatt ggcaaaattt tgggtaagga 9480

atcagatagc acgtatttta agccatgaga tctatgtctt ggccaggtgc cgtggctcag 9540

gtctttaatc ccagcacttt gagagcccga ggctggtgga tcacttgagc ccaggggttt 9600

gagaccagcc tgggccacat ggtgaaaccc tgtgtctaca aacaacgcaa aaattagccg 9660

ggtatggtag catgcatgtg tattgccagc tacccaggag gctgaggtag gaggatggct 9720

tgagccatac agctcactgc agaggttgca gtgagctgag atcgagccac tgcactccag 9780

cctgggtggc agagtgatac cctgtctaaa aaaaagaaaa aaaaatctat gtctcaattc 9840

tgctgttgaa gtgtgaaggt agtcataaac aataactagt gtggctgtgt cccaataaaa 9900

cttcatttat caaaacaggt ggtgggctgg aattgtcttg tatgttgtag cttgctgact 9960

actgatagag tggaaagaac atgcactaat cacacaaacc aaagttttag ttgagactac 10020

atcacttatc acctttaggg tcttggggaa gcgtacttaa catctctgag catcacttcc 10080

ctgattagta aaaaatatga tttagaaaac tgcaactacc ttgcagtttt tgtgggaatg 10140

tcataataag acaggacata tgaataattg agcacacttt tatatatagg aaccatggtt 10200

attattatca aataaactct ccaacggaat aattactttg ccaacacgtt ttccatttat 10260

tcttttatcc ttcattacat aactagtttg aaagattgga ggcgaccaaa gaccatttta 10320

taatttcact tatggctgaa gatgtttggt agaagcctca taagaaaagt aatctcattc 10380

ctttataaga atatactttt aacaactact ttttaactca ttgaagaact accttaatga 10440

tcagtgttat ttttatgggt tttgttccct ccatttttgt tatctgcgta caccaatttt 10500

caatcaacat acttcaattt aatagacaaa aatttcttca aatgactcag aaattaatta 10560

gatctaaatc caaaagcaga aagatttaat tatctttata taatgctcag taatataaat 10620

gcaataaata caagaaaatg atgatctttg agtgtcttcc aatgccactc tgctcaataa 10680

gcagcagtgg ccatcagtga aattgatagc aaattctcaa gtcaaaatgt gcttcacctc 10740

actaagctga caaagtcaac ataacatgca caacagggat aactgagttc tcaaaactct 10800

caggtattac ttctgacctt cttctccact ctgtgctctt ttgaggttgg gaagacaaga 10860

tagggtgtgt gtgggacacc tccgctcagg gaagccatca gctctggtgt ccctacagca 10920

tttatacctt gctagtcaca taaccacttg gcacctattt tgtaggtgta cgttatcaat 10980

tacagattac tcataaatta aaggctaacc atcaattaca gattattagt aaataattat 11040

gacctcaaag aacaactgat tggtttgata catggtaacc ttatgaggac tctcatttat 11100

ctcgtttttt taagttatat acctatctct ttggggttgc actacaaaaa tataaaatat 11160

gttgcataag atatttataa aaaataatta attataagtt ctaatggtgt ggtttagtgg 11220

cattcttttt tttttctttt tttctgagat agggtctcaa tctgtcattt cactccaggc 11280

tgaagtgcag tggtgtgatc tcggctcact gcaacctccg cctcctgggt tcaagttatt 11340

ctcctgactc agcctcctga gtagctgaaa ttacaggcat gcaccaccat gcccggctaa 11400

tttttgtatt tttagtagag atggggtttc accatgttag ccaggatggt ctcgaactcc 11460

tgatctcatc atccccgacc tcggcctccc aaaatgctgg gattacaggc gtgagccatt 11520

gcacccggcc tagtggcatt cttttttaaa aataaattta attgtgtata tttagggtat 11580

gcaacatgat gctatcagat acattagaca ctaaaaaatt actatattga agcaaattaa 11640

tatattcata atctctcata gttacctttt ttgttgtttt tgtggcaagg gcagctaaaa 11700

tccacttatt tatcatgaat ctcaaatata gtacaatttt atcacctaca gtcctcatac 11760

attagatctg tacacttttt catcttacac atctgctact tgcttggatc ctatggccta 11820

tatgtcccta ttttctacct acttttccac ccctattaac cctgtttttt acgtagtctc 11880

tgtatatttg aattttgttt caagcttcca catatatgtg agataatgta atatttttct 11940

ttctgtgttt ggcttatttc acttagcata attttgtctg ggttcatcca tgttgtaaat 12000

ggtaggatct tgttttttta gggctgactg atattccatt gtatctatgt accacaatct 12060

ttttatctac ctatctatca gtagacactt tagttgtggc tattatgttt ttcttttttt 12120

cttttttgga gacagggtct tgctgtcacc caggctgcaa tggagtggtg ttatcatagc 12180

tcactgtaac ctcaaacttc tgggctcaag agatcctcct gccttggcct cccaagtagc 12240

tgagactaca ggcatacatt accatgcctg gctaattttt aatatttttt gtagatatag 12300

catctcactc tgttgcccag actggtctca aactcctaat tcaaatttag aatagagtat 12360

gacaattctg taaaatataa aaaacatgtc cactccgtat aggaagttat acaatgagaa 12420

gaagacaaac actatttaca ttactcttga taagtttttt acaaagaaat aaaacacttt 12480

aatttctaat gttttaaatt ctggtttgct aaataaataa atattagttt tagtgttttt 12540

aaaattcctt atatagttat aagtgatctt cctgcctcag cctcccaaag cactgggatt 12600

ccaagcaaga gccactgtgt tggggccctt ggaaacagat atgctgaaat cttttcttgt 12660

ggatctacac ccagaagagg gattgctggg tcatatgcta ctctattttt aatttttctt 12720

ttatttttag tgaatatgta ataattgtat ataattgtgg gatccagaat tatatttcca 12780

tacatgtata caatgtgtga taatcaaatt agggtaatta acatatccat tacctgaaac 12840

atttatcatt cctttgtggt gggaacagta aaaattaaaa attctctctt ctagattttt 12900

gaacatatgc aataaactat tgttaagtat atcaccctac agtactacag aatgctagaa 12960

ctcattcctc atatttggct ccaatttcat attctttaac caacctctcc atatcctccc 13020

ctccctctta ccgttgtcag cctctaataa tcataattct actctctact tctatctcat 13080

tgtctttgat ttagaatatg tttcataatt taaccaaagg tcaaattctt aggtactgct 13140

aaggcaaaga acaaagatcg cattccagct gttagacatt tcttactact agtcattttt 13200

aagacaacat ggggtgcagg tggtgaggat gagagataga gattgaaaca tattctctta 13260

aatatcagct gttctcactc tgcatagttc cagcacaaac aaattccagg tactatggtt 13320

agttaaataa caccagccac taacaacaca attcaaattt ctgttaccac agtataccga 13380

aagtcattgc ataaagtaca aactttgctg ctaactcttc agccttcaaa tcattacata 13440

aataacagaa acccattata atcagtgaca aaaccacagc acttctttca aagctttttg 13500

gagattggtt gcttcacatc tgttatgcag ttcatacaga cagcaatgcc cggacttgtg 13560

tggccacatt gtctcccagt ggtgagccca tgtgatgttt cacgaaaatg cgcaatcaaa 13620

agaggaaact ggccagcaaa gatgaaagag tagcaaacaa aggaagtgaa acattctgga 13680

agtaaaattt gaatcaaaca taagttgatg tatacaggaa gtagctaccc tgaggatgtt 13740

gtcactgctg caattcagga gactctaaat atgcagtcag aggaacgtag tgaggtgaag 13800

gtatccgtat aatggggaaa gaggttgtga taaagagtga aggtgtccca gaggaagtgt 13860

tgctgaaaaa tacaccttat gttaaataca ctgtcagtat atcatgacat taaagtgcaa 13920

atgataacat tttgtaaact gatccaaact taaaaaggag tatgataatt ctgtaaaaca 13980

taaaaatcat gccgattcca taaattatac agtgtgaatt acactgaaaa atccaacatt 14040

agagaggata tgaatacaat tttttacaag cataatttta ataatacaca taataattat 14100

ttgtattcaa gtttagtaat gttcaaggtt tggaagaaat tctgatcctg tgtagagacc 14160

ctagtttgaa tgtgcttata gcctattatt acatgtgtaa tgttacataa attacttaac 14220

tcggattttt aatttcatca gctatttaaa atgggcataa tataactata ttaaatggct 14280

gttatgaaga ttaaataaga tgatatgtaa aatgtgtttt ttgtttgttt gtttgtttgt 14340

ctgtttgttt ttttgagaca gagtcttgct ctgttaccca ggctggagtg cagtggcaca 14400

atcttggctc actgcaagtt ctgcctcccg agttcatgcc attctcctgc ctcagcccct 14460

cccaagtagc tgggactaca ggcacccgcc accacgcctg gctaattttt tgtatttttg 14520

gtagagatgg ggtttcacca tattagccag gatggtctcg atctcctgac ctcgtgatct 14580

gcccacctcg gcctcccaaa ttgctgggat tacaggcatg agccactgcg cccagcctaa 14640

aatgtttttt ttacataatg ggtgttcagc acatgttaaa gccttctctc catccttctt 14700

cccttttgtt tcatgggttg actgatctgt ctctagtgct gtacttttaa agcttctaca 14760

gttctgaatt caaaattatc ttctcactgg gccccggtgt tatctcattc ttttttctcc 14820

tctgtaagtt gacatgtgat gtgggaacaa aggggataaa gtcattattt tgtgctaaaa 14880

tcgtaattgg agaggacctc ctgttagctg ggctttcttc tatttattgt ggtggttact 14940

ggagttcctt cttctagttt taggatatat atatatattt ttttctttcc ctgaagatat 15000

aataatatat atacttctga agattgagat ttttaaatta gttgtattga aaactagcta 15060

atcagcaatt taaggctagc ttgagactta tgtcttgaat ttgtttttgt aggctccaaa 15120

accaaggagg gagtggtgca tggtgtggca acaggtaagc tccattgtgc ttatatccaa 15180

agatgatatt taaagtatct agtgattagt gtggcccagt attcaagatt cctatgaaat 15240

tgtaaaacaa tcactgagca ttctaagaac atatcagtct tattgaaact gaattcttta 15300

taaagtattt ttaaataggt aaatattgat tataaataaa aaatatactt gccaagaata 15360

atgagggctt tgaattgata agctatgttt aatttatagt aagtgggcat ttaaatattc 15420

tgaccaaaaa tgtattgaca aactgctgac aaaaataaaa tgtgaatatt gccataattt 15480

taaaaaaagt aaaatttctg ttgattacag taaaatattt tgaccttaaa ttatgttgat 15540

tacaatattc ctttgataat tcagagtgca tttcaggaaa cacccttgga cagtcagtaa 15600

aatgtttatt gtatttatct ttgtattgtt atggtatagc tatttgtaca aatattattg 15660

tgcaattatt acatttctga ttatattatt catttggcct aaatttaccg agaatttgaa 15720

caagtcaatt aggtttacaa tcaagaaata tcaaaaatga tgaaaaggat gataatcatc 15780

atcagatgtt gaggaagatg aggatgagag tgccagaaat agagaaatca aaggagaacc 15840

aaaatttaac aaattaaaag cccacagact tgctgtaatt aagttttctg ttgtaagtac 15900

tccacgtttc ctggcagatg tggtgaagca aaagatataa tcagaaatat aatttatata 15960

atcggaaagc attaaacaca atagtgccta tacaaataaa atgttcctat cactgacttc 16020

taaaatggaa atgaggacaa tgatatggga atcttaatac agtgttgtgg atatgactaa 16080

aaacacagga gtcagatctt cttggttcaa cttcctgctt actccttacc agctgtgtgt 16140

tttttgcaag attcttcacc tctgtgtgat ttagcttcct catctataaa ataattcagt 16200

gaattaatgt acacaaaaca tctggaaaac aaaagcaaac aatatgtatt ttataagtgt 16260

tacttatagt tttatagtga actttcttgt gcaacatttt tacaactagt ggagaaaaat 16320

atttctttaa atgaatactt ttgatttaaa aatcagagtg taaaaataaa acagactcct 16380

ttgaaactag ttctgttaga agttaattgt gcacctttaa tgggctctgt tgcaatccaa 16440

cagagaagta gttaagtaag tggactatga tgccttctag ggacctccta taaatatgat 16500

attgtgaagc atgattataa taagaactag ataacagaca ggtggagact ccactatctg 16560

aagacggtca acctagatga atggtgttcc atttagtagt tgaggaagaa cccatgaggt 16620

ttagaaagca gacaagcatg tggcaagttc tggagtcagt ggtaaaaatt aaagaaccca 16680

actattactg tcacctgatg atctaatgga gactgtggag atgggctgca tttttttagt 16740

cttttccaga atgccaaaat gtaaacacat atctgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 16800

gtgcgtgtgt gtgagagaga gagagagact gaagtttgta caattagaca ttttataaaa 16860

tgttttctga aggacagtgg ctcacaatct taagtttcta acattgtaca atgttgggag 16920

actttgtata ctttattttc tctttagcgt attaaggaat ctgagatgtc ctacagtaaa 16980

gaaatttgca ttacatagtt aaaatcaggg ttattcaaac tttttgatta ttgaaaactt 17040

tcttcattag ttactagggt tgaatgaaac tagtgttcca cagaaaacta tgggaaatgt 17100

tgctaggcag taaggacatg gtgatttcag catgtgcaat atttacagcg attgcaccca 17160

tggaccaccc tggcagtagt gaaataacca aaaatgctgt cataactagt atggctatga 17220

gaaacacatt gggataaatc ggctgctatc ataatcattc ctctcccaca tcagataaat 17280

gaattaactt tttgaatagg gttatttaat ataaagtgct taagtctaat tatgagaaga 17340

aataagataa ttacacttca atggttaaag agagggagaa taatttgcat attatgcctg 17400

atgtaaaatg tttattatgg gtacatatta agtgctaact aattgttaat tgttcttgct 17460

acaagtctta atgcagggaa acaagaaatt attacatagt acctaatatt atcttctaat 17520

attaaagaaa caatttcccc taaattcatc ccattagctt tttttttttc ggtggggcag 17580

gggagaaata cagacttcag taaacttggg ctgggaactt tctacctaca aagttcaaat 17640

aaaataaatt atcctagtta gataatatca atgaaaaatc caccaactta aatcctggct 17700

gtttgatctc aggaaattat ttcagttatc aacttaatgc atcatattat agaaatatat 17760

gaaaatgtgt ttaattaaac ttactgaatg atatgttttt tcaggtactt taaaaataaa 17820

ctatgatata aagttaccta tttttcatgc aagtatagta taaagaaatt tctaacactg 17880

gagattttct gaaggttttg attcttataa atttattaca tcataatgaa caaaactaat 17940

tttcaacata ttatgattta aatttcctta gtaaattgtt tcaaatttat tttctttaaa 18000

tccatattta catatgtata tttaaatata catatttact tgtataacaa ttcaaaacca 18060

tatattaatt ttataatttt gtttaatgtc aaaggttaga tttggctata tctattctaa 18120

aagttggtat cacatttcct ttttggaatt ttatttttaa agtagctaaa gtcaaatata 18180

aacctattat ttatattaat gcagacatta gaggtagaca ctaaattcat tttagtatat 18240

tctaaattat ttattatcta ctatgaaata atataaagaa aaataaagca gaatccctga 18300

tttcaaagaa ctcaattgcc gaaaaacagt taccatttat tagacccaaa atgtactaat 18360

atgagtgtgt ctcttttcct tttgttttgt cacccgtcat ttggaatgtc agtgagtaga 18420

gagatagtgt gaaaggccct caaggggaaa aatagaggtt aaaggtcagc agagacccta 18480

ctagagaaat cagttctaca gaaatgtttt taaatgtgtc gattattgct acatgtacac 18540

tctgtcattt tgtaatgtag ccattttatt tatgattata ataataaaac aacaaaatta 18600

taataatgtg tagagtacat tttactgtgc agtgtattgc attaaaacta gattaaaatt 18660

tatacatata taaaaggcta tctagatatt ataaaattta tggctggatc tgtaaaaaat 18720

tcaaaaccta tttttaatct cgctttgaga ttttataaca agaaaatgtt cgtttcaagc 18780

aaaattttca attcacgtcc ttgaaaagga aaaaaatgac aacttgaaac acataattga 18840

ctatttttaa aggatcaaca tttcagaaat gttttaaaac ataagatttt cagtacagct 18900

tttcgctggc atttaaatcg aactttgaat tgtaaatagc tcttgctctt aaggagacat 18960

cagccatatc cttagaagtg gcacggagtt gttaggtagt tgtacaaaat tctagcctaa 19020

aagacaaata gggagcaaca ctactgtgga ccgtttctgg tcttgggctg tgtggctatg 19080

tcaggcttgc ccacattgcc tgtactaagg agaaagcctc ttgtccttac agaccccctt 19140

agcttacata gtctatttga aaacaaattg ctttgtccac accatttaaa tattggcttc 19200

aggccaggcg cggtggctca cgcctgttat cccagcactt tgggaggctg aggcgggcag 19260

atcacgaggt caggagatcg agaccatcct ggctaacacg gtgaaaccct gtctctacta 19320

aaaatataaa aaaattagcc gggtgtggtg gcgcgcacct gtagtcccag ctgctgggga 19380

ggctgaggca ggagaatggc ctgaacccgg gagtcggagt ttgcagtgag ccgacatcgt 19440

gccactgcac tccagcctgg gtgacagagc aagactccgt ctcaaaataa ataaataaat 19500

aaataaataa gtaaatattg gcttcttcaa ctggtgagat gaaacctata caatagtcat 19560

gtgaatagca ctaaacagct gacatggtgt aactcctctc agactgaggc ttatctgggg 19620

agtacaaagc atgtcaagaa aatgtgcctt catttcctta gatgagtgtc cccatcctcc 19680

actctcctcc actgttctcc tctctgcttc tatgatatca acttttcttt ttctttagat 19740

tccacatgag tgagatcatg tggttgtttg cctttctgtt tctggcttat ttaactgaac 19800

aagaaagttt ttgacatgaa attaaacttc tgcttgtaaa ctcaattcaa actatttaca 19860

ctgtcttctc aaaaatgtta acttatttta ataaatctac tgaatgaccg tatctcattt 19920

tgttttatga aaagaaattg taagggtgct caatagcctc ttcattttca tactgtctag 19980

ctcctgtgct cctattaaaa ttactgcaaa tttagctttt taagaaccct ttgtttcact 20040

acctgaagtt ctataaaaag atccaagttc cttcacaacc gtttcttatg ctgttattcg 20100

tacatatgtg ataataccac gtctgaacac gtagataata agtaggggct gggtgcggtg 20160

gatcatgcct ataatcctag cactttggga ggctaaggcg ggtggatcac ctgaggttag 20220

gagttcgaga ccggcctggc caacatgatg aaaccctgtt tctactaaaa atacaaataa 20280

taataataat aataattagc caggtgtggt tgtgggcacc tgtaatccca gctactcggg 20340

agactgaggc aggagaatag cttgaactca ggaggcggag gttgctgtga gctgagattg 20400

tgccattgca ttccagcctg aacaacaaga atgaaactcc atctcaaata aataaataaa 20460

tagaagtatg tattgtgttg cttagaaggt gtggtggaaa ttaacttgct gagtgagatc 20520

aaaggattgg cactgaattg aaataaagaa atattcatgc tgagtctggt tcaaatataa 20580

ctgcacctgt aagaattgct ttctgtaaac tttccatagt ataaaccaaa tccaaatcac 20640

tcatggcttt acattcctga tcgttaaact tgaagcactt tttaatactg catgacttta 20700

gccaaaatat cttagccaag attcaatgtt tggttgaacc acactcactt ggacatcttg 20760

gtggcttttg tttcttctga ccactcagtt atctatggca tgtgtagata caggtgtatg 20820

gaagccgatg gctagtggaa gtggaatgat tttaagtcac tgttattcta ccacccttta 20880

atctgttgtt gctctttatt tgtaccagtg gctgagaaga ccaaagagca agtgacaaat 20940

gttggaggag cagtggtgac gggtgtgaca gcagtagccc agaagacagt ggagggagca 21000

gggagcattg cagcagccac tggctttgtc aaaaaggacc agttgggcaa ggtatggctg 21060

tgtacgtttt gtgttacatt tataagctgg tgagattacg gttcattttc atgtgaggcc 21120

tggaggcagg agcaagatac ttactgtggg gaacggctac ctgaccctcc ccttgtgaaa 21180

aagtgctacc tttatattgg tcttgcttgt ttcaggcatt aacccagata aatgccatgc 21240

aaattttata attattatga ttgtttcaat ttctggaaga aagttaatga aacaaaaaat 21300

gtagtaaaat gccaaaggaa cagtgacatt tcagaaagaa tgagggcttt catgttaatt 21360

gtaagtcttg gaatttctct tccttggagt aacaaatccc tttgtgccta atttcctaat 21420

ttccaaaata aagttctttt acttatttct ttatagtgac atcatctctt attaaatggc 21480

atatctgcat attacataac agttcattgc caaatacata tttgtgggaa atgagagact 21540

taaaatacat accaaccaga gatatagttt tgaggtagat tttaaaattc tgagaagaat 21600

tttgactgaa tttttttgac aaacatggga cacgaataag attataccaa agatattata 21660

actttcattt taaatatgga actaatacag tatgaggtgt caacaacgtt gaagtttcac 21720

aaacatcacc actacaacag caaaataatt tttgcttttt ccctgccaca atgacctcct 21780

tgctatttct tgaataaatc aagcataccc ttgccctgac acgttcttgg ggaggcctgc 21840

cctaatctat ataaaattgg agccattctt ctcacctctg gtattcccag tctccctact 21900

ttttttcctt ctttctttct ttttcttttt ctttctttct ttccttcttt ctctctttcc 21960

tttctttctt ttcccttcct tccttccttt ctcccttcct tccttcctcc ctctctccct 22020

cccttccttc ctccctttct ttctttctct tttttctttc ttgcttcctt ccttccttct 22080

ttccttttct ttctttttcc tttctttgcc aaagtgttat tcacctttaa atataataca 22140

taatgtgctt actttaatgt atgattttta ttttatttct cccttctaga atgtaggcac 22200

catgagagtg aaatatattt attttgttca ttgatatttc acaagtgtct gggagagttt 22260

ccaacttaca gtagacaatt aacaaacatt tattaaatta aggagggaag gaagtgagta 22320

agcacaacaa ctttcatttc tgggtctttt ataatcatat gcttagtata agaacagtgc 22380

tattcagcta tccaaaagtt acaatcaaaa tgattttgga tgaatatctt gaaaattgtg 22440

agaaagaagt tttatttgct ggcaaactat tctgggttgt ttccacttca tgtaatccta 22500

agtagcagcc ttaccttgat agcccattaa aactctgata ataaaaaggc agaacaaaaa 22560

tatctgtgat atatttagat ttactacatg tacttacatg tctagtgtct ggtgcaatgg 22620

atgctaatga tggcaaatcc ttactgggct tctagtgaag ttcttcagct aatgtttgaa 22680

tgcatggttg gtcatggtgg tacccctttg tacaaaatat gcttttcaaa taatcttatt 22740

agggataata attatattaa ttcctggttt ccatctaaaa ttttaattct atttatagct 22800

tcgtaagatt tcacaagtta agagggacct cagattaaat tagtacacag gcaattaatc 22860

agttttgtgt ctccgaccct tttcacgggc taatagaagc tatagaccct cttagcttca 22920

gaaaaatgcg cactcacata cgcacatcaa agagcttaat gggaagtcca ttgacagacc 22980

ctctgttcag atcaatcttc tgattgtaga gatgaggaaa cagaaatcta cagaggaagt 23040

gggtagtcca agattgcaca gtcatttgga atagactgga caccagtagt acttttccag 23100

ccactatatc acttccccaa gcacttcctc aaaacttacc ttcctttggg tctttataca 23160

ttcagttatg gacaactaga tttaactaga ggattttatt gcttcagaat attaagcaac 23220

agggaaacat gtaccgtctt ttattcacct gcatttaagg catacaatat aaattgcaaa 23280

tggagcatga aagtgcttaa tcttttacaa aactgggttt gctttccacc catctaaaaa 23340

tacttctatt tattttaata tttaaagcag aaatctaagt gatgtgacaa aattaatcat 23400

ttggagatat ttcccttata ggtagtatag tttcttactg atttctaata tgaaaatgaa 23460

gccatagaac ctagaaattg cagcatagtt gtggaaataa acattggact gagagtgaaa 23520

atggctagtc ttcctctctg ctcatacacc acctgactgg ataacctttc gcagatctcc 23580

taaaagtctt tctcataaaa tgaggaagct ctactagaaa attgttgaag tctaatttag 23640

caataaagtt ctgagtttct ataataattc aaagaatact ctaataaatg tctgcaattg 23700

tggtcacatc tatgggatgc taaaaaatct ggatggtttc aatgaaagta tttaatttgt 23760

tcattatgaa ctttgaaata atttatttca ttttttaaac tttgatcaaa atgaccctgg 23820

taaatagaaa taagcaaact ctttttgctt gaaatgctta ttaatgactg cattgagaca 23880

ctcattcatc attcaagaaa gaatgtttgc tcacactgtg ccagaaactt ggaggaagag 23940

ggatgtgaca agtaggggta ctggatgtct agcttgtaga agtggattaa tggctctgct 24000

tttaagatca ggaacactga aagggagtaa tggcaccggt tttcaccttt catgcccttt 24060

gagggtatct ggtccatcac cctctagttg atgagggagg gaaagttccc tctcccttca 24120

caaataggtg gaaattaaat gacataattc tgaacaacca ataaatcgag agtaaatcaa 24180

agcagatacc tgttttgtta atttgatcat atgaatgtag ctgcccttag taataatttc 24240

taagtataag actagttaaa ggacaaatga gttatcttga attataagat tttgttttac 24300

agaacaatat taactcttgt gtttagtaca ttagaataat agatcttttg atccatattt 24360

ttactcatgt gcacataaga agttatcagt catacaattc atttcttgaa gttcatacct 24420

ttcattggca gagtagaaac aggttaaaag tgcacaggca gaaattttaa gtgcaaagca 24480

acagtgatgt tatatagaga aaatttatat ttcctacttc tattgaagaa gaaagatctg 24540

cttgttctaa gaatattgta caaagaaagt gacttgaatc agcgttattc tgtaatgcta 24600

ctatgcgtgc agtgtggagt agccactaga acacttggtc tatcccagct cctcaacagt 24660

gtcttgcttg tggctggtgc tcaaataaat ccttgctgaa ctaatgagca tctctttcat 24720

gccacatgga atgctctaaa agagttggat cctgaagttt ttatattttt gtaattttct 24780

ggagttttag agagcaaaag tcctgaataa actgtgaagc cactgcctga caaataatac 24840

agcagtcagc ttcgttatca tatcccattg agacacgact tatctacatg atgattaata 24900

gttttcacgc aagaaataag cttgaaatgt ctgttgcctt ggatacttaa aacatccagg 24960

ttcagcgatg ttatttattg ttgttcaaaa tcagaatgaa gttcctaagc aatgccattt 25020

tggaaaaatt acatcaatat attatgaaca acttttttta aatcttgatt tcaaatggat 25080

tgacacgtgt atattctgta ataatcctga cttaattcat aaaaggatag ctagccagtt 25140

gtgtgctaga tgaataaaaa aaaagcaggt tttaaaatgt caggtttgac attgtgaata 25200

taatatctaa gtatcctttt actcatttcc tttgacttac tatggctgtc atgttgggct 25260

tcatgaaaat ttatttttaa acacttgagt gttatggacc ctctgattaa atgattaatc 25320

agatgatgta tgttgccatc agctgaatca tttaatgttg atttcacaaa caagcacagg 25380

tcacaggcaa catttcagat ttctttgaag aagcacacac aggtcacagg cataatctta 25440

aaataatttt ataacaaggt agtaataaga gatgtcagga ctggagaaat attttaattt 25500

atagtaagct ttccccttaa gtgtctaata attgttaata taatacattg cctcaaataa 25560

ttaaaagttt ggttcttgtc cttgtgcttg acttcagaag ataaccagat gactattagg 25620

tatatttaga cctaaattaa aagctttgag acacaatgaa ttgcctgatt tgtatttgtg 25680

tttcgagtgg catatactat tactggcact ataatcttag attaaagcat actgtgatta 25740

ttaaagaaaa atttaagatt gatttgtttc taaaggtatg taacagtgac attttgcaat 25800

gtggtatgta aaagttggta tttctcactc atatgagagc ccactaatgg tacataaact 25860

gtccccactt agaaacacaa ttattatggc ctttctttgt atctgacaaa atttcactgg 25920

gttcaagatg gatgaatagt gaattctaat gacccttaat cctgtaaggt tctaggtggg 25980

aaagtactct gtaattatgt ataaaattat aaggaaaata ggcttactgc tatgttttca 26040

ttaaaaatca ttaactgagt acttaatatg tgccagacac tcagctgggc accatgagaa 26100

atacaaaact gagtaacata tgggtggctc ctgccttcaa gaaatgggca gttcaggccg 26160

ggagactgac atatttaccc tgggaaaaag ggagcagctg tggtctctga gaacaatatg 26220

gtttgttaca agtatatatc catcatggaa aaaaagagat ttatcttaga aatgagagag 26280

gctgatgctc tcaataaata tcatacatta aattgtgttt ttgtcagtag actgaaatta 26340

cctcacatac acgcacagat agtagccatg atattttagc tgcttagata tagagacaaa 26400

tacttccacc caaatcttag gatcagtggt taatagtctg taagcattac aatcccacaa 26460

catatgcatg actatacatc caattttaat attcaaagaa ctgattgcga tgatagtttt 26520

gtttgtcaaa gaaatgtatt ataggatgag tgggatagaa ctgcatcacg ttacaccaac 26580

aaataggttt aaatcatatt tgtgcacttc ccttgttcct tcataaatgt ttaacatagc 26640

ttaaaattct gtggactgca acgtgagagc aatgaccaca cttctgtgaa cccattttta 26700

ctgtgcatgt gctaacgtct attgttagta ttccttcact tgcaaagatg gcatgataat 26760

tttgctggtt tcattaatga gatactgtta aatgtaggat gacttcaaac ttagttgtat 26820

tgtaaaatta tttttaattg tatacattta agttgtacag catgatgttt tgagatactt 26880

atctttattt atatatatat ataatataca cacgtatata aaagtgattc ctacattgaa 26940

gcaaattaac atacccatca tcatatggtt atctttgctt ttttactatc agtgcctaaa 27000

atctactttc ttgaaaaatt accagtatgc actacaatat tattaacaat aatcttcatg 27060

ttgtacatta gatctttaga cttactcatc ttacatgact taggtttgtt tttacctcta 27120

ctaccatctg agccatattt ccactttgta atttgataat aaacttggaa aaatagcact 27180

tatatgttta ggtgacgggc ataaatagga taagatgtgt ttatatatta ttccatatat 27240

cttgtctcca actacaatga taaacaacct gtttgtccct aaaaagtaag aaataacttg 27300

acttttctgc cccttcaagc ataggctgtt agcttttaag ttttagggag acattgatga 27360

tgctatttgc tttatcaaga ggaaattgtc aaaagaggtc ttttggttct caaactattc 27420

aaagtattta aaaatcagga caaaatatgt ttacgtgata ttcaagggta cagaaatgag 27480

gtaaatgaga tgccaattgt atttgtcatg caaatatata attacgtgta tgagagttag 27540

atgatacatc tcatcaattt aattgttctt ctacaaggag aaaatgaaca atttgtcaac 27600

tcgtatatga agtaattttt ataagaaatt ttattaaaac ttttaacaac atttggattt 27660

ttaagttgca atttaaatat ccccttctac caggtgattc tggaatcact aagcagttac 27720

ttgtgaaaat tccaaagtag catttaattc ttattaatgt catagtgaat actaatgcaa 27780

agaatactga gccagaaatt atgcttgttg aataaataga ttatttattg aacaagtaag 27840

tgaaaaaatg gaaataaaga acggatatat attttatctt cctgcttaga tgtgggactg 27900

tcctactttt ctctggtgtt cacaacaaca atatgataaa tctaattgga attcagttca 27960

taggaatgaa ttcagttaca ttatggattg tgatgaataa tgtacacttt taatttaatg 28020

aaatcaaata gattttaact atctatgctt acaatggggt gacataagtc tgacaatcct 28080

taatatcaag tcatctccaa ttcacatgta tacacacttt ttttctattt ggctattggg 28140

aatcctcaca aaaatcgaaa attgcccttt cagtgtacgt tacggtattt catgccacac 28200

agattttctg aggttgtaca tacagctttg ccttgaggtt ccaatttttg ctcagtggat 28260

tgagtatata ttatttgcta tatatcagaa gaggcatgtg cttcctactt atgtcaggta 28320

actttgggat taatataatt gtcctacaaa gcatagatag atagaaatac ttcatcctta 28380

atttctaata ttatgacata tctaaagtag gcacctttaa aagttaatct ccactaaata 28440

ctaatgactg cttatagtgg caattcatct ttcatggtag tcctcctaca aaggtatact 28500

aacatttatg agtttgaaac aaaggcaatt cacaagtgtt ctgctagaga tggtctatat 28560

ctgctgtttg atccagcatg atggccagct ggccctcctg tgcatgacgg ctcgtggttt 28620

aactgcacca ttttgtttgg tcatatacag ggaaaacatg gcatggtgtg gagggcatgg 28680

gcttgaattc agggaacaga gagttggtct tctctctctc actctactgg atgatgtcat 28740

ctcccctctc taagcatgag ttttcttatc tgtgaaataa aaatgttgaa ttaaatgagt 28800

tcaaaatgct ttcagtctgt gtttaatagc ttgaatctta agacaatgta ttcaattatg 28860

cgttgccaga tccctggcaa ctcatgtaac ctttctaaac catagctact catctgtaac 28920

tggccagcca actgcccagg gttggagtgt gaatgaaata agataatgca gacaaaagat 28980

ttttaaaaat tgtagtgcat tatacagttg taatattttg ccaagaactt acattttctc 29040

taagaagtgt gtcgatacat gatcacagaa aatcttttcc atattccttt gtagtttgat 29100

gatattaagt aagtaaattg tataacacaa agagggaaaa gcatcactga acatgccgtt 29160

ttatttagct aaataaaatg taatcactat tagttttcct ctgatttccc caaagtcatg 29220

tgattccatt gagtattatg cacatggtat aattagaatg gattctctgc tcaaataatt 29280

ttgggaaaca tttaaattaa caaagtttaa aagtatctct gttaagctga agcaaatctc 29340

aaaggcctta atattgtatg taagaggaat agttaccatc tttcctaatg cctctttgac 29400

gccaaaccca tggagaatag ttctaggtgt tcagtaaaac acagatttgg gatgccacag 29460

gttaattgga actgtcccct gcaatccttt tctctttttc ttaataatgg ctgattgcag 29520

gtcctagatg aaagacattt agagagatta tcaggactca gcatcccata tcagaatcca 29580

ttcttttata gtcattttct gttacatttc ttgggacaac accaaagaaa tgaccatctt 29640

cattcacata ggctttgtac caaatgctga caaagatcct tggtgaccta gatgggggca 29700

ggtctaagta gattgcagct gtaaaattgg ctgatgaatg atctcagccc cttttactca 29760

cactcaaagg caggacagtc cattaagggg aaggagggca gagtttttcc ttaggccaat 29820

tccctatgcc agaacttttt agaatggaag catttccaga ggagaaacaa ccccaagcac 29880

agttcaaagc cccctcctcc caagttcatt tgaaagtggg atggtttatc tgcaaagggg 29940

gaaaagatga gggataggga cgggaatatc cctacccttc agagagtctg gtttcatcct 30000

gcacttttac tgcacagcca caaatgcctt ggggtgaatc tacaatatga tacatcatat 30060

ggtctaaacg tgcctggctg atcctctcta atacttcagg ggtctaaaag ggataacatg 30120

ctctcctgtt actcaccgac tctgtccgcc atatttcacc cagccagcca ctgccttcac 30180

ttccgtccga ggcctaatct gagcccatgg gaaacctaag aacccctacc acaactgcct 30240

caactcttgg gaatcagggt gtatgggggt gacaggaagt gagcatacat tctccaactt 30300

gatatgtcag cccccacgtc tgtatgaatg tttgctcaca ctgtgactgc cggccttgct 30360

cctcaggctg catcctacca gggagtaaga cccaagtcct tcctgctttc agacaacacc 30420

aagcctcatg agtccccact cagaggaagg accagagaca aactctaatg ttccactaat 30480

acttcccttc ttattacttt ccttgaaaat cccttctccc tctttctttt tatacttcgc 30540

taatgaaagg taatgaaagg gtctggcact tggaatttag aattgataca tggtttttaa 30600

cccgcggacg tattccacaa taacccttgc atcttctact aagatgtggg ctaggaaggg 30660

accagccagt tcccagggtc acagtgcctc agctgatgtt tcatattttc agcaacttta 30720

tgttagagat gtccatcaat cagaacaata tggttagaga ataaactaat aaaagtcatt 30780

tttgaggaca tgttggaagt ctatcaaaag cattgaaatt atgcatgctc tgaccagtcg 30840

catgtctaag aatttaaata tgatcataag tttaaatatg aagatgttta tcacagaatt 30900

gattataaaa caaaattgaa aaaaatagtg ctagaagttt gatcataggg acctcattaa 30960

atgcattatg gttgatccat gcagtggttt gctgaacagc cattaaaatg ttgtagaata 31020

attattaatg gtgtggaagg atgctattgt tgcagtatgt gaaaagaaca aattacaaag 31080

cagtttgtgc agcataatat ttttattttt taaaaacctg tatgtggctt atgtacatat 31140

aaagacgtgg aataaatgca caaggtactc agtttttctc agtgaagccc attttgcatt 31200

ttgggctggg taattcttcg ctgtggagaa ctctcattca ttgtaggatg tttacaagcc 31260

ctgggcctta cctctttaac gccagtaggc acccccagca tggcaacaag cacaaaatgg 31320

tctctctcat attgcccttg aggaaatttt gcaactaagt aactattact gggtcctaga 31380

ttacagtctg gattattgcg ttcctttctt atttttattt tctccaattc cctttaataa 31440

gcatgtactg gattcataaa aaaacaacat aaatggtaat tacaatattc cgcactggtt 31500

aaaacttatg taaataagca ttctgctgct ttagccacaa ttgcaattta tgctccttct 31560

ctttcttaag ttcccagttc ccacgtacat tcattcgact gattcaaaag tcattttagc 31620

ttgatagact cttaaaagtt agagttatca tttctgctat ttattctttc aattatccat 31680

ttgtccaccc atccatctga tccattttgt tgatgcatgc tgtgtataaa atactacacc 31740

agcctggtgc ggtggctcac gcctgtaatt ccaggacttt gggaggccaa ggcgggtgga 31800

tcacctgaag tcaggtgttt gagaccagcc tggccaacgt ggaaaaaccc tgtctctact 31860

aaaaatacaa aaattagcca ggcatggtgg cagacgactc taatcccagc tacttaggag 31920

gctgaaccag gagaatcgct cgaacccagg agatggagtt tgcagtgagc tgagatcatg 31980

ccaatacact ccagcctggg tgacagagca agactccgtc tcaaaaacaa acaaaaaaaa 32040

tacaatgcca agcatcataa aaaatatagt gatatataag acctatttgt tgtgctctag 32100

gcattgacat ctagctgtca accattaata tgtgtaggag tctatctatc aatattatgg 32160

actgtgcttg aagacttctt ccccaatctt tttctcttcc cattaagttt gaagtgaggt 32220

tttctgagtg aagtatcata gtacatacag tctcattatt tttcaaaaat ctctggttat 32280

agtacatttc tttcctttat cccctttgtt cccaactatc aaaccatttt ggatatccag 32340

tattggtatc cagtattatt aaaaagcaaa acagagaact attaacaaaa aaatttgtag 32400

gagtaattgg ttgtatggta tccagtacta ttagatagta aatcagaaaa ttattaacaa 32460

aaattttaga cgaataatgg attgtcttgc ccaagtgaat tgagtgattt agttgttctt 32520

tcatttttag caagtacagc tgatcatttg aggccttact cattgtttga ttttgcaaat 32580

tcttactatt ataaatgttt tgggctctga gaaagctgtt gtcttaatct gtttgtgctg 32640

ttataacaaa atacatgaga ctgggtaatt tacaaacaac agaaatttat ttctcatagc 32700

tctggaggct gggaactcca agatcaaggc atttgtcttc aggttcagta tctggcgagg 32760

gccggttctc tactcccaag atggtgtctt gtcactgtat cctccagagg gccaaatgct 32820

gtgttctcac atggtagaga gatagaaagg gccaactcac tccctcaagg cctttcataa 32880

tgttaccaat tccacttgtc agggctctgc ccccgtgact ttattacctc tgcaaggccc 32940

caccacttaa tactatcacg ttggttatta cgatttatca catgaatttc gaccatacta 33000

gttgccatcc tttcattttc atatatcctt aaaactttgc ctttctcatt ttaatgtact 33060

ttatccacag tatgccaact tttcgatact tttgttaacc tgtctgacga tatataggaa 33120

actgtaaaag tgcagttttt gatacactct ttagctgccc gtttacttct actgtcgtta 33180

gagaacccca tccatagtgc atgtgtttat tttgtgtatg aacaaagact ttatatatag 33240

tttgggtcat ttttattcat tagtgcttcc cttataatct ctgaatacca ttttattagt 33300

acatactgct attcttaata gtaactagca tgcctgatca tcccaaatgt ctaggttcac 33360

attttaaaat aagttatatc tttgggctta acagtttatt gaaaggtaac aaggattgag 33420

tcatagttgt atgtttttgg aagtagaatt caactgtaaa tagaaattgg ttgtttagat 33480

ctcactatat atgaaaaaat gaaggcttta ggagaaaatc tccccaaagt acccattttt 33540

catgtgataa atatcatgaa atgatttgag aaaaaaatgt atatttgtta cagctaacaa 33600

atatttgtgt tttttattct tcatggagag aatgaaattt cttctcttct ttacacattt 33660

ctttttctta ttagaaacta attggtgcct ttataaaaat taactgcaga gcactaacgt 33720

gtatatataa gtattatgta gggtgtaggg tatgttcagg gtatggtgtg tgtgtgtgtg 33780

tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tagctgtgtg tgtatataat gaaatatatg gtagtgttgt 33840

ttcagaaatc tgcttggtct tcccagagtt cattcatctt ataaattcat ctacattgat 33900

ctctattttt ggaatccatg aaatgttttt tggcagtact tcctttaata tagtgtgctg 33960

gaaatctgga aatttctagc cagattagtt acaaaaaatt agccagtggt tttgcactct 34020

ctatagaatc aaggcccaag gcctactctt gttactcagg gccttgtttt atctggcctc 34080

tttcttttca gccatatagc tctcaaatac tcaacaaaat tcttcattct aggtagacaa 34140

gtatcttcaa aatacttccc aattatctaa taactgtctt accactaaga aggcttttat 34200

gtctcctgtc tgaattttat ccatgcaaaa aagtccagcc caagcctcca gaactccaaa 34260

aagttatccc taactgctga aacacagtaa tttcactatg tgaaatttca ctttggtctc 34320

ctagcatttg cagatatacc atacatatcc ttgatccttt tcctttcata ccttttatat 34380

ctaaccctta agctaataat tttacctaca ctgtaattca aaatgtatcc ccagtcttac 34440

catgtctccc ttctctactg ttaccaccct aggctaggcc ttcatcattt ctcacctgga 34500

ctccttccct aacctctgaa ctgatctgcc tgcttccact tagacaccca acctagtcca 34560

ttcttgagca gtcggaataa ttcttttaag aaagaaacca gatcacatcc ccctctgctc 34620

ccaaccatcc agtgacctct tatcatacat agaatgaaat gcaaatcttt actgtgtttt 34680

aaaggcccta cattatctgg acctcagtaa cttcttactt cctatccctt ttctccttgt 34740

atgccaccct ccaactacac tctaactaca ctgtcttttt ccctgttctt cagacctgcc 34800

aaccatattt tcactgctca attaatatgt agaaaatgaa ttgtttgtta aatgtagact 34860

gtttccttct taaagcaaag ataaatgaca ttgtcttcaa aaacaactaa ctgcccagaa 34920

ttcctgattt taattttaaa aagacaaact gcaagaatgt gttaaacagt aaggaaacaa 34980

ttcactactt cagaattcta tatgatttca ctgcacgtta gtaattttgt atattataga 35040

atatgagggt attctaataa acttaactct atgctgtata cttatcatga tagctcattt 35100

tcttatatgt ttataacagc actacttatt gtacatggat acgtgggaaa taaattaatt 35160

ttctccttaa gaacaaagca accatttcac tcatgagata aatcttgaag atttaaaaac 35220

tacttataat taattataca ttattcatat aatgttaagt attttcttag taaaccacat 35280

aatttagaat ggcaattgga cagatgggca gaaccacatg catccactat taggcagttg 35340

gtgagcataa gatgccagaa agaagattag gaatatcaag gcagggagct tccgatcgct 35400

cttgaaaaca ttgacccttc actcctcact ctccacgatg catttccttt gaaaagtaat 35460

gccttccaaa acaaagttct ctgttttata tctaaactta ctcaatagtt tctcatggtt 35520

attgatatat aaaaaataaa gtaaaatgtt taggcagacc aaaagaagaa tttccccctc 35580

cctctgcctt ttatgccaag gtgacagcta tgaaatgtac agtacgtttc ctctgcaagg 35640

aatgtagcag tgttccattg caagaagatg agagggagag aaaggttgca cgctgaggaa 35700

tatagtgtca tttgtcactg cctagactca tcagctgtgt ggaactctga gaggcaccag 35760

gcttctttat ttatttcttc agaaacttca gcaaaaaaga tttcattagg agcagagaaa 35820

aatgtgaaaa acgaattagc ttttgtgatg gggagtagtc atctctgaat attgatcaag 35880

attaagaggg ttgtcttcgt aacttctttt atccatagtc tatactgatt taactagaaa 35940

actaatttca ggtggtattt cgggtgtggc agatctttat agtaaatgaa gaatctagtc 36000

aaatctactg aaaaactctg cttactttaa tgtttgatct ggttgaaacc attttagctt 36060

aacaatcctt cctctgaaac agggaatcaa ttgatatcct acagcaaaat tatgtggaag 36120

ggccattagc ttcacatcca atgcaaattt tgcctgtgtt tactcttccc caatccaaaa 36180

tatatcagat cctagatgcc agtgaaatcg tttgagctag atggcttgag ggtcatagct 36240

tttttcattt cctgttctca gacctcttat aattgataga ataaaatcag aagagcccta 36300

gagctgtccc acctattctg cctcacaaaa gtagaagtaa tggcaaccac tatcataggg 36360

atcatgctca cctttttctt accagacaaa tttggatatt agcttgaaat taataccttc 36420

cttaaaatgt tggaatttgg ttatatgcga aattttgctc tatttattca ttatattttg 36480

tatggaatta tttttgccct atattttcac ttaagtgttc tctacccaag attttaattg 36540

aacccaaatc agccagacac acagacatgg attttgctgc caccaaggtt aattcttctt 36600

ttaaagttaa cttttaaaat ttggtaaaat atagctttga aaatttgcat tcgtctagtg 36660

tttgttatgt atttccccct tttgtttgat tatatgtcta tatttttctt gtagaaattg 36720

atttttaacc tgctttttat gttagctttt atgagcttct gtctgaattc tgaatatgtc 36780

tttcttaatg tcttctaaat gtttctttct ggattattaa aagatttatt aggcttttaa 36840

taattatatt tgttacctta gggaatgtgt ttgaaaatat tttaaatgga attgccagtt 36900

aacacagcat tgaacttttt cttgttagag atacattgtt ttctaggcat tttattggga 36960

gagaagttag tatgatataa tgtctttggc tgatattaac tcttctaaga tgcattgttt 37020

ctgagaacac cattgtctga tttcattcag ggaaatttca cacaagccag tagagtcaat 37080

acttttttca agacctgtta attgatatat ataaaaactt gccattgttt acatgcccat 37140

ttcagatcct ttatgtgacc taagctagaa atgcatttta acagcatttg tttttccaaa 37200

aatatttatt tatttattta ttatagagat agcgtctctc tatgttgccc aggctggcct 37260

cgaactcctg ggctcaagca attctcctgc ctcggcctcc caacagtgct gggatacagg 37320

tgtgagccat tgtgccaggc ccttgttttt attttttttg aacattgtat tttgaaaggg 37380

gtttgaaggt gatccctaga tagcaaccag taatgattcg agcagcaaaa caatctaaaa 37440

agtaatttta taagaaaatg cagaacataa atgagcccat aaaaaattat attaggttct 37500

atttacatta ctaccttctt tcacatgtaa tatttcacta acatttaatg aatttctgtg 37560

cagtgccata taccattatg aattctagga tagaagaatg agtgagaaat gttcttaggc 37620

cttaggaaga aggaacaagc atctctgtgt aatagttatt tcaactcttc ttttacacct 37680

cattcccata ttaaatctca gaaaagctaa agtaatagct atcccagatc tattttagac 37740

tccagacact tacttcaatg tcttgttctc cttatcagac tggaatcatt ccaaacctct 37800

taacttctgg gcaaccatga taatgcgaca gaaaggacac taaatctgtc gcaaatttat 37860

cttgatattc tatccagtct tacttggtac tgaaggtcac aagtaaaata aggtggttgt 37920

tttttgtttg tttttttttt tttgacagaa gagaaaagaa cactgtgagc acagagtgaa 37980

tgtctaacat tgattcttga gtagcaggaa ttctctatgc gagaggatct ctatgcaaaa 38040

agatctcata ttctagcaca atttaaggat ctctatgcaa agatatccca tattttagca 38100

ttatcaataa gctatggggt aatatattgt atgtggtgtg gcttgaattc tagaaatttg 38160

atttctagaa atggtccctg tagttaagga tatataatgt ggccgtctcc agttttctat 38220

gaggaatagg aaaatactat cattattagc tgtgtgacca tggacaactt gcttcgttct 38280

tcagttgcat catctgtata aaataagaat aagaaaattt acatctgcaa ggtgtgatgg 38340

agatcacatg ggataattgt ggtcccagag cctggcacaa aagggcttaa tatttataat 38400

cctccccatt tctccgtata ctctaaagga agtttattgc ttatcaaatt gtgccgtggt 38460

tagttgtaca gcttccctgc caaattgtaa actccaacac taatgtgacg ttacatttta 38520

tatagtgcta tgattttcaa attgtttgca taatttcaaa tacacagtaa attgcttttt 38580

attagtataa ttattgctat tgtcaatatt attattacaa cagcttcaca gtaagatggg 38640

cagaaaaaaa tttaatttcc attttacaaa tgcacttttg aggctcacag aagtcaaata 38700

gaccaaagtc acagggctag tgagggaccc agaagaaaca aattgtaatt cactgattcc 38760

aagttcagtg gttgccttac tgcatcataa aggctattac acaatccagg tgtatcatat 38820

gattcttgtc tatatattca tacatatcag aaaaagtgtt ctactcaaaa ttgctagcaa 38880

tcaacagata ctgatagtca ttagtactta aatctttatc aaatgaaata ttaataccca 38940

tgaaagagag gacaatgaaa ggtttgtatc atttgtatgt cacaagtcaa cttttttcaa 39000

tcactcatta ttagtttaac tgtaaaaaat tatttacatt tagcgtgaaa ctttcctgta 39060

ttctcaacat atttccttcg gtagaaaagc aaacctccag ttctctgttc tttgcttgga 39120

tacttgccag tttgtaactc agctatcaaa cagtaaagct cacaaaacac ttattaaaat 39180

gactaaaatc caaaacacca agagcacagc atgctggtga gatgtggagc aacaagaact 39240

ttcattcatt cactaatgct ggcaatacaa aatggtacag taactttgga agataggttg 39300

acaatttctt acgaagctaa actatactta acatatatat ttgtccattt tcacagtgct 39360

aaaaagaagt tcccgagact gggaaattta taaaggaaag aggtttattt aattgactca 39420

cagctcagca tggctgagga ggcctcagaa agcttataat catggtggaa ggagaagggg 39480

aagcaaggca cctacttcac aaggtgacag gaaggagaat gaatgcagga ggaactacca 39540

aacacataaa accattagct ctcgtgagaa ctcactcgct atcatgagaa cagcatgggg 39600

gaaacagctc tcatgatcta gttacctcca cctggtctct cccttgacat gtggggatta 39660

tggggattat aattcaagat gagatttggg tggggacaca aagcctaacc atatcaccat 39720

atgatccaaa atcatgctac atgatattca cccaaaggaa atgtaaactg tgtccacacc 39780

aaaacctgca catgcacgtt tatagcagct ttattcataa ttgccaaaac ttggaagcaa 39840

ccaagatgtt cctcaatagg tgaatgaaca aaaagactgg cacatgtact caatggaata 39900

ttattcagtg ataaaaagaa atgagctatc aagccacaaa aacacatgga gaaaacttag 39960

gtacgtaagc cagtttgaaa ggttgcattc tatatgattc caatatatga cattctgaaa 40020

gagacaaaat tctggagaca gtaaaaagat cagtgattgc ctggggctct gagaaagtgc 40080

agagggatga atgggtgaag cacatggcat gtttaggaca gtgaaactat tctctatgat 40140

actgtcatgg tggatacatg accttatacc tttgttaaaa ctcagaattt tacaatacag 40200

agtgaattct aatataaact atggacttta gttgtaataa ggtatcaatg ttatttcata 40260

agttttaata atgtaccaca ctaatgcaaa attataataa taggggaatt gggggaaggg 40320

taatggagta tatgggaatg cactgtaatc tcagtacaat tattccacaa acctaaaact 40380

tctttcaaaa atacaagcta ttggtcaggt gtgatggctt ataccagtaa tctcagcact 40440

ttgggaagtc aagaccctca gatcacttga ggccaggagt tcgagaccag cctggccaac 40500

atggtgaaat cctgtctcta ctaaaaatac aaaaaaaaaa aaagaaagaa agaaaagaaa 40560

gaaagaacag aagaaataaa agaaagaaag gaaagaaaga aagaagaaaa gaaagaaaga 40620

gaaagagaga aagaaagaag gaaagaaaga aacagaaaga gagaaagaaa gaaagaaaaa 40680

gaaagaaaga aagaaagaaa gaaaagaaag acagatgcgg ttgctcatgc ttgtaatcac 40740

aactactcgg gagactgagg catgagaatc gcctgaactc agaaggtgga ggttgcagta 40800

gggtgagatt acgccactgc actccagcct gggtgacaga gcaaggctct gtctcaaaaa 40860

aaaaaaaaaa aagctattaa aaatatgtaa agctcagtct agatacagta ccagaatagt 40920

aggaacttta tttcacctgt cctacaaatt atggttgtgt gccacttggg taaaactcag 40980

aatccaaata tgtgaatgta agatttatgg ggaaattatt tgtatttcaa aataatcctt 41040

aatgaatgca ctccttctaa agtagccatt aataaagcag ttaatgtttc atttaattat 41100

agattaatgt acataagata tgccaggaat gcaattagga actgggaagg gggtgttatt 41160

ctaataactt ccacatagca ttgtgagaca ttttctgctt tcttcaaatt tcatttaatt 41220

acattttaaa caaatatttt tgtgagccta ttatatagtc cttcgctagc actgaggaga 41280

catgctttgt gaccttggtg atttcacatt caaatttccc tttcacctac actcttcctt 41340

gttttttcat gcctgtgtag attgtaaatt cttcctcaga ttaagacatt ttattcacct 41400

ttgtaacatc cacagtatct agcacaatca gtgccttcaa aaacaattgg cctcaagaat 41460

tgattgactc aatgagtgac tgaaagacta aattaataag tacacatcta tttgtacttc 41520

cctgcttact tataaggtat gacaatgaaa tactgagaca gttatacatt acttacggac 41580

tcaatctcat ttctttacaa tctctattct tcttttttga gtataatgtt attttacaat 41640

tccactaact tgtcactctt tattataaat tcatatctcc atttcacctg agaataataa 41700

aggcaaggaa gtattttaaa tgatcttgtt ttttataact agcattcatt gagcaaatca 41760

aagtatgaaa ataatatagg tgtcagtgat tattataaag ttgtatgcac aaaacattcc 41820

aatgattggg gccaatacag agaaaacatc tcaatatttg gaattttgct tttctgtaaa 41880

tactttgata tgtacttaca tcatatcaat tataactcct gctgaaaaca aacagtgcac 41940

acaaatttgg tagttggagg agactttata aagggactaa ttacgaaggt ttagaccggg 42000

ttaggaaaaa cacacggaat agtgcaatac tttaggatgg caacagcgag caccgttata 42060

accactaggc caaaatgaac taaatgaaca gggagattac catttatcag aaaaagaggg 42120

agaaaggaag gagagatgac caagcaagtc ctatgtgaag acggctgcct gacttgagct 42180

gtgtgatctt tggactgata ccacctgcct gcactggcct agcagggcga gaatagtcaa 42240

tatctggaaa atggatcacc tgaccttact ttcctccctc cctgtttcct ctttgtggtg 42300

tttccactgg ccaaactcac agcgtagaca aaaggagtgc attgatgtag cagtggttct 42360

aatccagggc caattgtgct cccagggaac attagtggtt atcacagctc aggggaggaa 42420

gggagaggag tggagtgcta ctatgattca ctgagggatt tttttaaaca tctacaatgc 42480

acaggacatc cttccacaac aaagtatcca gttaaaaaat gtcattactg ccaaggttga 42540

aaaaccgtgg tgtagtcagt acaattcatc ttctccaggc acagtgcagg agtggggtgg 42600

agtgtctgaa ggggaagaag gaagaaacca gcacacccca caaaagtaac caatgcaaat 42660

accaaatagg aaaagacagc acttaaaata caaaagtctc aggaatatat ctgatagtgt 42720

tttatggaat ttattaaaat ttagcctgga gtgagtaata tttagcaagc caggtttgtc 42780

tttagagaaa tccttgtggg gtttatacaa ggatttatta acaaagggca cacacaatac 42840

tcatattaca gtcagtctgg ttatgtaaaa catgggcaag aatgtaatag gacaatgtga 42900

tgtattcaca aaggatttta ggactacaca gataatcctc taatgctttc acttacgtac 42960

tatgaaaggc tatagtttgc atagtgatat agccacgtaa gatagtaaac ttgacattca 43020

tgcagctata catgtttgca cacaccagga tgcatgccct ttctacctgg ttgatttttt 43080

attcttttat taatctctaa tttattcccc agaacactct ccataaaaac tttctcacaa 43140

cttaaatctt taatctattg tgtggatttc tgactcattc tccaagcttt tcctcttccc 43200

tccgcaatgc cttatagtct tatgactatt tatccctttg cctacatttc tagccagatc 43260

tcttgcctga tacacactct catatttctc tttgcacgct acacattttt atttagatat 43320

cacactacta ctttgatttc aacaggtctc agtttaactt aatttttcct tcaagcaagg 43380

agtcccttca tatcagttat caccattggc accagaattt ttcttatgac ttcccatgac 43440

ctacaatata aaccatataa atcactgatg cctccatagt tccctccctc tcaaatttag 43500

ccataagatg attttaggat ccttgttttt tccaatctct ctttcattct ctcccccatc 43560

tcttccatta tgaaggtttg gataggacac aactcatgcc tagattagtg caatagatgc 43620

tgagcctgtg cagcggtagt ttagctttct ctcctggtta actttaactg ccacatatat 43680

cacttcacac gtcatttttc attcaaacgt atttaactgg ctcttcattc ataagaagct 43740

ggaatttgtc gtttgactga tattttaaag attttatatt ttttctccat cctcgttcta 43800

atgttgtatc ttgtgtcatt tgttcattca taaacttaag acttagctaa ccactgagca 43860

tccaggaaat tcagtatcta tcatgtgaat tctctaatac tggttgatcc attgtcacca 43920

gagcatagca ggcttctcct gcctttatgt atgtttgtca tatagttcat gcctaaaatt 43980

ctttcttaaa tcttaaattc ctaagataca cacttttgcc caagatcaca gtaatctctg 44040

ccataatctc tgctggaatc tgttcactgt gttgctcctg ctaaacttct tacagatgac 44100

tttttttctt tttggtttcc ctggtatcta gtataatttc ttatataggt actcaataaa 44160

tgtttcctgt tgatctctac acctactctg tacaatacca tagtgactag acacatgttg 44220

ctatcaagca tttcaaaagt agctagcctg agttgagata taggggtaaa atacacaaca 44280

gatttcaaga catattatga aaaaaaccca taaaatttct cagtaatttt tttatagatt 44340

acatgtagaa actataacat tttgaataag ttgtatcaaa taaaatataa aattcacccg 44400

gttcttttta atttgttaaa tgtggtggct agaaaattta aaattacata attggctcac 44460

agaataatta taatggatgg tattgcttta gatcaagttt gtctaacccg tggcccatgg 44520

gccacaagcg gcccaggatg gttttgaatg agatccaaca caaatgtgtg aacttcctta 44580

aaacattatg aattttttgt ttgttttgtt tttgtttttt tctcatcagc tatcatgagt 44640

gttagtgtat tttatgcatg gctcaagaca attaattctt cttcaaatat ggcccaggga 44700

agccaaaaga ctggacaacc ctgctttaga tagtaaagca tatgagtagt taatgtgtac 44760

tataagcagt gtgatctgat agactattta atgttgtttg atggtacatt attcaagtcg 44820

attattatgt ctacctatgc agtttaacga cggtaatgag agagggcagc ttgattacag 44880

gtcttatctt ttgactaact tgctaggcca cctgagaagg acccaaatta tctgaatgct 44940

taactcaact aatttgtatt cacttgaaga atttcaagga tgtttatatg ccatcaactt 45000

gctttaaatt ttttctctca gtgaaaattt ttcttaaaat gagtatgtgg tattcaaatt 45060

tatccttgtt ttctatgatt atcttttcat agcactgtgg tttccaggaa cctttttttt 45120

tttgagatgc attctacatg taactattgc acagtttgca tgtagtaagg ttcattattc 45180

ttctactttt ccaaacacct ggcatgttta cttgaggttg gtacaccttg tatcccagat 45240

tttgctgttt ttaacttaaa tattgaatat tttgattaaa cattatggaa agtttaaatg 45300

ggtcaagaaa aatagctttt cttcccatga agaacaatac ggcataggag ttaagagcat 45360

agatttaaag tcagaaaacc tgtgctgcct acttgtgcaa agtcacttac atgctgtact 45420

tctgtttctt catctgtaag ttctacccct aggtatttac ttaagattaa tggaagcata 45480

tgttcataca atgacttgta cagaattatt cacgatagca ttactcttaa tagctctaac 45540

tggtaacaac acaataatca atcaacaatt gtgctgtatt catacagcag aatactactt 45600

agcaacaaaa atggaatgga ctactgataa cctcaacaac atggatgaat ctcaaaacta 45660

tcatgctgtg tgatgccagg cacaaatcag tacatactat aattccagaa aagacaaatg 45720

tcatccatgg taacaacaag atccatgctt gctggaggta gaggcatcag ttcagtcatt 45780

caggaagctg attccaagat ggtgttagaa ttacaaccat ccacaagaga tttattgcag 45840

gcaatagcta tgaaaggtag aaagagaaca ggagaaaaac caggcaagga aaaaccacaa 45900

tgtagttgtg atatcacttc aaagggaggc agaaggaagg agaattgggt aggaatagcc 45960

acagattaca gtgcagttac aagaaagtct tggcttccaa caaaggttac ttgttgagga 46020

gtcatgcatt aggcagacat gtctgggctg tagtttcctt gctgctccca gtcattggct 46080

ggaggccagt ctgggttcct gtgctgtggt ggatcccatt gctgctgcag caggaggcca 46140

atagcactcc tggcagctaa ttggagagaa aagatccaag aggtgtacct tcatggctac 46200

ccccatgggg ctggggtgga ggtggaggag aaggagaagg aattaactag aaaaaggcac 46260

aaaggaaaat tggggaaaat aatgaagata tatgatttct caattgtggt ggtcgttaca 46320

tgggtttatt aatgcatcaa aactcaagaa atgtacattt aaaatgagtg catatgattg 46380

taagtgaatt atacctcaat atagttaatt ttttaaaaat catagatttc tttatattta 46440

atgcatgaac ataaacctaa gacactcctc cactccaaaa cttaattacc ttgtgatcag 46500

cagagcagaa ggtactttgt gatatatagg tagagaagat gaagtcttgt gacatttaac 46560

aagggacagg aaaatggacc ttgtcctaag ttaccaaact gcaaaaatat cacctacaaa 46620

ggctattcat aacatacatt ttcaaggggg ttacaatatt tgcctactat aaaattttgg 46680

atctgtaaag gggttaaatt atttgtgcag gggaataaac atcaaagaaa cattaagagg 46740

tccagagaag taaaatagga agggtctttt ggctagagga gatatttaac tttcagaaca 46800

tgtggaatta agttgtattg attatgatct gatcttcttc cccctaaatt tgatcctctt 46860

cctgtaatct attgtttcca tcatcttcaa ctcttccctt tccctctccc ttgtccctca 46920

gttctagtca atcacaaagt cctacagttt cactttctgt ataccttatt tctggaattc 46980

atctctagac ttcaaaatat atatatatat attttttttt ttgagatgga gtctcgctct 47040

gttgcccagg ctggagtgcc gtggtgcaat ctcagctcac agcagcctct gccacccagg 47100

ttcaagcgat tctcctagtt cagcctcctg agtagctggg attacaggca tctgccacca 47160

cgcctggtta atttttgtat tttcagtaga gatggggttt cgccatgttg gccaggctga 47220

tctcgaactc ctgacctcag gtgatccacc cgcgtcagcc tcccaaagtg ctggaattac 47280

aggtgtgagc cactgcttcc agcccaaaat atcttaagta gataattgca cgactaatct 47340

ctgcttttct ctcccagcag ccttccaaat tcatgtctca cagctgacag agttgttcct 47400

gccttcagat tcatgacctg gctctgtgtt ctagctcagg ctttctctct catatcacct 47460

cttgcctctc tgttgccccc atattttccc ctctggttgg ttggtgctcc tttggaaccc 47520

tctgcatatc ttttcaagaa tattatgact tattatgcct ataaactttg tttaattatt 47580

tatttctaaa atttgacagg gaactttccg aaggcaggta ttgtgtcttt ctcatttaaa 47640

agcaaattct cgcctggcat ggtggctcat gcctgtaatc ccacactttg ggaggctaag 47700

gtggacagat cacttgagcc taggagttca tgaccagcct gggcaacaca gttagaccaa 47760

aaaaaaaata tatacgaaaa ttagcctggc atggtggcac acccccgtag tctcagctag 47820

tctggtagct gaggtgagag gatcacttga gcctggatgg ttgaggttgc agtgagctgt 47880

gattgtatca ctgcactcca gcctgggcaa aaaagtaaga tcctgtctca aaaaaaaaaa 47940

aaaaaaaaat tagtgaatcc tcagtgttta aaaagtccat aaacatacta aacatagaag 48000

acctccaaat gaaattaatc aattattatt tagtgggttg cttctctttt gttttaatat 48060

agttttaaca aagagtaaaa gttatgatct ttttatatgt aaaataaata atgccgggtt 48120

tgacataaat tttaggaaaa ctagagacgc tacttcctaa aaattttctt tctataatct 48180

tcctaaatat ttttccataa agtacaaaat aatagaaaaa aattaagaga ttgagtatcc 48240

tttcaggaag tgatatgaca aatagggttc gagaactatt tgaattctca ccacttttca 48300

taagggcaga tctcaagtta aatttttcta ttcgaattta aatgactttc actggaatac 48360

cattacagaa aagcttctgt gtttagatgg caatatggag tttcttttct tggaatatta 48420

attgaaggag aagtcttaat tttttaagtc tatatctccg tatatatttg aacctatttt 48480

atatgttagt ccttctcttt agtaaccttc atccacagtg aacaagattt acccttacct 48540

ttaagcagta gcggctactt tatgtgaagt gaacagctgc tttttttatc tgcatctaga 48600

catcaagtag tccagagtcc tttctaacac cctagcaata gaagtaagaa tattttgacc 48660

attccatgac ttgatgatac ttctagtaat aatactgtat tattaaaaac aaacaaacct 48720

ttgtgcagtg gtaattgaag cagttccttg ggaacatgta ttaagtactt tttagcagtt 48780

aagtccactc tctgtaggtt aaggaatatt taaataaaat aatgtggcaa atgagttcaa 48840

gatgataaat gcgatgagaa ctaaaacagc tttaatttta tgtgggaaat aaatagagga 48900

aaagtacatt acagggctcc tggacttatt tctttcttca aagtgtttct cctagcgaat 48960

attattacta ttttttctct taagtaaaaa atacacaaag tatgaatcta cacaggataa 49020

taatattgaa gttaaggatg atgtctcctc cttcactctc caaaatacta tttacttggc 49080

ttcatggaaa tctctctcac tccaattcca ccgtgtcaac tgaggtcttc tgttctttct 49140

ctccctatag catattcctg ttacataaat cctaaactgt gtcgtgttag tcacacactg 49200

taacctctag ataagcgcct gtccagaggt tctcaatcag agccttgcaa atatgtatta 49260

aatcaatggg tcatcttcag tgtctcagtg ggcccttgga tatgttttgc agactgctgt 49320

gagtatgtag ggatgtccag tatcgaggga agtgtggatg gctttcattg gttcttatag 49380

ggctgaagaa cacatagagc agtaagcact tctactgtag ggagagatcg agcttctccc 49440

atccccactg ctggcaccac caccacccta caccccattt tgagttctga aagtgaatcc 49500

ttgagaaaga acacacaaaa caaccatcat aatagtgggc acagctgtgg gtggtagaat 49560

aacattccca agcttctttt cctacacatg attaatatta attcagcaaa catttattca 49620

gctcctactt ttaaacaggc actattctag gtactaaaga catagaggca aagcatacaa 49680

gactctgcct ttgtgaaaca attaagaaat aagtaaaaag aaaagaaaca gaaaaggcaa 49740

tttggatagt gtcaggtgct ataaagaaaa caaaatgcca ttttaataaa taataataat 49800

acaatgtttt catactatgt gctagacact atgctagtag gtatttatag acataacctc 49860

aattaatcct caaaatggca tgttgatatc aataccccaa gtttacatat gagacttaag 49920

atgtctgagt atattccccc aggtaacaat taatatgcac aataaaactt tttgctcatt 49980

catttattaa cctatgttga ttgagtacct attttgtgtc aggcatcatt ttaaggcacc 50040

tggatatagt tatgaacaaa caaataaaaa tctctgccct caaataatta atatctcaca 50100

gaggttaggc aaaatataat cagaaaataa gtataacgta taggatgcca gatcatgaaa 50160

gaagctatga atggcatcaa gaagctggaa aaggcaagga gacagatttt ctcctagagt 50220

ctccaaaaca gaacacagtc ctgccgacac cttaacttta ggctagtgag acccctattg 50280

gacttcagac ttacaatccc acaatgtaat aaatttgtgg taattcagta ggggaacaat 50340

agaaaactaa tacgatatca aaacaaatta tatcatagaa caagaaaatg taattgtgac 50400

aaataatacc tacaaaaatg ttgtaaatgc taggcaaata atgtgtttaa agcacttagg 50460

ccaatgttca acgtaaagta attcatgcta taatatcatc atcatcatta ccaatattta 50520

ggggctctaa caaatgatgt acgtgtaagc agatgtaaga aaatttcctt gctgaagagg 50580

aggtattaat agagtatata acaatagata acaaattcca aataaaggca aactaaatgt 50640

tttattggat taaatttaat tttaaaaact acaagaggcc gggcgcggtg gctcacgcct 50700

ataatcccag cactttggaa ggctgaggtg ggtggatcac gaggtcagga gatcgagacc 50760

atcctggcca acatggtgaa acgctgtctc tactaaaaat acaaaaatta gctgggcctg 50820

gtggcgcgtg cctgtaatct cagctatttg ggaggctgag gcaagagaat cacttgaaca 50880

accaaggagt cggaggttgc agtgagccaa gattgtgcca ctgcactcca gcctggcaac 50940

agagtgagat cccgtctcaa caacaacaac aacaacaaca acaacaacaa caacaacaac 51000

aacaaaactg tgagatccat ggtgggcttt taagaggaaa atgcaagcta aggtttgttt 51060

agactctgag tactgcatgt gtaaaaataa aggcatgatg aaaagatcaa gagattagag 51120

tgatactttt tatctactag tgtcagagtc atgaccaggg gattggctat gagaatacat 51180

aagctgtgcc aggagtaatc caaggagatt gtttcaattt ggaagagtgt ccacagaatg 51240

attctcatac tagacgttgg gctattgtaa agaaagttgg taggtactcc atcgctagga 51300

tcatatcagg gagaaattga acaggatggc cctaatgacc ctgttgtacc cctagcttat 51360

ggattaggca agtcacttct actcgtatac cctgtttccc catttgtaaa taagaggatg 51420

tgttactcta aggatctcta agattctttg cagttgttaa attgcatagc tctccactga 51480

ttccatggtg gaaatttgct attctattac aaatattcta aatgtatgag atatcagaca 51540

tactcattta aaaaacaaaa tacaaaaaat aagtattcta caaataaaca cagataatgt 51600

ttaaattcta tatgtctttg tttctcttca gaagcatcca aaatacaaac catctaagag 51660

gcaagaaaat gtcgtgatgt tcctagtgca agttaaaaag atttgctttc ctcaagtcgg 51720

aaagcccttc tcatttttga ggtttttttc ttcttttttt tttcaagtga aagcattttg 51780

gaggagtcaa tatccatctt taaaggtagc caggtcacat gtatacatat gtaactaacc 51840

tgcacaatgt gcacatgtac cctaaaactt aaagtataat ttaaaaaaaa agaatttaaa 51900

taaaaaaaga aaatcagaga gaaaaaaaaa aagatgcatg tgcaccctga tactaccatc 51960

catagtgata cggtttggct ttgtgtcccc acccaaatct catcttgaat tgtaaccccc 52020

atgtgttgag ggagggacct tatgggaggt gattggatca tgggggtagt ttctccatgc 52080

tgttctcatg atagtgaatg agttctcata agatctaatg gtttaaaatc atggcacttc 52140

cttttgctct ctctttctcc tgccatgtga ggtgtgcctt gcttcccctt ccccttctgc 52200

tatgattgta agtttcctga ggcctcctca gctatgcaga acggtgagtc aattaaactt 52260

ctttctttat aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aggtagccag gtaaaaatta cttgtttcca 52320

ggacattttc acctgaaaga agcattgtca tataacatag aagcaagaaa tccagtagtg 52380

ggggttattt aaaaatagct ggaaaatttc aatcagcatg agtttgaagc aacaatttat 52440

catcaccttt tatggtgggt ggggttaaga acatttcagc gggcaaagtg gtggtgatgg 52500

ggaagagaca ccaggggagg tgattcccat tgcattgctt tgtaaacaga ggcacaggtt 52560

cttcattttt gtcacacaaa atcacagcta tgcagaattt attaatttat tcttctgaga 52620

caagaaaaaa gccaccaaag gaaaccaaca gcttgctcct ctcacactgg gggaaccata 52680

tgagagactt atctatccct gactttaatt ttgacctgag gagagctcct cttaaggaaa 52740

acaaattaat tcaatgacta tactacttaa tcattgacct ttatttaata agagattttt 52800

ccataggata tgctgagctg tctcacttac atcagttgtg tctcctgagg tgggtgacag 52860

gagaccacaa atattgcata gcacacaaat cgttaatagc agctgtatac caaaccatta 52920

cctaaatatg tagagtacaa ttcattctca ctaatgtcag agagcatgct ataaaatggt 52980

gaatccggac agctgaagat actgaataat aacctctatt ttgaacaagt ttacagtgtt 53040

ccaatcagta attaaattga tacctgatga atatatgtgt gtgtatgtat tcatagcaga 53100

gatggttttc ctgagataag gattttgtta ttcggatagg ctgctgctgg aattgtcctt 53160

ctacccttgt ttctttgtcc ttagtcatca ctcatacctc tttccactct tctgccatca 53220

cttttgtcac caaagtcatg gtcctttccc cgccgattgc tgctgcaggt ctagggcacc 53280

aagacttagg cagcactcac catgtgccaa gaactggacc acaggtacca tccagcattg 53340

ctcatggaga ctctgtccct ttctgtagga caccctcctt ttagctagca acccctccac 53400

cacctagagc ctctggacct ctcattttaa tattaagaac taggaaaact taccgctgag 53460

aataactagt acaactagaa ctggtagaga aatctgggtc tcttgggaat ggatttttag 53520

gctttattga ttagaggtgt attaataatg cagtgttata gtttcatgac ataacgaata 53580

aaaaagttca ttttggactt gcctttcagc tccctaggag ctaaaagacg tatttaatgt 53640

aacttgtgtg gtggaaataa gttctttttt caggcaaaag atgtgcaaac ccatctgggg 53700

aagaaacatt aaaaactaag gagacagtgt cctagataac tatgttcttt tcctgtttta 53760

gtctaaaata atgattagtt ttcttatata tcttcatttg tcttggttcc ttttagccca 53820

atttaataat attattgcag atattgatga aaacctttac cttcctctta attcatcaaa 53880

gtacttgata aaatttatac atagtacatt aattgggagg tttttatgag attaattaat 53940

ataatgaact gatgttgaaa ttatttaaaa cctgaattat tattgtatta agtaggacac 54000

ttaatacagt taatcagttc tgtctttatt catttgtgag aatttttggc aagctattgt 54060

gaatattcag ggaagggaat gtatttttag caggaatctt atacctccta catagaaatg 54120

aagcatttac tgaaacatcc atgaaacaaa atgtttctga atgtgtacta tacacttgtt 54180

ataagcccct tttcttctgt agctatattt tggagaaaaa tctttgcttt gacaaaaaaa 54240

attatgttga cttacacata tattttataa ctaagcagtg tttggtttgt gataaaggat 54300

acaaaaatat aaaaatgttc agcacacgta agtaaggcct tgttgacagt gtgagttatg 54360

ctactggata ctcaaaagga acattcagtg ttctcaggtg gtctctagac tgtctcaagc 54420

ctaggaagat attttataag caaaggaata agagaaggaa gattcagatt taatccaagt 54480

gaagaattca gttttgtgtg ccttatcctg ttattttgag aggcagccaa aagatgctgg 54540

tcagcaagga gaattgtaag ttgggcagcc aactctgatt tctcaacctc ttagctgttt 54600

tcttaaactc agaattttta atgaatttaa atgtccatat caggtagact ttggggatgc 54660

ttttaccagt gattttcaga atgttacttt ctggcatttc ttttcacgta gcattatatt 54720

aaaaatgaat tcattcatcc accttccctt gtccttacta attttccctc ctactccctt 54780

cccccttgtt cttgccatgg ggacatgcaa acactggtgg ttgatgtctg agcaaggctg 54840

ctgacagggg gaggaaggag atgtcaagca gaggtcaatg gcagtgtgcc cagcagccta 54900

ggaagtagga gggaaaagag agagagacag agatggtgga tgaaagagaa agccaggatg 54960

attatggtgg ttatgatact tgtcatgctg aacacccaat tgagcaccca ataagcacat 55020

aataatttaa tcatcctctg gcttggatgg cagtgttcta tcagtgttga cttcctggtt 55080

gtgacagttt tacagtgtta gtgtagaaga gaatccttgc tttagagagg tacttactga 55140

agtacttagg gttaatgcac cattgtgctg gaaaaagata cgcacacaca cgcacacaca 55200

cacacacaca cactctcaca cacacgcaca aatacatcca tgtgttaggc agagggagca 55260

aatgaggtaa aatgttaaca attaggaatt ctgggtgaag tggatagagg gactctttga 55320

ctgttcttga aacttctcta tacatttgat ctgtttcaaa ttcttcagaa aatcaaacta 55380

caaaaactta attcatttag tgaacatcta ctgaacatct gtatattaaa tagtgttaaa 55440

tgaatgtcaa ttaaaatgct caaacacagt agaggttgat tctcattcac ataagtccat 55500

ggtaggtgtt tttggcaggt gggtgagttt ctcccttagg gagattgagg aacccagact 55560

cctcccaagt tgcagcccca ccgtcttctg aggggatgca tccataccca cttcgaagta 55620

gcatacatta tttcctttct cattcctttg gataccagcc acaatttatt caaggtagac 55680

agaaaattgt agtatatagc catatgccct gacaaagaag ggagaacaga ttttggtgga 55740

caactagcaa actctgatac aatctgttat taagcactgt gtgtggatag atgctaacta 55800

gaaggagatt atcttccctt cagcaaatat aaactgaatg ccgtttattt ggttgaaact 55860

aagctagatc atgggagtat agaaatttta taagaagaca tagtcacttc tgtcagtgag 55920

ctcaagaaga attagtatgc ggaatgtaat catacctaca gggggcttgt gccacttaag 55980

taaaatgaaa cattattttg agtacaattt agcaataaat gtactacgag atcattaaaa 56040

atcatgtttg aatgttattg tgtcaaggat gggaaaaaga cttttgggtt gtagacttga 56100

taattatagt taaaaacagt ttttattctt gtttagtctt attttttatg tttaaacata 56160

tttatacttg ctaacattta tacttgctaa gtaaagactg tttttacaac catgacaaga 56220

acaaaacata ttagtaatgc aaatgccaca tttcctacaa tcaactaatc acactaacat 56280

atttgcatgg aagaatcact gggattgatc tggccacgtg tgtagtcatg cccaaaatgt 56340

gaagtccatc tgttttgcaa ttttttttaa ccactgttat ccaaatgctc cttggatttt 56400

ttttattagt ggatatattt tggaggtcag acaccctctt ggctagatca tcacctttat 56460

aacaaatata tatactattc tcatggaaat atatttagac attgccctac tgggaatttt 56520

tttcaagtaa ttaatgtaca gcttgtgcaa cagcttgatc ttggcttcat ggaaataatt 56580

cactcttagc agcatctaat gccacaaagc atttatggat gtcagctcag aacttacttt 56640

tatttatctc tgagttactt tttttttttt ttttttgaga cagagtctca ctctgtcttt 56700

ggcttgtccc taacctctta acagacttaa tattaagctc catttcactc agtcgttctg 56760

ttgtcatata aatgagacat tctacaagca tagtttttag tttctgccag agcatcatac 56820

aacattgtga gctatgatga agataaagac ctagagaaga tatttaatat gaagttcatt 56880

atctaatatt tggtatgtgt ggcaaaatag caatctactg cttggttctg ctgtaatcta 56940

tttacccacc catcccatct ttctttcaat ttaaaaggat aatgatttta gtcacgatta 57000

tacataaacc cattaccata ggcaataaac aatggggcaa accattggtc ccatagttgg 57060

agtgtggtct gaagtgtgtt ttggtggaga gagatctatg tctggagata gctaacatgg 57120

atttggatcc cagatctgct cctacctgtt gctgtgcctg tgaccaaatc atgtgatctc 57180

tctggtttca gtttacttgt gaataaagta aataccttca tcaacacctg tttttgaata 57240

caatgttttt ctgtaatttt tgcttcttat aatgttataa tgatcatcct tacatctaaa 57300

tcttggttta cattttcatc aattcttttg gaaagattgg agaagtaaat tttggagatg 57360

tatgtcggct attaaaaatg tttaattttt taattaaaaa ttaaaacgtt gaaaaatcct 57420

gatgcaaaat aaatgcatta tgcttagtga actcttctca tttcgaagtt tattcacctt 57480

cttgtttttg caagtttcct gaaaaatgca tataaagtca ctaagttagc agaactttat 57540

aaaattatat aactatatat aatcttttga tatcagtgaa gccagctgat cctatagaaa 57600

taatgtagga attataatca ctagcacata atttaagagt cctgtggtct tattcatgtt 57660

atttaccctc tctgaatctt acatatagta agagggttat tatacataat atgtgtacat 57720

gtatacaggt aagtaagtat atatgcttat gtgtaaaagc agagttattg tgagagtcaa 57780

atggaaatgt gaaagtactt tgtagttttt tattactatt attaattttt aataaaatgg 57840

taacattcat ttaataatca ttagttttaa cttcagattg tactggattt cctctagtat 57900

ttcttaagat tagtgaataa agtatttctc ctaataaata tattgactac tgtctttcga 57960

tcaaacatat taggtatatt tttacagtag catcaggcag tgaaaatttg aagctcttta 58020

tagaggactg atttatgatg aaaaggaata acatgaacaa atggaattat atgaagcttc 58080

cccagaaata tctaagaggg gccaatttta agaaatatct gacttctttt tcatggacat 58140

ttcaaaataa acctaactca tatggtacag tttttaagag ggaaaagaaa aaaccatctg 58200

agaatctctg gaattctgcc gaaagtatca cttggcattt tattctacct tctggatgca 58260

gttgattgac agtagtgtta tgatgccagg ggtatagtga ctagaaaaag aaaaccaggg 58320

aattcagtgt tcttgctcat gaagaacagc ttggttcttt aaaaacaatg agattttgcc 58380

accccatctc acaaacctat gatttgtgag aacaatccct tttgtgttgc aagactttta 58440

catttctctt cccacactat attagaagaa taaacattgc ttcataagta ccgattgata 58500

gtctcatttc atatttttaa aatagagtta ctttaaggtt aaatttttca tgtagattaa 58560

aatgactaag taaccattca catatttcaa ataaaatata tttttactac aaaaggaaaa 58620

taactagatt cttaagtgtt atagtcaagt gtaattgagt aatatgaatt ctaaatgaat 58680

ttctaagatc tgctcagctt tcactacttt aggaaggaac aacttaagaa aaattttaat 58740

aaagatatct cttcacacac atggcagtgt tgtacttaga gaacatgacc caaaattttt 58800

tatgactgca tattgaattc ctgatactct tgggaagctc caaaagcacc agtggagttt 58860

ccagatgtaa ctgtggctgc agacccgcca gtcccggtgt tggaagggat cattataggc 58920

tcttgtgtgc agactcatct tcagacccag aggaattaaa taacttgccc aaagtcgcac 58980

aactttctca tggtaggttg ggcactagaa taaatattgc tttttcttaa gagttttagc 59040

ctccgtatta tgaaatcttc tatgttctgc tgatgatatc tcctttcttc atctgttttc 59100

tatttttaag caatggaaat acaaacttgc aactccccat ttccaacaca acttagaaaa 59160

aacaatattt aaagaaaaaa ttacaggcat ctcatctcct ttacctgaca gatgcttgat 59220

agtaatggcc tctagatagg gatgacatct aatataaatg tgtcctttca agtcaagctt 59280

tctctgttca ttagtagaaa tattgtatat caagtgtgca aaaattttct tcaacaggga 59340

gctttgtttc cctcctttta ttataacaat ctgagctttg tggtcccagg gtctcctagt 59400

gcctgtcttt aggtctgttt attcacatga agaaagcatg tcatatagta ttatctaaga 59460

ctcaggctgc ttatgcatga tgacagaagg gttcccaggc acaaacattc atccatgcat 59520

tcatccatcc acctattcat ccattgattt ggctgataat tattgactac tgttgagttg 59580

ccctcagatt tagtttctgt ccttctgcca tggggaaata tggggttaag ccacaacata 59640

ctcttctctt ctttttctgc accttcttag tatatttagt tccattttgt ctagccctgc 59700

ctctgacttc tttgttgtac ttcaggtttt ttatcattga aagttatttc tggatcatag 59760

atcattctct tggtcacttt gcttgttcac ttataaaatt aattcagaaa aaatgaccca 59820

cagtaattac cgtaaatcac agaccataaa ctataatact gtatattgta ttatagtaca 59880

gaaatattta tactttaaaa tgttttaaat atagatatta taaaaagata tgtctcatat 59940

aagtaatata aatacttttt tattacctct tctctcccta ttctccaggc cagtgtttta 60000

aaaatccatc tttatatgtc catcctggaa aaaactcatg atcataaatg agtttctcaa 60060

tagagtttat aagcccacag ttgaaacaca attgtcttag catccattta gttgtcatac 60120

ttttaagatt taatggcaaa tattatgttt tgtttcttca aaagaaatat tttaaaattt 60180

tagtaaaggc agttagagaa ggtagagata atggactgtt taatcctact tttcatccca 60240

caagtgaaca aaaaaatgat aaaacatttt tcccaaaatg tagctttaac tatacttaaa 60300

tttggactaa aatgggagat atcttttcta ctattgaaaa gccgtgtctg tagattaatg 60360

ctaaaatcgg gtgtaaaagc aaaatttgtt tggcttgatt gccaatggcc cattcatttg 60420

gctacagaaa caatagcaca tagcaacaga taatgatgtg agatcaccta gctcaagtaa 60480

gagtgtctga tccgtcaaaa atatatacat caagattcaa aagaaatgtg tgttttctca 60540

agtcatctct gtaaaaatac attaaataga ggaatagaag tttgactttg aaaatacatt 60600

gcagacccaa tccgtctttc ctattttctg gtgaaaagta tcaaatatgt ggaacctgga 60660

actgctattc tccttcttaa aaatctttct taatattcta ttgataactg gtgcaagcct 60720

aactttttgt cttacccgat tcttctcaca ccaaagtgat aggaccttca ggtagccttt 60780

ggatagaaga taaataataa tttaactatt gatggaagtt agtattagaa ttagacttgg 60840

aagtctatgg aataaaatga ttctacaaca atttgtactt cagacattag tataacaaaa 60900

catgtttgcc cgtgcatgcg gaaacaacca atttcatgtg gatgcttata ttcacaaagg 60960

agtaaccacc tggggtttcc cactgttgct ccagagaaaa ctagcagcag gagaacttct 61020

ctgaaggtat caagacatct ttaaaaaaca cttgttaagt gttggttcag ctaaagcagg 61080

gagttttcag ttagtaatgg cttttaaaaa ttaaaacaag tttagcatgt aggtcattaa 61140

ccttgaatca ctgtcatgat tattattaac catctgttct caaatcgaaa gatatttttc 61200

ttttctagat cacatttatt ctcacattgc tcaatttcac tatatatcaa gacatgaaaa 61260

ctgtaaaaat cacaccttct acattattat ttttattgaa aaattcctaa tgaaacagtg 61320

cgctctggga tagagaaagg aactaactga cattttgctt cttaacttgt ttttatgcaa 61380

gttctaagtg gtttctggcc atgtacataa aagacaaata tctggaaaaa aaactagcag 61440

aagtcagtta tttggctcta tctactttga gaattatgtt atataaatgt taggaaattt 61500

tttgtaatat tcttatttag aaatgaaata taaaaagttt taaaaatatc taaggacagt 61560

atacagtcct aaagtaaagc tgttaggtaa atgctacaca atcctcttat tacagagtca 61620

cttacctgag aatataagaa gagggcctct tgtttaagag taaatgtgag ctgcaatcag 61680

gattctgcac tcatttggac acttagtttt gtttttccat gactggtgtt gcctgttact 61740

gagacaccta cctgtcatgt gaccacagct tatgttacaa tgtgtctagt cagacttaga 61800

gatgtgtgaa agagcagtac ctagacggga aactatgggt ctataaaggt tttgccttct 61860

tgggcggagt tcaaactagg aagccacaaa acttccagtt gcattttcac agattaatga 61920

aatatatttt acacttttcc tgaaagatat tttatttgtg caaaccttgt tacaaagtac 61980

agccagttga ttaatcgatg aagtgatttg tagtggattc ttatattttg tgtaagggta 62040

tatgtgaggc cctatatatg aggctttcta tataatgaag tataattcag ttcagcattt 62100

caattcagca atcacttatt gggcctctac tcagttgcct tcagggcttt ataatttaat 62160

tgataaaggg aggttaatta attaattata acaacagatc gcttaatagt gtaactacta 62220

atttaattaa tgacaaataa caatacatta aaagaaatgc attaataaaa ataatatatt 62280

ggtgttatag acaataattt tctgattaac tttattatta ttatttcaat agcttttggg 62340

gagcaggtgg tttttggtta tatggagaag ttgtttaggt atgatttctg agattttggt 62400

acactcataa cctgagcagc atacactgca cccaatgtgt agtctttcat tcctcacctt 62460

cctcccaccc ttcccctcaa gtctccagag tccattatat cattcttatg cctttgcatc 62520

ctttagttta ggtggcagtt ataaatgaga acatgtaatg tttggttttc cactcctgag 62580

ttacttcact tagaataatg gtctccaact ctatctacgt agctacaaat gccattattt 62640

tgttcctttt tatggctgag tagtattcca tagcatccac acacaccccc ctatgcttta 62700

tatatatatg taaatatatc acattttctt tatccactca ttggttgatg ggtatttagg 62760

ctggttccat atttttgcaa ttgtgaattg tgcagctata aacatgcatg tgcaagtgtc 62820

tttttcatat aatgacttct tttcctctgg gtagatacct aggagtggga tcgctggaac 62880

aaatgattgt tctactttta gttctttaag gaatctccat aacttttcca tggtggttgt 62940

actagtttac attcctacca gcagtgtaaa aaaatgttcc ctttttacca cttccatgcc 63000

aacgtttatt tttttatttt ttaattatgg caattcttgc aggagtaagg tggtatcaca 63060

ttgtggtttt gatttgcatt tccctggtca ttaaagatgt tgagcatttt ttcatatgtt 63120

tgttggctgt ttgtctatct tcttttgaga attgtctatt catgtcctta gcccactttt 63180

tgataggatt atttgttttt tcttactgat ttgtttgagt tccttgtaga ttctggatat 63240

tagtcctttg tcagatggat agtttgcaga tatttctccc attctgtggg ttgtctgttt 63300

actctgatga ttatttcttt tgctgtgcag aagctttata gttttaggtc ccatctattt 63360

atcttttttg ttgttgttgc atttgctttt ggtttcttgg tcatgaactc tttgcttaag 63420

ccagtgtcta gaagagtttt accaatgtta tcttctataa tttttaaggt tttgggtctt 63480

agatttaagt ctttgatcca tcttgagtgg atttttgtat aagttgagag atgaggatcc 63540

agcttcattc ttctacatgt ggcttgccaa ttatcccaac accatttgtt gaataggatg 63600

tcctttcccc accttatgtt tttgtttgct ttgttgaaga tcagttggct gtaagtattt 63660

agctttattt ctggattttc tattctgctc cattgatcta catgtctatt tttatagtag 63720

taccatgctg ttttcctaac tatagtcttg tagtatagtt tgaagttggg taatctagtg 63780

cctccagatt tgttattttt tgcttagtct tgctttggct gtatgggctg ttgttttgtt 63840

ccatgtgaat tttaagattt tttttcttgt tctttgaaga atgatggtgg cattttgatg 63900

ggagtcgcat tgaatttata gattgttttt ggcagtgtgc tcattttcac aatattgatt 63960

ctgccaatcc atgaataagg gatgtgtttt cattagtttc tgttgtctgt gatttctttc 64020

agcaatattt tgtagttttc ctgtagagat cttccacctc tttggttagg tatattccta 64080

agcatttttt ttttttgcag ctgttgtaaa aaggctcaag ttcttaattt gattctcagt 64140

tttgttgctg ttggtgtata gcactggtac tgatttgtgt acattgattt tgtatctgga 64200

aactttactg aattaactta tcagatctag gagctttttg gatgagtctt taggttttct 64260

aggtatacaa acatatcatc ggcaaagagc aacagtttga cttcctcttt agcagtttgg 64320

atgctcttta tttctttctc ttgtctgatt gctctggcta ggatttccag tactatgttg 64380

aatagaagtg gtgaaagcag gcattcttgt cttattccag ttctcggggg aaatgctttc 64440

aaattttccc ccgttcaata taatgttggc tgtgggtttg tcataagtgg cttttattac 64500

cttaaggtgt gtatcttata tgccagtttt gctgagggtt ttaatcataa agcaatactg 64560

aattttgtca aatgcttttt ctgcatctat tgagtttatc atatgatttt tgtttttact 64620

cctgcttata tggtgtatca catttattga cttgcatatg ttaaagcaac cctgcatccc 64680

cggtatgaaa cccacctgat catggtggat tatctttttg atatgctgct ggattcattt 64740

agctagtatt ttattgagga tttttacatc tctgttcatc agggatattg gtctgtagtt 64800

ttcttttttt gttatgtcct tttctggttt tgatattagg gtaatactgg cttcatagaa 64860

tgatttaggg aggattccct ctgtctctat cttttggaac agtttcaata gaatttgtac 64920

caatttttct ttgaatttct gatagcattc acctgtgaat ccatctggtc ctagactttt 64980

tttgtttcct gacatttttt ctattattgt ttcactctca ctatgcatta ttggtctgtt 65040

aataatttct atttcttcct gttttaatct aggaggtttg tatatatgca ggaatttgtc 65100

catctcttct tggttttcta gtttgtgtac gtaaatgtgt tcacagtagt cttgaataat 65160

cttttttatt tctgtggtat cagttgtagt atctcccatt tcatttctaa ttgagcttgt 65220

ttagatcttt tttcttgttt tcttggttaa tcttgccaat ggtctattga ttttgtttat 65280

cttttcaaag aagcaggttt ttgtttcatt tatcttttgt attgtatttt gtgtttcaat 65340

tttatttatt tatttattta tttttatttt tattttttga gatggagtct cactcttgtt 65400

acccaggctg gaatgcaaca gtatgatctt ggctcactgc aacatctgcc ttccaggttc 65460

aagtgattct cttgcctcag ctgcccgagt agctgggact acaggtgcct gccaccacac 65520

ctggctaatt tttgtatttt tagtagagac ggggtttcac catgttggcc aggcaggtct 65580

caaactcctg acttatggtg atccgcctgc cttggcctcc caaagtgctg cgattacagg 65640

tgtgagccac cacactaaga ctcaatttta tttatttcta ttctgatctt tgttatttct 65700

tttcttctgc tgggtttggg tttgctttgt cttgtttttc cagttcctag aggtgtaagc 65760

tcagattgtc tatttgtgct ctttcagact ttttgatgta gatatttaat gctatgaact 65820

ttgctcttaa catggctttt gctgtatccc agaggttgtg ataggttttg tcattattat 65880

tgttgaattc aaatattttt aaaattttca tctttcttga tttcattgtt gacccaaaga 65940

tcattcagga gcagattatt cgatttccat gtatttgtat agttttgagg gtttcttttg 66000

gagttaattt ttaattttat tccactgtgg tctgagagaa tacttgatat aattttgatt 66060

ttcttaaatt tattgagact tgttcatatg gtctgtcttg gagaatattc catgtgttga 66120

tgaaaaggat gtagttgttg ggtaggattt tttgtaaata tctgttaagt ccatttgttc 66180

tagggtatag tttaagtcca tgtttctttg ttgactttct gtcttgatga cctgtctagt 66240

gctgtcagtg gagtactgaa gtcccccact attattgtgt tgctgtctat ctcatgtctt 66300

aggtctagta gtgattgctt tataaatttg ggagcccaag tgttagatgc atatacactt 66360

aagattgtaa atttttcctg ttgaactaat tattttatca ttatataatg tctctctttg 66420

tcttttttaa ttgttgttgc tttaaaatct tttttgtctg atataagaat tgctattctt 66480

tctcactttg agtttccatt tgcatggaat atctttttcc acccctttac cttaagttta 66540

tgtgagtcct tacgtgttag gtgagtctct tgaagacagc agatacttgg ttgatggatt 66600

tttatccatt ctgccattct gtatctttta agtggagcat ttaggccatt tacattcaac 66660

attagtattg aggtatgagg tactgttcta ttcatcatga tagttgttgc ctcaatacct 66720

tcttgttgtt gctgttgtta attgtgttat tattttatgg gtcctgttaa atttatgctt 66780

taaggaggtt ctattttgat gtattcaagt tactgtttca agatttagag ctccttttag 66840

catttctcag tgctggcttg gtagtggcaa attcagcatt tgtttgtctg aaaaagactt 66900

tatctctctt tcatttatga agcttagttt cactggatac aaaattcttg gctgataatt 66960

attttgttta agaggctaaa tatagggccc aatctcttct ggctagcagg gtttatgctg 67020

agaaatctgc tattaatctg ctatgttttc ttttatagga tacctgatgc ttttgcctca 67080

cagctcttaa gattctttcc ttcatcttga ctttagacaa cctgatggct gtgtgcccag 67140

gtggtaatct ttttgcattg aatttcccag gtgttctttg tgcttcttat atttggatat 67200

ctagatctct agcaagacta ggaagttttt cttgattatt ccctcaaata agtccttaat 67260

gaccccacta tataacatga aatatctgtt attggtactg aggtgctggc cacaaacaat 67320

tctgtgtgtc ctgaaaactc ttcagaatat tcgtcatctt tagcacttgt tatcttagtg 67380

tttgggcttg gcttagagtg atacatctca taacagggca acagaaagaa ccaggaacca 67440

agatttatat aacataagtc agtaaaacta gaggcaccag aggtttacat ttacattagg 67500

ttacattttc taacaggtag caaagcacat gaatgaagtt cagtggaagg ccttcctcag 67560

gaatccagta aaaaccaaac atacacacac acacacggac atccgtgagg caggaaggga 67620

tgtccactat agtacagaca agcatcctgg aaggccatca aggagtaggt gggtttcagt 67680

tgcctcagga atgtggcatg gacccaaact aagtgagtac agatacttgt cattgaggag 67740

aagattcaaa atagcatcct aggtgtaaaa actgaggcac ctggggcagg ggaactaggt 67800

ctctggaatg ttggcttaaa agcacccctc tcaggaaagg cctcatatgc catgcagggg 67860

gttatatatg tgttgtggga cacagatggc aaggagataa ttctatgcac caggctccac 67920

tactaacagg taaacagacc aacattaaca gagacttagg taaaaaggta ggtgcccagt 67980

ggtcagttct caggcacttc caagatgcac ctaacagaaa tgtaacttgg tgtctattgt 68040

gtcctaggtc taacaactga agagaagtga attagtacct cttgtggaca gagaaacagg 68100

ggcagagacc cattacaaag ctgtctcaga taggcatttg aagctgttta agtatgtaga 68160

ggcttaagtc aggctggttc tgaaatgtga gagagggtta agcttcatgg gaaatcagca 68220

gggtagtttg ctatttttta ttataaccaa tctcacaata gtttgggaca tcaaatatca 68280

aattgttggg aatatttatc catattagtc tttttgccac taatatttaa aaatagttta 68340

caatatacaa caaaaagttg taaaatttcc atctccactt aatcgatctt atgtaaccca 68400

tacaatacat caaatgtcct ttccccactt tatgttttta tttgctttgt caaagatcac 68460

ttggctgtta gcatttgggt ttatttctag gttctctatt ctgttttatt ggtctgtgtg 68520

cctattttta taccagtgcc atgctgtttt ggtgactatg gccttatagt atagtttgaa 68580

agcaggtaat gtgatgcctc cagatttttc tttttgctta atcttgcttt ggctatgtgg 68640

gctctttttt ggttccatat gaattttagg attgtttttt ctagttctgt gaagaatgat 68700

ggtggtattt tgatgggaat tgcatttaat tgtagatttc tcttggcagt attacccagg 68760

cttttcttat tttggcaccc tgtgctgctg tctccttttc cttctttctg cttctcttaa 68820

ccaactgtta cctacacttc aatactttct gagggcaatt catcctccag taagtctccc 68880

tgaatcttct cttccttccc tggcttatta tatatccttc ctcttggttc ccatagcacc 68940

tatgcacact tctgtcattg cacttgccaa tttgttttat aatgatctgc tcatctgtct 69000

cctcacttag actatgagct cactgagagc aatggctgtt gcattcacct tatatcctca 69060

acaccattct gaaggcaaga gaaagaatac ccagaggtgg agctgggaag ctggttgtcc 69120

aagtagtgaa tgactctagt ttgaattgaa ctctatagcc agtgggcaat gtggatgtgt 69180

tgacagtttt ttaacagggg actagtgaaa acacattttg ggtttagaaa aaattgcaag 69240

tctgatgaca tacataggag aagagattag agataggaat ttcacttcag aaatttaacc 69300

acaagagcaa gtgacagatc acggaagtct gaaccagact ataaatgtga gaatagagaa 69360

aaaagttaac aatttgggtg tgaaagggcg agggagagag gtgtgaagaa tgactaagtg 69420

tggatctgtt tttaaggatt gaatggaaat ttgagcattt tagctaatca ggcctaatat 69480

tgagcaaagc aaaactcttg caaattgtta tttcaagtgt gggctgagaa aatgaaaaaa 69540

tataaattct cacgttataa cctcttccgt gtgtctgatt tgatagaatc cagccccatt 69600

gcctccaaat tccattgcat cttagaccag caaacacaag tgaattctac ttaaccccag 69660

aattctgtat gaaaatctta ctgccttttt ttttctaatc atgtgtcaaa gtgtgggaag 69720

aacttttatt tatgttttaa taaattgtca gtataaccat ttttacttga aaatattata 69780

atttttcaag taaacaaatt gtttctctaa gttgaaaatt ttatgatgga ataaaagtat 69840

ttttcctcaa aacacataga aattttacaa caatatttta gagttaacta aatgtttctt 69900

tagtagttta gtcacttaaa aagtgatatg attatgaaaa tacttaaact ttgtctttta 69960

actatttcta ataatgctat tggtataatt tcatattttt atactgatct tttctccaaa 70020

ctttagtaaa acatacttct gtaaacccct gcccacaaaa ctgaagtcca catttacttc 70080

tgaatgactg ataagtttgt aaaagtatgc atgaatttcg ttattaaatt aaagttttta 70140

ttatatttta tgcacaatgg tataaattat taaattaatt ttcaagctta tagaacattg 70200

ataaagattg tcattagaaa accctgagtt gattgttata cattacataa cctttcattg 70260

gtggattagt gaatatgtta tagggtgacc atgaatccaa agaatcaaag ctggctacag 70320

caaacagagg gtcaaaagga tatggaacta tgcatgatcc agcaaaacac tcaatatctg 70380

ttttcctgga atgttaaaag acaaagaaga aaacttgggg aacactagat gcatatagtt 70440

ctggttcttt aagaataaaa atatgggccg ggcccggtgg ctcatgcctg taatcccagc 70500

actttgtggg aggccaaggc gggtggatca caaggttagg agttcaagac cagccaggcc 70560

aacatagtga aaccctgtct ctactaaaaa tacaaaaaaa aattacaaaa aaaatacaaa 70620

aaaaaaaata gccaggtgtg gtgacaggca cctgtattcc cagctacttg ggaggctgag 70680

gcaggagaat cacttgaacc cgggaggcag aggttgcagt gagccaagat agtgccactg 70740

tgctccagcc tgggtgacat agtgagactc tgtctcaaaa aaaaaaaaaa gaataaaaac 70800

aagaatggtc agagtcctag taccttgtcc agtgtagtgc tgccttgaga ttgcattgca 70860

atctgtctga gagatagtaa aagaaagtga taccttcctt agccctgttt ctctttagac 70920

tatgctttcc cctctccaag ttaatatctc tcagtctaaa gcctgggaaa aggtgccaat 70980

tttgtttttc tttcttcctc acacctccta gaagttacac tgggacacta ttactttttt 71040

ccaggctttg gccatgtgta ttgttttgga gagtcaactt ccttttttct ttcattctgc 71100

aaatagtttt gagctgtcac tctgtactag gtgctataaa acttacaggt gcattttaca 71160

tgcctatttc ctataggcca cgatttaaca aaatgttcat aaatgagaat taggagtgca 71220

tgtattgaat caccacacat taactgaaca gctttcattg gccagagact atattgacag 71280

tggagattca aagataaact agagaaatct catgcttaaa taactttcta taataaatta 71340

tataagagaa gtaggttcag ggatcttggg agctcagaag caggatgagt taaacaaaag 71400

ttggattttg cctttagctt ggtttcatta tcctgaagga agagcctgaa atatagtgta 71460

gggtgcaagt agtatatgtg ggtggcaatc tcgggaaaca ggagcatgtg atgaataagg 71520

agaaaaagcc aatataaagg tactgcattg agggcaatga gggctctaat tctctgcacc 71580

ttctcaagca ttgtgcagat tggttttctg gattatcagc ctgaaggaca aaacgaagaa 71640

acagccatta gctcctgtct cccattgtct gagagctgcc actaggatat taacttcctg 71700

aaattctgca gaaatctcct cttactttgg cactggagat gcccatacgc agaaagcaaa 71760

aaggcacagc atatttaagg aagctcataa gaaacagtgc atccagaagt ggcgagaatt 71820

ggaggaatgg acatgagact ctaagaacca gcgcctttga tgttcctttt gatctgttat 71880

gtagctcttc ttgtacacag gtgagcaaag gcatgctgga caaatggatt cacatgtgct 71940

aaagcatggg gcaaaaacca catattaatt caggaaaaga caagatgcgt ggccctctct 72000

gtctctgtct aagggtgaat taaagagggg atatatgtac agagtggcag ggcaggactt 72060

gagataagaa ggctaggtgg gtgctctcat gctagtagca ttatagtaca ggtgatgaga 72120

agctcctgaa gaatcatctt aacatttgta ttttagagca acagtattga gttctgactt 72180

agagacagca aaactaaaga cagaaagact attttgatta ttaatgatgt agatataaga 72240

atatcgtcaa tgtgaactaa agcatgaagc tacttatgat atatcattaa aaggatttaa 72300

ctgattggag acaaacgaga gggatgggga aaagaattca tttgttttta gttgctcttt 72360

ttttcctact tattcctttg ttccgagtgt gaataaactt tgtaaacttt tatactaaaa 72420

cattctgctc attcatactt atttctttga tgaaacaagg aaacccttgt atagttataa 72480

acgtgtgaat caatttaaat attaggaaat ttttttaaat aaagctagtt ttctgaaggg 72540

gaaaaacttg gttcaatttt ttgctggcaa tctgctttgt gatttttgaa catgatatct 72600

acatctagac tcatgttttg ctagctggaa ttttttttca aattaacgct accattatta 72660

tatgctttac tatttagctt ttgcagcctt ggaaatctat gattaataca aataattctc 72720

tatggcaatt ttaaaaatac atgtaaaagc cttcaatcta cattgctact gtgtcgtagc 72780

acaaaaaaag aaaatgtgat caaattttaa taaaatctac aatttattcc cttctaaata 72840

cagtcctagc tcaggagaaa ggaagctatt tgtatttttc agaatcaaat ttccctaaat 72900

gaatatagag aaagaattat aactgaaata ttgttgaaac agtggtcatc tcaaatctga 72960

aggtcattcc aaaaaagttt ctgagttttc attgcctcaa tctaaaagtt ggcctttttg 73020

gtaatagatg aaagtaaaat aattgaaagg gtctgttgca gttttggaat atcttgaaaa 73080

tatagtagag tgaagccttc ttcccttaaa taaaagacaa gttgctgatt gttttctttc 73140

tagccagata agaataatgc cttctttctc ttgttagtct taacacctca cttgttacta 73200

tgtgtcagaa aggcgagaca ccataaatgg agatactact gatggaggtc atctgacatg 73260

gggctggtag gcagtgggaa gactggtatg gacacaggtg gcttaggggt tggggaatga 73320

tatggaacta aggaaatgat aattagcaga acccagtgtg catgtgtgtg cattcgtgtg 73380

tccgtgtatg tgtgtactgt agcacaatgc aagaaagaaa aaacaaggca gacttttcat 73440

aatttcaggg ataaataaat cctttatcac ttcatgtaga atattggcta cttggaggta 73500

tatctaaacg taaatatata actatataac tacatgctaa ttaaaaacat acaaagaaga 73560

agtgcctaaa gaattacaac agaaagtggc atagtgatta ttagagttaa tataatataa 73620

ataaggccag gcatggtggc tcatgcctat aatcccagca cttttggagg tcaagttgca 73680

gggatcactt gaggacaggg gatagagaca agcctagcca acatggtgaa acccatctct 73740

actaaaaata cagaaattag ctgggtgtgg tgatgggcgc tggtaatccc agctactcaa 73800

gaaactgaag caggagaatt gcttgaaccc ggaagctggg gctgcagtga gccaagatcg 73860

cgcactgcac tccagactgg gtgacagaga aagacccggt ctcaaaaaat taaaaaatag 73920

tataaataat atttcaaaac acaagtctgt taagataaaa ggtacagagg aatggtgaga 73980

tgactttttt atttgtgtga taagggactg ttttctgtga ttgtgagaaa gaccaggagt 74040

taagaaaaag tggccatcaa taaatcagcc acttatgggg aagaaccata aaccactctc 74100

agatgaaata caaatgcagt cattatttaa tattattgga atatttgtat tagtttttgg 74160

tatgtgctgc tagtgctggt acattttagt agtcaattaa tattttgtta atcttaattt 74220

ctaactaaat tccagagtga aatggaaata ataatgaaaa aattttattt acaaaacaga 74280

ttttgttttt ttctgttaag aatgatacac agttgtcctt cagtagccat aggggattgg 74340

tttcaggacc tcccttgggt actaaaatct gcagatgcct aagcccctgt tataaaatgg 74400

cttagtattt gtatataacc tatgcacatc ctctcatata ctttcaatca ggggtcccca 74460

accccagggc catgaccagt actggtccat agcctgttag gctgttcgat accaggctgc 74520

acagcaagag ctgagctcct cctcctgtca gctcagtggt ggcattagat tgccatagga 74580

gcacgaaccc tattgtgaac tgcacatgtg agggatctag gttgtgcgct ccttatgaga 74640

atctaatgat aaatgtaatg tgcttgaatc atcccaaaac cattcccctt cccctcacca 74700

tccctgtccg tggaaacatt tcttccagaa aaccagtccc tggtgccaga aaggttgggg 74760

actgctgctt taaataatct ctagattact gataatgccc aatacaatgt aaattctatg 74820

taaatagttt ttatactata ttgtttagag aataatgaaa agaaaaagtc tacatgttca 74880

gtttaagtgt tgataagtgt gtagagaaaa gggaaccctt gtacattgtt ggtggaaata 74940

tagattggtg cagtcattat ggacaatagt acggaggttc ctaaagaaat taaaattaga 75000

attacctaag acccagcaat ccctcctctg gatgtaccca aaggaaataa aatcatcacc 75060

tcataaagat atctgcactg ctatattcat tgcagcatta tttacagtag ccaagatatg 75120

gaaaccacct aggtatgtgt tggtgcatga atggataaaa gaaactgtgg tatatgtata 75180

tacaatggaa tattattcag ccttaaaaaa ggagaagacc ctgtcatttg ccacaacatg 75240

catggacctg gaggatatta agctgtggga aataagtcca acacacatcc acacacaaaa 75300

ttgcataatc tcacttatat gtggaatcta aaaagaaaaa gttcaaatat aaagttagaa 75360

taaaacagtg gttaccggcc ggatgtggta gctcacgcct gtaatcctag ccctttggga 75420

agccgaggtg ggtgaatcac ctgaggtcag gagttcaaga ccagcctgac caacatggtg 75480

aaatcctgtt tctactaaaa gtacaaaaat tagccgggca tagtggcagg tgcctgtaat 75540

cccagctact caggcagttg agaaaggaga atcacttgaa ctcaggaggc ataggttgca 75600

gtgagccgag atggcgccac ttcactccag cctgggcaaa agagcaaaac tctgtctcaa 75660

aataaaaaaa caaaaaacac agtccacaca ctggttacca tgagtgaggt ggcagggagg 75720

agattgggag atgtagatct aaggatacaa agtagcagat atgtaggagg aactaaaaag 75780

ctgacatgca ggatgacaac tatagttagt aatagtgtat tgtattcagg atttttgcta 75840

attgagtaga ttatagctgc tcttgccaca ggggaaaaag tgggtaacta cgtgagatag 75900

acaatggatg tgttaatttt tgtcactata ataacctttt caccatatac attcatctta 75960

taacagcatg ttgtttactg taaatatata caataaaatt tatttttaaa tatctgagta 76020

tgatttgatg atttgtgaaa atagagtgaa ttataataat tttaaatgta agttaatgtt 76080

attagaaaag aaacagaaag aacataccac acagaaagtc tgtctgaagg atctttgttt 76140

tctccaccaa tacaagtgtt cattgattca gaggtggatt atgagatatg accataaaac 76200

aaaaatttca agggaaatat attttattca atgaaaaatt ctcaacacaa ctgttatatg 76260

ccagtaaaca ctatatcttt taaataacag gtcatatcta ttatatttaa aattcaagga 76320

gagactacat tagagatgct attagatcaa cttctaattt caaagatttc taagatatgg 76380

aacagttact ccttatacaa attaaaaaag caaatgctga agaaattcag ctacatggat 76440

acaccatgag gtggaaagat gctccataac tcttagttaa actgcactaa ttacacataa 76500

aaggaaaatg tttcatttca ctgtaatttg gaaaccaaag aaagaaaaga ctgaattttt 76560

acatactgtt aaagagattg cgtatctgtt ctaagtttaa gacagaggca aaatgtattt 76620

tattcatttg tcctgcaccg tttagaaata aaattcaact tccttttaat tttttttaag 76680

aataaaaaac tcagtctaag gaaagtctta aagttttcat tttaagtgat ccactgttct 76740

agaagtttaa tattttgttt aaaatgttta tgttctgtat tccaccaagt ctagttttaa 76800

aacaaaacaa acaacaacaa aatacttctc taacttggag tttaaggtga aagaaaccaa 76860

ttacgtggtt tggaaatgtc acacttttca tctctttttt aaaaaaattt ttaattcagg 76920

acagaaattg tatggattta gtgtaagtct tgggatctca caagtgtcag tatttcactc 76980

tcctccatat cttgatagca ataacttgaa ataggatctc agtagctcaa gcaatactgg 77040

gctctgagag ttggttaaaa attatttggc tgagcgcctg ttgctgaggg aagaactaat 77100

ctcgagcata tttttggagc caaataccaa attgtttgtg cttagcaaca cagcaccagg 77160

cttgcccttc agaatgattc tagaccaaat gccagaaatg ctctggttct gactacagag 77220

ttctattcac aaatgacagg aggcaagagg tcctcctcac tttcagaaga aaggtccttt 77280

gctttcttag tcaatggtag gaaaaccatt gtggttttca ttgcattaca taatttttaa 77340

ggtgattact tcaataagaa gtgctctgtg tatatgtgtg tttatagacg cattttttaa 77400

acactggaga atttctgaaa gtagtacaaa ccttgtaatg tcaagtagat gtgggaaaaa 77460

gggagtttac aacattctct cctgacattg ctctcctttg gcatctgcat ttttaaaatg 77520

ttaaaaatgt ttaaaaacgt gtgcttaaca cttaatttgg tgatagttgc tgttaccaag 77580

gcaactctgt aactccaccc agataaaaat aaatcttgaa gatgagtttc tgtgtctctg 77640

agcaaatatt tttgtgaata gtagaagcag agaaagttaa agatacctga gcttttgatc 77700

tttactagtt ttatagatat gtttatagtt atacattttt attcatacat tttagataaa 77760

taactttgta aagcaattga ttcttcttgt aaaaatcaag tatattctta atagactgat 77820

aaactttctt tttttgagac agagtcttgc tctattgccc aggctggaat acagtgccat 77880

gatcttggct cactgcaacc tacctctgcc tcctgggttc aagcaattct cctgcctcag 77940

cctcttgagt agctgagatt acaggtgcat ggtaccacac cccactaatt tttgtattct 78000

tagtagagat ggggttttgc cattttggcc aggctctgag aaacttttta aggtctcttt 78060

tgcagccagc tatttgtcta ccttatttca ttcttaatct cactagccaa tattttttct 78120

gtttaagtgc tttcagcaaa tattaaatgc ttgtgccttc agtcttatcc tgtggaaaca 78180

ctggtaatga caaaaacaca tatttcaacc taatatacaa tagaaacaga atgccagtta 78240

ttcatggagg agaagaatag acttctgtat ttaaaataac attttgctct gtgttttaaa 78300

atcattcttc cttcatcaat tgtaagcatc ttgactataa tttatacacc taaagataaa 78360

taattcagta gcaatgataa ctgaaaacag gacacataca atgaactagc taaattacca 78420

tacattctca tccatttcaa aaatagctct gtactttttt cagattttgt tagaagaata 78480

ttcaatacaa atttttattc aatgaacact tcagatgtca agattgttac ccacatggac 78540

aacagtaacc taggtaaaga ttctgcagcc aggcgtggtg gctcacacct gtaatcccag 78600

cactttggga ggctgaggcg ggcagatcat gaggtcagga gatcgagact atcctggcta 78660

acatggtgaa accccatctc tactaaaaat acaaaaaatt agccaggtgt ggtgtcatgt 78720

gcttgtagtc ccagctgctc gggaggctaa ggcaggagaa tcgcttgaac ccgggaggtg 78780

gaggttgcgg tgagccgaga ttgcaccact gcactccagc ctgggtgaca gagcgagact 78840

ctgtctcaaa aaaaaaaaaa aaaaatttta tacctgggct ctgtgctcac cagcagaagg 78900

ggtaacatgg cttcttagga caaccttact tgaccattta cttctttgac actaggggta 78960

ttcttagatc agcaggtcct tccctccact tatgcacatg aggctcacag agagtctggg 79020

aggcagggaa tttatgattg gaaacagtat actttttatc taagaaatta ttaatgtcac 79080

tgcattcaag tgattaacac catcaatatc ttcaagacta aggggattac atgatgtgta 79140

aaattagaaa actgtcatct actagtggct aggcacttta attatattaa gcatgcaaca 79200

agagaactct tcaaatgaat ccatctctcc tctgtattat ttccaaccct tggatcccca 79260

tctgtttctg cagacaacag ctatgctgct gaatgtctta atggtttgct gccccaacta 79320

gcttcaagat actgcaggtc aagcatagca tcttactctt ccctgcatct ccagcacctc 79380

tcagaatgtt ggtcacatag aagatgtttg ctgaggagtt gaataagaat atgtacaagg 79440

gacacaatta gcattgttta aaaaagatgt aacaagatag ggtaaaggaa agctttggag 79500

gataaatctt tagaacaatc aataatatct tctcctctgt tggttagttg cccttcaatc 79560

tcagccactg aatcaaatac aacataatta ctattctgat atgttcttga atcgaatatc 79620

caataataag atattcggat gcatagccat gtctaatatc aaagcccatg cttttcgcta 79680

ttattgtact ccatacatta gcttccaaat ttatttgcaa tccaaatatt aaaagcaagt 79740

cataagctta gtatcgccaa tgtgatacta agtatccact tactaaactt tattttcaaa 79800

atgtggtttt atctcagttt aatgaacacg gcatgtttta atttacactt tcatattata 79860

tagtaagggc gtggttacag atatgttaat ttcctgtgct gcttcacaat gatggaacat 79920

aatagcaaat gaaactgtta atttgcagat acccataggc ctttggtgtc tgaatagaaa 79980

taaacacacc tacaactgag agaggaagca tgtgaagcat tccagtgaac agaggccatt 80040

tattcagtca cagacacagg agaaaaacaa caattaaaaa aaaatctctg atgaaaagtt 80100

cataaaaagt tcactcagtt taagcatatg tcctataact acttaaaata gagttcttct 80160

taaatatcat tctttgctgt ttttagattt cttctgcctg tatcaaatta atagaacaca 80220

gcatactttt aatttgctct ggtttcttag tggggcattt attaaacaca ttaaaacaat 80280

agtctcaggg ttttactgct gatgttaaag ttctgctttc ctacttacca actgtgtcat 80340

cttaaggcac atactttgcc tctctctcaa atctcccaaa tggagaatga taagaatacg 80400

tacctcaatt aaagaagcta taacaagtag aatgtttgga aaagtgccgg gtacaccata 80460

agcccactat gagtattgga ttgtattacc tctgaaagct gcagaatgga attctcaaag 80520

ttatatgtcc ctaaaatcct cttaagtgac agaaatggag aaattagcag tctgtctaag 80580

agagcttttc tagagtctgg gcatatgttt ttaggacaag acagttcagc ttcagcttaa 80640

aatgagagag cacgtctgtg tccttactcc tgggtgccag gtttcttgtc cccatcttaa 80700

gacaaataat tttggtggag aagaggcagt ctctttgatt tcgctctaaa aaccttttct 80760

ggaggaggta gacactctcc acccccgttt tgagactcat gcagctgagg atgactggct 80820

gagtacaagc aattgttcct tctaagcagt ttcaattctt ataacttgtg gagatattct 80880

taagtccagg ggattttgtg tatggtggat ttttattaca aagtcctgta cttcatagga 80940

acaaaataat tcaaagtcag gaaccagatc aaagccacaa ctcagatatg gcaccttgag 81000

aagttcattt gtatttcact tgcataaaaa ccctcaccac tgctatctga ttttcacaaa 81060

tcattcaaca gctatccatg aagcacccac tgtgtgtctg gtctctgtgt cagtccctgg 81120

cttcatgtgt ctttccttct gtaccctgac tccccaactc atgaacacat gaagtaaaaa 81180

aatgaaaatc tttttctgac ctctcttcaa aatcactttt ttcaaaacaa acacctctca 81240

cctgctcatc ctccagccag taaatcacag gggcctagaa atgtcactta caaatatttt 81300

ctgattctgt ccctcccttc aagcttgcca acattatcac agtttagggc ctgctcatct 81360

ttcccccaat ctccaattag atctctccac aatgcaattc tgcacattcc ctgttacaac 81420

ccttcaatta tttcccagcc catccaaaat aaaatctaag cctcttacta acacattcag 81480

gaactctgtg gcctacggtt ttctacagac taattttcca gcagttgact tccagtgcaa 81540

gtgaaaacct agtgtcatgc ctgcatgata gataaatttg aagctgaaga gcccaaatgt 81600

atagaccatg ccatgaaagg tttatagtca tgacacagtg gccctatagt acagtgcttg 81660

aagctggctc tctactgtca gacagaccac ttgccagcca tgagacctgg ggcaaaatgc 81720

cttaattttt atgtgcctca agttctcatg tgagatgaga ataaaaatta cccctatttc 81780

ataagatttg ataaagtgtt tagcataata cctcataaca attgcaattc agtggtggtt 81840

attattataa agaaaagatg attaacttta tcttaatgtt taacttgttc tgatagttat 81900

tgatctatag ctttgatatg gaggtttgag aatgacctgg aaagaattgg ccacaatgat 81960

tgaagatagt gatacaagaa taaaagatga ctgcaaaatg taaacctgca ataacagaaa 82020

gaatgaagtc actggtctca tgggaactga tatgggagaa aaaaacagat caaaaggcta 82080

ttcatgtttt gggcctcttt gtcaaaatgg aaatgagaaa ctggggaata aaaattaaag 82140

caattctagc atctggtttt aacataattc ttatccctaa aaagaatcta taagaaactc 82200

ccaaaatgac aggcagccgt gggtagcatt gcatttcaag taatctttta attgttaaaa 82260

tttaagtttc caacatgaac ataaaatttt caacctaaaa gaaatgagtt ccaaatctga 82320

gacaagtgaa aaaggataaa gcctactagg gggtaaattc catctcttta gagatctagt 82380

acccaattta gcaatgtcca atcaagcctt taactactac atttgaacac ctcatcattt 82440

caaaatgtta cttaatgatg ccaattaact gtacaatgtc tctgcatagc acatagccct 82500

aaaatgattt gtgcaatgtt actgtcagta aaactgaact acagggaatg ctcatattct 82560

atgtcattat atacagaaat gcaatatcaa taaagtgata tctgttggta ttagaaaaaa 82620

gtgaaaattt tcatatcttt ctattttctt ttttcctcaa tgggatgctc ttgttaaaga 82680

tagctctgca tagtaaggtt tgtataaaca ttatttagct aaagttaaaa ggggtaacat 82740

actggttcta gcacagatat taaaacaaat tagtttgtag gtagggcagc aatcaattat 82800

attactaacc atagctttgg tccttttatc ctttcccatt tgattttaca cagtgggatg 82860

ttaaaggttg aatgtctttg gtatctataa acttaattga aagctgttat ttgtttgttt 82920

aagtctgttg atttttataa tcataatttt actcctatag atttcttgta ggagtactat 82980

atgaatttat gttgcactga attttgttat gttatacaaa ttaataggct tttatttatg 83040

gaaagctact attgatctgt catttcttaa aaaattacta aaaagtgtta aaactttaaa 83100

tgttggagag tttatatttt aaaagttaca tgctagaaaa acatgatgtc tgagtatatt 83160

agaagttata gataattcat ctgtcaacta taaaactctc caacactgcc tttctttaat 83220

gaataatatg aaatttagca gtgaaaatgt gacaatgtac aatcctaaat aaatcaacaa 83280

atttagagat gtacctctaa aaccattgta aattcaacag tgtaattttc cattggactt 83340

tcacttattc attcattaaa caaatgtttg tgagtgcctg caatgtatga gacattgtac 83400

tgaagctagg cagtgtgagt tatcatatgg gattatcctt taaatacttc tgagggcaaa 83460

aaaaaaaaaa aaaagaagag aaaaggtgtg aggaaagata aagggttaat tcattaaaaa 83520

ataacacttg aggactgttt tctttgcaag gcataaagtt atcacccttt caaacagtag 83580

atatttcaca tttaggatgc gagactccag ttccaacaaa gctcattgca cagctgctac 83640

cctgattaaa ctgctacatg aactctgagc aatgtagcat ggtagccgca tgcttctgct 83700

tgcatgatgg ttaattcctt ccattctcat tagtgatttt ctgagctttg aaattctgat 83760

ggtacctagg atataaagca tatttatcta actgaaaaac agataattag atgtaacata 83820

aaatatgaat ggctttgtca ctttattgta gcagagaatg aatgtgggat aaattaaagc 83880

tgatgctaga acatatgcct attttttagc tggaaaattt caagatttat gtactttggg 83940

cttgagaaag aaatggagtt tattttttat gcactgacat ctcttttttt ttttttttgg 84000

aagagctctc ttaggaatga atggtatgta aatacagtag gaatgtaatt atagattttc 84060

ctgacccagt tcctaaataa tagatatcat ttcagaagtg ccccaatacc tgaccttttg 84120

ctccaagcca tatcaaagca cacatctagt ctacttttca ctctcattcc tagccactat 84180

gacaatacta ttcagataaa acttctagtc ctctacttat gtgactcata ccaacttgac 84240

cttacgatag tgactggggg tgcatatcta ggttcatgct gtttgtccat tattatggtt 84300

ttgtgagaaa aggcaaaatt tctaggtaaa gtgttatgag gacgaataat ccaccaggca 84360

accaactgac cctttcattt gccatcttgt cacttcaaac agctctccag aacctgcagc 84420

cagcacagac caaagtcagg tttgtctcct cttctgttga tgaacaaagg ttgattccat 84480

atcgtggcta ttgtgaatag tggcagtaaa catggcagta ttgtatgaaa atatcacaga 84540

tagcccttaa atatgtgcaa ctatgatgat ctatcaaaat taaaaattaa aatttatttt 84600

taaaagttca gttagaaagc ttgtagttcc tggcaaacta ctacctttct cggcaaaaga 84660

atttgatatc tcttaaatat tttctgccta atgctgatag attgtattta catattccat 84720

taatgcaata aataaaatta caccaaaaca tcagcattat ttatttccag gggcatctct 84780

caaaataaat tcctccaaaa ttcacaaaac caaaaccaat gtgaaattgt actcagggat 84840

gcaaatgtag cccagtgaag catttgccca cttgtttggt attattgaag cacaattaga 84900

aaaatgtgca atgtatgccc aaaaattcta taataagggc caggcgcggt ggctcacacc 84960

tgtaatctca gcattttggg aggccaaggt gggcaaatca tgaggtcagg agatcgagac 85020

catcctagct aacaccatga aacccagtct ttactaaaaa tacaaaaaat tggcccagac 85080

gtggtggcgg gatcctgtag tcccagctac tcgggaggct gaggcaggag aatggcatga 85140

acccaggagg cagagtttgc actgagccta ctctccagcc tgaacgacag agcgagaccc 85200

catctcaaaa aaaaaaacca taataagaac tttttaatat actatattat aatgtaaaaa 85260

gactagatgt caaacaaatt aggtgatggg aaggaattga gggagaattt tagactaagc 85320

aattgagcag cacctgtttt tcaccacaaa tctgttacat gtattgctca attgtgctga 85380

atccatattg ggtcctggtg gctatgtaat agtctctttc ttggataaat gtttgtcctc 85440

tcttatggtt tactaatggt gtacagaaca gcattgaata gtggttattt cctatgactt 85500

cctagatatc tctctcataa tcctgaatgt tttaaagatc attcttagat agagtacagc 85560

tagacacgaa ccatagtgga aatcaggtag acaaaattta aaaggagtct taattgaagg 85620

tcattttatt gtcctcagta ttaatcttac ttaaaacaaa cctgtcactg agcagaactc 85680

aaaacaccag agccctttgc caaatgtgat tttttacaac aggagcgctg gcagttgaga 85740

ggagtattct gtcacacttg agagaattcg agtccctgaa gatttatatg aatgcttagc 85800

tattatcgaa ccatctcttc acagatgact tagtaaatgt ctgcctttgc atcagataat 85860

ggcttacaag ttaatctcct cttgctccct gttacacaca tatacacctt cttcctaaac 85920

agctcataag gtgaaagaaa gactcagatt tctgactatg taattgataa tatcacacgg 85980

actgcctgct catcatctgc tagtcacatt ggcagagttg acagttttgg agacactgaa 86040

gacagtgcat atattaggaa ataagcagtt tcctgatata aattttcttg tagtttataa 86100

attacatagc atttattatt ccctcatatt ttataacatt taataataga actgacacat 86160

atattcattt taaactcaat tgtgtataat aactatcata gcaacccttc agtgcctaaa 86220

tatcaaatct tccattcctc ccatgaacat cttgaatata taggtactgt ggttagctcc 86280

aacaagcttt tggttagaat tcattgcact gatacataga cattgtttta aaggcaattt 86340

caaatcaaag ctgtcagctg tgaatcaagc acaccttaaa aagtgacaca tttgtcacta 86400

gattccagcc tctcaaatta ctgacacgca tcctttttat gtaaagatga cattgttctt 86460

tcctgatata ttgcattcct catgaatttc ttatagtcat agaattttta taaaccattt 86520

cagaatcgct gaaataaaca tcaatatttt taactttttc attctgtcaa aaatattgta 86580

tgcagagata ttgctgtaag tgtgtatacc tgtgcttaag agactagggc tgaagagaag 86640

taatcaaccg aaccactggt gtaaatgtgc gtcacatttt tagtgactag aaattgaaat 86700

aattccaaca aatttatgtg ctttgggctt gagaattcag actgccttag gctaagataa 86760

aaatcttttc ctggtactat ataccttctt ttattgaatg actacctggc tctttctatt 86820

atatatgcag attttgtacc tctggtcatc tttgtaaatg gtgcctaaaa gatatttgaa 86880

gaataagtga ccagcaataa gaacaaatgt ctatacaaaa gcacccttta gttggatgta 86940

attcactact ttgagttgtt aataacctct aaggatgaca gtagctatta gttgaataaa 87000

ccattatgtc tattattaga acactagata gtttataagt ccaaacaatg cataaaatac 87060

ctatctcatg ttaccattgt ttaggttacc agataattgt tctgtccaat tattccactt 87120

aattttttgc ttgcccatta gctaaatggc aagataaaat ttgtcaaacg ggggggaatg 87180

tattgaaaat gctagacaac tacacttaaa atgaaaacag gccaggcgcg gtggctcagg 87240

cctgtaatcc cagcactttg ggaggccaag gcgggtggat cacctgaggt cgggagttca 87300

agaccagctt gaccaacatg gagaaactcc atctctacta aaaatacaaa attagccggg 87360

catggtggca catacctgta atcccaacta ctggggaggc tgaggcagaa gaatcgtttg 87420

aacccaggag gcggtggttg cagtgagccg agattgtgcc actgtattct agcctaggca 87480

acatgagcga aactccatct caaaaaaaaa aaaaaaaaga aagaaaagaa aacaaatgca 87540

taatttgcaa atattatttt tatattgtat gttatctagg gcttctaaat gcattcttct 87600

tataagccta ggtttgcaat aacattcatt tagaattgag taattttaaa tataatattt 87660

tataaaataa aatataataa tttctcttaa ttctttgaaa atattaaatt aaaagggggt 87720

tgcaaactct gcattccaca tttccatccc aacatttaat tttagcaatt ttgtagtctg 87780

cctaaaatgc aatccatcat ttactgttta gaaaataggg aatgtacaca aaggcctttc 87840

agctttccct gaactccata aaaatctttt tgcttcttta ctgcccccct ttgtcaggag 87900

ttctgaggaa ctgtttttta tcttaagtct cacaaagcat ttaggagaat atttaaactt 87960

aaattctttt aaaacttatg ttcaggacaa agtaacattg tatgcattgg tgtcatatgt 88020

atttaaattt tgaaattttt aatactggca aaatgaggtt tcaattttaa tataaattat 88080

ttaacaatct taaatcatta aatatattac ttaatatatt taatatatct aaacagtcac 88140

aattttccca tactaataat cataaaaaat cttacccaat ggtcatatag atatacttaa 88200

tggagttttg ggggggtatt tttgtatatt aaaaaattca tatatttgcc ttacttagaa 88260

gaactgatta aatgaaagta taatattaac aaacatattg ttattttata tttgcatttg 88320

tgataattat atttgaaacg ttcaagattt tccaatgaat ttcttttgca tttgcgtatt 88380

tgtgcctttt tattataaaa ataggtggct ttttagttcc actgcataag tttcaacata 88440

ggtctacaaa tagtgcatct ttttgaagtt aatcattata atcacaaatt gaagttgcct 88500

gagctccaat tggagtctaa atggatgact gaatcttatt attcgaaacc cactgttgct 88560

acacaatatg gccacacaag agagtacaca agacccgtct gattcagcct cagtgccata 88620

aatattttaa tggtttcgtt ggaatctgga aatggagctc accacaggag atgcttcttc 88680

ctttgactct cattattatt tcctttacaa attaattaat aaaaacttag atgctaaatt 88740

agcacttgat gaaaacttat atagccttga cattttgatt ctgtgagtga ataaaaatac 88800

ttggagaaat aaaaatccta atcatgttca ggaataccca caaggtaaca agtacatttt 88860

taaactttaa aaacatttat tattcatgat aaaacatgtt gtgtgattta aatataaatt 88920

tttattattt gctttaactt atttccggat taaaaagtaa atgtttacct agctgttcta 88980

aatggtaatc ctcatgatta aaacagcaat ttgtcatatt tcagttacaa atgatctttt 89040

attattagtt atagaacata agtttcttca ttgactgagg cgatgtttca agtagataaa 89100

tctgttaaaa aaattgtggt catattctgt taaattctca taccaggcaa tttgtttgat 89160

attcaggaaa aacctagcca ctgaccaaaa actctacctg ccttctcagt tgtatcctct 89220

tggacttaaa ggggactggg aaagttataa gatggttcat gatagtccat caacatccca 89280

agaacaaaaa cagatgttgt actgacagca tcatatgatc atatgcatgt aagagcacat 89340

tcatattgcc aaatcagttg gaatttttca cggttgaaag ttaaatgaaa tgcttagatg 89400

tatgagtcat cggagttaaa gacaattaca gccagattta tggctgtgct aaaataaagc 89460

tagttagaaa acagaccaaa ttccatgacg ataccaagtc tgactaatga ttcaccttaa 89520

atttcggagc aacatttatc ctcacttgtt tgtttatttg acaatgtgcc cttatccatt 89580

aagtaactag gaggaaggga aaagcactac gtgggtgagt gacaagacac tgacactgat 89640

ttgtgacttt ggataattcc tggatgctgt tatctgtttt ggcatagaga tggatctgta 89700

actgctaata attgccgact gtgaccatcc cagaggccat ttacttaacc caggtatttc 89760

agacctgaca gcccgaggat aaacacgatt tccctccatc actaacttca tctgcagggc 89820

ctaagcctcc ttcacagtct ctccagtgat ttattggcat ctccaagggt atctcacatg 89880

tgctgaagaa caaatctgct cactttcatc tgcttggttt tcccttttga aatctgctgc 89940

tttaaaatta ctaagggagg aatcatgcct gctgctaccc ttgccagtga ccttgcagtt 90000

tgtgccctga ttgttccaat taccacaatc aaaacagaag cgtttgcagt tactgcagtg 90060

ctctctctgt ggatgtcagg tctgactcag agagccaggc tggggaacag ccatttccac 90120

tcttgtacct ctgcaaaagg acttccatgt tccgtaaaca gactcccacc tctcattttc 90180

cccccaagca aagcatcata aattagagag catgtaacgg gaaagaaaat ccattagcca 90240

tttgggttca gtcagacaag ccagctcatg gaaagtttat acaggaaggt cacatttcaa 90300

ttgagatcag gagggtgaaa gggtccagct gtgtgatgag agagagaatg ttcgggaatg 90360

tggaacagag gtatccaagg cagaacaaac tcgtatatga aggctttaag ggtgtgcaaa 90420

tctagcatat tttatgacat aaaagagtcc tgattagcta gaatatgatg aatgtgagaa 90480

gaggtgaagg ctggagatag gaaaaattat tccagatctt ataagctata gtaagaaatt 90540

tgcatattat atatagactt gtgggaagcc attggatttt gtaagaagga gattaacatt 90600

atcttattta tgttatttgt gatttataac cccaaatgtg ccagatacaa acaaaccaaa 90660

aataataata ataataataa gaagaagaac aacaacagca atggaactgt ggtgatggtt 90720

ttggtcacaa aatgcatata tatctatttt tcacaatgca aaaatatttc attatttcaa 90780

attttaacat aaatgtgggt atgcatgagc ttacaaatct tgaagtttat tggggaatat 90840

tggtgagcat ggtttttatt gcatggtcac aacttactaa tgggaaacat ctgaatacct 90900

attgagttaa tgcatgcaca tttttatttt cctggaatac tgagaaaaag gttgctacat 90960

aatgtcttga tagcttctaa gtcatggctc aaaagtgaat gtggaatctg ctaatcggaa 91020

tggactcaga ttcagccaag ttctcaaaaa catttgcttt catagatgtc ttcaagaaac 91080

aaggagtctt gaatttaaat tgtgaagtgt ctatcttaga atagagagat ttaaaatctg 91140

actgtatttt gtttaaaaaa gcctatataa ctgtattata taaaattatt tatactacag 91200

ttaaaaaaag aatcccatcc tatttgtgcc taaataagtg cctgcttgta gcatgaaaac 91260

tatttgttga gggtccttag atcctcagag catgctgtga aagtaggtac aattgttctt 91320

tctatataag cctcttaaga taacagataa ttgccagaaa tacagcacac agtacaaaat 91380

taccttgttt tacttttgcc acaaaaaaca atttcttttg gctttgagca ataaagtcca 91440

atgatttttt tcctttcaaa atatcttcct ccctctccat aagttttata tttattcacg 91500

aaggaatatt ccaatatcgg atgtttttgt ctgtgtctct tcctggaaca aatgttaatt 91560

aatctctttg ggtttgtatg tcaagtggag gggtggggat tggggacagg tgatagttgt 91620

ctagggagtt aacttcatct ctataggaga gtggatagac gctgtatacg aaaagctctt 91680

gaaaagggaa atacagcagc cacttcctca gggcttccat ggtggtcaga ctccttgatt 91740

gctttagatt aactctggct tttgtccttc ggaggccacc agattgggtg gatagacatt 91800

gtccttgctg ttcttttgac ctacctactt gtactttagg ggaaaaaaat gcctgtaata 91860

ggttaaatgc tttctcaaag atcaccaaag tatataacac atggcaaata gacagagaaa 91920

tgagacagta taatcagtat aatttataaa agtaccttac agcaggatcc catgggatat 91980

gggttttttt taaaaaaaat ctacctaatc ttttcattga actcctattc aggattcatt 92040

atattgaata tggctcagag acctggaaaa ttgtttccac ctttttaatt tattcaccat 92100

catttatgga agttttcaag gacgtttact tacctacctc agttaacaga ttgtactact 92160

tgggaagtct ataaatatga gcttaaagca ttttctgagt tttaaaataa tttagattgt 92220

gtagaatgtt aaaactaaaa gaggaaaaaa ttattcagtt cctcagttga acctagcaat 92280

ttatcttttc acagtgtgct caagtatagt ttttgaaaag taaagaagat ggtttttata 92340

caaacataaa cacatttcaa agattttatt caactaatta attagtagtg gagccaataa 92400

gctggtaaga ctggtttaaa ggaatatctg aggaataaag atttatagaa acagtcaaag 92460

aaattctaaa gagaattgac taatagatat aaatctagta aatatttgat taataatagc 92520

agtaacctat ggaattatgt tttctactga gcataaatga gcatgaatct ctttgggttt 92580

gtatgtcaag tggaagggtg gggattgggg acaagtgata gttgtcaagg gagttaactt 92640

catctctata ggagagtgga tagatgctgt ataagaaaag ctcttgaaaa gggaaataaa 92700

gcagccactg cacatctgca catataacct gtagatctgg gggctctaat aaaaaagtta 92760

atggcaatgt caaaatctgg tgttttatct tagataactt catagtcatt gattgagccc 92820

cttaaaaata acatttaaag gacatgtagt cattctgttt ctttattgcc aagttttcag 92880

caatttttct catgagaatg agtgctaaga aacttttggt ggagcgtggt ggctcaagcc 92940

tgcagtcttg cactttggga cgccaaggct ggccaattac ttgagatcag tagtttgaga 93000

ccaccctggc caacatggtg aaaccttgtc tctactaaaa atacaaaaaa aaaaaaaagt 93060

gggatgtggt ggcatgcgcc tgtaatcctg gctactctgg aggctgaggc acgagagtca 93120

cttgaacccg ggaggcagag gttgcagtga gccgagatcc tgccactgca ctccagcctg 93180

ggctacagag ggagactcca tctcaaacaa acaaacaaac aaaaaagaaa cttttaaaat 93240

ataacaatag agacattaca taggcccaca aaaccacctc caaaaaagca ttctatcacc 93300

tgcaagaaag catatatata tatctgcttt tgtgtatata tatatatata tatatatctg 93360

cttttgtgta tatatatata cacacacaca cacacatatg tgtgatatca gcatgtgtat 93420

ttacacatat attttgtgca tgtatatttt taactaaaaa tgtgctagga gttagatatg 93480

aactgatttt ggaggaggtg atatgctgta gagagagaga atgggagaat agcagtatta 93540

taatctctct ccattgtatt cagttttttt ctttgtctga atttttaata gaagtcagcc 93600

agaagatgtt agtttctggg aaatgtgttg agatttacag tcaaatccag agagaactag 93660

aggcttatga gtaaataagt aaaggttatg cagagaaagt attctttttc ctgtgtaaac 93720

ttgaatattg gccaggcgcg gtggacacct gtaatccagc actttgggag gccaaggcgg 93780

gtggatcgac tgaggtcagg agttcatgac cagcctgtcc aacatggtga aacccattct 93840

ctaccaaaaa tacaaaaatt agtgggtgtg gtggcaggat cctgtaatcc cagctactac 93900

ggaggctgag gcaggagaat tgctttaacc taggaggcgg aggttgcagt gagctgagac 93960

agcgccattg cactatagct acggcgataa gagtgagact tcatctaaaa aaaaaaaaga 94020

aaagaaaacc ttgaatattt cttgtacttg tgttcaaatc atacagttat gaaagtttac 94080

ccctagctgt tacacttaaa atgtacttct gaaatataca gagagatgat acagactatt 94140

aatgagttcc actaaacttt taatggttta gaaaatacaa atattttctt atttttctgg 94200

aattccagcc attaatgtaa aacattggtt tcaacataaa taacacactg gcatgcacat 94260

atgcctaagc atgggccccc acacatacag acattctgaa agaccacttt ttaaaaatat 94320

tcagtaccgt atattgtgca ttccttcttt atccacatac ttaagctgct gcaagcatcc 94380

cattgataac accagtaata aaagatggga ccatcagtaa tgagatttga aagccccttt 94440

tgcaagaaag taaggactag aaggtggaaa tcactctgtc ttagagtcat atggattggg 94500

gctttgctag aagtgtgtgc tctcagggaa agctgccttt ttattttctc cagagaaaag 94560

cctttttgtc agtaaaagaa gatgtatcat ccaatgcata tgtaaaattc taaacagcag 94620

ataaaacaac attcactatt aatctctgca aaagaagata tattgaaaaa atcctcaagt 94680

gtccctcttt gggtttcttt gttatatatt aaagcagtta tctttagatg catgagaatc 94740

acctgaagac cttattttta aaattcagat tcctgtcagt tcactcccaa agattccgat 94800

tcagtagtta agagacaaag cctaggaatg tgaatttaca atcaacacct caggtgatag 94860

ccatgcatgt tcttaatgct ctactactat ctatgcataa aaggaagata aagttttaaa 94920

aacttgaaat gtggtataac agtttagtat tgaataatat acatttttac ttattgtaac 94980

aaattatgat atctacttgg ggcaacagta tcttttattt tggatctgaa tcctaatttt 95040

ggctaggtat cactgaggga ttcttagtct aaaacaatta aatggagtta gtggtttttt 95100

ttagtaactc ttgattttct gtttttttcc attggcatct tacaaaattt attcattcat 95160

ttttcccttt ttcacttggc attatttgtt agacagtgga caaaagaact atagaaagta 95220

gagaagcatg tgatgttgtc ctgctcttag attctcgcaa ctcaggagag gacattcgct 95280

tacaccaatc atctcaaaac atggcagttt atgctgaact cagtccaatg ggagagcatt 95340

tgactgagca catagggaga gaagttagct ctgttgaagg ataatcaacg aagaattctt 95400

aggaaaggta cagtcattca ttgaatattt gctcggcact tactaggtgc atatgtgcac 95460

taagatctaa ggatgggctg atgaagaacc caggtccctt ttcttctagt ggacatgcag 95520

actggcctaa aaaaaaaaag gtaactggaa aatggataag gaaactgagt cactcggttt 95580

atttattatc actcggttta tttgcttttg tttgtatttt cattttgaca cagcacagtg 95640

tcatcttaac gcatcctcca aagtgaagga tggggtggat aacactttag ttggcatttc 95700

tgtagccagg agccaggatc tttctcccat aattgcatta acctgggaag gcaccctcta 95760

ggtagatttg tatagcaccc tggttaatca attatcagtt tacttcttgt ctcactaagc 95820

tttaacacct tacatttatg aagcagtgta aatataactt tagcatcttg atcacagcaa 95880

gcacctgatt tgtatttttt tattagctca agtgaaatca gatcagagaa gtacattaca 95940

ggtcataaaa tatgtgcaaa tttcataatg acctcctttt aaaatgtgca aaaataagat 96000

tgttaaggca cattccagag ccttgggggg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 96060

cgtgtgtgtg tgtgcttgtc ttttgagaat atctgtatat cagaaaattt ggctgagaag 96120

caatcttctt cttagtggtt ctttttctct tttgaaaata aagtactaaa aatacttaaa 96180

gatgcagaac agcaacctgt tcccagtgag actctcgttt aattaatgtg gtgatctata 96240

tagagaaaag ggacaattgc aaaagtccct caataattat ctaaccacag tctttaggta 96300

attacagcag aaagattttc aagacacaaa acaccctgga aaatttgacc tcttattttg 96360

attcaggcct ttcatttctt aaatattttc tttaatgttg atgtttatgc ttgacaaggt 96420

cagcctaatg ccagatgaat ccctggaact caaaacattg ctgaattcac agttgaagga 96480

ttttaatata atataccagc ttttaaaaat cctacagtga gaataacagg actgaataaa 96540

aaaattaaga aatgctcagg tagaaataaa tagagaaatt tagaaaaaaa ataaaacgta 96600

ttcaaaataa gtattaagca ttggcaaaga aaaaatagta gcagacaatt acatgttcca 96660

tttgtaaaga tgattattaa ttagtggtct tgcaaaacat tggagaaaat ttgctgaacc 96720

atcacattca taaatattaa aaccacccat tagtgaaaat ctttttacta aacttcacaa 96780

ctgatagtca aataatgttc agtttttctc cattgcaata aaaaataaag gcttttgcct 96840

tcagatcagt ctctgggcct tattaattca gtcagccaga agccacatgg aaatattttg 96900

ttttgttaaa agccagcttg ccctcatgat cttttaaaat cttttaaaaa tcttccatca 96960

gccctctccc tgacttgaat tatggcagtg ctttctaaac tggtaaactc aatctccttg 97020

gtgtgcctca agatagagta cataaaccct ccttagaaat tgagctctca attctaaatt 97080

gcactctcca tgagagcaag caagaatgct ttgctttgta ttaagtggtc acaatattaa 97140

atataaccat agacagcact gtattttcta aacaccttat tttcttttaa tgactgacat 97200

aaattagatc ataagtatac aaatgcatat ctgttgtatt tttcagcacc atgtgttttt 97260

ttttcttttt tctgagttat tttcctgctt tcggcagcct tttctctcag gtgccttgtg 97320

atccacagtg gtgtgtgttc acactaacca aagcaatagt cttacctgcc agaaatagct 97380

gtgacattta aagagaggtc caggggaagg cacagtgctt aacatccaag tctgaagagc 97440

taatagtgaa attggggcat cagctacaga gagatttagg ggaagtaaca ggcaggttaa 97500

atattttatg gaaatgattt ctgttctgta tatgattgca attaacacat gtcaatctgt 97560

ttcattaatt tgttaactca tctattatgc tatgccatga agaaaataaa attggagttc 97620

tttatttttt tgagatggag tctcactctc ttgcccaggc tggagtgcag tggcaggatc 97680

tcagctcact gcaatctcca ccacccaggt tcaagcgatt cttctgcctc agccacctga 97740

gtaactggga ctacaggtgc gtgcaaccat gcctggctaa tttttgtatt tttagtagag 97800

atggggtttc accatgtggg ccaggctggt cccaaactcc tgacctcaag tgatccgcct 97860

gtcttggcct cccaaggtgc tgggattaca ggcgtgagcc accgcgcccc gccacaaaac 97920

tgaagttcta agcttcagtt tagatgctca ctaaatgctt gttttgcaat acctgactgt 97980

aactggcagg aatatgtttt gaaagtcctc attttccagg tatgcagatg aaatataggg 98040

gcattatcta ctatgtcaaa ttataatgat ttatcagtgg cacatgaaag tcgcctcaca 98100

tttcttaatc agtgatatac cattatgtca tgccaccttt taatgtaata tgtttacatc 98160

tttctttaga tgtaagcatt catttagttc atcacggtgg ctttcacact tactccaaga 98220

acgctatgag ttcctttgat gtgctcaagt ctcctgcccc agggagaaag ggagtggtga 98280

gcaggaatcg ctttaatcta tttacacaga tattttcttt tccatttatt ttaaaggaat 98340

tttttttaac ttaatgagta tgcagtgacg gtggtgatga tgatgatact aaggtttaaa 98400

tgattagata gtcaaatctg ggctggaatt gtaatactgt tttgactttt aatcttagag 98460

aagctccagt ctgcttattt tctgggcata aacacatgag aacaataaca cagttctgtt 98520

atctgaatgt tgttatattt tgtttgaaac attcagtgac tttcaaatat tgtatttgcc 98580

taagaaaatt caacagagtc agacattctc ttccaggtta aatttggtga gtctgctagg 98640

aaaataaatt ttgtgcactg gtcattctga tctagtggac gttctaataa aagcaccttt 98700

gtgctgccta cgtcttcact ttaaagataa gatacctggg tactcgacac caaattatag 98760

tttgagatct caaaaatggg atagggaaac cacagctcaa aaacaaaaat actagcactg 98820

gaaaagatag aactagtgaa gatgaatcat tctctagact ttaaattcag agatatcaaa 98880

attaagaaaa agtaggagga ataaaaaaag agggtaagca aaacaatata agtttgtata 98940

gcaagagggt ataaagcaaa tacaatattt ttcagaaaaa ttaaataaaa atagatttac 99000

ataacattgt ttttaatctc aaagatcaaa tttcaatttt catctcattt taaaacccat 99060

atgcacagtc tcctttatat acatcagttg ggtgtcaaag tgactttttt cttgtttcca 99120

aatacagtta tttttaaaat ttaattgtat gatttaggaa tttgaaagca agccagtttg 99180

cacacacata tgttattata tgtgtgcttt agacttggtt tttagttaat gtaacatgac 99240

agggccacct gagttatttg tttacaaact agctggaaag ccaccctgga ggagaaacct 99300

ggcaacaaaa tggtctgcag ctttgttatt gttatctata ggattggatg ccattattgc 99360

tgtaaaatag ttcacaagaa ctcagtctat gggaaagact caaaaattct ttgcctgtta 99420

aagaaaaatc aggatattgg actggttagt ttaactaaaa agtgatgata ctcagattct 99480

gcttggattc actgcttctc agcagttgtt ttgtttcttt ctaattgata ttttattttt 99540

cagagaaccc attataaaac tcttcttctt cccttaaaat cacaaccaca caacagcaat 99600

taaaacatgc tttgacgtaa gactgatatg gttttaaacc cagcttgact atcgaatttt 99660

ttactttagg caaaacacct ctgacattta tgtcttatcg tcagtaaaaa ggggtgatta 99720

acagttttac aagattattc aataaataaa tataaattcc tccttttcct tcctttcctt 99780

tcttcatctt cagcatctgc atgccataag ctcattttag ttctctggac tcatgttaac 99840

atgtcccacc tttcccaaat taaacatcat ctctgttatt ggctccattc ttttcctctc 99900

atttgagaca attctttatc aaccaacacc ctctctgctc tgtattgtga aactctgctc 99960

ctactacatt aacagtctct tggtttcttt aaaaagaaga caaaacaatt aaagaacaga 100020

agcaaaaaat ctactcaaat ccccaattgt taccctcaaa attaattgtc ccacccctag 100080

ctttctcatt gcacaactct ttgtcaaaat gttttctacc atcacagcct tcaatgatct 100140

ttctggttcc tttatctcct gaagtctgac ttctacctcc atctttttct ggactattca 100200

acacactttg agaaaaaaca tacttttgtt aaacaggtat gcatccctga agcataaaat 100260

acatagtact gaaagtgcac atgtgtggtt cttcccattt tttttacagc acttgaaact 100320

gacaagtagt agtaccaatt acttagtaaa agaccttttt catttcattt ctgaaatatt 100380

gttattttcc tttttcatct tccatctctg actacacctc caattttacc tctttgctgc 100440

cttccttcct aagaaagttc ttcatgcaat gccatcttgt ttttcttcac ttgcctcttt 100500

ttctcacttt aattttatga actctgatga cttacctctg tagtgtaact actcaaaata 100560

tgtatttctg aagtctcaac tccaatctca tattttcaac ttatatttat ggaggcatct 100620

cagactcaac ctacctaaaa aatggcttat ctgccctaaa atctactttg ttcttttttt 100680

ctctactgct aataattatc ttcctagttg gtcaagctca aaacctaatc atttttactc 100740

cttgtccctg tgtcagctgt ccacattcaa gcagcgtatc atttctgcac atttttcaag 100800

caagtcagta actgcctttt gtttgggact gtcttttcat atagtgaaca gccttggaag 100860

atagaaatca tttctccttc taaaacaaaa ggcaggtgtg cttgcagcct tggatagagg 100920

tagtgcctct ttctaaagca aagggacatc tttactggcc attataaaat atccatgttt 100980

cctgagctct gcgttcctct tttctaatgc aacccactga gcatgtaggt gtcacctgag 101040

cttttctgtg ggaattgcgg cttgaggaat cagtgcaaga aaatcatgat actcttgcta 101100

atgctattaa tgtgagtagt aaagttaatt gtctctgacc cagcactatt gtgtctttgc 101160

ccagcactca aaagactggc aggcttgcaa gtaggacaaa atgttagatt tttcacagtt 101220

cttctgctta taagtacttg ttaaaaccaa ttaaaacaca acttgtagtt tgcacctata 101280

attttgtagc atttgcttct tatctatgtc actaggatgt gcttagtgac agacccatct 101340

atcatctatt actcaagttt ttggctgtat tcctaggcaa cagagagaag gggaacaaac 101400

aagaggacct gtgcacagtt tgagaaaggc aaaacaccga gcttaattgc agacttgaat 101460

gtagctagca aacgaagtaa ggcaaaaggt tccttttttt tttttttaga tggagtctca 101520

ctctgtcgcc agtctggagt gcagtggtgc tgtctcggct cactgcaacc tccgcctcct 101580

gggttccagc gattcttctg cctcagcctc ccgagtagct gggactacag gcatgtgcca 101640

ccatgcccag ctaacttttg tatttttagt agagacggag tttcaccacg ttggccagga 101700

tggtctcaat ctcttgacct tgtgatccgc ccattcggcc tcccaaagtg ctgagattat 101760

aggtgtgagc ctccgttccc ggccaaaagt ttccattttt taaatagttg ggtttttagt 101820

ttcgattctt tccaaaaaaa ggttttctta aaaaaataaa attagcaata agatgaaata 101880

taacaacaat ataatcttat taagacaata tatgatatac atttatcaaa atacttatat 101940

tttcaaaagt gcttaaaata atctagcaca tagtagatgc tcagtaaata tttgatatta 102000

tgactgtgca tgggtcatta taggctactt tatgtatatc atttcattta gtacaacatc 102060

actctgaaaa atgttttatt gttaccgttt ttcagttgaa acatttacgt tgctcaagat 102120

ctcactggta ccatctacta ttaggtcagt ctgccaccaa atctcatgct cttaaatgcc 102180

ctttttctcc tgagcttcca acaaatagtg tactgtatat aattgttgaa gggaggggac 102240

tgtgagacaa aatatttaga gtgaatgtgt agccacaatt tcagttcctc aacaaagtga 102300

taaaattagg aatcatcctc aatatatatt cttccaacac acacacacac atacacacac 102360

acacacacac aaataccaca agcccacttg aatgcacccc acctacacat tgcaaccata 102420

gagacaattg cagcattaaa tacagaatat tctgtgtgtt gtttgtttgt tctccctttg 102480

ctacaaaaat cagaatttct actcaataaa cagcaaaggg agatacaaat gaaccaaatt 102540

aaagaaggaa aaaatgttga aaaaattata tacagaacta tgtattgatt tattgagagt 102600

tcagtaatgt aatccagaaa taatggatgc cttaaaagta attaaaagaa tgcaaataaa 102660

catttagtgc caattaaaga aaaagaaata caacattaga caaaataaaa gatattcatt 102720

tgatgcaatg aggaaataat cttttattcc tctttaaatt ctctgtggaa taaggcatgg 102780

ttataaataa ataaacatct gccccatgga cttaatggat cgttatattt tattgcgata 102840

atcataatga aattgttggg agggattagt atctctagtg taatgctaag aaagataaag 102900

cctgtgccca ggcaaaagct ttcttggttg gtcaaaaggt ttgaagacat ttcaaactat 102960

tctaaaacaa acaaacaagc aaacaaacaa aaaacataca atgtctttgc cacatattta 103020

ggaaacaaaa tgaacaattt atttctgaca acctcatagt ctttgttctg tcagaacaat 103080

aatggaaagg tctaaaccag aaaatgctat gcattgaatt tataataaac tattttttcc 103140

tgtaacaaaa aattgataaa cttgatattt gcagatttaa tgattatgtg tttaaaaaaa 103200

atctggtttt tgcccttgca aaaaatcata tatatacaca tagatatgta tgtgtgtgtg 103260

tgcatagtat atatatatgt atatacatat atatacacac atttatatat ataaacattt 103320

cctttaacct cctattttat tccaataaaa atattggtat tagagatagt tctgatattt 103380

catcatgaat agttaacatt gcatttggaa aggattaatt tttttgaaac gtaattttac 103440

cttaataagt agcccagcgt aatattttag taattacaca gatttttttt tcaagacatt 103500

tgacaactaa tattgcataa tagttaagag tgtgggcttt ggagccagac ttcctatctc 103560

tgttcattca ctgataaaat ggagacagta gtaacttcct caaagagttg ttttttaaga 103620

tcaaataatg catataaaac tcttgaaatg gtaccaaata cagagtaagc accaaataaa 103680

cattaactgt tattgttatt ccatgtccga ataacacaga aaagtaagaa ttttaatatt 103740

tcatttgaat gaccttttaa ggatacacct agcccattat ctttcttgat aatcttgtaa 103800

gatgattcct tttttatctc cgatctgttg aggcatggat agaggttttc agagaaaaca 103860

ttttctaggt aactgaaaga aagtagcaac aacaaactgt gacaaaactt aacaatgaga 103920

gaatttacaa gatagaataa ttgcaactcc ttttgaaatc aaccactatg gtcctctggc 103980

tgggatagct aagcaaagat attccagcct gaaggttgag atctacttga agagttttct 104040

atccagattg tgagggcccc tcaaacttca cttagtatct gtttctatta gtatggaaac 104100

ttctggaacc ttgtggtatc acattcactt gactacttta ttcctgctct agctatctta 104160

aagcctttct taatctttta tcttttagag aagatacttc taggttttaa atccaccgat 104220

cttgaagcta ttgccttcac tctctgcttc agagcccatc cttttgtata tgagtagttt 104280

gttttgccta aagtactttc tcccagtcag attttaagtc cagtttctca tctgtttttg 104340

agagcaaact cctgggcctt ggctcactaa catcttgaca gcatatttct tctttcctat 104400

gggcttttca gcattccctg ggtttttcta aaatatgaaa gcagactctt tatctcttac 104460

tttgtcaaag cctaccctcc ccactgattt ctcacccagt tgctagtttt aagacctgcc 104520

tctggccggg cgcagtggct cacgcctgta atcccagcac tttgggaggc caaggtaggt 104580

ggatcacgag gtcaggagat cgagaccatc ctggctaaca cagtgaaacc ctgtctctac 104640

taaaattaca aaaaaattag ccaggcgtgg tggtgagcgc ctgtagtccc agctactcgg 104700

gaggctgaag caggagaatg gcgtgatccc gtgaggcaga gcttgcagtg agctgagatc 104760

gcgccactgc actccagcct gggcgacaga gcgagactct gtctcaaaaa aaaaaaaaaa 104820

aaaaaaaaaa aaaaaagacc tgcctccaaa tatcattgta tttgcaaaca tgaaatgact 104880

tattgattct gagctcagca caagagcaaa cctttctcag cttgacccat cttcacatcg 104940

ttaatgtctt attcagtcac tacccaaggg gctgaccttc aagattctaa tccatgaaag 105000

cttaaaatag taaacaaatt tgaatatagt ttaacataca taataaattt tatttctaga 105060

agaggaggat cagcccttag acatgaaaag taaaaatagt ttattcccag atttcccttt 105120

gtgcattagt atattcaacc gagtctatcc aagtaacagg acaaaaaaag ctggcagttg 105180

ttgctgcgct gtgaagtctt attaggtgag tcagctaatt atatggcact accataaata 105240

cagcaggcac tgccctgctt gttaggcttg ccaaggaaaa taaggattta aagcagcata 105300

ctacctcttt gctatataat gacattttct tcttaaaaat gattttgcac caattcctga 105360

tttatccacc aattattttt taatttatgg ttgaatgtat ttaaacctga attcagagat 105420

aaaactagta aatagctccc caaaataacc ccaaatatat ttaatatatt agctttactc 105480

tctcctccac tgccaaacct ttaaaaactg aaataaattg tttttatttc atcttttctc 105540

tttttctctc tctctaaggt gattgccaag actaaagaaa cagctagaag ggcaaaagac 105600

aagaaaatca gtaagatagt aacagattat ccaaagtaga gcacggctca ggtgcagtgg 105660

ctcatgcctg taatcccagc actttcggag gctgacgcag gaggatcact tgagtccagg 105720

agtttgagac cagcctgggc aacataatga aacttcatct ctataaaaaa aaaaaattta 105780

aatagccgag catggtggtg taagcctata gtcccagcta tttgggaggc tgaggctgga 105840

ggatcacttg ggcccaggag ttggagacta cagtgagcta tgattgtatc actgcattac 105900

agcctgggca atagggcaag accctgcctc taaacaaaag ataaacaaag tagagcataa 105960

atggcttcta aatatatgtt atttatgtgt aagactgggt tctctaaagg tatcatttaa 106020

ttaaaataga tttgcattct caatctgtag gtatggatta tgtataatgt atttaagata 106080

tgacttacag cgttcaccaa tgtgactatt cccaagtgat ccagatggct gatgacatag 106140

taatttgtac atttgctgag acctgatctg agtaggtatg taacataact gagggagagc 106200

aagtccattt gccgaaagaa agcctagcat atgacccagg agccacatct tcactcagcc 106260

ttgttgctag gtttggctta gcatatataa tagcatagca tgtataattt atgacaaaaa 106320

attatacttt gcacttttta attagaacat tcaaaatgat ctcaggaagt ggcaccagag 106380

atcatcagtg gtctactgta cttcgtgtgt atgtgtctgt gagtatgtat gtgtttgtgt 106440

gtgttcccac attctaaggc atgtctttta caggttagta gaaaatgttg atagaaaatt 106500

atagatttca acatctaaaa cacagtaggt cactacattg ttaaaacttg gaatttttta 106560

tcttgttgta aagtcaggcc aaccaaacct aaaatactgc tacattgaaa tagtgcaaaa 106620

tattcaaaat actatagtta tagatttggt agtaggactg taccagacct gtcactctat 106680

acaagactta tgccttgccc tttcacttac ctgttccctt ttacatctat cttactagat 106740

gtaatgctat aaattatatt tctaatatat tataatttat catgtattat aatgtatcaa 106800

atattacaaa ttatgttgca actcccctta cctttcgtct gcatattgcc tcagaaagaa 106860

cagatggatc caacagactt caaccacagg cccttagtga caaatagctc ttaatgctgg 106920

gcttgccact ttgatgcatt tctaaagtta tagaatgtta aatgcaccaa gtcctttggt 106980

cattttattt ctaccttaga tctaagccat aactatactt tcccaaaaat taaagtttga 107040

attttaactt aaccatatat aattggaaaa ggaggttggg ttcgttaagt gtaattttat 107100

catgctttat tatcctttgg gcattggata cagcagaaca tgccaatttc tatggcttct 107160

catgtgacag aatatactta ctaggatgca attaaatact cctcagagta tgtaaacaat 107220

aaatgtaatc attacattat ttttatattg ttctttctta tgcataatag taagactgaa 107280

aatatagtgt tatttctgaa atatgcatat tgttttgctt ttgatgatta aataacattg 107340

tccaaagttt taggtttttt gaaatcttat attttttaac aaaatatcta gcctttccaa 107400

aacaagacct caataattcg tttaagaccc agagttgttc ctctccacat agatctctta 107460

aaaaggcaga ggatttatga cctcaagaga aatcagagta tccaaagttt gctttaattc 107520

aatgttttaa aaataaaatt ccttagattt tatcaaaaat tgagattagt ttgattttga 107580

atcagatgcc ctttgctccc caccccaaaa tggcattatg agcagactag gaattgataa 107640

tagaaaattg aacatatgaa atatatcttt accttgcttt ttaacaaggt attcatgtct 107700

atcgccttca tttttaagtg catcaataaa atacatggta attctcttag tgaaatatac 107760

tatctacact atgtacacac tcccctgtct gaggtagaga agtagagaat attcacattt 107820

ttgaaacgtc tatgctattt ttatttaaat acgagttctg ggcttgattt cattttggaa 107880

cacgggtgtg tgcttaagtt gaaccttttt ttcctcttaa gtcaaagttc ttttttagtt 107940

tcttctttta tctttttggc tactatctct ctccttcatc ctcctggtgt gagttgttga 108000

gtgaaggtat taattccatt atttgaggct aagtgacatt gttcaataat gcagcaaaac 108060

aatggttcta cccaaaatat cttcaagtgt aaaagcagtg ggcaaaagag aaagtgcgct 108120

tctgctgctt tgaatgttta aggctgtgaa agttgatcac acaaattggg tcattcttgt 108180

tatacccaac taaaacaatc aagaagcctg ggaggaaaag cattcaagaa acatcacatt 108240

gctccaaaag tgtaattttc tacaagtccg catgctgagg ctgcctgttg taacctggga 108300

ccaatttttt ctgtaactgc tgaaaaaact tgctgcagct ctaggactaa ttttgcccac 108360

cactgtcact caccaattga agcttactag ctccccagaa cctttctagt gccaatgaac 108420

tttctcaaag agcagcgtgt atcatttctc tttttcagaa cacctccaac ctcctctttg 108480

ttctttgggt ataccaaaga ccaaccagcc ttgaatttca atttttcttc ccacataaaa 108540

gttttaattt agaaatgtat ctctacattt ctaactttga caaagcatag ataccagata 108600

attgatgaaa ccttgctatt ttaacgatca ccatggatta cttcccagtg tcttcagata 108660

accctcaaca tttgccaaca tttgatggac ttcaaaatga gcatatcttt tttaaaaaaa 108720

attattcaca ctgacagcaa gtacattggt atactctata ttaaattata ccacagggtt 108780

tacaaacaat tggtgatgtc gggcagtggt ttccaaggaa catacttaac aagacactca 108840

caaggcccta caaacctgca tttttaacaa gggccctaga tgattctaga agagtgtggt 108900

ttggaaagca atttttgcct ttattatgtg tcattttaaa tatatttaaa attaaagtta 108960

taagtcatag aattgaataa agataatttc cttacagaaa gtattactag gtatctaaat 109020

acaatatggt tcaaaacagg aaatttaaaa agattatgta aattctgtag ttgtattcct 109080

aaagacagta gctgaaattt tttcctactt ctccttgtat cacttccctt ttccttcact 109140

ttcacttccc tggaattgta cttcccaata agctattagc agtgaaggaa gcttcgtctc 109200

atgatctgtt ttatagagca cttcagctgg gacgagtacg aaatgataat cagttatatc 109260

agctattcaa ccctacaggt ttatttaaaa agaacttgaa taagcttttt agggagaaag 109320

aggtcagtct cagccatttc tgtttcctaa tatagctttt aagtctttcc ttattagcaa 109380

tgagggtcat tccattgtaa ttttttgata accatttttc tttctgtgtg tcaaatgcag 109440

atataagata ctgaactgag tctatttcac tgttcgtaaa acaatcccat ttgaaaaaaa 109500

aaagtctaca gctattccag ggatagggcc tagtagagag agaataaaag gtattttctt 109560

actatgtctc tatatcctac cctgtaggtt ctcttattaa gcatacaggc atataccaaa 109620

atccagacgt ttttctcatt tattttattg ccctaacata ttctgggtta atataatatc 109680

ataatgaaaa tttgagaaaa aattgatttt ttcaaaagtg tttaacattt gttatattgg 109740

tagttttttt tcttgtttgt ggtaaaaata aatagaaggt gcacttcaca ccttcaagta 109800

tgattatatt ttgaaaacaa gtcatgaata ctcataaaat gcaaatttta atgttctttt 109860

tttgttacag ccaaactata ttaggcacag ttgtaaattg gagttgaaat ttaatatttc 109920

tttatagata acaatgtttt tagaaatagg tttatgaaac agtaaatata caggtatagg 109980

gataaaattg tgtctgatgg tcatatgaag tgtttgttgt tatattctcc ttggaatagc 110040

tgccaaatat tttagtatgc ttaaaatcta cgaatgtgat agagtcaaca aatttagatc 110100

acatattcag aaaaacatag ttagagaact aactattgaa atgagcatac agcagtcttc 110160

ctttatctac agggatacat tctgaaaccc ccactaggac acctgaaatt gcggatagta 110220

gcaaacccta catatactgt tttttccaat gcttatgtac ctatgaaaaa gtttaattta 110280

taaactaggc acagtaagag attaacaaca ataactaata acaaaagaga acaattataa 110340

taatatactg taataaaagt tatgtgggta tggtctcgct ttctctttcc ctctctctct 110400

gtctctaaat atcttagtat tttggggttg caattggtgg tgggcaactg aaaccatgga 110460

aaacaaaacc acggataaaa ggagactact gtatatactt tttaaaactg atgaaatatt 110520

aaactcatgt ttcttctata tcccacccat ttcccccacc caaacctaga tagatatctt 110580

atttgatctg taaacattta attaatttgt aaaagttaag aactttttga agtaaaactg 110640

caatatatca tcacacctaa agaaataaac aataattctt aaatatcaag tcagtgttca 110700

aatttcccca actacctcat atgtgttttc catttgctta tgtagggttc ccaatgagaa 110760

tgaaataaag ttcttaggtt gcaattggct aatgctctct cacttctact ttaagcggca 110820

ggttcccact aacttctttt tagttgcaat ttacttattg aaattagacg tattctttgt 110880

cttgtgtagt ttctcacagt gcaaaatttg ctgattgtag ccactgttgt aagcaatgaa 110940

catgtttttc accaccttat atttgctgta agttgtcagt gatagttaaa tgttaatcaa 111000

attcaaattc ggatcacgta gggcttttct ttttttgttt tctttttcta tttatatatt 111060

tatttattta ttttgagacg gagtctcact ccgtcaccag gctggagtgc aatggtgtga 111120

tctgggctca ctgcaatctc cacctcccgg gttcaagtga ttcccctggc tcagtctccc 111180

gagtagctgg gactatagga gaaccaccac gcccggctaa ctttttgtat tttagtagag 111240

atggggtttc accatgttgg ccaggatgct atagatctcc tgacctcacc gatcatgtag 111300

gacttcaatt gtcgaacaaa cgaaccttta atagcagtta caccattagg atgacctgat 111360

ccaacatcga ggtcgtaaac cctattgtcg atttggactc tagaatagga ttgtgctgtc 111420

atccctagtg tagcttgttc ccacttgatg aagttattgg atcagtgaac aatagcccac 111480

ttaaactagt acagtcttag tttaagatgg tgatgtgtat gtacttccat cagagggcac 111540

ataatacagt aaatcctcac ttaacttcat caatagtttc tggaaactgt gacttgaagc 111600

aaaacaacat ataacaaaac cagttttacc attggctaat tgatataagc aagaattaag 111660

tcctatggca aatttctgga cacaaaaaca ccatcaaact cctaaataaa gataaatcac 111720

ttctgacatt aaacattgaa attaatgtga gctatatata cgtttaagaa agattaatac 111780

aaacaagtca aataacttac ctaattattt cggtggaggc cgcaggtggt tggagcctat 111840

cctggcagct cagggagcaa tatgggaacc caccccggac aggacgctgt tccattactg 111900

cagggtgctc ttgtacacac ccactcaccc aggctggaac catgcagaca cacacactca 111960

cctaacctac acatctgtgt acatccttca aagttcagcc aaataacata taaacaaatc 112020

cagtaatatc catcagtctt agttccgtca taacaactcc tttttgatca tcaaacaaca 112080

aacagggtag gtctgccata tttacttgtc tggtccatat caaaattttc taacaaatta 112140

tattagaaaa tcaaatctct gtcagtttca aaatcatgga aaaaaatttg ccttatttcc 112200

cttatacttg gatatcctaa cagtaatcta aatattaatg agaaagttaa tgatgtcgtt 112260

tccttctccc tgttgtaaag aaggttttgc tgtcccgttt gatcactaag actaattgac 112320

actcagaaaa agcataggaa acttctcagc atcacaaaag ctctgtcatc tagagaagct 112380

aggacttgag ctcaagtcct gtgacatgga aggccttgtg cctagccatc ctgcagcaga 112440

ggcgtatcta ccaagaagtg aaacactacg aaaacagtat gtttactcca cattttaaag 112500

tgaggtagtt tggggtggtt catattttat ttaatttata tattatttgg atttttttta 112560

gtttataaaa agggcattgg caagggcaga atgatctgta agcttctctg cccacctacc 112620

ataagcatga tctttagtgt gaccttttct tactgttagc cattttctta tacttctgcg 112680

tccctgtcag tcacttccat gtgaagacat ggggaagctt ttttacatca gacatgttgt 112740

tgaaaatcag ccgcgttggc tgagggatta tttgatctct ttctccaagt ccctttaggc 112800

tcacattgcc tctctgttct ttgaattttc acttaccttt atcttcttat aattactttg 112860

ctgaaataaa tgcaaagcaa caaaaggtat ttagtgaaga ataccaacaa agccatgacc 112920

atttcaggct gagttttgta gtattctttg tctaggaaga gatacctaga aaaattttct 112980

gaccatgtat ttgattattt tccttcaata tgtatagtct cagtcttcaa atttcagaaa 113040

agaatttgtt tcttcattgt catttaaaat taatgtgtta aatatgtatg cttttacatt 113100

ataagtggtt ataaaagtta aacacttaga aaaaaagtca aaataacata catactatcc 113160

aacaaaataa ctttcatatt ttattgtgtt ttcttccaaa ctttttacct ttgcgtctga 113220

attctgtgta ggttgtatct ataatataga caacacttta tagcctgcta aatattatac 113280

cataaatagg tagttgttac ataattctca ggtaatagta atacaggtct ttatcataat 113340

ctactgagta gttgaatgat aatttttttt aagacaaggt ctccctctgt cacccaggct 113400

agaatgcagt ggcatgcaca tggctcactg tagcctctac ctcccaggct caagtgatcc 113460

tcctgcctca gcctcccaag tggctgggac tgtaggcatg tgccaccatg cccagctatt 113520

tatttgtatt tttagtagag atggggtttc attgtaacag cccaggctgg tcttgaactc 113580

ctggactcaa atgatccacc tgcctcagcc tcccaaagtg ctgaaatcac aggagtgaac 113640

cactgcaccc agcaataatt ttttaactct tcattattca ttgaacattt agttaacaat 113700

tctaaaaatt ttgtttcctg ctgtcattga tcttgtgaaa aatatctttg gactatagct 113760

gtggattatt tcctaaatag taaattactt gagcaaaaag tttacatact ttgagggttg 113820

ataacccatg ttgccgcaat gtttccccgg aggcattgtg gagtttagaa tgccagtagt 113880

aatattaagg tgtgccattt tcaagatccg tggccaacat ccctatatgt aagatttttc 113940

caaaacatgg ttctgatttt taaaagtgaa aaatgctact tcatcatgtt ctttttgtgc 114000

ttcttacttt aaatattaga atgaagaagg agccccacag gaaggaattc tggaagatat 114060

gcctgtggat cctgacaatg aggcttatga aatgccttct gaggtaggag tccaagctga 114120

atctttctaa caagacagta ccaaaaacct gtcattgtca catttctctt tcattagtgc 114180

ttagtgagaa tcatttgctc tctacatgct cattacgtgg acaacttgca agttaagaat 114240

agtttttaca tttttaaagg gtccttaaaa aaaaagagga ggaggaagat gaagaagagg 114300

aagaaaggat gtaaaagaaa tcatatgtag tccacatagc ttaatatact tactacttga 114360

ccctttacag gaaaagttta ctaacccctg cattagagaa tatattttta gaaactttac 114420

attctaaaat aaatttctaa atggaaagtt agggaaatca atggaatgcc aaaggaaggt 114480

tattattttt tgccatacat gtccaatggg atgacgcata gtaaaataaa agttacccac 114540

acaagttata gaataaaaag ataaatgcat gatttgcgac aattgatata ttccagtata 114600

atgttttaaa caacacaata tgattgttaa ttttattttg attgaaaatg aaagtatctt 114660

taatagaaaa tgtatcaaaa gggaaattag aaaatactgt tagatgaata aaactggccc 114720

aagaagaaac agtaaatctg aatagatttg taacacagcg aatagattaa attagtaata 114780

aaaaaaaaaa cctacctgca aagaaaatcc caggccgaga tggcatcact ggtaaattct 114840

accaaacatt taaagaggaa ttaatactaa ttagttaaca ccaattaata tctcttacaa 114900

aacagaagag gagacatttc ccaactaatt ttgtgagacc aatattaccc tgataatcaa 114960

aaccaaatga agatatcaca agaaaagaaa ctatataatg gctccattaa aaattgagtt 115020

caagtatgtt gtagtttggt tatgtattat tcctcacggc attattaaaa ggcatgtcga 115080

ggatgggcac agcagttcac acctgtaatc ccgcactttg tgagccaaag tggccaggtt 115140

acttgaggcc aggagttgga gaccagtctg gccaacatgg tgaaacccca tctctactaa 115200

aaatacaaaa attagccggg catggtggta cacgcctatg gttccagcta cttgggaggc 115260

tgaggcatga gagtcacttg aacccaggag gcagaggttg cagtgagctg agatggcacc 115320

cctgcactcc aatcttggta acagagcaag actgtctcac acagacacac gaaaggcata 115380

ttgataataa ttcaacttat agaaattgag attaaattgt ttgtttgcct aataagaatt 115440

tccaatattt tggggtcttt tatgcaagac acagtactaa acacaatgga aaactataga 115500

gtaattgaca ttaccaggac ataaggagtt tacagtctgg taggtttgat gaaaaaaaat 115560

agaaattcat tcattcattt cttcattatg attcctttaa caaacataat tgattgtctt 115620

cgatgtacca ggcatcacag gagcaaaaat atataagaca tactaaaaag taaaacattt 115680

taaagatctg tttcaatcaa tcaggagaag ttttattgag gaggtaatgt tgatctgggt 115740

gggaaaaggt aagagatata gtaggtcaaa acaaacagag gacattctgg cacaagggaa 115800

tatcagaagc aaaggcatgt atgtctgagc atgcaaatgg atatgtctga gaacagtgaa 115860

taattatgac tcaagcttag gaacaaggaa aatggtgata gattgaattt gcagctatgg 115920

gtcaaagaca agttatagag tattaggata atcttgtcat ttcagcttgt attctattca 115980

gaaaacaact tgagttattg aagttatgct tatttgtttg tttttaagca gaatcctgat 116040

attattagag ttgctcttta ggaggaataa tctgatccct ttaattaaat ccattaatat 116100

ttgtgttgtg gatgctatcc agatactgta tggagagctt gaggtttgaa atacaagtaa 116160

taattgaagc catagatgaa gacgaaattt tcaactggga gagtgaaagt agggaaaatg 116220

tatcttgcct tcaaacatct taatttcctt ctgagaatta gagcatctta gtctggaaaa 116280

ggctttatag acagcttgat tttgttctca cattttacag gtgaagaaac tgagaaccag 116340

acagtccaac ttatttgtcc taccaaacta ggtatatgat cattaaatgg tgcatccgga 116400

tcagaaccta gatattttaa ctctgactac tactgtaatt cacttttata tcagacaaga 116460

aagacacaac tattaaaaat aagataatat ttgctgcaga atatttgcaa aaacattgat 116520

tgtaaatttt agtgtaagtg gggagccatt tcctatctca ttggctgtca gtgctgatgc 116580

gtaattgaaa cttatactaa cagtgtgtgc tgtctttttg atttttctaa tattaggaag 116640

ggtatcaaga ctacgaacct gaagcctaag aaatatcttt gctcccagtt tcttgagatc 116700

tgctgacaga tgttccatcc tgtacaagtg ctcagttcca atgtgcccag tcatgacatt 116760

tctcaaagtt tttacagtgt atctcgaagt cttccatcag cagtgattga agtatctgta 116820

cctgccccca ctcagcattt cggtgcttcc ctttcactga agtgaataca tggtagcagg 116880

gtctttgtgt gctgtggatt ttgtggcttc aatctacgat gttaaaacaa attaaaaaca 116940

cctaagtgac taccacttat ttctaaatcc tcactatttt tttgttgctg ttgttcagaa 117000

gttgttagtg atttgctatc atatattata agatttttag gtgtctttta atgatactgt 117060

ctaagaataa tgacgtattg tgaaatttgt taatatatat aatacttaaa aatatgtgag 117120

catgaaacta tgcacctata aatactaaat atgaaatttt accattttgc gatgtgtttt 117180

attcacttgt gtttgtatat aaatggtgag aattaaaata aaacgttatc tcattgcaaa 117240

aatattttat ttttatccca tctcacttta ataataaaaa tcatgcttat aagcaacatg 117300

aattaagaac tgacacaaag gacaaaaata taaagttatt aatagccatt tgaagaagga 117360

ggaattttag aagaggtaga gaaaatggaa cattaaccct acactcggaa ttccctgaag 117420

caacactgcc agaagtgtgt tttggtatgc actggttcct taagtggctg tgattaatta 117480

ttgaaagtgg ggtgttgaag accccaacta ctattgtaga gtggtctatt tctcccttca 117540

atcctgtcaa tgtttgcttt acgtattttg gggaactgtt gtttgatgtg tatgtgttta 117600

taattgttat acatttttaa ttgagccttt tattaacata tattgttatt tttgtctcga 117660

aataattttt tagttaaaat ctattttgtc tgatattggt gtgaatgctg tacctttctg 117720

acaataaata atattcgacc atgaataaaa aaaaaaaaaa agtgggttcc cgggaactaa 117780

gcagtgtaga agatgatttt gactacaccc tccttagaga gccataagac acattagcac 117840

atattagcac attcaaggct ctgagagaat gtggttaact ttgtttaact cagcattcct 117900

cacttttttt ttttaatcat cagaaattct ctctctctct ctctcttttt ctctcgctct 117960

cttttttttt ttttttttac aggaaatgcc tttaaacatc gttggaacta ccagagtcac 118020

cttaaaggag atcaattctc tagactgata aaaatttcat ggcctccttt aaatgttgcc 118080

aaatatatga attctaggat ttttccttag gaaaggtttt tctctttcag ggaagatcta 118140

ttaactcccc atgggtgctg aaaataaact tgatggtgaa aaactctgta taaattaatt 118200

taaaaattat ttggtttctc tttttaatta ttctggggca tagtcatttc taaaagtcac 118260

tagtagaaag tataatttca agacagaata ttctagacat gctagcagtt tatatgtatt 118320

catgagtaat gtgatatata ttgggcgctg gtgaggaagg aaggaggaat gagtgactat 118380

aaggatggtt accatagaaa cttccttttt tacctaattg aagagagact actacagagt 118440

gctaagctgc atgtgtcatc ttacactaga gagaaatggt aagtttcttg ttttatttaa 118500

gttatgttta agcaaggaaa ggatttgtta ttgaacagta tatttcagga aggttagaaa 118560

gtggcggtta ggatatattt taaatctacc taaagcagca tattttaaaa atttaaaagt 118620

attggtatta aattaagaaa tagaggacag aactagactg atagcagtga cctagaacaa 118680

tttgagatta ggaaagttgt gaccatgaat ttaaggattt atgtggatac aaattctcct 118740

ttaaagtgtt tcttccctta atatttatct gacggtaatt tttgagcagt gaattacttt 118800

atatatctta atagtttatt tgggaccaaa cacttaaaca aaaagttctt taagtcatat 118860

aagccttttc aggaagcttg tctcatattc actcccgaga cattcacctg ccaagtggcc 118920

tgaggatcaa tccagtccta ggtttatttt gcagacttac attctcccaa gttattcagc 118980

ctcatatgac tccacggtcg gctttaccaa aacagttcag agtgcacttt ggcacacaat 119040

tgggaacaga acaatctaat gtgtggtttg gtattccaag tggggtcttt ttcagaatct 119100

ctgcactagt gtgagatgca aacatgtttc ctcatctttc tggcttatcc agtatgtagc 119160

tatttgtgac ataataaata tatacatata tgaaaatatg tatttggttt ctgcctccag 119220

ttcttacaaa gagctcctaa aacccttgta atttcctgag tagtaggggt gctagggtca 119280

tcttttgttc taatatttgg tctttgactc tgctttctga cagagctcct tagtccctgg 119340

gtgagagtag catcttctct tctaatgaag tgactcttgc tgggttcctg gatgggggct 119400

ggtcaccaga aaggtcaagc catgataaga agcttgaagc ttttggcccc attcacatct 119460

tctggggacg ggagagaaga ggagctggag attgagttaa taagcaacaa tgcttccatg 119520

atgaagactc cataaaaatc cctaaaagac aggattcaga gtgctttgaa ataggtgaac 119580

atgcagaggt gctgggaatt gtggtgtgtc cagagaaggc atgcaagctc cccacgcctc 119640

ccccatacct ttccctgtgc atctcttcca tctggctgtt cctgagttgt atccttttat 119700

aacaaactgg taatctagta agcaaactgt tttcctgaag tctgtgaatc acactagcaa 119760

attatcaaac ctgaggagag ggccgtggag accttggatt tgtagacaag tcaaacagaa 119820

gctatgagta acatgaggac tcattgcttg tgattgtcat cttcagtggg aaggggaaaa 119880

atcttgtaaa actgagtcct taacctgtgg gtcaatgcta actccaggta gatagtgtcc 119940

gatttgaatt acgggacacc cagttggtag ccacaaagaa tgggagaatt gcttggtgta 120000

gaaaacacac cccacacaca catgtggtgt cagaaatgaa ccggaaatat tgtgttccgg 120060

aaatattgag tgttgtgagt gagtgtatag aaagaaaaac agcgtttcct tttcactact 120120

agattaaaac aaacacactc atgcattcac acatctcaaa gacaactatt aattctcaaa 120180

gacagtgctg tctaaatcca tactgaggaa gaaaacacat tttcttttca aatctgtaaa 120240

cctgacagac tgcctctgtc cacacactaa tggaactctg tgtttcatct gaaatgtgtt 120300

catcccactt tgttctttct gtcttgggca gggcaagagt gcaacagggc tgacattttc 120360

atatgagctc tgtccctgtt attggctata ctttagacaa attattatgt gtcaaatata 120420

gatgtaagtg atttatcaat attaagtcat ttaattctca aaacaacctt aataggttcc 120480

attatgattc taattttaca cataagccaa aggaggcacc cacaggctag ataactttcc 120540

cacggccaca cagctagtaa gcggcagagc caagaggccc aacattacag caccacagtc 120600

tgtgctctca gccccttggc cacatagtgt cagagtgagg acacacagct atttaagaaa 120660

acttccagaa gtctaggaaa tggggtgata gccccacttt tctaggtata ataattagat 120720

atttgttttt cttcaggtac ctaaagaaaa tttactagag tttgagcctt tagtaagttt 120780

tgctagtaca tctgtttttc ttcaggtgcc tgaagacaaa catatacaca cacacacaca 120840

cacaaacaca cacaaaatgt gtatctatat atatgtgtac acatatctct catctctata 120900

tatatgtctc tgtatatcta tatatctata aacatatcta tatctataga tacatataga 120960

gagatttctt tttttttttt tttgagatgg agtcttgctc ttgccaccta ggctggagtg 121020

caatggcaca atctcagttc actgcaacct ccgcctccca ggttcaagcg attctcctgc 121080

ctcagcctct cgagtaggtg ggattacagg aacacaccac cttagcccga ctaatttttg 121140

tatttttagt agagacaggg ttcaccacgt tggccaggct ggtctcaaac tcctgacc 121198

<210> 2

<211> 3215

<212> DNA

<213> Homo Sapies

<400> 2

aggagaagga gaaggaggag gactaggagg aggaggacgg cgacgaccag aaggggccca 60

agagaggggg cgagcgaccg agcgccgcga cgcggaagtg aggtgcgtgc gggctgcagc 120

gcagaccccg gcccggcccc tccgagagcg tcctgggcgc tccctcacgc cttgccttca 180

agccttctgc ctttccaccc tcgtgagcgg agaactggga gtggccattc gacgacagtg 240

tggtgtaaag gaattcatta gccatggatg tattcatgaa aggactttca aaggccaagg 300

agggagttgt ggctgctgct gagaaaacca aacagggtgt ggcagaagca gcaggaaaga 360

caaaagaggg tgttctctat gtaggctcca aaaccaagga gggagtggtg catggtgtgg 420

caacagtggc tgagaagacc aaagagcaag tgacaaatgt tggaggagca gtggtgacgg 480

gtgtgacagc agtagcccag aagacagtgg agggagcagg gagcattgca gcagccactg 540

gctttgtcaa aaaggaccag ttgggcaaga atgaagaagg agccccacag gaaggaattc 600

tggaagatat gcctgtggat cctgacaatg aggcttatga aatgccttct gaggaagggt 660

atcaagacta cgaacctgaa gcctaagaaa tatctttgct cccagtttct tgagatctgc 720

tgacagatgt tccatcctgt acaagtgctc agttccaatg tgcccagtca tgacatttct 780

caaagttttt acagtgtatc tcgaagtctt ccatcagcag tgattgaagt atctgtacct 840

gcccccactc agcatttcgg tgcttccctt tcactgaagt gaatacatgg tagcagggtc 900

tttgtgtgct gtggattttg tggcttcaat ctacgatgtt aaaacaaatt aaaaacacct 960

aagtgactac cacttatttc taaatcctca ctattttttt gttgctgttg ttcagaagtt 1020

gttagtgatt tgctatcata tattataaga tttttaggtg tcttttaatg atactgtcta 1080

agaataatga cgtattgtga aatttgttaa tatatataat acttaaaaat atgtgagcat 1140

gaaactatgc acctataaat actaaatatg aaattttacc attttgcgat gtgttttatt 1200

cacttgtgtt tgtatataaa tggtgagaat taaaataaaa cgttatctca ttgcaaaaat 1260

attttatttt tatcccatct cactttaata ataaaaatca tgcttataag caacatgaat 1320

taagaactga cacaaaggac aaaaatataa agttattaat agccatttga agaaggagga 1380

attttagaag aggtagagaa aatggaacat taaccctaca ctcggaattc cctgaagcaa 1440

cactgccaga agtgtgtttt ggtatgcact ggttccttaa gtggctgtga ttaattattg 1500

aaagtggggt gttgaagacc ccaactacta ttgtagagtg gtctatttct cccttcaatc 1560

ctgtcaatgt ttgctttacg tattttgggg aactgttgtt tgatgtgtat gtgtttataa 1620

ttgttataca tttttaattg agccttttat taacatatat tgttattttt gtctcgaaat 1680

aattttttag ttaaaatcta ttttgtctga tattggtgtg aatgctgtac ctttctgaca 1740

ataaataata ttcgaccatg aataaaaaaa aaaaaaaagt gggttcccgg gaactaagca 1800

gtgtagaaga tgattttgac tacaccctcc ttagagagcc ataagacaca ttagcacata 1860

ttagcacatt caaggctctg agagaatgtg gttaactttg tttaactcag cattcctcac 1920

tttttttttt taatcatcag aaattctctc tctctctctc tctttttctc tcgctctctt 1980

tttttttttt tttttacagg aaatgccttt aaacatcgtt ggaactacca gagtcacctt 2040

aaaggagatc aattctctag actgataaaa atttcatggc ctcctttaaa tgttgccaaa 2100

tatatgaatt ctaggatttt tccttaggaa aggtttttct ctttcaggga agatctatta 2160

actccccatg ggtgctgaaa ataaacttga tggtgaaaaa ctctgtataa attaatttaa 2220

aaattatttg gtttctcttt ttaattattc tggggcatag tcatttctaa aagtcactag 2280

tagaaagtat aatttcaaga cagaatattc tagacatgct agcagtttat atgtattcat 2340

gagtaatgtg atatatattg ggcgctggtg aggaaggaag gaggaatgag tgactataag 2400

gatggttacc atagaaactt ccttttttac ctaattgaag agagactact acagagtgct 2460

aagctgcatg tgtcatctta cactagagag aaatggtaag tttcttgttt tatttaagtt 2520

atgtttaagc aaggaaagga tttgttattg aacagtatat ttcaggaagg ttagaaagtg 2580

gcggttagga tatattttaa atctacctaa agcagcatat tttaaaaatt taaaagtatt 2640

ggtattaaat taagaaatag aggacagaac tagactgata gcagtgacct agaacaattt 2700

gagattagga aagttgtgac catgaattta aggatttatg tggatacaaa ttctccttta 2760

aagtgtttct tcccttaata tttatctgac ggtaattttt gagcagtgaa ttactttata 2820

tatcttaata gtttatttgg gaccaaacac ttaaacaaaa agttctttaa gtcatataag 2880

ccttttcagg aagcttgtct catattcact cccgagacat tcacctgcca agtggcctga 2940

ggatcaatcc agtcctaggt ttattttgca gacttacatt ctcccaagtt attcagcctc 3000

atatgactcc acggtcggct ttaccaaaac agttcagagt gcactttggc acacaattgg 3060

gaacagaaca atctaatgtg tggtttggta ttccaagtgg ggtctttttc agaatctctg 3120

cactagtgtg agatgcaaac atgtttcctc atctttctgg cttatccagt atgtagctat 3180

ttgtgacata ataaatatat acatatatga aaata 3215

<210> 3

<211> 3211

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 3

gccattcgac gacaggttag cgggtttgcc tcccactccc ccagcctcgc gtcgccggct 60

cacagcggcc tcctctgggg acagtccccc ccgggtgccg cctccgccct tcctgtgcgc 120

tccttttcct tcttctttcc tattaaatat tatttgggaa ttgtttaaat ttttttttta 180

aaaaaagaga gaggcgggga ggagtcggag ttgtggagaa gcagagggac tcagtgtggt 240

gtaaaggaat tcattagcca tggatgtatt catgaaagga ctttcaaagg ccaaggaggg 300

agttgtggct gctgctgaga aaaccaaaca gggtgtggca gaagcagcag gaaagacaaa 360

agagggtgtt ctctatgtag gctccaaaac caaggaggga gtggtgcatg gtgtggcaac 420

agtggctgag aagaccaaag agcaagtgac aaatgttgga ggagcagtgg tgacgggtgt 480

gacagcagta gcccagaaga cagtggaggg agcagggagc attgcagcag ccactggctt 540

tgtcaaaaag gaccagttgg gcaagaatga agaaggagcc ccacaggaag gaattctgga 600

agatatgcct gtggatcctg acaatgaggc ttatgaaatg ccttctgagg aagggtatca 660

agactacgaa cctgaagcct aagaaatatc tttgctccca gtttcttgag atctgctgac 720

agatgttcca tcctgtacaa gtgctcagtt ccaatgtgcc cagtcatgac atttctcaaa 780

gtttttacag tgtatctcga agtcttccat cagcagtgat tgaagtatct gtacctgccc 840

ccactcagca tttcggtgct tccctttcac tgaagtgaat acatggtagc agggtctttg 900

tgtgctgtgg attttgtggc ttcaatctac gatgttaaaa caaattaaaa acacctaagt 960

gactaccact tatttctaaa tcctcactat ttttttgttg ctgttgttca gaagttgtta 1020

gtgatttgct atcatatatt ataagatttt taggtgtctt ttaatgatac tgtctaagaa 1080

taatgacgta ttgtgaaatt tgttaatata tataatactt aaaaatatgt gagcatgaaa 1140

ctatgcacct ataaatacta aatatgaaat tttaccattt tgcgatgtgt tttattcact 1200

tgtgtttgta tataaatggt gagaattaaa ataaaacgtt atctcattgc aaaaatattt 1260

tatttttatc ccatctcact ttaataataa aaatcatgct tataagcaac atgaattaag 1320

aactgacaca aaggacaaaa atataaagtt attaatagcc atttgaagaa ggaggaattt 1380

tagaagaggt agagaaaatg gaacattaac cctacactcg gaattccctg aagcaacact 1440

gccagaagtg tgttttggta tgcactggtt ccttaagtgg ctgtgattaa ttattgaaag 1500

tggggtgttg aagaccccaa ctactattgt agagtggtct atttctccct tcaatcctgt 1560

caatgtttgc tttacgtatt ttggggaact gttgtttgat gtgtatgtgt ttataattgt 1620

tatacatttt taattgagcc ttttattaac atatattgtt atttttgtct cgaaataatt 1680

ttttagttaa aatctatttt gtctgatatt ggtgtgaatg ctgtaccttt ctgacaataa 1740

ataatattcg accatgaata aaaaaaaaaa aaaagtgggt tcccgggaac taagcagtgt 1800

agaagatgat tttgactaca ccctccttag agagccataa gacacattag cacatattag 1860

cacattcaag gctctgagag aatgtggtta actttgttta actcagcatt cctcactttt 1920

tttttttaat catcagaaat tctctctctc tctctctctt tttctctcgc tctctttttt 1980

tttttttttt tacaggaaat gcctttaaac atcgttggaa ctaccagagt caccttaaag 2040

gagatcaatt ctctagactg ataaaaattt catggcctcc tttaaatgtt gccaaatata 2100

tgaattctag gatttttcct taggaaaggt ttttctcttt cagggaagat ctattaactc 2160

cccatgggtg ctgaaaataa acttgatggt gaaaaactct gtataaatta atttaaaaat 2220

tatttggttt ctctttttaa ttattctggg gcatagtcat ttctaaaagt cactagtaga 2280

aagtataatt tcaagacaga atattctaga catgctagca gtttatatgt attcatgagt 2340

aatgtgatat atattgggcg ctggtgagga aggaaggagg aatgagtgac tataaggatg 2400

gttaccatag aaacttcctt ttttacctaa ttgaagagag actactacag agtgctaagc 2460

tgcatgtgtc atcttacact agagagaaat ggtaagtttc ttgttttatt taagttatgt 2520

ttaagcaagg aaaggatttg ttattgaaca gtatatttca ggaaggttag aaagtggcgg 2580

ttaggatata ttttaaatct acctaaagca gcatatttta aaaatttaaa agtattggta 2640

ttaaattaag aaatagagga cagaactaga ctgatagcag tgacctagaa caatttgaga 2700

ttaggaaagt tgtgaccatg aatttaagga tttatgtgga tacaaattct cctttaaagt 2760

gtttcttccc ttaatattta tctgacggta atttttgagc agtgaattac tttatatatc 2820

ttaatagttt atttgggacc aaacacttaa acaaaaagtt ctttaagtca tataagcctt 2880

ttcaggaagc ttgtctcata ttcactcccg agacattcac ctgccaagtg gcctgaggat 2940

caatccagtc ctaggtttat tttgcagact tacattctcc caagttattc agcctcatat 3000

gactccacgg tcggctttac caaaacagtt cagagtgcac tttggcacac aattgggaac 3060

agaacaatct aatgtgtggt ttggtattcc aagtggggtc tttttcagaa tctctgcact 3120

agtgtgagat gcaaacatgt ttcctcatct ttctggctta tccagtatgt agctatttgt 3180

gacataataa atatatacat atatgaaaat a 3211

<210> 4

<211> 3022

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 4

attctggtgt gatccaggaa cagctgtctt ccagctctga aagagtgtgg tgtaaaggaa 60

ttcattagcc atggatgtat tcatgaaagg actttcaaag gccaaggagg gagttgtggc 120

tgctgctgag aaaaccaaac agggtgtggc agaagcagca ggaaagacaa aagagggtgt 180

tctctatgta ggctccaaaa ccaaggaggg agtggtgcat ggtgtggcaa cagtggctga 240

gaagaccaaa gagcaagtga caaatgttgg aggagcagtg gtgacgggtg tgacagcagt 300

agcccagaag acagtggagg gagcagggag cattgcagca gccactggct ttgtcaaaaa 360

ggaccagttg ggcaagaatg aagaaggagc cccacaggaa ggaattctgg aagatatgcc 420

tgtggatcct gacaatgagg cttatgaaat gccttctgag gaagggtatc aagactacga 480

acctgaagcc taagaaatat ctttgctccc agtttcttga gatctgctga cagatgttcc 540

atcctgtaca agtgctcagt tccaatgtgc ccagtcatga catttctcaa agtttttaca 600

gtgtatctcg aagtcttcca tcagcagtga ttgaagtatc tgtacctgcc cccactcagc 660

atttcggtgc ttccctttca ctgaagtgaa tacatggtag cagggtcttt gtgtgctgtg 720

gattttgtgg cttcaatcta cgatgttaaa acaaattaaa aacacctaag tgactaccac 780

ttatttctaa atcctcacta tttttttgtt gctgttgttc agaagttgtt agtgatttgc 840

tatcatatat tataagattt ttaggtgtct tttaatgata ctgtctaaga ataatgacgt 900

attgtgaaat ttgttaatat atataatact taaaaatatg tgagcatgaa actatgcacc 960

tataaatact aaatatgaaa ttttaccatt ttgcgatgtg ttttattcac ttgtgtttgt 1020

atataaatgg tgagaattaa aataaaacgt tatctcattg caaaaatatt ttatttttat 1080

cccatctcac tttaataata aaaatcatgc ttataagcaa catgaattaa gaactgacac 1140

aaaggacaaa aatataaagt tattaatagc catttgaaga aggaggaatt ttagaagagg 1200

tagagaaaat ggaacattaa ccctacactc ggaattccct gaagcaacac tgccagaagt 1260

gtgttttggt atgcactggt tccttaagtg gctgtgatta attattgaaa gtggggtgtt 1320

gaagacccca actactattg tagagtggtc tatttctccc ttcaatcctg tcaatgtttg 1380

ctttacgtat tttggggaac tgttgtttga tgtgtatgtg tttataattg ttatacattt 1440

ttaattgagc cttttattaa catatattgt tatttttgtc tcgaaataat tttttagtta 1500

aaatctattt tgtctgatat tggtgtgaat gctgtacctt tctgacaata aataatattc 1560

gaccatgaat aaaaaaaaaa aaaaagtggg ttcccgggaa ctaagcagtg tagaagatga 1620

ttttgactac accctcctta gagagccata agacacatta gcacatatta gcacattcaa 1680

ggctctgaga gaatgtggtt aactttgttt aactcagcat tcctcacttt ttttttttaa 1740

tcatcagaaa ttctctctct ctctctctct ttttctctcg ctctcttttt tttttttttt 1800

ttacaggaaa tgcctttaaa catcgttgga actaccagag tcaccttaaa ggagatcaat 1860

tctctagact gataaaaatt tcatggcctc ctttaaatgt tgccaaatat atgaattcta 1920

ggatttttcc ttaggaaagg tttttctctt tcagggaaga tctattaact ccccatgggt 1980

gctgaaaata aacttgatgg tgaaaaactc tgtataaatt aatttaaaaa ttatttggtt 2040

tctcttttta attattctgg ggcatagtca tttctaaaag tcactagtag aaagtataat 2100

ttcaagacag aatattctag acatgctagc agtttatatg tattcatgag taatgtgata 2160

tatattgggc gctggtgagg aaggaaggag gaatgagtga ctataaggat ggttaccata 2220

gaaacttcct tttttaccta attgaagaga gactactaca gagtgctaag ctgcatgtgt 2280

catcttacac tagagagaaa tggtaagttt cttgttttat ttaagttatg tttaagcaag 2340

gaaaggattt gttattgaac agtatatttc aggaaggtta gaaagtggcg gttaggatat 2400

attttaaatc tacctaaagc agcatatttt aaaaatttaa aagtattggt attaaattaa 2460

gaaatagagg acagaactag actgatagca gtgacctaga acaatttgag attaggaaag 2520

ttgtgaccat gaatttaagg atttatgtgg atacaaattc tcctttaaag tgtttcttcc 2580

cttaatattt atctgacggt aatttttgag cagtgaatta ctttatatat cttaatagtt 2640

tatttgggac caaacactta aacaaaaagt tctttaagtc atataagcct tttcaggaag 2700

cttgtctcat attcactccc gagacattca cctgccaagt ggcctgagga tcaatccagt 2760

cctaggttta ttttgcagac ttacattctc ccaagttatt cagcctcata tgactccacg 2820

gtcggcttta ccaaaacagt tcagagtgca ctttggcaca caattgggaa cagaacaatc 2880

taatgtgtgg tttggtattc caagtggggt ctttttcaga atctctgcac tagtgtgaga 2940

tgcaaacatg tttcctcatc tttctggctt atccagtatg tagctatttg tgacataata 3000

aatatataca tatatgaaaa ta 3022

<210> 5

<211> 3127

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 5

gccattcgac gacaggttag cgggtttgcc tcccactccc ccagcctcgc gtcgccggct 60

cacagcggcc tcctctgggg acagtccccc ccgggtgccg cctccgccct tcctgtgcgc 120

tccttttcct tcttctttcc tattaaatat tatttgggaa ttgtttaaat ttttttttta 180

aaaaaagaga gaggcgggga ggagtcggag ttgtggagaa gcagagggac tcagtgtggt 240

gtaaaggaat tcattagcca tggatgtatt catgaaagga ctttcaaagg ccaaggaggg 300

agttgtggct gctgctgaga aaaccaaaca gggtgtggca gaagcagcag gaaagacaaa 360

agagggtgtt ctctatgtag gctccaaaac caaggaggga gtggtgcatg gtgtggcaac 420

agtggctgag aagaccaaag agcaagtgac aaatgttgga ggagcagtgg tgacgggtgt 480

gacagcagta gcccagaaga cagtggaggg agcagggagc attgcagcag ccactggctt 540

tgtcaaaaag gaccagttgg gcaaggaagg gtatcaagac tacgaacctg aagcctaaga 600

aatatctttg ctcccagttt cttgagatct gctgacagat gttccatcct gtacaagtgc 660

tcagttccaa tgtgcccagt catgacattt ctcaaagttt ttacagtgta tctcgaagtc 720

ttccatcagc agtgattgaa gtatctgtac ctgcccccac tcagcatttc ggtgcttccc 780

tttcactgaa gtgaatacat ggtagcaggg tctttgtgtg ctgtggattt tgtggcttca 840

atctacgatg ttaaaacaaa ttaaaaacac ctaagtgact accacttatt tctaaatcct 900

cactattttt ttgttgctgt tgttcagaag ttgttagtga tttgctatca tatattataa 960

gatttttagg tgtcttttaa tgatactgtc taagaataat gacgtattgt gaaatttgtt 1020

aatatatata atacttaaaa atatgtgagc atgaaactat gcacctataa atactaaata 1080

tgaaatttta ccattttgcg atgtgtttta ttcacttgtg tttgtatata aatggtgaga 1140

attaaaataa aacgttatct cattgcaaaa atattttatt tttatcccat ctcactttaa 1200

taataaaaat catgcttata agcaacatga attaagaact gacacaaagg acaaaaatat 1260

aaagttatta atagccattt gaagaaggag gaattttaga agaggtagag aaaatggaac 1320

attaacccta cactcggaat tccctgaagc aacactgcca gaagtgtgtt ttggtatgca 1380

ctggttcctt aagtggctgt gattaattat tgaaagtggg gtgttgaaga ccccaactac 1440

tattgtagag tggtctattt ctcccttcaa tcctgtcaat gtttgcttta cgtattttgg 1500

ggaactgttg tttgatgtgt atgtgtttat aattgttata catttttaat tgagcctttt 1560

attaacatat attgttattt ttgtctcgaa ataatttttt agttaaaatc tattttgtct 1620

gatattggtg tgaatgctgt acctttctga caataaataa tattcgacca tgaataaaaa 1680

aaaaaaaaaa gtgggttccc gggaactaag cagtgtagaa gatgattttg actacaccct 1740

ccttagagag ccataagaca cattagcaca tattagcaca ttcaaggctc tgagagaatg 1800

tggttaactt tgtttaactc agcattcctc actttttttt tttaatcatc agaaattctc 1860

tctctctctc tctctttttc tctcgctctc tttttttttt tttttttaca ggaaatgcct 1920

ttaaacatcg ttggaactac cagagtcacc ttaaaggaga tcaattctct agactgataa 1980

aaatttcatg gcctccttta aatgttgcca aatatatgaa ttctaggatt tttccttagg 2040

aaaggttttt ctctttcagg gaagatctat taactcccca tgggtgctga aaataaactt 2100

gatggtgaaa aactctgtat aaattaattt aaaaattatt tggtttctct ttttaattat 2160

tctggggcat agtcatttct aaaagtcact agtagaaagt ataatttcaa gacagaatat 2220

tctagacatg ctagcagttt atatgtattc atgagtaatg tgatatatat tgggcgctgg 2280

tgaggaagga aggaggaatg agtgactata aggatggtta ccatagaaac ttcctttttt 2340

acctaattga agagagacta ctacagagtg ctaagctgca tgtgtcatct tacactagag 2400

agaaatggta agtttcttgt tttatttaag ttatgtttaa gcaaggaaag gatttgttat 2460

tgaacagtat atttcaggaa ggttagaaag tggcggttag gatatatttt aaatctacct 2520

aaagcagcat attttaaaaa tttaaaagta ttggtattaa attaagaaat agaggacaga 2580

actagactga tagcagtgac ctagaacaat ttgagattag gaaagttgtg accatgaatt 2640

taaggattta tgtggataca aattctcctt taaagtgttt cttcccttaa tatttatctg 2700

acggtaattt ttgagcagtg aattacttta tatatcttaa tagtttattt gggaccaaac 2760

acttaaacaa aaagttcttt aagtcatata agccttttca ggaagcttgt ctcatattca 2820

ctcccgagac attcacctgc caagtggcct gaggatcaat ccagtcctag gtttattttg 2880

cagacttaca ttctcccaag ttattcagcc tcatatgact ccacggtcgg ctttaccaaa 2940

acagttcaga gtgcactttg gcacacaatt gggaacagaa caatctaatg tgtggtttgg 3000

tattccaagt ggggtctttt tcagaatctc tgcactagtg tgagatgcaa acatgtttcc 3060

tcatctttct ggcttatcca gtatgtagct atttgtgaca taataaatat atacatatat 3120

gaaaata 3127

<210> 6

<211> 140

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 6

Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val

1 5 10 15

Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys

20 25 30

Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val

35 40 45

Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr

50 55 60

Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys

65 70 75 80

Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys

85 90 95

Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile

100 105 110

Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro

115 120 125

Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala

130 135 140

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense oligonucleotide

<400> 7

taacacattt tcacctct 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 8

ttaacacatt ttcacctc 18

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 9

cttaacacat tttcacct 18

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 10

gcttaacaca ttttcacct 19

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 11

gcttaacaca ttttcacc 18

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 12

cgcttaacac attttcacc 19

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 13

cgcttaacac attttcac 18

<210> 14

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 14

cgcttaacac attttca 17

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 15

tcgcttaaca cattttca 18

<210> 16

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 16

tcgcttaaca cattttc 17

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 17

atcgcttaac acattttc 18

<210> 18

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 18

catcgcttaa cacattt 17

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 19

catcatatcc aatttctt 18

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 20

ccatcatatc caatttctt 19

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 21

accatcatat ccaatttctt 20

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 22

ccatcatatc caatttct 18

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 23

accatcatat ccaatttc 18

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 24

gaccatcata tccaattt 18

<210> 25

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 25

agcgcacagg aagggc 16

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 26

aaggagcgca caggaagggc 20

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 27

ggagcgcaca ggaagggc 18

<210> 28

<400> 28

000

<210> 29

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 29

aggagcgcac aggaaggg 18

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 30

aaaggagcgc acaggaaggg 20

<210> 31

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 31

ggagcgcaca ggaagg 16

<210> 32

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 32

aaggagcgca caggaagg 18

<210> 33

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 33

aaaggagcgc acaggaag 18

<210> 34

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 34

aggagcgcac aggaag 16

<210> 35

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 35

aaggagcgca caggaa 16

<210> 36

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 36

aaaggagcgc acagga 16

<210> 37

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 37

acaattccca aataatatt 19

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 38

aacaattccc aaataatatt 20

<210> 39

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 39

aacaattccc aaataatat 19

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 40

aaacaattcc caaataatat 20

<210> 41

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 41

aacaattccc aaataata 18

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 42

taaacaattc ccaaataata 20

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 43

ttaaacaatt cccaaataat 20

<210> 44

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 44

taaacaattc ccaaataa 18

<210> 45

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 45

ttaaacaatt cccaaata 18

<210> 46

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 46

tttaaacaat tcccaaat 18

<210> 47

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 47

atttaaacaa ttcccaaa 18

<210> 48

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 48

aaaatttaaa caattccc 18

<210> 49

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 49

aaaaatttaa acaattcc 18

<210> 50

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 50

cacaactccg actcct 16

<210> 51

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 51

ccacaactcc gactcc 16

<210> 52

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 52

tccacaactc cgactc 16

<210> 53

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 53

ctccacaact ccgact 16

<210> 54

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 54

cttctccaca actccg 16

<210> 55

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 55

aagggaatat cagaagca 18

<210> 56

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 56

cctaatctct cagccctt 18

<210> 57

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 57

cctaatctct cagccc 16

<210> 58

<211> 14

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 58

atcctcgcgt ttcc 14

<210> 59

<211> 14

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 59

catcctcgcg tttc 14

<210> 60

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 60

gcacttccat ttcattatt 19

<210> 61

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 61

cacttccatt tcattatt 18

<210> 62

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 62

atttagcatc tcccatc 17

<210> 63

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 63

tacactcatt taaccatt 18

<210> 64

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 64

gtacactcat ttaaccatt 19

<210> 65

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 65

gtacactcat ttaaccat 18

<210> 66

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 66

gtacactcat ttaacca 17

<210> 67

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 67

tgtacactca tttaacca 18

<210> 68

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 68

tgtacactca tttaacc 17

<210> 69

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 69

gaaagtcctt tcatga 16

<210> 70

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 70

tgaaagtcct ttcatg 16

<210> 71

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 71

cctttgaaag tccttt 16

<210> 72

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 72

gcctttgaaa gtcctt 16

<210> 73

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 73

ggcctttgaa agtcct 16

<210> 74

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 74

ttggcctttg aaagtc 16

<210> 75

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 75

agcagccaca actccc 16

<210> 76

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 76

tcaatttctt tattctttta 20

<210> 77

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 77

atcaatttct ttattctttt 20

<210> 78

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 78

catcaatttc tttattctt 19

<210> 79

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 79

catcaatttc tttattct 18

<210> 80

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 80

gcatcaattt ctttattc 18

<210> 81

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 81

aagcatcaat ttctttat 18

<210> 82

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 82

aatatttaaa attaactcat 20

<210> 83

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 83

aatatttaaa attaactca 19

<210> 84

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 84

acacttcata aaatatttaa 20

<210> 85

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 85

cacacttcat aaaatattt 19

<210> 86

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 86

tcacacttca taaaatattt 20

<210> 87

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 87

tcacacttca taaaatatt 19

<210> 88

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 88

ttcacacttc ataaaatatt 20

<210> 89

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 89

ttcacacttc ataaaatat 19

<210> 90

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 90

attcacactt cataaaatat 20

<210> 91

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 91

attcacactt cataaaata 19

<210> 92

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 92

taattcacac ttcataaaat 20

<210> 93

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 93

ataattcaca cttcataaa 19

<210> 94

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 94

tataattcac acttcataaa 20

<210> 95

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 95

tataattcac acttcataa 19

<210> 96

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 96

cagtattcca aattccat 18

<210> 97

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 97

tcagtattcc aaattcca 18

<210> 98

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 98

agttcaactc tcaatta 17

<210> 99

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 99

aagttcaact ctcaatta 18

<210> 100

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 100

taagttcaac tctcaat 17

<210> 101

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 101

cattttttat cttaaattct 20

<210> 102

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 102

tcatttttta tcttaaattc 20

<210> 103

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 103

catatttttt actaatca 18

<210> 104

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 104

tcatattttt tactaatca 19

<210> 105

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 105

atcatatttt ttactaatca 20

<210> 106

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 106

tcatattttt tactaatc 18

<210> 107

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 107

atcatatttt ttactaatc 19

<210> 108

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 108

aatcatattt tttactaatc 20

<210> 109

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 109

aatcatattt tttactaat 19

<210> 110

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 110

taaatcatat tttttactaa 20

<210> 111

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 111

ctaaatcata ttttttacta 20

<210> 112

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 112

ctaaatcata ttttttact 19

<210> 113

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 113

tctaaatcat attttttact 20

<210> 114

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 114

ctaaatcata ttttttac 18

<210> 115

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 115

tctaaatcat attttttac 19

<210> 116

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 116

ttctaaatca tattttttac 20

<210> 117

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 117

tttctaaatc atatttttta 20

<210> 118

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 118

ttttctaaat catatttttt 20

<210> 119

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 119

cagttttcta aatcatat 18

<210> 120

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 120

atgtatcaaa ccaatca 17

<210> 121

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 121

catgtatcaa accaatca 18

<210> 122

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 122

catgtatcaa accaatc 17

<210> 123

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 123

ccatgtatca aaccaatc 18

<210> 124

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 124

ccatgtatca aaccaat 17

<210> 125

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 125

accatgtatc aaaccaa 17

<210> 126

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 126

agatcctacc atttacaac 19

<210> 127

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 127

aagatcctac catttaca 18

<210> 128

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 128

tattacatat tcactaaa 18

<210> 129

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 129

aatctctatc tctcatcc 18

<210> 130

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 130

caatctctat ctctcatc 18

<210> 131

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 131

gattcaaatt ttacttcca 19

<210> 132

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 132

attcaaattt tacttcca 18

<210> 133

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 133

tttatcacaa cctctttcc 19

<210> 134

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 134

ctctttatca caacctct 18

<210> 135

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 135

cactctttat cacaacct 18

<210> 136

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 136

cactctttat cacaacc 17

<210> 137

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 137

tcactcttta tcacaacc 18

<210> 138

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 138

ttcactcttt atcacaacc 19

<210> 139

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 139

cttcactctt tatcacaacc 20

<210> 140

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 140

tcactcttta tcacaac 17

<210> 141

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 141

ttcactcttt atcacaac 18

<210> 142

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 142

ccttcactct ttatcacaac 20

<210> 143

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 143

accttcactc tttatcacaa 20

<210> 144

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 144

ccttcactct ttatcaca 18

<210> 145

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 145

accttcactc tttatcaca 19

<210> 146

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 146

caccttcact ctttatcaca 20

<210> 147

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 147

accttcactc tttatcac 18

<210> 148

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 148

caccttcact ctttatcac 19

<210> 149

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 149

caccttcact ctttatca 18

<210> 150

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 150

tattcatatc ctctctaa 18

<210> 151

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 151

ataagcacat tcaaacta 18

<210> 152

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 152

ttacctattt aaaaatact 19

<210> 153

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 153

tttacctatt taaaaatact 20

<210> 154

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 154

ttactataaa ttaaacata 19

<210> 155

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 155

ctataccata acaatacaaa 20

<210> 156

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 156

tataccataa caatacaa 18

<210> 157

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 157

ctataccata acaatacaa 19

<210> 158

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 158

gctataccat aacaataca 19

<210> 159

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 159

ctataccata acaataca 18

<210> 160

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 160

agctatacca taacaatac 19

<210> 161

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 161

ctataccata acaatac 17

<210> 162

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 162

gctataccat aacaatac 18

<210> 163

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 163

agctatacca taacaata 18

<210> 164

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 164

tagctatacc ataacaat 18

<210> 165

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 165

tagctatacc ataacaa 17

<210> 166

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 166

atagctatac cataacaa 18

<210> 167

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 167

atagctatac cataaca 17

<210> 168

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 168

aatagctata ccataaca 18

<210> 169

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 169

aatagctata ccataac 17

<210> 170

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 170

taagattccc atatcatt 18

<210> 171

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 171

tcacaatatc atatttata 19

<210> 172

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 172

ttcacaatat catatttata 20

<210> 173

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 173

cacaatatca tatttata 18

<210> 174

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 174

ttcacaatat catatttat 19

<210> 175

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 175

cttcacaata tcatatttat 20

<210> 176

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 176

tcacaatatc atatttat 18

<210> 177

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 177

cttcacaata tcatattta 19

<210> 178

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 178

ttcacaatat catattta 18

<210> 179

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 179

cttcacaata tcatattt 18

<210> 180

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 180

gcttcacaat atcatatt 18

<210> 181

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 181

tgcttcacaa tatcatat 18

<210> 182

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 182

atgcttcaca atatcata 18

<210> 183

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 183

cttcctcaac tactaaat 18

<210> 184

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 184

gttcttcctc aactactaa 19

<210> 185

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 185

actagtttca ttcaaccc 18

<210> 186

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 186

actagtttca ttcaacc 17

<210> 187

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 187

cactagtttc attcaac 17

<210> 188

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 188

ctttatatta aataaccct 19

<210> 189

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 189

actttatatt aaataaccct 20

<210> 190

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 190

actttatatt aaataaccc 19

<210> 191

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 191

agcactttat attaaata 18

<210> 192

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 192

ttatttcttc tcataatta 19

<210> 193

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 193

ttgatattat ctaacta 17

<210> 194

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 194

cattgatatt atctaac 17

<210> 195

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 195

taagaatcaa aaccttca 18

<210> 196

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 196

ataagaatca aaaccttc 18

<210> 197

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 197

tttctttata ttatttcata 20

<210> 198

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 198

ttttctttat attatttcat 20

<210> 199

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 199

cacatttaaa aacatttct 19

<210> 200

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 200

acacatttaa aaacatttct 20

<210> 201

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 201

gacacattta aaaacattt 19

<210> 202

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 202

cgacacattt aaaaacatt 19

<210> 203

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 203

cgacacattt aaaaacat 18

<210> 204

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 204

tcgacacatt taaaaaca 18

<210> 205

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 205

tattattata atcataaa 18

<210> 206

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 206

ttattattat aatcataa 18

<210> 207

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 207

cataaatttt ataatatct 19

<210> 208

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 208

ccataaattt tataatatc 19

<210> 209

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 209

ccataaattt tataatat 18

<210> 210

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 210

gccataaatt ttataata 18

<210> 211

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 211

agccataaat tttataat 18

<210> 212

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 212

cagccataaa ttttataa 18

<210> 213

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 213

agctatttac aattcaaa 18

<210> 214

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 214

catacttcta tttatttatt 20

<210> 215

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 215

acatacttct atttatttat 20

<210> 216

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 216

tacatacttc tatttattta 20

<210> 217

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 217

atacatactt ctatttattt 20

<210> 218

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 218

aatacatact tctatttatt 20

<210> 219

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 219

caatacatac ttctatttat 20

<210> 220

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 220

aatacatact tctattta 18

<210> 221

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 221

caatacatac ttctattt 18

<210> 222

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 222

atttctttat ttcaattca 19

<210> 223

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 223

tatttcttta tttcaattca 20

<210> 224

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 224

tatttcttta tttcaattc 19

<210> 225

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 225

atatttcttt atttcaattc 20

<210> 226

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 226

aatatttctt tatttcaatt 20

<210> 227

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 227

aatatttctt tatttcaa 18

<210> 228

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 228

taaaatcatt ccacttccac 20

<210> 229

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 229

aaaatcattc cacttcca 18

<210> 230

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 230

taaaatcatt ccacttcca 19

<210> 231

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 231

ttaaaatcat tccacttcca 20

<210> 232

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 232

ttaaaatcat tccacttcc 19

<210> 233

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 233

ctccaacatt tgtcac 16

<210> 234

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 234

cctccaacat ttgtca 16

<210> 235

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 235

gctcctccaa catttg 16

<210> 236

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 236

tcttctgggc tactgc 16

<210> 237

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 237

ttgacaaagc cagtgg 16

<210> 238

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 238

aaatctacct caaaactat 19

<210> 239

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 239

gaattttaaa atctacctc 19

<210> 240

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 240

aataaatata tttcactctc 20

<210> 241

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 241

ctccttaatt taataaat 18

<210> 242

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 242

cctccttaat ttaataaa 18

<210> 243

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 243

aacttctttc tcacaatttt 20

<210> 244

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 244

taaaacttct ttctcacaat 20

<210> 245

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 245

taaaacttct ttctcacaa 19

<210> 246

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 246

ataaaacttc tttctcacaa 20

<210> 247

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 247

taaaacttct ttctcaca 18

<210> 248

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 248

ataaaacttc tttctcaca 19

<210> 249

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 249

aataaaactt ctttctcaca 20

<210> 250

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 250

ataaaacttc tttctcac 18

<210> 251

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 251

aataaaactt ctttctcac 19

<210> 252

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 252

aaataaaact tctttctca 19

<210> 253

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 253

taatataatt attatcccta 20

<210> 254

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 254

taatataatt attatccct 19

<210> 255

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 255

ttaatataat tattatccct 20

<210> 256

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 256

taatataatt attatccc 18

<210> 257

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 257

ttaatataat tattatccc 19

<210> 258

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 258

attaatataa ttattatccc 20

<210> 259

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 259

attaatataa ttattatcc 19

<210> 260

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 260

gtttatttcc acaactat 18

<210> 261

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 261

atgtttattt ccacaact 18

<210> 262

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 262

aatgtttatt tccacaac 18

<210> 263

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 263

acaaattaaa tactttcatt 20

<210> 264

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 264

acaaattaaa tactttcat 19

<210> 265

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 265

aacaaattaa atactttcat 20

<210> 266

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 266

aacaaattaa atactttca 19

<210> 267

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 267

attaatccac ttctacaa 18

<210> 268

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 268

cattaatcca cttctacaa 19

<210> 269

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 269

ccattaatcc acttctacaa 20

<210> 270

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 270

cattaatcca cttctaca 18

<210> 271

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 271

ccattaatcc acttctaca 19

<210> 272

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 272

cattaatcca cttctac 17

<210> 273

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 273

gccattaatc cacttcta 18

<210> 274

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 274

gccattaatc cacttct 17

<210> 275

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 275

ctctatataa catcact 17

<210> 276

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 276

ttctctatat aacatcact 19

<210> 277

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 277

tctctatata acatcac 17

<210> 278

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 278

tttctctata taacatcac 19

<210> 279

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 279

attttctcta tataacatc 19

<210> 280

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 280

aattttctct atataacatc 20

<210> 281

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 281

aattttctct atataacat 19

<210> 282

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 282

aaattttctc tatataacat 20

<210> 283

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 283

taaattttct ctatataaca 20

<210> 284

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 284

taaattttct ctatataac 19

<210> 285

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 285

ataaattttc tctatataac 20

<210> 286

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 286

ataaattttc tctatataa 19

<210> 287

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 287

tataaatttt ctctatataa 20

<210> 288

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 288

atataaattt tctctatata 20

<210> 289

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 289

aatataaatt ttctctatat 20

<210> 290

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 290

atataaattt tctctatat 19

<210> 291

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 291

ataaattaaa atatttctcc 20

<210> 292

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 292

tataaattaa aatatttctc 20

<210> 293

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 293

ctataaatta aaatatttct 20

<210> 294

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 294

aatttttctt taataatcac 20

<210> 295

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 295

aacttttaca taccacatt 19

<210> 296

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 296

aacttttaca taccacat 18

<210> 297

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 297

ctttgacaaa caaaacta 18

<210> 298

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 298

atcctataat acatttcttt 20

<210> 299

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 299

actcatccta taataca 17

<210> 300

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 300

ccactcatcc tataataca 19

<210> 301

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 301

cccactcatc ctataatac 19

<210> 302

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 302

cccactcatc ctataata 18

<210> 303

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 303

cccactcatc ctataat 17

<210> 304

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 304

tatcccactc atcctataa 19

<210> 305

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 305

taagtatctc aaaacatc 18

<210> 306

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 306

gtttattatc aaattaca 18

<210> 307

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 307

agtttattat caaattac 18

<210> 308

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 308

acatcttatc ctatttat 18

<210> 309

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 309

cacatcttat cctatttat 19

<210> 310

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 310

acacatctta tcctatttat 20

<210> 311

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 311

cacatcttat cctattta 18

<210> 312

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 312

acacatctta tcctattta 19

<210> 313

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 313

acacatctta tcctattt 18

<210> 314

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 314

taatatataa acacatctta 20

<210> 315

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 315

taatatataa acacatctt 19

<210> 316

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 316

ataatatata aacacatctt 20

<210> 317

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 317

aataatatat aaacacatct 20

<210> 318

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 318

aataatatat aaacacatc 19

<210> 319

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 319

taatctattt attcaacaa 19

<210> 320

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 320

ataatctatt tattcaacaa 20

<210> 321

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 321

ataatctatt tattcaaca 19

<210> 322

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 322

aataatctat ttattcaaca 20

<210> 323

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 323

ataatctatt tattcaac 18

<210> 324

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 324

aataatctat ttattcaac 19

<210> 325

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 325

attattcatc acaatcca 18

<210> 326

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 326

cattattcat cacaatcca 19

<210> 327

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 327

acattattca tcacaatcca 20

<210> 328

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 328

attattcatc acaatcc 17

<210> 329

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 329

cattattcat cacaatcc 18

<210> 330

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 330

acattattca tcacaatcc 19

<210> 331

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 331

tacattattc atcacaatcc 20

<210> 332

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 332

acattattca tcacaatc 18

<210> 333

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 333

tacattattc atcacaatc 19

<210> 334

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 334

gtacattatt catcacaat 19

<210> 335

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 335

gtacattatt catcacaa 18

<210> 336

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 336

tgtacattat tcatcaca 18

<210> 337

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 337

tgtttcaaac tcataaat 18

<210> 338

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 338

ttgtttcaaa ctcataaa 18

<210> 339

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 339

ttcaacattt ttatttcaca 20

<210> 340

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 340

ttcaacattt ttatttcac 19

<210> 341

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 341

attcaacatt tttatttcac 20

<210> 342

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 342

attcaacatt tttatttca 19

<210> 343

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 343

aattcaacat ttttatttca 20

<210> 344

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 344

taattcaaca tttttatttc 20

<210> 345

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 345

ttaattcaac atttttattt 20

<210> 346

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 346

tttaattcaa catttttatt 20

<210> 347

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 347

atttaattca acatttttat 20

<210> 348

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 348

catttaattc aacattttta 20

<210> 349

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 349

catttaattc aacattttt 19

<210> 350

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 350

tcatttaatt caacattttt 20

<210> 351

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 351

tcatttaatt caacatttt 19

<210> 352

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 352

ctcatttaat tcaacatttt 20

<210> 353

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 353

ctcatttaat tcaacattt 19

<210> 354

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 354

actcatttaa ttcaacattt 20

<210> 355

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 355

actcatttaa ttcaacatt 19

<210> 356

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 356

actcatttaa ttcaacat 18

<210> 357

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 357

gaactcattt aattcaaca 19

<210> 358

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 358

ttgaactcat ttaattca 18

<210> 359

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 359

ttaatatcat caaactacaa 20

<210> 360

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 360

acttaatatc atcaaactac 20

<210> 361

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 361

ttaatatcat caaactac 18

<210> 362

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 362

tacttaatat catcaaacta 20

<210> 363

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 363

cttaatatca tcaaacta 18

<210> 364

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 364

cttacttaat atcatcaaac 20

<210> 365

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 365

ttacttactt aatatcatca 20

<210> 366

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 366

atttacttac ttaatatc 18

<210> 367

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 367

aatttactta cttaatatc 19

<210> 368

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 368

caatttactt acttaatatc 20

<210> 369

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 369

caatttactt acttaatat 19

<210> 370

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 370

acaatttact tacttaatat 20

<210> 371

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 371

caatttactt acttaata 18

<210> 372

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 372

acaatttact tacttaata 19

<210> 373

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 373

tacaatttac ttacttaata 20

<210> 374

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 374

acaatttact tacttaat 18

<210> 375

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 375

tacaatttac ttacttaat 19

<210> 376

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 376

atacaattta cttacttaat 20

<210> 377

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 377

tatacaattt acttacttaa 20

<210> 378

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 378

tatacaattt acttactta 19

<210> 379

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 379

ttatacaatt tacttactta 20

<210> 380

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 380

ttatacaatt tacttactt 19

<210> 381

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 381

ttatacaatt tacttact 18

<210> 382

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 382

gttatacaat ttacttac 18

<210> 383

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 383

ccattctaat tataccat 18

<210> 384

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 384

ccattctaat tatacca 17

<210> 385

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 385

ctgataatct ctctaaat 18

<210> 386

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 386

aatagcatcc ttccacac 18

<210> 387

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 387

aatagcatcc ttccaca 17

<210> 388

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 388

caatagcatc cttccac 17

<210> 389

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 389

aataagaaag gaacgc 16

<210> 390

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 390

actatgatac ttcactc 17

<210> 391

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 391

ttactcctac aaattttttt 20

<210> 392

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 392

ttactcctac aaatttttt 19

<210> 393

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 393

attactccta caaatttttt 20

<210> 394

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 394

ttactcctac aaattttt 18

<210> 395

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 395

attactccta caaattttt 19

<210> 396

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 396

aattactcct acaaattttt 20

<210> 397

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 397

caattactcc tacaaatttt 20

<210> 398

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 398

caattactcc tacaaattt 19

<210> 399

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 399

ccaattactc ctacaaattt 20

<210> 400

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 400

ccaattactc ctacaaatt 19

<210> 401

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 401

caattactcc tacaaatt 18

<210> 402

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 402

ttgttacctt tcaataaa 18

<210> 403

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 403

ccaaaaacat acaactat 18

<210> 404

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 404

tccaaaaaca tacaactat 19

<210> 405

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 405

ttccaaaaac atacaactat 20

<210> 406

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 406

ttccaaaaac atacaacta 19

<210> 407

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 407

cttccaaaaa catacaacta 20

<210> 408

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 408

cttccaaaaa catacaact 19

<210> 409

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 409

cttccaaaaa catacaac 18

<210> 410

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 410

tacttccaaa aacatacaac 20

<210> 411

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 411

ctacttccaa aaacatacaa 20

<210> 412

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 412

tacttccaaa aacatacaa 19

<210> 413

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 413

tctacttcca aaaacataca 20

<210> 414

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 414

ctacttccaa aaacataca 19

<210> 415

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 415

ttctacttcc aaaaacata 19

<210> 416

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 416

attctacttc caaaaacata 20

<210> 417

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 417

attctacttc caaaaacat 19

<210> 418

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 418

attctacttc caaaaaca 18

<210> 419

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 419

aaccaatttc tatttaca 18

<210> 420

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 420

caaccaattt ctatttaca 19

<210> 421

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 421

acaaccaatt tctatttaca 20

<210> 422

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 422

acaaccaatt tctatttac 19

<210> 423

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 423

aacaaccaat ttctatttac 20

<210> 424

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 424

acaaccaatt tctattta 18

<210> 425

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 425

aacaaccaat ttctattta 19

<210> 426

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 426

tctaaacaac caatttct 18

<210> 427

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 427

aacactacca tatatttcat 20

<210> 428

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 428

aacactacca tatatttca 19

<210> 429

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 429

aacactacca tatatttc 18

<210> 430

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 430

ccctcatatt ctataata 18

<210> 431

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 431

ccctcatatt ctataa 16

<210> 432

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 432

aaaattaatt tatttccca 19

<210> 433

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 433

gaaaattaat ttatttccc 19

<210> 434

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 434

gaaaatactt aacattata 19

<210> 435

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 435

tgatattcct aatcttct 18

<210> 436

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 436

ttgatattcc taatcttc 18

<210> 437

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 437

ttgatattcc taatctt 17

<210> 438

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 438

ccagatcaaa cattaaa 17

<210> 439

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 439

ttattctatc aattataa 18

<210> 440

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 440

tttattctat caattataa 19

<210> 441

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 441

ttttattcta tcaattataa 20

<210> 442

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 442

attttattct atcaattata 20

<210> 443

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 443

tttattctat caattata 18

<210> 444

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 444

ttttattcta tcaattata 19

<210> 445

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 445

attttattct atcaattat 19

<210> 446

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 446

gattttattc tatcaatt 18

<210> 447

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 447

ctgattttat tctatcaa 18

<210> 448

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 448

gcaaaaataa ttccataca 19

<210> 449

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 449

tactaacttc tctcccaat 19

<210> 450

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 450

atactaactt ctctcccaat 20

<210> 451

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 451

actaacttct ctcccaa 17

<210> 452

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 452

atactaactt ctctcccaa 19

<210> 453

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 453

catactaact tctctcccaa 20

<210> 454

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 454

catactaact tctctccca 19

<210> 455

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 455

atcatactaa cttctctccc 20

<210> 456

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 456

catactaact tctctccc 18

<210> 457

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 457

tatcatacta acttctctcc 20

<210> 458

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 458

tcatactaac ttctctcc 18

<210> 459

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 459

atcatactaa cttctctcc 19

<210> 460

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 460

atatcatact aacttctctc 20

<210> 461

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 461

atcatactaa cttctctc 18

<210> 462

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 462

atatcatact aacttctct 19

<210> 463

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 463

tatcatacta acttctc 17

<210> 464

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 464

attatatatc cttaacta 18

<210> 465

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 465

cattatatat ccttaacta 19

<210> 466

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 466

acattatata tccttaacta 20

<210> 467

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 467

cattatatat ccttaact 18

<210> 468

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 468

acattatata tccttaact 19

<210> 469

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 469

cacattatat atccttaact 20

<210> 470

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 470

cattatatat ccttaac 17

<210> 471

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 471

acattatata tccttaac 18

<210> 472

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 472

cacattatat atccttaac 19

<210> 473

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 473

ccacattata tatccttaac 20

<210> 474

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 474

cacattatat atccttaa 18

<210> 475

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 475

ccacattata tatccttaa 19

<210> 476

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 476

ccacattata tatcctta 18

<210> 477

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 477

gccacattat atatcctta 19

<210> 478

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 478

gccacattat atatcctt 18

<210> 479

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 479

gccacattat atatcct 17

<210> 480

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 480

tcaattaaat aaacctct 18

<210> 481

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 481

catatactcc attaccc 17

<210> 482

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 482

ccatatactc cattaccc 18

<210> 483

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 483

cccatatact ccattacc 18

<210> 484

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 484

cccatatact ccattac 17

<210> 485

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 485

cattcccata tactccat 18

<210> 486

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 486

atcttacatt cacatatt 18

<210> 487

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 487

taaatcttac attcacatat 20

<210> 488

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 488

taaatcttac attcacat 18

<210> 489

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 489

tacattaatc tataattaaa 20

<210> 490

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 490

tacattaatc tataattaa 19

<210> 491

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 491

gtacattaat ctataatt 18

<210> 492

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 492

tgtacattaa tctataat 18

<210> 493

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 493

atgtacatta atctataa 18

<210> 494

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 494

taaaataaca ttatactca 19

<210> 495

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 495

gtaaaataac attatactc 19

<210> 496

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 496

gtaaaataac attatact 18

<210> 497

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 497

tatattattt tcatacttt 19

<210> 498

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 498

ctatattatt ttcatacttt 20

<210> 499

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 499

ctatattatt ttcatactt 19

<210> 500

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 500

cctatattat tttcatactt 20

<210> 501

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 501

ctatattatt ttcatact 18

<210> 502

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 502

cctatattat tttcatact 19

<210> 503

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 503

acctatatta ttttcatact 20

<210> 504

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 504

cctatattat tttcatac 18

<210> 505

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 505

acctatatta ttttcatac 19

<210> 506

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 506

cacctatatt attttcatac 20

<210> 507

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 507

cacctatatt attttcata 19

<210> 508

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 508

acacctatat tattttcata 20

<210> 509

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 509

cacctatatt attttcat 18

<210> 510

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 510

acacctatat tattttcat 19

<210> 511

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 511

gacacctata ttattttca 19

<210> 512

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 512

gacacctata ttattttc 18

<210> 513

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 513

tgacacctat attatttt 18

<210> 514

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 514

atcactgaca cctatat 17

<210> 515

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 515

gctaaatatt actcactc 18

<210> 516

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 516

ttgctaaata ttactcac 18

<210> 517

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 517

cttgctaaat attactca 18

<210> 518

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 518

cacattaact actcatat 18

<210> 519

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 519

acacattaac tactcatat 19

<210> 520

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 520

tacacattaa ctactcatat 20

<210> 521

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 521

cacattaact actcata 17

<210> 522

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 522

acacattaac tactcata 18

<210> 523

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 523

tacacattaa ctactcata 19

<210> 524

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 524

tacacattaa ctactcat 18

<210> 525

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 525

gtacacatta actactcat 19

<210> 526

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 526

agtacacatt aactactca 19

<210> 527

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 527

gtacacatta actactc 17

<210> 528

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 528

agtacacatt aactactc 18

<210> 529

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 529

tatatcttca ttattttccc 20

<210> 530

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 530

tatatcttca ttattttcc 19

<210> 531

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 531

catatatctt cattattt 18

<210> 532

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 532

atcatatatc ttcattattt 20

<210> 533

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 533

aatcatatat cttcattatt 20

<210> 534

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 534

caatacaact taattcca 18

<210> 535

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 535

caacccacta aataata 17

<210> 536

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 536

gcaacccact aaataata 18

<210> 537

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 537

gcaacccact aaataat 17

<210> 538

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 538

agcaacccac taaataa 17

<210> 539

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 539

tcttaatttt tttctattat 20

<210> 540

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 540

ctcttaattt ttttctatta 20

<210> 541

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 541

atctcttaat ttttttctat 20

<210> 542

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 542

aatctcttaa tttttttcta 20

<210> 543

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 543

caatctctta atttttttc 19

<210> 544

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 544

tcaatctctt aatttttttc 20

<210> 545

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 545

atactcaatc tcttaatttt 20

<210> 546

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 546

atactcaatc tcttaattt 19

<210> 547

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 547

atactcaatc tcttaatt 18

<210> 548

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 548

gatactcaat ctcttaatt 19

<210> 549

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 549

gatactcaat ctcttaat 18

<210> 550

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 550

gatactcaat ctcttaa 17

<210> 551

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 551

aaatattctt acttctatt 19

<210> 552

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 552

aaaatattct tacttctatt 20

<210> 553

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 553

aaatattctt acttctat 18

<210> 554

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 554

aaaatattct tacttctat 19

<210> 555

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 555

caaaatattc ttacttctat 20

<210> 556

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 556

caaaatattc ttacttcta 19

<210> 557

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 557

tcaaaatatt cttacttcta 20

<210> 558

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 558

tcaaaatatt cttacttct 19

<210> 559

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 559

gtcaaaatat tcttacttc 19

<210> 560

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 560

taaatattcc ttaaccta 18

<210> 561

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense Oligonucleotide

<400> 561

ttaaatattc cttaaccta 19

<210> 562

<211> 20

<212> DNA