Способ получения композиционных биоматериалов хитозан/гидроксиапатит Российский патент 2021 года по МПК C08J5/00 C08J5/18 A61L27/12 A61K31/722 

Изобретение относится к получению композиционных биоматериалов на основе природных полимеров, а именно, хитозана, и кальций фосфатов, в частности гидроксиапатита, и может найти применение при получении сорбентов, мембран, покрытий, а также материалов, применяемых в биотехнологических целях, в инженерии костных тканей, получившей интенсивное развитие в последнее время, при изготовлении функциональных биоматериалов для медицины и ветеринарии, в частности, предназначенных для протезирования.

Известен способ получения обладающего гомогенной кристаллической наноструктурой композиционного материала, содержащего в своем составе хитозан (ХТЗ) и гидроксиапатит (ГА) в соотношении от 20/80 до 80/20 (в мас.%), (Yamaguchi I. et al. Preparation and microstructure analysis of chitosan/hydroxyapatite nanocomposites. J. Biomed Mater. Res. 2001. V. 55. P. 20-27). Согласно известному способу, 3% раствор ХТЗ в 1% уксусной кислоте в расчетном количестве добавляют к 8,5% раствору H₃PO₄. Подготовленную смесь при 25°С по каплям вводят в суспензию 0,5М Са(ОН)₂ при энергичном перемешивании до достижения значения рН~9,0 с получением осадка композиционного материала. Полученный осадок отстаивают в течение 24 ч при встряхивании, затем отфильтровывают, промывают и прессуют в виде пленки либо придают ему объемную форму под давлением 20 МПа, после чего в течение 20 минут подвергают в автоклаве воздействию насыщенного водяного пара при 120°С. Свойства полученного известным способом композиционного материала, проявляющего высокую остеоиндуктивность и одновременно необходимую механическую прочность и гибкость, предполагают его успешное использование в имплантационной хирургии. Однако, это единственная область его применения, поскольку способ является узконаправленным.

Известен способ получения композиционного материала, имеющего состав и микроструктуру натуральной кости, на основе гидроксиапатита Са₅(PO₄)₃ОН и хитозана (A. Rogina et al. Preparation and characterization of nano-hydroxyapatite within chitosan matrix. Materials Science and Engineering C. 2013. V. 33. P. 4539-4544). Апатитную фазу получают методом соосаждения с использованием 1,2% раствора в 2% уксусной кислоте. К полученному раствору добавляют при перемешивании кальцит СаСО₃ в количестве, достаточном для формирования в составе композита 33 мас.% гидроксиапатита. Затем в реакционную смесь вводят фосфат мочевины СО(NH₂)₂⋅H₃PO₄ в количестве, обеспечивающем соотношение Са: Р=1,67. Смесь встряхивают в течение трех дней. После этого медленно, по каплям, добавляют раствор аммиака до достижения значения рН 8,5. Полученный гидрогель с осажденным хитозаном промывают деминерализованной водой и высушивают при комнатной температуре с получением композитных образцов в виде пленок. Недостатком способа является значительная неоднородность увеличения в ходе синтеза значения рН в реакционной смеси, что отрицательно влияет на равномерность формирования и качество конечного продукта. Для компенсации неоднородности увеличения значения рН и уменьшения обусловленных этой неоднородностью локальных различий в протекании реакции синтеза ее проводят без аммиака. В этом случае процесс организуют таким образом, чтобы необходимое количество аммиака поступало реакционную смесь в результате гидролиза мочевины при 50°С в течение 5 дней. При этом после высушивания образовавшегося коллоидного раствора получают композиционный материал в виде пленки. Локальное увеличение значения рН в ходе реакции синтеза и принимаемые меры по борьбе с этим явлением в значительной мере усложняют известный способ и увеличивают затраты времени на его осуществление.

Известен способ получения высокопористых биокомпозитов хитозан/гидроксиапатит (A. Rogina et al. Effect of in situ formed hydroxyapatite on microstructure of freeze-gelled chitosan-based biocomposite scaffolds. European Polymer J. 2015. V. 68. P. 278-287), осуществляемый следующим образом. Кальцит СаСО₃ в количестве, обеспечивающем содержание в формируемом композите от 0 до 60 мас.% гидроксиапатита, суспендируют в 1,2% растворе хитозана, приготовленном в 0,36% уксусной кислоте. К нему при температуре 50°С добавляют расчетное количество фосфата мочевины, которое необходимо для обеспечения соотношения Са: Р=1,67. Реакционную смесь встряхивают в течение 4 суток, поддерживая заданную температуру 50°С. Часть полученной суспензии высушивают при 37°С до образования композиционной пленки толщиной 0,2-0,5 мм. Для получения объемного пористого материала ее другую часть помещают на холод и выдерживают при минус 22°С в течение 18 часов. Затем замороженные образцы при достигнутой температуре погружают на 12 часов в нейтрализующую среду, содержащую 1М NaOH и этанол в объемном соотношении 1:1. После этого указанные образцы при той же температуре перемещают в этанол на 12 ч и завершают процесс испарением этанола в течение одних суток при температуре окружающей среды и окончательной дегидратацией формируемых образцов. К недостаткам известного способа относятся длительность и многоступенчатость процедуры получения композита, необходимость использования горючего растворителя, при этом получаемый композит не обладает достаточной механической прочностью.

Известен способ получения композиционного материала для использования в инженерии костных тканей, содержащего наногибридный каркас из гидроксиапатита, кристаллизующегося in situ в хитозановой матрице (J.Chenetal. Characterization and biocompatibility of nanohybrid scaffold prepared via crystallization of hydroxyapatite in chitosan matrix. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 81 (2010). P. 640-647). В известном способе к раствору хитозана в 2% (по объему) уксусной кислоте добавляют по каплям растворы Са(NO₃)₂ и K₂HPO₄ в количествах, обеспечивающих соотношение Са:Р=1,67. Содержание хитозана в конечном растворе составляет 20 г/л, содержание гидроксиапатита, с учетом введенных растворов Са(NO₃)₂ и K₂HPO₄, равно 12 г/л. Полученную смесь после перемешивания в течение 3 часов помещают в планшет с 24 ячейками и выдерживают еще 3 часа при температуре минус 4°С. Затем ее подвергают вакуумно-лиофильному вымораживанию при минус 20°С с формированием пористого каркаса, который пропитывают 5% (по весу) водно-этанольным (деионизированная вода: этанол в объемном отношении 1:1) раствором щелочи NaOH при комнатной температуре, выдерживают в течение 10 часов, несколько раз промывают деионизированной водой до нейтральной реакции и повторно подвергают лиофилизации с получением окончательной пористой структуры (хитозан/гидроксиапатит). Область применения полученного известным способом композиционного материала четко ограничена регенерацией костных тканей, что нерационально с экономической точки зрения.

Наиболее близким к заявляемому является способ получения биосовместимых композиционных материалов хитозан/гидроксиапатит (S.N. Danilchenko et al. Chitosan-hydroxyapatite composite biomaterials made by a one step co-precipitation method: preparation, characterization and in vivo tests. J. Biological Physics and Chemistry 9 (2009). P. 119-126), для осуществления которого к 0,2% раствору хитозана в 1% уксусной кислоте добавляют водные растворы хлорида кальция и дигидрофосфата аммония в количествах, обеспечивающих мольное соотношение кальций: фосфор = 1,67. Необходимый для осаждения гидроксиапатита уровень рН поддерживают добавлением раствора щелочи NaOH. Продукт синтеза выдерживают для старения при комнатной температуре в течение 24 ч, промывают и высушивают.

К недостаткам известного способа относится неоднородность возрастания в процессе синтеза значения рН в объеме реакционной смеси при добавлении щелочи и, как следствие, неравномерность формирования получаемого материала и его недостаточно высокая механическая прочность. Кроме того, известный способ является узконаправленным; полученные с его помощью материалы предназначены исключительно для костного протезирования и обладают соответствующей заменяемой кости структурой и остеоиндуктивными свойствами. Но способ не обеспечивает возможности изменения структуры и свойств изготавливаемых материалов для их применения в других областях, что на практике экономически себя не оправдывает.

Задачей изобретения является создание экономически эффективного способа получения механически прочных композиционных биоматериалов хитозан/гидроксиапатит с широким спектром применения.

Технический результат предлагаемого способа заключается в обеспечении однородного увеличения значения рН по всему объему реакционной смеси в ходе синтеза композиционного материала и в улучшении условий его формирования, что позволяет повысить механическую прочность получаемого материала и одновременно дает возможность получать композиционные материалы для различных областей применения с одним составом, но с разными свойствами, обладающие разной кристаллической структурой минеральной составляющей и хитозана.

Указанный технический результат достигают способом получения композиционного биоматериала хитозан/гидроксиапатит, включающим приготовление раствора хитозана в разбавленной кислоте, введение в полученный раствор растворимой соли кальция и дигидрофосфата щелочного металла в количествах, обеспечивающих соотношение Са: Р=1,67, повышение рН реакционной смеси и получение кальций фосфат содержащего осадка, согласно которому, в отличие от известного, готовят 1% раствор хитозана в 0,1М соляной кислоте, в качестве растворимой соли кальция берут хлорид либо нитрат, в качестве дигидрофосфата щелочного металла используют дигидрофосфат калия, для повышения значения рН реакционной смеси ее помещают в атмосферу аммиака NH₃ на 50-60 минут с перемешиванием до достижения значения рН~10, образовавшийся осадок в неизменном состоянии переносят в термостатированный сушильный шкаф с температурой 95-105°С и выдерживают 10-12 часов до его полного высушивания с получением композиционного материала в виде пленки, содержащей кальций фосфатную фазу со структурой, отличающейся от апатитовой, конверсию которой в апатитовую осуществляют путем обработки 0,1М раствором NaOH, после чего промывают деионизированной водой и высушивают.

В преимущественном варианте осуществления способа обработку композиционного материала 0,1М раствором NaOH с конверсией неапатитовой структуры кальций фосфатной фазы в апатитовую осуществляют в течение 10-12 часов при температуре 95-105°С.

В другом преимущественном варианте осуществления способа обработку композиционного материала 0,1М раствором NaOH с конверсией неапатитовой структуры в апатитовую осуществляют в течение 5 дней при комнатной температуре.

Способ осуществляют следующим образом, в два этапа.

На первом этапе готовят 1% раствор хитозана в 0,1М соляной кислоте. Хитозан представляет собой производное линейного полисахарида в виде нерастворимой в воде клетчатки; он является производным хитина, который получают из панцирей и скорлупы таких морских обитателей, как креветки, омары и крабы.

В полученный раствор вносят расчетное количество растворимой соли кальция, преимущественно хлорида либо нитрата, и перемешивают до ее полного растворения. Добавляют по каплям раствор дигидрофосфата калия KH₂PO₄, достигая в реакционной смеси мольного соотношения Са: Р=1,67 и образования кальций фосфатной фазы.

Реакционную смесь, содержащую кальций фосфатную фазу, помещают в закрытый объем, содержащий аммиак NH₃, и выдерживают в атмосфере аммиака 50-60 мин при постоянном перемешивании до повышения значения рН примерно до 10, контролируя процесс по изменению ее цвета. При повышении значения рН до 9,5-10,0 цвет реакционной смеси во всем объеме становится мутно-белым, что свидетельствует о произошедшей реакции. Непосредственно после этого полученный состав помещают в термостатированный сушильный шкаф, не дожидаясь существенного повышения вязкости, и выдерживают его при температуре 95-105°С в течение 10-12 часов до полного высушивания и образования композиционного материала в виде пленки, содержащей кальций фосфатное соединение со структурой, отличающейся от структуры гидроксиапатита.

Гидроксиапатит Са₁₀(PO₄)₆(ОН)₂ известен как кристаллохимический аналог основного минерального компонента костной ткани человека и животных и находит широкое применение в качестве хорошо зарекомендовавшего себя основного неорганического составляющего синтетических материалов, используемых в инженерии костных тканей.

Хорошо изучена зависимость растворимости хитозана от значения рН среды. Указанная зависимость в совокупности с также известным влиянием рН среды на осаждение гидроксиапатита, обеспечивающим возможность корректировки условий его осаждения путем изменения значения рН, позволяет оказывать воздействие на формирование кристаллической структуры двух основных составляющих получаемого композиционного материала и тем самым изменять его свойства без изменения состава.

На втором этапе приготовления композиционного материала хитозан/гидроксиапатит осуществляют конверсию образовавшейся в его составе на первом этапе кальций фосфатной фазы в гидроксиапатит.

Для этого сформированную пленку композиционного материала со структурой, отличающейся от структуры гидроксиапатита, обрабатывают 0,1М раствором NaOH либо в течение 10-12 часов при 95-105°С, либо в течение 5 дней при комнатной температуре. Полученный материал промывают деионизированной водой и высушивают.

Примеры конкретного осуществления способа

Идентификацию фаз составляющих компонентов полученных композиционных материалов хитозан/гидроксиапатит осуществляли методом рентгенофазового анализа на многоцелевом рентгеновском дифрактометре «D8 Advance» (Bruker AXS, Германия). Приведенные дифрактограммы свидетельствуют, что полученные предлагаемым способом композиционные материалы одного состава обнаруживают, в зависимости от условий их формирования, различную структуру.

На фиг. 1 (а-д) представлены дифрактограммы композиционных материалов, полученных предлагаемым способом: (а) хитозановой пленки без обработки аммиаком и (б-д) материалов, полученных по примерам 1-4.

На фиг. 2 показана структура материала, полученного по примеру 1, которому соответствует дифрактограмма (б) на фиг. 1.

На фиг. 3 показана структура материала, полученного по примеру 4, которому соответствует дифрактограмма (д) на фиг. 1.

СЭМ-изображения структуры композиционных материалов, приведенные на фиг. 2 и 3, получены при разном увеличении.

Пример 1

К 260 мл 1% раствора хитозана в ОДМ соляной кислоте добавили 1,8 г (10,6 ммоль) нитрата кальция Са(NO₃)₂ и перемешивали с помощью магнитной мешалки со скоростью 550 об/мин в течение 5 минут до полного растворения последнего. Затем по каплям, со скоростью 1 капля/10 сек, добавили 37 мл 2,3% раствора дигидрофосфата калия KH₂PO₄, содержащего 0,86 г (6,3 ммоль) указанной соли в пересчете на твердое вещество, что обеспечило стехиометрическое соотношение Са: Р=1,67. Затем реакционную смесь в широком стакане химического стекла поместили в закрытую емкость, содержащую аммиак NH₃, и выдержали в его атмосфере 50 минут, при этом значение рН от 2 в исходном растворе увеличилось до 10, что сопровождалось изменением цвета реакционной смеси во всем объеме от прозрачного до мутно-белого. После этого смесь поместили в стеклянную чашку Петри и высушили в сушильном шкафу в течение 10 часов при температуре 105°С с получением пленки композиционного материала, по данным рентгенофазового анализа содержащего в своем составе кальций фосфатную фазу в количестве 51% со структурой, отличающейся от апатитовой. Как видно (фиг. 1, б), рефлексы, характерные для кристаллического хитозана, на полученной дифрактограмме отсутствуют.

Пример 2

К 220 мл 1% раствора хитозана в 0,1М соляной кислоте добавили 2,4 г (16,3 ммоль) дигидратхлорида кальция CaCl₂⋅2H₂O и перемешивали в условиях примера 1. Затем по каплям, как в примере 1, добавили 78 мл 1,69% раствора дигидрофосфата калия KH₂PO₄, содержащего 1,3 г (9,8 ммоль) соли в пересчете на твердое вещество, что обеспечило соотношение Са: Р=1,67.

Дальнейшую обработку проводили по примеру 1.

По данным РФА, в результате, после выдержки в сушильном шкафу в течение 12 часов при температуре 95°С, образовался фосфат кальция со структурой, отличающейся от апатитовой, содержание которого в составе композитной пленки составило 63%. Рефлексы, характерные для кристаллического ХТЗ, на полученной дифрактограмме (фиг. 1, в) отсутствуют.

Пример 3

Способ осуществляли по примеру 1, за исключением следующих параметров. Выдержанный в сушильном шкафу при температуре 105°С в течение 10 часов композиционный материал заливали ~100 мл 0,1М раствора NaOH и выдерживали при комнатной температуре (примерно 25°С) в течение 120 часов (5 дней), поддерживая постоянный объем щелочи. Полученный материал промывали деионизированной водой и высушивали на воздухе.

По данным РФА (фиг. 1, г), получен композиционный материал, содержащий фосфат кальция со структурой гидроксиапатита и хитозан в кристаллической форме.

Пример 4

Способ осуществляли аналогично примеру 2, за исключением следующих параметров. Выдержанный в сушильном шкафу композит заливали 0,1М раствором NaOH в количестве ~100 мл и выдерживали при температуре 95°С в течение 10 часов.

По данным РФА (фиг. 1, д), получен фосфат кальция со структурой гидроксиапатита, хитозан присутствует в композиционном материале в аморфной форме.

Изобретение относится к получению композиционных биоматериалов на основе природного полимера хитозана, содержащих кальций-фосфаты, в частности гидроксиапатит, и может найти применение при получении сорбентов и мембран, покрытий, а также в биотехнологических целях для создания функциональных биоматериалов для медицины и ветеринарии, в частности, применяемых в инженерии костных тканей. Способ получения композиционного биоматериала хитозан/гидроксиапатит включает приготовление раствора хитозана в разбавленной кислоте, введение в полученный раствор растворимой соли кальция и дигидрофосфата щелочного металла в количествах, обеспечивающих мольное соотношение Са:Р в реакционной смеси, равное 1,67, последующее повышение рН реакционной смеси и получение кальций-фосфорсодержащего осадка. При этом готовят 1%-ный раствор хитозана в 0,1М соляной кислоте. В качестве растворимой соли берут хлорид либо нитрат. В качестве дигидрофосфата щелочного металла используют дигидрофосфат калия. Для повышения значения рН реакционной смеси ее помещают в атмосферу аммиака NH₃ на 50-60 минут при перемешивании до достижения значения рН~10. Образовавшийся осадок в неизменном состоянии переносят в термостатированный сушильный шкаф с температурой 95-105°С и выдерживают 10-12 часов до его полного высушивания с получением композиционного материала в виде пленки, содержащей кальций фосфатную фазу со структурой, отличающейся от апатитовой, конверсию которой в апатитовую осуществляют путем обработки полученной пленки 0,1М раствором NaOH, после чего промывают деионизированной водой и высушивают. Технический результат - однородное увеличение значения рН по всему объему реакционной смеси в ходе синтеза композиционного материала и улучшение условий его формирования, что обеспечивает повышение механической прочности получаемого материала и одновременно позволяет получать композиционные материалы для различных областей применения с одним составом, но с разными свойствами, обладающие разной кристаллической структурой минеральной составляющей и хитозана. 2 з.п. ф-лы, 4 пр., 3 ил.

1. Способ получения композиционного биоматериала хитозан/гидроксиапатит, включающий приготовление раствора хитозана в разбавленной кислоте, введение в полученный раствор растворимой соли кальция и дигидрофосфата щелочного металла в количествах, обеспечивающих мольное соотношение Са:Р в реакционной смеси, равное 1,67, последующее повышение рН реакционной смеси и получение кальций-фосфорсодержащего осадка, отличающийся тем, что готовят 1%-ный раствор хитозана в 0,1М соляной кислоте, в качестве растворимой соли берут хлорид либо нитрат, в качестве дигидрофосфата щелочного металла используют дигидрофосфат калия, для повышения значения рН реакционной смеси ее помещают в атмосферу аммиака NH₃ на 50-60 минут при перемешивании до достижения значения рН~10, образовавшийся осадок в неизменном состоянии переносят в термостатированный сушильный шкаф с температурой 95-105°С и выдерживают 10-12 часов до его полного высушивания с получением композиционного материала в виде пленки, содержащей кальций-фосфатную фазу со структурой, отличающейся от апатитовой, конверсию которой в апатитовую осуществляют путем обработки полученной пленки 0,1М раствором NaOH, после чего промывают деионизированной водой и высушивают.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что обработку композиционного материала, содержащего кальций-фосфатную фазу со структурой, отличающейся от апатитовой, 0,1М раствором NaOH с конверсией упомянутой структуры в апатитовую осуществляют в течение 10-12 часов при температуре 95-105°С.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что обработку композиционного материала, содержащего кальций-фосфатную фазу со структурой, отличающейся от апатитовой, 0,1М раствором NaOH с конверсией упомянутой структуры в апатитовую осуществляют в течение 5 дней при комнатной температуре.