ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к области фармацевтических композиций, в частности, оно относится к фармацевтической композиции, содержащей белковый комплекс интерлейкина 15 (IL-15), и к ее применению в качестве лекарственного средства.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Интерлейкин-15 (IL-15) представляет собой цитокин с молекулярной массой приблизительно от 12 до 14 кДа, обнаруженный группой исследователей Grabstein et al. в 1994. Он может играть определенную роль в нормальном иммунном ответе in vivo, например, в стимуляции пролиферации Т-клеток, В-клеток и природных клеток-киллеров (NK).
IL-15 принадлежит к небольшому семейству цитокинов, имеющих структуру пучков из четырех α-спиралей. IL-15 проявляет биологическую активность путем связывания со своим рецептором. Рецептор IL-15 состоит из трех рецепторных субъединиц: IL-15 рецептора альфа (IL-15Rα), рецептора IL-2 бета (IL-2Rβ, дополнительно известного как IL-15Rβ или CD122) и γc (дополнительно известного как CD132). IL-15Rα содержит домен Sushi, способный связываться с IL-15 и необходимый для выполнения биологической функции IL-15 после связывания.
За последние годы было обнаружено, что связывание IL-15 с его рецептором IL-15Rα с образованием комплекса приводит к существенному повышению биологической активности IL-15. Исследования показали, что комплекс, образованный IL-15 и его растворимым рецептором IL-15Rα, значительно превосходит отдельный IL-15 в стимуляции пролиферации CDe+T-лимфоцитов памяти и клеток NT/NKT. Комплекс IL-15/IL-15Rα в значительной степени усиливает и индуцирует пролиферацию клеток CD12high, включая CD44highCD8+ Т-клетки памяти, стимулированные антигенами. Способность комплекса IL-15/IL-15Rα стимулировать пролиферацию и поддерживать выживание CD8+ Т-клеток памяти в 10 раз превышает таковую в случае отдельного IL-15, при этом механизм данного действия может быть обусловлен эффектом транс-презентации.
Поскольку с IL-15 связывают большие ожидания в области иммунотерапии опухолей, Национальным институтом здоровья (англ. NIH, (англ.National Institute of Health) было сначала проведено исследование лечения опухолей с помощью IL-15, а затем сделана попытка продвижения исследования в клиническую фазу I. Однако существуют некоторые сложности, связанные с IL-15, например, из-за небольшой молекулярной массы и короткого периода полураспада in vivo сложно контролировать дозу при повторном введении IL-15 и можно легко вызвать системные иммунные побочные эффекты. Следовательно, существует острая потребность в улучшении периода полураспада IL-15 in vivo, стимулировании или усилении его биологической активности in vivo. В исследования, связанные с иммунотерапией IL-15, вовлечено множество отечественных или зарубежных компаний или научно-исследовательских институтов, например, патентный документ CN 100334112C (Shanghai Haixin Biotechnology Co., Ltd.) относится к гомодимерному белку IL-15-hlgG4Fc для использования при лечении микробных инфекций. Введение дисульфидной связи между IL-15 и IL-15Rα в молекулы комплекса по настоящей заявке может улучшить стабильность молекул и биологическую активность, а дополнительно упростить способ получения.
Однако макромолекулярные белковые лекарственные средства являются нестабильными, например, они подвержены разложению, полимеризации или нежелательной химической модификации из-за их высокой молекулярной массы и сложной структуры. Для того, чтобы сделать белковое лекарственное средство пригодным для введения, для поддержания стабильности при хранении, транспортировке и последующем применении, а дополнительно для достижения более эффективного действия особенно важными являются изыскания стабильного состава белковых лекарственных средств.
В настоящее время рядом компаний разработаны белковые комплексы IL-15, например, патентные документы CN 103370339 A, CN 100334112, CN 101735982, WO 2007001677, US 20070160578, WO 2016/095642 и так далее. Однако в случае белковых комплексов IL-15 с новой структурой по-прежнему сохраняется потребность в разработке фармацевтической композиции (состава), содержащей белковый комплекс IL-15, более удобной для введения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение предлагает фармацевтическую композицию, содержащую белковый комплекс IL-15 и буфер, где белковый комплекс IL-15 состоит из IL-15 и любого из компонентов, выбранных из группы, состоящей из:
- рецептора IL-15,
- фрагмента, содержащего внеклеточную область рецептора IL-15, и
- слитого белка, содержащего внеклеточную область рецептора IL-15.
Буфер выбран из группы, состоящей из гистидинового буфера, сукцинатного буфера, фосфатного буфера и цитратного буфера, предпочтительно, цитратного буфера, более предпочтительно, буфера на основе лимонной кислоты-цитрата натрия.
Согласно альтернативному варианту осуществления, концентрация белкового комплекса IL-15 в фармацевтической композиции (т.е. концентрация белкового комплекса IL-15 в смеси с буфером) составляет приблизительно от 1 мг/мл до 50 мг/мл, предпочтительно, приблизительно от 1 мг/мл до 20 мг/мл, наиболее предпочтительно, от 1 мг/мл до 10 мг/мл. Неограничивающие примеры включают 1 мг/мл, 2 мг/мл, 3 мг/мл, 4 мг/мл, 5 мг/мл, 6 мг/мл, 7 мг/мл, 8 мг/мл, 9 мг/мл, 10 мг/мл.
Согласно альтернативному варианту осуществления, концентрация белкового комплекса IL-15 в фармацевтической композиции имеет форму небольшой дозы, приблизительно от 0,9 мг/мл до 1,1 мг/мл, предпочтительно, приблизительно 1 мг/мл.
Согласно альтернативному варианту осуществления, концентрация буфера составляет приблизительно от 5 мМ до 30 мМ, предпочтительно, приблизительно от 10 мМ до 20 мМ, и неограничивающие примеры включают 10 мМ, 11 мМ, 12 мМ, 13 мМ, 14 мМ, 15 мМ, 16 мМ, 17 мМ, 18 мМ, 19 мМ, 20 мМ, более предпочтительно, приблизительно 10 мМ ± 2 мМ и, наиболее предпочтительно, 10 мМ.
Согласно альтернативному варианту осуществления, величина рН буфера в фармацевтической композиции составляет приблизительно от 5,0 до 6,0, предпочтительно, приблизительно от 5,0 до 5,5, и неограничивающие примеры включают приблизительно 5,0, приблизительно 5,1, приблизительно 5,15, приблизительно 5,2, приблизительно 5,25, приблизительно 5,3, приблизительно 5,35, приблизительно 5,4, приблизительно 5,45, приблизительно 5,5, более предпочтительно, приблизительно от 5,15 до 5,25 и, наиболее предпочтительно, приблизительно 5,2.
Кроме того, согласно альтернативному варианту осуществления, фармацевтическая композиция дополнительно содержит сахарид. Термин "сахарид " в настоящем раскрытии включает в себя обычное соединение формулы (CH2O)n и его производные, в том числе моносахариды, дисахариды, трисахариды, полисахариды, сахарные спирты, восстанавливающие сахара, невосстанавливающие сахара и так далее, которые могут быть выбраны из группы, состоящей из глюкозы, сахарозы, трегалозы, лактозы, фруктозы, мальтозы, декстрана, глицерина, эритрита, глицерина, арабита, ксилита, сорбита, маннита, мелибиозы, мелецитозы, рафинозы, маннотриозы, стахиозы, мальтозы, лактулозы, мальтулозы, сорбита, мальтита, лактита, изомальтоксозы и так далее. Предпочтительный сахарид представляет собой невосстанавливающий дисахарид, более предпочтительно, является трегалозой или сахарозой. Согласно настоящему раскрытию, "трегалоза" предпочтительно представляет собой дигидрат α,α-трегалозы.
Согласно альтернативному варианту осуществления, концентрация сахара в фармацевтической композиции составляет приблизительно от 60 мг/мл до 90 мг/мл, предпочтительно, 75±5 мг/мл, неограничивающие примеры включают 70 мг/мл, 71 мг/мл, 72 мг/мл, 73 мг/мл, 73 мг/мл, 74 мг/мл, 75 мг/мл, 76 мг/мл, 77 мг/мл, 78 мг/мл, 79 мг/мл, 80 мг/мл, наиболее предпочтительно, 75 мг/мл.
Согласно альтернативному варианту осуществления, фармацевтическая композиция дополнительно содержит поверхностно-активное вещество (вещества). Поверхностно-активное вещество может быть выбрано из группы, состоящей из полисорбата 20, полисорбата 80, полоксамера, Тритона, додецилсульфоната натрия, лаурилульфоната натрия, октилгликозида натрия, лаурилсульфобетаина, миристилсульфобетаина, линолеилсульфобетаина, стеарилсульфобетаина, лаурилсаркозина, миристилсаркозина, линолеилсаркозина, стеарилсаркозина, линолеилбетаина, миристилбетаина, цетилбетаина, лаурамидопропилбетаина, кокамидопропилбетаина, олеамидопропилбетаина, миристиламидопропилбетаина, пальмитамидопропилбетаина, изостеарамидопропилбетаина, миристиламидопропилдиметиламина, пальмитамидопропилдиметиламина, изостеарамидопропилдиметиламина, метилкокоила натрия, метилолеилтаурата натрия, полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимера этилен- и пропиленгликоля и так далее. Поверхностно-активное вещество предпочтительно представляет собой полисорбат 80 или полисорбат 20, более предпочтительно, полисорбат 20.
Согласно альтернативному варианту осуществления, концентрация поверхностно-активного вещества в фармацевтической композиции составляет приблизительно от 0,1 мг/мл до 0,6 мг/мл, предпочтительно, приблизительно от 0,4 мг/мл до 0,6 мг/мл, и неограничивающие примеры включают 0,4 мг/мл, 0,42 мг/мл, 0,44 мг/мл, 0,46 мг/мл, 0,48 мг/мл, 0,5 мг/мл, 0,52 мг/мл, 0,54 мг/мл, 0,56 мг/мл, 0,58 мг/мл, 0,6 мг/мл, наиболее предпочтительно, 0,5 мг/мл.
Согласно альтернативному варианту осуществления, фармацевтическая композиция содержит:
(a) от 1 мг/мл до 10 мг/мл белкового комплекса IL-15,
(b) от 5 мМ до 30 мМ цитратного буфера,
(c) от 60 мг/мл до 90 мг/мл трегалозы и
(d) от 0,1 мг/мл до 0,6 мг/мл полисорбата 20, величина рН фармацевтической композиции составляет приблизительно от 5,0 до 6,0.
Согласно альтернативному варианту осуществления, фармацевтическая композиция содержит: (а) от 1 мг/мл до 5 мг/мл белкового комплекса IL-15, (b) от 10 до 20 мМ цитратного буфера, (с) от 60 мг/мл до 90 мг/мл трегалозы и (d) от 0,4 мг/мл до 0,6 мг/мл полисорбата 20, величина рН фармацевтической композиции составляет приблизительно от 5,0 до 5,5.
Согласно альтернативному варианту осуществления, фармацевтическая композиция содержит:
(a) 1 мг/мл белкового комплекса IL-15,
(b) 10 мМ ± 2 мМ цитратного буфера,
(c) 75±5 мг/мл трегалозы и
(d) от 0,4 мг/мл до 0,6 мг/мл полисорбата 20, величина рН фармацевтической композиции составляет приблизительно от 5,15 до 5,25.
Согласно альтернативному варианту осуществления, фармацевтическая композиция содержит:
(a) 1 мг/мл белкового комплекса IL-15,
(b) 10 мМ цитратного буфера,
(с) 75 мг/мл трегалозы и
(d) 0,5 мг/мл полисорбата 20, величина рН фармацевтической композиции составляет приблизительно от 5,15 до 5,25, предпочтительно, рН 5,2.
Согласно альтернативному варианту осуществления, фармацевтическая композиция содержит: (а) 1 мг/мл белкового комплекса 3 белка IL-15 и (b) 10 мМ цитратного буфера, рН фармацевтической композиции составляет приблизительно от 5,0 до 5,5.
Согласно альтернативному варианту осуществления, фармацевтическая композиция содержит: (а) от 1 до 5 мг/мл белкового комплекса 3 IL-15, (b) 10 мМ буфера на основе лимонной кислоты-цитрата натрия, (с) 60 мг/мл сахарозы и (d) 0,4 мг/мл полисорбата 20, рН фармацевтической композиции составляет приблизительно 5,5.
Согласно альтернативному варианту осуществления, фармацевтическая композиция содержит: (а) 1 мг/мл белкового комплекса 3 IL-15, (b) 10 мМ буфера на основе лимонной кислоты-цитрата натрия и (с) 60 мг/мл трегалозы, рН фармацевтической композиции составляет приблизительно 5,5.
Согласно альтернативному варианту осуществления, фармацевтическая композиция содержит: (а) 1 мг/мл белкового комплекса 3 IL-15, (b) 10 мМ буфера на основе лимонной кислоты-цитрата натрия и (с) 90 мг/мл трегалозы, рН фармацевтической композиции составляет приблизительно 5,5.
Согласно альтернативному варианту осуществления, фармацевтическая композиция содержит: (а) 1 мг/мл белкового комплекса 3 IL-15, (b) 10 мМ ± 2 мМ буфера на основе лимонной кислоты-цитрата натрия, (с) 75±5 мг/мл трегалозы и (d) от 0,4 мг/мл до 0,6 мг/мл полисорбата 20, рН фармацевтической композиции составляет приблизительно от 5,15 до 5,25.
Согласно альтернативному варианту осуществления, фармацевтическая композиция содержит: (а) 1 мг/мл белкового комплекса 3 IL-15, (b) 10 мМ ± 2 мМ буфера на основе лимонной кислоты-цитрата натрия, (с) 75±5 мг/мл трегалозы и (d) от 0,4 мг/мл до 0,6 мг/мл полисорбата 20, рН фармацевтической композиции составляет приблизительно от 5,15 до 5,25.
Согласно альтернативному варианту осуществления, фармацевтическая композиция содержит: (а) 1 мг/мл белкового комплекса IL-15, (b) 10 мМ буфера на основе лимонной кислоты-цитрата натрия, (с) 75 мг/мл трегалозы и (d) 0,5 мг/мл полисорбата 20, рН фармацевтической композиции составляет приблизительно 5,2.
Согласно альтернативному варианту осуществления, белковый комплекс IL-15, содержащийся в фармацевтической композиции, состоит из IL-15, имеющего последовательность, по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную полипептиду SEQ ID NO: 1, и слитого белка рецептора IL-15, имеющего последовательность, по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную полипептиду SEQ ID NO: 2.
Согласно предпочтительному варианту осуществления, белковый комплекс IL-15 состоит из IL-15 с SEQ ID NO: 1 и слитого белка рецептора IL-15 с SEQ ID NO: 2.
Согласно некоторым вариантам осуществления, фармацевтическая композиция стабильна при температуре от 2 до 8°С в течение по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 18 месяцев или по меньшей мере 24 месяцев. Согласно некоторым вариантам осуществления, фармацевтическая композиция стабильна при температуре 40°С в течение по меньшей мере 7 дней, по меньшей мере 14 дней или по меньшей мере 28 дней.
Настоящее изобретение дополнительно предлагает способ получения фармацевтической композиции, описанной выше, включающий в себя приготовление фармацевтической композиции из белкового комплекса IL-15 и буфера. В фармацевтической композиции концентрация белкового комплекса IL-15 составляет приблизительно от 1 мг/мл до 10 мг/мл, предпочтительно, приблизительно от 1 мг/мл до 5 мг/мл и, наиболее предпочтительно, приблизительно от 0,9 мг/мл до 1,1 мг/мл, более предпочтительно, 1 мг/мл.
Буфер предпочтительно представляет собой цитратный буфер, концентрация буфера предпочтительно составляет приблизительно от 5 мМ до 30 мМ, более предпочтительно, приблизительно от 5 мМ до 20 мМ, наиболее предпочтительно, приблизительно 10 мМ ± 2 мМ, а величина рН буфера составляет приблизительно от 5,0 до 6,0, предпочтительно, приблизительно от 5,0 до 5,5, наиболее предпочтительно, приблизительно от 5,15 до 5,25. Величина рН буфера для приготовления фармацевтической композиции по настоящему раскрытию по существу соответствует конечной величине рН фармацевтической композиции.
Белковый комплекс IL-15 состоит из IL-15 и любого из компонентов, выбранных из группы, состоящей из:
- рецептора IL-15,
- фрагмента, содержащего внеклеточную область рецептора IL-15, и
- слитого белка, содержащего внеклеточную область рецептора IL-15.
В частности, белковый комплекс IL-15 состоит из IL-15, имеющего последовательность, по меньше мере на 95% идентичную полипептиду SEQ ID NO: 1, и слитого белка рецептора IL-15, имеющего последовательность, по меньше мере на 95% идентичную полипептиду SEQ ID NO: 2.
Предпочтительно, белковый комплекс IL-15 состоит из IL-15 с SEQ ID NO: 1 и слитого белка рецептора IL-15 с SEQ ID NO: 2.
Согласно альтернативному варианту осуществления, способ получения фармацевтической композиции, описанной выше, дополнительно включает в себя стадию добавления трегалозы и полисорбата 20, предпочтительно, концентрация трегалозы составляет приблизительно от 60 мг/мл до 90 мг/мл, предпочтительно, 75±5 мг/мл, наиболее предпочтительно, 75 мг/мл, концентрация полисорбата 20 составляет приблизительно от 0,1 мг/мл до 0,6 мг/мл, предпочтительно, приблизительно от 0,4 мг/мл до 0,6 мг/мл, наиболее предпочтительно, приблизительно 0,5 мг/мл.
Настоящее изобретение дополнительно предлагает способ получения лиофилизированного состава, содержащего белковый комплекс IL-15, включающий в себя стадию лиофилизации фармацевтической композиции, описанной выше.
Согласно альтернативному варианту осуществления, стадия лиофилизации, включенная в способ получения лиофилизированного состава, содержащего белковый комплекс IL-15, включает в себя последовательно стадии предварительного замораживания, первичной сушки и вторичной сушки. Стадию лиофилизации осуществляют путем замораживания состава с последующим сублимированием воды при температуре, подходящей для первичной сушки. В этих условиях температура продукта ниже эвтектической точки или температуры разложения состава. При подходящем давлении, как правило, в диапазоне приблизительно от 50 до 250 мторр, диапазон температур для первичной сушки обычно составляет приблизительно от -30 до 25°С (при условии, что продукт остается замороженным во время первичной сушки). Время, необходимое для сушки, зависит от объема и типа состава, контейнера (например, стеклянного флакона), в котором содержится образец, и объема жидкости. Время может составлять от нескольких часов до нескольких дней (например, от 40 до 60 часов). Вторичная сушка может быть осуществлена при температуре приблизительно от 0 до 40°С в зависимости, главным образом, от типа и размера контейнера и типа используемого белка. Время вторичной сушки определяется требуемым уровнем остаточной влажности в продукте, на нее обычно требуется по меньшей мере приблизительно 5 часов. Как правило, состав, лиофилизированный при пониженном давлении, имеет содержание воды менее приблизительно 5%, предпочтительно, менее приблизительно 3%. Давление может быть таким же, как давление, применяемое на стадии первичной сушки. Предпочтительно, давление, применяемое во время вторичной сушки, ниже, чем давление во время первичной сушки. Условия лиофилизации могут варьироваться в зависимости от объема состава и флакона. Предварительное замораживание в контексте настоящего раскрытия означает замораживание при температуре от 5°С до -40°С или до -50°С, предпочтительно, -45°С, независимо от степени вакуумирования. Температура во время первичной сушки предпочтительно составляет -25°С; степень вакуумирования составляет от 0,01 мбар до 0,2 мбар и, наиболее предпочтительно, 0,08 мбар. Температура во время вторичной сушки составляет от 20°С до 30°С, наиболее предпочтительно, 25°С, а степень вакуумирования составляет от 0,01 мбар до 0,2 мбар, наиболее предпочтительно, 0,08 мбар, снижена от 0,005 мбар до 0,02 мбар, наиболее предпочтительно, 0,01 мбар.
Настоящее раскрытие дополнительно предлагает лиофилизированный состав, содержащий белковый комплекс IL-15, полученный при помощи описанного выше способа получения лиофилизированного состава, содержащего белковый комплекс IL-15.
Настоящее раскрытие дополнительно предлагает способ получения восстановленного раствора лиофилизированного состава, содержащего фармацевтическую композицию, описанную выше, включающий стадию восстановления лиофилизированного состава, описанного выше, где растворитель, используемый для восстановления, предпочтительно представляет собой воду для инъекций.
Настоящее изобретение дополнительно предлагает восстановленный раствор, содержащий белковый комплекс IL-1,5 приготовленный при помощи способа получения восстановленного раствора, описанного выше.
Согласно альтернативному варианту осуществления, в восстановленном растворе концентрация белкового комплекса IL-15 составляет приблизительно от 0,9 мг/мл до 1,1 мг/мл, предпочтительно, приблизительно 1 мг/мл.
Согласно альтернативному варианту осуществления, в восстановленном растворе фармацевтическая композиция имеет величину рН приблизительно от 5,0 до 6,0, предпочтительно, приблизительно от 5,0 до 5,5, более предпочтительно, приблизительно от 5,15 до 5,25, наиболее предпочтительно, 5,2.
Согласно альтернативному варианту осуществления, восстановленный раствор содержит буфер на основе лимонной кислоты-цитрата натрия, при этом концентрация буфера составляет приблизительно от 5 мМ до 30 мМ, предпочтительно, приблизительно от 10 мМ до 20 мМ, более предпочтительно, 10 мМ.
Согласно альтернативному варианту осуществления, восстановленный раствор дополнительно содержит дисахарид, предпочтительно, дисахарид, выбранный из группы, состоящей из трегалозы и сахарозы, наиболее предпочтительно, трегалозу.
Согласно альтернативному варианту осуществления, в восстановленном растворе концентрация сахара составляет приблизительно от 60 мг/мл до 90 мг/мл, предпочтительно, приблизительно 75±5 мг/мл, более предпочтительно, 75 мг/мл.
Согласно альтернативному варианту осуществления, восстановленный раствор дополнительно содержит поверхностно-активное вещество, при этом поверхностно-активное вещество предпочтительно представляет собой полисорбат, более предпочтительно, полисорбат 20.
Согласно альтернативному варианту осуществления, в восстановленном растворе концентрация поверхностно-активного вещества составляет приблизительно от 0,1 мг/мл до 0,6 мг/мл, предпочтительно, приблизительно от 0,4 мг/мл до 0,6 мг/мл, наиболее предпочтительно, 0,5 мг/мл.
Настоящее раскрытие дополнительно относится к лиофилизированному составу, содержащему белковый комплекс IL-15, при этом лиофилизированный состав может быть восстановлен с образованием фармацевтической композиции, описанной выше.
Раскрытие дополнительно предлагает продукт или набор, включающий в себя контейнер, содержащий любую из фармацевтических композиций, описанных в данной работе. Согласно некоторым вариантам осуществления, стеклянный флакон представляет собой флакон для инъекций, изготовленный из нейтрального боросиликатного стекла.
Раскрытие дополнительно предлагает применение описанных выше фармацевтической композиции или лиофилизированного состава или восстановленного раствора лиофилизированного состава, при изготовлении лекарственного средства для лечения заболеваний или состояний, связанных с IL-15.
Согласно альтернативному варианту осуществления, заболевание или состояние, описанное в упомянутом выше применении, выбрано из группы, состоящей из инфекционного заболевания, ракового заболевания, заболевания крови, воспалительного заболевания и аутоиммунного заболевания; раковое заболевание предпочтительно выбрано из группы, состоящей из меланомы, рака толстой и прямой кишки, рака кожи, лимфомы, почечно-клеточной карциномы, рака печени, рака легких, рака желудка, рака молочной железы; инфекционное заболевание предпочтительно выбрано из группы, состоящей из вирусной инфекции оспы, ВИЧ-инфекции, бактериальной инфекции, грибковой инфекции и ВГБ-инфекции; заболевание крови предпочтительно выбрано из группы, состоящей из анемии, острого миелоцитарного лейкоза, миелодиспастического синдрома и Т-клеточного лейкоза из больших гранулярных лимфоцитов; аутоиммунное заболевание предпочтительно выбрано из группы, состоящей из множественного склероза, псориаза, ревматоидного артрита, гастрита и мукозита.
Согласно альтернативному варианту осуществления, в соответствии с указанным выше применением, фармацевтическую композицию или лиофилизированный состав или восстановленный раствор лиофилизированного состава вводят в комбинации с низкомолекулярным ингибитором или лекарственным средством на основе антител; низкомолекулярный ингибитор предпочтительно представляет собой таргетное химиотерапевтическое лекарственное средство или лекарственное средство для лучевой терапии, более предпочтительно, алкилирующий агент; лекарственное средство на основе антител предпочтительно представляет собой лекарственное средство на основе моноклональных антител, более предпочтительно, анти-CD20, анти-PD1, анти-PDL1, анти-Her2, анти-EGFR, анти-с-МЕТ антитело.
Настоящее раскрытие дополнительно предлагает применение описанных выше фармацевтической композиции или лиофилизированного состава или восстановленного раствора лиофилизированного состава при приготовлении лекарственного средства для клеточной иммунотерапии, в частности, клеточная иммунотерапия представляет собой иммунотерапию опухолевых клеток, такую как DC (иммунотерапия дендритными клетками), CIK (иммунотерапия цитокин-индуцированными клетками-киллерами), DC-CIK (иммунотерапия цитокин-индуцированными клетками-киллерами и дендритными клетками), ECIK (иммунотерапия улучшенными цитокин-индуцированными клетками-киллерами), NK (иммунотерапия природными клетками-киллерами), CAS-T (комбинированная иммунотерапия антигенстимулированными Т-клетками), BiAb-T (биспецифическая антигенсвязывающая Т-клеточная иммунотерапия), TCR-T (Т-клеточная иммунотерапия с использованием Т-клеточного рецептора), CAR-T (иммунотерапия с использованием Т-кпеток с химерными антигенными рецепторами).
Раскрытие дополнительно предлагает способ лечения заболеваний или состояний, связанных с IL-15, включающий в себя стадию введения субъекту описанных выше фармацевтической композиции или лиофилизированного состава или восстановленного раствора лиофилизированного состава.
Согласно альтернативному варианту осуществления, предложен способ лечения заболеваний или состояний, связанных с IL-15, описанный выше, где заболевание или состояние выбрано из группы, состоящей из инфекционного заболевания, ракового заболевания, заболевания крови, воспалительного заболевания и аутоиммунного заболевания.
Раковое заболевание предпочтительно выбрано из группы, состоящей из меланомы, рака толстой и прямой кишки, рака кожи, лимфомы, почечно-клеточной карциномы, рака печени, рака легких, рака желудка и рака молочной железы; инфекционное заболевание предпочтительно выбрано из группы, состоящей из вирусной инфекции оспы, ВИЧ-инфекции, бактериальной инфекции, грибковой инфекции и ВГБ-инфекции; заболевание крови предпочтительно выбрано из группы, состоящей из анемии, острого миелоцитарного лейкоза, миелодиспастического синдрома и Т-клеточного лейкоза из больших гранулярных лимфоцитов; аутоиммунное заболевание предпочтительно выбрано из группы, состоящей из множественного склероза, псориаза, ревматоидного артрита, гастрита и мукозита.
Согласно альтернативному варианту осуществления, в упомянутом выше способе лечения заболеваний или состояний, связанных с IL-15, фармацевтическую композицию или лиофилизированный состав или восстановленный раствор лиофилизированного состава вводят в комбинации с низкомолекулярным ингибитором или лекарственным средством на основе антител; низкомолекулярный ингибитор предпочтительно представляет собой таргетное химиотерапевтическое лекарственное средство или лекарственное средство для лучевой терапии, более предпочтительно, алкилирующий агент; лекарственное средство на основе антител предпочтительно представляет собой лекарственное средство на основе моноклональных антител, более предпочтительно, анти-СО20, анти-PDI, анти-PDL1, анти-Нег2, анти-EGFR, анти-с-МЕТ антитело.
Следует понимать, что один, несколько или все признаки различных вариантов осуществления, описанных в данном контексте, могут быть объединены для формирования других вариантов осуществления раскрытия. Эти и другие аспекты раскрытия будут очевидны для специалистов в данной области техники. Эти и другие варианты осуществления изобретения дополнительно описаны посредством следующего подробного описания.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фиг. 1 представляет собой график аппроксимирующей кривой, показывающий разницу в степени чистоты при SEC (англ. Size Exclusion Chromatography - гель-проникающая хроматография) после встряхивания по сравнению с таковой в момент D0.
Фиг. 2 представляет собой график аппроксимирующей кривой, показывающий разницу в степени чистоты после встряхивания по сравнению с таковой в момент D0 при CE-SDS (англ. Capillary Electrophoresis-Sodium Dodecyl Sulfate - капиллярный электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия) в невосстанавливающих условиях.
Фиг. 3 представляет собой контурную диаграмму, показывающую разницу в значениях для SEC и CE-SDS в невосстанавливающих условиях после встряхивания.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ РАСКРЫТИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
I. Термины
Для лучшего понимания настоящего раскрытия ниже особым образом определены некоторые технические и научные термины. Все другие научные и технические термины, используемые в настоящем документе, имеют значение, обычно понимаемое специалистом в области техники, к которой относится раскрытие, если в данном контексте явным образом не указано иное.
"Буфер" относится к буферу, устойчивому к изменениям величины рН под действием его сопряженных кислотно-основных компонентов. Примеры буфера, регулирующего величину рН в соответствующем диапазоне, включают ацетатный, сукцинатный, глюконатный, гистидиновый, оксалатный, лактатный, фосфатный, цитратный, тартратный, фумаратный, глицил-глициновый буфер и буферы других органических кислот.
"Гистидиновый буфер" представляет собой буфер, содержащий гистидин-ионы. Примеры гистидинового буфера включают буферы на основе гидрохлорида гистидина, ацетата гистидина, фосфата гистидина, сульфата гистидина и так далее, при этом буфер на основе гидрохлорида гистидина является предпочтительным. Буфер на основе гидрохлорида гистидина получают из гистидина и соляной кислоты или из гистидина и гидрохлорида гистидина. "Цитратный буфер" представляет собой буфер, содержащий цитрат-ионы. Примеры цитратного буфера включают буфер на основе лимонной кислоты-цитрата натрия, лимонной кислоты-гистидина, лимонной кислоты-цитрата калия, лимонной кислоты-цитрата кальция, лимонной кислоты-цитрата магния и так далее. Предпочтительным цитратным буфером является буфер на основе лимонной кислоты-цитрата натрия.
"Сукцинатный буфер" представляет собой буфер, содержащий сукцинат-ионы. Примеры сукцинатного буфера включают буфер на основе янтарной кислоты-сукцината натрия, сукцината гистидина, янтарной кислоты-сукцината калия, янтарной кислоты-сукцината кальция и так далее. Предпочтительным сукцинатным буфером является буфер на основе янтарной кислоты-сукцината натрия.
"Фосфатный буфер" представляет собой буфер, содержащий фосфат-ионы. Примеры фосфатного буфера включают буфер на основе гидрофосфата динатрия-дигидрофосфата натрия, гидрофосфата динатрия-дигидрофосфата калия и т.д. Предпочтительным фосфатным буфером является буфер на основе гидрофосфата динатрия-дигидрофосфата натрия.
"Ацетатный буфер" представляет собой буфер, содержащий ацетат-ионы. Примеры ацетатного буфера включают буфер на основе уксусной кислоты-ацетата натрия, ацетата гистидина, уксусной кислоты-ацетата калия, уксусной кислоты-ацетата кальция, уксусной кислоты-ацетата магния и т.д. Предпочтительным ацетатным буфером является буфер на основе уксусной кислоты-ацетата натрия.
"Трегалоза" дополнительно известна как "дигидрат α,α-трегалозы".
"Фармацевтическая композиция" означает смесь, содержащую один или более комплексов белка IL-15, описанных в данном контексте, и другие химические компоненты, такие как физиологически/фармацевтически приемлемые носители и вспомогательные вещества. Назначение фармацевтической композиции заключается в улучшении стабильности при хранении, транспортировке и в содействии введению в организм с целью облегчения абсорбции активного ингредиента и проявления им биологической активности. При использовании в данном контексте "фармацевтическая композиция" и "состав" не являются взаимоисключающими.
Согласно настоящему раскрытию, растворителем для растворной формы фармацевтической композиции является вода, если не указано иное.
"Лиофилизированный состав" означает состав или фармацевтическую композицию, полученные с помощью вакуумной лиофилизации фармацевтической композиции или состава в форме жидкости или раствора.
Фармацевтическая композиция по настоящему раскрытию может достигать стабильного эффекта: белковый комплекс, входящий в состав фармацевтической композиции, по существу сохраняет свою физическую стабильность и/или химическую стабильность и/или биологическую активность во время хранения. Предпочтительно, фармацевтическая композиция по существу сохраняет свою физическую и химическую стабильность и биологическую активность во время хранения. Продолжительность хранения обычно выбирают исходя из заданного срока годности фармацевтической композиции. В настоящее время существует целый ряд аналитических методов измерения стабильности белка, которые могут быть использованы для измерения стабильности после хранения в течение выбранного периода времени при выбранной температуре.
Стабильный белковый фармацевтический состав представляет собой состав, в котором не наблюдается существенных изменений при следующих условиях: хранение при пониженной температуре (2-8°С) в течение по меньшей мере 3 месяцев, предпочтительно, 6 месяцев, более предпочтительно, 1 года и, еще более предпочтительно, до 2 лет. Кроме того, стабильные жидкие составы включают составы, проявляющие требуемые характеристики после хранения при температуре от 25°С до 40°С в течение 1 месяца, 3 месяцев или 6 месяцев. Как правило, приемлемыми критериями стабильности являются следующие: при измерении методом эксклюзионной ВЭЖХ (англ. SEC-HPLC, size exclusion high-performance liquid chromatography - эксклюзионная высокоэффективная жидкостная хроматография) - обычно разлагаются не более приблизительно 10%, предпочтительно, не более приблизительно 5% мономеров белкового комплекса; при визуальном осмотре фармацевтический состав является бесцветным или от прозрачного до слабого молочно-белого цвета; изменения концентрации, величины рН и осмоляльности состава не превышают±10%; как правило, усечение составляет не более приблизительно 10%, предпочтительно, не более приблизительно 5%; обычно образуется не более приблизительно 10%, предпочтительно, не более приблизительно 5% агрегатов.
Считается, что белковый комплекс "сохраняет свою физическую стабильность" в фармацевтическом составе, когда указанный белковый комплекс не показывает значительного увеличения агрегации, осаждения и/или денатурации при визуальном контроле цвета и/или прозрачности или при измерении с помощью рассеяния УФ-света, эксклюзионной хроматографии (англ. SEC) и динамического рассеяния света (англ. DLS). Изменения конформации белка можно оценить при помощи флуоресцентной спектроскопии, позволяющей определить третичную структуру белка, и при помощи ИК-спектроскопии с преобразованием Фурье (англ. FTIR, Fourier Transform Infrared), позволяющей определить вторичную структуру белка.
Считается, что белковый комплекс "сохраняет свою химическую стабильность" в фармацевтическом составе, когда указанный белковый комплекс не проявляет значительных химических изменений. Химическую стабильность можно оценить путем обнаружения и количественного определения химически измененных форм белка. Процессы деградации, обычно меняющие химическую структуру белка, включают гидролиз или усечение (оценивается такими методами, как эксклюзионная хроматография и SDS-PAGE (англ. Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия), окисление (оценивается такими методами, как пептидная спектроскопия в комбинации с масс-спектрометрией или MALDI/TOF/MS (англ. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry -времяпролетная масс-спектрометрия с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы), дезамидирование (оценивается такими методами, как ионообменная хроматография, капиллярное изоэлектрическое фокусирование, пептидная спектроскопия, измерение изоспарагиновой кислоты) и изомеризация (оценивается измерением, например, содержания изоаспарагиновой кислоты, пептидной спектроскопией).
Считается, что белковый комплекс "сохраняет свою биологическую активность" в фармацевтическом составе, если биологическая активность белкового комплекса в данный момент времени находится в пределах заданного диапазона биологической активности, проявляемой в момент первоначального приготовления фармацевтического состава. Биологическая активность белкового комплекса может быть определена, например, с помощью реакции связывания антигена.
Трехбуквенный код и однобуквенный код аминокислот, используемый в настоящем раскрытии, описаны в работе J.biol.chem, 243, р. 3558 (1968).
"Белковый комплекс IL-15" представляет собой белковый комплекс, образованный белком IL-15 и рецептором IL-15 (и белком, содержащим функциональный фрагмент рецептора IL-15), где функциональный фрагмент рецептора IL-15 включает фрагмент, содержащий внеклеточную область рецептора IL-15, или слитый белок, содержащий внеклеточную область рецептора IL-15. "Белковый комплекс 3 IL-15" относится к белковому комплексу 3, описанному в патентном документе WO 2016/095642 и представляющему собой белковый комплекс, образованный мутированным IL-15 (L52C), связанным с IL-15Rα-Sushi+(S40C)-Fc, где IL-15 имеет мутацию L52C, внеклеточная область IL-15Rα имеет мутацию S40C (IL-15Rα-Sushi), а IL-15Rα-Sushi+(S40C) слит с Fc
Где IL-15(L52C) (SEQ ID NO: 1):
IL-15Rα-Sushi+(S40C)-Fc (SEQ ID NO: 2):
Способы получения и очистки белков хорошо известны в данной области техники, см., например, "Molecular Cloning: a laboratory manual (Молекулярное клонирование: Инструкции по проведению лабораторных работ), издательство Cold Spring Harbor Laboratory Press, главы 5-8 и 15". Белковый комплекс по настоящему раскрытию получают с помощью традиционных методов генной инженерии.
Сконструированный белковый комплекс по настоящему раскрытию может быть получен и очищен с использованием обычных методов. Например, последовательность cDNA, кодирующая IL-15 и рецептор IL-15, может быть клонирована и рекомбинирована в вектор экспрессии GS. Вектор экспрессии рекомбинантного белка может быть стабильно трансфицирован в клетки СНО (англ. Chinese hamster ovary - яичник китайского хомячка). В качестве рекомендуемого уровня техники, экспрессирующие системы млекопитающих могут приводить к гликозилированию белков, в частности, по высококонсервативному N-концевому сайту Fc-области. Стабильные клоны могут быть получены путем экспрессии белков, которые специфически связываются с человеческим IL-15. Позитивные клоны размножают в бессывороточной среде в биореакторе с образованием белкового комплекса. Культуральная среда, в которую секретируется белок, может быть очищена обычным способом. Например, очистку осуществляют с помощью колонки А или G Sepharose FF (англ. Sepharose FF, Sepharose fast flow - быстропроточная сефароза) с отрегулированным буфером. Неспецифически связанные компоненты вымываются. Связанный белковый комплекс элюируют градиентом рН, белковую фракцию определяют с помощью SDS-PAGE и собирают. Белковый комплекс может быть сконцентрирован с помощью фильтрации обычным методом. Растворимые смеси и мультимеры дополнительно могут быть удалены обычными методами, такими как молекулярные сита, ионный обмен. Полученный продукт следует немедленно заморозить, например, при температуре -70°С, или лиофилизировать.
"Идентичность" аминокислотной последовательности относится к сходству последовательностей между двумя белками или полипептидами. Если положения в двух сравниваемых последовательностях заняты одним и тем же аминоскислотным остатком, например, если положения в двух полипептидах заняты одним и тем же аминокислотным остатком, молекулы считаются идентичными в этом положении. Примерами алгоритмов, подходящих для определения процента идентичности последовательностей и процента сходства последовательностей, являются алгоритмы BLAST (англ. Basic local alignment search tool - средство поиска основного локального выравнивания) и BLAST 2.0, описанные в работе Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 и Altschul et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, соответственно. Программное обеспечение для проведения BLAST анализов имеется в открытом доступе в Национальном центре биотехнологической информации (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
"Введение" и "лечение" применительно к животному, человеку, подопытному субъекту, клетке, ткани, органу или биологической жидкости относится к контактированию экзогенного лекарственного средства, терапевтического агента, диагностического агента или композиции с животным, человеком, субъектом, клеткой, тканью, органом или биологический жидкостью. "Введение" и "лечение" может относиться, например, к терапевтическим, фармакокинетическим, диагностическим, исследовательским и экспериментальным способам. Лечение клетки включает в себя контактирование реагентов с клеткой и контактирование реагентов с жидкостью, где жидкости контактируют с клетками. "Введение" и "лечение" дополнительно означает лечение, например, клеток, in vitro и ex vivo с помощью реагентов, диагностических средств, связующих композиций или другой клетки. "Лечение" применительно к человеку, ветеринарному или подопытному субъекту относится к терапевтическому лечению, профилактическим или превентивным мерам, исследовательским и диагностическим применениям.
"Лечение" означает введение пациенту терапевтического агента для внутреннего или наружного применения, например, композиции, содержащей любое из связующих соединений по настоящему раскрытию, при этом у пациента имеется один или более симптомов заболевания, и известно, что терапевтический агент оказывает терапевтическое действие на эти симптомы. Как правило, терапевтический агент вводят субъекту или популяции, подлежащим лечению, в количестве, подходящем для эффективного облегчения одного или более симптомов заболевания, в целях ослабления симптомов или замедления развития таких симптомов в любой клинически измеримой степени. Количество терапевтического агента, подходящее для эффективного облегчения симптома какого-либо конкретного заболевания (дополнительно называемое "терапевтически эффективное количество") может варьироваться в зависимости от целого ряда факторов, таких как стадия заболевания пациента, возраст и вес, а дополнительно способность лекарственного средства вызывать желаемый эффект у пациента. Для того, чтобы оценить, были ли облегчены симптомы заболевания, может быть использован любой метод клинического исследования, обычно применяемый врачом или другим профессиональным медицинским работником для оценки тяжести или развития состояний. Хотя варианты осуществления настоящего раскрытия (например, способы лечения или продукт) могут оказаться неэффективными для уменьшения интенсивности симптомов единичного целевого заболевания, они должны облегчать симптомы целевого заболевания у статистически значимого числа пациентов в соответствии с любым статистическим критерием, известным в данной области, таким как t-критерий Стъюдента, критерий хи-квадрат, U-критерий Манна-Уитни, критерий Крускала-Уоллиса (Н-критерий), критерий Джонкхиера-Терпстра и критерий Уилкоксана.
"Эффективное количество" включает в себя количество, достаточное для уменьшения интенсивности или предотвращения симптомов или состояний медицинского заболевания. Эффективное количество дополнительно означает количество, достаточное для обеспечения возможности или облегчения проведения диагностики. Эффективное количество для конкретного пациента или ветеринарного субъекта может варьироваться в зависимости от таких факторов, как состояние, подлежащее лечению, общее состояние здоровья пациента, способ, путь и доза введения, а дополнительно тяжесть побочных эффектов. Эффективное количество может представлять собой максимальную дозу или режим дозирования, позволяющие избежать значительных побочных эффектов или токсического действия.
ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Далее раскрытие будет описано с помощью следующих примеров. Однако представленные примеры не предназначены для ограничения объема раскрытия.
Методики проведения экспериментов, для которых в примерах или тестовых примерах по настоящему раскрытию особым образом не указаны конкретные условия, как правило, проводили в соответствии с обычными условиями или условиями, рекомендованными производитлями. См. работы J. Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual (Молекулярное клонирование: Руководство по эксперимериментам), издательство Cold Spring Harbor Laboratory Press; Frederick M. Ausubel, The Modern Molecular Biology Method (Методы современной молекулярной биологии), издательство Greene Press Association. Реактивы, для которых особым образом не указан источник, приобретали на рынке в обычном порядке.
Способ приготовления фармацевтической композиции (состава), содержащей белковый комплекс IL-15
Примеры
Способ приготовления фармацевтической композиции (состава), содержащей белковый комплекс IL-15, заключается в следующем (компоненты и композиции каждого состава могут быть выбраны и отрегулированы исходя из стабильности белкового комплекса):
Первая стадия: приготовление маточного раствора, содержащего комплекс 3 белка IL-15 (для получения, экспрессии и очистки белкового комплекса 3 IL-15 см. заявку на патент WO 2016/095642 с датой подачи 17 ноября 2015, с номером заявки PCT/CN2015/094780, которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки) и стабилизирующие компоненты, фильтрация и затем отбор проб раствора для анализа на стерильность. Маточный раствор пропускают через PVDF фильтр 0,22 мкм и собирают фильтрат.
Белковый комплекс 3 IL-15 состоит из следующих полипептидов:
IL-15(L52C) (SEQIDNO:1):
IL-15Rα-Sushi+(S40C)-Fc (SEQ ID NO: 2):
Вторая стадия: регулируя объем нагрузки до 1,1 мл, фильтрат заливали в пробирки емкостью 2 мл с не полностью закрытой пробкой. Отбор проб производили в начале, середине и конце заполнения, соответственно, для контроля разницы нагрузки.
Третья стадия: жидкий раствор с пробкой помещали в лиофилизационную камеру и лиофилизировали. Лиофилизация включает последовательно стадии предварительного замораживания, первичной сушки и вторичной сушки. После завершения процесса лиофилизации пробку полностью закрывают в вакууме.
Четвертая стадия: укупоривание алюминиевой крышкой с помощью закаточной машины.
Пятая стадия: проводили визуальный осмотр для подтверждения отсутствия оплывания продукта, точности объема нагрузки и отсутствия других дефектов. Печатают этикетку для флакона и наклеивают ее на флакон. Флаконы помещают в поддон, распечатывают и наклеивают на поддон этикетку.
Пример 1
Составы белкового комплекса 3 IL-15 с концентрацией 1 мг/мл готовили в серии буферов с величиной рН 5,0-8,5. Каждый из составов фильтровали и помещали во флакон емкостью 2 мл по 1 мл/флакон, закрывали пробкой, укупоривали колпачком и герметизировали. Образцы подвергали испытанию на форсированное разложение, такому как выдерживание при высокой температуре 40°С, многократное замораживание-оттаивание и встряхивание. В качестве оценочных показателей использовали внешний вид и SEC (англ. Size Exclusion Chromatography - гель-проникающая хроматография). Результаты показали, что после форсированного разложения при температуре 40°С чистота мономера SEC в каждой буферной системе значительно снижалась. При этом снижение в цитратной системе было наименьшим. После встряхивания, замораживания-оттаивания SEC каждой буферной системы (кроме фосфатной) не показала значительного изменения по сравнению с показателями в момент D0. Поэтому в качестве буферной системы был выбран цитрат. Для цитратной системы при рН 6,0 внешний вид после замораживания-оттаивания и SEC при температуре 40°С были несколько хуже. Следовательно, условия при рН от 5,0 до 5,5 были более подходящими.
Пример 2
Составы, содержащие белковый комплекс 3 IL-15 в концентрации 1 мг/мл, 10 мМ лимонной кислоты-цитрата натрия, 60 мг/мл сахарозы, имеющие величину рН 5,5, готовили в буферах, содержащих следующие поверхностно-активные вещества в различных концентрациях:
1) 0,2 мг/мл полисорбата 20,
2) 0,4 мг/мл полисорбата 20,
3) 0,2 мг/мл полисорбата 80,
4) 0,4 мг/мл полисорбата 80.
Каждый из составов фильтровали и помещали во флакон емкостью 2 мл по 1 мл/флакон, закрывали пробкой, укупоривали колпачком и герметизировали. Образцы подвергали испытанию на форсированное разложение, такое как выдерживание при высокой температуре 40°С и многократное замораживание-оттаивание. Результаты анализа стабильности показали отсутствие существенных различий во внешнем виде и SEC между различными составами. Результаты CE-SDS (англ. Capillary Electrophoresis-Sodium Dodecyl Sulfate - капиллярный электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия) в невосстанавливающих условиях, полученные при высокой температуре 40°С и замораживании-оттаивании, показали лучшую стабильность в группе, содержащей 0,4 мг/мл полисорбата 20.
Пример 3
Фармацевтические составы, содержащие белковый комплекс 3 IL-15 в концентрации 1 мг/мл, 10 мМ лимонной кислоты-цитрата натрия, готовили в буферах (рН 5,5), содержащих дигидрат α,α-трегалозы и сахарозу, соответственно. Каждый из составов фильтровали и помещали во флакон емкостью 2 мл по 1 мл/флакон, закрывали пробкой, укупоривали колпачком и герметизировали. Образцы подвергали испытанию на форсированное разложение, такому как выдерживание при высокой температуре 40°С и многократное замораживание-оттаивание. Результаты показали, что стабильность белкового комплекса 3 IL-15 в системе, содержащей трегалозу, превосходит таковую в системе, содержащей сахарозу.
Пример 4
Оптимизация состава
Для дальнейшей оптимизации концентрации трегалозы и полисорбата 20, ионной силы и величины рН было проведено DOE (англ. Design of Experiments -моделирование экспериментов) с использованием программного обеспечения JMP, при этом была получена серия составов с использованием модели RSM (анг. Response Surface Method - метод поверхностного отклика), где концентрация белка составляла 1 мг/мл. Раствор подвергали методу форсированного разложения, где в качестве оценочных показателей использовали SEC и CE-SDS в невосстанавливающих условиях, результаты анализировали статистически с помощью метода наименьших квадратов. Параметры DOE представлены в Таблице 4. Составы и результаты испытаний представлены в Таблицах 5 и 6. Результаты статистического анализа изображены на Фиг. с 1 по 3.
Данные, полученные при форсированном разложении, аппроксимировали и получали следующие результаты:
Была установлена разница в степени чистоты мономеров SEC между D0 и D15 (после встряхивания) (значение разницы считается равным 0, если оно отрицательное), R2 больше 0,99, Р меньше 0,05, модель является значимой. Результаты показаны на Фиг. 1.
При использовании CE-SDS в невосстанавливающих условиях была установлена разница в степени чистоты между D0 и D15 (после встряхивания), R2 больше 0,98, Р меньше 0,05, модель является значимой. Результаты показаны на Фиг. 2.
Для других данных аппроксимация была недействительной.
Для обеспечения хорошей формуемости и приемлемой осмоляльности лиофилизированного состава концентрацию трегалозы устанавливали на уровне 7,5±0,5% (75±5 мг/мл). Было обнаружено, что ионная сила 10±2 мМ имеет достаточную буферную емкость.
Концентрацию трегалозы устанавливали на уровне 7,5% (75 мг/мл), ионную силу устанавливали на уровне 10 мМ, откладывали по оси абсцисс величину рН, а по оси ординат - концентрацию полисорбата и строили контурную диаграмму, чтобы показать разницу в величинах SEC после встряхивания и CE-SDS в невосстанавливающих условиях. Результаты представлены на Фиг. 3. Основываясь на результатах, показанных на рисунке, в совокупности с изоэлектрической точкой белкового комплекса можно видеть, что предпочтительный диапазон величин рН для данного состава составляет от 5,15 до 5,25, а концентрация полисорбата составляет от 0,4 до 0,6 мг/мл.
Пример 5
Готовили белковый комплекс IL-15 из расчета 1,0 мг/мл на 10 мМ лимонной кислоты-цитрата натрия (рН 5,2), 75 мг/мл дигидрата α,α-трегалозы, 0,5 мг/мл полисорбата 20, рН 5,2. Белок помещали во флакон емкостью 2 мл по 1,1 мл/флакон, лиофилизировали при температуре первичной сушки -25°С, -20°С и -15°С, соответственно, и герметизировали лиофилизированной резиновой пробкой для испытаний. Результаты показали, что внешний вид всех восстановленных растворов при различных температурах соответствовал требованиям, при этом состав, лиофилизированный при температуре -25°С, имел лучший внешний вид, порошкообразный осадок был полным, без оплавления.
Пример 6
Готовили белковый комплекс IL-15 из расчета 1,0 мг/мл на 10 мМ лимонной кислоты-цитрата натрия (рН 5,2), 75 мг/мл дигидрата α,α-трегалозы, 0,5 мг/мл полисорбата 20, рН 5,2. Составы помещали в стеклянные флаконы, резервуары для хранения жидкостей и чаны из нержавеющей стали 316L, соответственно, и выдерживали при температуре от 2 до 8°С и 25°С, соответственно, в течение 24 часов. Анализ внешнего вида, величины рН, содержания белка и чистоты показал, что комплекс 3 белка IL-15 был стабилен в течение 24 часов. Состав была совместим со стеклянными флаконами, чанами из нержавеющей стали и резервуарами для хранения жидкостей.
Пример 7
Другие альтернативные фармацевтические композиции (составы) или восстановленные растворы
Кроме того, предложены стабильные фармацевтические составы, содержащие:
(1) 5 мг/мл белкового комплекса 3 IL-15, 75 мг/мл трегалозы, 0,5 мг/мл полисорбата 20 и 10 мМ буфера на основе лимонной кислоты-цитрата натрия с конечной величиной рН 5,2;
(2) 10 мг/мл белкового комплекса 3 IL-15, 75 мг/мл трегалозы, 0,5 мг/мл полисорбата 20 и 10 мМ буфера на основе лимонной кислоты-цитрата натрия с конечной величиной рН 5,2;
(3) 10 мг/мл белкового комплекса 3 IL-15, 75 мг/мл сахарозы, 0,5 мг/мл полисорбата 20 и 10 мМ буфера на основе лимонной кислоты-цитрата натрия с конечной величиной рН 5,25;
(4) 0,9 мг/мл белкового комплекса 3 IL-15, 60 мг/мл трегалозы, 0,1 мг/мл полисорбата 20 и 20 мМ буфера на основе лимонной кислоты-цитрата натрия (рН 5,0);
(5) 1 мг/мл белкового комплекса 3 IL-15, 75 мг/мл трегалозы, 0,5 мг/мл полисорбата 20 и 10 мМ буфера на основе лимонной кислоты-цитрата натрия (рН 5,2);
(6) 1,1 мг/мл белкового комплекса 3 IL-15, 90 мг/мл трегалозы, 0,6 мг/мл полисорбата 20 и 30 мМ буфера на основе лимонной кислоты-цитрата натрия (рН 5,5);
(7) 0,9 мг/мл белкового комплекса 3 IL-15, 60 мг/мл трегалозы, 0,1 мг/мл полисорбата 20 и 20 мМ буфера на основе лимонной кислоты-цитрата натрия с конечной величиной рН 5,0;
(8) 1,1 мг/мл белкового комплекса 3 IL-15, 90 мг/мл трегалозы, 0,6 мг/мл полисорбата 20 и 30 мМ буфера на основе лимонной кислоты-цитрата натрия с конечной величиной рН 5,5;
(9) 0,5 мг/мл белкового комплекса 3 IL-15, 65 мг/мл трегалозы, 0,3 мг/мл полисорбата 20 (рН 5,3) и 15 мМ буфера на основе лимонной кислоты-цитрата натрия.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> JIANGSU HENGRUI MEDICINE CO.,LTD;
SHANGHAI HENGRUI PHARMACEUTICAL CO.,LTD
<120> ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ОСНОВЕ БЕЛКОВОГО КОМПЛЕКСА IL-15 И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ
<130> 780054CPCT
<150> CN201710611317.2
<151> 2017-07-25
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 114
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> IL-15 (L52C)
<400> 1
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
1 5 10 15
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
20 25 30
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
35 40 45
Val Ile Ser Cys Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
50 55 60
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
65 70 75 80
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
85 90 95
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
100 105 110
Thr Ser
<210> 2
<211> 315
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> IL-15R альфа-Sushi+(S40C)-Fc
<400> 2
Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val
1 5 10 15
Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly
20 25 30
Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Cys Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn
35 40 45
Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile
50 55 60
Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
85 90 95
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
100 105 110
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
115 120 125
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
130 135 140
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
145 150 155 160
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
165 170 175
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
180 185 190
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
195 200 205
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
210 215 220
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
225 230 235 240
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
245 250 255
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
260 265 270
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
275 280 285
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
290 295 300
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
305 310 315
<---
Изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей белковый комплекс IL-15 и буфер на основе лимонной кислоты и цитрата натрия, трегалозу и полисорбат 20. Фармацевтическая композиция по настоящему раскрытию демонстрирует высокую степень стабильности даже после хранения при температуре от 2 до 8°С в течение нескольких месяцев. 9 н. и 17 з.п. ф-лы, 3 ил., 8 табл., 7 пр.
1. Фармацевтическая композиция для лечения заболеваний или состояний, связанных с интерлейкином 15 (IL-15), содержащая:
от 1 мг/мл до 10 мг/мл белкового комплекса IL-15, который состоит из IL-15 с SEQ ID NO: 1 и слитого белка рецептора IL-15 с SEQ ID NO: 2;
от 5 мМ до 30 мМ буфера на основе лимонной кислоты и цитрата натрия, рН которого составляет от 5,0 до 6,0;
от 60 мг/мл до 90 мг/мл трегалозы и
от 0,1 мг/мл до 0,6 мг/мл полисорбата 20.
2. Фармацевтическая композиция по п. 1, где концентрация белкового комплекса IL-15 в фармацевтической композиции составляет приблизительно от 1 мг/мл до 5 мг/мл, предпочтительно приблизительно от 1 мг/мл до 1,1 мг/мл, более предпочтительно 1 мг/мл.
3. Фармацевтическая композиция по п. 1 или 2, где рН фармацевтической композиции составляет приблизительно от 5,0 до 5,5, предпочтительно приблизительно от 5,15 до 5,25, более предпочтительно 5,2.
4. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-3, где концентрация буфера на основе лимонной кислоты и цитрата натрия составляет приблизительно от 5 мМ до 20 мМ, предпочтительно приблизительно 10±2 мМ и более предпочтительно 10 мМ.
5. Фармацевтическая композиция по п. 4, где рН буфера на основе лимонной кислоты и цитрата натрия составляет приблизительно от 5,0 до 5,5, предпочтительно приблизительно от 5,15 до 5,25, более предпочтительно 5,2.
6. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-5, где концентрация трегалозы составляет приблизительно 75±5 мг/мл, предпочтительно 75 мг/мл.
7. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-6, где концентрация полисорбата 20 составляет приблизительно от 0,4 мг/мл до 0,6 мг/мл, предпочтительно 0,5 мг/мл.
8. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-7, содержащая:
(a) 1 мг/мл белкового комплекса IL-15,
(b) 10 мМ ± 2 мМ буфера на основе лимонной кислоты и цитрата натрия,
(c) 75±5 мг/мл трегалозы и
(d) от 0,4 мг/мл до 0,6 мг/мл полисорбата 20,
при этом рН фармацевтической композиции составляет приблизительно от 5,15 до 5,25;
при этом предпочтительно фармацевтическая композиция содержит:
(a) 1 мг/мл белкового комплекса IL-15,
(b) 10 мМ буфера на основе лимонной кислоты и цитрата натрия,
(c) 75 мг/мл трегалозы и
(d) 0,5 мг/мл полисорбата 20,
при этом рН фармацевтической композиции составляет приблизительно 5,2.
9. Способ получения фармацевтической композиции по любому из пп. 1-8, где указанный способ включает стадию смешивания белкового комплекса IL-15 с буфером,
при этом концентрация белкового комплекса IL-15 в фармацевтической композиции составляет приблизительно от 1 мг/мл до 10 мг/мл, предпочтительно приблизительно от 1 мг/мл до 5 мг/мл, более предпочтительно приблизительно от 1 мг/мл до 1,1 мг/мл, наиболее предпочтительно 1 мг/мл.
10. Способ по п. 9, где:
буфер представляет собой цитратный буфер,
концентрация цитратного буфера составляет приблизительно от 5 мМ до 30 мМ, предпочтительно приблизительно от 10 мМ до 20 мМ,
рН цитратного буфера составляет приблизительно от 5,0 до 6,0, предпочтительно приблизительно от 5,0 до 5,5, более предпочтительно приблизительно от 5,15 до 5,25, наиболее предпочтительно 5,2.
11. Способ по п. 9 или 10, дополнительно включающий стадию добавления трегалозы и полисорбата 20, при этом
концентрация трегалозы составляет приблизительно от 60 мг/мл до 90 мг/мл, предпочтительно приблизительно 75±5 мг/мл, наиболее предпочтительно 75 мг/мл,
концентрация полисорбата 20 составляет приблизительно от 0,1 мг/мл до 0,6 мг/мл, предпочтительно приблизительно от 0,4 мг/мл до 0,6 мг/мл, наиболее предпочтительно приблизительно 0,5 мг/мл.
12. Способ получения лиофилизированного состава, содержащего белковый комплекс IL-15, включающий стадию лиофилизации фармацевтической композиции по любому из пп. 1-8.
13. Способ получения лиофилизированного состава, содержащего белковый комплекс IL-15, по п. 12, где стадия лиофилизации последовательно включает стадии предварительного замораживания, первичной сушки и вторичной сушки.
14. Лиофилизированный состав, содержащий белковый комплекс IL-15, для лечения заболеваний или состояний, связанных с IL-15, получаемый способом по п. 12 или 13.
15. Способ получения восстановленного раствора, содержащего белковый комплекс IL-15, включающий стадию восстановления лиофилизированного состава по п. 14, при этом растворитель, используемый для восстановления, предпочтительно представляет собой воду для инъекций.
16. Восстановленный раствор, содержащий белковый комплекс IL-15, для лечения заболеваний или состояний, связанных с IL-15, получаемый способом по п. 15.
17. Восстановленный раствор по п. 16, где концентрация белкового комплекса IL-15 составляет приблизительно от 1 мг/мл до 1,1 мг/мл, предпочтительно приблизительно 1 мг/мл.
18. Восстановленный раствор по п. 16, где рН восстановленного раствора составляет приблизительно от 5,0 до 6,0, предпочтительно приблизительно от 5,0 до 5,5, более предпочтительно приблизительно от 5,15 до 5,25, наиболее предпочтительно 5,2.
19. Восстановленный раствор по п. 16, содержащий буфер на основе лимонной кислоты и цитрата натрия, где концентрация буфера на основе лимонной кислоты и цитрата натрия составляет приблизительно от 5 мМ до 30 мМ, предпочтительно приблизительно от 10 мМ до 20 мМ, более предпочтительно 10 мМ.
20. Восстановленный раствор по п. 16, дополнительно содержащий трегалозу, где концентрация трегалозы составляет приблизительно от 60 мг/мл до 90 мг/мл, предпочтительно приблизительно 75±5 мг/мл, более предпочтительно 75 мг/мл.
21. Восстановленный раствор по п. 16, дополнительно содержащий полисорбат 20, где концентрация полисорбата 20 составляет приблизительно от 0,1 мг/мл до 0,6 мг/мл, предпочтительно приблизительно от 0,4 мг/мл до 0,6 мг/мл, наиболее предпочтительно 0,5 мг/мл.
22. Применение фармацевтической композиции по любому из пп. 1-8, или лиофилизированного состава по п. 14, или восстановленного раствора по любому из пп. 16-21 в изготовлении лекарственного средства для лечения заболеваний или состояний, связанных с IL-15.
23. Применение по п. 22, где заболевание или состояние, связанное с IL-15, выбрано из группы, состоящей из инфекционного заболевания, рака, заболевания крови, воспалительного заболевания и аутоиммунного заболевания;
при этом рак предпочтительно выбран из группы, состоящей из меланомы, рака толстой и прямой кишки, рака кожи, лимфомы, почечно-клеточной карциномы, рака печени, рака легких, рака желудка и рака молочной железы;
при этом инфекционное заболевание предпочтительно выбрано из группы, состоящей из вирусной инфекции оспы, ВИЧ-инфекции, бактериальной инфекции, грибковой инфекции и ВГБ-инфекции;
при этом заболевание крови предпочтительно выбрано из группы, состоящей из анемии, острого миелоцитарного лейкоза, миелодиспастического синдрома и Т-клеточного лейкоза из больших гранулярных лимфоцитов;
при этом аутоиммунное заболевание предпочтительно выбрано из группы, состоящей из множественного склероза, псориаза, ревматоидного артрита, гастрита и мукозита.
24. Применение по п. 22 или 23, где фармацевтическую композицию или лиофилизированный состав или восстановленный раствор вводят в комбинации с низкомолекулярным ингибитором или лекарственным средством на основе антител;
при этом низкомолекулярный ингибитор предпочтительно представляет собой таргетное химиотерапевтическое лекарственное средство или лекарственное средство для лучевой терапии, более предпочтительно алкилирующий агент;
при этом лекарственное средство на основе антител предпочтительно представляет собой лекарственное средство на основе моноклональных антител, более предпочтительно анти-CD20, анти-PDI, анти-PDLI, анти-Her2, анти-EGFR, анти-с-МЕТ антител.
25. Применение фармацевтической композиции по любому из пп. 1-8, или лиофилизированного состава по п. 14, или восстановленного раствора по любому из пп. 16-21 в получении лекарственного средства для клеточной иммунотерапии, при этом клеточная иммунотерапия представляет собой иммунотерапию опухолевых клеток, выбранную из группы, состоящей из иммунотерапии дендритными клетками, иммунотерапии цитокин-индуцированными клетками-киллерами, иммунотерапии цитокин-индуцированными клетками-киллерами и дендритными клетками, иммунотерапии улучшенными цитокин-индуцированными клетками-киллерами, иммунотерапии природными клетками-киллерами, комбинированной иммунотерапии антиген-стимулированными Т-клетками, биспецифической антигенсвязывающей Т-клеточной иммунотерапии, Т-клеточной иммунотерапии на основе Т-клеточных рецепторов и иммунотерапии на основе Т-клеток с химерными антигенными рецепторами.
26. Продукт для лечения заболеваний или состояний, связанных с IL-15, включающий контейнер (контейнеры), содержащий фармацевтическую композицию по любому из пп. 1-8, или лиофилизированный состав по п. 14, или восстановленный раствор по любому из пп. 16-21.
| WO 2016095642 A1, 23.06.2016 | |||
| CN 105708811 A, 29.06.2016 | |||
| WO 2017112528 A2, 29.06.2017. |
