ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ОСНОВЕ АНТИТЕЛА К PD-L1 И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2022 года по МПК A61K39/395 A61P35/00 C07K16/28 

Настоящая заявка испрашивает приоритет по заявке на патент Китая № CN201710341680.7, поданной 16 мая 2017 г., содержание которой включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области фармацевтических препаратов, в частности к фармацевтической композиции, содержащей антитело к PD-L1 или его антигенсвязывающий фрагмент, и ее применению в качестве противоракового лекарственного средства.

Уровень техники

Белок 1 запрограммированной клеточной смерти (PD-1), представляющий собой белковый рецептор, который экспрессируется на поверхности T-клеток и который был обнаружен в 1992 г., принимает участие в процессе апоптоза. PD-1 имеет два лиганда, а именно PD-L1 и PD-L2. PD-L1 преимущественно экспрессируется на T-клетках, B-клетках, макрофагах и дендритных клетках (DC), и экспрессия на активированных клетках может быть повышена. Экспрессия PD-L2 относительно ограничена, экспрессия которого в основном происходит на антиген-презентирующих клетках, таких как активированные макрофаги и дендритные клетки.

PD-L1 подавляет иммунную систему посредством связывания с PD-1 и B7-1, а множество опухолевых клеток в микроокружении опухоли экспрессируют PD-L1. В ходе последних исследований было обнаружено, что повышенная экспрессия белка PD-L1 наблюдается в тканях таких опухолей человека, как рак молочной железы, рак легкого, рак желудка, рак кишечника, рак почки, меланома, немелкоклеточный рак легкого, рак толстой кишки, рак мочевого пузыря, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак печени и другие, а уровень экспрессии PD-L1 тесно связан с клиническим состоянием пациентов и прогнозом. Поскольку PD-L1 выполняет функцию второго сигнального пути для подавления пролиферации T-клеток, блокирование связывания между PD-L1/PD-1 стало многообещающей перспективной целью в области иммунотерапии опухолей.

По сравнению с другими химическими лекарственными средствами лекарственные средства на основе антител становятся нестабильными из-за их большей молекулярной массы, более сложной структуры и легкости разрушения, полимеризации или нежелательной химической модификации. Чтобы получить молекулы антитела, подходящие для введения, и поддержать стабильность во время хранения и последующего применения, и добиться лучших эффектов, исследования по получению лекарственных средств на основе антител особенно важны.

Ряд международных фармацевтических компаний в настоящее время разрабатывают фармацевтические композиции, содержащие антитела к PD-L1/PD-1, такие как CN105793288A, CN103429264A и CN105960415A.

Настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую антитело к PD-L1 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые являются достаточно устойчивыми и подходящим для введения.

Краткое описание настоящего изобретения

Настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую антитело к PD-L1 или его антигенсвязывающий фрагмент и буфер, где буфер предпочтительно представляет собой сукцинатный буфер или ацетатный буфер, более предпочтительно сукцинатный буфер.

В вариантах осуществления настоящего изобретения концентрация буфера составляет от приблизительно 5 мM до 50 мM, предпочтительно от приблизительно 10 мM до 30 мM, более предпочтительно от 10 мM до 20 мM; в неограничивающих вариантах осуществления концентрация буфера включает 10 мM, 12 мM, 14 мM, 16 мM, 18 мM и 20 мM.

В вариантах осуществления настоящего изобретения pH фармацевтической композиции составляет от приблизительно 4,5 до 6,0, предпочтительно от приблизительно 4,8 до 5,7, более предпочтительно от 5,0 до 5,5 и может составлять 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4 или 5,5.

В вариантах осуществления настоящего изобретения концентрация антитела в фармацевтической композиции составляет от приблизительно 30 мг/мл до приблизительно 80 мг/мл, предпочтительно от приблизительно 40 мг/мл до приблизительно 60 мг/мл, более предпочтительно от 45 мг/мл до приблизительно 55 мг/мл; в неограничивающих вариантах осуществления концентрация антитела включает 45 мг/мл, 46 мг/мл, 47 мг/мл, 48 мг/мл, 49 мг/мл, 50 мг/мл, 51 мг/мл, 52 мг/мл, 53 мг/мл, 54 мг/мл и 55 мг/мл.

Кроме того, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению также содержит сахарид. «Сахарид» по настоящему изобретению предусматривает обычный состав (CH₂O)_n и его производные, в том числе моносахарид, дисахарид, трисахарид, полисахарид, сахароспирт, восстанавливающий сахар, невосстанавливающий сахар и т. п., которые могут быть выбраны из группы, состоящей из глюкозы, сахарозы, трегалозы, лактозы, фруктозы, мальтозы, декстрана, глицерина, декстрана, эритритола, глицерина, арабита, ксилита, сорбита, маннита, мелибиозы, мелицитозы, рафинозы, маннотриозы, стахиозы, мальтозы, лактулозы, мальтулозы, сорбита, мальтита, лактитола, изомальтулозы и т. п. Сахарид предпочтительно представляет собой невосстанавливающий дисахарид, более предпочтительно трегалозу или сахарозу.

В вариантах осуществления настоящего изобретения концентрация сахарида в фармацевтической композиции составляет от приблизительно 30 мг/мл до приблизительно 90 мг/мл, предпочтительно от 50 мг/мл до приблизительно 70 мг/мл, более предпочтительно от 55 мг/мл до приблизительно 65 мг/мл; в неограничивающих вариантах осуществления концентрация сахарида включает 55 мг/мл, 57 мг/мл, 59 мг/мл, 60 мг/мл, 61 мг/мл, 63 мг/мл и 65 мг/мл.

Кроме того, фармацевтическая композиция также содержит поверхностно-активное вещество, которое может быть выбрано из группы, состоящей из полисорбата 20, полисорбата 80, полоксамера, Triton, додецилсульфата натрия, лаурилсульфоната натрия, октилгликозида натрия, лаурилсульфобетаина, миристилсульфобетаина, линолеилсульфобетаина или стеарилсульфобетаина, лаурилсаркозина, миристилсаркозина, линолеилсаркозина, стеарилсаркозина, линолеилбетаина, миристилбетаина, цетилбетаина, лауриламидопропилбетаина, кокарамидопропилбетаина, линолеамидопропилбетаина, миристамидопропилбетаина, пальмитоиламидопропилбетаина или изостеарамидопропилбетаина, миристамидопропилдиметиламина, пальмитоиламидопропилдиметиламина, изостеарамидопропилдиметиламина, метилкокоилтаурата натрия или двунатриевого метилолеилтаурата, полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля и сополимера этилена и пропиленгликоля и т. д. Поверхностно-активное вещество предпочтительно представляет собой полисорбат 80 или полисорбат 20, более предпочтительно полисорбат 80.

В вариантах осуществления настоящего изобретения концентрация поверхностно-активного вещества в фармацевтической композиции составляет от приблизительно 0,1 мг/мл до 1,0 мг/мл, предпочтительно от 0,2 мг/мл до 0,8 мг/мл, более предпочтительно от 0,4 мг/мл до 0,8 мг/мл; в неограничивающих вариантах осуществления концентрация поверхностно-активного вещества включает 0,1 мг/мл, 0,2 мг/мл, 0,3 мг/мл, 0,4 мг/мл, 0,5 мг/мл, 0,6 мг/мл, 0,7 мг/мл и 0,8 мг/мл.

В вариантах осуществления настоящего изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в фармацевтической композиции содержит любые из последовательностей области CDR или их мутантных последовательностей, выбранные из группы, состоящей из последовательностей HCDR вариабельной области тяжелой цепи антитела: SEQ ID NO: 1-3, SEQ ID NO: 7-9; и/или последовательностей LCDR вариабельной области легкой цепи антитела: SEQ ID NO: 4-6, SEQ ID NO: 10-12; в частности, предусматривающие следующее:

HCDR1 выбрана из NDYWX₁ под SEQ ID NO: 1

или SYWMH под SEQ ID NO: 7,

HCDR2 выбрана из YISYTGSTYYNPSLKS под SEQ ID NO: 2

или RIX₄PNSG X₅TSYNEKFKN под SEQ ID NO: 8, и/или

HCDR3 выбрана из SGGWLAPFDY под SEQ ID NO: 3

или GGSSYDYFDY под SEQ ID NO: 9; и/или

LCDR1 выбрана из KSSQSLFY X₂ SNQK X₃SLA под SEQ ID NO: 4

или RASESVSIHGTHLMH под SEQ ID NO: 10,

LCDR2 выбрана из GASTRES под SEQ ID NO: 5

или AASNLES под SEQ ID NO: 11, и/или

LCDR3 выбрана из QQYYGYPYT под SEQ ID NO: 6

или QQSFEDPLT под SEQ ID NO: 12;

где X₁ выбран из N или T, X₂ выбран из R или H, X₃ выбран из N или H, X₄ выбран из H или G, и X₅ выбран из G или F.

В вариантах осуществления настоящего изобретения предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в фармацевтической композиции содержит последовательность CDR вариабельной области легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 или их мутантной последовательности, и последовательность CDR вариабельной области тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9 или их мутантной последовательности; более предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3, которые представлены под SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12 соответственно, и последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3, которые представлены под SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO:9 соответственно;

или предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в фармацевтической композиции содержит последовательность CDR вариабельной области тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 или их мутантной последовательности, и последовательность CDR вариабельной области легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6 или их мутантной последовательности; более предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3, которые представлены под SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3 соответственно, и последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3, которые представлены под SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6 соответственно.

В вариантах осуществления настоящего изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в фармацевтической композиции содержит последовательность CDR вариабельной области легкой цепи, характеризующуюся по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с аминокислотными последовательностями, которые представлены под SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12, и последовательность CDR вариабельной области тяжелой цепи, характеризующуюся по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с аминокислотными последовательностями, которые представлены под SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9.

В вариантах осуществления настоящего изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в фармацевтической композиции могут быть выбраны из группы, состоящей из мышиного антитела, химерного антитела, гуманизированного антитела и человеческого антитела, предпочтительно гуманизированного антитела.

В вариантах осуществления настоящего изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в фармацевтической композиции содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, характеризующуюся по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, которая представлена под SEQ ID NO: 13, и последовательность вариабельной области легкой цепи, характеризующуюся по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, которая представлена под SEQ ID NO: 14.

В вариантах осуществления настоящего изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в фармацевтической композиции содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, характеризующуюся по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, которая представлена под SEQ ID NO: 15, и последовательность вариабельной области легкой цепи, характеризующуюся по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, которая представлена под SEQ ID NO: 17.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую антитело к PD-L1 или его антигенсвязывающий фрагмент в концентрации от приблизительно 30 мг/мл до приблизительно 80 мг/мл, сукцинатный буфер с pH 5,0-6,0 в концентрации от приблизительно 5 мM до приблизительно 50 мM, дисахарид в концентрации от приблизительно 30 мг/мл до приблизительно 90 мг/мл и полисорбат 80 в концентрации от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 1,0 мг/мл.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую от 40 мг/мл до 60 мг/мл антитела к PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента, от 10 мM до 30 мM сукцинатного буфера с pH 5,0-5,5, от 40 мг/мл до 80 мг/мл сахарозы и от 0,4 мг/мл до 0,8 мг/мл полисорбата 80.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую от 45 мг/мл до 55 мг/мл PD-L1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, от 10 мM до 20 мM сукцинатного буфера с pH 5,0-5,5, от 55 мг/мл до 65 мг/мл сахарозы и от 0,5 мг/мл до 0,7 мг/мл полисорбата 80.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую антитело к PD-L1 или его антигенсвязывающий фрагмент в концентрации от приблизительно 30 мг/мл до приблизительно 80 мг/мл, ацетатный буфер с pH 5,0-6,0 в концентрации от приблизительно 5 мM до приблизительно 50 мM, дисахарид в концентрации от приблизительно 30 мг/мл до приблизительно 90 мг/мл и полисорбат 80 в концентрации от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 1,0 мг/мл.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую 50 мг/мл антитела к PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента, 10 мM сукцинатного буфера с pH 5,3 и 60 мг/мл сахарозы.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую 50 мг/мл антитела к PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента, 10 мM ацетатного буфера с pH 5 и 90 мг/мл сахарозы.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую 50 мг/мл антитела к PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента, 30 мM ацетатного буфера с pH 5 и 60 мг/мл трегалозы.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую 50 мг/мл антитела к PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента, 30 мM ацетатного буфера с pH 5 и 60 мг/мл трегалозы.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую 50 мг/мл антитела к PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента, 30 мM ацетатного буфера с pH 5,6 и 90 мг/мл сахарозы.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую 50 мг/мл антитела к PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента, 10 мM сукцинатного буфера с pH 5,0-5,5, 60 мг/мл сахарозы и 0,2 мг/мл полисорбата 20.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую 50 мг/мл антитела к PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента, от 10 мM до 20 мM сукцинатного буфера с pH 5,2, 60 мг/мл сахарозы и 0,2 мг/мл полисорбата 20.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую 50 мг/мл антитела к PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента, 20 мM ацетатного буфера с pH 5,2, 60 мг/мл сахарозы и от 0,1 мг/мл до 0,3 мг/мл полисорбата 20.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую 50 мг/мл антитела к PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента, 20 мM ацетатного буфера с pH 5,2, 60 мг/мл сахарозы и от 0,1 мг/мл до 0,3 мг/мл полисорбата 80.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую 50 мг/мл антитела к PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента, 20 мM сукцинатного буфера с pH 5,2, 60 мг/мл сахарозы и от 0,2 мг/мл до 0,6 мг/мл полисорбата 20.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую 50 мг/мл антитела к PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента, 20 мM сукцинатного буфера с pH 5,2, 60 мг/мл сахарозы и от 0,4 до 0,8 мг/мл полисорбата 80.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую 50 мг/мл антитела к PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента, 20 мM сукцинатного буфера с pH 5,2, 60 мг/мл сахарозы и 0,4 мг/мл полисорбата 80.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую 50 мг/мл антитела к PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента, 20 мM сукцинатного буфера с pH 5,2, 60 мг/мл сахарозы и 0,6 мг/мл полисорбата 80.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую 50 мг/мл антитела к PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента, 20 мM сукцинатного буфера с pH 5,2, 60 мг/мл сахарозы и 0,8 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах осуществления концентрация сукцинатного буфера в фармацевтической композиции составляет от приблизительно 5 мM до 50 мM. В некоторых вариантах осуществления концентрация сукцинатного буфера в фармацевтической композиции составляет от приблизительно 10 мM до 30 мM. В некоторых вариантах осуществления концентрация сукцинатного буфера в фармацевтической композиции составляет приблизительно 20 мM.

В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетатного буфера в фармацевтической композиции составляет от приблизительно 5 мM до 50 мM. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетатного буфера в фармацевтической композиции составляет от приблизительно 10 мM до 30 мM. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетатного буфера в фармацевтической композиции составляет приблизительно 20 мM.

В некоторых вариантах осуществления pH фармацевтической композиции составляет от приблизительно 5,0 до 6,0. В некоторых вариантах осуществления pH фармацевтической композиции составляет от приблизительно 5,0 до 5,5. В некоторых вариантах осуществления pH фармацевтической композиции составляет 5,2 или 5,5.

В некоторых вариантах осуществления концентрация антитела в фармацевтической композиции составляет от приблизительно 30 мг/мл до приблизительно 80 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления концентрация антитела в фармацевтической композиции составляет от приблизительно 40 мг/мл до приблизительно 60 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления концентрация антитела в фармацевтической композиции составляет приблизительно 50 мг/мл.

В некоторых вариантах осуществления концентрация дисахарида в фармацевтической композиции составляет от приблизительно 30 мг/мл до приблизительно 90 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления концентрация дисахарида в фармацевтической композиции составляет от приблизительно 40 мг/мл до приблизительно 80 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления концентрация дисахарида в фармацевтической композиции составляет приблизительно 60 мг/мл.

В некоторых вариантах осуществления полисорбат в фармацевтической композиции представляет собой полисорбат 20 или полисорбат 80. В некоторых вариантах осуществления полисорбат в фармацевтической композиции представляет собой полисорбат 80. В некоторых вариантах осуществления концентрация полисорбата в фармацевтической композиции составляет от приблизительно 0,1 мг/мл до 1,0 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления концентрация полисорбата в фармацевтической композиции составляет от приблизительно 0,4 мг/мл до 0,8 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления концентрация полисорбата в фармацевтической композиции составляет приблизительно 0,6 мг/мл.

В некоторых вариантах осуществления препарат является стабильным при 2-8°C в течение по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 18 месяцев или по меньшей мере 24 месяцев. В некоторых вариантах осуществления препарат является стабильным при 40°C в течение по меньшей мере 7 дней, по меньшей мере 14 дней или по меньшей мере 28 дней.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает изделие или набор, предусматривающие контейнер, содержащий любую из стабильных фармацевтических композиций, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления контейнер представляет собой стеклянный флакон, и стеклянный флакон представляет собой флакон из нейтрального боросиликатного стекла для инъекций.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает способ получения фармацевтических композиций, описанных выше, включающий смешивание антитела к PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента с фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает применение фармацевтической композиции, описанной выше, в изготовлении лекарственного препарата для лечения PD-L1-опосредованного заболевания или состояния, где заболевание или состояние предпочтительно представляет собой рак; более предпочтительно рак, характеризующийся экспрессией PD-L1; наиболее предпочтительно рак молочной железы, рак легкого, рак желудка, рак кишечника, рак почки, меланому или немелкоклеточный рак легкого; еще более предпочтительно немелкоклеточный рак легкого, меланому, рак мочевого пузыря или рак почки.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает способ лечения или предупреждения PD-L1-опосредованного заболевания или состояния, включающий введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей антитело к PD-L1 или его антигенсвязывающий фрагмент, субъекту, нуждающемуся в этом; где заболевание предпочтительно представляет собой рак; более предпочтительно рак, характеризующийся экспрессией PD-L1; наиболее предпочтительно рак представляет собой рак молочной железы, рак легкого, рак желудка, рак кишечника, рак почки, меланому, немелкоклеточный рак легкого или рак мочевого пузыря; наиболее предпочтительно немелкоклеточный рак легкого, меланому, рак мочевого пузыря или рак почки.

Следует понимать, что один, два или все признаки различных вариантов осуществления, описанных в данном документе, могут быть дополнительно подвергнуты комбинированию для получения других вариантов осуществления настоящего изобретения. Другие варианты осуществления, полученные путем комбинации вышеуказанных вариантов осуществления настоящего описания, дополнительно описаны посредством следующего подробного описания.

Краткое описание графических материалов

Фигура 1. Схематическая диаграмма дизайна праймеров во время конструирования гуманизированной конструкции для клонирования.

Фигура 2. Схематическая диаграмма карты вектора, разработанного во время конструирования гуманизированной конструкции для клонирования.

Фигура 3. График основного эффекта для Tm-факторов (включая буферную систему, концентрацию буфера, pH фармацевтической композиции, концентрацию сахарида и тип сахарида).

Подробное описание изобретения

Термины

Чтобы сделать настоящее изобретение более понятным, некоторые технические и научные термины конкретно определены ниже. Если конкретно не указано иное в данном документе, все остальные технические и научные термины, используемые в данном документе, должны рассматриваться как имеющие то же значение, которое обычно известно специалисту в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение.

«Буфер» относится к буферу, который является устойчивым к изменениям pH из-за того, что в его состав входит кислота, сопряженная с основанием. Значение pH буфера по настоящему изобретению составляет от приблизительно 4,5 до 6,0, предпочтительно от приблизительно 5,0 до 6,0, более предпочтительно от приблизительно 5,0 до 5,5, наиболее предпочтительно 5,2. Примеры буфера, который контролирует pH в таком диапазоне, включают ацетатный буфер, сукцинатный буфер, глюконатный буфер, гистидиновый буфер, оксалатный буфер, лактатный буфер, фосфатный буфер, цитратный буфер, тартратный буфер, фумаратный буфер, глицил-глициновый и другие буферы на основе органических кислот. Буфер по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой сукцинатный буфер или ацетатный буфер, более предпочтительно сукцинатный буфер.

«Сукцинатный буфер» относится к буферу, который содержит сукцинатные ионы. Примеры сукцинатного буфера включают янтарную кислоту-натрия сукцинат, сукцинат гистидина, янтарную кислоту-калия сукцинат, янтарную кислоту-кальция сукцинат и т. п. Сукцинатный буфер по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой янтарную кислоту-натрия сукцинат.

«Ацетатный буфер» относится к буферу, который содержит ацетатные ионы. Примеры ацетатного буфера включают уксусную кислоту-натрия ацетат, уксусную кислоту и гистидин, уксусную кислоту-ацетат калия, ацетат кальция, уксусную кислоту-ацетат магния и т. п. Предпочтительным ацетатным буфером по настоящему изобретению является уксусная кислота-ацетат натрия.

«Фармацевтическая композиция» относится к смеси, содержащей одно или более соединений, описанных в данном документе, или их физиологически/фармацевтически приемлемую соль или их пролекарственную форму вместе с другими химическими компонентами. Указанные другие химические компоненты представляют собой, например, физиологически/фармацевтически приемлемые носители и вспомогательные вещества. Назначение фармацевтической композиции состоит в том, чтобы способствовать введению в организм, что облегчает абсорбцию активных ингредиентов, тем самым проявляя биологическую активность.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению способна достигать устойчивого эффекта: антитело, содержащееся в ней, в значительной степени сохраняет свою физическую стабильность, и/или химическую стабильность, и/или биологическую активность после хранения; предпочтительно фармацевтическая композиция в значительной степени сохраняет свою физическую стабильность, химическую стабильность и биологическую активность после хранения. Срок хранения, как правило, определяют на основе предварительно определенного срока хранения фармацевтической композиции. В настоящее время существует ряд аналитических методик измерения стабильности белков, которые измеряют стабильность после хранение в течение выбранного периода времени при выбранной температуре.

Стабильный фармацевтический препарат на основе антител представляет собой препарат, в котором не наблюдается значительное изменение при следующих условиях: хранении при температуре охлаждения (2-8°C) в течение по меньшей мере 3 месяцев, предпочтительно 6 месяцев, более предпочтительно 1 года и даже более предпочтительно вплоть до 2 лет. Кроме того, устойчивый жидкий препарат включает жидкий препарат, который проявляет необходимые характеристики при хранении при температуре, включающей 25°C и 40°C, в течение периода, включающего 1 месяц, 3 месяца и 6 месяцев. Типичными приемлемыми критериями стабильности являются следующие: как правило, не более приблизительно 10%, предпочтительно не более приблизительно 5% мономера антитела подвергается разрушению согласно оценке, проведенной с помощью SEC-HPLC. Фармацевтический жидкий препарат является бесцветным или от прозрачного до слегка перламутрового белого цвета при визуальном анализе. Концентрация, pH и осмоляльность препарата изменяется на не более чем ±10%. Как правило, наблюдается не более 10%, предпочтительно 5% фрагментации. Как правило, наблюдается не более 10%, предпочтительно 5% агрегации.

Антитело «сохраняет свою физическую стабильность» в фармацевтическом препарате, если оно не проявляет значительного повышения показателей агрегации, осаждения и/или денатурации при визуальной оценке цвета и/или прозрачности или при измерении с помощью УФ-светорассеяния, эксклюзионной хроматографии по размеру (SEC) и динамического рассеяния света (DLS). Изменения конформации белка могут быть оценены с помощью флуоресцентной спектроскопии (которая определяет третичную структуру белка) и с помощью FTIR-спектроскопии (которая определяет вторичную структуру белка).

Антитело «сохраняет свою химическую стабильность» в фармацевтическом препарате, если оно не проявляет значительного химического изменения. Химическую стабильность можно оценить путем выявления и количественного определения химически измененных форм белка. Процессы распада, которые часто изменяют химическую структуру белка включают гидролиз или фрагментацию (оцениваемые с помощью таких способов, как эксклюзионная хроматография по размеру и SDS-PAGE), окисление (оцениваемое с помощью таких способов, как пептидное картирование в сочетании с масс-спектрометрией или MALDI/TOF/MS), дезамидирование (оцениваемое с помощью таких способов, как ионообменная хроматография, капиллярное изоэлектрическое фокусирование, пептидное картирование, измерение изоаспарагиновой кислоты) и изомеризацию (оцениваемую с помощью измерения содержания изоаспарагиновой кислоты, пептидного картирования и т. д.).

Антитело «сохраняет свою биологическую активность» в фармацевтическом препарате, если биологическая активность антитела в данный момент времени находится в пределах предварительно определенного диапазона биологической активности, проявляемой во время получения фармацевтического препарата. Биологическая активность антитела может быть определена, например, с помощью анализа связывания антигена.

Трехбуквенные коды и однобуквенные коды для аминокислотных остатков, используемые в данном документе, описаны в J. Biol. Chem. 243, p. 3558 (1968).

«Антитело», используемое в настоящем изобретении, относится к иммуноглобулину, который представляет собой структуру тетра-пептидной цепи, в которой две идентичные тяжелые цепи и две идентичные легкие цепи связаны межцепочечными дисульфидными мостиками. Различие в аминокислотном составе и порядке константной области тяжелой цепи приводит к отличиям в антигенности иммуноглобулина. Соответственно, иммуноглобулины могут быть разделены на пять классов, называемых изотипами иммуноглобулина, а именно IgM, IgD, IgG, IgA и IgE, соответствующие тяжелые цепи которых представляют собой μ-цепь, δ-цепь и γ-цепь, α -цепь и ε-цепь соответственно. В соответствии с аминокислотным составом их шарнирной области и числом и расположением дисульфидных связей тяжелой цепи один и тот же изотип Ig можно разделить на различные подклассы, например, IgG может быть разделен на IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Легкие цепи разделяют на κ-цепь или λ-цепь в соответствии различием в константной области. Каждый из пяти классов Ig может иметь κ-цепь или λ-цепь.

В настоящем изобретении легкая цепь антитела согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать константную область легкой цепи, предусматривающий человеческую или мышиную κ-, λ-цепь или ее вариант.

В настоящем изобретении тяжелая цепь антитела согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать константную область тяжелой цепи, предусматривающую человеческий или мышиный IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 или его вариант.

Приблизительно 110 аминокислотных последовательностей, смежных с N-концом тяжелой и легкой цепей антитела, характеризующиеся высокой степенью изменчивости, известны как вариабельная область (Fv-область); остальные аминокислотные последовательности, близкие к C-концу, являющиеся относительно устойчивыми, известны как константные области. Вариабельная область содержит три гипервариабельные области (HVR) и четыре относительно консервативные каркасные области (FR). Три гипервариабельных области, которые определяют специфичность антитела, также известны как области, определяющие комплементарность (CDR). Каждая вариабельная область легкой цепи (LCVR) и каждый вариабельная область тяжелой цепи (HCVR) состоит из трех областей CDR и четырех областей FR, расположенных в последовательном порядке от амино-конца к карбоксильному концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Три области CDR легкой цепи обозначаются как LCDR1, LCDR2 и LCDR3, и три области CDR тяжелой цепи обозначаются как HCDR1, HCDR2 и HCDR3. Количество и положение аминокислотных остатков области CDR в областях LCVR и HCVR антитела или антигенсвязывающего фрагмента в данном документе соответствуют известным правилам нумерации по Kabat (LCDR1-3, HCDE2-3) или соответствуют правилам нумерации по Kabat и Chothia (HCDR1).

Антитело по настоящему изобретению включает мышиное антитело, химерное антитело и гуманизированное антитело, предпочтительно гуманизированное антитело.

Термин «мышиное антитело» по настоящему изобретению относится к моноклональному антителу к PD-L1 человека, полученному в соответствии со знаниями и навыками в данной области. Во время получения испытуемому субъекту вводят антиген PD-L1, а затем выделяют гибридому, экспрессирующую антитело с необходимыми последовательностями или функциональными свойствами. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения мышиное антитело к PD-L1 или его антигенсвязывающий фрагмент может дополнительно содержать константную область легкой цепи мышиной κ-, λ-цепи или ее вариант или может дополнительно содержать константную область тяжелой цепи мышиного IgG1, IgG2, IgG3 или ее вариант.

Под термином «химерное антитело» понимают антитело, полученное путем слияния вариабельной области мышиного антитела с константной областью человеческого антитела, и химерное антитело может ослаблять иммунный ответ, который индуцируется мышиным антителом. Для конструирования химерного антитела сначала конструируют гибридому, секретирующую специфическое мышиное моноклональное антитело, при этом из клеток гибридомы мыши клонируют ген вариабельной области. Затем ген константной области человеческого антитела клонируют как необходимо, ген вариабельной области мыши лигируют с геном константной области человека с образованием химерного гена, который может быть вставлен в вектор для экспрессии человеческих последовательностей, и, наконец, экспрессируют молекулу химерного антитела в эукариотической или прокариотической промышленной системе. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения легкая цепь химерного антитела к PD-L1 дополнительно содержит константные области легкой цепи человеческой κ-, λ-цепи или их варианты. Тяжелая цепь химерного антитела к PD-L1 дополнительно содержит константные области тяжелой цепи человеческого IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 или их варианты. Константная область человеческого антитела может быть выбрана из константной области тяжелой цепи человеческого IgGl, IgG2, IgG3 или IgG4 или их вариантов, предпочтительно содержащей константную область тяжелой цепи человеческого IgG2, или IgG4, или IgG4 без ADCC (антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности) после аминокислотной мутации.

Термин «гуманизированное антитело», также известное как антитело с привитой CDR, относится к антителу, полученному путем прививания мышиных последовательностей CDR в каркас вариабельной области человеческого антитела, а именно антитела, полученного из различных типов последовательностей каркасной области антител зародышевой линии человека. Гуманизированное антитело преодолевает недостаток, связанный с сильным гуморальным ответом, индуцированным химерным антителом, которое несет большее количество мышиных белковых компонентов. Такие каркасные последовательности можно получить из общедоступной базы ДНК, охватывающей последовательности генов антител зародышевой линии, или опубликованных ссылок. Например, относящиеся к зародышевой линии последовательности ДНК человеческих генов вариабельной области тяжелой и легкой цепей можно найти в базе данных последовательностей зародышевой линии человека «VBase» (доступной на веб-сайте www.mrccpe.com.ac.uk/vbase), а также можно найти в Kabat, E A, et al, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Чтобы избежать снижения активности при уменьшении иммуногенности, каркасные последовательности в вариабельной области человеческого антитела подвергают минимальным реверсивным мутациям или обратным мутациям для поддержания активности. Гуманизированное антитело согласно настоящему изобретению также предусматривает гуманизированное антитело, в отношении которого созревание аффинности CDR проводят путем фагового дисплея.

«Антигенсвязывающий фрагмент» по настоящему изобретению относится к Fab-фрагменту, Fab′-фрагменту или F(ab′)2-фрагменту имеющему антигенсвязывающую активность, а также Fv- или scFv-фрагменту, связывающемуся с человеческим PD-L1; при этом он содержит одну или более областей CDR антител, описанных в настоящем изобретении, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 по SEQ ID NO: 12. Fv-фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи без константной области и представляет собой минимальный фрагмент антитела, имеющий все антигенсвязывающие участки. Обычно Fv антитела дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL и способен образовывать структуру, необходимую для связывания антигена. Также различные линкеры могут использоваться для соединения вариабельных областей двух антител с образованием полипептидной цепи, называемой одноцепочечным антителом или одноцепочечным фрагментом Fv (scFv). Термин «связывание с PD-L1» согласно настоящему изобретению означает, что он способен к взаимодействию с PD-L1 человека. Термин «антигенсвязывающие участки» согласно настоящему изобретению относится к прерывающимся трехмерным участкам на антигене, распознаваемым антителом или антигенсвязывающим фрагментом согласно настоящему изобретению.

Способы получения и проведения очистки антител и антигенсвязывающих фрагментов хорошо известны в уровне техники и могут быть найдены, например, в главах 5-8 и 15 Antibody Experimental Technology Guide of Cold Spring Harbor. Например, мышь может быть иммунизирована PD-L1 человека или его фрагментом, и полученное антитело может быть ренатурировано, очищено и подвергнуто секвенированию аминокислот общепринятым способом. Антигенсвязывающий фрагмент также может быть получен общепринятым способом. Антитело или антигенсвязывающие фрагменты согласно настоящему изобретению являются генетически сконструированными для введения одной или более человеческих каркасных областей (FR) в не являющуюся человеческой область CDR. Последовательности FR зародышевой линии человека могут быть получены из ImMunoGeneTics (IMGT) через их веб-сайт http://imgt.cines.fr или из The Immunoglobulin FactsBook, 2001ISBN012441351.

Сконструированное антитело или антигенсвязывающие фрагменты согласно настоящему изобретению могут быть получены и очищены с помощью общепринятых способов. Например, последовательности cDNA, кодирующие тяжелую цепь и легкую цепь, могут быть клонированы и рекомбинированы в вектор экспрессии GS. Вектор экспрессии рекомбинантного иммуноглобулина может затем стабильно быть трансфицированным в клетки CHO. В качестве более рекомендованного способа, хорошо известного в уровне техники, экспрессирующие системы млекопитающих приводят к гликозилированию антител, как правило, происходящему на высококонсервативном N-конце в Fc-области. Устойчивые клоны могут быть получены посредством экспрессии антитела, специфически связывающегося с PD-L1 человека. Положительные клоны могут быть размножены в бессывороточной культуральной среде для получения антитела в биореакторах. Культуральная среда, в которую было секретировано антитело, может быть очищена с помощью традиционных методик. Например, среду можно удобно применять на сефарозной быстропроточной колонке с белком A или G, которая была уравновешена соответствующим буфером. Колонку промывают для удаления компонентов с неспецифическим связыванием. Связанное антитело элюируют градиентом pH и фрагменты антитела выявляют с помощью SDS-PAGE, а затем объединяют. Антитело может быть отфильтровано и концентрировано с применением стандартных методик. Растворимый агрегат и мультимеры могут быть эффективно удалены с помощью стандартных методик, включающих эксклюзионную хроматографию по размеру или ионный обмен. Полученный продукт может быть непосредственно подвергнут заморозке, например при -70°C, или может быть лиофилизирован.

«Консервативные модификации» или «консервативная замена или замещение» относятся к заменам аминокислот в белке на другие аминокислоты, имеющие аналогичные характеристики (например заряд, размер боковой цепи, гидрофобность/гидрофильность, конформация и жесткость каркаса и т. д.), вследствие чего изменения часто могут быть выполнены без изменения биологической активности белка. Специалистам в данной области понятно, что, как правило, одиночные аминокислотные замены в несущественных областях полипептида существенно не изменяет биологическую активность (см., например, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4^th Ed.)). Кроме того, замены структурно или функционально подобных аминокислот с меньшей вероятностью нарушают биологическую активность.

«Идентичность» относится к сходству последовательностей между двумя полинуклеотидными последовательностями или между двумя полипептидами. Когда положение в обеих из двух сравниваемых последовательностях занимает одно и то же мономерное звено, представляющее собой основание или аминокислоту, например, если положение в каждой из двух молекул ДНК занимает аденин, молекулы являются идентичными в этом положении. Процент идентичности между двумя последовательностями представляет собой функцию количества совпадающих или согласующихся положений, являющихся общими для двух последовательностей, деленного на число сравниваемых положений × 100. Например, при оптимальном выравнивании последовательностей, если присутствует 6 совпадений или соответствий в 10 положениях двух последовательностей, тогда эти две последовательности характеризуются 60% идентичность. Как правило, сравнения проводят когда две последовательности выровнены для получения наибольшего процента идентичности.

«Введение» и «обработка» при применении по отношению к животному, человеку, экспериментальному субъекту, клетке, ткани, органу или биологической жидкости относится к приведению в контакт экзогенного фармацевтического, терапевтического, диагностического средства или композиции с животным, человеком, субъектом, клеткой, тканью, органом или биологической жидкостью. «Введение» и «обработка» могут относиться, например, к терапевтическим, фармакокинетическим, диагностическим, исследовательским и экспериментальным способам. Обработка клетки охватывает приведение в контакт реагента с клеткой, а также приведение в контакт реагента с жидкостью, где жидкость находится в контакте с клеткой. «Введение» и «обработка» также означает обработки in vitro и ex vivo, например, клетки реагентом, диагностическим средством, связывающим соединением или другой клеткой. «Лечение» применительно к человеку, ветеринарии или субъекту исследования относится к терапевтическому лечению, профилактическим или предупредительным мерам, исследовательским и диагностическим вариантам практического использования.

«Лечить» означает осуществлять введение терапевтического средства, такого как композиция, содержащая любое из связывающих соединений по настоящему изобретению, внутренне или наружно пациенту, имеющему один или более симптомов заболевания, в отношении которого средство обладает известной терапевтической активностью. Как правило, средство вводят в количестве, эффективном для ослабления одного или более симптомов заболевания у подвергаемого лечению пациента или популяции для того, чтобы индуцировать регрессию или подавить прогрессирование такого(таких) симптома(симптомов) до любой клинически измеримой степени. Количество терапевтического средства, которое эффективно для ослабления любого симптома конкретного заболевания (также называемое «терапевтически эффективное количество») может варьировать в соответствии с факторами, такими как стадия заболевания, возраст и вес пациента и способность лекарственного средства вызвать необходимый ответ у пациента. На сколько симптом заболевания был ослаблен можно оценить с помощью любого клинического измерения, обычно применяемого врачами или другими квалифицированными медицинскими работниками для оценки тяжести или состояния прогрессирования этого симптома. Хотя вариант осуществления настоящего изобретения (например, способ лечения или изделие) может не быть эффективным в отношении ослабления симптома(симптомов) заболевания, представляющего интерес, для каждого пациента, он должен ослаблять целевой(целевые) симптом(симптомы) заболевания, представляющего интерес, у статистически значимого числа пациентов, что определяется с помощью любого статистического теста, известного в уровне техники, такого как критерий Стьюдента, критерий хи-квадрат, U-критерий Манна-Уитни, критерий Крускала-Уоллиса (H-критерий), критерий Джонкхиера-Терпстра и критерий Уилкоксона.

«Эффективное количество» охватывает количество, достаточное для улучшения или предотвращения симптома или признака заболевания. Эффективное количество также означает количество, достаточное для предоставления возможности или облегчения диагностики. Эффективное количество для конкретного пациента или субъекта ветеринарии может варьировать в зависимости от факторов, таких как состояние, подлежащее лечению, общее состояние здоровья пациента, путь и доза введения и тяжесть побочных эффектов. Эффективное количество может быть максимальной дозой или протоколом введения доз, позволяющими избегать значительных побочных эффектов или токсических эффектов.

«Значение Tm» относится к средней точке тепловой денатурации белка, а именно к температуре, при которой половина количества белка разворачивается и пространственная структура белка разрушается. Следовательно, чем выше значение Tm, тем выше будет термостабильность белка.

Настоящее изобретение дополнительно описано посредством следующих вариантов осуществления, которые не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. Экспериментальные способы в вариантах осуществления настоящего изобретения, которые не определяют конкретные условия, обычно проводят в соответствии с традиционными условиями или в соответствии с условиями, рекомендованными производителем исходного материала или продукта. Реагенты без указанного конкретного источника являются обычными, коммерчески доступными реагентами.

В вариантах осуществления жидкостный хроматограф высокого давления Agilent-HPLC 1260 (колонка Waters Xbridge® BEH 200Å SEC 3,5 мкм, 7,8×300 мм, и колонка Thermo ProPac™ WCX-10 BioLC™, 250×4 мм) применяли для измерения при SE-HPLC и IEC-HPLC. Аппарат Beckman PA800 plus для капиллярного электрофореза (набор для анализа SDS-Gel MW) применяли для измерения CE-SDS в восстанавливающих и CE-SDS в невосстанавливающих условиях. Дифференциальный сканирующий калориметр GE MicroCal VP-Capillary DSC применяли для измерения температуры средней точки тепловой денатурации белка (Tm). Потенциометр наночастиц Malvern Zetasizer Nano ZS применяли для измерения средней величины частиц при DLS (динамическом рассеянии света).

Вариант осуществления 1. Получение антитела к PD-L1

(1) Получение антигена PD-L1 и белка, применяемого для обнаружения

Полноразмерный ген PD-L1 человека (Sino Biological Inc., HG10084-M) изоформы 1 лиганда 1 программируемой смерти клеток (PD-L1) согласно UniProt (SEQ ID NO: 19) применяли в качестве основы для PD-L1 по настоящему изобретению. Получали последовательность гена, кодирующего антиген по настоящему изобретению, и белок, используемый для обнаружения, необязательно рекомбинированный с Fc фрагментом тяжелой цепи антитела (такого как IgG1 человека), встраивали в вектор pTT5 (Biovector, кат. № 102762) или вектор pTargeT (promega, A1410) подвергали кратковременной экспрессии в клетках 293F (Invitrogen, R79007) или устойчивой экспрессии в клетках CHO-S (Invitrogen, k9000-20) и очищали с получением антигена и белка для обнаружения по настоящему изобретению. Ген PD-1 человека приобретали у ORIGENE, арт. № SC117011, эталонная последовательность NCBI: NM_005018.1.

1. Аминокислотная последовательность полноразмерного PD-L1 человека

MRIFAVFIFM TYWHLLNAFT VTVPKDLYVV EYGSNMTIEC KFPVEKQLDL AALIVYWEME DKNIIQFVHG EEDLKVQHSS YRQRARLLKD QLSLGNAALQ ITDVKLQDAG VYRCMISYGG ADYKRITVKV NAPYNKINQR ILVVDPVTSE HELTCQAEGY PKAEVIWTSS DHQVLSGKTT TTNSKREEKL FNVTSTLRIN TTTNEIFYCT FRRLDPEENH TAELVIPELP LAHPPNERTH LVILGAILLC LGVALTFIFR LRKGRMMDVK KCGIQDTNSK KQSDTHLEET

SEQ ID NO: 19

Примечание. Часть с двойным подчеркиванием является сигнальным пептидом (1-18); часть с одинарным подчеркиванием является внеклеточным доменом (19-238) PD-L1, где 19-127 представляет собой Ig-подобный домен V-типа, 133-225 представляет собой Ig-подобный домен C2-типа; часть с пунктирным подчеркиванием представляет собой трансмембранный домен (239-259); и часть, выделенная курсивом, представляет собой цитоплазматический домен (260-290).

2. Иммуноген. PD-L1 с метками His и PADRE: PD-L1 (внеклеточный домен, сокр. ECD) -PADRE-His6

FT VTVPKDLYVV EYGSNMTIEC KFPVEKQLDL AALIVYWEME

DKNIIQFVHG EEDLKVQHSS YRQRARLLKD QLSLGNAALQ ITDVKLQDAG VYRCMISYGG ADYKRITVKV NAPYNKINQR ILVVDPVTSE HELTCQAEGY PKAEVIWTSS DHQVLSGKTT TTNSKREEKL FNVTSTLRIN TTTNEIFYCT FRRLDPEENH TAELVIPELP LAHPPNERGS GAKFVAAWTL KAAAHHHHHH

SEQ ID NO: 20

Примечание. Часть с одинарным подчеркиванием представляет собой внеклеточный домен PD-L1; часть с пунктирным подчеркиванием представляет собой метку PADRE, и часть, выделенная курсивом, представляет собой метку His6-tag.

3. Получали PD-L1 с метками FLAG и HIS; PD-L1(ECD)-Flag-His6 применяли для проверки эффективности антител согласно настоящему изобретению.

FT VTVPKDLYVV EYGSNMTIEC KFPVEKQLDL AALIVYWEME DKNIIQFVHG EEDLKVQHSS YRQRARLLKD QLSLGNAALQ ITDVKLQDAG VYRCMISYGG ADYKRITVKV NAPYNKINQR ILVVDPVTSE HELTCQAEGY PKAEVIWTSS DHQVLSGKTT TTNSKREEKL FNVTSTLRIN TTTNEIFYCT FRRLDPEENH TAELVIPELP LAHPPNERDY KDDDDKHHHH HH

SEQ ID NO: 21

Примечание. Часть с одинарным подчеркиванием представляет собой внеклеточный домен PD-L1; часть с пунктирным подчеркиванием представляет собой метку FLAG-Tag, и часть, выделенная курсивом, представляет собой метку His6-tag.

4. Слитый белок на основе Fc и PD-L1. PD-L1 (ECD)-Fc применяли в качестве иммунологического антигена или реагента для обнаружения согласно настоящему изобретению.

VKL-PD-L1(ECD)-Fc(IgG1 человека)

FT VTVPKDLYVV EYGSNMTIEC KFPVEKQLDL AALIVYWEME DKNIIQFVHG EEDLKVQHSS YRQRARLLKD QLSLGNAALQ ITDVKLQDAG FTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 22

Примечание. Часть с одинарным подчеркиванием представляет собой внеклеточный домен PD-L1; а часть, выделенная курсивом, представляет собой часть Fc IgG1 человека.

5. Слитый белок на основе Fc и PD-L1. PD-L1 (ECD)-Fc применяли для проверки эффективности антител согласно настоящему изобретению.

PGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 23

Примечание. Часть с одинарным подчеркиванием представляет собой внеклеточный домен (ECD) PD-L1; а часть, выделенная курсивом, представляет собой часть hFc (IgG1 человека).

(2) Очистка рекомбинантного белка PD-L1, PD-1, а также гибридомных антител и рекомбинантных антител

1. Очистка «PD-L1 с метками His и PADRE»: рекомбинантный белок PD-L1 (ECD)-PADRE-His6 (SEQ ID NO: 20)

Образец супернатанта клеточной экспрессии центрифугировали на высокой скорости для удаления примесей, и буфер заменяли на PBS с последующим добавлением имидазола до конечной концентрации 5 мM. Никелевую колонку уравновешивали с помощью раствора PBS , содержащего 5 мM имидазола, и промывали с помощью 2-5 объемов колонки. Образец супернатанта загружали в колонку с Ni (GE, 17-5318-01). Колонку промывали PBS, содержащим 5 мM имидазола, до тех пор, пока показатель A280 не опускался до исходного уровня. Колонку промывали PBS, содержащим 10 мM имидазола, для удаления неспецифически связывающегося примесного белка, и элюат собирали. Целевой белок элюировали с помощью PBS, содержащего 300 мM имидазола, и собирали на пике элюирования. Собранный элюент концентрировали и дополнительно очищали посредством гель-хроматографии Superdex 200 (GE) с использованием PBS в качестве подвижной фазы. Пики полимеров отбрасывали, а элюируемые пики собирали. Полученный белок подтверждали идентификацией посредством электрофореза, пептидного картирования (Agilent, 6530 Q-TOF) и LC-MS (Agilent, 6530 Q-TOF) и разделяли на аликвоты для последующего применения. PD-L1 с метками His и PADRE: PD-L1 (ECD)-PADRE-His6 (SEQ ID NO: 2) получали и применяли в качестве иммуногена для антитела согласно настоящему изобретению.

2. Очистка PD-L1 (ECD)-Flag-His6 (SEQ ID NO: 21), представляющего собой рекомбинантный белок с меткой His и меткой Flag

Образец центрифугировали при высокой скорости для удаления примесей и концентрировали до необходимого объема. Пик белка, элюированного из колонки IMAC, как описано выше, загружали в аффинную в отношении метки flag колонку, уравновешенную 0,5×PBS (Sigma, A2220), и промывали с помощью 2-5 объемов колонки. Образец супернатанта клеточной экспрессии загружали в колонку после удаления примесей. Колонку промывали с помощью 0,5×PBS, до тех пор, пока показатель A280 не опускался до исходного уровня. Колонку промывали PBS, содержащим 0,3 M NaCl, и примесный белок элюировали и собирали. Целевой белок элюировали 0,1 M уксусной кислоты (pH 3,5-4,0) и собирали с последующим доведением pH до нейтрального. Собранный элюент концентрировали и дополнительно очищали посредством гель-хроматографии Superdex 200 (GE) с использованием PBS в качестве подвижной фазы. Пики полимеров отбрасывали, а элюируемые пики собирали. Собранный образец подтверждали идентификацией посредством электрофореза, пептидного картирования и LC-MS и разделяли на аликвоты для последующего применения. PD-L1 с меткой His и меткой Flag, т. е. PD-L1 (ECD)-Flag-His6 (SEQ ID NO: 3) получали для тестирования эффективности антитела согласно настоящему изобретению.

3. Очистка содержащего Fc слитого белка на основе PD-L1 и PD-1

Образец супернатанта клеточной экспрессии центрифугировали при высокой скорости для удаления примесей, концентрировали до необходимого объема и загружали в колонку с белком A (GE, 17-5438-01). Колонку промывали с помощью PBS, до тех пор, пока показатель A280 не опускался до исходного уровня. Представляющий интерес белок элюировали при помощи 100 мМ ацетата натрия с pH 3,0. Белок, нейтрализованный 1 M TrisHCl, дополнительно очищали с помощью PBS-уравновешенной гель-хроматографии Superdex 200 (GE). Пики полимеров отбрасывали, а элюируемые пики собирали и разделяли на аликвоты для последующего применения. Данный способ применяли для очистки PD-L1 (ECD)-Fc (SEQ ID NO: 4) и PD-1 (ECD)-Fc (SEQ ID NO: 5). PD-L1 (ECD)-Fc можно использовать в качестве иммунизирующего антигена или детектирующего реагента согласно настоящему изобретению, а PD-1 (ECD)-Fc можно использовать для тестирования эффективности антитела согласно настоящему изобретению.

(3) Получение гибридомного моноклонального антитела к PD-L1 человека

1. Иммунизация

Моноклональное антитело к PD-L1 человека получали путем иммунизации мыши, где использовали самку белой мыши SJL возрастом 6 недель (Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd., номер лицензии на животноводство: SCXK (Пекин) 2012-0001). Условия при кормлении: уровень SPF. Мышей после приобретения выращивали в лабораторных условиях (установка цикла день/ночь на 12/12 часов, температура 20-25°C; влажность 40-60%) в течение 1 недели. Мышей, который адаптировались к окружающей среде, иммунизировали по двум схемам (схеме A и схеме B) с 6-10 особями на группу. Иммунизирующим антигеном был PD-L1 с метками His и PADRE: PD-L1 (ECD)-PADRE-His6 (SEQ ID NO: 20).

На схеме A адъювант Фрейнда (номер партии Sigma: F5881/F5506) использовали для эмульгации: полный адъювант Фрейнда (CFA) использовали для первичной иммунизации, а неполный адъювант Фрейнда (IFA) использовали для остальной бустерной иммунизации. Соотношение антигена и адъюванта составляло 1:1, 100 мкг/мышь (первичная иммунизация), 50 мкг/мышь (бустерная иммунизация). Эмульгированный антиген внутрибрюшинно вводили в дозе 100 мкг/мышь в день 0 и вводили один раз в две недели после первичной иммунизации в общей сложности в течение 6-8 недель.

Для схемы B Titermax (номер партии Sigma: T2684) и квасцы (номер партии Thremo: 77161) использовали для перекрестной иммунизации. Соотношение антигена и адъюванта (Titermax) составляло 1:1, и соотношение антигена и адъюванта (квасцев) составляло 3:1, 10-20 мкг/на мышь (первичная иммунизация) и 5 мкг/на мышь (бустерная иммунизация). Эмульгированный антиген внутрибрюшинно вводили в дозе 20/10 мкг/мышь в день 0 и вводили один раз в неделю после первичной иммунизации. Titermax применяли с квасцами взаимозаменяемо в течение 6-11 недель. Через четыре недели иммунизации антиген вводили посредством инъекции в спину или внутрибрюшинной инъекции в зависимости от состояний опухоли спины и увеличения размеров живота.

2. Слияние клеток

Мышей с высоким титром антител в сыворотке крови, склонным к достижению плато, выбирали для слияния спленоцитов. Шоковую иммунизацию проводили путем внутрибрюшинной инъекции за 72 часа до слияния спленоцитов. Клетки гибридомы получали путем слияния лимфоцитов селезенки с клетками миеломной клеточной линии Sp2/0 (ATCC® CRL-8287™) посредством оптимизированной PEG-опосредованной процедуры слияния. Клетки гибридомы повторно суспендировали в полной среде HAT (среда RPMI-1640, содержащая 20% FBS, 1×HAT и 1×OPI) и вносили в аликвотах в 96-луночные планшеты для культивирования клеток (1×10⁵/150 мкл/лунка) с последующей инкубацией при 37°C при 5% CO₂. На 5-ый день после слияния добавляли полную среду HAT в количестве 50 мкл/лунка и инкубировали при 37°C при 5% CO₂. С 7-ого дня по 8-ой день после слияния в соответствии с плотностью роста клеток всю среду заменяли на полную среду HT (среда RPMI-1640, содержащая 20% FBS, 1×HT и 1×OPI) при 200 мкл/лунка и инкубировали при 37°C при 5% CO₂.

3. Скрининг клеток гибридомы

В период от дня 10 по день 11 после слияния осуществляли связывание PD-L1 согласно способу ELISA в соответствии с плотностью клеточного роста. Положительные лунки с клетками, обнаруженные при проведении ELISA, подвергали блокирующему связывание PD-L1/PD-1 ELISA. Среду в положительных лунках заменяли, и положительные клетки распределяли по 24-луночным планшетам в соответствии с плотностью клеток. Клетки, перенесенные в 24-луночный планшет, подвергали повторному испытанию, а затем подвергали консервации клеток и исходному субклонированию. Положительные клетки, определенные посредством скрининга после исходного субклонирования, подвергали консервации клеток с последующим вторым субклонированием. Положительные клетки, определенные посредством скрининга после исходного субклонирования, подвергали консервации клеток с последующей экспрессией белка. Клетки гибридомы, которые блокировали связывание PD-L1 и PD-1, получали путем множественных слияний.

Клоны 1 и 2 клеток гибридомы подвергали скринингу с помощью анализа блокирования и анализа связывания. Антитела дополнительно получали асцитическим способом или бессывороточным способом культивирования клеток, и антитела очищали в соответствии с вариантами осуществления очистки для применения в тестовых вариантах осуществления.

Последовательности вариабельной области мышиного антитела получали секвенированием, где последовательности вариабельных областей CDR клонов гибридомы показаны в таблице 1 ниже.

Таблица 1

При этом X₁ выбран из N или T, X₂ выбран из R или H, X₃ выбран из N или H, X₄ выбран из H или G, и X₅ выбран из G или F.

(4) Гуманизация гибридомного моноклонального антитела к PD-L1 человека

Гены зародышевой линии с высокой гомологичностью в вариабельной области тяжелой и легкой цепи выбирали в качестве основы путем сопоставления с генами вариабельной области тяжелой и легкой цепей антитела зародышевой линии человека из базы данных IMGT и программного обеспечения MOE. CDR мышиного антитела 1 и 2 прививали на соответствующую гуманизированную основу, и обеспечивали созревание аффинности с образованием последовательности вариабельной области, представляющей собой FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.

Основа гуманизированной легкой цепи мышиного антитела 1 представляет собой IGKV4-1*01 и hjk4.1, основа гуманизированной тяжелой цепи представляет собой IGHV4-30-4*01 и hjh2, и последовательности гуманизированной вариабельной области являются следующими:

>1 hVH-с привитыми CDR

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISNDYWNWIRQHPGKGLEWIGYISYTGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGGWLAPFDYWGRGTLVTVSS

SEQ ID NO: 24

>1 hVL с привитыми CDR

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFYRSNQKNSLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYGYPYTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO: 25

Основа гуманизированной легкой цепи мышиного антитела 2 представляет собой IGKV7-3*01 и hjk2.1, основа гуманизированной тяжелой цепи представляет собой IGHV1-46*01 и hjh6.1, и последовательность гуманизированной вариабельной области является следующей:

>2- hVH.1

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGRIHPNSGGTSYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO: 26

>2-hVL.1

DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIK

SEQ ID NO: 27

Примечание. Порядок представляет собой FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, где выделенная курсивом часть представляет собой последовательность FR, а часть с подчеркиванием представляет собой последовательность CDR.

(5) Конструирование гуманизированного клона

Праймеры разрабатывали для конструирования фрагмента гена VH/VK каждого гуманизированного антитела, а затем его гомологически рекомбинировали с вектором экспрессии pHr (с сигнальным пептидом и фрагментом гена константной области (CH1-FC/CL)) для конструирования полноразмерного вектора экспрессии VH- CH1-FC-pHr/VK-CL-pHr.

1. Разработка праймеров. Доступное онлайн программное обеспечение DNAWorks (v3.2.2) (http://helixweb.nih.gov/dnaworks/) применяли для разработки множества праймеров для синтеза VH/VK-содержащих фрагментов гена, необходимых для рекомбинации: сигнальный пептид 5'-30 п. о. + VH/VK + 30 п. о. CH1/CL-3'. Принцип разработки праймеров: если присутствовали отличающиеся аминокислоты между целевым геном 2 и целевым геном 1, тогда конструировали другой праймер, содержащий сайт мутации, как показано на фиг. 1.

2. Сплайсинг фрагментов. В соответствии с инструкцией по эксплуатации ДНК-полимеразы TaKaRa Primer STAR GXL фрагменты гена, содержащие VH/VK, необходимые для рекомбинации, получали с помощью ПЦР-амплификации с двумя стадиями с применением множества праймеров, сконструированных выше.

3. Конструирование и ферментативное расщепление вектора экспрессии pHr (с сигнальным пептидом и фрагментом гена константной области (CH1-FC/CL))

Вектор экспрессии pHr с сигнальным пептидом и фрагментом гена константной области (CH1-FC/CL) конструировали с применением некоторых специальных рестрикционных эндонуклеаз, благодаря специальной конструкции которых, последовательность распознавания была отлична от сайта рестрикции, как например BsmBI. Схематическая диаграмма конструкции показана на фигуре 2. Вектор расщепляли с помощью BsmBI, и гель экстрагировали для применения.

4. Рекомбинантная конструкция вектора экспрессии VH-CH1-FC-pHr/VK-CL-pHr

VH/VK-содержащие фрагменты гена, необходимые для рекомбинации, и расщепленный BsmBI и восстановленный вектор экспрессии pHr (с сигнальным пептидом и фрагментом гена константной области (CH1-FC/CL)) добавляли к компетентным клеткам DH5H в молярном соотношении 3:1, выдерживали на ледяной бане при 0°C в течение 30 минут, подвергали тепловому шоку при 42°C в течение 90 секунд с последующим добавлением 5-кратных объемов среды LB, инкубировали при 37°C в течение 45 минут, и распределяли на планшете LB-Amp, и инкубировали при 37°C в течение ночи. Отдельный клон отбирали и отправляли для секвенирования с получением целевого клона.

(6) Созревание аффинности гуманизированного антитела к PD-L1

1. Конструирование фагмидных векторов для гуманизированных антител к PD-L1 1 и 2

Гуманизированные антитела к PD-L1 1 и 2 встраивали в фагмидные векторы в виде scFv (VH-(GGGGS)₃-VL), соответственно, в качестве последовательностей дикого типа (т. е. это начальная или исходная последовательность, соответствующая мутантным последовательностям, которые подвергали скринингу в отношении созревания аффинности). VH, линкер (GGGGS)₃ и VL собирали с помощью ПЦР с перекрывающимися праймерами и лигировали в фагмидный вектор посредством сайтов распознавания рестрикции NcoI и NotI.

2. Получение библиотеки фагового дисплея

Сконструированный scFv дикого типа применяли в качестве основы, и применяли праймеры на основе кодонов. В процессе синтеза праймера каждый кодон в области мутации имел 50% кодона дикого типа и 50% NNK (обратным праймером был MNN), которые вводили мутации во все области CDR для создания библиотеки мутантов. Фрагмент ПЦР расщепляли NcoI и NotI, лигировали в фагмидный вектор и, наконец, посредством электричества трансформировали в TG1 E. coli. Для каждого праймера на основе кодона сконструировали независимую библиотеку, в которой антитело 1 разделяли на 7 библиотек, а антитело 2 разделяли на 8 библиотек.

3. Пэннинг библиотеки

После того, как библиотеку восстанавливали и объединяли с фаговыми частицами для пэннинга, биотинилированный антиген PD-L1 (ECD) человека и магнитные гранулы, покрытые стрептавидином, использовали для пэннинга жидкой фазы, а концентрация антигена после каждого цикла скрининга уменьшалась по сравнению с предыдущим циклом. После трех циклов пэннинга отбирали 250 клонов из антитела 1 и антитела 2 и подвергали фаговому ELISA для обнаружения активности связывания соответственно с последующим секвенированием положительных клонов.

4. Обнаружение аффинности с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR)

После секвенирования клонов избыточные последовательности удаляли, а не избыточные последовательности конвертировали в полноразмерный IG (γ1, κ) для экспрессии в клетках млекопитающих. Полноразмерный IG после аффинной очистки подвергали выявлению аффинности с использованием прибора BIAcoreTM X-100 (GE Life Sciences).

Последовательности вариабельной области гуманизированного антитела 2 после созревания аффинности показаны ниже.

Вариабельная область тяжелой цепи:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGRIGPNSGFTSYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO: 13,

где X₄ CDR2 представляет собой G, X₅ представляет собой F.

Вариабельная область легкой цепи:

DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIK

SEQ ID NO: 14.

Примечание. Выделенная курсивом часть последовательности является последовательностью FR; часть с подчеркиванием является последовательностью CDR; и сайт с двойным подчеркиванием является сайтом, полученным после скрининга созревания аффинности.

Последовательности вариабельной области гуманизированного антитела 1 после созревания аффинности показаны ниже.

Вариабельная область тяжелой цепи:

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISNDYWTWIRQHPGKGLEYIGYISYTGSTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGGWLAPFDYWGRGTLVTVSS

SEQ ID NO: 28,

где X₄ CDR1 представляет собой T.

Вариабельная область легкой цепи:

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFYHSNQKHSLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYGYPYTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO: 29,

где CDR1 X₂ представляет собой H, и X₃ представляет собой H.

Клон, полученный посредством созревания аффинности, преобразовывали в тип IgG4, и IgG4, в котором центральная шарнирная область содержит S228P мутацию, отбирали для получения антитела без ADCC и CDC, при этом антитело, полученное из антитела 2, называли HRP00052.

Последние три нуклеотида «TGA» следующих последовательностей гена SEQ ID NO: 16 и 18 представляют собой стоп-кодоны и не кодируют никакие аминокислоты.

Последовательность тяжелой цепи антитела HRP00052:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGRIGPNSGFTSYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

SEQ ID NO: 15.

Последовательность тяжелой цепи, кодирующая последовательность гена антитела HRP00052:

CAGGTGCAACTGGTGCAGAGCGGTGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCAAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGACAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAGGATCGGGCCCAACAGTGGTTTCACTAGCTACAATGAAAAGTTCAAGAACAGGGTAACCATGACCAGGGACACCTCCACCAGCACAGTGTATATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGGCGGCAGCAGCTACGACTACTTCGACTATTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGTGCTTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGGCTGCTGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA

SEQ ID NO: 16.

Последовательность легкой цепи антитела HRP00052:

DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 17.

Последовательность легкой цепи, кодирующая последовательность гена антитела HRP00052:

GACATCGTGCTGACCCAGAGTCCCGCCTCACTTGCCGTGAGCCCCGGTCAGAGGGCCACCATCACCTGTAGGGCCAGCGAGAGCGTGAGCATCCACGGCACCCACCTGATGCACTGGTATCAACAGAAACCCGGCCAGCCCCCCAAACTGCTGATCTACGCCGCCAGCAACCTGGAGAGCGGCGTGCCCGCCAGGTTCAGCGGCTCCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTCACTATCAACCCCGTGGAGGCCGAGGACACCGCCAACTACTACTGCCAGCAGAGCTTCGAGGACCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA

SEQ ID NO: 18.

Примечание. Часть с подчеркиванием представляет собой последовательность вариабельной области тяжелой или легкой цепи антитела или нуклеотидную последовательность, кодирующую ее; не имеющая подчеркивания часть представляет собой последовательность константной области антитела и соответствующую кодирующую ее нуклеотидную последовательность.

Конструировали экспрессионную плазмиду для экспрессии антитела к PD-L1 HRP00052. Нуклеотидные последовательности, кодирующие тяжелую и легкую цепи, и их соответствующий промотор, и их сигнальные последовательности полиаденилирования подтверждали с помощью анализа последовательности ДНК. Вектором экспрессии трансфицировали клеточную линию CHO. Клоны, экспрессирующие антитело, отбирали на основе стабильности роста и продуцирования, после чего получали главный посевной материал, который применяли для получения антител и создания главного клеточного банка после этого.

Клетки из главного клеточного банка размножали во встряхиваемых колбах, культуральных мешках и биореакторах для выращивания посевного материла и полученные клетки для посева использовали для получения представляющих собой антитела продуктов с помощью биореактора. Полученное антитело подвергали дополнительной очистке с помощью аффинной хроматографии с белком A, катионообменной хроматографии и анионообменной хроматографии, а также инактивации вирусов низким pH и стадий фильтрации для удаления вируса. Конкретные стадии очистки были следующими. Образец супернатанта клеточной экспрессии загружали в колонку с белком A, уравновешенную буфером PBS (Merck, 175118824). Колонку промывали PBS, до тех пор, пока показатель A280 не опускался до исходного уровня, а затем промывали с помощью буфера PB для удаления примесного белка. Целевой белок элюировали с помощью 50 мM цитрата натрия с pH 3,5, и элюированный пик собирали. После очистки смесь нейтрализовали 1 M Tris и загружали в колонку для анионообменной хроматографии (GE, 17-5316-10), уравновешенную буфером PB, и пик элюата собирали и доводили до pH 5,0 с помощью 1 M лимонной кислоты. После анионной хроматографии белок дополнительно очищали на катионной хроматографической колонке (Merck, 1.168882), уравновешенной цитратным буфером (pH 5,0). Целевой белок элюировали с помощью цитратного буфера (pH 5,0), содержащего 0,18 M хлорида натрия, и элюированный пик собирали и разделяли на аликвоты для последующего применения.

Вариант осуществления 2

Эксперименты разрабатывали на основе буферной системы, концентрации буфера, значения pH, типа сахарида и концентрации сахарида, которыми характеризовался препарат PD-L1 (1 мг/мл). Значение Tm образца определяли методикой DSC для первоначального скрининга состава препарата.

Буферную систему, концентрацию буфера, значение pH, тип сахарида и концентрацию сахарида применяли в качестве факторов, а значение Tm использовали в качестве значения отклика для разработки теста и создания расчетной таблицы. Значение Tm определяли в соответствии с экспериментальными группами расчетной таблицы.

Таблица 2. Результаты DSC со значением отклика Tm

Значение Tm применяли в качестве значения ответа и модель подбирали в соответствии с экспериментальными результатами. R² составлял 0,99987, скорректированный R² составлял 0,9979113, и P = 0,0348< 0,05 в дисперсионном анализе, что указывает на то, что модель являлась эффективной и результаты были надежными.

Примечание. Единица концентрации сахарида представляет собой г/100 мл.

В соответствии с принципом максимизации значения Tm, состав предварительно выбирали по диаграммам основных эффектов факторов Tm (фигура 3). Для буферной системы лучше использовать (натрия) ацетат, затем (натрия) сукцинат; когда концентрация буфера составляет 20-30 мM, значение Tm является более высоким; pH 5-5,6 оказывает незначительный эффект в отношении значения Tm; наиболее эффективная концентрация сахарида составляет 6%.

Вариант осуществления 3

Антитело к PD-L1 (HRP00052) составляли в виде препарата, содержащего 10 мM (натрия) сукцината, (натрия) ацетата, 60 мг/мл сахарозы и 0,2 мг/мл полисорбата 20 с pH 5,0-5,5 соответственно, и концентрация белка составляла 50 мг/мл. Каждый препарат фильтровали и загружали во флакон из нейтрального боросиликатного стекла для инъекций, закупоренный бромбутилкаучуковой пробкой, для наблюдения за долговременной стабильностью при 2-8°C. Стабильность образца иллюстрировали различными характеристиками, показанными в таблице 3.

Цвет, внешний вид и прозрачность образца определяли с помощью визуального осмотра образца под белым флуоресцентным светом при комнатной температуре на черном фоне. Чистоту образцов дополнительно оценивали с помощью высокоэффективной эксклюзионной хроматографии по размеру (HP-SEC), в ходе чего определяли долю в процентах мономера, а также долю в процентах высокомолекулярного вещества (возможно агрегатов) и пики позднего элюирования (возможно продуктов разложения). Чистоту оценивали путем выявления присутствия кислотных или основных вариантов с применением высокоэффективной ионообменной хроматографии (HP-IEX), и результаты выражали в виде доли в процентах от общего наблюдаемого вещества. Образцы анализировали по методике CE-SDS, в которой белки денатурировали с помощью додецилсульфата натрия (SDS) в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях и разделяли с помощью капиллярного электрофореза (CE). Белки разделяли на основе их средней молекулярной массы. В невосстанавливающих условиях все вещества, кроме главного пика IgG, классифицировали как примеси. В восстанавливающих условиях IgG разделяли на тяжелую и легкую цепи, а все другие вещества классифицировали как примеси.

Результаты показали, что стабильность антитела к PD-L1 в системе на основе сукцинатного буфера была в значительной степени выше, чем в системе на основе ацетатного буфера; и антитело к PD-L1 имело высокую стабильность с pH 5,0-5,5.

Таблица 3. Эффект pH и буферной системы на долговременную стабильность антитела к PD-L1 при 2-8°C

Вариант осуществления 4

Антитело к PD-L1 составляли в виде препарата, содержащего 60 мг/мл сахарозы и 0,2 мг/мл полисорбата 20 в 10 мM и 20 мM (натрия) сукцината с pH 5,2 соответственно, и концентрация белка составляла 50 мг/мл. Каждый препарат фильтровали и загружали во флакон из нейтрального боросиликатного стекла для инъекций, закупоренный бромбутилкаучуковой пробкой, с последующим ускоренным старением при 40°C и наблюдением за долговременной стабильностью при 2-8°C. Результаты показывали, что антитело к PD-L1 было вполне стабильным в буферной системе на основе 10-20 мM сукцината.

Таблица 4. Результаты стабильности препаратов при различных концентрациях буферной системы при 40°C

Таблица 5. Результаты стабильности препаратов при различных концентрациях буферной системы при 40°C

Вариант осуществления 5

Получали препараты на основе антитела к PD-L1, содержащие 50 мг/мл антитела к PD-LI (HRP00052), 20 мM (натрия) ацетата с pH 5,2 и 60 мг/мл сахарозы, и различные типы и концентрации поверхностно-активного вещества. Каждый препарат фильтровали и загружали во флакон из нейтрального боросиликатного стекла для инъекций, закупоренный бромбутилкаучуковой пробкой, и помещали в шейкер с постоянной температурой 25°C, и встряхивали при 200 об/мин.

DLS (динамическое рассеяние света) применяли для измерения среднего коэффициента диффузии, который применяли для характеристики размера частиц и распределения по размерам наноразмерных частиц в растворе. Коэффициент распределения PDI (показатель дисперсии частиц) отражает однородность размера частиц. Чем ниже значение PDI, тем более ограничено распределение частиц по размерам и более однородный размер частиц.

Результаты стабильности показали, что 0,1-0,3 мг/мл полисорбата 20 или полисорбата 80 эффективно предотвращали агрегацию антител к PD-L1 и образование крупных агломерированных частиц.

Таблица 6. Результаты теста со встряхиванием различных типов и концентраций полисорбата

Вариант осуществления 6

Получали препараты на основе антитела к PD-L1, содержащие 50 мг/мл антитела к PD-LI (HRP00052), 20 мM (натрия) сукцината с pH 5,2 и 60 мг/мл сахарозы, и различные типы и концентрации поверхностно-активного вещества. Каждый препарат фильтровали и загружали во флакон из нейтрального боросиликатного стекла для инъекций, закупоренный бромбутилкаучуковой пробкой, и помещали при 2-8°C для испытания на стабильность. Результаты показали, что полисорбат 80 был в значительной степени более эффективным, чем полисорбат 20, и не имелось значительной разницы между каждой концентрацией.

Таблица 7. Результаты стабильности препаратов с различными типами и концентрациями полисорбата при 2-8°C

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ЦЗЯНСУ ХЭНЖУЙ МЕДИСИН, Ко., Лтд.

ШАНХАЙ ХЭНЖУЙ ФАРМАСЬЮТИКАЛ, Ко., Лтд.

<120> Фармацевтическая композиция на основе антитела к PD-L1 и ее

применение

<130> P19412833RU

<150> CN201710341680.7

<151> 2017-05-16

<160> 29

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HCDR1 антитела 1

<220>

<221> НЕТОЧНАЯ

<222> (5)..(5)

<223> Xaa представляет собой N или T.

<220>

<221> НЕТОЧНАЯ

<222> (5)..(5)

<223> 'Xaa' в положении 5 представляет собой Asn или Thr.

<400> 1

Asn Asp Tyr Trp Xaa

1 5

<210> 2

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HCDR2 антитела 1

<400> 2

Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 3

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PD-L1 (ECD)-Flag-His6

<400> 3

Ser Gly Gly Trp Leu Ala Pro Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LCDR1 антитела 1

<220>

<221> НЕТОЧНАЯ

<222> (9)..(9)

<223> 'Xaa' в положении 9 представляет собой Arg или His.

<220>

<221> НЕТОЧНАЯ

<222> (14)..(14)

<223> Xaa представляет собой N или H.

<220>

<221> НЕТОЧНАЯ

<222> (14)..(14)

<223> 'Xaa' в положении 14 представляет собой Asn или His.

<400> 4

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Tyr Xaa Ser Asn Gln Lys Xaa Ser Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 5

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LCDR2 антитела 1

<400> 5

Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LCDR3 антитела 1

<400> 6

Gln Gln Tyr Tyr Gly Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 7

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HCDR1 антитела 2

<400> 7

Ser Tyr Trp Met His

1 5

<210> 8

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HCDR2 антитела 2

<220>

<221> НЕТОЧНАЯ

<222> (3)..(3)

<223> Xaa представляет собой H или G.

<220>

<221> НЕТОЧНАЯ

<222> (3)..(3)

<223> 'Xaa' в положении 3 представляет собой His или Gly.

<220>

<221> НЕТОЧНАЯ

<222> (8)..(8)

<223> Xaa представляет собой G или F.

<220>

<221> НЕТОЧНАЯ

<222> (8)..(8)

<223> 'Xaa' в положении 8 представляет собой Gly или Phe. .

<400> 8

Arg Ile Xaa Pro Asn Ser Gly Xaa Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asn

<210> 9

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HCDR3 антитела 2

<400> 9

Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 10

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LCDR1 антитела 2

<400> 10

Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His Gly Thr His Leu Met His

1 5 10 15

<210> 11

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LCDR2 антитела 2

<400> 11

Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser

1 5

<210> 12

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LCDR3 антитела 2

<400> 12

Gln Gln Ser Phe Glu Asp Pro Leu Thr

1 5

<210> 13

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного

антитела 2 после созревания аффинности

<400> 13

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Gly Pro Asn Ser Gly Phe Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 14

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепи гуманизированного антитела 2 после

созревания аффинности

<400> 14

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His

20 25 30

Gly Thr His Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 15

<211> 446

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность тяжелой цепи антитела HRP00052

<400> 15

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Gly Pro Asn Ser Gly Phe Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 16

<211> 1341

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность гена, кодирующая последовательность тяжелой цепи

антитела HRP00052

<400> 16

caggtgcaac tggtgcagag cggtgccgag gtgaagaagc ctggcgcaag cgtgaaagtg 60

agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc agctactgga tgcactgggt gaggcaggcc 120

cctggacagg gcctggagtg gatgggcagg atcgggccca acagtggttt cactagctac 180

aatgaaaagt tcaagaacag ggtaaccatg accagggaca cctccaccag cacagtgtat 240

atggagctga gcagcctgag gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc cagaggcggc 300

agcagctacg actacttcga ctattggggc cagggcacca ccgtgaccgt gagcagtgct 360

tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcgccctgct ccaggagcac ctccgagagc 420

acagccgccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480

aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540

ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac gaagacctac 600

acctgcaacg tagatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt tgagtccaaa 660

tatggtcccc catgcccacc atgcccagca cctgaggctg ctgggggacc atcagtcttc 720

ctgttccccc caaaacccaa ggacactctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 780

gtggtggtgg acgtgagcca ggaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggatggc 840

gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agttcaacag cacgtaccgt 900

gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 960

aaggtctcca acaaaggcct cccgtcctcc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1020

cagccccgag agccacaggt gtacaccctg cccccatccc aggaggagat gaccaagaac 1080

caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140

gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1200

ggctccttct tcctctacag caggctcacc gtggacaaga gcaggtggca ggaggggaat 1260

gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacaca gaagagcctc 1320

tccctgtctc tgggtaaatg a 1341

<210> 17

<211> 218

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность легкой цепи антитела HRP00052

<400> 17

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His

20 25 30

Gly Thr His Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 18

<211> 657

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность гена, кодирующая последовательность легкой цепи

антитела HRP00052

<400> 18

gacatcgtgc tgacccagag tcccgcctca cttgccgtga gccccggtca gagggccacc 60

atcacctgta gggccagcga gagcgtgagc atccacggca cccacctgat gcactggtat 120

caacagaaac ccggccagcc ccccaaactg ctgatctacg ccgccagcaa cctggagagc 180

ggcgtgcccg ccaggttcag cggctccggc agcggcaccg acttcaccct cactatcaac 240

cccgtggagg ccgaggacac cgccaactac tactgccagc agagcttcga ggaccccctg 300

accttcggcc agggcaccaa gctggagatc aagcgtacgg tggctgcacc atctgtcttc 360

atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420

aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480

ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540

agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600

acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttga 657

<210> 19

<211> 290

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность полноразмерного PD-L1 человека

<400> 19

Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu

1 5 10 15

Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr

20 25 30

Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu

35 40 45

Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile

50 55 60

Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser

65 70 75 80

Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn

85 90 95

Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr

100 105 110

Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val

115 120 125

Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val

130 135 140

Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr

145 150 155 160

Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser

165 170 175

Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn

180 185 190

Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr

195 200 205

Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu

210 215 220

Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His

225 230 235 240

Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr

245 250 255

Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys

260 265 270

Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu

275 280 285

Glu Thr

290

<210> 20

<211> 242

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PD-L1 с метками His, PADRE

<400> 20

Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser

1 5 10 15

Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu

20 25 30

Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln

35 40 45

Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg

50 55 60

Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala

65 70 75 80

Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys

85 90 95

Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val

100 105 110

Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro

115 120 125

Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys

130 135 140

Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys

145 150 155 160

Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr

165 170 175

Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr

180 185 190

Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile

195 200 205

Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Gly Ser Gly Ala

210 215 220

Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala His His His His

225 230 235 240

His His

<210> 21

<211> 234

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PD-L1 с метками FLAG, HIS: PD-L1(ECD)-Flag-His6

<400> 21

Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser

1 5 10 15

Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu

20 25 30

Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln

35 40 45

Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg

50 55 60

Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala

65 70 75 80

Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys

85 90 95

Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val

100 105 110

Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro

115 120 125

Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys

130 135 140

Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys

145 150 155 160

Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr

165 170 175

Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr

180 185 190

Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile

195 200 205

Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Asp Tyr Lys Asp

210 215 220

Asp Asp Asp Lys His His His His His His

225 230

<210> 22

<211> 447

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок на основе Fc и PD-L1: PD-L1(ECD)-Fc

<400> 22

Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser

1 5 10 15

Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu

20 25 30

Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln

35 40 45

Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg

50 55 60

Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala

65 70 75 80

Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys

85 90 95

Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val

100 105 110

Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro

115 120 125

Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys

130 135 140

Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys

145 150 155 160

Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr

165 170 175

Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr

180 185 190

Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile

195 200 205

Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 23

<211> 382

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок на основе Fc и PD-L1: PD-1(ECD)-Fc

<400> 23

Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr

1 5 10 15

Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe

20 25 30

Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr

35 40 45

Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu

50 55 60

Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu

65 70 75 80

Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn

85 90 95

Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala

100 105 110

Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg

115 120 125

Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly

130 135 140

Gln Phe Gln Thr Leu Val Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr

145 150 155 160

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

165 170 175

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

180 185 190

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

195 200 205

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

210 215 220

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

225 230 235 240

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

245 250 255

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

260 265 270

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

275 280 285

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

290 295 300

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

305 310 315 320

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

325 330 335

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

340 345 350

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

355 360 365

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

370 375 380

<210> 24

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 1 hVH- с привитыми CDR

<400> 24

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Asp

20 25 30

Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ser Gly Gly Trp Leu Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 25

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 1 hVL с привитыми CDR

<400> 25

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Tyr Arg

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Gly Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 26

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2- hVH.1

<400> 26

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile His Pro Asn Ser Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 27

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2-hVL.1

<400> 27

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His

20 25 30

Gly Thr His Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asn Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 28

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи гуманизированного антитела 1 после

созревания аффинности

<400> 28

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Asp

20 25 30

Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ser Gly Gly Trp Leu Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 29

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепи гуманизированного антитела 1 после

созревания аффинности

<400> 29

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Tyr His

20 25 30

Ser Asn Gln Lys His Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Gly Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая фармацевтическую композицию для лечения PD-L1-опосредованного заболевания или состояния, способ получения фармацевтической композици, применение фармацевтической композиции в изготовлении лекарственного препарата для лечения PD-L1-опосредованного заболевания или состояния и способ лечения PD-L1-опосредованного заболевания или состояния. В одном из вариантов реализации фармацевтическая композиция содержит 30-80 мг/мл антитела к PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента, 5-50 мМ сукцинатного буфера, 30-90 мг/мл сахарида, при этом сахарид представляет собой трегалозу или сахарозу и 0,1-1,0 мг/мл полисорбата 80 и антитело к PD-L1 содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, которые представлены под SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9 соответственно, и LCDR1, LCDR2 и LCDR3, которые представлены под SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12 соответственно. Изобретение расширяет арсенал средств для лечения PD-L1-опосредованных заболеваний или состояний. 4 н. и 12 з.п. ф-лы, 3 ил., 7 табл., 6 пр.

1. Фармацевтическая композиция для лечения PD-L1-опосредованного заболевания или состояния, содержащая:

а) 30-80 мг/мл антитела к PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента;

b) 5-50 мМ сукцинатного буфера;

c) 30-90 мг/мл сахарида, при этом сахарид представляет собой трегалозу или сахарозу;

d) 0,1-1,0 мг/мл полисорбата 80;

где антитело к PD-L1 содержит тяжелую цепь и легкую цепь, при этом тяжелая цепь содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, которые представлены под SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9 соответственно, и легкая цепь содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, которые представлены под SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12 соответственно; и аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 8 представляет собой RIX₄PNSG X₅TSYNEKFKN, где X₄ представляет собой G, и X₅ представляет собой F; и

рН фармацевтической композиции составляет от приблизительно 5,0 до 6,0.

2. Фармацевтическая композиция по п. 1, где рН фармацевтической композиции составляет от приблизительно 5,0 до 5,5, предпочтительно 5,2.

3. Фармацевтическая композиция по п. 1 или 2, где концентрация буфера составляет от приблизительно 10 до 30 мМ, предпочтительно от 10 до 20 мМ, более предпочтительно 20 мМ.

4. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-3, где концентрация антитела составляет от приблизительно 40 до 60 мг/мл, предпочтительно от приблизительно 45 до 55 мг/мл, более предпочтительно 50 мг/мл.

5. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-4, где концентрация сахарида составляет от приблизительно 40 до 80 мг/мл, предпочтительно от 55 до 65 мг/мл, более предпочтительно 60 мг/мл.

6. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-5, где концентрация полисорбата 80 составляет от 0,4 до 0,8 мг/мл, предпочтительно от 0,5 до 0,7 мг/мл, более предпочтительно 0,6 мг/мл.

7. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-6, содержащая

40-60 мг/мл антитела к PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента,

10-30 мМ сукцинатного буфера с рН 5,0-5,5,

40-80 мг/мл сахарозы и 0,4-0,8 мг/мл полисорбата 80;

предпочтительно фармацевтическая композиция содержит

45-55 мг/мл антитела к PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента,

10-20 мМ сукцинатного буфера с рН 5,0-5,5,

55-65 мг/мл сахарозы и 0,5-0,7 мг/мл полисорбата 80.

8. Фармацевтическая композиция по п. 1, где фармацевтическая композиция выбрана из одной из следующих композиций:

фармацевтической композиции А, содержащей 50 мг/мл антитела к PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента, 20 мМ сукцинатного буфера с рН 5,2, 60 мг/мл сахарозы и 0,4 мг/мл полисорбата 80;

фармацевтической композиции В, содержащей 50 мг/мл антитела к PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента, 20 мМ сукцинатного буфера с рН 5,2, 60 мг/мл сахарозы и 0,6 мг/мл полисорбата 80;

фармацевтической композиции С, содержащей 50 мг/мл антитела к PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента, 20 мМ сукцинатного буфера с рН 5,2, 60 мг/мл сахарозы и 0,8 мг/мл полисорбата 80;

фармацевтической композиции D, содержащей 50 мг/мл антитела к PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента, 20 мМ сукцинатного буфера с рН 5,5, 60 мг/мл сахарозы и 0,6 мг/мл полисорбата 80;

фармацевтической композиции Е, содержащей 50 мг/мл антитела к PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента, 20 мМ сукцинатного буфера с рН 5,8, 60 мг/мл сахарозы и 0,6 мг/мл полисорбата 80.

9. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-8, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент выбраны из группы, состоящей из мышиного антитела, химерного антитела, гуманизированного антитела и человеческого антитела.

10. Фармацевтическая композиция по п. 1, где тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи, и легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи, при этом последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента представлена под SEQ ID NO: 13, последовательность вариабельной области легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента представлена под SEQ ID NO: 14.

11. Фармацевтическая композиция по п. 10, где последовательность тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента представлена под SEQ ID NO: 15, последовательность легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента представлена под SEQ ID NO: 17.

12. Способ получения фармацевтической композици по любому из пп. 1-11, включающий смешивание антитела к PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента с фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом.

13. Применение фармацевтической композиции по любому из пп. 1-11 в изготовлении лекарственного препарата для лечения PD-L1-опосредованного заболевания или состояния, где заболевание или состояние предпочтительно представляет собой рак, предпочтительно рак, характеризующийся экспрессией PD-L1.

14. Применение по п. 13, где рак, характеризующийся экспрессией PD-L1, представляет собой рак молочной железы, рак легкого, рак желудка, рак кишечника, немелкоклеточный рак легкого, меланому, рак мочевого пузыря или рак почки.

15. Способ лечения PD-L1-опосредованного заболевания или состояния, включающий введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по любому из пп. 1-11 субъекту, нуждающемуся в этом; где заболевание или состояние представляет собой рак; предпочтительно рак, характеризующийся экспрессией PD-L1.

16. Способ по п. 15, где рак, характеризующийся экспрессией PD-L1, представляет собой рак молочной железы, рак легкого, рак желудка, рак кишечника, немелкоклеточный рак легкого, меланому, рак мочевого пузыря или рак почки.