ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ АНТИТЕЛО ПРОТИВ IL-5, И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2024 года по МПК A61K39/395 C07K16/24 A61K47/12 A61K47/26 A61K9/08 A61K9/19 A61P11/06 A61P9/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к области фармацевтических составов и, в частности, относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело к IL-5 или его антигенсвязывающий фрагмент, и к ее применению в качестве диагностического и терапевтического средства для лечения заболеваний, связанных с IL-5.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Приведенные в настоящем документе утверждения предоставляют только справочную информацию, относящуюся к настоящему раскрытию, и не обязательно представляют собой предшествующий уровень техники.

Интерлейкин-5 (IL-5) является одним из важных членов семейства интерлейкинов, также известных как фактор замещения Т-клеток (TRF), фактор роста В-клеток-II (BCGF-II), фактор усиления IgA (IgA-EF), или фактор дифференцировки эозинофилов (EDF), который представляет собой гомодимерный гликопротеин, секретируемый в основном Т-хелперными клетками 2 (Th2). Человеческий IL-5 состоит из 134 аминокислотных остатков, включая сигнальный пептид, состоящий из 22 аминокислот и двух сайтов гликозилирования. Активный IL-5 находится в форме олигодимера, в котором две пептидные цепи в антипараллельной конфигурации связаны дисульфидной связью(ями); тогда как мономер IL-5 не обладает биологической активностью (Adv Immunol. 1994; 57: 145-90).

Эозинофилы (EOS) связаны с различными воспалительными заболеваниями легких, включая аллергические заболевания, связанные с аллергическими реакциями. Астма является хроническим респираторным воспалительным заболеванием. Во всем мире насчитывается примерно 300 миллионов пациентов с уровнем заболеваемости 10%. Патогенез астмы связан с различными цитокинами. IL-5 и рецептор IL-5P играют важную роль в патогенезе астмы. В настоящее время наиболее эффективным способом лечения астмы является введение стеролов назальным или пероральным путем, чтобы ингибировать экспрессию нескольких ключевых медиаторов (включая IL-5), участвующих в астме, и тем самым уменьшить воспаление легких. Однако длительное применение стероидных средств имеет множество побочных эффектов. Следовательно, необходимо найти новую фармацевтическую мишень для лечения астмы. Исследования показали, что введение анти-1b-5 ингибирует связывание IL-5 с его рецептором; значительно снижает накопление эозинофилов в легких, а также снижает уровень эозинофилов в крови, тканях и мокроте; уменьшает воспалительную реакцию, опосредованную эозинофилами; улучшает работу легких; и оказывают благоприятное влияние на тяжелую эозинофильную астму и рецидивирующую астму (Drugs. 2017 May; 77(7):777-784).

Агенты-антитела имеют большую молекулярную массу и сложную структуру. В процессе производства, транспортировки и хранения часто возникают проблемы с антителами, связанные с денатурацией, агрегацией, контаминацией и образованием частиц. Чтобы антитело оставалось эффективным, необходимо поддерживать биологическую активность антитела во время производства, очистки, транспортировки и хранения. В настоящее время разработаны новые технологии получения и очистки для получения большого количества высокоочищенных моноклональных антител. Тем не менее, как стабилизировать эти антитела во время транспортировки и хранения и обеспечить антитела в дозированных формах, подходящих для введения, всегда было проблемой.

Что касается антител к IL-5, в настоящее время к продаже одобрены только меполизумаб от GSK и реслизумаб от Teva Pharma. Родственные патенты включают WO 2018119016, WO 2017033121, WO 2014141149, WO 2016040007, WO 2015095539, WO 2012138958 и WO 9535375 и т.д.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, которая содержит антитело к IL-5 или его антигенсвязывающий фрагмент, буфер и поверхностно-активное вещество, где буфер представляет собой любой буфер, выбранный из группы, состоящей из уксусной кислоты-ацетата натрия, янтарной кислоты-сукцината натрия, гистидина-гидрохлорида и лимонной кислоты-цитрата натрия, предпочтительно буфер уксусная кислота-ацетат натрия или янтарная кислота-сукцинат натрия; при этом антитело к IL-5 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, при этом:

(i) вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16, 17 и 18, соответственно; и

вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19, 20 и 21, соответственно;

(ii) вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 22, 23 и 24, соответственно; и

вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 25, 26 и 27, соответственно;

(iii) вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 28, 29 и 30, соответственно; и

вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 31, 32 и 33, соответственно;

(iv) вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34, 35 и 36, соответственно; и

вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 37, 38 и 39, соответственно;

(у) вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40, 41 и 42, соответственно; и

вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 43, 44 и 45, соответственно; или

(vi) вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34, 82 и 36, соответственно; и

вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 37, 38 и 39, соответственно.

В альтернативных вариантах реализации рН буфера в фармацевтической композиции составляет от примерно 5,0 до примерно 6,5, предпочтительно от примерно 5,5 до примерно 6,5, предпочтительно от примерно 6,0 до примерно 6,5, предпочтительно от примерно 5,0 до примерно 6,0, предпочтительно от примерно 5,5 до примерно 6,0, предпочтительно от примерно 5,0 до примерно 5,5, предпочтительно от примерно 5,0 до примерно 5,8, предпочтительно от примерно 5,2 до примерно 5,8; неограничивающие примеры рН буфера включают примерно 5,0, примерно 5,1, примерно 5,2, примерно 5,3, примерно 5,4, примерно 5,5, примерно 5,6, примерно 5,7, примерно 5,8, примерно 5,9, примерно 6,0, примерно 6,5, и наиболее предпочтительно примерно 5,5.

В альтернативных вариантах реализации концентрация буфера в фармацевтической композиции составляет от примерно 10 мМ до примерно 40 мМ, от примерно 10 мМ до примерно 30 мМ, предпочтительно от примерно 15 мМ до примерно 30 мМ, предпочтительно от примерно 20 мМ до примерно 30 мМ, предпочтительно от примерно 25 мМ до примерно 30 мМ, предпочтительно от примерно 10 мМ до примерно 25 мМ, предпочтительно от примерно 15 мМ до примерно 25 мМ, предпочтительно от примерно 20 мМ до примерно 25 мМ, предпочтительно от примерно 10 мМ до примерно 15 мМ; неограничивающие примеры концентрации буфера включают примерно 10 мМ, примерно 12 мМ, примерно 14 мМ, примерно 16 мМ, примерно 18 мМ, примерно 20 мМ, примерно 22 мМ, примерно 24 мМ, примерно 26 мМ, примерно 28 мМ, примерно 30 мМ, примерно 32 мМ, примерно 34 мМ, и наиболее предпочтительно примерно 30 мМ.

В альтернативных вариантах реализации концентрация антитела к IL-5 или его антигенсвязывающего фрагмента в фармацевтической композиции составляет от примерно 1 мг/мл до примерно 120 мг/мл, предпочтительно от примерно 1 мг/мл до примерно 100 мг/мл, предпочтительно от примерно 10 мг/мл до примерно 120 мг/мл, предпочтительно от примерно 20 мг/мл до примерно 120 мг/мл, предпочтительно от примерно 30 мг/мл до примерно 120 мг/мл, предпочтительно от примерно 40 мг/мл до примерно 120 мг/мл, предпочтительно от примерно 50 мг/мл до примерно 120 мг/мл, предпочтительно от примерно 60 мг/мл до примерно 120 мг/мл, предпочтительно от примерно 70 мг/мл до примерно 120 мг/мл, предпочтительно от примерно 80 мг/мл до примерно 120 мг/мл, предпочтительно от примерно 90 мг/мл до примерно 120 мг/мл, предпочтительно от примерно 100 мг/мл до примерно 120 мг/мл, предпочтительно от примерно 110 мг/мл до примерно 120 мг/мл, предпочтительно от примерно 20 мг/мл до примерно 100 мг/мл, предпочтительно от примерно 30 мг/мл до примерно 100 мг/мл, предпочтительно от примерно 40 мг/мл до примерно 100 мг/мл, предпочтительно от примерно 50 мг/мл до примерно 100 мг/мл, предпочтительно от примерно 60 мг/мл до примерно 100 мг/мл, предпочтительно от примерно 70 мг/мл до примерно 100 мг/мл, предпочтительно от примерно 80 мг/мл до примерно 100 мг/мл, предпочтительно от примерно 90 мг/мл до примерно 100 мг/мл; в качестве неограничивающих примеров, концентрация антитела к IL-5 или его антигенсвязьшающего фрагмента составляет примерно 80 мг/мл, примерно 85 мг/мл, примерно 90 мг/мл, примерно 91 мг/мл, примерно 92 мг/мл, примерно 93 мг/мл, примерно 94 мг/мл, примерно 95 мг/мл, примерно 96 мг/мл, примерно 97 мг/мл, примерно 98 мг/мл, примерно 99 мг/мл, примерно 100 мг/мл, примерно 101 мг/мл, примерно 102 мг/мл, примерно 103 мг/мл, примерно 104 мг/мл, примерно 105 мг/мл, примерно 106 мг/мл, примерно 107 мг/мл, примерно 108 мг/мл, примерно 109 мг/мл, примерно 110 мг/мл, примерно 115 мг/мл, примерно 120 мг/мл и наиболее предпочтительно примерно 100 мг/мл.

В альтернативных вариантах реализации поверхностно-активное вещество, входящее в состав фармацевтической композиции, может быть выбрано из группы, состоящей из полисорбата 20, полисорбата 80, полигидроксиалкилена, тритона, додецилсульфоната натрия, лаурилсульфоната натрия, октилгликозида натрия, лаурилсульфобетаина, миристилсульфобетаина, линолеилсульфобетаина, стеарилсульфобетаина, лаурилсаркозина, миристиласаркозина, линолеилсаркозина, стеарилсаркозина, линолеилбетаина, миристилбетаина, цетилбетаина, лаурамидопропилабетаина, кокамидопропилбетаина, линолеамидопропилбетаина, миристамидопропилбетаина, пальмитамидопропилбетаина, изостеамидопропилбетаина, миристамидопропилдиметиламина, пальмамидопропилдиметиламина, изостеарамидопропилдиметиламина, метилкокоила натрия, метилолеоилтаурата натрия, полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимеров этилена и пропиленгликоля и др. Предпочтительным поверхностно-активным веществом является полисорбат 80 или полисорбат 20, и более предпочтительно полисорбат 80.

В альтернативных вариантах реализации концентрация полисорбата 80 в фармацевтической композиции составляет от примерно 0,05 мг/мл до примерно 0,6 мг/мл, предпочтительно от примерно 0,1 мг/мл до примерно 0,6 мг/мл, предпочтительно от примерно 0,2 мг/мл до примерно 0,6 мг/мл, предпочтительно от примерно 0,3 мг/мл до примерно 0,6 мг/мл, предпочтительно от примерно 0,4 мг/мл до примерно 0,6 мг/мл, предпочтительно от примерно 0,5 мг/мл до примерно 0,6 мг/мл, предпочтительно от примерно 0,2 мг/мл до примерно 0,5 мг/мл, предпочтительно от примерно 0,3 мг/мл до примерно 0,5 мг/мл, предпочтительно от примерно 0,4 мг/мл до примерно 0,5 мг/мл, предпочтительно от примерно 0,3 мг/мл до примерно 0,4 мг/мл, в качестве неограничивающих примеров, концентрация поверхностно-активного вещества в фармацевтической композиции составляет примерно 0,2 мг/мл, примерно 0,3 мг/мл, примерно 0,4 мг/мл, примерно 0,45 мг/мл, примерно 0,5 мг/мл, примерно 0,55 мг/мл, примерно 0,6 мг/мл, и наиболее предпочтительно примерно 0,4 мг/мл.

Кроме того, в альтернативных вариантах реализации фармацевтическая композиция дополнительно содержит вспомогательное вещество(а), причем вспомогательное вещество выбрано из стабилизаторов.

В альтернативных вариантах реализации стабилизатор выбран из сахарида или аминокислоты; причем сахарид может быть выбран из группы, состоящей из сахарозы, трегалозы, маннита и сорбита, предпочтительно сахарозы. Аминокислота выбрана из группы, состоящей из глицина, метионина и пролина.

В альтернативных вариантах реализации концентрация сахарида составляет от примерно 50 мг/мл до примерно 80 мг/мл, предпочтительно от примерно 60 мг/мл до примерно 80 мг/мл, предпочтительно от примерно 70 мг/мл до примерно 80 мг/мл, предпочтительно от примерно 75 мг/мл до примерно 80 мг/мл, предпочтительно от примерно 70 мг/мл до примерно 75 мг/мл; в качестве неограничивающих примеров, концентрация стабилизатора в фармацевтической композиции включает примерно 70 мг/мл, примерно 71 мг/мл, примерно 72 мг/мл, примерно 73 мг/мл, примерно 74 мг/мл, примерно 75 мг/мл, примерно 76 мг/мл, примерно 77 мг/мл, примерно 78 мг/мл, примерно 79 мг/мл, примерно 80 мг/мл, и наиболее предпочтительно примерно 72 мг/мл.

В альтернативных вариантах концентрация аминокислоты составляет примерно 8 мг/мл.

В альтернативных вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит:

(а) от примерно 1 мг/мл до примерно 120 мг/мл антитела к IL-5 или его антигенсвязьшающего фрагмента; (b) от примерно 10 мМ до примерно 30 мМ буфера уксусная кислота-ацетат натрия, рН примерно от 5,0 до 6,5; и (с) от примерно 0,1 мг/мл до примерно 0,6 мг/мл полисорбата 80.

В альтернативных вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит:

(а) от примерно 80 мг/мл до примерно 100 мг/мл антитела к IL-5 или его антигенсвязывающего фрагмента; (b) от примерно 10 мМ до примерно 30 мМ буфера уксусная кислота-ацетат натрия, рН примерно от 5,0 до 6,0; и (с) от примерно 0,1 мг/мл до примерно 0,4 мг/мл полисорбата 80.

В альтернативных вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит:

(d) от примерно 80 мг/мл до примерно 120 мг/мл антитела к IL-5 или его антигенсвязывающего фрагмента; (е) от примерно 10 мМ до примерно 30 мМ буфера уксусная кислота-ацетат натрия, рН составляет от примерно 5,0 до примерно 5,8; (f) от примерно 0,2 мг/мл до примерно 0,6 мг/мл полисорбата 80; и (g) примерно от 70 мг/мл до примерно 75 мг/мл сахарозы; предпочтительно, фармацевтическая композиция предпочтительно содержит:

(h) примерно 100 мг/мл антитела к IL-5 или его антигенсвязывающего фрагмента, (i) примерно 30 мМ буфера уксусная кислота-ацетат натрия, рН примерно 5,5, (j) примерно 0,4 мг/мл полисорбата 80 и (k) примерно 72 мг/мл сахарозы.

В некоторых предпочтительных вариантах реализации антитело к IL-5 или его антигенсвязьшающий фрагмент в фармацевтической композиции по настоящему изобретению представляет собой мышиное антитело, химерное антитело или гуманизированное антитело.

В альтернативных вариантах реализации гуманизированное антитело к IL-5 в фармацевтической композиции содержит вариабельную область тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 49, 57, 63, 69 или 75, или ее вариант; при этом вариант включает от 1 до 10 аминокислотных обратных мутаций в последовательности вариабельной области тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 49, 57, 63, 69 или 75, соответственно.

В альтернативных вариантах реализации вариант представляет собой любой вариант, выбранный из группы, состоящей из следующего:

(i) вариант, включающий одну или более обратных мутаций аминокислот, выбранных из группы, состоящей из S49T, V93T и K98S в вариабельной области тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 49;

(i) вариант, включающий одну или более обратных мутаций аминокислот, выбранных из группы, состоящей из S49T, V93T и K98T в вариабельной области тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 57;

(iii) вариант, включающий одну или более обратных мутаций аминокислот, выбранных из группы, состоящей из R38K, M48I, R67K, V68A, M70L, R72V, T74K и L83F в вариабельной области тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 63;

(iv) вариант, включающий одну или более обратных мутаций аминокислот, выбранных из группы, состоящей из F29I, R38K, V48I, R72A и T97F в вариабельной области тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 69, и/или мутацию N55V в CDR; или

(у) вариант, включающий одну или более обратных мутаций аминокислот, выбранных из группы, состоящей из R38K, M48I, R67K, V68A, R72A, T74K, M81L, L83F и D89E в вариабельной области тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 75.

В альтернативных вариантах реализации гуманизированное антитело к IL-5 в фармацевтической композиции содержит:

вариабельную область тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 50 или 51; или

вариабельную область тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 58 или 59; или

вариабельную область тяжелой цепи, как показано, в любой, выбранной из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 64, 65 и 66; или

вариабельную область тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 70 или 71; или

вариабельную область тяжелой цепи, как показано, в любой, выбранной из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 76, 77, 78 и 79.

В альтернативных вариантах реализации гуманизированное антитело к IL-5 в фармацевтической композиции содержит вариабельную область легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 46, 54, 60, 67 или 72, или ее варианты; при

этом вариант включает от 1 до 10 аминокислотных обратных мутаций в вариабельной области легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 46, 54, 60, 67 или 72.

В альтернативных вариантах реализации вариант представляет собой любой вариант, выбранный из группы, состоящей из следующих:

(i) вариант, включающий одну или более обратных мутаций аминокислот, выбранных из группы, состоящей из A43S, L47V, G66R, T69S, F71Y и Y87F в вариабельной области легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 46;

(ii) вариант, включающий одну или более обратных мутаций аминокислот, выбранных из группы, состоящей из A43S, L47M, F71Y и Y87F в вариабельной области легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 54;

(iii) вариант, включающий обратную мутацию(и) аминокислот, выбранную из группы, состоящей из E1D, I2T, I57V, V84T and Y86F в вариабельной области легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 60, или их комбинацию;

(iv) вариант, включающий одну или более обратных мутаций аминокислот, выбранных из группы, состоящей из: M4L, A42S, L45P и L46W в вариабельной области легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 67; и

(v) вариант, включающий одну или более обратных мутаций аминокислот, выбранных из группы, состоящей из A43S, 148V и F71Y в вариабельной области легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 72.

В альтернативных вариантах реализации гуманизированное антитело к IL-5 в фармацевтической композиции содержит:

вариабельную область легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 47 или 48; или

вариабельную область легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 55 или 56; или

вариабельную область легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 61 или 62; или

вариабельную область легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 68, или вариабельную область легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 73 или 74.

В альтернативных вариантах реализации гуманизированное антитело к IL-5 в фармацевтической композиции содержит:

(i) вариабельную область тяжелой цепи, как показано в любой из SEQ ID NO: 49, 50 и 51, или имеющую 95% идентичности последовательности с любой из SEQ ID NO: 49, 50 и 51; и

вариабельную область легкой цепи, как показано в любой из SEQ ID NO: 46, 47 и 48, или имеющую 95% идентичности последовательности с любой из SEQ ID NO: 46, 47 и 48;

(ii) вариабельную область тяжелой цепи, как показано в любой из SEQ ID NO: 57, 58 и 59, или имеющую 95% идентичности последовательности с любой из SEQ ID NO: 57, 58 и 59; и

вариабельную область легкой цепи, как показано в любой из SEQ ID NO: 54, 55 и 56, или имеющую 95% идентичности последовательности с любой из SEQ ID NO: 54, 55 и 56;

(iii) вариабельную область тяжелой цепи, как показано в любой из SEQ ID NO: 63, 64, 65 и 66, или имеющую 95% идентичности последовательности с любой из SEQ ID NO: 63, 64, 65 и 66; и

вариабельную область легкой цепи, как показано в любой из SEQ ID NO: 60, 61 и 62, или имеющую 95%) идентичности последовательности с любой из SEQ ID NO: 60, 61 и 62;

(iv) вариабельную область тяжелой цепи, как показано в любой из SEQ ID NO: 69, 70 и 71, или имеющую 95%) идентичности последовательности с любой из SEQ ID NO: 69, 70 и 71; и

вариабельную область легкой цепи, как показано в любой из SEQ ID NO: 67 и 68, или имеющую 95% идентичности последовательности с любой из SEQ ID NO: 67 и 68; или

(v) вариабельную область тяжелой цепи, как показано в любой из SEQ ID NO: 75, 76, 77, 78 и 79, или имеющую 95%) идентичности последовательности с любой из SEQ ID NO: 75, 76, 77, 78 и 79; и

вариабельную область легкой цепи, как показано в любой из SEQ ID NO: 72, 73 и 74, или имеющую 95% идентичности последовательности с любой из SEQ ID NO: 72, 73 и74; предпочтительно, гуманизированное антитело к IL-5 содержит:

(a) вариабельную область тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 51, и вариабельную область легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 47;

(b) вариабельную область тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 65, и вариабельную область легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 62;

(c) вариабельную область тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 56;

(d) вариабельную область тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 71, и вариабельную область легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 68, или

(e) вариабельную область тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 79, и вариабельную область легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 73.

Аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 95% идентичности последовательности, как описано выше, предпочтительно имеет по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности и более предпочтительно имеет 97%, 98% или 99% или более, и наиболее предпочтительно имеет по меньшей мере 99% идентичности последовательности или выше, причем аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 95% идентичности последовательности, как описано выше, включает одну или более аминокислотных делеций, вставок или замен, полученных путем мутации.

В альтернативных вариантах реализации антитело к IL-5 в фармацевтической композиции содержит константную область человеческого антитела, предпочтительно константную область тяжелой цепи человеческого антитела, как показано в SEQ ID NO: 52, и константную область легкой цепи человеческого антитела, как показано в SEQ ID NO: 53.

В альтернативных вариантах реализации антитело к IL-5 в фармацевтической композиции содержит:

(i) тяжелую цепь, как показано в SEQ ID NO: 83, и легкую цепь, как показано в SEQ ID NO: 84;

(ii) тяжелую цепь, как показано в SEQ ID NO: 85, и легкую цепь, как показано в SEQ ID NO: 86;

(iii) тяжелую цепь, как показано в SEQ ID NO: 87, и легкую цепь, как показано в SEQ ID NO: 88;

(iv) тяжелую цепь, как показано в SEQ ID NO: 89, и легкую цепь, как показано в SEQ ID NO: 90; или

(v) тяжелую цепь, как показано в SEQ ID NO: 91, и легкую цепь, как показано в SEQ ID NO: 92.

В альтернативных вариантах реализации антитело к IL-5 в фармацевтической композиции представляет собой моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют за связывание с IL-5 с антителом к IL-5 или его антигенсвязывающим фрагментом, как описано выше.

В предпочтительном варианте реализации антигенсвязывающий фрагмент в фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению выбран из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab")2, одноцепочечного антитела (scFv), димеризованной V-области (диатела) и V-области, стабилизированной дисульфидной связью (dsFv).

В настоящем раскрытии дополнительно предложен способ получения фармацевтической композиции, как описано выше, где он включает стадию замены исходного раствора антитела к IL-5 буфером. В альтернативных вариантах реализации предпочтительным буфером является буфер из уксусной кислоты и ацетата натрия. рН буфера составляет от примерно 5,0 до примерно 6,5, предпочтительно от примерно 5,5 до примерно 6,5, предпочтительно от примерно 6,0 до примерно 6,5, предпочтительно от примерно 5,0 до примерно 6,0, предпочтительно от примерно 5,5 до примерно 6,0, предпочтительно от примерно 5,0 до примерно 5,5, предпочтительно от примерно 5,2 до примерно 5,8, неограничивающие примеры значения рН включают примерно 5,0, примерно 5,1, примерно 5,2, примерно 5,3, примерно 5,4, примерно 5,5, примерно 5,6, примерно 5,7, примерно 5,8, примерно 5,9, примерно 6,0, примерно 6,5, и наиболее предпочтительно примерно 5,5. В альтернативных вариантах реализации концентрация буфера в фармацевтической композиции составляет от примерно 10 мМ до примерно 30 мМ, предпочтительно от примерно 15 мМ до примерно 30 мМ, предпочтительно от примерно 20 мМ до примерно 30 мМ, предпочтительно от примерно 25 мМ до примерно 30 мМ, предпочтительно от примерно 5 мМ до примерно 25 мМ, предпочтительно от примерно 10 мМ до примерно 25 мМ, предпочтительно от примерно 15 мМ до примерно 25 мМ, предпочтительно от примерно 20 мМ до примерно 25 мМ, предпочтительно от примерно 5 мМ до примерно 20 мМ, предпочтительно от примерно 10 мМ до примерно 15 мМ; неограничивающие примеры концентрации буфера включают примерно 10 мМ, примерно 12 мМ, примерно 14 мМ, примерно 16 мМ, примерно 18 мМ, примерно 20 мМ, примерно 22 мМ, примерно 24 мМ, примерно 26 мМ, примерно 28 мМ, примерно 30 мМ, и наиболее предпочтительно примерно 30 мМ.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 100 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ уксусной кислоты-ацетата натрия, рН 5,5 и 0,2 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 100 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ уксусной кислоты-ацетата натрия, рН 5,5 и 0,05 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 100 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ янтарной кислоты-сукцината натрия, рН 5,0 и 0,2 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 100 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ янтарной кислоты-сукцината натрия, рН 5,5 и 0,2 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 100 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ янтарной кислоты-сукцината натрия, рН 6,0 и 0,2 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 100 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ янтарной кислоты-сукцината натрия, рН 5,0 и 0,05 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 100 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ янтарной кислоты-сукцината натрия, рН 5,5 и 0,05 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 100 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ янтарной кислоты-сукцината натрия, рН 6,0 и 0,05 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 100 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ лимонной кислоты-цитрата натрия, рН 6,5 и 0,2 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 100 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ лимонной кислоты-цитрата натрия, рН 5,5 и 0,2 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 100 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ лимонной кислоты-цитрата натрия, рН 6,0 и 0,2 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 100 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ лимонной кис лоты-цитрата натрия, рН 6,5 и 0,05 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 100 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ лимонной кис лоты-цитрата натрия, рН 5,5 и 0,05 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 100 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ лимонной кис лоты-цитрата натрия, рН 6,0 и 0,05 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 100 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ лимонной кислоты-цитрата натрия, рН 6,5 и 0,2 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 100 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ лимонной кислоты-цитрата натрия, рН 5,5 и 0,2 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 100 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ гистидина-хлористоводородной кислоты, рН 6,0 и 0,2 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 100 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ гистидина-хлористоводородной кислоты, рН 6,5 и 0,05 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 100 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ гистидина-хлористоводородной кислоты, рН 5,5 и 0,05 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 100 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ гистидина-хлористоводородной кислоты, рН 6,0 и 0,05 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 100 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ янтарной кислоты-сукцината натрия, рН 5,0 и 0,1 мг/мл полисорбата 20.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 100 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ янтарной кислоты-сукцината натрия, рН 5,0 и 0,1 мг/мл полисорбата 20.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 100 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ янтарной кислоты-сукцината натрия с рН 5,0, 50 мг/мл сахарозы и 0,1 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 100 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ янтарной кислоты-сукцината натрия с рН 5,0, 50 мг/мл трегалозы и 0,1 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 100 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ янтарной кислоты-сукцината натрия с рН 5,0, 50 мг/мл маннита и 0,1 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 100 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ янтарной кислоты-сукцината натрия с рН 5,0, 50 мг/мл сорбита и 0,1 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 100 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ янтарной кислоты-сукцината натрия с рН 5,0, 8 мг/мл глицина и 0,1 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 100 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ янтарной кислоты-сукцината натрия с рН 5,0, 8 мг/мл метионина и 0,1 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 100 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ янтарной кислоты-сукцината натрия с рН 5,0, 8 мг/мл пролина и 0,1 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 100 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ янтарной кислоты-сукцината натрия с рН 5,5, 70 мг/мл сахарозы и 0,4 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 80 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ уксусной кислоты-ацетата натрия с рН 5,8 и 0,2 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 100 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ уксусной кислоты-ацетата натрия с рН 5,4 и 0,6 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 80 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ уксусной кис лоты-ацетата натрия с рН 5,4 и 0,4 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 80 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ уксусной кислоты-ацетата натрия с рН 5,0 и 0,2 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 100 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ уксусной кислоты-ацетата натрия с рН 5,4 и 0,2 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 80 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ уксусной кислоты-ацетата натрия с рН5,8 и 0,6 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 120 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ уксусной кислоты-ацетата натрия с рН 5,0 и 0,2 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 80 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ уксусной кислоты-ацетата натрия с рН 5,0 и 0,6 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 120 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ уксусной кислоты-ацетата натрия с рН 5,8 и 0,6 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 120 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ уксусной кислоты-ацетата натрия с рН 5,4 и 0,4 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 100 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ уксусной кислоты-ацетата натрия с рН 5,4 и 0,4 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 120 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ уксусной кислоты-ацетата натрия с рН 5,0 и 0,6 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 120 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ уксусной кислоты-ацетата натрия с рН 5,8 и 0,2 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 100 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ уксусной кислоты-ацетата натрия с рН 5,0 и 0,4 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 100 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ уксусной кислоты-ацетата натрия с рН 5,8 и 0,4 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 100 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 10 мМ уксусной кислоты-ацетата натрия с рН 5,5, 70 мг/мл сахарозы и 0,4 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 100 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 20 мМ уксусной кислоты-ацетата натрия с рН 5,5, 70 мг/мл сахарозы и 0,4 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 100 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 30 мМ уксусной кислоты-ацетата натрия с рН 5,5, 70 мг/мл сахарозы и 0,4 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 100 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 30 мМ уксусной кислоты-ацетата натрия с рН 5,5, 73 мг/мл сахарозы и 0,4 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит: 100 мг/мл антитела к IL-5 h1705-008, 30 мМ уксусной кислоты-ацетата натрия с рН 5,5, 75 мг/мл сахарозы и 0,4 мг/мл полисорбата 80.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция по настоящему изобретению стабильна при 2-8°С в течение по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 18 месяцев или по меньшей мере 24 месяцев. Фармацевтическая композиция может быть стабильной при 25°С в течение по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев.

В настоящем изобретении дополнительно предложен способ получения лиофилизированного состава, содержащего антитело к IL-5, который включает стадию лиофилизации фармацевтической композиции, как описано выше.

В альтернативном варианте реализации лиофилизация в способе получения лиофилизированного состава, содержащего антитело к IL-5, включает стадии предварительного замораживания, первичной сушки и вторичной сушки, последовательно. Лиофилизацию осуществляют путем замораживания состава и последующей сублимации воды при температуре, подходящей для первичной сушки. В таких условиях температура продукта составляет ниже точки эвтектики или температуры разложения состава. При подходящем давлении, обычно в диапазоне примерно от 50 до 250 мТорр, температура хранения для первичной сушки обычно составляет примерно от -30 до 25°С (при условии, что продукт остается замороженным во время первичной сушки). Состав, размер и тип контейнера для образца (например, стеклянный флакон) и объем жидкости определяют продолжительность времени, необходимого для сушки, и продолжительность времени может варьироваться от нескольких часов до нескольких дней (например, от 40 до 60 часов). Вторичную сушку можно проводить при температуре примерно от 0 до 40°С, что в основном зависит от типа и размера контейнера и типа используемого белка. Продолжительность вторичной сушки определяется желаемым уровнем остаточной влажности продукта и обычно составляет не менее примерно 5 часов. Как правило, содержание воды в лиофилизированном составе, полученном при низком давлении, составляет менее примерно 5%, предпочтительно менее примерно 3%. Давление может быть таким же, как и давление, применяемое на стадии первичной сушки; предпочтительно давление, используемое при вторичной сушке, ниже, чем давление, используемое при первичной сушке. Условия лиофилизации могут варьироваться в зависимости от состава и размера флакона.

Настоящее изобретение дополнительно относится к лиофилизированному составу, содержащему антитело к IL-5, полученному способом получения лиофилизированного состава, содержащего антитело к IL-5, как описано выше.

В некоторых вариантах реализации лиофилизированный состав является стабильным при 2-8°С в течение по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 18 месяцев или по меньшей мере 24 месяцев. В некоторых вариантах реализации лиофилизированный состав является стабильным при 40°С в течение по меньшей мере 7 дней, по меньшей мере 14 дней или по меньшей мере 28 дней.

В настоящем раскрытии дополнительно предложен способ получения восстановленного раствора лиофилизированного состава, содержащего антитело к IL-5, где он включает стадию восстановления лиофилизированного состава, как описано выше, и раствор, используемый для восстановления, содержит, но не ограничивается ими, воду для инъекций, изотонический раствор или раствор глюкозы.

Настоящее изобретение дополнительно относится к восстановленному раствору лиофилизированного состава, содержащего антитело к IL-5, полученному способом получения восстановленного раствора лиофилизированного состава, содержащего антитело к IL-5, как описано выше.

В соответствии с настоящем изобретением дополнительно предложено изделие или набор, который содержит контейнер(ы), содержащий любую из стабильных фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации контейнер представляет собой флакон для инъекций, изготовленный из нейтрального боросиликатного стекла.

В настоящем изобретении дополнительно предложено изделие, которое содержит контейнер(ы), содержащие фармацевтическую композицию или лиофилизированный состав, или восстановленный раствор лиофилизированного состава, как описано выше.

В настоящем изобретении также предложен способ лечения заболевания(й), опосредованного IL-5, включающий введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции или лиофилизированного состава, или восстановленного раствора, или промышленного изделия, как описано выше, субъекту, нуждающемуся в этом; причем заболевание, опосредованное IL-5, предпочтительно выбрано из группы, состоящей из астмы, хронической пневмонии, аллергического ринита, аллергического бронхолегочного аспергиллеза, эозинофилии, синдрома Чарга-Стросса, атопического дерматита, онхоцеркозного дерматита, перемежающегося ангионевротического отека, синдрома эозинофильной миалгии, эозинофильного гастроэнтерита, глистной инфекции, болезни Ходжкина, полипов носа, синдрома Леффлера, крапивницы, гипер эозинофильного бронхита, узелкового артериита, синусита, эозинофильного эзофагита, аллергического эозинофильного эзофагита, аллергического конъюнктивита, онхоцеркозного дерматита, эндометриоза и стероид-зависимого эозинофильного бронхита.

В настоящем изобретении также предложено применение фармацевтической композиции или лиофилизированного состава, или восстановленного раствора лиофилизированного состава, или промышленного изделия, как описано выше, для получения лекарственного средства для лечения заболевания(ий), опосредованного IL-5; причем заболевание, опосредованное IL-5, предпочтительно выбрано из группы, состоящей из астмы, хронической пневмонии, аллергического ринита, аллергического бронхолегочного аспергиллеза, эозинофилии, синдрома Чарга-Стросса, атопического дерматита, онхоцеркозного дерматита, перемежающегося ангионевротического отека, синдрома эозинофильной миалгии, эозинофильного гастроэнтерита, глистной инфекции, болезни Ходжкина, полипов носа, синдрома Леффлера, крапивницы, гипер эозинофильного бронхита, узелкового артериита, синусита, эозинофильного эзофагита, аллергического эозинофильного эзофагита, аллергического конъюнктивита, онхоцеркозного дерматита, эндометриоза и стероид-зависимого эозинофильного бронхита.

В настоящем изобретении также предложена фармацевтическая композиция или лиофилизированный состав, или восстановленный раствор лиофилизированного состава, или промышленное изделие, как описано выше, для применения в качестве лекарственного средства, причем лекарственное средство предназначено для лечения заболевания(ий), опосредованного IL-5; причем заболевание, опосредованное IL-5, предпочтительно выбрано из группы, состоящей из астмы, хронической пневмонии, аллергического ринита, аллергического бронхолегочного аспергиллеза, эозинофилии, синдрома Чарга-Стросса, атопического дерматита, онхоцеркозного дерматита, перемежающегося ангионевротического отека, синдрома эозинофильной миалгии, эозинофильного гастроэнтерита, глистной инфекции, болезни Ходжкина, полипов носа, синдрома Леффлера, крапивницы, гипер эозинофильного бронхита, узелкового артериита, синусита, эозинофильного эзофагита, аллергического эозинофильного эзофагита, аллергического конъюнктивита, онхоцеркозного дерматита, эндометриоза и стероид-зависимого эозинофильного бронхита.

Как хорошо известно специалистам в данной области техники, один, некоторые или все признаки каждого варианта реализации настоящего изобретения могут быть дополнительно объединены для образования других вариантов реализации настоящего изобретения. Варианты релизации настоящего раскрытия, как описано выше, и дополнительные варианты релизации, полученные с помощью комбинации, дополнительно проиллюстрированы приведенным ниже подробным описанием.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1 представляет результаты экспериментов FACS, в которых антитела к IL-5 блокируют связывание IL-5 с рецептором IL-5;

Фигура 2 представляет результат обнаружения специфичности связывания антитела к IL-5 с цитокином Th2;

На Фигуре 3 показано, что антитело к IL-5 усиливает течение перемежающегося респираторного синдрома (Penh). G1: нормальная контрольная группа (PBS); G2: модельная группа (IgG); G3: группа антител h1705-008 10 mpk; G4: группа антител h1705-008 2mpk; G5: группа антител h1706-009 10 mpk; G6: группа антител h1706-009 2mpk; G7: группа Hu39D10 10mpk; где *р<0,05, **<0,01 (по сравнению с группой G2, согласно ANOVA/Bonferroni);

Фигура 4А представляет уровень эозинофилов BALF в легких мышей с астмой; на Фигуре 4 В представлена оценка толщины слизистой оболочки трахеи мышей с астмой. G1: нормальная контрольная группа; G2: модельная группа; G3: группа антител h1705-008 10 mpk; G4: группа антител h1705-008 2mpk; G5: группа антител h1706-009 10 mpk; G6: группа антител h1706-009 2mpk; G7: группа Hu39D10 10mpk; Фигура 4С представляет процентное содержание эозинофилов BALF в легких мышей с астмой;

На Фигуре 5А и Фигуре 5В представлена способность моноклонального антитела IL5 снижать уровень эозинофилов в BALF.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ РЕАЛИЗАЦИИ

Термины

Для более легкого понимания настоящего раскрытия некоторые технические и научные термины конкретно определены ниже. Все другие технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют значение, обычно понятное специалистам в области техники, к которой относится настоящее раскрытие, если иное явно не определено в настоящем документе.

«Буфер» относится к буферу, который устойчив к изменениям рН под действием его компонентов кислотно-щелочного конъюгата. Примеры буфера, который регулирует рН в соответствующем диапазоне, включают ацетатный, сукцинатный, глюконатный, гистидиновый, оксалатный, лактатный, фосфатный, цитратный, тартратный, фумаратный, глицилглициновый и другие буферы на основе органических кислот.

«Гистидиновый солевой буфер» представляет собой буфер, содержащий ионы гистидина. Примеры буфера на основе соли гистидина включают гистидин-гидрохлоридный, гистидин-ацетатный, гистидин-фосфатный, гистидин-сульфатный буфер и т.п.; предпочтительно гистидин-ацетатный буфер или гистидин-гидрохлоридный буфер; гистидин-ацетатный буфер готовят из гистидина и уксусной кислоты, а гистидиновый солевой буфер готовят из гистидина и HCl.

«Цитратный буфер» представляет собой буфер, содержащий ионы цитрата. Примеры нитратного буфера включают лимонную кислоту-цитрат натрия, лимонную кислоту-цитрат калия, лимонную кислоту-цитрат кальция, лимонную кислоту-цитрат магния и т.п. Предпочтительным цитратным буфером является лимонная кислота-цитрат натрия.

«Сукцинатный буфер» представляет собой буфер, содержащий ионы сукцината. Примеры сукцинатного буфера включают янтарную кислоту-сукцинат натрия, янтарную кислоту-сукцинат калия, янтарную кислоту-сукцинат кальция и т.п. Предпочтительным сукцинатным буфером является янтарная кислота-сукцинат натрия.

«Фосфатный буфер» представляет собой буфер, содержащий ионы фосфата. Примеры фосфатного буфера включают гидрофосфат динатрия-дигидрофосфат натрия, гидрофосфат динатрия-дигидрофосфат калия, гидрофосфат динатрия-лимонную кислоту и т.п. Предпочтительным фосфатным буфером является гидрофосфат динатрия-дигидрофосфат натрия.

«Ацетатный буфер» представляет собой буфер, содержащий ионы ацетата. Примеры ацетатного буфера включают уксусную кислоту-ацетат натрия, гистидин ацетат, уксусную кислоту-ацетат калия, уксусную кислоту-ацетат кальция, уксусную кислоту-ацетат магния и т.п. Предпочтительным ацетатным буфером является уксусная кислота-ацетат натрия.

«Фармацевтическая композиция» означает смесь, включающую одно или более соединений (или их физиологически/фармацевтически приемлемых солей или пролекарств), описанных в настоящем документе, и другие химические компоненты (такие как физиологически/фармацевтически приемлемые носители и вспомогательные вещества). Целью фармацевтической композиции является поддержание стабильности активных ингредиентов антитела и облегчение введения в организм, чтобы облегчить абсорбцию и биологическую активность активного ингредиента.

Используемые в настоящем документе термины «фармацевтическая композиция» и «состав» являются взаимозаменяемыми.

«Сахарид» в настоящем изобретении включает обычный (CH₂O)_n и его производные, включая моносахариды, дисахариды, трисахариды, полисахариды, сахарные спирты, восстанавливающие сахариды, невосстанавливающие сахариды и т.д. Сахарид может быть выбран из группы, состоящей из: глюкозы, сахарозы, трегалозы, лактозы, фруктозы, мальтозы, декстрана, глицерина, эритрита, глицерина, арабита, ксилита, сорбита, маннита, мелибиозы, мелецитозы, мелитриозы, маннотриозы, стахиозы, мальтозы, лактулозы, мальтулозы, сорбита, мальтита, лактита, изомалыулозы и т.д. Предпочтительным сахарид ом является невосстанавливающий дисахарид, более предпочтительна сахароза.

В соответствии с настоящим изобретением растворитель, содержащийся в форме раствора фармацевтической композиции, представляет собой воду, если не указано иное.

«Лиофилизированный состав» означает состав или фармацевтическую композицию, полученную вакуумной лиофилизацией жидкой или растворенной формы фармацевтической композиции или состава.

Лиофилизация в настоящем изобретении включает предварительное замораживание, первичную сушку и вторичную сушку. Целью предварительного замораживания является замораживание продуктов для получения кристаллических твердых веществ. Температура предварительного замораживания и скорость предварительного замораживания являются двумя важными параметрами процесса. В настоящем изобретении температура предварительного замораживания установлена на уровне -45°С, а скорость предварительного замораживания составляет 1°С/мин. Первичная сушка, также называемая основной сушкой, является основной стадией лиофилизации образцов. Цель состоит в том, чтобы удалить лед из продукта, сохраняя форму продукта, чтобы ограничить повреждение продукта до минимального уровня. При неправильном выборе температуры первичной сушки и степени вакуума продукт будет разрушаться. Более высокая температура и более высокий уровень вакуума ускоряют эффективность лиофилизации, но также увеличивают риск разрушения продукта. Температура первичной сушки в настоящем изобретении может представлять собой обычную температуру в условиях эксплуатации, такую как от -30°С до 0°С. Вторичная сушка, также называемая вакуумной сушкой, представляет собой основную стадию, на которй из продукта удаляют связанную воду путем создания предельного вакуума (0,01 мбар) и повышения температуры (от 20 до 40°С). Поскольку большинство биопрепаратов чувствительны к температуре, выбранная температура вторичной сушки должна находиться в нижней точке температурного диапазона, которая составляет 25°С. Продолжительность лиофилизации зависит от морозильной камеры, дозы лиофилизируемого состава и контейнера с лиофилизируемым составом. Специалистам в данной области техники хорошо известно, как регулировать такую продолжительность времени.

Используемые в настоящем документе термины «примерно» и «приблизительно» означают, что значение находится в пределах допустимого диапазона погрешности конкретного значения, измеренного обычным специалистом в данной области техники. Значение частично зависит от того, как значение измеряют или определяют (т.е. предел системы измерения). Например, в любой практике в данной области техники «приблизительно» означает стандартное отклонение в пределах 1 или более 1. В качестве альтернативы «примерно» или «по существу включает» означает диапазон не более ±20%, например, рН примерно 5,5 означает рН 5,5±1,1. Кроме того, особенно для биологических систем или процессов, этот термин означает не более одного порядка величины или не более 5-кратного значения. Если не указано иное, когда конкретное значение указано в настоящей заявке и формуле изобретения, значение «примерно» или «по существу включает» должно находиться в пределах допустимого диапазона погрешности конкретного значения.

Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению способна оказывать стабильное действие: т.е. антитело, содержащееся в фармацевтической композиции, по существу сохраняет физическую стабильность, и/или химическую стабильность, и/или биологическую активность во время хранения. Предпочтительно фармацевтическая композиция в значительной степени сохраняет физическую стабильность и химическую стабильность, а также биологическую активность в течение хранения. Срок хранения обычно определяют исходя из заданного срока годности фармацевтической композиции. В настоящее время существует ряд аналитических методов измерения стабильности белка, которые можно использовать для измерения стабильности после хранения в течение выбранного периода времени при выбранной температуре.

Стабильный фармацевтический состав антитела представляет собой состав, для которого не наблюдается значительных физических, и/или химических и/или биологических изменений при следующих условиях: хранение при низкой температуре (2-8°С) в течение не менее 3 месяцев, предпочтительно 6 месяцев, более предпочтительно 1 года и еще более предпочтительно до 2 лет. Кроме того, стабильные жидкие составы включают те, которые проявляют желаемые характеристики после хранения при температуре 25°С в течение 1 месяца, 3 месяцев или 6 месяцев. Как правило, критерии стабильного состава представляют собой следующие: обычно не более примерно 10%, предпочтительно не более примерно 5% мономеров антител подвергаются деградации, как измерено с помощью SEC-HPLC; при визуальном осмотре фармацевтический состав антитела представляет собой светло-желтую, почти бесцветную прозрачную жидкость, либо бесцветную, либо от прозрачной до слегка бледной; изменение концентрации, рН и осмоляльности состава не превышает ±10%; обычно наблюдается не более примерно 10%, предпочтительно не более примерно 5% снижения; обычно возникает не более примерно 10%, предпочтительно не более примерно 5% агрегации.

Считается, что антитело «сохраняет свою физическую стабильность» в фармацевтическом составе, если антитело не демонстрирует значительно повышенной агрегации, преципитации и/или денатурации при визуальном осмотре цвета и/или прозрачности или при измерении с помощью рассеяния УФ-излучения, эксклюзионной хроматографии (SEC) и динамического светорассеяния (DLS). Изменения в конформации белка можно оценить с помощью флуоресцентной спектроскопии, определяющей третичную структуру белка, и с помощью FTIR-спектроскопии, определяющей вторичную структуру белка.

Считается, что антитело «сохраняет свою химическую стабильность» в фармацевтическом составе, если антитело не проявляет значительной химической модификации. Химическую стабильность можно оценить путем обнаружения и количественного определения химически измененных форм белка. Процессы деградации, которые часто изменяют химическую структуру белка, включают гидролиз или укорочение (оценивают такими способами, как эксклюзионная хроматография и SDS-PAGE), окисление (оценивают такими способами, как пептидная спектроскопия в комбинации с масс-спектрометрией или MALDI/TOF/MS), дезамидирование (оценивают такими способами, как ионообменная хроматография, капиллярное изоэлектрическое фокусирование, спектроскопия пептидов, измерение изоаспарагиновой кислоты) и изомеризация (оценивают такими способами, как измерение содержания изоаспарагиновой кислоты, пептидная спектроскопия).

Считается, что антитело «сохраняет свою биологическую активность» в фармацевтическом составе, когда биологическая активность антитела в данный момент времени все еще находится в пределах заданного диапазона биологической активности, проявляемой во время первоначального приготовления фармацевтического состава. Биологическую активность антитела можно определить, например, с помощью анализа связывания антигена.

Трехбуквенный код и однобуквенный код аминокислот, используемые в настоящем раскрытии, описаны в J. biol. chem. 243, р 3558 (1968).

Термин «антитело», используемый в настоящем раскрытии, относится к иммуноглобулину; полное антитело представляет собой структуру тетрапептидной цепи, состоящую из двух идентичных тяжелых цепей и двух идентичных легких цепей, соединенных межцепочечной дисульфидной связью (связями).

В настоящем раскрытии легкая цепь антитела по настоящему изобретению дополнительно содержит константную область легкой цепи, и константная область легкой цепи включает человеческие или мышиные к, Х-цепи или их вариант(ы).

В настоящем раскрытии тяжелая цепь антитела по настоящему изобретению дополнительно содержит константную область тяжелой цепи, и константная область тяжелой цепи включает человеческие или мышиные IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 или их вариант(ы).

Приблизительно 110 аминокислот, прилегающих к N-концу тяжелой и легкой цепей антитела, являются сильно вариабельными, известными как вариабельные области (области Fv); остальные аминокислотные последовательности, близкие к С-концу, относительно стабильны и известны как константные области. Вариабельная область включает три гипервариабельных области (HVR) и четыре относительно консервативных каркасных области (FR). Три гипервариабельные области, которые определяют специфичность антитела, также известны как области, определяющие комплементарность (CDR). Каждая вариабельная область легкой цепи (LCVR, VL) и вариабельная область тяжелой цепи (HCVR, VH) состоит из 3 областей CDR и 4 областей FR в последовательном порядке от амино-конца к карбокси-концу: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Три области CDR легкой цепи относятся к LCDR1, LCDR2 и LCDR3, а три области CDR тяжелой цепи относятся к HCDR1, HCDR2 и HCDR3. Количество и положение аминокислотных остатков CDR области LCVR и области HCVR в антителе или его антигенсвязывающем фрагменте, описанных в настоящем раскрытии, соответствуют известным критериям нумерации по Кэбату (LCDR 1-3, HCDR 1-3).

Антитела по настоящему раскрытию включают мышиные антитела, химерные антитела, гуманизированные антитела и предпочтительно гуманизированные антитела.

В настоящем раскрытии «антигенсвязывающий фрагмент антитела» или «функциональный фрагмент» относится к Fab-фрагментам, Fab'-фрагментам, F(ab')₂-фрагментам, обладающим антигенсвязывающей активностью, и Fv-фрагментам, scFv-фрагментам, которые связываются с антителом. Фрагмент Fv содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи антитела, но не имеет константной области, и фрагмент Fv представляет собой наименьший фрагмент антитела, который имеет все сайты связывания антигена. Как правило, антитело Fv также содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL и способно образовывать структуру, необходимую для связывания антигена. Различные линкеры также можно использовать для соединения двух вариабельных областей антител с образованием полипептидной цепи, называемой одноцепочечным антителом или одноцепочечным Fv (sFv).

Термин «антигенсвязывающий сайт» по настоящему раскрытию относится к непрерывному или прерывистому трехмерному пространственному сайту на антигене, распознаваемом антителом или его антигенсвязьюающим фрагментом по настоящему раскрытию.

Термин «мышиное антитело» в настоящем описании относится к моноклональному антителу против человеческого IL-5, полученному в соответствии со знаниями и навыками в данной области техники. Во время подготовки испытуемому субъекту вводят антиген IL-5, а затем выделяют гибридому, экспрессирующую антитело с желаемой последовательностью или функциональным свойством.

Термин «химерное антитело» представляет собой антитело, образованное путем слияния вариабельной области мышиного антитела с константной областью человеческого антитела, что снижает иммунный ответ, индуцированный мышиным антителом. Для создания химерного антитела необходимо сначала получить гибридому, секретирующую мышиные специфичные моноклональные антитела; затем из клеток мышиной гибридомы клонировать гены вариабельной области; а затем при необходимости клонировать гены константной области антител человека; и мышиные гены вариабельной области комбинировать с человеческими генами константной области с образованием химерного гена, который встраивают в человеческий вектор, и, наконец, молекулу химерного антитела экспрессируют в эукариотической промышленной системе или прокариотической промышленной системе. В предпочтительном варианте реализации настоящего раскрытия легкая цепь химерного антитела IL-5 дополнительно содержит константную область легкой цепи человеческой κ-, λ-цепи или ее варианта(ов). Тяжелая цепь химерного антитела к IL-5 дополнительно содержит константную область тяжелой цепи IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 человека или их вариант(ы). Константная область человеческого антитела может быть выбрана из группы, состоящей из: константной области тяжелой цепи IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека или варианта(ов), предпочтительно содержащей константную область тяжелой цепи IgG2 или IgG4 человека, или IgG4 без токсичности АЗКЦ (антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность) после аминокислотной мутации.

Термин «гуманизированное антитело», также известное как антитело с привитой CDR, относится к антителу, полученному путем прививки последовательностей CDR мыши на каркасную область вариабельной области человеческого антитела. Гуманизированное антитело позволяет избежать сильных гетерогенных ответов, индуцированных химерным антителом, которое несет большое количество белковых компонентов мыши. Такие каркасные последовательности можно получить из общедоступной базы данных ДНК, охватывающей последовательности генов антител зародышевой линии, или из опубликованных ссылок. Например, последовательности ДНК зародышевой линии генов вариабельных областей тяжелой и легкой цепи человека можно найти в базе данных последовательностей зародышевой линии человека "VBase" (доступна на сайте www.mrccpe.com.ac.uk/vbase), а также в Kabat, ЕА, et al. 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Чтобы избежать снижения активности, вызванного снижением иммуногенности, каркасные последовательности в вариабельной области человеческого антитела могут быть подвергнуты минимальной обратной мутации или обратной мутации для поддержания активности. Гуманизированное антитело по настоящему изобретению также относится к гуманизированному антителу, в котором созревание аффинности CDR осуществляется с помощью фагового дисплея.

В настоящем изобретении «АЗКЦ» (т.е. антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность) означает, что клетки-мишени, покрытые антителами, непосредственно уничтожаются клетками, экспрессирующими Fc-рецепторы, посредством распознавания Fc-сегмента антитела. Эффекторная функция АЗКЦ антитела может быть снижена или устранена путем модификации Fc-сегмента IgG. Модификация относится к мутациям, осуществляемым в константной области тяжелой цепи антитела, такой как выбранная из группы, состоящей из: N297A, L234A, L235A на IgG1; IgG2/4 химеры, F234A/L235A мутации на IgG4.

«Мутация» в мутантной последовательности в настоящем раскрытии включает, но не ограничивается ими, «обратную(ые) мутацию(и)», «консервативную модификацию» или «консервативное замещение или замену». «Консервативная модификация» или «консервативное замещение или замена», используемые в настоящем описании, относятся к другим аминокислотам с аналогичными характеристиками (такими как заряд, размер боковой цепи, гидрофобность/гидрофильность, конформация и жесткость основной цепи и т.д.), которые используются для замены аминокислоты в белке, так что замену можно часто осуществлять без изменения биологической активности белка. Специалистам в данной области техники известно, что, как правило, замена одной аминокислоты в заменимой области полипептида существенно не меняет биологическую активность (см., например, Watson et al., (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., Page 224, (4-е издание)). Кроме того, замена аминокислот с аналогичной структурой или функцией вряд ли нарушит биологическую активность.

«Мутированная последовательность» в настоящем раскрытии означает, что нуклеотидная последовательность и/или аминокислотная последовательность согласно настоящему раскрытию надлежащим образом модифицированы путем мутации(ий) (таких как замена, вставка или делеция) для получения нуклеотидной последовательности и/или аминокислотной последовательности, которая имеет другой процент идентичности последовательности с нуклеотидной последовательностью и/или аминокислотной последовательностью по настоящему раскрытию. В настоящем раскрытии идентичность последовательности может составлять по меньшей мере 85%, 90% или 95%, предпочтительно по меньшей мере 95%. Неограничивающие примеры относятся к 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%. Выравнивание последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями можно выполнить с помощью настроек по умолчанию алгоритма BLASTN/BLASTP, доступных на веб-сайте Национального центра биотехнологического института.

Термин «связывание с IL-5» относится к взаимодействию с IL-5, предпочтительно с человеческим IL-5.

Термины «анти-Ib-5 антитело» и «антитело к IL-5» используются взаимозаменяемо, и оба относятся к антителу, которое связывается с IL-5.

В настоящем раскрытии слитый белок представляет собой белковый продукт, полученный путем совместной экспрессии двух генов посредством рекомбинации ДНК. Рекомбинантный слитый белок внеклеточной области IL-5-Fc представляет собой слитый белок, полученный путем совместной экспрессии внеклеточной области IL-5 и Fc-фрагмента человеческого антитела посредством рекомбинации ДНК. Внеклеточная область IL-5 относится к части белка IL-5, экспрессируемой вне клеточной мембраны, и ее последовательность показана в SEQ ID NO: 1.

Способы получения и очистки антител и антигенсвязывающих фрагментов хорошо известны и доступны в предшествующем уровне техники, например, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor press, Chapters 5-8 and 15. Например, мышей можно иммунизировать с помощью человеческого IL-5 или его фрагмента, и полученное антитело может быть ренатурировано и очищено, и секвенирование аминокислот может быть выполнено с использованием обычных способов. Антигенсвязывающие фрагменты также могут быть получены с использованием обычных способов. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с настоящим раскрытием генетически сконструированы для прививки одной или более областей FR человека на области CDR, отличные от человека. Последовательности зародышевой линии FR человека можно получить с веб-сайта ImMunoGeneTics (IMGT) http://imgt.cines.fr, или можно получить с The Immunoglobulin Journal, 2001ISBN012441351.

Сконструированное антитело или его антигенсвязьшающий фрагмент можно получить и очистить обычными способами. Например, последовательности кДНК, кодирующие тяжелую цепь и легкую цепь, можно клонировать и рекомбинировать в вектор экспрессии GS. Векторы экспрессии рекомбинантного иммуноглобулина можно стабильно трансфецировать в клетки СНО. В соответствии с рекомендуемым уровнем техники системы экспрессии млекопитающих могут приводить к гликозилированию антител, особенно в высококонсервативных N-концевых положениях области Fc. Стабильные клоны получают путем экспрессии антител, которые специфически связываются с IL-5 человека. Положительные клоны размножают в бессывороточной культуральной среде биореакторов с образованием антител. Культуральная среда, в которую секретируются антитела, может быть очищена обычными способами. Например, для очистки можно использовать колонку Protein А или Protein G Sepharose FF, содержащую откорректированный буфер. Неспецифически связанные компоненты вымываются. Затем связанные антитела элюируют градиентом рН, фрагменты антител обнаруживают с помощью SDS-PAGE и собирают.Антитела можно фильтровать и концентрировать обычными способами. Растворимые смеси и мультимеры также могут быть удалены обычными способами, например молекулярными ситами и ионным обменом. Полученный продукт следует немедленно заморозить, например, при -70°С, или лиофилизировать.

«Необязательный» или «необязательно» означает, что событие или среда, следующие за термином, могут, но не должны произойти, и описание включает случаи, когда событие или среда могут произойти или не произойти. Например, «необязательно содержит от 1 до 3 областей CDR тяжелой цепи антитела» означает, что область(и) CDR тяжелой цепи антитела, имеющая специфическую последовательность(и), может присутствовать, но не обязательно.

«Введение» и «лечение» применительно к животным, людям, экспериментальным субъектам, клеткам, тканям, органам или биологическим жидкостям относятся к контакту экзогенного лекарственного средства, терапевтического агента, диагностического агента или композиции с животными, людьми, субъектами, клетками, тканями, органами или биологическими жидкостями. «Введение» и «лечение» могут относиться, например, к лечению, фармакокинетике, диагностике, исследованиям и экспериментальным методам. Лечение клеток включает контакт реагента с клетками и контакт реагента с жидкостями, при этом жидкости находятся в контакте с клетками. «Введение» и «лечение», например, также означают обработку клеток реагентами, диагностическим средством, связывающими композициями или другой клеткой in vitro и ex vivo. «Лечение» применительно к человеку, ветеринарии или субъектам исследования относится к терапевтическому лечению, предотвраащению или профилактическим мерам, исследовательским и диагностическим применениям.

«Лечение» означает применение внутреннего или наружного терапевтического агента, например композиции, содержащей любое из связывающих соединений по настоящему изобретению, у пациента, у которого присутствует один или более симптомов заболевания, в отношении которых известно, что терапевтический агент оказывает терапевтическое действие. Как правило, терапевтическое средство вводят в количестве, эффективном для облегчения одного или более симптомов заболевания у получавшего лечение пациента или популяции, чтобы вызвать регрессию таких симптомов или ингибировать развитие таких симптомов до любой клинически определяемой степени. Количество терапевтического агента, эффективное для облегчения любого конкретного симптома заболевания (также называемое «терапевтически эффективным количеством»), может варьироваться в зависимости от множества факторов, например, от состояния пациента, возраста и массы тела, а также способности средства для получения желаемого терапевтического эффекта у пациента. Облегчение симптомов заболевания можно оценить с помощью любых способов клинического тестирования, обычно используемых врачами или другими медицинскими работниками для оценки тяжести или прогрессирования симптомов. Хотя вариант реализации настоящего изобретения (например, способ лечения или изделие) может быть неэффективен для облегчения каждого симптома целевого заболевания, он должен облегчать симптом целевого заболевания у статистически значимого числа пациентов, как определено в соответствии с любыми статистическими критериями определения, известными в данной области техники, такими как t-критерий Стьюдента, критерий хи-квадрат, U-критерий Манна и Уитни, критерий Крускала-Уоллиса (Н-критерий), критерий Джонкхира-Терпстры и критерий Уилкоксона.

Не существует ограничений в отношении заболеваний, связанных с IL-5, если оно представляет собой заболевание, связанное с IL-5. Например, терапевтический ответ, индуцированный молекулой по настоящему раскрытию, может быть получен путем связывания с человеческим IL-5 и последующего блокирования или ингибирования стимулирующих эффектов эозинофилов. Следовательно, при применении в отношении препаратов и составов, подходящх для терапевтического применения, фармацевтическая композиция по настоящему раскрытию очень подходит для таких субъектов, которые страдают от аллергии и/или атопических реакций, или страдают от реакций, связанных с эозинофилами, таких как, но не ограничиваясь ими, бронхиальная астма, обострение бронхиальной астмы, злокачественное начало бронхиальной астмы, хроническая пневмония, аллергический ринит, круглогодичный аллергический ринит, аллергический бронхо легочный аспергиллез, эозинофилия, синдром Чарга-Стросса, атопический дерматит, онхоцеркозный дерматит, перемежающийся ангионевротический отек, синдром эозинофильной миалгии, эозинофильный гастроэнтерит, глистная инфекция, болезнь Ходжкина, полипы носа, синдром Леффлера, крапивница, гипер эозинофильный бронхит, узелковый артериит, синусит, эозинофильный эзофагит, аллергический эозинофильный эзофагит, аллергический конъюнктивит, онхоцеркозный дерматит, эндометриоз и стероид-зависимый эозинофильный бронхит. В предпочтительном варианте реализации лечение может ингибировать или ослаблять инфильтрацию эозинофилов в легочную ткань. Частота введения фармацевтической композиции может составлять от трех раз в сутки до одного раза в 6 месяцев. Путь введения может представлять собой внутривенный, подкожный, внутримышечный, парентеральный или местный путь.

Составы согласно настоящему изобретению можно применять для лечения заболеваний, опосредованных IL-5. Например, составы могут быть использованы, но не ограничиваясь ими, для ингибирования или облегчения опосредованного IL-5 воспалительного ответа и созревания, активации, дегрануляции или инфильтрации тканей эозинофилов in vivo и in vitro; ингибировать чрезмерное напряжение гладкой мускулатуры, вызванное IL-5; снизить уровень IL-5 в легких, дыхательных путях или крови. Предпочтительно, состав по настоящему раскрытию можно использовать для лечения заболеваний, опосредованных IL-5, предпочтительно заболевание, опосредованное IL-5, выбрано из группы, состоящей из: астмы, хронической пневмонии, аллергического ринита, аллергического бронхолегочного аспергиллеза, эозинофилии, синдрома Чарга-Стросса, атопического дерматита, онхоцеркозного дерматита, перемежающегося ангионевротического отека, синдрома эозинофильной миалгии, эозинофильного гастроэнтерита, глистной инфекции, болезни Ходжкина, полипов носа, синдрома Леффлера, крапивницы, гиперэозинофильного бронхита, узелкового артериита, синусита, эозинофильного эзофагита, аллергического эозинофильного эзофагита, аллергического конъюнктивита, онхоцеркозного дерматита, эндометриоза и стероид-зависимого эозинофильного бронхита.

«Эффективное количество» включает количество, достаточное для улучшения или предотвращения симптомов или состояний соматического заболевания. Эффективное количество также относится к количеству, достаточному для обеспечения или облегчения диагностики. Эффективное количество для конкретного пациента или ветеринарного субъекта может варьироваться в зависимости от следующих факторов: например, состояние, подлежащее лечению, общее состояние пациента, способ введения и дозировка, а также тяжесть побочных эффектов. Эффективное количество может представлять собой максимальную дозу или режим дозирования, позволяющий избежать значительных побочных эффектов или токсических эффектов.

«Замена» относится к замене системы растворителей, которую используют для растворения белка антитела. Например, систему с высоким содержанием солей или гипертонических растворителей, содержащую белок антитела, заменяют буферной системой стабильного состава путем физических манипуляций, чтобы белок антитела присутствовал в стабильном составе. Физические манипуляции включают, помимо прочего, ультрафильтрацию, диализ или восстановление после центрифугирования.

Примеры и примеры экспериментов

Настоящее раскрытие дополнительно описано вместе с приведенными ниже примерами, но эти примеры не ограничивают объем настоящего раскрытия. Экспериментальные способы, которые не снабжены конкретными условиями в примере настоящего раскрытия, обычно соответствуют общепринятым условиям, таким как ссылки на публикации ntibodies: А Laboratory Manual, Molecular Cloning by Cold Spring Harbor Laboratory; или в соответствии с условиями, рекомендованными производителями материалов или изделий. Реагенты, не имеющие конкретных источников, представляют собой обычные реагенты, приобретаемые на рынке.

Пример 1. Получение антигена IL-5 и белка, используемых при обнаружении

1.1 Дизайн и экспрессия антигена IL-5

Последовательности, кодирующие человеческий IL-5 с His-меткой, IL-5 макака-резус с His-меткой, мышиный IL-5 с His-меткой, крысиный IL-5 с His-меткой, слитый белок внеклеточной области рецептора IL-5Rα человека, содержащий человеческий фрагмент IgG1-Fc клонировали в векторы phr, и конструировали экспрессионные плазмиды, и затем трансфицировали в HEK293. На 6-й день после трансфекции отбирали образцы, и супернатант клеток собирали центрифугированием при 4500 об/мин в течение 10 мин. Супернатанты, содержащие рекомбинантные белки рецептора IL-5 и IL-5a, очищали с использованием колонки с никелем, рекомбинантный слитый белок IL-5-Fc человека очищали с использованием колонки для аффинной хроматографии с белком А. Очищенный белок можно использовать в последующих экспериментах. Последовательности специфических белковых антигенов представляют собой следующие:

Аминокислотная последовательность человеческого IL-5 с гистидиновой меткой (rhIL-5-his)

Аминокислотная последовательность IL-5 яванского макака с гистидиновой меткой

Примечание: Часть, выделенная курсивом, представляет His6-метку.

Аминокислотная последовательность мышиного IL-5 с гистидиновой меткой

Примечание: Часть, выделенная курсивом, представляет His6-метку.

Аминокислотная последовательность крысиного IL-5 с гистидиновой меткой

Примечание: Часть, выделенная курсивом, представляет His6-метку.

Аминокислотная последовательность рецептора IL-5a человека, слитая с Fc-фрагментом человека

Примечание: Часть, выделенная курсивом, представляет человеческий IgG1-Fc-метка.

Пример 2. Конструирование и идентификация клеточных линий рекомбинантного рецептора IL-5α и рецептора IL-5α/β

Для скрининга функциональных антител в настоящем изобретении сконструированы клеточные линии CHO-S/IL-5α, экспрессирующие IL-5α, и клеточные линии CHO-S/IL-5α/IL-5β, экспрессирующие как IL-5α, так и IL-5β.

В частности, полноразмерный ген IL-5α человека (Q01344) клонировали в вектор экспрессии клеток млекопитающих pTargeT, линеаризованную плазмиду электротрансфицировали в клетки CHO-S и подвергали скринингу в присутствии G418 в течение 2 недель, а затем дважды осуществляли лимитирующие разведения. Ген IL-5α обнаруживали на клеточной поверхности с помощью FACS, и отбирали клеточную линию CHO-S/IL-5α с высоким уровнем экспрессии IL-5α. Исходя из этого, линеаризованную pcDNA3.1-IL-5β подвергали электротрансфекции, и проводили скрининг в присутствии G418 и зеоцина в течение 2 недель, а затем дважды осуществляли лимитирующие разведения. Гены IL-5α и IL-5β обнаруживали на клеточной поверхности с помощью FACS, и отбирали клеточную линию СНО-S/IL-5α/IL-5β с высоким уровнем экспрессии IL-5α и IL-5β.

Пример 3. Получение мышиного моноклонального антитела против человеческого IL-5.

Две дозы рекомбинантного белка rhIL-5-his, адъюванта Фрейнда CFA (Sigma, партия № SLBQ1109V) и IFA (Sigma, партия № SLBJ2845V) (100 г/50 г/50 г (high) и 25 г/12,5 г/12,5 г (low)) использовали для иммунизации двух групп мышей Balb/c (5 мышей/группа) и четырех групп мышей SJL (5 мышей/группа) соответственно. Специфический иммунный ответ на IL-5 определяли с помощью определения титра сыворотки посредством ELISA, анализа блокирования лиганд-рецептора и анализа ингибирования пролиферации TF-1. Мышей с хорошим специфическим иммунным ответом отбирали и умерщвляли; клетки селезенки собирали и сливали с клетками миеломы.

Первичный скрининг проводили с помощью анализа связывания ELISA против IL-5 человека. После переноса клеток гибридомы в 24-луночный планшет супернатанты снова подвергали скринингу с использованием анализа связывания ELISA против человеческого IL-5 человека, яванского макака и мыши, анализа блокирования рецептора IL-5 на основе ELISA и анализа ингибирования пролиферации TF-1. После двух раундов субклонирования положительных клонов получали гибридомные клоны, которые использовали для получения антител; и полученные антитела очищали аффинной хроматографией.

Очищенные антитела подвергали: Эксклюзионной ВЭЖХ, обнаружению содержания эндотоксина, анализу аффинности Biacore для различных видов IL-5, анализу блокирования рецептора против IL-5 на основе FACS, анализу ингибирования пролиферации TF-1, исследованию адгезии эозинофилов, и оценке эффективности на мышиной модели бронхиальной астмы и на модели нейтрализации морской свинки in vivo; отбирали моноклональные гибридомные клеточные линии mAb1705, mAb1706, mAb1780, mAb1773 и mAb1779, демонстрирующие желаемую активность in vivo и in vitro.

Способ клонирования последовательностей из положительной гибридомы представлял собой следующий: собирали клетки гибридомы в логарифмической фазе роста, РНК экстрагировали тризолом (Invitrogen, кат. №15596-018) в соответствии с инструкциями к набору, набор обратной транскриптазы PrimeScript™ Reverse Transcriptase Kit применяли для обратной транскрипции (Takara, кат. №2680А). кДНК, полученную с помощью обратной транскрипции, амплифицировали с помощью ПЦР с использованием набора мышиных Ig-праймеров (Novagen, ТВ326 Rev. В0503), и затем секвенировали. Были получены аминокислотные последовательности, соответствующие ДНК-последовательностям вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи для mAb1705, mAb1706, mAb1780, mAb1773 и mAb1779 (аминокислотные остатки CDR VH/VL определены и отмечены с помощью критериев нумерации согласно Кэботу).

Последовательность мышиной вариабельной области тяжелой цепи mAb1705

Последовательность мышиной вариабельной области легкой цепи mAb1705

Последовательность мышиной вариабельной области тяжелой цепи mAb1706

Последовательность мышиной вариабельной области легкой цепи mAb1706

Последовательность мышиной вариабельной области тяжелой цепи mAb1780

Последовательность мышиной вариабельной области легкой цепи mAb1780

Последовательность мышиной вариабельной области тяжелой цепи mAb1773

Последовательность мышиной вариабельной области легкой цепи mAb1773

Последовательность мышиной вариабельной области тяжелой цепи mAb1779

Последовательность мышиной вариабельной области легкой цепи mAb1779

Последовательности CDR легкой и тяжелой цепи для каждого антитела показаны в Таблице 1.

Результат обнаружения активности Biacore можно найти в Таблице 2.

Результаты показывают, что мышиные антитела по настоящему раскрытию обладают высокой аффинностью к антигену.

Пример 4. Очистка родственных IL-5 рекомбинантных белков и очистка гибридомных антител и рекомбинантных антител

4.1 Стадии очистки рекомбинантного белка IL-5-Flag-His:

Образцы центрифугировали на высокой скорости для удаления примесей и концентрировали до соответствующего объема. Аффинную колонку NI-NTA (QIAGEN, кат. №30721) уравновешивали PBS и промывали 2-5-кратным объемом колонки. После удаления примесей в колонку загружали образец супернатанта экспрессии клеток. Колонку промывали PBS до тех пор, пока показание А280 не уменьшилось до исходного уровня. Колонку промывали PBS для удаления загрязняющих белков, собирали образец. Целевой белок элюировали последовательно промывочным буфером (20 мМ имидазол) и элюирующим буфером (300 мМ имидазол) и собирали пики элюирования.

Собранный элюат дополнительно очищали ионным обменом (колонка Hiload 16/600 superdex 200). Колонку уравновешивали примерно 2 объемами колонки PBS, чтобы обеспечить рН 7,4. Буфер для элюирования, содержащий идентифицированный целевой белок, концентрировали и загружали, образец собирали и проверяли с помощью SDS-PAGE и идентификации LC-MS, а также делили на аликвоты для применения.

4.2 Очистка гибридомного экспрессированного антитела и слитого белка Fc

Образец супернатанта экспрессии клеток центрифугировали на высокой скорости для удаления примесей. Супернатант экспрессии гибридомы очищали на колонке с белком G, а супернатант экспрессии слитого белка Fc очищали на колонке с белком А. Колонку промывали PBS до тех пор, пока показания А280 не уменьшались до исходного уровня. Целевой белок элюировали 100 мМ уксусной кислоты, рН 3,0, и нейтрализовали 1М Трис-HCl, рН 8,0. После того, как элюированный образец был должным образом сконцентрирован, образец дополнительно очищали с помощью гель-хроматографии Superdex200 (GE), уравновешенной PBS, и пик без агрегатов собирали, а затем разделяли на аликвоты для использования.

Пример 5. Дизайн гуманизированного моноклонального человеческого антитела к IL-5

Гуманизацию мышиного моноклонального антитела против человеческого IL-5 проводили, как описано во многих источниках в данной области техники. Вкратце, константные области мышиного антитела были заменены человеческими константными областями, a CDR мышиного антитела были привиты на человеческую матрицу FR, имеющую наивысшую гомологию, и была выполнена обратная мутация аминокислот в FR-области.

Путем выравнивания с базой данных генов зародышевой линии вариабельной области тяжелой и легкой цепи человеческого антитела IMGT, были выбраны в качестве матриц зародышевые линии вариабельной области тяжелой и легкой цепи, которые обладают высокой идентичностью с каждой из аминокислотных последовательностей антител mAb-1705, mAb-1706, mAb1780, mAb1773 и mAb1779, CDR мышиного антитела были привиты на соответствующую человеческую матрицу для формирования вариабельной области в порядке FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Аминокислотные остатки определяли и обозначали согласно критериям нумерации Кэбота.

Выбор областей FR человека и обратная мутация аминокислот На основе типичной структуры CDR VH/VL полученного мышиного антитела гомологичные последовательности вариабельной области легкой цепи (VL) и вариабельной области тяжелой цепи (VH) были извлечены из базы данных зародышевой линии человека и ранжированы в соответствии с гомологией FR (от высокой к низкой); зародышевую линию с наивысшей гомологией FR выбирали в качестве основной матрицы. Участки CDR мышиного антитела пересаживали на человеческую матрицу, затем остатки FR подвергали мутации, а аминокислотные остатки оптимизировали для получения конечных гуманизированных молекул.

5.1 Выбор гуманизированного каркаса для гибридомного клона mAb1705

Для h1705 в качестве матрицы для VH был выбран IGHV3-23*04, а в качестве матрицы для VL был выбран IGKV1-12*01. CDR mAb1705 прививали на человеческую матрицу; встроенные остатки и остатки, непосредственно взаимодействующие с областью CDR (найденные с помощью программного обеспечения), подвергали обратной мутации. Были получены различные вариабельные области легкой и тяжелой цепей гуманизированных антител, как показано в Таблице 3.

Примечание: «Привито» означает, что CDR мышиного антитела были привиты к последовательности области FR зародышевой линии человека. Например, в соответствии с естественной нумерацией аминокислотной последовательности A43S означает, что А в положении 43 «привитого» был мутирован обратно в S.

Примечание: В этой таблице показаны последовательности, полученные с помощью различных комбинаций мутаций. Как указано посредством h1705-007, гуманизированное мышиное антитело h1705-007 содержит два мутанта, т.е. легкую цепь h1705_VL.1A и тяжелую цепь h1705_УН.1А и т.д.

Конкретные последовательности вариабельных областей гуманизированного антитела h1705 представляют собой следующие:

Каждая из описанных выше вариабельных областей легкой цепи была объединена с константной областью легкой цепи с образованием последовательности легкой цепи, и каждая из вариабельных областей тяжелой цепи была объединена с константной областью тяжелой цепи с образованием последовательности тяжелой цепи. Примеры последовательностей константной области гуманизированного антитела показаны ниже:

>константная область тяжелой цепи IgG1:

Примечание: подчеркнутая часть представляет мутации M252Y, S254T, Т256Е.

>константная область легкой цепи каппа:

5.2 Выбор гуманизированного каркаса для гибридомного клона mAb1706

Для h1706 в качестве матрицы для VH был выбран IGHV3 -23*04, а в качестве матрицы для VL был выбран IGKV1-12*01. CDR мышиного антитела mAb1706 прививали на выбранную гуманизированную матрицу; аминокислоты FR подвергали обратной мутации. Были получены вариабельные области легкой и тяжелой цепей гуманизированных антител, как показано в Таблице 5.

Примечание: «Привито» означает, что CDR мышиного антитела были привиты к области FR зародышевой линии человека. Например, в соответствии с естественной нумерацией аминокислотной последовательности A43S означает, что А в положении 43 «привитого» был мутирован обратно в S.

Сконструированные гуманизированные молекулы объединяли с образованием различных антител, показанных в следующей таблице, как показано в Таблице 6.

Таблица 6. Комбинация вариабельных областей тяжелой и легкой цепи гуманизированного антитела h1706

Конкретные последовательности вариабельных областей гуманизированного антитела h1706 представляют собой следующие:

Каждая из описанных выше вариабельных областей легкой цепи была объединена с константной областью легкой цепи с образованием последовательности легкой цепи. Каждая из вариабельных областей тяжелой цепи была объединена с константной областью тяжелой цепи с образованием последовательности тяжелой цепи.

5.3 Выбор гуманизированного каркаса для гибридомного клона mAb1780

Для h1780 в качестве матрицы для VH был выбран IGHV1-2*02, а в качестве матрицы для VL был выбран IGKV3-11*01. CDR мышиного антитела mAb1780 прививали на выбранную гуманизированную матрицу; аминокислоты FR подвергали обратной мутации. Были получены вариабельные области легкой и тяжелой цепей гуманизированных антител, как показано в Таблице 7.

Примечание: «Привито» означает, что CDR мышиного антитела были привиты к области FR зародышевой линии человека. Например, в соответствии с естественной нумерацией аминокислотной последовательности E1D означает, что Е в положении 1 «привитого» был мутирован обратно в D.

Сконструированные гуманизированные молекулы объединяли с образованием различных молекул, показанных в следующей таблице, как показано в Таблице 8.

Конкретные последовательности вариабельных областей гуманизированного антитела h1780 представляют собой следующие:

Каждая из описанных выше вариабельных областей легкой цепи была объединена с константной областью легкой цепи с образованием последовательности легкой цепи. Каждая из вариабельных областей тяжелой цепи была объединена с константной областью тяжелой цепи с образованием последовательности тяжелой цепи.

5.4 Выбор гуманизированного каркаса для гибридомного клона mAb1773

Для h1773 в качестве матрицы для VH был выбран IGHV3-73*01, а в качестве матрицы для VL был выбран IGKV1-39*01. CDR мышиного антитела mAb1773 прививали на выбранную гуманизированную матрицу; аминокислоты подвергали обратной мутации. Были получены вариабельные области легкой и тяжелой цепей гуманизированных антител, как показано в Таблице 9. Кроме того, N в h1773 HCDR2 (RIDPANGDTK HGPKFQG) был мутирован в V (т.е. N55V) с образованием варианта HCDR2 вариабельной области тяжелой цепи (последовательность мутантного HCDR2 показана в SEQ ID NO: 82: RIDPAVGDTKHGPKFQG).

Примечание: «Привито» означает, что CDR мышиного антитела были привиты к области FR зародышевой линии человека. Например, в соответствии с естественной нумерацией аминокислотной последовательности M4L означает, что М в положении 4 «привитого» был мутирован обратно в L.

Сконструированные гуманизированные молекулы объединяли с образованием различных молекул, показанных в следующей таблице, как показано в Таблице 10.

Конкретные последовательности вариабельных областей гуманизированного антитела h1773 представляют собой следующие:

Каждую из описанных выше вариабельных областей легкой цепи объединяли с последовательностью константной области легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 53, с образованием конечной полной последовательности легкой цепи. Каждую из вариабельных областей тяжелой цепи объединяли с константной областью тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 52, с образованием конечной полной последовательности тяжелой цепи.

5.5 Выбор гуманизированного каркаса для гибридомного клона mAb1779

Для h1779 в качестве матрицы для VH был выбран IGHV1-2*02, а в качестве матрицы для VL был выбран IGKV1-33*01. CDR мышиного антитела h1779 прививали на выбранную гуманизированную матрицу; аминокислоты подвергали обратной мутации. Были получены вариабельные области легкой и тяжелой цепей гуманизированных антител, как показано в Таблице 11.

Примечание: «Привито» означает, что CDR мышиного антитела были привиты к области FR зародышевой линии человека. Например, в соответствии с естественной нумерацией аминокислотной последовательности A43S означает, что А в положении 43 «привитого» был мутирован обратно в S.

Сконструированные гуманизированные молекулы объединяли с образованием различных молекул, показанных в следующей таблице, как показано в Таблице 12.

Конкретные последовательности вариабельных областей гуманизированного антитела h1779 представляют собой следующие:

Каждую из описанных выше вариабельных областей легкой цепи объединяли с последовательностью константной области легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 53, с образованием последовательности легкой цепи. Каждую из вариабельных областей тяжелой цепи объединяли с константной областью тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 52, с образованием последовательности тяжелой цепи.

Полноразмерные последовательности примеров гуманизированных антител являются следующими: b1705-008 тяжелая цепь:

h1705-008 легкая цепь:

h1706-009 тяжелая цепь:

h1706-009 легкая цепь:

h1780-017 тяжелая цепь:

h1780-017 легкая цепь:

h1773-007 тяжелая цепь:

h1773-007 легкая цепь:

h1779-014 тяжелая цепь:

h1779-014 легкая цепь:

Антитело Hu39D10 против IL5 в WO 2012083370 A1 использовали в качестве положительного контроля в настоящем раскрытии, и его последовательности тяжелой цепи и легкой цепи показаны в SEQ ID NO: 80 и SEQ ID NO: 81 соответственно.

Последовательность тяжелой цепи Hu39D10

Последовательность легкой цепи Hu39D10

Пример 6. Получение рекомбинантного химерного антитела и гуманизированного антитела

1. Молекулярное клонирование рекомбинантного химерного антитела

После того, как положительные молекулы антител были получены путем скрининга гибридом, последовательности генов, кодирующих вариабельную область, были получены путем секвенирования. На основе полученных последовательностей конструировали прямой и обратный праймеры, а секвенированный ген использовали в качестве матрицы для конструирования каждого фрагмента гена VH/VK антитела с помощью ПЦР, а затем встраивали в вектор экспрессии рНг (содержащий сигнальный пептид и hIgG1/hkappa гена константной области (фрагмент CH1-Fc/CL)) путем гомологичной рекомбинации для конструирования полноразмерной экспрессионной плазмиды рекомбинантного химерного антитела VH-CH1-Fc-pHr/VL-CL-pHr с получением пяти химерных антител Ch1705, Ch1706, Ch1780, Ch1773 и Ch1779.

2. Молекулярное клонирование гуманизированных антител Последовательность гуманизированного антитела подвергали оптимизации кодонов, затем получали последовательность кодирующего гена с предпочтительными кодонами для человека; были разработаны праймеры для конструирования каждого фрагмента гена VH/VK антитела с помощью ПЦР, которые затем были вставлены в вектор экспрессии pHr (содержащий сигнальный пептид и фрагмент гена константной области hIgG1/hkappa (фрагмент CH1-Fc/CL)) путем гомологичной рекомбинации для конструирования полноразмерной экспрессионной плазмиды гуманизированного антитела VH-CH1-Fc-pHr/VL-CL-pHr.

3. Экспрессия и очистка рекомбинантного химерного антитела и гуманизированного антитела

Плазмиду, экспрессирующую легкую или тяжелую цепь антитела, отдельно трансфицировали в клетки HEK293E. Через 6 дней супернатант экспрессии собирали, центрифугировали на высокой скорости для удаления примесей и очищали на колонке с белком А. Колонку промывали PBS до тех пор, пока показания А280 не уменьшались до исходного уровня. Целевой белок элюировали кислым буфером для элюирования, рН 3,0-рН 3,5, и нейтрализовали 1М Трис-HCl, рН 8,0-9,0. Элюированный образец соответствующим образом концентрировали и дополнительно очищали с помощью гель-хроматографии Superdex200 (GE), предварительно уравновешенной PBS, для удаления агрегатов, пики мономеров собирали и разделяли на аликвоты для использования.

Для проверки характеристик и благоприятных эффектов антител по настоящему раскрытию применяли следующие способы испытаний.

Биологическая оценка активности in vitro

Пример исследования 1 Связывание мышиного антитела к IL-5 с IL-5 разных видов с помощью анализа Biacore

Аффинность тестируемого мышиного антитела к IL-5 с человеческим IL-5 измеряли с помощью прибора Biacore Т200 (GE).

Чип биосенсора белка А использовали для аффинного захвата тестируемых молекул, а затем антиген (рекомбинантный IL-5 человека и яванского макака, полученный в примере 1) пропускали через поверхность чипа, и сигнал реакции регистрировали в реальном времени прибором Biacore Т200 для получения кривых связывания и диссоциации. После завершения диссоциации каждого экспериментального цикла чип биосенсора промывали и регенерировали регенерационным раствором глицин-соляная кислота (рН 1,5). Программное обеспечение BIAevaluation версии 4.1 GE использовали для сопоставления данных с моделью Ленгмюра (1:1), и было получено значение сродства, показанное в Таблице 13.

Этот пример доказывает, что антитела mAb1705, mAb1706, mAb1780, mAb1773 и mAb1779 по настоящему раскрытию обладают высокой аффинностью к IL-5 различных видов (человека, обезьяны).

Пример исследования 2. Аффинность гуманизированного антитела к IL-5 к IL-5 разных видов с помощью анализа Biacore

Аффинность тестируемого гуманизированного антитела к IL-5 с человеческим IL-5 измеряли с помощью прибора Biacore Т200 (GE).

Чип биосенсора белка А использовали для аффинного захвата тестируемых молекул, а затем антиген (полученный в примере 1) пропускали через поверхность чипа, и сигнал реакции регистрировали в реальном времени прибором Biacore Т200 для получения кривых связывания и диссоциации. После завершения диссоциации каждого экспериментального цикла чип биосенсора промывали и регенерировали регенерационным раствором глицин-соляная кислота (рН 1,5). Программное обеспечение BIAevaluation версии 4.1 GE использовали для сопоставления данных с моделью Ленгмюра (1:1), и было получено значение сродства, показанное в Таблице 14.

Результаты показывают, что все гуманизированные антитела IL-5 обладают высокой аффинностью к человеческому IL-5.

Пример исследования 3. Анализ мышиного антитела к IL-5 на основе ELISA для блокирования связывания IL-5 с рецептором IL-5α

Для определения способности антитела к IL-5 блокировать связывание IL-5 с внеклеточной областью рекомбинантно экспрессированного белка рецептора IL-5α, IL-5 (5 мкг/мл в PBS) наносили на планшет для ELISA и инкубировали при 37°С в течение 1 часа; жидкость удаляли, добавляли 200 мкл/лунку 5% блокирующего раствора обезжиренного молока, разбавленного PBS, и инкубировали в течение 2,5 часов в инкубаторе при 37°С для блокирования. После блокирования блокирующий раствор удаляли, и планшет промывали буфером PBST (рН 7,4 PBS, содержащим 0,05% Tween-20) 5 раз; добавляли 25 мкл 10 мкг/мл IL-5Rα (в 1% БСА), меченного набором для мечения биотином (Tojin Chemical, LK03), а затем добавляли 25 мкл градиентно разведенного антитела (антитело конкурировало с IL-5Rα за связывание с IL-5) и инкубировали при 37°С в течение 1 часа. После инкубации реакционный раствор в титрационном микропланшете удаляли, планшет 5 раз промывали PBST, добавляли 50 мкл/лунку полимера стрептавидин-пероксидазы (Sigma, S2438-250UG), разбавленного раствором для разведения образца в соотношении 1:600, и инкубировали 1 час при 37°С. Планшет промывали 5 раз PBST, добавляли 50 мкл/лунку хромогенного субстрата ТМВ (KPL, 52-00-03) и инкубировали при комнатной температуре в течение 3-10 мин; для остановки реакции добавляли 50 мкл/лунку 1М H₂SO₄; считыватель микропланшетов NOVO Star использовали для считывания значения поглощения при 450 нм; рассчитывали значение IC50 антитела IL-5 для блокирования связывания IL-5 с IL-5Rα. Результаты представлены в Таблице 15. Антитела согласно настоящему изобретению могут эффективно ингибировать связывание IL-5 с его рецептором.

Пример исследования 4. Анализ антитела IL-5 на основе FACS для блокирования связывания IL-5 с рецептором IL-5

Чтобы идентифицировать отобранное антитело к IL-5, которое может блокировать рецептор IL-5 на клеточной поверхности, была сконструирована рекомбинантная клеточная линия CHOS, которая в высокой степени экспрессирует два рецептора IL-5Rα/β. Этот эксперимент продемонстрировал, что антитела IL-5 могут блокировать связывание IL-5 с рекомбинантным рецептором IL-5α/β на поверхности клеточной линии CHOS соответственно.

Конкретный способ представлял собой следующий: CD-CHO, содержащий 100 нг/мл G418 и 25 нг/мл зеоцина, использовали для культивирования CHO-S-IL-5Rα и β. При культивировании клеток концентрация не должна превышать 3×10⁶ клеток/мл. Клетки IL-5Rα/β-CHOS в хороших условиях центрифугировали (при 1000 об/мин, 5 мин), однократно промывали 10% FBS в PBS, клетки подсчитывали, концентрацию клеток доводили до 4×10⁶ клеток/мл, и 25 мкл отбирали и добавляли в круглодонный 96-луночный планшет. Тестируемое антитело разводили раствором PBS, содержащим 10% FBS. Начальная концентрация составляла 200 мкг/мл, и осуществляли разведение в соотношении 1:10 для получения 8 градиентных разведений. Добавляли 25 мкл 100 нг/мл IL-5, меченного набором для мечения биотином (Tojin Chemical, LK03), и полностью смешивали с 50 мкл разбавленного антитела в каждой концентрации, и добавляли в 96-луночный планшет, в который были добавлены клетки, и инкубировали при 4°С в течение 1 часа. После инкубирования образец центрифугировали при 4°С (400 g, 5 мин), удаляли супернатант, планшет промывали 200 мкл предварительно охлажденного PBS путем центрифугирования, повторенного дважды; добавляли вторичное антитело РЕ-авидин, разбавленное в соотношении 1:1333, и инкубировали в темноте при 4°С в течение 40 минут, центрифугировали при 4°С (400g, 5 минут); удаляли супернатант, добавляли 200 мкл предварительно охлажденного PBS для пипетирования клеток; планшет промывали центрифугированием при 4°С три раза; добавляли 100 мкл PBS, планшет считывали на приборе; значение IC50 антитела IL-5 для блокирования связывания IL-5 с IL-5Rα/β рассчитывали в соответствии со значением сигнала флуоресценции. Результаты представлены в Таблице 16 и на Фигуре 1.

Результаты показывают, что антитела h1705-008, h1706-009, h1780-017 и h1779-014 проявляют сильную способность блокировать связывание IL-5 с рецептором IL-5 на клеточной поверхности.

Пример исследования 5. Антитело к IL-5 ингибирует индуцированную IL-5 пролиферацию клеток TF1

IL-5 может индуцировать пролиферацию клеток TF-1, а антитело IL-5 может предотвращать стимуляцию IL-5 пролиферации клеток TF-1.

В частности: клетки TF-1 (АТСС, CRL-2003) культивировали в среде RPMI1640, содержащей 10% FBS и 2 нг/мл rhGM-CSF (LrnkBio, кат. №96-AF-300-03-20), помещенной в 37°С, инкубатор с 5% CO₂, плотность клеток не должна превышать 1×10⁶ клеток/мл. Для обнаружения антител клетки в логарифмической фазе роста трижды промывали PBS и центрифугировали при 800 об/мин в течение 5 мин; плотность клеток доводили до 6000 клеток/лунку/90 мкл с помощью RPMI1640 (FBS: 2%, рекомбинантный человеческий IL-5: 10 нг/мл); 10 мкл тестируемого антитела, разбавленного градиентом, добавляли в 96-луночный планшет для культивирования, через 3 дня культивирования добавляли 30 мкл титра клеток и перемешивали для обнаружения, IC50 рассчитывали по показаниям. Результаты испытаний показаны в Таблице 17 ниже.

Пример испытания 6. Испытание антитела к IL5 на ингибирование адгезии эозинофилов, индуцированной IL5

IL5 может индуцировать дифференцировку, созревание, миграцию и активацию эозинофилов, вызывая воспаление дыхательных путей и приводя к астме. Данный эксперимент основан на том принципе, что цитокины IL-5 могут способствовать адгезии и активации эозинофилов. Эозинофилы собирали и очищали из периферической крови человека для проверки блокирующего действия IL-5-специфических антител на путь IL-5 и для выявления блокирующего действия антител к IL-5 на опосредованную IL5 адгезию эозинофилов in vitro.

В частности: периферическую кровь человека разбавляли в 5 раз PBS, содержащим 2 мМ ЭДТА, и Percoll™ (градиент плотности 1,088) использовали для выделения моноцитов и гранулоцитов. Слой эритроцитов, содержащий гранулоциты, осторожно откачивали, и раствор для лизиса эритроцитов использовали для удаления эритроцитов; остальные клетки подсчитывали, пропорционально добавляли разделительные магнитные шарики (Miltenyi Biotec, кат. №130-045-701) с антителом к CD 16, инкубировали в течение 30 минут и пропускали через колонку с магнитными шариками, субпопуляции (в основном эозинофилы) непосредственно протекающие через колонку, собирали негативным отбором. Выделенные эозинофилы подсчитывали и добавляли в 96-луночный планшет для культивирования клеток, предварительно покрытый антителом IgG, примерно 1×10⁴ клеток на лунку; добавляли человеческий IL-5 (20 нг/мл) и молекулы антител к IL-5 в различных концентрациях (начиная с 10 мкг/мл, 3-кратное разведение, 10 точек концентрации); планшет для культивирования клеток помещали в инкубатор при 37°С, 5% CO₂ и инкубировали в течение 1 часа, затем планшет извлекали и добавляли 0,3% СТАВ для лизиса клеток, и, наконец, добавляли субстрат пероксидазной реакции ТМВ для проявления окрашивания, и значение поглощения OD450 считывали с помощью устройства для считывания микропланшетов. Значение показания для лунки, в которую был добавлен только IL-5, представляло собой максимальное значение поглощения; лунка без IL-5 и агента антитела служила фоновым контролем; рассчитывали значение ингибирования агента антитела при каждой концентрации относительно максимального значения адсорбции=(максимальное значение адсорбции-[агент антитело])/(максимальное значение адсорбции-фоновое контрольное значение) × 100%, и рассчитывали IC50. Результаты представлены в Таблице 18.

Результаты показывают, что гуманизированные антитела по настоящему раскрытию проявляют сильную способность ингибировать опосредованную IL5 адгезию эозинофилов.

Пример исследования 7. Оценка специфичности гуманизированного антитела к IL-5 с цитокином Th2

IL-5 представлял собой один из цитокинов Th2. Для подтверждения того, что антитела к IL-5 нацелены только на IL-5 и не вступают в перекрестную реакцию с другими цитокинами, Fortebio использовали для обнаружения 12 типов Th2 и родственных цитокинов, включая IL2 (R&D, 202-IL-010/CF), IL4 (R&D, 204-IL-050/CF), IL-5 (R&D, 205-IL-025/CF), IFNgamma, IL6 (R&D, 7270-IL-025/CF), IL9 (R&D, 209-IL-010/CF), IL10 (R&D, 217-IL-025/CF), IL13 (R&D, 213-ILB-025/CF), IL25 (R&D, 8134-IL-025/CF), IL31 (R&D, 2824-IL-010/CF) и IL3 (203-IL-050/CF) and GMCSF (R&D, 215-GM-010/CF), которые имеют общие а-рецепторы с IL-5.

В частности: Биосенсор белка A (PALL Fortebio, 18-5010) использовали для захвата антитела, регистрировали сигнал захвата, а затем вводили 40 нМ каждого цитокина, регистрировали новый сигнал связывания. Наконец, сигнал связывания с IL-5 был определен как 100%. Наблюдались сигналы связывания других цитокинов с антителами, и результаты показаны на Фигуре 2.

Результаты показывают, что среди 12 родственных цитокинов гуманизированные антитела к IL-5 h1705-008 и h1706-009 специфически связываются только с IL-5 и не обладают перекрестной реактивностью с другими цитокинами Th2.

Биологическая оценка активности in vivo

Пример исследования 8. Оценка эффективности антитела к IL-5 в OVA-индуцированной модели астмы мышей

Данное исследование было основано на воспалительной реакции дыхательных путей и ремоделировании дыхательных путей для оценки эффективности антитела к IL-5 в модели астмы мышей BALB/c, индуцированной аэрозолем овальбумина (OVA).

Мыши были случайным образом разделены на 7 групп в зависимости от массы тела, по 10 мышей в каждой: нормальная контрольная группа (G1); модельная группа (G2); группы лечения двумя исследуемыми антителами h1705-008 (G3 и G4) и h1706-009 (G5 и G6) в двух дозах (10 мкг/кг и 2 мкг/кг) каждого исследуемого антитела; и контрольная группа с положительным антителом Hu39D10 (G7, 10 мг/кг) На 1-й и 14-й дни всех мышей сенсибилизировали внутрибрюшинным введением раствора аллергена. В дни 28, 29 и 30 шесть групп мышей (за исключением первой группы) подвергали контрольному заражению аэрозольным раствором OVA в течение 30 минут. За два часа до заражения второй группе (G2) внутрибрюшинно вводили фосфатный буфер, мышам от третьей группы до седьмой группы (G3-G7) внутрибрюшинно вводили разные дозы разных антител (один раз в сутки, в течение трех последовательных дней). Тестируемые антитела были свежеприготовленными перед каждой инъекцией, и введение заканчивали в течение получаса после приготовления антитела. Мышей в первой группе (в качестве нормальной контрольной группы) подвергали контрольному заражению аэрозолем PBS в течение 30 минут, а за 2 часа до контрольного заражения внутрибрюшинно вводили фосфатный буфер один раз в день в течение трех последовательных дней.

На 31-й день систему WBP использовали для проверки гиперреактивности дыхательных путей у животных. Всем животным вводили аэрозоль для приема метахолина в 2-кратных возрастающих концентрациях (1,5625, 3,125, 6,25, 12,5, 25 и 50 мг/мл), измеряли значения индекса PenH дыхания при соответствующих концентрациях.

На 31-й день, через 1 час после определения реактивности дыхательных путей с помощью системы WBP, в трахею вводили и фиксировали трахеальную трубку диаметром 1,2 мм и дважды проводили лаваж легких по 0,8 мл фосфатного буфера, содержащего 1% БСА и 0,6 мМ ЭДТА. Регистрировали восстановленный объем лаважной жидкости.

BALF центрифугировали при 300 g при 4 градусах Цельсия в течение 5 минут. Супернатант сохраняли для анализа цитокинов. После центрифугирования клетки ресуспендировали в 1,5 мл PBS (содержащего 1% БСА и 0,6 мМ ЭДТА) для подсчета клеток. Для подсчета общего количества клеток в BALF использовали гемоцитометр и эксперимент по окрашиванию трипановым синим. Клетки толстым слоем наносили на на предметное стекло и окрашивали раствором Райта для окрашивания в течение одной минуты, а затем окрашивали красителем Гимза в течение 7 минут, чтобы различить эозинофилы, нейтрофилы, макрофаги и лимфоциты. Подсчет проводили под световым микроскопом.

После лаважа легочную ткань собирали и окрашивали 10% нейтральным раствором формальдегида, а затем фиксировали в 10%) нейтральном растворе формальдегида. Фиксированную ткань заливали в парафин, обрезали, окрашивали гематоксилин-эозином и проводили подсчет. Результаты исследований показаны на Фигуре 3, Фигуре 4А и Фигуре 4В.

Результаты показывают, что молекулы антител h1705-008 и h1706-009 по настоящему раскрытию могут значительно улучшать функцию легких дозозависимым образом, в то время как высокая доза (10 мг/кг) положительного соединения не может улучшить функцию легких (см. Фигуру 3). Между тем, два антитела значительно снижают уровень эозинофилов и толщину слизистой оболочки в той же дозе (10 мг/кг) и проявляют более сильную способность снижать количество эозинофилов, чем у положительного антитела (см. Фигуры 4А и 4В). В модели астмы у мышей того же типа повторные эксперименты также подтвердили, что 1 мг/мл h1705-008, h1706-009 и hi 780-017 значительно снижают уровень эозинофилов в BalF, чем уровень положительного антитела (см. Фигуру 4С).

Пример исследования 9. Оценка in vivo эффективности антитела к IL-5 в модели острой астмы морской свинки, индуцированной экзогенным человеческим IL-5

В этом эксперименте были отобраны самцы морских свинок для создания модели острой астмы, индуцированной человеческим IL-5, для оценки ингибирующего действия пяти гуманизированных mAb к IL-5 по настоящему описанию на увеличение эозинофилов в жидкости бронхиального лаважа (BALF) легких морской свинки, индуцированное IL-5 человека; и hu39D10 использовали в качестве положительного антитела. Морские свинки были разделены на 9 групп по 8-10 животных в каждой: нормальная контрольная группа, модельная группа, группа hu39D10 (1 мг/кг), группа h1705-008 (1 мг/кг), группа h1706-009 (1 мг/кгкг), группа hi780-017 (1 мг/кг), группа h1773-007 (1 мг/кг) и группа h1779-014 (1 мг/кг). Морским свинкам в модельной группе и группах введения трахеально вводили 100 мкл человеческого IL5 (содержащего 5 мкг антигена IL5) в день 1 для раздражения соответственно; и нормальной контрольной группе трахеально вводили PBS. Группе введения внутрибрюшинно вводили 1 мг/кг моноклонального антитела к IL5, как описано выше, за 2 часа до раздражения, с объемом введения 5 мл/кг; модельной группе вводили соответствующее антитело IgG; и нормальной контрольной группе внутрибрюшинно вводили растворитель PBS. Морских свинок анестезировали через 24 часа после инъекции в трахею для извлечения жидкости бронхиального лаважа легких. Концентрацию клеток доводили до 5^∧10⁶/мл, 15 мкл наносили на предметное стекло и высушивали для фиксации; выполняли окрашивание гематоксилин-эозином, подсчитывали общее количество клеток и эозинофилов под 400-кратным микроскопом и рассчитывали процентное содержание эозинофилов. Результаты показаны на Фигуре 5А и Фигуре 5В, что указывает на то, что 5 гуманизированных антител по настоящему раскрытию значительно снижают уровень эозинофилов в BALF.

Отбор и оценка стабильности ингредиентов в составе

Иллюстративный способ приготовления фармацевтической композиции (состава) антитела:

Стадия 1: брали определенное количество очищенного раствора антитела к IL-5 и использовали буфер, не содержащий антител (например, 30 мМ буфер уксусной кислоты и ацетата натрия, рН 5,5), вместо замены растворителя (предпочтительно путем ультрафильтрации); по меньшей мере, 6-кратный объем заменяли ультрафильтрационной мембраной, и белок концентрировали примерно до 120 мг/мл. Добавляли определенный объем исходного раствора сахарозы и перемешивали, чтобы получить конечную концентрацию сахарозы 72 мг/мл. Добавляли определенный объем исходного раствора полисорбата 80 и перемешивали, чтобы получить конечную концентрацию полисорбата 80 0,4 мг/мл. 10 мМ буфера уксусная кислота-ацетат натрия с рН 5,5 добавляли до достижения определенного объема, что приводило к концентрации белка 100 мг/мл (другие составы для тестирования или стабильные составы готовили в соответствии с аналогичными стадиями).

Продукт фильтровали, а затем тестировали путем центрального контроля на отсутствие патогенных агентов. Исходный раствор пропускали через фильтр 0,22 мкм PVDF и собирали фильтрат.

Стадия 2: объем доводили до 1,2 мл, фильтрат загружали в 2 мл флакон с пробкой, а пробы центрального контроля отбирали в начале, в середине и в конце загрузки для определения разницы в объеме загрузки.

Стадия 3: запускали укупорочную машину для наложения алюминиевых колпачков и выполнения укупорки.

Стадия 4: проводили визуальный осмотр, чтобы убедиться, что продукты не имеют дефектов, таких как неточная загрузка. Этикетки флаконов печатали и наносили; печатали этикетки на коробки; коробки складывали; упаковывали; и наносили этикетки на короба.

Пример исследования 10. Скрининг буферной системы

Составы h1705-008 с концентрацией белка 100 мг/мл готовили в серии буферов с рН от 5,0 до 6,5, где встряхиваемый образец содержал 0,2 мг/мл полисорбата 80 (PS80), а другие образцы содержали 0,05 мг/мл мл PS80. Буферные системы представляли собой следующие: 10 мМ уксусная кислота-ацетат натрия (АА), рН 5,0, 5,5; 10 мМ янтарная кислота-сукцинат натрия (SA) рН 5,0, 5,5, 6,0; 10 мМ лимонная кислота-цитрат натрия (СА) рН 5,5, 6,0, 6,5; 10 мМ гистидин-гидрохлорид (His) рН 5,5, 6,0, 6,5; 10 мМ фосфата (РВ) рН 6,0, 6,5. Каждый состав фильтровали, загружали, накладывали пробку и укупоривали. Образцы подвергали эксперименту по принудительной деградации; и оценочными показателями служили внешний вид, SEC, iCIEF.

Результаты представлены в Таблице 19. Данные внешнего вида показывают, что образцы, подвергшиеся встряхиванию (300 об/мин, 25°С), и образцы при 40°С демонстрируют разную степень образования частиц. В целом внешний вид лучше, когда рН ниже, а буферные системы уксусная кислота-ацетат натрия и янтарная кислота-сукцинат натрия являются лучшими; данные SEC показывают, что группа АА с рН 5,5 несколько лучше при 40°С; данные iCIEF показывают, что группы АА с рН 5,5, His с рН 5,5, СА с рН 6,5 несколько лучше при 40°С; при всестороннем рассмотрении физической и химической стабильности предпочтительным является АК с рН 5,5.

Пример исследования 11. Скрининг вспомогательных веществ в составах

Составы h1705-008 с концентрацией белка 100 мг/мл готовили в 10 мМ буфере SA (рН 5,0), содержащем различные типы вспомогательных веществ, указанные ниже. В частности, вспомогательные вещества представляли собой следующие:

1) 0,1 мг/мл полисорбата 20 (PS20)

2) 0,1 мг/мл полисорбата 80 (PS80)

3) 50 мг/мл сахарозы+0,1 мг/мл PS80

4) 50 мг/мл трегалозы+0,1 мг/мл PS80

5) 50 мг/мл маннита+0,1 мг/мл PS80

6) 50 мг/мл сорбита+0,1 мг/мл PS80

7) 8 мг/мл аргинина (Arg)+0,1 мг/мл PS80

8) 8 мг/мл лизина (Lys)+0,1 мг/мл PS80

9) 8 мг/мл глицина (Gly)+0,1 мг/мл PS80

10) 8 мг/мл метионина (Met)+0,1 мг/мл PS80

11) 8 мг/мл пролина (Pro)+0,1 мг/мл PS80

12) 8 мг/мл хлорида натрия (NaCl)+0,1 мг/мл PS80.

Каждый состав фильтровали, загружали, накладывали пробку и укупоривали, для применения. Образцы подвергали эксперименту по принудительной деградации при 40°С, результаты показывают, что (Таблица 20): нет существенной разницы в результатах испытаний SEC, СЕ и iCIEF среди каждой группы образцов, Arg/Lys/NaCl группы имеют худший внешний вид, и нет существенной разницы между другими группами. Благоприятное влияние на стабильность белка оказывают сахароза, трегалоза, маннит, сорбит, глицин, пролин и метионин.

Пример исследования 12. Скрининг поверхностно-активных веществ

Были приготовлены составы h1705-008, содержащие 10 мМ SA pH 5,5, 70 мг/мл сахарозы, 0,4 мг/мл PS20 или PS80 с концентрацией белка 100 мг/мл.

Образцы помещали при 4°С для исследования стабильности. Результаты представлены в Таблице 21. Результаты показывают, что группа PS80 демонстрирует прозрачный внешний вид и отсутствие значительных изменений в SEC, СЕ и iCIEF при 4°С в течение 4 месяцев, что указывает на благоприятную стабильность; тогда как большое количество частиц наблюдается в группе PS20. Поэтому PS80 лучше, чем PS20. Кроме того, можно увидеть, что добавление PS80 в состав оказывает лучший стабилизирующий эффект на h1705-008, и стабильность состава выше.

Пример исследования 13. Дизайн и скрининг DOE состава

DOE (дизайн эксперимента) разработан с рН 10 мМ ацетатного буфера (АА), концентрацией белка и концентрацией Твил в качестве переменных; ряд составов был разработан на основе следующих факторов и уровней: рН от 5,0 до 5,8, концентрация PS80 от 0,2 до 0,6 мг/мл, концентрация антитела h1705-008 от 80 до 120 мг/мл; составы показаны в Таблице 22. Образцы подвергали принудительной деградации при высокой температуре 40°С. В качестве показателей оценки использовали внешний вид, SEC, СЕ в невосстанавливаюших условиях и iCIEF. Результаты представлены в Таблице 23.

Результаты показывают, что внешний вид каждого состава является прозрачным; SEC, СЕ и iCIEF снижаются в допустимых пределах, на <2%, <2% и примерно на 14% соответственно; и стабильность состава является благоприятной; таким образом, состав содержит концентрацию белка 80-120 мг/мл, 0,2-0,6 мг/мл PS80, рН 5,0-5,8. Оптимальный состав представляет собой: 100 мг/мл белка, 0,4 мг/мл PS80, рН 5,5.

Пример исследования 14. Исследование стабильности

Были приготовлены составы h1705-008, содержащие 10 мМ АК, рН 5,5, 70 мг/мл сахарозы и 0,4 мг/мл PS80, с концентрацией белка 100 мг/мл; и образцы подвергали исследованию стабильности при 4°С и 25°С. Результаты представлены в Таблице 24.

Результаты показывают, что в условиях высокой температуры SEC, СЕ и iCIEF немного снижаются в составе h1705-008, но это снижение находится в допустимых пределах; нет существенного изменения всех показателей при других условиях. Состав имеет подходящую стабильность и может обеспечить стабильность h1705-008 при 4°С в течение 6 месяцев.

Пример исследования 15. Скрининг ионной силы.

Составы h1705-008, содержащие белок в концентрации 100 мг/мл, 70 мг/мл сахарозы и 0,4 мг/мл PS80, готовили в (натриевом) ацетатном буфере с различной ионной силой; измеряли рН буферов, используемых для замены, и рН конечных составов. Результаты представлены в Таблице 25. Результаты показывают, что чем выше ионная сила, тем ниже дрейф рН. Когда ионная сила составляет 30 мМ, дрейф рН составляет менее 0,1.

Пример исследования 16. Скрининг концентрации сахарида

Составы h1705-008, содержащие белок с концентрацией 100 мг/мл, 30 мМ АК, рН 5,5, 0,4 мг/мл PS80, готовили в следующих буферах, содержащих сахарозу с различными концентрациями. Определяли осмотическое давление. Результаты представлены в Таблице 26.

Результаты показывают, что осмотическое давление находится в оптимальном изотоническом диапазоне от 290 до 310 моем при концентрации сахарида 70-75 мг/мл; по данным осмотического давления групп 70 мг/мл и 73 мг/мл, осмотическое давление достигает наилучшего значения примерно 300 моем, когда концентрация сахарида составляет 72 мг/мл.

Пример исследования 17. Исследование стабильности составов

Составы h1705-008, содержащие белок в концентрации 100 мг/мл, 30 мМ АБС, рН 5,5, 72 мг/мл сахарозы, 0,4 мг/мл PS80, готовили для исследования стабильности при 4°С и 25°С. Результаты представлены в Таблице 27. Результаты показывают, что SEC, СЕ и IEC немного снижаются в составе h1705-008 в условиях высокой температуры, но это снижение находится в допустимом диапазоне; нет существенного изменения всех показателей при температуре 4°С, что указывает на благоприятную стабильность составов.

Пример исследования 18. Дополнительные возможные составы

Кроме того, в настоящем изобретении также предложены дополнительные составы фармацевтических составов антитела к IL-5, включающие, помимо прочего:

(1) 1 мг/мл антитела к IL-5 (h1705-008), 72 мг/мл сахарозы, 0,4 мг/мл полисорбата 80, и 10 мМ буфера уксусная кислота-ацетат натрия при рН 5,5;

(2) 100 мг/мл антитела к IL-5 (h1705-008), 72 мг/мл сахарозы, 0,4 мг/мл полисорбата 80, и 20 мМ буфера уксусная кислота-ацетат натрия при рН 5,5;

(3) 120 мг/мл антитела к IL-5 (h1705-008), 72 мг/мл сахарозы, 0,4 мг/мл полисорбата 80, и 40 мМ буфера уксусная кислота-ацетат натрия при рН 5,5;

(4) 100 мг/мл антитела к IL-5 (h1705-008), 80 мг/мл сахарозы, 0,6 мг/мл полисорбата 80, и 30 мМ буфера уксусная кислота-ацетат натрия при рН 5,0;

(5) 80 мг/мл антитела к IL-5 (h1705-008), 75 мг/мл сахарозы, 0,6 мг/мл полисорбата 80, и 20 мМ буфера уксусная кислота-ацетат натрия при рН 5,4;

(6) 100 мг/мл антитела к IL-5 (h1705-008), 80 мг/мл сахарозы, 0,4 мг/мл полисорбата 80, и 30 мМ буфера уксусная кислота-ацетат натрия при рН 5,5;

(7) 90 мг/мл антитела к IL-5 (h1705-008), 74 мг/мл сахарозы, 0,5 мг/мл полисорбата 80, и 25 мМ буфера уксусная кислота-ацетат натрия при рН 5,6;

(8) 90 мг/мл антитела к IL-5 (h1705-008), 76 мг/мл сахарозы, 0,3 мг/мл полисорбата 80, и 35 мМ буфер уксусная кислота-ацетат натрия при рН 5,4;

(9) 80 мг/мл антитела к IL-5 (h1705-008), 72 мг/мл сахарозы, 0,4 мг/мл полисорбата 80, и 30 мМ буфера уксусная кислота-ацетат натрия при рН 5,6;

(10) 100 мг/мл антитела к IL-5 (h1705-008), 72 мг/мл сахарозы, 0,4 мг/мл полисорбата 80, и 40 мМ буфера уксусная кислота-ацетат натрия при рН 5,5;

(11) 100 мг/мл антитела к IL-5 (h1705-008), 80 мг/мл сахарозы, 0,4 мг/мл полисорбата 80, и 40 мМ буфер уксусная кислота-ацетат натрия при рН 5,5;

Экспериментальные результаты показывают, что составы антитела к IL-5, как описано выше, обладают подходящей стабильностью и могут применяться для получения агентов антитела к IL-5.

Пример исследования 19. Лиофилизация составов антител к IL-5

Составы антител h1705-008, содержащие 72 мг/мл сахарозы, 0,4 мг/мл полисорбата 80 и концентрацию 100 мг/мл антитела к IL-5, готовили в 30 мМ буфере уксусная кислота-ацетат натрия при рН 5,5. Антитело загружали во флакон на 6 мл по 2,15 мл на флакон и помещали в лиофилизационную камеру для лиофилизации. Процесс лиофилизации включает предварительное замораживание, первичную сушку и вторичную сушку. По окончании процесса лиофилизации флаконы вакуумировали и закрывали пробками. Восстановленные образцы сравнивали с аналогом перед лиофилизацией. Результаты показывают, что восстановленные растворы могут сохранять те же характеристики, что и жидкие составы.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> JIANGSU HENGRUI MEDICINE CO., LTD.

SHANGHAI HENGRUI PHARMACEUTICAL CO., LTD.

<120> ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ АНТИТЕЛО К IL-5 И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ

<130> 702030CPCT

<160> 92

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 140

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ПЕПТИД

<223> Аминокислотная последовательность человеческого IL-5 с His-меткой (rhIL-5-his)

<400> 1

Met Arg Met Leu Leu His Leu Ser Leu Leu Ala Leu Gly Ala Ala Tyr

1 5 10 15

Val Tyr Ala Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu

20 25 30

Thr Leu Ala Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu

35 40 45

Thr Leu Arg Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr

50 55 60

Glu Glu Ile Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gln Thr Val Gln

65 70 75 80

Gly Gly Thr Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys

85 90 95

Tyr Ile Asp Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Val

100 105 110

Asn Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr

115 120 125

Glu Trp Ile Ile Glu Ser His His His His His His

130 135 140

<210> 2

<211> 140

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ПЕПТИД

<223> Аминокислотная последовательность cyno IL-5 с His-меткой

<400> 2

Met Arg Met Leu Leu His Leu Ser Leu Leu Ala Leu Gly Ala Ala Tyr

1 5 10 15

Val Tyr Ala Ile Pro Thr Glu Ile Pro Ala Ser Ala Leu Val Lys Glu

20 25 30

Thr Leu Ala Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu

35 40 45

Thr Leu Arg Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr

50 55 60

Glu Glu Ile Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gln Thr Val Gln

65 70 75 80

Gly Gly Thr Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys

85 90 95

Tyr Ile Gly Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Val

100 105 110

Asn Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr

115 120 125

Glu Trp Ile Ile Glu Ser His His His His His His

130 135 140

<210> 3

<211> 119

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ПЕПТИД

<223> Аминокислотная последовательность мышиного IL-5 с His-меткой

<400> 3

Met Glu Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Thr Gln Leu

1 5 10 15

Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro

20 25 30

Val Pro Thr His Lys Asn His Gln Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gln

35 40 45

Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asn Gln Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Glu

50 55 60

Met Leu Phe Gln Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gln

65 70 75 80

Lys Glu Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Thr Arg Gln Phe Leu Asp

85 90 95

Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Ser Thr Glu Trp Ala Met Glu

100 105 110

Gly His His His His His His

115

<210> 4

<211> 119

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ПЕПТИД

<223> Аминокислотная последовательность мышиного IL-5 с His-меткой

<400> 4

Met Glu Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Ile Gln Leu

1 5 10 15

Ser Thr His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro

20 25 30

Val Pro Thr His Lys Asn His Gln Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gln

35 40 45

Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asn Gln Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Glu

50 55 60

Ile Leu Phe Gln Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Gly Gln

65 70 75 80

Lys Glu Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Lys Thr Arg His Phe Leu Asp

85 90 95

Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Ser Thr Glu Trp Ala Met Glu

100 105 110

Val His His His His His His

115

<210> 5

<211> 560

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ПЕПТИД

<223> Аминокислотная последовательность рецептора IL-5 альфа человека, слитого с Fc-фрагментом человека

<400> 5

Asp Leu Leu Pro Asp Glu Lys Ile Ser Leu Leu Pro Pro Val Asn Phe

1 5 10 15

Thr Ile Lys Val Thr Gly Leu Ala Gln Val Leu Leu Gln Trp Lys Pro

20 25 30

Asn Pro Asp Gln Glu Gln Arg Asn Val Asn Leu Glu Tyr Gln Val Lys

35 40 45

Ile Asn Ala Pro Lys Glu Asp Asp Tyr Glu Thr Arg Ile Thr Glu Ser

50 55 60

Lys Cys Val Thr Ile Leu His Lys Gly Phe Ser Ala Ser Val Arg Thr

65 70 75 80

Ile Leu Gln Asn Asp His Ser Leu Leu Ala Ser Ser Trp Ala Ser Ala

85 90 95

Glu Leu His Ala Pro Pro Gly Ser Pro Gly Thr Ser Ile Val Asn Leu

100 105 110

Thr Cys Thr Thr Asn Thr Thr Glu Asp Asn Tyr Ser Arg Leu Arg Ser

115 120 125

Tyr Gln Val Ser Leu His Cys Thr Trp Leu Val Gly Thr Asp Ala Pro

130 135 140

Glu Asp Thr Gln Tyr Phe Leu Tyr Tyr Arg Tyr Gly Ser Trp Thr Glu

145 150 155 160

Glu Cys Gln Glu Tyr Ser Lys Asp Thr Leu Gly Arg Asn Ile Ala Cys

165 170 175

Trp Phe Pro Arg Thr Phe Ile Leu Ser Lys Gly Arg Asp Trp Leu Ala

180 185 190

Val Leu Val Asn Gly Ser Ser Lys His Ser Ala Ile Arg Pro Phe Asp

195 200 205

Gln Leu Phe Ala Leu His Ala Ile Asp Gln Ile Asn Pro Pro Leu Asn

210 215 220

Val Thr Ala Glu Ile Glu Gly Thr Arg Leu Ser Ile Gln Trp Glu Lys

225 230 235 240

Pro Val Ser Ala Phe Pro Ile His Cys Phe Asp Tyr Glu Val Lys Ile

245 250 255

His Asn Thr Arg Asn Gly Tyr Leu Gln Ile Glu Lys Leu Met Thr Asn

260 265 270

Ala Phe Ile Ser Ile Ile Asp Asp Leu Ser Lys Tyr Asp Val Gln Val

275 280 285

Arg Ala Ala Val Ser Ser Met Cys Arg Glu Ala Gly Leu Trp Ser Glu

290 295 300

Trp Ser Gln Pro Ile Tyr Val Gly Asn Asp Glu His Lys Pro Leu Arg

305 310 315 320

Glu Trp Ile Glu Gly Arg Met Asp Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

325 330 335

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

340 345 350

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

355 360 365

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

370 375 380

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

385 390 395 400

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

405 410 415

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

420 425 430

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

435 440 445

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

450 455 460

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

465 470 475 480

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

485 490 495

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

500 505 510

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

515 520 525

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

530 535 540

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

545 550 555 560

<210> 6

<211> 118

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области тяжелой цепи мышиного mAb1705

<400> 6

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr

20 25 30

Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Thr Ser Ile Ser Tyr Glu Gly Asp Ile Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Gln Thr Leu Arg Glu Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val

100 105 110

Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 7

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области легкой цепи мышиного mAb1705

<400> 7

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ala Asn Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Ile Ala Arg Ser Pro Lys Leu Val Ile

35 40 45

Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Glu Val Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Thr Leu Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Phe Cys Leu Gln Asp Lys Glu Phe Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 8

<211> 118

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<220>

<221> ДОМЕН

<223> вариабельная область тяжелой цепи мышиного mAb1706

<400> 8

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr

20 25 30

Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Thr Ser Ile Asn Tyr Glu Gly Asn Ser Ala Tyr Tyr Gly Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Glu Thr Leu Arg Glu Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val

100 105 110

Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 9

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<220>

<221> ДОМЕН

<223> последовательность вариабельной области легкой цепи мышиного mAb1706

<400> 9

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Lys Ser Pro Lys Leu Met Ile

35 40 45

His Ser Ala Ser Asn Leu Glu Val Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Thr Leu Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Pro Gly Ile Tyr Phe Cys Leu Gln His Lys Gln Phe Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 10

<211> 119

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<220>

<221> ДОМЕН

<223> последовательность вариабельной области тяжелой цепи мышиного mAb1780

<400> 10

Gln Val Lys Leu Leu Gln Ser Gly Ala Ala Leu Val Lys Pro Gly Asp

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr

20 25 30

Leu Ile His Trp Val Lys Gln Ser Gln Gly Arg Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Ser Gly Gly Thr Val Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Phe Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Phe Arg Arg Leu Thr Phe Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gly Gly Tyr Ser Asp Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Val Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 11

<211> 106

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<220>

<221> ДОМЕН

<223> п вариабельной области легкой цепи мышиного mAb1780

<400> 11

Asp Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ala Val Ser Pro Gly Glu

1 5 10 15

Arg Val Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Gly Leu Thr Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Lys Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Ala Asp

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Asn Trp Asn Asp Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 12

<211> 116

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<220>

<221> ДОМЕН

<223> The sequence for mAb1773 murine вариабельной области тяжелой цепи

<400> 12

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Leu Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Thr Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asn Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asp Thr Lys His Gly Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Phe Arg Tyr Gly Ile Tyr Pro Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Pro Leu

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 13

<211> 106

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области легкой цепи мышиного mAb1773

<400> 13

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Ile

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Leu Thr Ala Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Phe Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Glu

100 105

<210> 14

<211> 120

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области тяжелой цепи мышиного mAb1779

<400> 14

Gln Val Lys Leu Leu Gln Ser Gly Ala Ala Leu Val Lys Pro Gly Asp

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ile Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Asn Tyr Asn Glu Asn Phe

50 55 60

Lys Arg Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Phe Ser Arg Val Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Gly Arg Arg Ile Ala Trp Asp His Trp Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Pro

100 105 110

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 15

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области легкой цепи мышиного mAb1779

<400> 15

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Ser Ile Glu Cys Leu Ala Ser Glu Gly Ile Ser Asn Asp

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Arg Ser Pro Gln Leu Leu Val

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Arg Tyr Phe Phe Lys Ile Ser Gly Met Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Tyr Lys Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 16

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<220>

<221> ДОМЕН

<223> mAb1705 HCDR1

<400> 16

His Tyr Tyr Met Ala

1 5

<210> 17

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<220>

<221> ДОМЕН

<223> mAb1705 HCDR2

<400> 17

Ser Ile Ser Tyr Glu Gly Asp Ile Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 18

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<220>

<221> ДОМЕН

<223> mAb1705 HCDR3

<400> 18

Gln Thr Leu Arg Glu Ser Phe Asp Tyr

1 5

<210> 19

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<220>

<221> ДОМЕН

<223> mAb1705 LCDR1

<400> 19

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ala Asn Tyr Leu Ser

1 5 10

<210> 20

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<220>

<221> ДОМЕН

<223> mAb1705 LCDR2

<400> 20

Gly Thr Ser Asn Leu Glu Val

1 5

<210> 21

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<220>

<221> ДОМЕН

<223> mAb1705 LCDR3

<400> 21

Leu Gln Asp Lys Glu Phe Pro Arg Thr

1 5

<210> 22

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<220>

<221> ДОМЕН

<223> mAb1706 HCDR1

<400> 22

His Tyr Tyr Met Ala

1 5

<210> 23

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<220>

<221> ДОМЕН

<223> mAb1706 HCDR2

<400> 23

Ser Ile Asn Tyr Glu Gly Asn Ser Ala Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 24

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<220>

<221> ДОМЕН

<223> mAb1706 HCDR3

<400> 24

Glu Thr Leu Arg Glu Ser Leu Asp Tyr

1 5

<210> 25

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<220>

<221> ДОМЕН

<223> mAb1706 LCDR1

<400> 25

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Tyr Leu Ser

1 5 10

<210> 26

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<220>

<221> ДОМЕН

<223> mAb1706 LCDR2

<400> 26

Ser Ala Ser Asn Leu Glu Val

1 5

<210> 27

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<220>

<221> ДОМЕН

<223> mAb1706 LCDR3

<400> 27

Leu Gln His Lys Gln Phe Pro Arg Thr

1 5

<210> 28

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<220>

<221> ДОМЕН

<223> mAb1780 HCDR1

<400> 28

Glu Tyr Leu Ile His

1 5

<210> 29

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<220>

<221> ДОМЕН

<223> mAb1780 HCDR2

<400> 29

Tyr Ile Asn Pro Tyr Ser Gly Gly Thr Val Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Ser

<210> 30

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<220>

<221> ДОМЕН

<223> mAb1780 HCDR3

<400> 30

Asp Gly Gly Tyr Ser Asp Pro Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 31

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<220>

<221> ДОМЕН

<223> mAb1780 LCDR1

<400> 31

Arg Ala Ser Glu Gly Leu Thr Ser Tyr Met His

1 5 10

<210> 32

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<220>

<221> ДОМЕН

<223> mAb1780 LCDR2

<400> 32

Lys Ala Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 33

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<220>

<221> ДОМЕН

<223> mAb1780 LCDR3

<400> 33

Gln Gln Asn Trp Asn Asp Pro Trp Thr

1 5

<210> 34

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<220>

<221> ДОМЕН

<223> mAb1773 HCDR1

<400> 34

Asn Thr Tyr Ile His

1 5

<210> 35

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<220>

<221> ДОМЕН

<223> mAb1773 HCDR2

<400> 35

Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asp Thr Lys His Gly Pro Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 36

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<220>

<221> ДОМЕН

<223> mAb1773 HCDR3

<400> 36

Tyr Gly Ile Tyr Pro Asp His

1 5

<210> 37

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<220>

<221> ДОМЕН

<223> mAb1773 LCDR1

<400> 37

Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Ile Tyr

1 5 10

<210> 38

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<220>

<221> ДОМЕН

<223> mAb1773 LCDR2

<400> 38

Leu Thr Ala Thr Leu Ala Ser

1 5

<210> 39

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<220>

<221> ДОМЕН

<223> mAb1773 LCDR3

<400> 39

Gln Gln Trp Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 40

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<220>

<221> ДОМЕН

<223> mAb1779 HCDR1

<400> 40

Asp Tyr Ile Ile His

1 5

<210> 41

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<220>

<221> ДОМЕН

<223> mAb1779 HCDR2

<400> 41

Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Asn Tyr Asn Glu Asn Phe Lys

1 5 10 15

Arg

<210> 42

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<220>

<221> ДОМЕН

<223> mAb1779 HCDR3

<400> 42

Arg Ile Ala Trp Asp His Trp Tyr Phe Asp Phe

1 5 10

<210> 43

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<220>

<221> ДОМЕН

<223> mAb1779 LCDR1

<400> 43

Leu Ala Ser Glu Gly Ile Ser Asn Asp Val Ala

1 5 10

<210> 44

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<220>

<221> ДОМЕН

<223> mAb1779 LCDR2

<400> 44

Ala Ala Ser Arg Leu Gln Asp

1 5

<210> 45

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<220>

<221> ДОМЕН

<223> mAb1779 LCDR3

<400> 45

Gln Gln Gly Tyr Lys Thr Pro Leu Thr

1 5

<210> 46

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> h1705_VL.1

<400> 46

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ala Asn Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Glu Val Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Lys Glu Phe Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 47

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> h1705_VL.1A

<400> 47

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ala Asn Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Glu Val Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Lys Glu Phe Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 48

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> h1705_VL.1B

<400> 48

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ala Asn Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Val Ile

35 40 45

Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Glu Val Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln Asp Lys Glu Phe Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 49

<211> 118

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> h1705_VH.1

<400> 49

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr

20 25 30

Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Tyr Glu Gly Asp Ile Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gln Thr Leu Arg Glu Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 50

<211> 118

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> h1705_VH.1A

<400> 50

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr

20 25 30

Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Tyr Glu Gly Asp Ile Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Gln Thr Leu Arg Glu Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 51

<211> 118

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> h1705_VH.1B

<400> 51

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr

20 25 30

Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Thr Ser Ile Ser Tyr Glu Gly Asp Ile Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Gln Thr Leu Arg Glu Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 52

<211> 330

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Константная область тяжелой цепи IgG1

<400> 52

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 53

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> константная область легкой цепи каппа

<400> 53

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 54

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> h1706_VL.1

<400> 54

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Glu Val Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Lys Gln Phe Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 55

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> h1706_VL.1A

<400> 55

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Glu Val Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Lys Gln Phe Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 56

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> h1706_VL.1B

<400> 56

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Met Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Glu Val Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln His Lys Gln Phe Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 57

<211> 118

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> h1706_VH.1

<400> 57

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr

20 25 30

Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Asn Tyr Glu Gly Asn Ser Ala Tyr Tyr Gly Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Glu Thr Leu Arg Glu Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 58

<211> 118

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> h1706_VH.1A

<400> 58

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr

20 25 30

Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Asn Tyr Glu Gly Asn Ser Ala Tyr Tyr Gly Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Glu Thr Leu Arg Glu Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 59

<211> 118

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> h1706_VH.1B

<400> 59

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr

20 25 30

Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Thr Ser Ile Asn Tyr Glu Gly Asn Ser Ala Tyr Tyr Gly Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Glu Thr Leu Arg Glu Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 60

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> h1780_VL.1

<400> 60

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Gly Leu Thr Ser Tyr

20 25 30

Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Trp Asn Asp Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 61

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> h1780_VL.1A

<400> 61

Asp Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Gly Leu Thr Ser Tyr

20 25 30

Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Trp Asn Asp Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 62

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> h1780_VL.1B

<400> 62

Asp Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Gly Leu Thr Ser Tyr

20 25 30

Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Asn Trp Asn Asp Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 63

<211> 119

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> h1780_VH.1

<400> 63

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr

20 25 30

Leu Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Ser Gly Gly Thr Val Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gly Gly Tyr Ser Asp Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 64

<211> 119

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> h1780_VH.1A

<400> 64

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr

20 25 30

Leu Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Ser Gly Gly Thr Val Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gly Gly Tyr Ser Asp Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 65

<211> 119

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> h1780_VH.1B

<400> 65

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr

20 25 30

Leu Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Ser Gly Gly Thr Val Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Phe Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gly Gly Tyr Ser Asp Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 66

<211> 119

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> h1780_VH.1C

<400> 66

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr

20 25 30

Leu Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Ser Gly Gly Thr Val Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Phe Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gly Gly Tyr Ser Asp Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 67

<211> 106

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> h1773_VL.1

<400> 67

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Ile

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Leu Thr Ala Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 68

<211> 106

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> h1773_VL.1A

<400> 68

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Ile

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Leu Thr Ala Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 69

<211> 116

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> h1773_VH.1

<400> 69

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Val Gly Asp Thr Lys His Gly Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Tyr Gly Ile Tyr Pro Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 70

<211> 116

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> h1773_VH.1A

<400> 70

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Asn Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Val Gly Asp Thr Lys His Gly Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Phe Arg Tyr Gly Ile Tyr Pro Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 71

<211> 116

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> h1773_VH.1B

<400> 71

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Asn Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Val Gly Asp Thr Lys His Gly Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Phe Arg Tyr Gly Ile Tyr Pro Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 72

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> h1779_VL.1

<400> 72

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Glu Gly Ile Ser Asn Asp

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Lys Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 73

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> h1779_VL.1A

<400> 73

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Glu Gly Ile Ser Asn Asp

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Lys Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 74

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> h1779_VL.1B

<400> 74

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Glu Gly Ile Ser Asn Asp

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Val

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Lys Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 75

<211> 120

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> h1779_VH.1

<400> 75

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ile Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Asn Tyr Asn Glu Asn Phe

50 55 60

Lys Arg Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Ile Ala Trp Asp His Trp Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 76

<211> 120

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> h1779_VH.1A

<400> 76

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ile Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Asn Tyr Asn Glu Asn Phe

50 55 60

Lys Arg Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Ile Ala Trp Asp His Trp Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 77

<211> 120

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> h1779_VH.1B

<400> 77

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ile Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Asn Tyr Asn Glu Asn Phe

50 55 60

Lys Arg Arg Ala Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Ile Ala Trp Asp His Trp Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 78

<211> 120

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> h1779_VH.1C

<400> 78

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ile Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Asn Tyr Asn Glu Asn Phe

50 55 60

Lys Arg Arg Ala Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Phe Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Ile Ala Trp Asp His Trp Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 79

<211> 120

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> h1779_VH.1D

<400> 79

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ile Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Asn Tyr Asn Glu Asn Phe

50 55 60

Lys Arg Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Phe Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Ile Ala Trp Asp His Trp Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 80

<211> 443

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность тяжелой цепи hu39D10

<400> 80

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Leu Ser Leu Thr Ser Asn

20 25 30

Ser Val Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Leu Ile Trp Ser Asn Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Ile Lys

50 55 60

Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Glu Tyr Tyr Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro

210 215 220

Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

225 230 235 240

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

245 250 255

Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn

260 265 270

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

275 280 285

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

290 295 300

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

305 310 315 320

Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

325 330 335

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu

340 345 350

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

355 360 365

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

370 375 380

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

385 390 395 400

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly

405 410 415

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

420 425 430

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440

<210> 81

<211> 214

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность легкой цепи hu39D10

<400> 81

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Glu Gly Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Asn Ser Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Ala Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Lys Phe Pro Asn

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Val Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 82

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> HCDR2 вариант тяжелой цепи антитела h1773

<400> 82

Arg Ile Asp Pro Ala Val Gly Asp Thr Lys His Gly Pro Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 83

<211> 448

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЦЕПЬ

<223> h1705-008 тяжелая цепь

<400> 83

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr

20 25 30

Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Thr Ser Ile Ser Tyr Glu Gly Asp Ile Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Gln Thr Leu Arg Glu Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg

245 250 255

Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 84

<211> 214

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> CHAIN

<223> h1705-008 легкая цепь

<400> 84

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ala Asn Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Glu Val Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Lys Glu Phe Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 85

<211> 448

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> цепь

<223> h1706-009 тяжелая цепь

<400> 85

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr

20 25 30

Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Asn Tyr Glu Gly Asn Ser Ala Tyr Tyr Gly Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Glu Thr Leu Arg Glu Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg

245 250 255

Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 86

<211> 214

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЦЕПЬ

<223> h1706-009 легкая цепь

<400> 86

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Met Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Glu Val Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln His Lys Gln Phe Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 87

<211> 449

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЦЕПЬ

<223> h1780-017 тяжелая цепь

<400> 87

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr

20 25 30

Leu Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Ser Gly Gly Thr Val Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Phe Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gly Gly Tyr Ser Asp Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr

245 250 255

Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 88

<211> 214

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЦЕПЬ

<223> h1780-017 ЛЕГКАЯ ЦЕПЬ

<400> 88

Asp Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Gly Leu Thr Ser Tyr

20 25 30

Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Asn Trp Asn Asp Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 89

<211> 446

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЦЕПЬ

<223> h1773-007 тяжелая цепь

<400> 89

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Asn Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Val Gly Asp Thr Lys His Gly Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Phe Arg Tyr Gly Ile Tyr Pro Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 90

<211> 213

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЦЕПЬ

<223> h1773-007 легкая цепь

<400> 90

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Ile

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Leu Thr Ala Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 91

<211> 450

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЦЕПЬ

<223> h1779-014 тяжелая цепь

<400> 91

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ile Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Asn Tyr Asn Glu Asn Phe

50 55 60

Lys Arg Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Phe Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Ile Ala Trp Asp His Trp Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile

245 250 255

Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 92

<211> 214

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЦЕПЬ

<223> h1779-014 легкая цепь

<400> 92

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Glu Gly Ile Ser Asn Asp

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Val

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Lys Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<---

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложена фармацевтическая композиция, содержащая антитело против IL-5, и ее применение. Фармацевтическая композиция содержит от 80 мг/мл до 120 мг/мл антитела к IL-5, от 10 мМ до 30 мМ буфера уксусная кислота-ацетат натрия или янтарная кислота-сукцинат натрия, при этом pH составляет от 5,0 до 5,8, от 0,1 мг/мл до 0,6 мг/мл полисорбата 80 и от 50 мг/мл до 80 мг/мл сахарозы. Антитело к IL-5 содержит тяжелую цепь, как показано в SEQ ID NO: 83, и легкую цепь, как показано в SEQ ID NO: 84. Также предложены лиофилизированный состав и восстановленный раствор, содержащие антитело к IL-5 и указанные буфер и поверхностно-активное вещество, для лечения заболевания, опосредованного IL-5. Изобретения обеспечивают составы антитела против IL-5, стабильные при 2-8°С или при 25°С в течение по меньшей мере 6 месяцев. 4 н. и 10 з.п. ф-лы, 5 ил., 28 табл., 19 пр.

1. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания, опосредованного IL-5, содержащая:

от 80 мг/мл до 120 мг/мл антитела к IL-5,

от 10 мМ до 30 мМ буфера уксусная кислота-ацетат натрия или янтарная кислота-сукцинат натрия, при этом pH составляет от 5,0 до 5,8,

от 0,1 мг/мл до 0,6 мг/мл полисорбата 80 и

от 50 мг/мл до 80 мг/мл сахарозы;

при этом антитело к IL-5 содержит тяжелую цепь, как показано в SEQ ID NO: 83, и легкую цепь, как показано в SEQ ID NO: 84.

2. Фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что рН буфера составляет 5,5.

3. Фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что концентрация буфера уксусная кислота-ацетат натрия или янтарная кислота-сукцинат натрия составляет от 20 мМ до 30 мМ.

4. Фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что концентрация антитела к IL-5 составляет 100 мг/мл.

5. Фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что концентрация полисорбата 80 составляет от 0,2 мг/мл до 0,6 мг/мл.

6. Фармацевтическая композиция по п. 5, отличающаяся тем, что концентрация полисорбата 80 составляет 0,4 мг/мл.

7. Фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что концентрация сахарозы составляет от 70 мг/мл до 75 мг/мл.

8. Фармацевтическая композиция по п. 7, отличающаяся тем, что концентрация сахарозы составляет 72 мг/мл.

9. Фармацевтическая композиция по п. 1, которая содержит:

от 80 мг/мл до 120 мг/мл антитела к IL-5,

от 10 мМ до 30 мМ буфера уксусная кислота-ацетат натрия, при этом рН составляет от 5,0 до 5,8,

от 0,2 мг/мл до 0,6 мг/мл полисорбата 80, и

от 70 мг/мл до 80 мг/мл сахарозы;

при этом антитело к IL-5 содержит тяжелую цепь, как показано в SEQ ID NO: 83, и легкую цепь, как показано в SEQ ID NO: 84.

10. Фармацевтическая композиция по п. 1, которая содержит:

100 мг/мл антитела к IL-5,

30 мМ буфера уксусная кислота-ацетат натрия, при этом рН составляет 5,5,

0,4 мг/мл полисорбата 80, и

72 мг/мл сахарозы;

при этом антитело к IL-5 содержит тяжелую цепь, как показано в SEQ ID NO: 83, и легкую цепь, как показано в SEQ ID NO: 84.

11. Лиофилизированный состав, содержащий антитело к IL-5, для лечения заболевания, опосредованного IL-5, который получают путем лиофилизации фармацевтической композиции по любому из пп. 1-10, где указанный лиофилизированный состав содержит антитело к IL-5, буфер уксусная кислота-ацетат натрия или янтарная кислота-сукцинат натрия, полисорбат 80 и сахарозу; при этом антитело к IL-5 содержит тяжелую цепь, как показано в SEQ ID NO: 83, и легкую цепь, как показано в SEQ ID NO: 84.

12. Лиофилизированный состав по п. 11, при получении которого лиофилизация включает стадии предварительного замораживания, первичной сушки и вторичной сушки, последовательно.

13. Восстановленный раствор, содержащий антитело к IL-5, для лечения заболевания, опосредованного IL-5, причем указанный восстановленный раствор получают путем восстановления лиофилизированного состава по п. 11 или 12, причем восстановленный раствор содержит:

от 80 мг/мл до 120 мг/мл антитела к IL-5,

от 10 мМ до 30 мМ буфера уксусная кислота-ацетат натрия или янтарная кислота-сукцинат натрия, при этом pH составляет от 5,0 до 5,8,

от 0,1 мг/мл до 0,6 мг/мл полисорбата 80 и

от 50 мг/мл до 80 мг/мл сахарозы;

при этом антитело к IL-5 содержит тяжелую цепь, как показано в SEQ ID NO: 83, и легкую цепь, как показано в SEQ ID NO: 84.

14. Применение фармацевтической композиции по любому из пп. 1-10, или лиофилизированного состава по п. 11 или 12, или восстановленного раствора по п. 13 для получения лекарственного средства, где лекарственное средство предназначено для лечения заболевания, опосредованного IL-5; причем заболевание, опосредованное IL-5, выбрано из группы, состоящей из астмы, хронической пневмонии, аллергического ринита, аллергического бронхолегочного аспергиллеза, эозинофилии, синдрома Чарга-Стросса, атопического дерматита, онхоцеркозного дерматита, перемежающегося ангионевротического отека, синдрома эозинофильной миалгии, эозинофильного гастроэнтерита, глистной инфекции, болезни Ходжкина, полипов носа, синдрома Леффлера, крапивницы, гиперэозинофильного бронхита, узелкового артериита, синусита, эозинофильного эзофагита, аллергического эозинофильного эзофагита, аллергического конъюнктивита, онхоцеркозного дерматита, эндометриоза и стероид-зависимого эозинофильного бронхита.