Применение рекомбинантного аналога белка человека SLURP-1 совместно с цитостатиками или препаратами ингибиторами протеасом для торможения роста карцином Российский патент 2021 года по МПК C12N15/11 C07K14/52 A61K38/19 A61P35/00 

Описание патента на изобретение RU2751132C1

Изобретение относится к медицине и биологии, к области экспериментальной онкологии. Способ может быть использован для торможения роста и терапии опухолей.

Онкологические заболевания являются второй по распространенности причиной смерти населения после заболеваний сердечно-сосудистой системы, как в России, так и в мире, поэтому поиск новых эффективных стратегий терапии опухолей входит в список приоритетных проблем современной медицины. Большинство из применяемых в настоящее время противоопухолевых препаратов также действуют и на здоровые клетки организма и обладают высокой токсичностью [Nurgali K, Jagoe RT, Abalo R. (2018). Front. Pharmacol. 9(245):00245. doi: 10.3389/fphar.2018.00245]. Кроме того, клетки опухоли в процессе роста, могут вырабатывать резистентность к применяемым химиотерапевтическим препаратам [Vasan N, Baselga J, HymanDM. A view on drug resistance in cancer. (2019). Nature. 575(7782):299-309. doi: 10.1038/s41586-019-1730-1]. Одним из способов увеличения эффективности противоопухолевого действия, уменьшения токсического действия и ограничения способности клеток к выработке резистентности является использование комбинаций препаратов, действующих на разные молекулярные мишени [Nurgali K, Jagoe RT, Abalo R. (2018). Front. Pharmacol. 9:245. 00245. doi: 10.3389/fphar.2018.00245].

Известно, что в клетках карцином экспрессируются никотиновые ацетилхолиновые рецепторы а7 типа (а7-nAChR), ингибирование которых приводит к торможению роста опухолевых клеток [Grozio A, Paleari L, Catassi A, Servent D, Cilli M, Piccardi F, Paganuzzi M, Cesario A, Granone P, Mourier G, Russo P. (2008) Int. J. Cancer. 122(8):1911-5; Zhang H. (2016) Drug Design, Development and Therapy. 10:3867-72; Trombino S, Cesario A, Margaritora S, Granone P, Motta G, Falugi C, Russo P. (2004) Cancer Res. 64(1):135-45]. Белок SLURP-1 действует на никотиновые ацетилхолиновые рецепторы a7 типа (а7-nAChR) и способен тормозить рост клеток карцином [Shulepko MA, Bychkov ML, Shlepova OV, Shenkarev ZO, Kirpichnikov MP, Lyukmanova EN. (2020) Int Immunopharmacol. 82:106303; Lyukmanova EN, Bychkov ML, Sharonov GV, Efremenko AV, Shulepko MA, Kulbatskii DS, Shenkarev ZO, Feofanov AV, Dolgikh DA, Kirpichnikov MP. (2018). Br J Pharmacol. 175:1973-1986. doi: 10.1111/bph.14194; Е. Н. Люкманова, М. А. Шулепко, М. Л. Бычков, З. О. Шенкарев, А. С. Парамонов, А. О. Чугунов, A. С. Арсеньев, Д. А. Долгих, М. П. Кирпичников. (2014) Acta Naturae, 6(4): 58-65].

Наиболее близким к заявленному является способ торможения роста клеток карцином с использованием ингибитора рецептора эпидермального фактора роста гефитиниба в комбинации с рекомбинантным аналогом белка человека SLURP-1 (SEQ ID NO:1) [Lyukmanova EN, Bychkov ML, Sharonov GV, Efremenko AV, Shulepko MA, Kulbatskii DS, Shenkarev ZO, Feofanov AV, Dolgikh DA, Kirpichnikov MP. (2018). Br J Pharmacol. 175:1973-1986. doi: 10.1111/bph.14194]. Сочетанное применение гефитиниба и SLURP-1 позволяет добиться более эффективного торможения роста клеток карцином. Однако, клетки не всех типов карцином экспрессируют рецептор эпидермального фактора роста и чувствительны к действию ингибиторов этого рецептора [Sigismund S, Avanzato D, Lanzetti L. (2018). Mol Oncol. 12(1):3- 20. doi: 10.1002/1878-0261.12155].

В настоящее время для торможения роста опухолей также применяются препараты более широкого действия, например, цитостатики (доксорубицин, [Ingle JN, Pfeifle DM, Green SJ, Kvols LK, Brunk SF, Reuter NF, Krook JE, Laurie JA, Everson LK, Marschke RF. (1985). Am J Clin Oncol. 8(4):275-282]) и ингибиторы протеасом (бортезомиб, [Kouroukis TC, Baldassarre FG, Haynes AE, Imrie K, Reece DE, Cheung MC. (2014). Current Oncology. 21(4):e573-e603]). Однако, препараты этих семейств обладают значительной токсичностью и при высоких концентрациях способны вызывать множество побочных эффектов [Schirrmacher V. (2019). Int J Oncol. 54(2):407-419. doi: 10.3892/ijo.2018.4661].

Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является увеличение эффективности действия препаратов из групп цитостатиков и ингибиторов протеасом при снижении их концентраций. Достигаемый технический результат – высокая эффективность торможения роста клеток карцином, снижение эффективных концентраций действующих веществ препаратов, необходимых для подавления роста опухоли.

Поставленная техническая проблема и заявленный технический результат достигается за счет сочетанного применения препаратов цитостатиков или ингибиторов протеасом с рекомбинантным аналогом белка SLURP-1 (SEQ ID NO:1) для торможения роста клеток карцином. В этом случае остановка роста опухолевых клеток достигается за счет комбинированного действия противоопухолевых препаратов (либо цитостатических, либо действующих на протеасомы) и рекомбинантного аналога белка SLURP-1 (SEQ № 1), действующего на а7-nAChR. В качестве ингибитора протеасом может быть использован, например, ингибитор 26S субъединицы протеасом бортезомиб, а в качестве цитостатика может быть использован интеркалирующий ДНК антибиотик антрациклинового ряда доксорубицин. Рекомбинантный аналог белка человека SLURP-1 (SEQ ID NO:1) получают в бактериальной системе экспрессии, при которой белок ренатурируют из цитоплазматических

телец включения E. coli (патент РФ № 2453602, C12N 15/11, опубл. 27.02.2012г.).

Изобретение иллюстрируют графические материалы:

На фиг. 1 представлены данные по влиянию рекомбинантного аналога SLURP-1 (SEQ ID NO:1), ингибитора протеасом бортезомиба и комбинации препаратов на рост клеток карциномы легкого линии А549. Клетки инкубируют в течение 24 часов или с 1 мкМ SLURP-1, или с бортезомибом (10 или 1 мкМ), или с 1 мкМ SLURP-1 в комбинации с 10 нМ бортезомиба. Жизнеспособность клеток определяют с помощью МТТ-теста. Данные показаны как среднее ± S.E.M. (n = 6). (*) означает статистически значимые (p < 0.05) отличия групп согласно двухфакторному дисперсионному анализу (two-way ANOVA) и апостериорному критерию Туки.

На фиг. 2 представлены данные по влиянию рекомбинантного аналога SLURP-1 (SEQ ID NO:1), ингибитора протеасом бортезомиба, цитостатика доксорубицина и комбинаций препаратов на рост объемных опухолей из клеток эпидермальной карциномы линии А431. Объемные опухоли инкубируют или с рекомбинантным аналогом SLURP-1 (1 нМ), или с ингибитором протеасом бортезомибом (10 нМ), или с цитостатиком доксорубицином (1 мкМ) по-отдельности, или в комбинации в течение 48 часов. Жизнеспособность опухолевых клеток определяют с помощью МТТ-теста. Данные показаны как среднее ± S.E.M. (n = 6).

Изобретение иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1. Изобретение раскрывается на примере клеток карциномы легкого A549. Клетки культивируются в питательной среде DMEM c добавлением 10% (по объему) эмбриональной бычьей сыворотки и 2мМ глутамина и 25 мМ HEPES. Клетки культивируют в культуральных флаконах объемом 75 мл и пересаживают минимум 2 раза в неделю. Клетки высевают в лунки культурального 96-луночного планшета (5000 клеток на лунку), через сутки добавляют или 1 мкМ рекомбинантного аналога SLURP-1 (SEQ ID NO:1), или бортезомиб (10 нМ или 1 мкМ), или SLURP-1 (1 мкМ) в комбинации с бортезомибом (10 нМ). После этого клетки A549 инкубируют с препаратами в течение 24 часов. Затем определяют число жизнеспособных клеток А549 при помощи теста на активность митохондриальной сукцинатдегидрогеназы (МТТ-тест). Для этого, к клеткам добавляют субстрат митохондриальной сукцинатдегидрогеназы МТТ (конечная концентрация составляет 0,25 мг/мл) и инкубируют в течение 2 часов. МТТ при этом восстанавливается митохондриальной сукцинатдегидрогеназой до формазана. После инкубации нерастворимые кристаллы формазана растворяют в изопропаноле с добавлением 75 мМ соляной кислоты в течение 4 часов при периодическом помешивании и затем определяют поглощение в лунках при 540 нМ с выравниванием на фон при 655 нМ.

Пример показывает, что рекомбинантный аналог SLURP-1 (SEQ ID NO:1) в концентрации 1 мкМ ингибирует рост клеток карциномы легкого А549 до 68,7 ± 1,5 % от контроля при 24-часовой инкубации (фиг. 1). Бортезомиб в концентрации 10 нМ или 1 мкМ ингибирует рост клеток карциномы легкого А549 до 82,5 ± 1,8 %и 29,8 ± 1,5 %, соответственно (фиг. 1). Сочетанное применение 1 мкМ SLURP-1 и 10 нМ бортезомиба ингибирует рост клеток карциномы легкого А549 до 35,0 ± 2,2 % (фиг. 1). Таким образом, совместное применение бортезомиба с рекомбинантным аналогом SLURP-1 (SEQ ID NO:1) эффективнее тормозит рост клеток карциномы легкого А549. При этом действующая концентрация бортезомиба уменьшается в 100 раз.

Пример 2. Изобретение раскрывается на примере объемных опухолей, полученных из клеток эпидермальной карциномы A431. Клетки культивируются в питательной среде DMEM c добавлением 10% (по объему) эмбриональной бычьей сыворотки и 2мМ глутамина и 25 мМ HEPES. Клетки А431 культивируют в культуральных флаконах объемом 75 мл и пересаживают минимум 2 раза в неделю. Объемные опухоли получают при культивировании клеток (15000 клеток на лунку культурального планшета) на полигидроксиметилакрилатной матрице в течение 48 часов. Затем, к объемным опухолям добавляют или 1 нМ рекомбинантного аналога SLURP-1 (SEQ ID NO:1), или 10 нМ ингибитора протеасом бортезомиба, или 1 мкМ цитостатика доксорубицина, или комбинацию SLURP-1 с бортезомибом, или комбинацию SLURP-1 с доксорубицином, в тех же концентрациях. Объемные опухоли из клеток A431 инкубируют с препаратами в течение 48 часов с заменой среды каждые сутки. Жизнеспособность клеток опухоли определяют с помощью МТТ-теста.

Пример показывает, что рекомбинантный аналог SLURP-1 в концентрации 1 нМ, бортезомиб в концентрации 10 нМ и доксорубицин в концентрации 1 мкМ по-отдельности ингибируют рост клеток эпидермальной карциномы А431 до 80,0 ± 2,0 %; 83,6 ± 6,25 % и 84,4 ± 6,8 % от контроля при 48-часовой инкубации, соответственно (фиг. 2). Совместное применение бортезомиба или доксорубицина с рекомбинантным аналогом SLURP-1 эффективнее тормозит рост объемных опухолей из клеток эпидермальной карциномы А431 со снижением числа жизнеспособных клеток до 71,2 ± 7,3 % и 72,7 ± 4,2 % от контроля при 48-часовой инкубации, соответственно (фиг. 2).

--->

Перечень последовательностей

SEQ ID NO:1

Met Leu Lys Cys Tyr Thr Cys Lys Glu Pro Met Thr Ser Ala Ser Cys

1 5 10 15

Arg Thr Ile Thr Arg Cys Lys Pro Glu Asp Thr Ala Cys Met Thr Thr

20 25 30

Leu Val Thr Val Glu Ala Glu Tyr Pro Phe Asn Gln Ser Pro Val Val

35 40 45

Thr Arg Ser Cys Ser Ser Ser Cys Val Ala Thr Asp Pro Asp Ser Ile

50 55 60

Gly Ala Ala His Leu Ile Phe Cys Cys Phe Arg Asp Leu Cys Asn Ser

65 70 75 80

Glu Leu

<---

Похожие патенты RU2751132C1

название год авторы номер документа
ПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ АКТИВНОСТЬЮ БЕЛКА SLURP-1 ЧЕЛОВЕКА, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА КАРЦИНОМ И ГЛИОМ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА КАРЦИНОМ И ГЛИОМ, И СПОСОБ ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА КАРЦИНОМ И ГЛИОМ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ УКАЗАННОГО ПЕПТИДА 2022
  • Люкманова Екатерина Назымовна
  • Шенкарев Захар Олегович
  • Шулепко Михаил Анатольевич
  • Бычков Максим Леонидович
  • Кульбацкий Дмитрий Сергеевич
  • Кирпичников Михаил Петрович
RU2792364C1
ПРИМЕНЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО АНАЛОГА ВОДОРАСТВОРИМОГО ДОМЕНА БЕЛКА LYNX1 ДЛЯ ТОРМОЖЕНИЯ РОСТА КЛЕТОК КАРЦИНОМ 2019
  • Кирпичников Михаил Петрович
  • Люкманова Екатерина Назымовна
  • Шенкарев Захар Олегович
  • Бычков Максим Леонидович
RU2721129C1
Иммуноцитокин для активации IL-10Rα рецептора человека и его применение 2020
  • Кононов Алексей Владимирович
  • Евдокимовская Юлия Викторовна
  • Смирнова Яна Андреевна
  • Евдокимов Станислав Рудольфович
  • Колосова Елена Сергеевна
  • Агеев Сергей Андреевич
  • Цымпилов Владимир Сергеевич
  • Соловьев Валерий Владимирович
  • Яковлев Павел Андреевич
  • Морозов Дмитрий Валентинович
RU2810750C2
СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ РАКА, ВКЛЮЧАЮЩИЕ СВЯЗЫВАЮЩИЕ TIGIT АГЕНТЫ 2017
  • Дюпон, Джейкоб
  • Пармар, Хема
RU2765410C2
АНТИТЕЛА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКОВЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ПРИ КОТОРЫХ ЭКСПРЕССИРУЕТСЯ КЛАУДИН 6 2012
  • Сахин Угур
  • Тюречи Эзлем
  • Козловски Михаель
  • Вальтер Корден
  • Вёль Штефан
  • Кройцберг Мария
  • Хубнер Бернд
  • Эрдельян Михаэль
  • Вайхель Михаэль
RU2816850C2
АНТИТЕЛА, СПЕЦИФИЧНЫЕ В ОТНОШЕНИИ НЕКТИНА-2 ЧЕЛОВЕКА 2020
  • Мандельбойм, Офер
  • Цукерман, Пинхас
  • Йонич, Стипан
  • Ленац Ровиш, Тихана
  • Кучан Брлич, Паола
RU2820275C2
АНТИТЕЛА, СПЕЦИФИЧНЫЕ К CD47 и PD-L1 2020
  • Соловьев Кирилл Владимирович
  • Улитин Андрей Борисович
  • Неманкин Тимофей Александрович
  • Соловьев Валерий Владимирович
  • Морозов Дмитрий Валентинович
RU2779652C2
ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ АДРЕСНОГО ДЕЙСТВИЯ ДЛЯ ТЕРАПИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ 2019
  • Никольская Елена Дмитриевна
  • Яббаров Никита Григорьевич
  • Сокол Мария Борисовна
  • Жунина Ольга Александровна
  • Фаустова Мария Романовна
  • Заболотский Артур Игоревич
  • Фомичева Маргарита Викторовна
  • Моллаев Мурад Давлетович
  • Помазкова Татьяна Анатольевна
  • Сапелкин Михаил Александрович
RU2727924C1
КОМБИНИРОВАННАЯ ТЕРАПИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АНТИТЕЛ ПРОТИВ КЛАУДИНА 18.2 ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА 2014
  • Сахин, Угур
  • Тюречи, Озлем
  • Митнахт-Краус, Рита
  • Вёль, Штефан
  • Якобс, Штефан
  • Хайнц, Корнелиа
RU2792932C2
РЕЖИМЫ ДОЗИРОВАНИЯ АНТИТЕЛ АНТИ-LAG-3 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ 2018
  • Стейн, Эндрю Марк
  • Фогль, Флориан Доминик
  • Селлами, Далила
RU2801208C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 751 132 C1

Реферат патента 2021 года Применение рекомбинантного аналога белка человека SLURP-1 совместно с цитостатиками или препаратами ингибиторами протеасом для торможения роста карцином

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к сочетанному применению препаратов из групп цитостатиков или ингибиторов протеасом с рекомбинантным аналогом белка SLURP-1 с SEQ ID NO:1 для торможения роста карцином, и может быть использовано в медицине. Данный способ позволяет увеличить эффективность действия препаратов из групп цитостатиков и ингибиторов протеасом, а также понизить их концентрации, необходимые для подавления роста опухоли. 2 н.п. ф-лы, 2 ил., 2 пр.

Формула изобретения RU 2 751 132 C1

1. Применение рекомбинантного аналога белка человека SLURP-1, имеющего последовательность SEQ ID NO:1, совместно с цитостатиками или препаратами ингибиторами протеасом для торможения роста карцином.

2. Способ торможения роста клеток карцином, характеризующийся тем, что клетки карциномы инкубируют от 24 до 48 часов с препаратом цитостатиком или с ингибитором протеасом совместно с рекомбинантным аналогом белка человека SLURP-1, имеющего последовательность SEQ ID NO:1, в концентрациях от 1 нМ до 10 мкМ.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2021 года RU2751132C1

LYUKMANOVA E.N., BYCHKOV M.L., SHARONOV G.V, EFREMENKO A.V
et al
Печь для непрерывного получения сернистого натрия 1921
  • Настюков А.М.
  • Настюков К.И.
SU1A1
Способ получения цианистых соединений 1924
  • Климов Б.К.
SU2018A1
INGLE J.N., PFEIFLE D.M., GREEN S.J., KVOLS L.K
et al
"Randomized clinical

RU 2 751 132 C1

Авторы

Люкманова Екатерина Назымовна

Шенкарев Захар Олегович

Шулепко Михаил Анатольевич

Бычков Максим Леонидович

Кирпичников Михаил Петрович

Даты

2021-07-08Публикация

2020-05-29Подача