Питательная среда для размножения на стадии пролиферации крыжовника сорта "Розовый-2" Российский патент 2021 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к области биотехнологии и сельского хозяйства, а именно касается питательных сред различного минерального и органического состава, предназначенных для культивирования ягодных и плодовых культур, которые непосредственно могут быть использованы в процессе микроклонирования крыжовника сорта «Розовый-2» на стадии его пролиферации.

Описаны питательные среды различного минерального и органического состава, предназначенные для культивирования ягодных и плодовых растений [Murashige Т., Skoog F.A revised for rapid growth and bioassays with tobako tissue culture // Physiol. Plantarum. 1962. V. 15. №3. P. 473-497; RU 2063682, A01H 4/00, 1996; Hunkova С.М., Libiakova G., Fejer J., Vugovic T. //Genetika.2018.V. 50. №1, P. 351-356].

Вместе с тем также известно, что даже для каждого сорта в рамках одного вида, исходя из его биологических требований, необходимо подбирать определенный питательный состав [Hedtrich С.М., Feucht W. Die Bedeutung der Meristem-Vermehrung-der derzeitige Stand beim Beeren-Obst//Obstbau (Bonn). 1981. V. 6. №3. P. 82-86]. Однако среди выявленных аналогов не выявлены питательные среды, позволяющие именно для крыжовника сорта Розовый-2 на стадии пролиферации при микроразмножении получить высокие коэффициенты размножения и длину побегов.

Аналогом предлагаемой в заявке питательной среды является известная питательная среда для размножения различных ягодных и плодовых культур, представляющая собой модифицированный сиреневой кислотой состав Мурасиге-Скуга, включающий макро- и микро-элементы в виде минеральных солей, а также смесь сернокислого железа и динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (Na₂ЭДТА), позиционируемые как комплекс FеЭДТА, и специальные органические добавки для интенсификации микроразмножения [RU 2063682, А01Н 4/00, 1996]. Данная питательная среда содержит аммоний азотнокислый, калий азотнокислый, кальций азотнокислый, магний сернокислый, марганец сернокислый, калий фосфорнокислый, железо сернокислое, (Na₂ЭДТА), борную кислоту, цинк сернокислый, калий йодистый, натрий молибденовокислый, медь сернокислую, кобальт хлористый, сиреневую кислоту, миоинозит, тиамин гидрохлорид, пиродоксин гидрохлорид, никотиновую кислоту, аскорбиновую кислоту, 6-бензиламинопурин, сахарозу, агар-агар, остальное - вода.

Данная питательная смесь при рН 5,5-5,7 нагревается до растворения агара, разливается по сосудам и автоклавируются при давлении 0,9 атм. при температуре 119-121°С, после чего осуществляется высаживание экспоната.

Наиболее близким аналогом заявляемой питательной среды, выбранным в качестве прототипа, является питательная среда для размножения различных ягодных и плодовых культур, описанная в протоколе Кворина-Лепуавра [Quoirin М., Lepoivre P.// Acta Horticulture. 1977. V. 78. Р. 437-442]. Данная среда содержит макро- и микро-элементы, а именно: аммоний азотнокислый, калий азотнокислый, магний сернокислый, кальций азотнокислый, калий фосфорнокислый, железо(П) сернокислое и (Na₂ЭДТА), позиционируемые, как уже было замечено выше, как железный комплекс ЭДТА, цинк сернокислый, калий йодистый, натрий молибденовокислый, медь сернокислую, кобальт хлористый, борную кислоту, воду. К данной минеральной составляющей питательной среды добавляются общепринятые органические препараты, активирующие микроразмножение, включающие миоинозит, тиамин гидрохлорид, пиродоксин гидрохлорид, никотиновую кислоту, аскорбиновую кислоту, 6-бензиламинопурин, сахарозу, агар-агар. Составы, описанные в протоколе Кворина-Лепуавра, были дополнительно проверены на эффективность выращивания крыжовника сорта «Розовый-2». При использовании составов, содержащих этилендиаминтетраацетат натрия Na₂ЭДТА и железо сернокислое, а также другие указанные выше компоненты в качестве питательной среды для размножения крыжовника сорта «Розовый-2», были получены показатели, характеризующие эффективность этого состава при его использовании, а именно выявлено, что коэффициент размножения составляет 1,1, среднее число побегов (штук)-1,1, средняя длина побегов (см)-1,2.

Как показали дополнительные исследования питательной среды-прототипа, в процессе микроразмножения на этой среде в большинстве случаев не удается достичь высоких коэффициентов размножения и длины образуемых побегов крыжовника сорта «Розовый-2», поскольку у растений часто наблюдается железный хлороз и некроз тканей. При развитии микрорастений в стерильных условиях при использовании указанной выше питательной среды наблюдается снижение общего коэффициента размножения и производительности процесса, причиной чего, по всей вероятности, является отсутствие в питательной среде уже готового, хорошо усваиваемого комплекса железа (Ш).

Для повышения эффективности питательной среды, применяемой для выращивания крыжовника сорта «Розовый-2», а именно увеличения коэффициента его размножения и длины побегов, предлагается новый состав питательной среды для размножения на стадии пролиферации крыжовника сорта «Розовый-2», содержащий следующие компоненты (мг/л): аммоний азотнокислый 200-360, калий азотнокислый 750-1550, кальций азотнокислый 650-800, магний сернокислый 120-250, калий фосфорнокислый 300-370, борная кислота 6,0-6,4, цинк сернокислый 8,0-9,2, калий йодистый 0,075-0,085, натрий молибденовокислый 0,2-0,3, медь сернокислая 0,02-0,03: кобальт хлористый 0,02-0,03, железный(П) комплекс гидроксиэтилидендифосфоновой кислоты 15,2-60,8, миоинозит 100, тиамин гидрохлорид 0,5, пиродоксин гидрохлорид 0,5, никотинамид 0,5; глицин 1000, 6-бензиламинопурин 0,3, сахароза 30000, агар 6000, остальное вода до 1 л.

Сопоставительный анализ предлагаемого состава с составом-прототипом показывает, что заявляемая питательная среда, как и известная, выбранная в качестве прототипа, содержит макро- и микро-элементы, регуляторы роста и другие органические добавки, однако она отличается от известной тем, что в качестве комплекса железа(П) в ней используется комплекс гидроксиэтилидендифосфоновой кислоты- Fe(П)HEDP, в отличие от прототипа, где используется железо(П) сернокислое и этилендиаминтетраацетат натрия, позиционируемый как железный комплекс EDTA.

Дополнительные исследования питательных растворов, в которых вместо предлагаемого комплекса железа(П) с гидроксиэтилидендифосфоновой кислотой - Fe(П)HEDP содержатся комплексы железа(Ш) с аминоуксусными кислотами, такими как этилендиаминтетрауксусная кислота(ЕDТА), диэтилентриаминпентауксусная кислота (DTPA), этилендиаминди(2-гидроксифенил)уксусная кислота (EDHHA)], показали, что в интервале предлагаемых концентраций компонентов в составах высокая эффективность получаемой питательной среды не достигается. Кроме того, известно, что комплексы железа(П) с карбоксилсодержащими комплексонами не образуются, поскольку в процессе комплексообразования при взаимодействии солей железа(П) с EDTA, DTPA, EDDH железо(П) окисляется в железо(Ш).

Процесс микроклонирования крыжовника сорта «Розовый-2» на стадии его пролиферации с использованием предлагаемой питательной среды проводится по следующей схеме: в питательную среду вносятся компоненты в подобранных оптимальных концентрациях (табл.1, среда 2-4), добавляется вода, и объем раствора доводится до 1 л, затем устанавливается рН 5,5-5,7 и проводится нагревание до полного растворения агара. После этого питательная среда разливается по культуральным сосудам и автоклавируется при давлении 0,1 мПа (при температуре 119-121°С) в течение 20-25 мин. После этого в каждый сосуд высаживается по 5 микрочеренков длиной 2-3 узла. Культуры инкубируются в световой комнате при интенсивности освещения 2500 люкс, 16-ти часовом фотопериоде и температуре 20-22°С.

Ниже предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими примерами и таблицами: Таблица 1 «Концентрация компонентов питательных сред», Таблица 2 «Влияние состава питательной среды на микроразмножение крыжовника сорта Розовый-2 на стадии пролиферации».

Пример 1. В питательную среду вносят компоненты в указанных концентрациях (табл. 1, среда 2). Объем раствора доводят до 1 л, устанавливают рН 5,5-5,7 и при нагревании добиваются растворения агара. Питательную среду разливают по культуральным сосудам и автоклавируют при давлении 0,1 мПа (при температуре 119-121 С) в течение 20 мин. После этого в каждый сосуд высаживают по 5 микрочеренков длиной 2-3 узла. Культуры инкубируют в световой комнате при интенсивности освещения 2500 люкс, 16-ти часовом фотопериоде и температуре 20-22°С. Морфометрические показатели микропобегов рассматривали на 60-тый день субкультивирования.

Использование разработанной питательной среды обеспечивает увеличение коэффициента размножения крыжовника сорта «Розовый-2» в 1,82 раза по сравнению со средой Кворина-Лепуавра, что на стадии пролиферации в первую очередь определяет эффективность питательной среды (табл. 2).

Пример 2. Осуществляют аналогично примеру 1. Концентрации компонентов указаны в табл. 1. (Среда 3). Результаты размножения на предлагаемой среде представлены в табл. 2. Предложенная среда обеспечивает увеличение коэффициента размножения в 1,36 раза и средней величины побегов в 1,18 раз по сравнению со средой Кворина-Лепуавра.

Пример 3. Осуществляют аналогично примеру 1. Концентрация компонентов указана в табл. 1 (Среда 4). Результаты размножения на разных средах представлены в табл. 2. На разработанной среде по сравнению со средой Кворина-Лепуавра наблюдается увеличение коэффициента размножения в среднем в 1,64 раза и средней длины побегов в 1,18 раз.

Как показали исследования, при более высоких концентрациях питательных веществ (среда 5) и более низких (среда 1) по сравнению с предложенным диапазоном концентраций рост эксплантов ухудшается и, следовательно, подобные питательные растворы менее эффективны (табл. 2).

Таким образом, применение предлагаемой питательной среды позволяет получить новый эффект: увеличить коэффициент размножения и длину побегов по сравнению с известной средой, обеспечивая увеличение коэффициента размножения крыжовника сорта Розовый-2 в 1,36-1,82 раза, что на стадии пролиферации является основным показателем эффективности действия предлагаемой питательной среды.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предлагается питательная среда, которая содержит следующие компоненты (мг/л): аммоний азотнокислый 200-360, калий азотнокислый 750-1550, кальций азотнокислый 650-800, магний сернокислый 120-250, калий фосфорнокислый 300-370, борная кислота 6,0-6,4, цинк сернокислый 8,0-9,2, калий йодистый 0,075-0,085, натрий молибденовокислый 0,2-0,3, медь сернокислая 0,02-0,03: кобальт хлористый 0,02-0,03, железный(П) комплекс гидроксиэтилидендифосфоновой кислоты 15,2-60,8, миоинозит 100, тиамин гидрохлорид 0,5, пиродоксин гидрохлорид 0,5, никотинамид 0,5; глицин 1000, 6-бензиламинопурин 0,3, сахароза 30000, агар 6000, остальное вода до 1 л. Питательная среда обеспечивает увеличение коэффициента размножения крыжовника сорта «Розовый-2» в 1,36 - 1,82 раза по сравнению со средой Кворина-Лепуавра, при этом в 1,3-2,0 раза увеличивается и средняя длина побегов. 2 табл., 3 пр.

Питательная среда для размножения на стадии пролиферации крыжовника сорта «Розовый-2», содержащая аммоний азотнокислый, калий азотнокислый, магний сернокислый, калий фосфорнокислый, комплексное соединение железа(П), борную кислоту, цинк сернокислый, калий йодистый, натрий молибденовокислый, медь сернокислую, кобальт хлористый, кальций азотнокислый, органическую составляющую и воду, отличающаяся тем, что в качестве комплексного соединения железа(П) питательная среда содержит железный(П) комплекс гидроксиэтилидендифосфоновой кислоты Fe(П)HEDP при следующем весовом соотношении компонентов, мг/л:

Аммоний азотнокислый 200-360 Калий азотнокислый 750-1550 Кальций азотнокислый 650-800 Магний сернокислый 120-250 Калий фосфорнокислый 300-370 Борная кислота 6,0-6,4 Цинк сернокислый 8,0-9,2 Калий йодистый 0,075-0,085 Натрий молибденовокислый 0,2-0,3 Медь сернокислая 0,02-0,03 Кобальт хлористый 0,02-0,03 Железный(П) комплекс гидроксиэтилидендифосфоновой кислоты 15,2-60,8 Миоинозит 100 Тиамин гидрохлорид 0,5 Пиридоксин гидрохлорид 0,5 Никотинамид 0,5 Глицин 1000 6-Бензиламинопурин 0,3 Сахароза 30000 Агар 6000 Вода остальное до 1 л