Способ определения концентрации дидецилдиметиламмония хлорида и полигексаметиленбигуанидин гидрохлорида в фекальных стоках транспортных средств Российский патент 2021 года по МПК C12Q1/06 

Изобретение относится к области биохимии, точнее, к способам измерения, использующим микроорганизмы для количественного определения дезинфицирующих веществ (далее - ДВ) в сточных водах неопределенного состава, в первую очередь, в фекальных стоках транспортных средств: самолетов, пассажирских вагонов, автобусов и судов.

Промывочная жидкость туалетов транспортных средств включает в качестве ДВ дидецилдиметиламмония хлорид (далее - D4 - общепринятое сокращение) и полигексаметиленбигуанидин гидрохлорид (далее - ПГМГ-ГХ - общепринятое сокращение). Кроме того, она содержит целый ряд других химически активных веществ, таких как отдушки и красители, поверхностно-активные вещества.

Фекальные стоки туалетов транспортных средств аккумулируются в аэропортах, на станциях и в портах. Они подлежат обезвреживанию методами биологической очистки. Особенностью этого вида стоков является количественное превышение промывочной жидкости над собственно фекалиями всего лишь в 2…10 раз, тогда как в канализационных стоках городских поселений степень разведения фекалий во многие десятки раз выше, а содержание химических, в том числе дезинфицирующих, веществ в сотни раз ниже. Содержание ДВ и поверхностно-активных веществ в неразбавленных фекальных стоках транспортных средств настолько велико, что никакие бактериальные культуры, обычно используемые при очистке сточных вод, выжить и, тем более, активно размножаться, в них не могут. Поэтому нейтрализация таких стоков является серьезной проблемой.

Решение этой проблемы состоит в разбавлении фекальных стоков водой для снижения концентрации ДВ до уровня, при котором их биологическое обезвреживание становится возможным. Однако это многократно увеличивает объем стоков и, соответственно, плату службам очистных сооружений, их принимающих. Для разрешения возникающего противоречия разбавление следует проводить ровно до приемлемой для служб очистных сооружений концентрации ДВ, но не более. Отсюда возникает новая проблема: определение концентрации ДВ в разбавленных стоках.

Решение этой проблемы затруднено не только химически сложным составом фекальных стоков транспортных средств, но также и тем, что используемые в промывочной жидкости D4 и ПГМГ-ГХ весьма эффективны как бактерицидные средства и потому их концентрация в стоках очень невелика, практически близка к пределам чувствительности химико-аналитических методов.

Известен ряд способов определения D4 и ПГМГ-ГХ методами аналитической химии [CN 101943690, JP 2002243719, JP 2002243719, RU 2252413, RU 2336522, RU 2479839, UA 83673]. Однако для количественного определения содержания этих веществ в фекальных стоках транспортных средств известные способы непригодны из-за присутствия в стоках целого ряда других химически активных веществ, искажающих результаты измерений, либо делающих их просто невозможными.

Известен также способ количественного определения полигексаметиленгуанидина методом инверсионной вольтамперометрии, который, как указано в описании патента, может быть использован и для контроля сточных вод [RU 2381501]. Недостаток этого способа тот же, что и у вышеописанных аналогов.

Известны также способы определения производных гуанидина, основанные на фотоэлектроколориметрировании [RU 2487346] или высокоскоростной жидкостной хроматографии [CN 105021721, JP S578447] раствора анализируемой пробы. Оба способа очень чувствительны к присутствию в растворе других химических веществ и потому для количественного определения содержания производных гуанидина в фекальных стоках непригодны.

Наиболее подходящим для решения вышеуказанной проблемы являются способы, использующие микроорганизмы.

Известен способ определения токсичности среды, при котором определяют показатели роста тест-культур (микромицетов) в контроле и опыте, вычисляют степень угнетения роста тест-культур в опыте по отношению к контролю и сравнивают полученные данные с пятью условно установленными классами опасности среды [RU 2570637]. Близким к этому способу является способ определения общей токсичности отходов, при котором также сравнивают показатели роста тест-культур (рода Bacillus), известных по чувствительности к предположительно содержащимся в исследуемой среде токсикантам, в контроле и опыте, вычисляют интегральный критерий и сравнивают с критериями токсичности [RU 2202619].

Общим для этих двух способов недостатком является то, что они хороши для определения только общей токсичности исследуемой среды, безотносительно к тому, какими именно веществами и в какой концентрации эта токсичность вызвана.

Известен способ определения бактерицидной и бактериостатической концентрации ДВ, включающий создание ряда испытуемых образцов путем многократных последовательных разведений ДВ в стерильной жидкости, приведение испытуемых образцов в контакт с тест-культурой, культивирование в течение испытательного времени, и оценку концентрации ДВ по параметрам разбавления, в котором присутствует бактериальный рост [UA 89484]. Способ предназначен для оценки токсичности ДВ, использует разведения известного количества ДВ в стерильной жидкости и потому непригоден для определения неизвестной концентрации ДВ в фекальных стоках транспортных средств, содержащих разнообразные химические и органические вещества.

Известен способ обнаружения противомикробных веществ в испытуемом образце, при котором вносят тест-культуру, являющуюся штаммом Bacillus или Streptococcus, и, по меньшей мере, два окислительно-восстановительных индикатора в агаровую среду, после чего приводят испытуемый образец в контакт с агаровой средой и оценивают содержание противомикробных веществ сравнением роста тест-культуры с контрольными образцами [RU 94045954 A1]. Недостаток известного способа состоит в то, что он лишь определяет, есть ли в испытуемом образце противомикробные вещества или нет, без количественной оценки.

Известен способ определения токсичности проб, согласно которому тест-культуры Pseudomonas yamanorum VKM B-3033D инкубируют в определенных условиях в присутствии тестируемых проб и в их отсутствие, спустя определенное время измеряют показатели, характеризующие степень активирования или ингибирования тестовых образцов (интенсивность света, оптическую плотность и интенсивность фотофлуоресценции) и вычисляют эту степень по специально разработанной формуле [RU 2688745]. Недостаток известного способа состоит в то, что он определяет лишь степень токсичности тестируемых проб, безотносительно к тому, какими веществами и в какой концентрации эта токсичность вызвана.

Наиболее близким к предложенному по технической сущности и достигаемому результату является способ определения ДВ в жидком образце, при котором этот образец приводят в контакт с тест-культурой, выбираемой из термофильных штаммов Bacillus и Streptococcus, контрольные образцы тест-культуры подвергают воздействию известного количества ДВ, сравнивают, спустя определенный срок, рост испытуемого и контрольных образцов тест-микроорганизмов [RU 96119987 A].

Недостаток известного способа состоит в низкой точности определения количественного содержания антибактериального соединения, поскольку он не учитывает наличия в исследуемом образце других, не антибактериальных, химических соединений, способных оказать влияние на рост/ингибирование бактериальных колоний. Кроме того, термофильные штаммы Bacillus и Streptococcus обладают огромным разнообразием и включают штаммы, как с повышенной, так и с пониженной чувствительностью к дидецилдиметиламмония хлориду и полигексаметиленбигуанидин гидрохлориду.

Задачей настоящего изобретения является повышение точности способа количественного определения содержания D4 и ПГМГ-ГХ в фекальных стоках сложного состава, продуцируемых в туалетах транспортных средств.

Технический результат от использования предложенного способа состоит в повышении точности определения содержания D4 и ПГМГ-ГХ в фекальных стоках сложного состава, продуцируемых в туалетах транспортных средств.

Указанный технический результат достигается тем, что из пробы фекального стока приготавливают ряд испытуемых образцов с различной степенью разведения пробы, приготавливают тестовую жидкость, наиболее близкую по составу к испытуемым стокам и содержащую заданную концентрацию D4 и ПГМГ-ГХ, и которая представляет собой человеческие фекалии в смеси с водой в пропорции 1:(2-10) с добавлением поверхностно-активного вещества, в качестве которого используют оксиэтилированные моноалкилфенолы, и пропанола-2, приготавливают ряд тестовых образцов из последовательных разведений тестовой жидкости, приводят испытуемые и тестовые образцы в контакт с тест-культурой, далее образцы инкубируют, измеряют степень подавления роста тест-культуры, где испытуемый и тестовые образцы с одинаковой степенью подавления роста считают содержащими равные концентрации дидецилдиметиламмония хлорида и полигексаметиленбигуанидин гидрохлорида, после чего по известной концентрации дидецилдиметиламмония хлорида и полигексаметиленбигуанидин гидрохлорида в тестовом образце и известной степени разведения испытуемого образца вычисляют концентрацию дидецилдиметиламмония хлорида и полигексаметиленбигуанидин гидрохлорида в пробе фекального стока и, при необходимости, уточняют результат дробным разведением тестовой жидкости вблизи первоначально установленного разведения с одинаковой степенью подавления роста, а также проведением серии повторных испытаний вблизи этой точки.

Кроме того, в качестве поверхностно-активного вещества используют неонол, выбранный из группы: Неонол АФ 9-9, Неонол АФ 9-10, Неонол АФБ-10, Неонол АФ 9-12, Неонол АФБ-12 в количестве (0,02...0,1) от общей массы тестовой жидкости нулевого разведения.

Кроме того, в качестве тест-культуры используют штаммы бактерий, выбранные из ряда: Paenalcaligenes sp., Staphylococcus pasteuri, Enterococcus faecium, Micrococcus endophyticus, Enterococcus casseliflavus, Bacillus subtilis, Alcaligenes aquatilis.

Благодаря созданию ряда испытуемых и ряда тестовых образцов с различной степенью разведения исходного материала существенно повышается точность определения содержания D4 и ПГМГ-ГХ, поскольку разведения можно осуществлять как кратные, так и дробные.

Благодаря использованию тестовой жидкости, наиболее близкой по составу к испытуемым стокам и содержащую заданную концентрацию указанных веществ, существенно повышается точность определения содержания D4 и ПГМГ-ГХ, поскольку тестовые культуры оказываются в среде, практически идентичной среде исследуемого стока.

Благодаря тому, что в качестве тестовой жидкости используют человеческие фекалии, в смеси с водой в пропорции 1:(2…10) с добавлением поверхностно-активного вещества повышается точность определения содержания D4 и ПГМГ-ГХ, поскольку тестовые культуры оказываются в среде, практически идентичной среде исследуемого стока.

Благодаря близкому совпадению химических составов пробы фекального стока и тестовой жидкости повышается точность определения, поскольку результаты не зависят от мелких отклонений от состава и условий выращивания тест-культур, одинаковых для испытуемых и тестовых образцов.

Использование в качестве поверхностно-активного вещества оксиэтилированных моноалкилфенолов, преимущественно выбранных из группы Неонол АФ 9-9, Неонол АФ 9-10, Неонол АФБ-10, Неонол АФ 9-12, Неонол АФБ-12 в количестве (0,02…0,1) от общей массы тестовой жидкости нулевого разведения, повышает точность определения содержания D4 и ПГМГ-ГХ, поскольку в наибольшей степени приближает состав тестовой жидкости и, следовательно, условия роста тестовой культуры к составу и условиям исследуемого стока.

Использование в качестве в качестве тест-культуры штаммов бактерий, выбранных из ряда: Paenalcaligenes sp., Staphylococcus pasteuri, Enterococcus faecium, Micrococcus endophyticus, Enterococcus casseliflavus, Bacillus subtilis, Alcaligenes aquatilis способствует повышению точности определения содержания D4 и ПГМГ-ГХ, поскольку эти штаммы, обладая чувствительностью к D4 и ПГМГ-ГХ, обеспечивают в то же время, хорошую стабильность результатов от опыта к опыту.

Благодаря тому, что результат определения уточняют дробным разведением тестовой жидкости вблизи первоначально установленного разведения с близкими с испытуемыми образцами реакциями тест-культуры, достигается точность определения концентрации, достаточная для расчета необходимого разведения фекальных стоков.

Предложенный способ осуществляется следующим образом.

Приготавливают ряд одинаковых образцов тест-культуры путем посева в чашку Петри на питательный агар микробной суспензии определенной плотности.

Приготавливают тестовую жидкость, по составу почти подобную фекальным стокам транспортных средств.

Приготавливают ряд тестовых образцов из разведений тестовой жидкости (например, от 1:10 до 1:600) стерильной водой.

Приготавливают ряд испытуемых образцов из пробы фекального стока путем его разведений различной степени стерильной водой.

Приводят в контакт образцы тест-культуры с испытуемыми и тестовыми образцами.

Инкубируют чашки в термостате при определенной температуре в течение определенного времени, после чего учитывают результат, измеряя степень подавления роста тест-культуры.

Испытуемый и контрольный образцы с одинаковой степенью подавления роста считают содержащими равные концентрации ДВ. Степени разведения испытуемого и тестовых образцов могут оказаться при этом разными.

По известной концентрации ДВ в тестовом образце и известной степени разведения испытуемого образца вычисляют концентрацию ДВ в пробе фекального стока.

При необходимости, уточняют результат дробным разведением тестовой жидкости вблизи первоначально установленного разведения с одинаковой степенью подавления роста, а также проведением серии повторных испытаний вблизи этой точки.

Ниже, в качестве примера, описан более подробно один из возможных вариантов процесса осуществления предложенного способа.

1. Приготавливают ряд одинаковых образцов тест-культуры путем посева в чашку Петри на питательный агар микробной суспензии определенной плотности.

2. Предварительные исследования показали, что состав жидкостей для промывки унитазов приблизительно одинаков, независимо от страны, где они были изготовлены.

Более того, во всех них используется дезинфицирующее средство, выпускаемое Швецией под торговым обозначением "Arquad 2.10-50", имеющее полным аналогом швейцарское средство "Bardac-22". Они представляют собой водный раствор D4 и 2-Пропанола с концентрацией 50 г/л и 20 г/л соответственно.

В отечественной транспортной технике для промывки унитазов употребляется жидкость под торговым обозначением «Дезодорирующее средство «Латрина», представляющая собой водный раствор "Arquad 2.10-50" (100 г/л), ПГМГ-ГХ (7 г/л), выпускаемого отечественной промышленностью под торговым обозначением «Полисепт», ПГМГ-ГХ (7 г/л), поверхностно-активного вещества представляющего собой техническую смесь полиэтиленгликолевых эфиров моноалкилфенолов, известного под торговым обозначением «Неонол АФ 9-10» (50 г/л), а также отдушки и красителя в небольших концентрациях.

Поскольку составы промывочных жидкостей примерно одинаковы во всех странах, а источники сырья для их изготовления одни и те же, результаты описываемого процесса практически не зависят от того, были ли источником фекальных стоков отечественные или зарубежные транспортные средства.

Поэтому для приготовления тестового раствора вначале приготовляют тестовый аналог жидкости для промывки унитазов в виде водного раствора следующего состава:

- Arquad 2.10-50 (Арквад) - 100 г/л (содержание D4 50/г/л);

- Полисепт (ПГМГ-ГХ) - 7 г/л:

- Неонол АФ 9-10- 50 г/л.

3. В двух…десяти частях приготовленного тестового аналога жидкости для промывки унитазов разводят 1 часть человеческих фекалий, включающих кал и мочу. Получаемая тестовая жидкость имеет концентрацию ДВ приблизительно такую же, что и фекальные стоки. Указанные пропорции установлены экспериментально с учетом содержания веществ в промывочных жидкостях и обеспечивают быструю сходимость процесса определения содержания D4 и ПГМГ-ГХ.

4. Готовят ряд испытуемых образцов из разведений стерильной водой пробы фекального стока и ряд тестовых образцов из разведений тестовой жидкости в пропорциях от 1:10 до 1:600. Образцы наносят на бумажные диски в количестве (5-20 мкл).

5. В чашку Петри на питательный агар LB (Broth, Miller) делают посев микробной суспензии определенной плотности (эквивалентную стандарту мутности 0.5 (при ОП 600 нм)) одной из вышеперечисленных тест-культур.

6. На агар помещают бумажные диски с нанесенными образцами. Диффузия дезинфицирующих веществ в агар приводит к формированию зоны подавления роста микроорганизмов вокруг дисков. После инкубации чашек в термостате при 28°С в течение 24…48 часов, учитывают результат, путем измерения зоны подавления роста вокруг дисков. По диаметру зоны судят о реакции тест-культуры и о бактерицидном действии образцов с данным разведением. Этот способ сочтен наиболее удобным из всех других способов приведения образцов в контакт с тест-культурой.

7. Выявляют испытуемые и тестовые образцы с одинаковой реакцией тест-культуры и, зная степень разведения образцов, вычисляют содержание ДВ в пробе фекального стока. Все испытания проводят в трехкратной повторности, для обработки результатов используют стандартные статистические методы.

8. Зная содержание ДВ в пробе фекального стока, вычисляют требуемую степень разведения этого стока, при которой концентрация ДВ не превысит заданного значения. Документируют результат.

9. Если оказывается, что в предшествующем разведении диаметр зоны подавления роста испытуемых образцов оказывается больше, а в последующем разведении меньше, чем у тестовых образцов, применяют дробное разведение тестовой жидкость в диапазоне между предшествовавшем и последующим разведениями методом дихотомии, чтобы получить более точный результат. Это важно, поскольку при разведениях, кратных 2, ошибка на одно разведение означает удвоение объема стоков, сдаваемых на очистные сооружения и, соответственно, удвоение платы за их прием.

Результаты контрольных экспериментов, проведенных с тестовой жидкостью, состоящей из водного раствора только D4 и ПГМГ-ГХ показали кратное расхождение результатов с полученными предложенным способом.

Трудоемкость предложенного способа невелика, он не требует технически сложного и дорогостоящего оборудования, как химические или химико-физические методы, точность определения не зависит от погрешностей в приготовлении тест-культур. Главное, он позволяет получить результаты с достаточной для практики точностью на таком материале, с каким ни одна из известных методик просто не дает никаких результатов.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ определения концентрации дидецилдиметиламмония хлорида и полигексаметиленбигуанидин гидрохлорида в фекальных стоках. Способ включает приготовление из пробы фекального стока испытуемых образцов с различной степенью разведения, тестовой жидкости с заданной концентрацией указанных веществ, поверхностно-активным веществом и пропанолом-2, а также тестовых образцов, путем последовательных разведений тестовой жидкости. Далее приводят в контакт испытуемые и тестовые образцы с тест-культурой и измеряют степень подавления роста тест-культуры, где испытуемый и тестовый образцы с одинаковой степенью подавления роста считают содержащими равные концентрации указанных веществ. По известной концентрации указанных веществ в тестовом образце и известной степени разведения испытуемого образца вычисляют концентрацию дидецилдиметиламмония хлорида и полигексаметиленбигуанидин гидрохлорида в пробе. Изобретение обеспечивает повышение точности определения содержания дидецилдиметиламмония хлорида и полигексаметиленбигуанидин гидрохлорида в продуцируемых в туалетах транспортных средств фекальных стоках. 2 з.п. ф-лы.

1. Способ определения концентрации дидецилдиметиламмония хлорида и полигексаметиленбигуанидин гидрохлорида в фекальных стоках транспортных средств, при котором из пробы фекального стока приготавливают ряд испытуемых образцов с различной степенью разведения пробы, приготавливают тестовую жидкость, наиболее близкую по составу к испытуемым стокам и содержащую заданную концентрацию указанных веществ и которая представляет собой человеческие фекалии в смеси с водой в пропорции 1:(2-10) с добавлением поверхностно-активного вещества, в качестве которого используют оксиэтилированные моноалкилфенолы, и пропанола-2, приготавливают ряд тестовых образцов из последовательных разведений тестовой жидкости, приводят испытуемые и тестовые образцы в контакт с тест-культурой, далее образцы инкубируют, измеряют степень подавления роста тест-культуры, где испытуемый и тестовые образцы с одинаковой степенью подавления роста считают содержащими равные концентрации дидецилдиметиламмония хлорида и полигексаметиленбигуанидин гидрохлорида, после чего по известной концентрации дидецилдиметиламмония хлорида и полигексаметиленбигуанидин гидрохлорида в тестовом образце и известной степени разведения испытуемого образца вычисляют концентрацию дидецилдиметиламмония хлорида и полигексаметиленбигуанидин гидрохлорида в пробе фекального стока и, при необходимости, уточняют результат дробным разведением тестовой жидкости вблизи первоначально установленного разведения с одинаковой степенью подавления роста, а также проведением серии повторных испытаний вблизи этой точки.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве поверхностно-активного вещества используют неонол, выбранный из группы: Неонол АФ 9-9, Неонол АФ 9-10, Неонол АФБ-10, Неонол АФ 9-12, Неонол АФБ-12 в количестве 0,02-0,1 от общей массы тестовой жидкости нулевого разведения.

3. Способ по любому из пп.1, 2, отличающийся тем, что в качестве тест-культуры используют штаммы бактерий, выбранные из ряда: Paenalcaligenes sp., Staphylococcus pasteuri, Enterococcus faecium, Micrococcus endophyticus, Enterococcus casseliflavus, Bacillus subtilis, Alcaligenes aquatilis.