Способ оценки центральной десинхронизации организма у крыс Российский патент 2021 года по МПК A61B5/00 G01N33/74 G09B23/28 

Изобретение относится к экспериментальной медицине, хронобиологии, патофизиологии, ветеринарии и предназначено для повышения объективности при проведении фундаментального анализа временной структуры организма в условиях искусственного освещения.

Множество факторов влияют на состояние циркадианной системы организма. Скоординированные по времени физиологические функции различных систем органов обуславливают высокий уровень здоровья, степень физической и умственной работоспособности. При рассогласовании внешнего и внутреннего ритмозадачиков в организме происходит каскад приспособительных реакций, приводящий к развитию десинхронизма. Тип десинхроноза и степень нарушений физиологических функций зависит от сроков аномального воздействия света, мощности внешнего осциллятора и типа светового режима.

Известен способ оценки степени выраженности десинхроноза, на основе которого была создана программа для ЭВМ [свидетельство о регистрации №2014617722]. Заложенный в программу алгоритм позволяет провести персонализированный количественный анализ десинхронизма на основе теста «индивидуальной минуты» и частоты сердечных сокращений.

Недостатком применяемого в данном программном продукте подхода к оценке степени выраженности десинхронизма является использование в качестве объекта только человека, что исключает возможность экспериментального моделирования различных видов нарушения биологических ритмов, ограничивает использование методов исследования.

Известен также ряд способов оценки десинхроноза у больных с патологиями систем органов. Выявление дискоординации циркадианных ритмов артериального давления у больных гипертонической болезнью позволяет установить факторы риска десинхроноза у больных с гипертонической болезнью [патент RU на изобретение №2452365]. Вычисление времени индивидуальной акрофазы и батифазы синтеза ТТГ, Т₃, Т₄ для каждого испытуемого определяет тактику лечения с учетом индивидуальных особенностей каждого пациента в условиях десинхроноза гипофизарно-тиреоидной системы [патент RU на изобретение №2313098]. Персонализированный выбор препаратов при бронхиальной астме тяжелого течения на основе изучения ритмов секреторной активности гипофиза и щитовидной железы приводит к уменьшению частоты побочных действий, уменьшению количества обострений, удлинению периодов ремиссии и снижению времени пребывания в стационаре.

Недостатком указанных способов является рассмотрение десинхроноза только при одной патологии, что не позволяет сделать выводы о процессах, происходящих в организме в целом.

Наиболее близким аналогом является способ оценки десинхроноза, заключающийся в определении концентрации мелатонина в крови [Gooley J.J., Chamberlain K., Smith K.A. et al. Exposure to Room Light before Bedtime Suppresses Melatonin Onset and Shortens Melatonin Duration in Humans // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2011. V. 96. P. 463–472]. Факторы, нарушающие эндогенную продукцию мелатонина, выступают как триггеры для развитиятех или иных форм десинхроноза. В частности, искусственное освещение, воздействующее в темную фазу суток, в том числе с экрана телевизора и смартфона подавляет выработку эндогенного мелатонина. Свет, действующий в ночные часы, подавляет выработку мелатонина, прежде всего эпифизом и сетчаткой, что влечет за собой существенные изменения гормонального баланса, развитие десинхроноза и многообразие его пагубных последствий.

Однако, использование мелатонина в качестве маркера в развитии десинхроноза недостаточно информативно для оценки функциональных взаимосвязей эпифиза и гипоталамо-гипофизарной системы, что снижает его прогностическую значимость в оценке неблагоприятных последствий десинхроноза.

Задачей заявляемого изобретения является повышение качества и прогностической ценности биохимической оценки неблагоприятных последствий светового десинхроноза при изучении биологических ритмов организма у крыс.

Сущность заявляемого изобретения заключается в том, что в способе оценки центральной десинхронизации организма у крыс, включающем определение в сыворотке крови концентрации мелатонина и дополнительно концентраций кортикотропина и β-эндорфина с последующим рассчетом индекса десинхронизации k, определяемом как отношение концентрации кортикотропина к сумме концентраций мелатонина и β-эндорфина, при k>0,15 констатируют развитие у крысы десинхроноза, затрагивающего центральные регуляторные механизмы.

Технический результат заявляемого изобретения.

Предлагаемый способ отличается от существующих тем, что в нем используется комплексная оценка активности эпифиза и гипоталамо-гипофизарной системы. Это позволяет повысить качество и прогностическую ценность оценки неблагоприятных последствий светового десинхроноза, в том числе особенностей развития десинхронизма, степени выраженности нарушений при разных световых режимах, спрогнозировать возможные патологические изменения в органах и тканях в условиях аномального фотопериода.

Светоиндуцированный десинхроноз — процесс временной дезорганизации биологических функций организма, приводящий к активации комплекса механизмов адаптации в условиях неблагоприятной хронобиологической ситуации. Концентрация мелатонина и уровень стрессорных гормонов являются главными маркерами стресс-реакции, определяющими сроки срыва регуляторных функций в условиях аномального светового воздействия. Уровень гормона сна является диагностическим признаком десинхронизма, выраженность которого определяется степенью активации стресс-реализующих и стресс-лимитирующих систем. Определение уровня β-эндорфина позволяет оценить функциональный статус механизмов регуляции, а содержание кортикотропина отражает секреторную активность гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы. Расчет индекса десинхронизации позволяет установить степень рассогласования центральных механизмов регуляции, что приводит к учету индивидуальных особенностей объекта исследования.

Способ оценки центральной десинхронизации организма у крыс осуществляют следующим образом.

За 5 минут до проведения манипуляций животным вводят препараты для достижения наркоза. Осуществляют забор крови из правых отделов сердца в объеме 3-5 мл. Сыворотку крови получают путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 20 минут не позднее 3-х часов с момента получения образцов. Аликвоты сыворотки крови замораживают и хранят при температуре -20 С. Проводят определение концентрации гормонов, а именно мелатонина, кортикотропина, в-эндорфина в сыворотке крови животных методом твердофазного иммуноферментного анализа. Рассчитывают индекс десинхронизации k:

,

где С_{кортикотропина} – концентрация кортикотропина;

С_{мелатонина} – контцентрация мелатонина;

С_{в-эндорфина} – концентрация в-эндорфина.

При k>0,15 констатируют развитие у крысы десинхроноза, затрагивающего центральные регуляторные механизмы.

Примеры.

Заявляемый способ был апробирован при моделировании световой десинхронизации биологических ритмов на 30-ти лабораторных белых нелинейных крысах-самцах. Особей с массой тела 250±50 г. вводили в эксперимент при достижении возраста 180 дней. Световой десинхроноз моделировали путем изменения режима освещения в лаборатории. Освещение животных производили светодиодными лампами, с цветовой температурой 4500 К в диапазоне длин волн 360-460 нм, интенсивностью 500 лк. Особи были разделены на 3 равные группы: 1-я группа включала интактных крыс, находящихся в естественных условиях освещения, 2-я группа (модель Light-Light [24:0]) – крысы, которые подвергались круглосуточному воздействию света в течение 10-ти суток, 3-я группа (модель Light-Light [24:0]) – животные, находящиеся в условиях постоянного искусственном освещения в течение 21-х суток.

При проведении экспериментов на животных соблюдались этические принципы Женевской конвенции «Internetional Guiding Principals for Biomedical Involving Animals» (Geneva, 1990). Осуществление экспериментального исследования было одобрено этическим комитетом ФГБОУ ВО «Саратовский ГМУ им. В. И. Разумовского» Минздрава России (протокол №4 от 06.12.2016 года).

За 5 минут до проведения манипуляций животным вводили внутримышечно комбинацию Телазола (Zoetis Inc, США) в дозе 8 мг/кг и Ксиланита (Нита-Фарм, Россия) в дозе 8 мг/кг для достижения наркоза. В первой половине дня осуществляли забор крови из правых отделов сердца в объеме 3-5 мл. Для забора крови использовали пластиковые пробирки BD Vacutainer® SST™ II Advance REF с желтой крышкой Brand Vacutainer®, объемом 5 мл. Животных выводили из эксперимента путем передозировки препаратов для наркоза. Сыворотку крови получали путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 20 минут не позднее 3-х часов с момента получения образцов. Аликвоты сыворотки крови замораживали и хранили при температуре -20 С.

Для диагностики десинхроноза проводили определение концентрации гормонов в сыворотке крови экспериментальных животных методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием набора реактивов Rat ELISA Kit For Melatonin (Cloud-Clone Corp., США), Rat ELISA Kit For Corticotropin Releasing Hormone (Cloud-Clone Corp., США), в-EPR ELISA Kit (Cloud-Clone Corp., США). Твердофазный иммуноферментный анализ образцов сыворотки осуществляли на анализаторе Lazurit Automated ELISA System (Dynex Technology Inc, США).

Обработку данных осуществляли с помощью пакета прикладных статистических программ Statistica 10.0 (StatSoft, США). Проверку гипотезы о подчинении выборки закону нормального распределения производили с помощью критерия Пирсона. Так как полученные данные имели распределение отличное от нормального при дальнейшей статистической обработке использовали U-критерий Мана-Уитни. Различия считали значимыми при р < 0,05. Для каждой группы вычисляли медиану, нижний и верхний квартили.

Таблица – Гормональный статус крыс

при круглосуточном искусственном освещении

(Модель Light-Light [24:0])

Группа
Показатель Контрольная группа Опытная группа
10 сутки Опытная группа
21 сутки Мелатонин 77
(64; 113) 47 (33; 58)
р=0,056198 36 (29; 39)
р=0,002112 Кортикотропин 20
(17; 22) 30 (27; 52)
р=0,002520 31 (28; 40)
р=0,001993 в-эндорфин 66
(61; 81) 86 (34; 158)
р=0,677585 49 (37; 91)
р=0,520523

Примечание: в каждом случае приведены медиана, нижний и верхний квартили; р – по сравнению с контрольной группой.

Результаты применения способа иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1.

У животных, находящихся в условиях естественного фотопериода, значение индекса десинхронизации k варьировало от 0,09 до 0,15, составляя в среднем 0,13, что соответствовало отсутствию признаков центральной десинхронизации биологических ритмов.

Пример 2.

При воздействии круглосуточного освещения на 10-е сутки эксперимента регистрировали уменьшение концентрации мелатонина на 40% по сравнению с группой контроля. Содержание кортикотропина увеличивался в 1,5 раза на 10-е стуки постоянного светового воздействия. К 10-му дню эксперимента концентрация β-эндорфина превышаала контрольные значения на 30%. При расчете индекса десинхронизации было установлено, что на 10-е сутки он варьирует от 0,2 до 0,7, составляя в среднем 0,25, что свидетельствует о развитии десинхронизации центральных регуляторных систем.

Пример 3.

При воздействии круглосуточного освещения в течение 21-х суток концентрация мелатонина снижается в среднем на 53%, β-эндорфина – на 74%, а концентрация кортикотропина напротив возрастает на 55%. При расчете индекса десинхронизации установлено, что на 21-е сутки варьирует от 0,22 до 0,47, составляя в среднем 0,36, что свидетельствует о сохранении десинхронизации центральных регуляторных систем.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной медицине, хронобиологии, патофизиологии, ветеринарии, и может быть использовано для оценки центральной десинхронизации организма у крыс. Проводят исследование в сыворотке крови концентрации мелатонина, кортикотропина и β-эндорфина. Рассчитывают индекс десинхронизации k, определяемый как отношение концентрации кортикотропина к сумме концентраций мелатонина и β-эндорфина. При k>0,15 констатируют развитие у крысы десинхроноза, затрагивающего центральные регуляторные механизмы. Способ обеспечивает возможность повысить качество и прогностическую ценность биохимической оценки неблагоприятных последствий светового десинхроноза при изучении биологических ритмов организма у крыс за счет комплексной оценки активности эпифиза и гипоталамо-гипофизарной системы. 1 табл., 3 пр.

Способ оценки центральной десинхронизации организма у крыс, включающий исследование в сыворотке крови концентрации мелатонина, отличающийся тем, что дополнительно в сыворотке крови определяют концентрацию кортикотропина и β-эндорфина, рассчитывают индекс десинхронизации k, определяемый как отношение концентрации кортикотропина к сумме концентраций мелатонина и β-эндорфина, при k>0,15 констатируют развитие у крысы десинхроноза, затрагивающего центральные регуляторные механизмы.