ПРОЦЕСС ФЕРМЕНТАЦИИ АСКОМИЦЕТОВ Российский патент 2021 года по МПК C12N1/14 C12P19/04 C12R1/645 

Настоящее изобретение относится к способу культивирования Ascomycota бета-глюкана, полученного этим способом, и к использованию бета-глюкана в качестве модификатора реологии.

Аскомицеты - это дрожжеподобные грибы, способные производить широкий спектр различных ценных биопродуктов, таких как ферменты, пигменты и биополимеры, такие как бета-глюканы. Эти бета-глюканы имеют большое экономическое значение, поскольку они могут широко использоваться в пищевой, фармацевтической, сельскохозяйственной и химической промышленности.

Однако ферментация этих грибов оказалась сложной задачей. До сих пор подходы из различных дисциплин, таких как микробиология, биохимическая инженерия, способы инженерии и генетики, были направлены на удовлетворение потребности в обеспечении стабильного и надежного процесса, который обеспечивает выход бета-глюкана, необходимый для производства в промышленных масштабах. В Zhenming et al. (Биопродукты из Aureobasidium pullulans, биотехнологически важных дрожжей; Appl Microbiol Biotechnol 2009, 82; 793-804) оценили влияние различных источников сахара и специфической активности ферментов на ферментацию. Ввиду возникших трудностей авторы пришли к выводу, что генетические модификации будут более многообещающим способом для достижения эффективных масштабов промышленного производства, но для этого потребуется полный анализ генома.

Авторы настоящего изобретения поставили перед собой задачу разработать способ ферментации грибов, принадлежащих к отделу Ascomycota, который приводит к достаточно высоким выходам желаемых продуктов ферментации, особенно бета-глюканов, при сохранении затрат на уровне, подходящем для промышленного масштаба производства.

Эта задача была решена процессом ферментации Ascomycota, состоящим из следующих этапов:

a) обеспечение среды с содержанием сухого вещества, выбранным из диапазона от 0,1 до 0,3 масс. % и содержащей менее 0,1 масс. % источника органического азота;

b) инокуляция среды по меньшей мере одним грибом, принадлежащим к отделу Ascomycota, с плотностью инокуляции, выбранной из диапазона от 0,01 г_CDW/л до 50 г_CDW/л;

c) добавление по меньшей мере одного источника углерода в концентрации от 1 до 20 масс. %;

d) смешивание среды и по меньшей мере одного гриба согласно этапу d) в течение периода времени от 24 до 400 часов;

e) удаление от 30 до 90 масс. % среды и по меньшей мере одного гриба;

f) добавление от 30 до 90 масс. % среды, как определено на этапе а), дополнительно содержащей источник углерода;

g) повторение этапов с) - f) от 2 до 100 раз;

при этом по меньшей мере один из этапов с) - g) выполняют с относительным содержанием газа, выбранным из диапазона от 0,005 до 0,5.

Способ согласно изобретению гарантирует стабильный и надежный процесс, который может быть реализован в любом состоянии ферментационного реактора современного уровня техники. Кроме того, способ по изобретению не включает в себя генную инженерию или использование генетически модифицированных микроорганизмов, которые увеличивают затраты, но также ограничивают применение произведенных бета-глюканов и их принятие потребителями. Кроме того, способ согласно настоящему изобретению гарантирует, что выходы бета-глюкана более чем в 3,5 раза выше по сравнению с способом в условиях современного уровня техники (см. пример 1).

Далее элементы настоящего изобретения будут описаны более подробно. Эти элементы перечислены с конкретными вариантами осуществления изобретения, однако, следует принимать во внимание, что они могут комбинироваться любым способом и в любом количестве для создания дополнительных вариантов осуществления. Различные описанные примеры и варианты осуществления не должны толковаться как ограничивающие настоящее изобретение только явно описанными вариантами осуществления. Это описание следует рассматривать таким образом, что оно поддерживает и охватывает варианты осуществления, которые объединяют явно описанные варианты осуществления с любым количеством раскрытых элементов. Кроме того, любые перестановки и комбинации всех описанных элементов в этой заявке должны рассматриваться как раскрытые в описании настоящей заявки, до тех пор, пока контекст не подразумевает иное.

Во всем этом описании и формуле изобретения, если контекст не требует иного, слово «содержать» и варианты, такие как «содержит» и «содержащий», будут рассматриваться как подразумевающие включение указанного члена, целого числа, этапа или группы членов, целых чисел или этапов, но не исключение любого другого члена, целого числа или этапа, или группы членов, целых чисел или этапов. Термины, указывающие на использование единственного числа, и аналогичные ссылки, используемые в контексте описания изобретения (особенно в контексте формулы изобретения), должны толковаться как охватывающие как единственное, так и множественное число, до тех пор, пока в данном документе не указывается иное, или явно не противоречит контексту. Приведение диапазонов значений в данном документе просто предназначено для использования для сокращенной отсылки к каждому отдельному значению, попадающему в этот диапазон. До тех пор, пока в данном документе не указано иное, каждое отдельное значение включено в описание, как если бы оно было отдельно указано здесь. Все способы, описанные здесь, могут выполняться в любом подходящем порядке, до тех пор, пока в данном документе не указывается иное, или иным образом явно не противоречит контексту. Использование любых и всех примеров или вводное слово перед примером (например, «такой как», «например», «конкретный», «конкретный вариант осуществления»), представленных в настоящем документе, предназначено просто для лучшей иллюстрации изобретения и не представляет собой ограничения в объеме изобретения, до тех пор, пока не заявлено иное. Никакие формулировки в описании не следует истолковывать как указывающие на какой-либо не заявленный элемент, существенный для осуществления изобретения.

В рамках настоящего изобретения следует принимать во внимание, что термин «Ascomycota» включает в себя любой гриб, принадлежащий к отделу или типу царства грибов. Ascomycota относятся к подцарству дикария (Dikarya). Ascomycota, которые подходят для способа по настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваясь этим, любой гриб, относящийся к классу Dothideomycetes, такой как Aureobasidiaceae. Способ согласно настоящему изобретению особенно подходит для ферментации Aureobasidium pullulans, также называемых Aureobasidium oleae, Azymocandida malicola, Candida malicola, Cladosporium pullulans, Dematium pullulans, Exobasidium vitis, Hormonema oleae, Hormonema pullulans, Pullansullia fermentans, Pullansullia fermentans var. schoenii, Pullularia pullulans, Torula oleae или Torula schoenii. Все эти виды следует рассматривать как синонимы. Грибы, принадлежащие к отделу Ascomycota, обычно называют аскомицетами.

Среда, обеспечиваемая на этапе а) способа согласно настоящему изобретению, характеризуется содержанием сухого вещества, выбранным из диапазона от 0,1 до 0,3 масс. %, при этом содержание сухого вещества, выбранное из диапазона от 0,15 до 0,25 масс. % также входит в объем настоящего изобретения. Термин «содержание сухого вещества» относится к массе, определенной после удаления воды и других летучих соединений из образца с использованием инфракрасных весов (IR-balance).

По меньшей мере один из этапов с) - g) способа согласно настоящему изобретению выполняется при относительном содержании газа, выбранном из диапазона от 0,005 до 0,50, при этом диапазоны от 0,0075 до 0,40, от 0,01 до 0,35 и от 0,01 до 0,20 также находятся в пределах объема настоящего изобретения.

В рамках настоящего изобретения относительное содержание газа определяется формулой:

(где P – подводимая мощность [Вт], V_L - объем среды, по меньшей мере, одного из грибов, и по меньшей мере одного из источников углерода [м³], ρ_L - плотность среды согласно этапу а), по меньшей мере, в отношении гриба и по меньшей мере в одном из источников углерода [кг/м³], а u_G - приведенная скорость газа [м/с ] (Лиепе (1988): Verfahrenstechnische Berechnungsmethoden Teil 4: Stoffvereinigen in fluiden Phasen - Ausrüstungen und ihre Berechnungen von einem Autorenkollektiv unter Federführung von F. Liepe, Leipzig, VEB Deutscher Verlag für Grundstoffindustrie).

В рамках настоящего изобретения термин «подводимая мощность» определяется как (где Ne - число Ньютона, ρ_L - плотность среды согласно этапу а) по меньшей мере одного из грибов и по меньшей мере одного из источников углерода [кг/м³], n - частота перемешивания [с^-1], d - диаметр мешалки [м]). В рамках настоящего изобретения термин «приведенная скорость газа» определяется как , где Q_G - объемный расход газа [м³/с], который следует рассматривать как объем воздух, барботирующий через среду, по меньшей мере, на грибок и по меньшей мере один источник углерода в секунду, и Dr - это внутренний диаметр сосуда.

Среда может быть обеспечена в любом сосуде, известном специалисту в данной области техники, который является подходящим для способа согласно изобретению, например, в периодическом реакторе или реакторе периодического действия с подпиткой, эрлифтном реакторе, реакторе с мешалкой или реакторе с барботажной колонной. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения абсолютное давление в свободном пространстве над пространством сосуда выбирается из диапазона от 1 до 11 бар, при этом диапазоны от 1,1 до 10 бар, от 1,2 до 9 бар и от 1,3 до 8 бар также входят в объем настоящего изобретения. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения сосуд оборудован источником света, обеспечивающим интенсивность света по меньшей мере 300 лк. В подходящем варианте осуществления источник света можно размещать над поверхностью ферментационной среды в течение по меньшей мере 40% времени, как описано на этапе d). 1 лк определяется как 1 лм на м². В другом показательном подходящем варианте осуществления источник света может быть размещен рядом с сосудом и за его пределами. В этом случае сосуд может быть оборудован окном или может содержать, или состоять из прозрачного материала. В другом показательном подходящем варианте осуществления источник света может быть помещен внутрь сосуда, погруженного в ферментационную среду.

На этапе b) способа по настоящему изобретению среду инокулируют по меньшей мере одним грибом, принадлежащим к отделу Аскомицеты, с плотностью инокуляции, выбранной из диапазона от 0,01 г_CDW/л до 50 г_CDW/л. «Инокуляцию» можно выполнять любым способом, известным специалисту в данной области, который является подходящим для способа по изобретению, таким как добавление по меньшей мере одного гриба в очищенной форме или в форме для предварительного культивирования. В рамках способа по изобретению концентрация по меньшей мере одного гриба выбирается из диапазона от 0,01 г_CDW/л до 50 г_CDW/л, при этом диапазоны, составляющие от 0,02 г_CDW/л до 25 г_CDW/л, от 0,03 г_CDW/л до 20 г_CDW/л и от 0,05 г_CDW/л до 15 г_CDW/л, также входят в объем изобретения. Таким образом, параметр «L» относится к объему среды согласно этапу а) способа по настоящему изобретению.

По меньшей мере один грибок, используемый в способе изобретения, представляет собой, например, только один единственный тип грибов или смесь различных грибов. Термин «сухой вес клеток» (CDW) следует рассматривать как вес общей биомассы, деленный на объем образца ферментации после центрифугирования ферментированного образца, удаления надосадочной жидкости, промывки раствором 9 г/л NaCl, повторного центрифугирования, повторного удаления надосадочной жидкости и сушки при температуре 90°C до достижения постоянного веса.

В рамках настоящего изобретения термин «предварительное культивирование» следует рассматривать как включающий в себя любую композицию для ферментации или культуральную среду, используемую для предварительного культивирования по меньшей мере одного гриба. Термин «предварительное культивирование» хорошо известен любому специалисту в области ферментации. В конкретном варианте осуществления по меньшей мере один гриб предварительно культивируют до сухой массы клеток от 2 г_CDW/л до 30 г_CDW/л перед добавлением в среду согласно этапу b) способа согласно изобретению. Особым преимуществом способа согласно изобретению, является то, что высокие выходы бета-глюкана могут быть получены при сохранении относительно низкого объема предварительного культивирования, как, например, использование от 0,1 до 0,5 масс. % (вес продукта предварительного культивирования к весу среды), что является достаточным.

В рамках особого варианта осуществления настоящего изобретения содержание азота в среде согласно этапу а) выбирается из диапазона от 0,003 до 0,02 масс. %, при этом диапазоны от 0,005 до 0,015 масс. %, и от 0,006 до 0,01 масс. % также входят в объем настоящего изобретения.

В рамках особого варианта осуществления настоящего изобретения этап b) способа согласно изобретению, выполняется в течение периода времени от 1 минуты до 8 часов, причем периоды времени от 2 минут до 7 часов, от 3 минут до 6 часов и от 5 минут до 5 часов также входят в объем настоящего изобретения. Таким образом, особенно подходящим для выполнения инокуляции является добавление по меньшей мере одного гриба сразу в начале временного периода.

На этапе с) способа по настоящему изобретению добавляется по меньшей мере один источник углерода в концентрации от 1 до 20 масс. %, при этом концентрации от 2 до 18 масс. %, от 3 до 15 масс. %, и от 4 до 12 масс. % также входят в объем настоящего изобретения. «Добавление» может быть выполнено любым способом, известным специалисту в данной области, который является подходящим для способа изобретения. Этап c) может выполняться после этапа b) способа согласно изобретению, но может также выполняться перед этапом b), или этапы b) и c) также могут выполняться параллельно. В другом варианте осуществления настоящего изобретения этапы а) и с) могут выполняться параллельно и перед этапом b).

На этапе d) способа согласно изобретению среда и по меньшей мере один грибок смешивают в течение периода времени от 24 до 400 часов, причем периоды времени от 30 до 350 часов, от 35 до 300 часов, от 40 до 250 часов, и от 50 до 200 часов также входят в объем настоящего изобретения. «Смешивание» может быть выполнено любым способом, известным специалисту в данной техники, который является подходящим для способа согласно изобретению.

Способ, который показал особые преимущества с точки зрения затрат времени и энергии, заключается в смешивании посредством непрерывного перекачивания среды и по меньшей мере одного гриба в направлении снизу-вверх сосуда.

В особенно предпочтительном варианте осуществления смешивание выполняется без использования какого-либо вращающегося устройства, такого как мешалка. Система, которая является предпочтительной для выполнения способа по настоящему изобретению, представляет собой, например, реактор с барботажной колонной.

В конкретном варианте осуществления смешивание может осуществляться с удельной подводимой мощностью P/V от 2 до 12.000 Вт/м³, при этом удельная подводимая мощность, составляющая от 100 до 1.000 Вт/м³, также находится в пределах объема настоящего изобретения.

В системе перемешивания, такой как реактор с баком-мешалкой, термин «удельная подводимая мощность» следует рассматривать как , где P - подводимая мощность, [Вт], Ne - число Ньютона [-], ρ - плотность среды согласно этапу a) [кг/м³], n - частота мешалки [с^-1], d - диаметр крыльчатки [м], а V - объем среды согласно этапу а), источник углерода и по меньшей мере один грибок.

В системе без какого-либо типа крыльчатки или мешалки, такой как реактор с барботажной колонной, удельную подводимую мощность следует рассматривать как , где g - ускорение свободного падения [м с^-2], а u_g - приведенная скорость газа, как определено выше.

В другом конкретном варианте осуществления смешивание выполняется до тех пор, пока динамическая вязкость при скорости 20 с^-1 сдвига и при температуре 20°C среды, и по меньшей мере одного гриба на этапе d) не будет находиться в диапазоне от 40 до 600 мПа·с, причем диапазоны от 50 до 550 мПа·с, от 70 до 500 мПа·с, от 90 до 450 мПа·с и от 100 до 400 мПа·с также находятся в пределах объема настоящего изобретения.

В рамках особого варианта осуществления настоящего изобретения уровень pH поддерживается в диапазоне от 4,0 до 6,0 в течение всего способа, при этом диапазоны от 4,25 до 5,75, от 4,25 до 5,5 и от 4,25 до 4,75 также входят в объем настоящего изобретения. В другом особом варианте осуществления настоящего изобретения уровень pH поддерживается выше 4,75, например, в диапазоне от 4,75 до 5,25 во время всего способа посредством добавления основания, при этом основания могут быть любыми основаниями, известными специалисту в данной области ферментации, подходящими для использования в ферментациях, и не содержащая азота, такая как NaOH или KOH. Особым преимуществом способа согласно настоящему изобретению является то, что не нужно использовать кислоту для регулирования уровней pH.

В рамках особого варианта осуществления настоящего изобретения температура поддерживается в диапазоне от 22 до 30°C в течение всего способа, при этом диапазоны от 23 до 30°C, диапазон от 24 до 29 и от 24 до 28°C также входят в объем настоящего изобретения.

В рамках этапа е) способа согласно настоящему изобретению удаляют от 30 до 90 масс. % среды и по меньшей мере один грибок, при этом диапазоны, составляющие от 40 до 85 масс. %, от 45 до 80 масс. %, от 50 до 75 масс. %, и от 55 до 65 масс. %, также входят в объем настоящего изобретения. Таким образом, «удаление» может быть выполнено любыми средствами и способами, известными специалисту в данной области техники, которые являются подходящими для способа по изобретению.

В рамках этапа f) способа согласно настоящему изобретению, от 30 до 90 масс. % среды, определенной на этапе a) способа согласно настоящему изобретению и дополнительно содержащей источник углерода, добавляют к оставшейся среде и по меньшей мере одному грибку, причём диапазоны от 40 до 85 масс. %, от 45 до 80 масс. %, от 50 до 75 масс. % и от 55 до 65 масс. % также входят в объем настоящего изобретения. При этом следует принимать во внимание, что диапазон от 30 до 90 масс. % включает в себя вес среды и источника углерода. Таким образом, «добавление» может осуществляться любыми средствами и способами, известными специалисту в данной области техники, которые являются подходящими для способа согласно изобретению. Таким образом, важно, чтобы количество удаленной среды и гриба, а также количество новой среды были равными, при этом допустимое отклонение составляет до 30%, предпочтительно менее 10%.

В рамках этапа g) способа согласно настоящему изобретению этапы с) - f) повторяются от 2 до 100 раз, причем повторения от 2 до 80, от 2 до 70, от 2 до 50 и от 2 до 25 раз также находятся в пределах объема настоящего изобретения. Особым преимуществом способа согласно настоящему изобретению является то, что клетки и продукты ферментации можно собирать до 100 раз без необходимости новой инокуляции. Способ ферментации и состав среды, разработанные авторами настоящего изобретения, будут гарантировать высокие выходы бета-глюкана. Повторение этапов с) - f) имеет особое преимущество, поскольку выход бета-глюкана значительно увеличивается с первым повторением. Кроме того, затраты на очистку могут быть минимизированы, поскольку очистка реактора необходима только после завершения этапа g) способа по настоящему изобретению, что способствует дополнительной экономии затрат, затраты на подготовку предварительных культур могут быть минимизированы, поскольку подготовка предварительного культивирования необходима только для каждой итерации способа в пределах от второй до сотой. Кроме того, минимизируются простои (непроизводственные фазы) производственного оборудования, так как производство может продолжаться без потерь времени на сбор полезного продукта, стерилизацию, очистку и наполнение. Однако также возможно получить приличный выход бета-глюкана, не повторяя этапы с) - f), а выполняя этапы с) - f) только один раз.

В рамках настоящего изобретения термин «биополимер» следует рассматривать как любой полимер, продуцируемый живыми организмами. Способ и система согласно настоящему изобретению особенно подходят для биополимеров, которые показывают не зависящую от температуры вязкость в диапазоне от 20 до 100°C или в диапазоне от 20 до 80°C. Способ по настоящему изобретению особенно подходит для биополимеров, содержащих ковалентно связанные мономерные звенья, такие как полимерные углеводные структуры, каучук, суберин, меланин и лигнин. В иллюстративном варианте осуществления изобретения по меньшей мере один биополимер имеет молекулярный вес по меньшей мере 0,8 мегадальтона, такой как склероглюкан, пуллулан или бета-глюкан. В другом иллюстративном варианте осуществления по меньшей мере один биополимер имеет распределение молекулярного веса максимум от 0,5 до 5,0 миллионов дальтон (мегадальтон) или от 0,75 до 3,5 миллионов дальтон (мегадальтон) или от 1,0 до 2,0 миллионов дальтон (мегадальтон). В иллюстративном варианте осуществления биополимер имеет поведение, сопровождающееся истончением при сдвиге, описываемое константой b, при этом b является градиентом между двумя парами значений x1/y1 и x2/y2, где x - скорость сдвига [с^-1] в диапазоне 0,1 -100 с^-1, а y - динамическая вязкость [мПа·с] при заданной скорости сдвига и температуре биополимера от 20°C до 80°C и концентрации от 0,05 до 0,5 масс. %. Константа b может быть описана формулой b = -((lg (y1/y2)/(lg (x1/x2)). В подходящем, но иллюстративном варианте осуществления b выбирается из диапазона от 0,65 до 1,05. В рамках другого иллюстративного варианта осуществления b выбирается из диапазона от 0,7 до 1,0. В дамках другого иллюстративного варианта осуществления b выбирается из диапазона от 0,75 до 0,9. В рамках настоящего изобретения термин «бета-глюкан» следует рассматривать как относящийся к любому β-полисахариду D-глюкозы, характеризующийся образованием линейной основной цепи с 1-3 β-гликозидными связями. В рамках особых вариантов осуществления настоящего изобретения бета-глюканы имеют распределение молекулярного веса максимум от 0,5 до 5,0 миллионов дальтон (мегадальтон), или от 0,75 до 3,5 миллионов дальтон (мегадальтон) или от 1,0 до 2,0 миллионов дальтон (мегадальтон).

Конкретные варианты осуществления настоящего изобретения

Следующие ниже конкретные варианты осуществления определяют варианты осуществления, которые особенно полезны для производства бета-глюкана с помощью грибов, принадлежащих к семейству Aureobasidiaceae. Эти варианты осуществления никоим образом не предназначены для ограничения объема настоящей заявки в каком-либо отношении.

Конкретный вариант А осуществления изобретения

Способ ферментации Aureobasidiaceae, содержащий следующие этапы:

a) обеспечение среды с содержанием сухого вещества, выбранным из диапазона от 0,1 до 0,3 масс. % и содержащей менее 0,1 масс. % источника органического азота;

b) инокуляция среды по меньшей мере с одним грибом, принадлежащим виду Aureobasidium pullulans, с плотностью инокуляции, выбранной из диапазона от 0,01 г_CDW/л до 50 г_CDW/л;

c) добавление по меньшей мере одного источника углерода в концентрации от 1 до 20 масс. %;

d) смешивание среды и по меньшей мере одного гриба согласно этапу d) в течение периода времени от 24 до 400 часов;

e) удаление от 30 до 90 масс. % среды и по меньшей мере одного гриба;

f) добавление от 30 до 90 масс. % среды, как определено на этапе а), дополнительно содержащей источник углерода;

g) повторение этапов с) - f) от 2 до 100 раз;

при этом, по меньшей мере, один из этапов с) - g) выполняют с относительным содержанием газа, выбранным из диапазона от 0,005 до 0,5.

Конкретный вариант B осуществления изобретения

Способ ферментации Aureobasidiaceae, содержащий следующие этапы:

a) обеспечение среды с содержанием сухого вещества, выбранным из диапазона от 0,1 до 0,3 масс. %, и содержащей менее 0,1 масс. % источника органического азота;

b) инокуляция среды по меньшей мере с одним грибом, принадлежащим к виду Aureobasidium pullulans, с плотностью инокуляции, выбранной из диапазона от 0,01 г_CDW/л до 50 г_CDW/л;

c) добавление сахарозы в концентрации от 1 до 20 масс. %;

d) смешивание среды и по меньшей мере одного гриба согласно этапу d) в течение периода времени от 24 до 400 часов;

e) удаление от 30 до 90 масс. % среды и по меньшей мере одного гриба;

f) добавление от 30 до 90 масс. % среды, как определено на этапе а), дополнительно содержащей источник углерода;

g) повторение этапов с) - f) от 2 до 100 раз;

при этом по меньшей мере один из этапов с) - g) выполняют с относительным содержанием газа, выбранным из диапазона от 0,005 до 0,2.

Конкретный вариант C осуществления изобретения

Способ культивирования Aureobasidiaceae, содержащий следующие этапы:

a) обеспечение среды с содержанием сухого вещества, выбранным из диапазона от 0,1 до 0,3 масс. %, и содержащей менее 0,1 масс. % источника органического азота;

b) инокуляция среды по меньшей мере с одним грибом, принадлежащим к виду Aureobasidium pullulans, с плотностью инокуляции, выбранной из диапазона от 0,01 г_CDW/л до 50 г_CDW/л;

c) добавление сахарозы в концентрации от 1 до 20 масс. %;

d) смешивание среды и по меньшей мере одного гриба согласно этапу d) в течение периода времени от 24 до 400 часов;

e) удаление от 30 до 90 масс. % среды и по меньшей мере одного гриба;

f) добавление от 30 до 90 масс. % среды, как определено на этапе а), дополнительно содержащей источник углерода;

g) повторение этапов с) по f) от 2 до 100 раз;

при этом по меньшей мере один из этапов с) - g) выполняют при относительном содержании газа, выбранном из диапазона от 0,005 до 0,2, при температуре от 24 до 30°C, и при уровне pH от 4 до 6.

Конкретный вариант D осуществления изобретения

Способ ферментации Aureobasidiaceae, содержащий следующие этапы:

a) обеспечение среды с содержанием сухого вещества, выбранным из диапазона от 0,1 до 0,3 масс. %, и содержащей менее 0,1 масс. % источника органического азота;

b) инокуляция среды по меньшей мере с одним грибом, принадлежащим к виду Aureobasidium pullulans, с плотностью инокуляции, выбранной из диапазона от 0,01 г_CDW/л до 50 г_CDW/л;

c) добавление сахарозы в концентрации от 1 до 20 масс. %;

d) смешивание среды и по меньшей мере одного гриба согласно этапу d) в течение периода времени от 24 до 400 часов;

e) удаление от 30 до 90 масс. % среды и по меньшей мере одного гриба;

f) добавление от 30 до 90 масс. % среды, как определено на этапе а), дополнительно содержащей источник углерода;

g) повторение этапов с) - f) от 2 до 100 раз;

при этом по меньшей мере один из этапов c) - g) выполняется с относительным содержанием газа, выбранным из диапазона от 0,005 до 0,2, при температуре от 24 до 30°C и при уровне pH от 4 до 6, а этап b) выполняется в течение периода времени от 1 минуты до 8 часов перед этапом c).

Примеры и фигуры

Далее настоящее изобретение описано с помощью конкретных примеров и чертежей. Примеры и чертежи используются только для иллюстрации и не ограничивают объем настоящего изобретения.

Список чертежей:

На фиг. 1 показано влияние содержания сухого вещества и азота на формирование продукта.

На фиг. 2 показано влияние температуры на формирование продукта.

На фиг. 3 показано влияние уровня pH на формирование продукта.

На фиг. 4 показано влияние источника углерода на формирование продукта.

На фиг. 5 показан схематический обзор повторяющегося периодического способа.

На фиг. 6 показано формирование продукта на партию при изготовлении продукции партиями.

На фиг.7 показано влияние относительного содержания газа на формирование продукта.

На фиг.8 показано влияние фазы голодания на формирование продукта.

Пример 1

Влияние содержания сухого вещества и азота

Были приготовлены 100 кг следующих сред, которые автоклавировали при температуре 121°C в течение 20 минут в реакторе Techfors 150 (Infors AG, Боттминген, Швейцария):

среда PDB-Medium (картофельный бульон с декстрозой, содержание сухого вещества 0,4 масс. %, содержание азота 0,008 масс. %; современный уровень техники): 3 г/кг экстракта картофеля (Sigma Aldrich, Steinheim, Германия), 1 г/кг Antifoam 204 (Sigma Aldrich, Steinheim, Германия) в водопроводной воде (Osin´ska-Jaroszuk et al., Extracellular polysaccharides from Ascomycota and Basidiomycota: production conditions, biochemical characteristics, and biological properties; World J Microbiol Biotechnol. 2015 31:1823–1844),

среда PM-Medium (производственная среда, содержание сухого вещества 0,5 масс. %, содержание азота 0,02 масс. %; современный уровень техники): 2 г/кг (NH4) 2SO4 (Sigma Aldrich, Штайнхайм, Германия), 1 г/кг K2HPO2 (Sigma Aldrich, Штайнхайм, Германия), 0,5 г/кг KCl (Sigma Aldrich, Штайнхайм, Германия), 0,5 г/кг MgSO4 * 7H2O (Sigma Aldrich, Steinheim, Германия), 0,01 г/кг FeSO4 * 7H2O (Sigma Aldrich, Steinheim, Германия), 0,4 г/кг дрожжевого экстракта (Lallemand, Монреаль, Канада), 1 г/кг Antifoam 204 в водопроводной воде (Youssef et al. Pullulan production by a non-pigmented strain of Aureobasidium pullulans using batch and fed-batch culture; Process Biochemistry 34 (1999) 355–366) и

среда ОМ-Medium (изобретение): 0,4 г/кг NaNO3 (Sigma Aldrich, Штайнхайм, Германия), 0,4 г/кг K2HPO4, 0,4 г/кг NaCl (Sigma Aldrich, Штайнхайм, Германия), 0,4 г/кг MgSO4 * 7H2O (Sigma Aldrich, Steinheim, Германия), 0,2 г/кг дрожжевого экстракта (Lallemand, Монреаль, Канада), 1 г/кг Antifoam 204 (Sigma Aldrich).

Перед автоклавированием к каждой среде добавляли 50 г/кг сахарозы (Südzucker AG). После автоклавирования для оставшейся части эксперимента температуру поддерживали на уровне 26°C, уровень pH доводился до 4,5 +/- 0,25 с использованием 5 M H2SO4 и 5 M NaOH и поддерживался на уровне 4,5 +/- 0,25 для оставшейся ферментации с 5 M NaOH, среду перемешивали и аэрировали при относительном содержании газа на значении 0,016 и давлении в свободном пространстве 0,2 бар.

Когда были достигнуты постоянные условия, каждую среду инокулировали до концентрации 0,019 г/кг сухой массы клеток (CDW) Aureobasidium pullulans. Организм культивировали в соответствующей среде в упомянутых выше условиях в течение 144 ч.

Вязкость как меру образования продукта измеряли с помощью ротационного реометра и коаксиального цилиндра, в соответствии с DIN 53019, с использованием реометра Malvern Kinexus Lab + (Malvern Panalytical Ltd., Алмело, Нидерланды) при скорости 20 с^-1 сдвига и температуре 20°С. Улучшение с помощью самостоятельно разработанной среды, показанное на фиг. 1, оценивается из стоимости среды (сумма затрат на все компоненты среды) и динамической вязкости ферментационного бульона после 144 часов культивирования в качестве меры образования продукта. На фигуре показано, что среда OM с содержанием сухого вещества 0,16 масс. % и содержанием азота 0,0066 масс. % показывает наивысшую вязкость (и, следовательно, выход бета-глюкана) при сохранении затрат на минимальном уровне.

Пример 2

Влияние температуры на выход бета-глюкана

2 кг среды OM и 50 г/кг сахарозы (Südzucker AG) автоклавировали при 121°C в течение 20 минут в реакторе Labfors 5 BioEtOH (Infors AG, Боттминген, Швейцария), оборудованном одной турбиной Раштона и одной крыльчаткой с наклонными лопастями. После автоклавирования для оставшейся части эксперимента температуру контролировали в диапазоне от 24 до 32°C (см. фиг. 2, уровень pH доводился до 4,5 +/- 0,25 с использованием 5 M H2SO4 и 5 M NaOH и поддерживался в диапазоне 4,5 +/- 0,25 для оставшейся ферментации с 5 М NaOH, при этом среду перемешивали и аэрировали при относительном содержании газа, составляющем 0,03.

Когда были достигнуты постоянные условия, среду инокулировали до концентрации 0,019 г/кг сухой массы клеток (CDW) Aureobasidium pullulans. Организм культивировали в соответствующей среде в упомянутых выше условиях в течение 144 ч. Вязкость как меру формирования продукта измеряли с помощью ротационного реометра и коаксиального цилиндра в соответствии со стандартом DIN 53019 с использованием реометра Malvern Kinexus Lab + (Malvern Panalytical Ltd., Алмело, Нидерланды) при скорости 20 с^-1 сдвига и температуре 20°С.

На фиг. 2 показано, что наилучшие результаты были достигнуты при температурах от 24 до 30°C с оптимумом на 26°C (динамическая вязкость ферментационного бульона после 144 часов культивирования как мера выхода бета-глюкана).

Пример 3

Влияние pH на выход бета-глюкана

2 кг среды OM и 50 г/кг сахарозы (Südzucker AG) автоклавировали при температуре 121°C в течение 20 минут в реакторе Labfors 5 BioEtOH (Infors AG, Боттминген, Швейцария), оборудованном одной турбиной Раштона и одной крыльчаткой с наклонными лопастями. После автоклавирования для оставшейся части эксперимента температуру поддерживали на уровне 26°C, уровень pH доводился и поддерживался до значений, приведенных на фиг. 3, используя 5 M H2SO4 и 5 M NaOH, среду перемешивали и аэрировали при относительном содержании газа, составляющем 0,03.

Когда были достигнуты постоянные условия, среду инокулировали до концентрации 0,019 г/кг сухой массы клеток (CDW) Aureobasidium pullulans. Организм культивировали в соответствующей среде в упомянутых выше условиях в течение 144 ч. Вязкость как меру формирования продукта измеряли с помощью ротационного реометра и коаксиального цилиндра, в соответствии со стандартом DIN 53019, с использованием реометра Malvern Kinexus Lab + (Malvern Panalytical Ltd., Алмело, Нидерланды) при скорости 20 с^-1 сдвига и температуре 20°С.

На фиг. 3 показано, что наилучшие результаты были достигнуты при уровне pH от 4 до 6 с оптимумом 5 (динамическая вязкость ферментационного бульона после 144 часов культивирования как мера выхода бета-глюкана).

Повышение уровня pH, установленного на 5,0, показано на фиг. 3 с помощью динамической вязкости ферментационного бульона после 144 часов культивирования в качестве меры формирования продукта.

Пример 4

Влияние различных источников углерода на выход бета-глюкана

2 кг среды OM и различных источников углерода, как показано на фиг. 4, что равняется 50 г общего сахара/кг, автоклавировали при температуре 121°C в течение 20 минут в реакторе Labfors 5 BioEtOH (Infors AG, Боттминген, Швейцария), оборудованном одной турбиной Раштона и одной крыльчаткой с наклонными лопастями. После автоклавирования для оставшейся части эксперимента температуру поддерживали на уровне 26°C, уровень pH доводился до значения 4,75 ± 0,25 с использованием NaOH и H2SO4 и поддерживался на уровне 4,75 ± 0,25 с помощью 5 M H2SO4 и 5 M NaOH, среду перемешивали и аэрировали при относительном содержании газа, составляющем 0,03.

Когда были достигнуты постоянные условия, среду инокулировали до концентрации 0,019 г/кг сухой массы клеток (CDW) Aureobasidium pullulans. Организм культивировали в соответствующей среде в упомянутых выше условиях в течение 144 ч. Вязкость как меру формирования продукта измеряли с помощью ротационного реометра и коаксиального цилиндра, в соответствии со стандартом DIN 53019, с использованием реометра Malvern Kinexus Lab + (Malvern Panalytical Ltd., Алмело, Нидерланды) при скорости 20 с^-1 сдвига и температуре 20°С.

На фиг. 4 показано, что наилучшие результаты были достигнуты при использовании сахарозы в качестве источника углерода (динамическая вязкость ферментационного бульона после 144 часов культивирования как мера выхода бета-глюкана).

Пример 5

Многократное изготовление продукции партиями

2 кг среды OM и 50 г/кг сахарозы (Südzucker AG) автоклавировали при температуре 121°C в течение 20 минут в реакторе Labfors 5 BioEtOH (Infors AG, Боттминген, Швейцария), оборудованном одной турбиной Раштона и одной крыльчаткой с наклонными лопастями. После автоклавирования для оставшейся части эксперимента температуру поддерживали на уровне 26°C, уровень pH доводился до 4,75 ± 0,25 с использованием NaOH и H2SO4 и поддерживался на уровне 4,75 ± 0,25 с помощью 5 M H2SO4 и 5 M NaOH, среду перемешивали и аэрировали при относительном содержании газа, составляющем 0,03.

Когда были достигнуты постоянные условия, среду инокулировали до концентрации 0,019 г/кг сухой массы клеток (CDW) Aureobasidium pullulans. Организм культивировали в условиях, упомянутых выше. Когда уровень pH повышается выше 5, собирают 75% среды, и ферментер повторно заполняют свежей средой OM (с составом, который был определен выше). В первые девять циклов была включена дополнительная фаза роста посредством добавления 5% рабочего объема ростовой среды (30 г/кг сахарозы (Südzucker AG) и 20 г/кг дрожжевого экстракта (Lallemand, Монреаль, Канада) в течение 2 дней. В партиях с 10 по 12 фаза роста не включалась. Этот цикл сбора продукта и повторного заполнения повторяли несколько раз, как показано на фиг. 5. Вязкость образцов в качестве меры формирования продукта измеряли с помощью ротационного реометра и коаксиального цилиндра в соответствии со стандартом DIN 53019 с использованием реометра Malvern Kinexus Lab + (Malvern Panalytical Ltd., Алмело, Нидерланды) при скорости 20 с^-1 сдвига и температуре 20°C.

Пример 6

Влияние относительного содержания газа

0,8 л среды OM и 50 г/кг сахарозы (Südzucker AG) автоклавировали при температуре 121°C в течение 20 минут в реакторе DasGip (сосуд с мешалкой DasGip Bioblock, Eppendorf AG, Гамбург, Германия), оборудованном двумя турбинами Раштона, или 2 л среды OM и 50 г/кг сахарозы автоклавировали при температуре 121°C в течение 20 минут в реакторе Labfors 5 BioEtOH (Infors AG, Боттминген, Швейцария), оборудованном одной турбиной Раштона, и одной крыльчаткой с наклонными лопастями, или 100 кг среды OM и 50 г/кг сахарозы (Südzucker AG) автоклавировали при температуре 121°C в течение 20 минут в реакторе Techfors 150 (Infors AG, Боттминген, Швейцария), или 25 м³ среды OM и 50 г/кг сахарозы (Südzucker AG) стерилизовали с помощью обработки сверхвысокой температурой (150°C, 10 минут) и переносили в реактор с мешалкой объемом 30 м³. В оставшейся части эксперимента температуру поддерживали на уровне 26°C, уровень pH доводился до 4,75 ± 0,25 с помощью NaOH и H2SO4 и поддерживался на уровне 4,75 ± 0,25 с помощью 5 M H2SO4 и 5 M NaOH, среду перемешивали при определенных подводимых мощностях в диапазонах от 100 до 12.000 Вт/м3 и аэрировали от 0,5 до 1,5 объемов воздуха на объем среды и в минуту.

Когда были достигнуты постоянные условия, среду инокулировали до концентрации 0,019 г/кг сухой массы клеток (CDW) Aureobasidium pullulans. Организм культивировали в условиях, упомянутых выше.

Пример 7

Влияние фазы голодания

2 кг среды OM (0,4 г/кг NaNO3 (Sigma Aldrich, Штайнхайм, Германия), 0,4 г/кг K2HPO4, 0,4 г/кг NaCl (Sigma Aldrich, Штайнхайм, Германия), 0,4 г/кг MgSO4 * 7H2O (Sigma Aldrich , Steinheim, Германия), 0,2 г/кг дрожжевого экстракта (Lallemand, Montral, Canada), 1 г/кг противовспенивающей присадки Antifoam 204 (Sigma Aldrich)) автоклавировали при температуре 121°C в течение 20 минут в реакторе Labfors 5 BioEtOH (Infors AG, Боттминген, Швейцария), оснащенный одной турбиной Раштона и одной крыльчаткой с наклонными лопастями. После автоклавирования для оставшейся части эксперимента температуру поддерживали на уровне 26°C, уровень pH доводили до 4,75, используя 5 M H2SO4 и 5 M NaOH, среду перемешивали и аэрировали при относительном содержании газа, составляющем 0,017.

Когда были достигнуты постоянные условия, среду инокулировали до концентрации 0,019 г/кг сухой массы клеток (CDW) Aureobasidium pullulans. Организм культивировали в соответствующей среде в упомянутых выше условиях в течение 144 ч. Через 0 ч, 2 ч и 4 ч, соответственно, стерильный раствор сахарозы добавляли к среде за один прием до достижения концентрации сахарозы 50 г/кг. Вязкость как меру формирования продукта измеряли с помощью ротационного реометра и коаксиального цилиндра, в соответствии со стандартом DIN 53019 с использованием реометра Malvern Kinexus Lab + (Malvern Panalytical Ltd., Алмело, Нидерланды) при скорости 20 с^-1 сдвига и температуре 20°С.

На фиг. 8 показано, что наилучшие результаты были достигнуты при реализации фазы голодания в течение 4 часов (динамическая вязкость ферментационного бульона после 144 часов культивирования как мера выхода бета-глюкана).

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ культивирования Dothideomycetes, включающий смешивание в течение от 24 до 400 ч по меньшей мере одного гриба с плотностью инокуляции от 0,01 г сухой массы клеток/л среды/л до 50 г сухой массы клеток/л и среды с содержанием сухого вещества от 0,1 до 0,3 масс. %, источника органического азота менее 0,1 масс. %; при этом по меньшей мере один источник углерода в концентрации от 1 до 20 масс. % добавляют до указанного смешивания по меньшей мере одного гриба и среды. По окончании смешивания удаляют от 30 до 90 масс. % среды и по меньшей мере одного гриба; затем добавляют от 30 до 90 масс. % указанной среды, причем указанная среда дополнительно содержит источник углерода. Этап способа, включающий добавление по меньшей мере одного источника углерода, и следующие за ним этапы повторяют от 2 до 100 раз при относительном содержании газа от 0,005 до 0,5. Изобретение обеспечивает повышение выхода целевого продукта, в частности бета-глюкана, при сохранении затрат на уровне, подходящем для промышленного масштаба производства. 5 з.п. ф-лы, 8 ил., 7 пр.

1. Способ культивирования Dothideomycetes, включающий смешивание грибов, принадлежащих к классу Dothideomycetes, и среды, содержащей источник органического азота и по меньшей мере один источник углерода, в течение периода времени от 24 до 400 ч, где указанный способ отличается тем, что:

i. среда представляет собой среду с содержанием сухого вещества, выбранным из диапазона от 0,1 до 0,3 масс. %, и содержащую менее 0,1 масс. % источника органического азота;

ii. по меньшей мере один источник углерода в концентрации от 1 до 20 масс. % добавляют до указанного смешивания грибов и среды, но после инокуляции указанной среды указанным по меньшей мере одним грибом, где этот гриб инокулируют с плотностью инокуляции, выбранной из диапазона от 0,01 г сухой массы клеток/л среды/л до 50 г сухой массы клеток/л;

iii. после указанного смешивания удаляют от 30 до 90 масс. % среды и по меньшей мере одного гриба;

iv. затем добавляют от 30 до 90 масс. % указанной среды, причем указанная среда дополнительно содержит источник углерода;

v. повторяют этапы ii) - iv) от 2 до 100 раз;

vi. по меньшей мере один из этапов ii) - v) и указанного этапа смешивания выполняют с относительным содержанием газа, выбранным из диапазона от 0,005 до 0,5.

2. Способ по п. 1, в котором содержание азота в среде выбирают из диапазона от 0,003 до 0,02 масс. %.

3. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором уровень pH поддерживают в диапазоне от 4,0 до 6,0 в течение всего процесса.

4. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором температуру Т поддерживают в диапазоне от 22 до 30°C в течение всего способа.

5. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором динамическую вязкость среды на этапе d) выбирают из диапазона от 40 до 600 мПа·с.

6. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором инокуляцию проводят в течение периода времени от 1 мин до 8 ч.