ШТАММ ГРИБА AUREOBASIDIUM PULLULANS - ПРОДУЦЕНТ ЭКЗОПОЛИСАХАРИДА Советский патент 1994 года по МПК C12P19/04 C12P19/10 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма гриба - продуцента внеклеточного полисахарида, предназначенного для изготовления различных лекарственных форм.

Цель изобретения - получение штамма гриба Aureobasidium pullulans ВКПМ F-371 (лабораторный номер 18а), способного к повышенному синтезу экзополисахарида, отличающегося по химическому строению, молекулярной массе и другим свойствам, от экзополисахаридов, синтезируемых известными штаммами.

Штамм получен путем естественного отбора культуры А. pullulans штамм 18, имеющийся в музее микроорганизмов кафедры микробиологии ЛХФИ. Исходный штамм, выделенный с поверхности гниющих ягод, рассевали на питательные среды (сусло-агар и глюкозо-пептонный агар) и отбирали варианты наиболее продуктивные по образованию полисахарида.

Штамм имеет следующую характеристику.

Культурально-морфологические признаки.

В жидких питательных средах (сусло, глюкозо-пептонная и "морфологическая" среды) в стационарных условиях через трое суток при 25^оС культура развивается в виде дрожжеподобных и мицелиальных клеток. Размер дрожжеподобных клеток - 3,35 х 5,83 мкм - 5,83 х 15,62 мкм, размер поперечника сечения мицелиальных клеток от 2,29 мкм до 7,92 мкм, одиночных дрожжеподобных клеток (бластоконидий) мало. В процессе развития культуры питательная среда слабо опалесцирует и на поверхности ее формируется кольцо в виде слизистой провисающей пленки желтовато-белого цвета (через 5-7 дней толщина пленки достигает 4-5 мм).

На "морфологическом" агаре штрих культуры через 8 суток роста при 25^оС светло-бежевый, бархатистый с однородной поверхностью, на суслоагаре штрих желтовато-белого цвета, слизистый, гладкий с небольшой опушенностью по краю. Через 30 дней начинается образование меланиноподобного пигмента.

На "морфологическом" агаре формируют гигантские колонии (выращивание в течение 30 суток при 20-21^оС) диаметром 40-50 мм, светло-бежевые, неоднородные, с кратерообразным бугорком в центре, бархатистые, кожистые, с неровным краем. На суслоагаре (через 30 суток, 20-21^оС) гигантские колонии диаметром до 80 мм желтовато-белого цвета, слизистые, по краю опушенные, с неоднородной поверхностью, секторноскладчатые в центре со звездчатой выпуклостью, кожистой консистенции, с неровным краем. После 2-3 недель роста колония чернеет, начиная с центра.

Физиолого-биохимические признаки.

Отношение к источникам углерода: интенсивно ассимилирует D-маннозу, D-глюкозу, глицерин, сахарозу, мальтозу, DL-фруктозу, крахмал растворимый, этанол, трегалозу; удовлетворительно растет при использовании D-ксилозы, D-арабинозы, L-рамнозы, маннита, раффинозы, α-метил-D-глюкозида, мелецитозы, i-инозита; слабо ассимилирует дульцит, лактозу, D-галактозу, D-рибозу, мелибиозу, целлобиозу, сорбит, салицин, лимонную и яблочную кислоты; не ассимилирует DL-сорбозу, инулин, молочную кислоту; не сбраживает D-глюкозу, D-галактозу, сахарозу, мальтозу, трегалозу, мелибиозу, лактозу, целлобиозу, мелицитозу, инулин, растворимый крахмал.

Отношение к источникам азота: используют нитраты, нитриты и аммонийные соли в качестве единственного источника азота в среде.

Хорошо растет на безвитаминной среде.

Осмотогрантен: растет на среде с 50% глюкозы.

Обладает высокой уреазной активностью, хорошо разжижает желатин, не гидролизует говяжий жир, умеренный кислотообразователь, чувствителен к актидиону в концентрации 1 мкг/мл, хорошо развивается на среде, содержащей NaCl в концентрации до 10%.

Аэроб.

Оптимальная температура - 24-26^оС, при 33^оС рост слабый, при 37^оС не растет.

При изучении физико-химических свойств и структуры полисахарида методами периодатного окисления и деградации по Смиту, метилирования, определения удельного вращения было установлено, что данный полимер представляет собой глюкан, содержащий 16,5% - 1-3, 56,0% - 1,4, 27,5% - 1,6 гликозидных связей (табл.2). Преобладают α-гликозидные связи. Данный полисахарид оригинален по своему химическому строению и отличается от известных полисахаридов культур А.pullulans.

Для определения возможного использования глюкана, образуемого предлагаемым штаммом, как вспомогательного вещества для изготовления различных лекарственных трав, определяют молекулярную массу, удельное вращение и относительную вязкость 0,1%-ного водного раствора полисахарида. Относительную вязкость определяют по отношению к дистиллированной воде в капиллярном вискозиметре Оствальда с диаметром 0,73 мм. Как следует из данных табл.1, полисахарид, образуемый штаммом ВКПМ F-371, по своим реологическим свойствам, молекулярной массе может быть использован как перспективное вспомогательное вещество для изготовления различных лекарственных форм, а также как самостоятельное лекарственное средство, например в качестве кровезаменителя после предварительного кислотного гидролиза глюкана до молекулярной массы 40-70 тыс. дальтон.

П р и м е р 1. Известный штамм А.pullulans 8 и предлагаемый штамм А. pullulans ВКПМ F-371 выращивают на регламентной среде Чапека-Докса с 5% сахара-рафинада и среде, где источником азота является сульфат аммония. Сначала штаммы выращивают на сусло-агаре в течение 7 суток при 25^оС. Выросшие культуры используют для засева посевных колб вместимостью 750 мл, содержащих 100 мл среды Чапека-Докса с 3% сахара-рафинада, либо среды с (NH₄)₂SO₄ и 3% сахара-рафинада. Для засева посевной питательной среды ведут приблизительно 1 см² мицелия гриба со скошенного сусло-агара. Выращивание посевного материала производят на качалке при 25^оС в течение 48 ч. Выросшим посевным материалом в количестве 5% по объему засевают ферментационные колбы вместимостью 750 мл, содержащие 200 мл среды Чапека-Докса или среды с (NH₄)₂SO₄.

Состав среды Чапека-Докса г/л: NaNO₃ 3,0 K₂HPO₄ 1,0 MgSO₄ ˙7H₂O 0,5 KCl 0,5 FeSO₄ 0,01 Cахар-рафинад 50,0
рН среды до стери- лизации 6,0-6,5
Среду готовят на дистиллированной воде и стерилизуют при 0,202 МПа (1 ати) в течение 40 мин. Продолжительность ферментации - 94-96 ч при 24±1^оС.

Состав среды с (NH₄)₂ SO₄ (г/л): (NH₄)₂ SO₄ 0,6 К₂НРО₄ 5,0 MgSO₄ ˙7H₂O 0,2 NaCl 1,0 Дрожжевой экстракт 0,4 Тиамин (В₁) 0,002 Сахар-рафинад 50,0
рН среды до стерилизации 6,4-6,6
Среду готовят на дистиллированной воде. Стерилизация среды при 0,202 МПа (1 ати) в течение 40 мин. Продолжительность ферментации - 94-96 ч при 24±1^оС. По окончании ферментации в культуральной жидкости определяют содержание нативного полисахарида (высушенная масса внеклеточного полисахарида совместно с клетками). Для этого в пробе культуральной жидкости, равной 10 мл, осаждают полисахариды вместе с клетками двумя объемами 96^о этилового спирта и осадок высушивают при 105^оС до постоянной массы. Исследуемые штаммы анализируют также по образованию чистого полисахарида. Содержание чистого полисахарида определяют путем отделения клеток продуцента от полисахарида на суперцентрифуге непрерывного действия типа С-44 при 28000 об/мин, расход жидкости - 0,2 л/мин. В супернатанте осаждают чистый полисахарид двумя объемами 96^о этанола. Осадок промывают этанолом, отжимают от жидкости и высушивают при 37^оС. Результаты сравнительного изучения известного и предлагаемого штаммов А.pullulans при ферментации на двух средах с разными источниками азота приведены в табл.2.

Из таблицы видно, что предлагаемый штамм превышает известный по продуктивности нативного и чистого полисахарида на среде с (NH₄)₂SO₄.

Кроме того, штамм А. pullulans ВКПМ F-371 развивается на среде с (NH₄)₂SO₄ в виде мицелиальных и дрожжеподобных клеток, а известный штамм на обеих исследуемых средах - в виде дрожжеподобных клеток, которые отделяются от полисахарида при сепарировании значительно хуже, чем более крупные конгломераты мицелия и бластоконидий. Следовательно, биомасса штамма ВКПМ F-371 выгодно отличает его от известного штамма в аспекте уменьшения трудоемкости процесса сепарирования клеток от биополимера.

П р и м е р 2. Штаммы, условие культивирования, как в примере 1, за исключением того, что в ферментационной среде в качестве источника углерода используют 10% гидролизата крахмала (декстрозный эквивалент - 93%).

Выход экзополисахарида после 5 суток ферментации представлен в табл.3.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма гриба - продуцента внеклеточного полисахарида, предназначенного для изготовления различных лекарственных форм. Цель изобретения получение штамма гриба Aureobasidium pullulans ВКПМ F-371 (лабораторный номер 18а), способного к повышенному синтезу экзополисахарида, отличающегося по химическому строению, молекулярной массе и другим свойствам от экзополисахаридов, синтезируемых известными штаммами. Полисахарид представляет собой глюкан, содержащий 16,5%-1,3-56,0%-1,4- и 27,5%-1,6-гликозидных связей. Вязкость 0,1% -ного водного раствора полисахарида - 2,0, молекулярная масса - около 2×10⁶ Da . После 4 суток выращивания на среде с сахаром, аммонием сернокислым, минеральными солями и дрожжевым экстрактом образуется до 17,4 г/л нативного и 8,9 г/л чистого полисахарида. 3 табл.

Штамм гриба Aureobasidium pullulans ВКПМF-371 - продуцент экзополисахарида.