ШТАММ ГРИБА AUREOBASIDIUM PULLULANS - ПРОДУЦЕНТ ЭКЗОПОЛИСАХАРИДА Советский патент 1994 года по МПК C12P19/04 C12P19/08 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма гриба - продуцента внеклеточного полисахарида, предназначенного для изготовления различных лекарственных форм.

Цель изобретения - получение штамма гриба Aureobasidium pullulans ВКПМ F-370 (лабораторный номер 16а), способного к повышенному синтезу экзополисахарида, отличающегося по химическому строению, молекулярной массе и другим свойствам от экзополисахаридов, синтезируемых известными штаммами.

Штамм получен путем естественного отбора культуры. А.pullulans штамм 16, имеющейся в музее микроорганизмов кафедры микробиологии ЛХФИ. Исходный штамм рассевали на питательные среды (сусло-агар, глюкозо-пептонный и "морфологический" агар) и отбирали варианты, наиболее продуктивные по образованию экзополисахарида.

Штамм имеет следующие характеристики.

Культурально-морфологические признаки.

В жидких питательных средах (сусло, глюкозо-пептонная и "морфологическая" среды) в стационарных условиях через трое суток при 25^оС культура развивается в виде дрожжеподобных (бластоконидий) и мицелиальных клеток. Размер бластоконидий (3,7 х 6,25) - (8,33 х 13,54) мкм, размер поперечника сечения мицелиальных клеток 3,75-8,33 мкм, одиночных дрожжеподобных клеток мало. В процессе развития культуры питательная среда слабо опалесцирует и на ее поверхности формируется кратерообразное кольцо в виде слизистой провисающей пленки желто-коричневого цвета, со временем чернеющее. Через 5-7 дней толщина пленки достигает 7-9 мм.

На "морфологическом" агаре штрих культуры через 7-8 суток роста при 25^оС розовато-бежевый, бархатистый, с опущенностью белого цвета по краю. На сусло-агаре штрих бело-черного цвета с небольшой опущенностью, морщинистый, влажный. Образование меланиноподобного пигмента начинается через 5-7 дней.

На морфологическом агаре формируются гигантские колонии (выращивание в течение 30 суток при 20-21^оС) диаметром 40-50 мм, черно-серые, неоднородные, с небольшой выпуклостью в центре кремового цвета, бархатистые, с неровным краем, кожистые. На сусле-агаре (через 30 суток при 20-21^оС) гигантские колонии достигают размера до 95 мм, черного цвета, складчато-секторные, с опущенным краем серого цвета, с неоднородной поверхностью, кожистые, при прикосновении крошащиеся.

Физиолого-биохимические признаки.

Отношение к источникам углерода: интенсивно ассимилирует D-маннозу, D-глюкозу, лактозу, D-арабинозу, сахарозу, глицерин, этанол, лимонную кислоту, мальтозу, маннит, растворимый крахмал; удовлетворительно pастет при использовании трегалозы, α-метил-D-глюкозида, мелецитозы; слабо ассимилирует DL-сорбозу, дульцит, D-галактозу, целлобиозу, раффинозу, DL-арабинозу, сорбит, i-инозит, яблочную кислоту, салицин; не ассимилирует инулин, D-рибозу, мелибиозу, молочную кислоту; не сбраживает D-глюкозу, D-галактозу, сахарозу, мальтозу, трегалозу, мелибиозу, лактозу, целлобиозу, α-метил-D-глюкозид, рафиннозу, мелецитозу, инулин, растворимый крахмал.

Отношение к источникам азота: использует нитраты, нитриты и аммонийные соли в качестве единственного источника азота в среде.

Хорошо растет на безвитаминной среде.

Осмотолерантен: растет на среде с 50% глюкозы. Обладает высокой уреазной активностью, хорошо разжижает желатин, гидролизует говяжий жир, умеренный кислотообразователь, хорошо развивается на среде, содержащей NaCl в концентрации до 10% , устойчив к актидиону (может расти при концентрации антибиотика 1000 мкг/мл).

Аэроб.

Оптимальная температура роста 24-26^оС, при 33^оС - рост слабый, при 37^оС - нет роста.

При изучении физико-химических свойств и структуры полисахарида, синтезируемого штаммом А. pullulans ВКПМ F-370, методами периодатного окисления и деградации по Смиту, метилирования, определения удельного вращения было установлено, что данный полимер представляет собой глюкан, содержащий 21% - 1,3, 52% - 1,4 и 27% - 1,6 гликозидных связей. Преобладают α-гликозидные связи. Полисахарид оригинален по своему химическому строению и отличается от известных полисахаридов культур А.pullulans.

Для определения возможного использования глюкана, образуемого предлагаемым штаммом, как вспомогательного вещества для изготовления различных лекарственных форм, определяли молекулярную массу, удельное вращение и относительную вязкость 0,1%-ного водного раствора полисахарида. Относительную вязкость определяли по отношению к дистиллированной воде в капиллярном вискозиметре Оствальда диаметром 0,73 мм. Как следует из данных табл.1, полисахарид, образуемый предлагаемым штаммом, по своим реологическим свойствам, молекулярной массе может быть использован как перспективное вспомогательное вещество для изготовления различных лекарственных форм, а также как самостоятельное лекарственное средство.

П р и м е р 1. Предложенный штамм А.pullulans ВКПМ F-370 и известный штамм. А.pullulans 8 выращивают на регламентной среде Чапека-Докса с 5% сахара-рафинада и среде, где источником азота является сульфат аммония. Сначала штаммы выращивают на сусле-агаре в течение 7 суток при 25^оС. Выросшую культуру используют для засева посевных колб вместимостью 750 мл, содержащих 100 мл среды Чапека-Докса с 3% сахара-рафинада, либо среды с (NH₄)₂SO₄ и 3% сахара-рафинада. Для засева посевной питательной среды берут приблизительно 1 см² мицелия гриба со скошенного сусла-агара. Выращивание посевного материала проводят на качалке при 25^оС в течение 48 ч. Выросшим посевным материалом в количестве 5% по объему засевают ферментационные колбы вместимостью 750 мл, содержащие 200 мл среды Чапека-Докса или среды с (NH₄)₂SO₄.

Состав среды Чапека-Докса, г/л: NaNO₃ 3,0 K₂HPO₄ 1,0 MgSO₄ x 7H₂O 0,5 KCl 0,5 FeSO₄ ˙5H₂O 0,01 Cахар-рафинад 50,0
рН среды до стерилизации 6,0-6,5
Среду готовят на дистиллированной воде и стерилизуют при 0,202 мПа (1 ати) 40 мин. Продолжительность ферментации 94-96 ч при 24±1^оС. Состав среды с (NH₄)₂SO₄, г/л: (NH₂)SO₄ 0,6 K₂HPO₄ 5,0 MgSO₄ ˙7H₂O 0,2 NaCl 1,0 Дрожжевой экстракт 0,4 Тамин 0,002 Сахар-рафинад 50,0
рН среды до
стерилизации 6,4-6,6
Среду готовят на дистиллированной воде, стерилизация среды при 0,202 мПа (1 ати) в течение 40 мин. Продолжительность ферментации 84-96 ч при 24±1^оС. По окончании ферментации в культуральной жидкости определяют содержание нативного полисахарида (высушенная масса внеклеточного полисахарида совместно с клетками). Для этого в пробе культуральной жидкости, равной 10 мл, осаждают полисахарид вместе с клетками двумя объемами 96^о этилового спирта и осадок высушивают при 105^оС до постоянной массы. Исследуемые штаммы анализируют также по образованию чистого полисахарида. Содержание чистого полисахарида определяют путем отделения клеток продуцента от полисахарида на суперцентрифуге непрерывного действия типа С-44 при 28000 об/мин, расход жидкости 0,2 л/мин. В супернатанте осаждают чистый полисахарид двумя объемами 96^о этанола. Осадок промывают этанолом, отжимают от жидкости и высушивают при 37^оС. Результаты сравнительного изучения известного и предложенного штаммов при ферментации на двух средах с разными источниками азота приведены в табл.2.

Из табл.2 видно, что на среде с (NH₄)₂SO₄ продуктивность предлагаемого штамма по образованию нативного и чистого экзополисахарида превышает продуктивность известного штамма.

Кроме того, штамм А. pullulans ВКПМ F-370 развивается на среде с (NH₄)₂SO₄ в виде мицелиальных и дрожжеподобных, которые отделяются от полисахарида при сепарировании значительно хуже, чем более крупные конгломераты мицелия и бластоконидий. Следовательно, биомасса предложенного штамма выгодно отличает этот штамм от известного штамма в аспекте уменьшения трудоемкости процесса сепарирования клеток от биополимера.

П р и м е р 2. Условия выращивания штамма, как в примере 1, за исключением того, что в ферментационной среде в качестве источника углерода используют 10% гидролизата крахмала (декстрозный эквивалент - 93%). Продолжительность ферментации 5 суток.

Данные по выходу экзополисахарида представлены в табл.3.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма гриба - продуцента внеклеточного полисахарида, предназначенного для изготовления различных лекарственных форм. Цель изобретения - получение штамма гриба Aureobasidium pullulans ВКПМ F-370 (лабораторный номер 16а), способного к повышенному синтезу экзополисахарида, отличающегося по химическому строению, молекулярной массе и другим свойствам от экзополисахаридов, синтезируемых известными штаммами. Полисахарид представляет собой глюкан, содержащий 21% - 1,3, 52% - 1,4 и 27% - 1,6 гликозидных связей. Вязкость 0,1%-ного водного раствора полисахарида 2,5, мол.м. около 1,3·10⁶ Da . После 4 сут выращивания на среде с сахаром, сернокислым аммонием, минеральными солями и дрожжевым экстрактом образуется до 18,6 г/л нативного и 9,2 г/л чистого полисахарида. 3 табл.

Штамм гриба Aureobasidium pullulans ВКПМ F-370 - продуцент экзополисахарида.