ШТАММ ГРИБА AUREOBASIDIUM PULLULANS - ПРОДУЦЕНТ ЭКЗОПОЛИСАХАРИДА Советский патент 1994 года по МПК C12P19/04 C12P19/08 

Описание патента на изобретение SU1559717A1

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма гриба - продуцента внеклеточного полисахарида, предназначенного для изготовления различных лекарственных форм.

Цель изобретения - получение штамма гриба Aureobasidium pullulans ВКПМ F-370 (лабораторный номер 16а), способного к повышенному синтезу экзополисахарида, отличающегося по химическому строению, молекулярной массе и другим свойствам от экзополисахаридов, синтезируемых известными штаммами.

Штамм получен путем естественного отбора культуры. А.pullulans штамм 16, имеющейся в музее микроорганизмов кафедры микробиологии ЛХФИ. Исходный штамм рассевали на питательные среды (сусло-агар, глюкозо-пептонный и "морфологический" агар) и отбирали варианты, наиболее продуктивные по образованию экзополисахарида.

Штамм имеет следующие характеристики.

Культурально-морфологические признаки.

В жидких питательных средах (сусло, глюкозо-пептонная и "морфологическая" среды) в стационарных условиях через трое суток при 25оС культура развивается в виде дрожжеподобных (бластоконидий) и мицелиальных клеток. Размер бластоконидий (3,7 х 6,25) - (8,33 х 13,54) мкм, размер поперечника сечения мицелиальных клеток 3,75-8,33 мкм, одиночных дрожжеподобных клеток мало. В процессе развития культуры питательная среда слабо опалесцирует и на ее поверхности формируется кратерообразное кольцо в виде слизистой провисающей пленки желто-коричневого цвета, со временем чернеющее. Через 5-7 дней толщина пленки достигает 7-9 мм.

На "морфологическом" агаре штрих культуры через 7-8 суток роста при 25оС розовато-бежевый, бархатистый, с опущенностью белого цвета по краю. На сусло-агаре штрих бело-черного цвета с небольшой опущенностью, морщинистый, влажный. Образование меланиноподобного пигмента начинается через 5-7 дней.

На морфологическом агаре формируются гигантские колонии (выращивание в течение 30 суток при 20-21оС) диаметром 40-50 мм, черно-серые, неоднородные, с небольшой выпуклостью в центре кремового цвета, бархатистые, с неровным краем, кожистые. На сусле-агаре (через 30 суток при 20-21оС) гигантские колонии достигают размера до 95 мм, черного цвета, складчато-секторные, с опущенным краем серого цвета, с неоднородной поверхностью, кожистые, при прикосновении крошащиеся.

Физиолого-биохимические признаки.

Отношение к источникам углерода: интенсивно ассимилирует D-маннозу, D-глюкозу, лактозу, D-арабинозу, сахарозу, глицерин, этанол, лимонную кислоту, мальтозу, маннит, растворимый крахмал; удовлетворительно pастет при использовании трегалозы, α-метил-D-глюкозида, мелецитозы; слабо ассимилирует DL-сорбозу, дульцит, D-галактозу, целлобиозу, раффинозу, DL-арабинозу, сорбит, i-инозит, яблочную кислоту, салицин; не ассимилирует инулин, D-рибозу, мелибиозу, молочную кислоту; не сбраживает D-глюкозу, D-галактозу, сахарозу, мальтозу, трегалозу, мелибиозу, лактозу, целлобиозу, α-метил-D-глюкозид, рафиннозу, мелецитозу, инулин, растворимый крахмал.

Отношение к источникам азота: использует нитраты, нитриты и аммонийные соли в качестве единственного источника азота в среде.

Хорошо растет на безвитаминной среде.

Осмотолерантен: растет на среде с 50% глюкозы. Обладает высокой уреазной активностью, хорошо разжижает желатин, гидролизует говяжий жир, умеренный кислотообразователь, хорошо развивается на среде, содержащей NaCl в концентрации до 10% , устойчив к актидиону (может расти при концентрации антибиотика 1000 мкг/мл).

Аэроб.

Оптимальная температура роста 24-26оС, при 33оС - рост слабый, при 37оС - нет роста.

При изучении физико-химических свойств и структуры полисахарида, синтезируемого штаммом А. pullulans ВКПМ F-370, методами периодатного окисления и деградации по Смиту, метилирования, определения удельного вращения было установлено, что данный полимер представляет собой глюкан, содержащий 21% - 1,3, 52% - 1,4 и 27% - 1,6 гликозидных связей. Преобладают α-гликозидные связи. Полисахарид оригинален по своему химическому строению и отличается от известных полисахаридов культур А.pullulans.

Для определения возможного использования глюкана, образуемого предлагаемым штаммом, как вспомогательного вещества для изготовления различных лекарственных форм, определяли молекулярную массу, удельное вращение и относительную вязкость 0,1%-ного водного раствора полисахарида. Относительную вязкость определяли по отношению к дистиллированной воде в капиллярном вискозиметре Оствальда диаметром 0,73 мм. Как следует из данных табл.1, полисахарид, образуемый предлагаемым штаммом, по своим реологическим свойствам, молекулярной массе может быть использован как перспективное вспомогательное вещество для изготовления различных лекарственных форм, а также как самостоятельное лекарственное средство.

П р и м е р 1. Предложенный штамм А.pullulans ВКПМ F-370 и известный штамм. А.pullulans 8 выращивают на регламентной среде Чапека-Докса с 5% сахара-рафинада и среде, где источником азота является сульфат аммония. Сначала штаммы выращивают на сусле-агаре в течение 7 суток при 25оС. Выросшую культуру используют для засева посевных колб вместимостью 750 мл, содержащих 100 мл среды Чапека-Докса с 3% сахара-рафинада, либо среды с (NH4)2SO4 и 3% сахара-рафинада. Для засева посевной питательной среды берут приблизительно 1 см2 мицелия гриба со скошенного сусла-агара. Выращивание посевного материала проводят на качалке при 25оС в течение 48 ч. Выросшим посевным материалом в количестве 5% по объему засевают ферментационные колбы вместимостью 750 мл, содержащие 200 мл среды Чапека-Докса или среды с (NH4)2SO4.

Состав среды Чапека-Докса, г/л: NaNO3 3,0 K2HPO4 1,0 MgSO4 x 7H2O 0,5 KCl 0,5 FeSO4 ˙5H2O 0,01 Cахар-рафинад 50,0
рН среды до стерилизации 6,0-6,5
Среду готовят на дистиллированной воде и стерилизуют при 0,202 мПа (1 ати) 40 мин. Продолжительность ферментации 94-96 ч при 24±1оС. Состав среды с (NH4)2SO4, г/л: (NH2)SO4 0,6 K2HPO4 5,0 MgSO4 ˙7H2O 0,2 NaCl 1,0 Дрожжевой экстракт 0,4 Тамин 0,002 Сахар-рафинад 50,0
рН среды до
стерилизации 6,4-6,6
Среду готовят на дистиллированной воде, стерилизация среды при 0,202 мПа (1 ати) в течение 40 мин. Продолжительность ферментации 84-96 ч при 24±1оС. По окончании ферментации в культуральной жидкости определяют содержание нативного полисахарида (высушенная масса внеклеточного полисахарида совместно с клетками). Для этого в пробе культуральной жидкости, равной 10 мл, осаждают полисахарид вместе с клетками двумя объемами 96о этилового спирта и осадок высушивают при 105оС до постоянной массы. Исследуемые штаммы анализируют также по образованию чистого полисахарида. Содержание чистого полисахарида определяют путем отделения клеток продуцента от полисахарида на суперцентрифуге непрерывного действия типа С-44 при 28000 об/мин, расход жидкости 0,2 л/мин. В супернатанте осаждают чистый полисахарид двумя объемами 96о этанола. Осадок промывают этанолом, отжимают от жидкости и высушивают при 37оС. Результаты сравнительного изучения известного и предложенного штаммов при ферментации на двух средах с разными источниками азота приведены в табл.2.

Из табл.2 видно, что на среде с (NH4)2SO4 продуктивность предлагаемого штамма по образованию нативного и чистого экзополисахарида превышает продуктивность известного штамма.

Кроме того, штамм А. pullulans ВКПМ F-370 развивается на среде с (NH4)2SO4 в виде мицелиальных и дрожжеподобных, которые отделяются от полисахарида при сепарировании значительно хуже, чем более крупные конгломераты мицелия и бластоконидий. Следовательно, биомасса предложенного штамма выгодно отличает этот штамм от известного штамма в аспекте уменьшения трудоемкости процесса сепарирования клеток от биополимера.

П р и м е р 2. Условия выращивания штамма, как в примере 1, за исключением того, что в ферментационной среде в качестве источника углерода используют 10% гидролизата крахмала (декстрозный эквивалент - 93%). Продолжительность ферментации 5 суток.

Данные по выходу экзополисахарида представлены в табл.3.

Похожие патенты SU1559717A1

название год авторы номер документа
ШТАММ ГРИБА AUREOBASIDIUM PULLULANS - ПРОДУЦЕНТ ЭКЗОПОЛИСАХАРИДА 1989
  • Юрлова Н.А.
  • Елинов Н.П.
  • Байко Т.В.
  • Зен Б.Г.
SU1559718A1
ШТАММ ГРИБА AUREOBASIDIUM PULLULANS 23 - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИСАХАРИДА АУБАЗИДАНА 1985
  • Елинов Н.П.
  • Коссиор Л.А.
  • Пронина М.И.
  • Ананьева Е.П.
RU1272699C
ШТАММ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА MYCELIOPHTHORA FERGUSII-ПРОДУЦЕНТ НЕЙТРАЛЬНЫХ ЦЕЛЛЮЛАЗЫ, БЕТА-ГЛЮКАНАЗЫ И КСИЛАНАЗЫ 2008
  • Синицын Аркадий Пантелеймонович
  • Окунев Олег Николаевич
  • Черноглазов Владимир Михайлович
  • Цурикова Нина Васильевна
  • Новожилов Евгений Всеволодович
  • Синицына Ольга Аркадьевна
RU2361915C1
ШТАММ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА ASPERGILLUS ACULEATUS - ПРОДУЦЕНТ КОМПЛЕКСА КАРБОГИДРАЗ, СОДЕРЖАЩЕГО КСИЛАНАЗЫ, БЕТА-ГЛЮКАНАЗЫ, ПЕКТИНАЗЫ И КСИЛОГЛЮКАНАЗЫ 2005
  • Окунев Олег Николаевич
  • Синицын Аркадий Пантелеймонович
  • Черноглазов Владимир Михайлович
RU2303057C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОСЕВНОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ 1994
  • Авчиева П.Б.
  • Винаров А.Ю.
  • Козлова И.А.
  • Яшина В.Н.
  • Первушина М.С.
RU2092557C1
Способ получения аубазидана 1986
  • Елинов Николай Петрович
  • Глазова Наталья Владимировна
  • Кравченко Сергей Борисович
  • Потехина Татьяна Сергеевна
  • Силуянова Надежда Александровна
SU1339129A1
ШТАММ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА Aspergillus foetidus BKM F 3890D - ПРОДУЦЕНТ КИСЛОЙ ПРОТЕАЗЫ И КОМПЛЕКСА КАРБОГИДРАЗ, СОДЕРЖАЩЕГО ПЕКТИНАЗУ (ПОЛИГАЛАКТУРОНАЗУ), КСИЛАНАЗУ, β-ГЛЮКАНАЗУ, АРАБИНАЗУ, ГАЛАКТАНАЗУ, КСИЛОГЛЮКАНАЗУ, САХАРАЗУ, α-L-АРАБИНОФУРАНОЗИДАЗУ, β-ГЛЮКОЗИДАЗУ И АМИЛАЗУ 2006
  • Окунев Олег Николаевич
  • Кошелев Анатолий Владимирович
  • Черноглазов Владимир Михайлович
  • Семенова Маргарита Викторовна
  • Синицын Аркадий Пантелеймонович
  • Синицына Ольга Александровна
RU2323973C1
ШТАММ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА TRICHODERMA LONGIBRACHIATUM - ПРОДУЦЕНТ ЦЕЛЛЮЛАЗ, БЕТА-ГЛЮКАНАЗ И КСИЛАНАЗ 2005
  • Окунев Олег Николаевич
  • Баккаревич Александра Олеговна
  • Синицын Аркадий Пантелеймонович
  • Черноглазов Владимир Михайлович
RU2303065C1
ШТАММ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА TRICHODERMA LONGIBRACHIATUM - ПРОДУЦЕНТ КОМПЛЕКСА КАРБОГИДРАЗ, СОДЕРЖАЩЕГО ЦЕЛЛЮЛАЗЫ, БЕТА-ГЛЮКАНАЗЫ, КСИЛАНАЗЫ, МАННАНАЗЫ И ПЕКТИНАЗЫ 2004
  • Окунев Олег Николаевич
  • Синицын Аркадий Пантелеймонович
  • Черноглазов Владимир Михайлович
  • Беккаревич Александра Олеговна
RU2287571C2
ШТАММ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА PENICILLIUM FUNICULOSUM - ПРОДУЦЕНТ КОМПЛЕКСА КАРБОГИДРАЗ, СОДЕРЖАЩЕГО ЦЕЛЛЮЛАЗЫ, БЕТА-ГЛЮКАНАЗЫ, КСИЛАНАЗЫ, ПЕКТИНАЗЫ И МАННАНАЗЫ 2002
  • Окунев Олег Николаевич
  • Синицын Аркадий Пантелеймонович
  • Черноглазов Владимир Михайлович
  • Соловьева Ирина Владимировна
RU2287570C2

Иллюстрации к изобретению SU 1 559 717 A1

Реферат патента 1994 года ШТАММ ГРИБА AUREOBASIDIUM PULLULANS - ПРОДУЦЕНТ ЭКЗОПОЛИСАХАРИДА

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма гриба - продуцента внеклеточного полисахарида, предназначенного для изготовления различных лекарственных форм. Цель изобретения - получение штамма гриба Aureobasidium pullulans ВКПМ F-370 (лабораторный номер 16а), способного к повышенному синтезу экзополисахарида, отличающегося по химическому строению, молекулярной массе и другим свойствам от экзополисахаридов, синтезируемых известными штаммами. Полисахарид представляет собой глюкан, содержащий 21% - 1,3, 52% - 1,4 и 27% - 1,6 гликозидных связей. Вязкость 0,1%-ного водного раствора полисахарида 2,5, мол.м. около 1,3·106 Da . После 4 сут выращивания на среде с сахаром, сернокислым аммонием, минеральными солями и дрожжевым экстрактом образуется до 18,6 г/л нативного и 9,2 г/л чистого полисахарида. 3 табл.

Формула изобретения SU 1 559 717 A1

Штамм гриба Aureobasidium pullulans ВКПМ F-370 - продуцент экзополисахарида.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 1994 года SU1559717A1

Авторское свидетельство СССР N 877939, кл
Способ гальванического снятия позолоты с серебряных изделий без заметного изменения их формы 1923
  • Бердников М.И.
SU12A1

SU 1 559 717 A1

Авторы

Юрлова Н.А.

Елинов Н.П.

Русских Т.Л.

Даты

1994-12-15Публикация

1988-01-08Подача