СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕМДЕСИВИРА И ФОСФОРАМИДАТЫ Российский патент 2021 года по МПК C07F9/24 C07H19/10 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области химико-фармацевтической промышленности и касается нового способа получения ремдесивира и новых фосфорамидатов. Предложенный способ получения характеризуется высоким выходом, химической и оптической чистотой полученной субстанции, а также простотой осуществления для реализации в промышленных масштабах. Полученный данными способами ремдесивир может использоваться в качестве противовирусного средства, например, в терапии новой коронавирусной инфекции COVID-19.

Уровень техники

В декабре 2019 года в городе Ухань (столица провинции Хубэй, Китай) произошла крупная вспышка, вызванная новым коронавирусом. Было установлено, что эта вспышка была вызвана коронавирусом типа 2 тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV-2) (F. Zhou, Т. Y. (2020). Clinical course and risk factors for mortality of adult inpatients with COVID-19 in Wuhan, China: a retrospective cohort study. Lancet, 10.1016 / S0140-6736(20)30566-3). Были зарегистрированы многочисленные клинические случаи SARS-CoV-2, которые были распределены между более чем половиной стран мира в течение менее чем 6-месячного периода. Нижние дыхательные пути являются основной мишенью инфекции SARS-CoV-2.

Коронавирусы (Coronaviridae) - это большое семейство РНК-содержащих вирусов, способных инфицировать человека и некоторых животных. У людей коронавирусы могут вызвать целый ряд заболеваний - от легких форм острой респираторной инфекции до тяжелого острого респираторного синдрома (ТОРС). В настоящее время известно о циркуляции среди населения четырех коронавирусов (HCoV-229E, -ОС43, -NL63 и -HKU1), которые круглогодично присутствуют в структуре ОРВИ, и, как правило, вызывают поражение верхних дыхательных путей легкой и средней степени тяжести. По результатам серологического и филогенетического анализа коронавирусы разделяются на три рода: Alphacoronavirus, Betacoronavirus и Gammacoronavirus. Естественными хозяевами большинства из известных в настоящее время коронавирусов являются млекопитающие¹ (Временные методические рекомендации Минздрава России «Профилактика, диагностика и лечение коронавирусной инфекции (COVID-19)», утвержденные Е.Г. Камкиным, версия 6 от 28.04.2020 г.)

До 2002 года коронавирусы рассматривались в качестве агентов, вызывающих нетяжелые заболевания верхних дыхательных путей (с крайне редкими летальными исходами). В конце 2002 года появился коронавирус (SARS-CoV), возбудитель атипичной пневмонии, который вызывал ТОРС у людей. Данный вирус относится к роду Betacoronavirus. Природным резервуаром SARS-CoV служат летучие мыши, промежуточные хозяева - верблюды и гималайские циветты. Всего за период эпидемии в 37 странах по миру зарегистрировано более 8000 случаев, из них 774 со смертельным исходом. С 2004 года новых случаев атипичной пневмонии, вызванной SARS-CoV, не зарегистрировано.

В 2012 году мир столкнулся с новым коронавирусом MERS (MERS-CoV), возбудителем ближневосточного респираторного синдрома, также принадлежащему к роду Betacoronavirus. Основным природным резервуаром коронавирусов MERS-CoV являются одногорбые верблюды (дромадеры). С 2012 г. по 31 января 2020 г. зарегистрировано 2519 случаев коронавирусной инфекции, вызванной вирусом MERS-CoV, из которых 866 закончились летальным исходом. Все случаи заболевания географически ассоциированы с Аравийским полуостровом (82% случаев зарегистрированы в Саудовской Аравии). В настоящий момент MERS-CoV продолжает циркулировать и вызывать новые случаи заболевания.

Новый коронавирус SARS-CoV-2 (название, присвоенное Международным комитетом по таксономии вирусов 11 февраля 2020 года) представляет собой одноцепочечный РНК-содержащийвирус, относится к семейству Coronaviridae, относится к линии Beta-CoV В. Вирус отнесен ко II группе патогенности, как и некоторые другие представители этого семейства (вирус SARS-CoV, MERS-CoV). Коронавирус SARS-CoV-2 предположительно является рекомбинантным вирусом между коронавирусом летучих мышей и неизвестным по происхождению коронавирусом. Генетическая последовательность SARS-CoV-2 сходна с последовательностью SARS-CoV по меньшей мере на 79%. Патогенез COVID-19 изучен недостаточно. Данные о длительности и напряженности иммунитета в отношении SARS-CoV-2 в настоящее время отсутствуют. Иммунитет при инфекциях, вызванных другими представителями семейства коронавирусов, не стойкий и возможно повторное заражение.

В отличие от случаев SARS в 2003 г. у некоторых пациентов с инфекцией SARS-CoV-2 не было продромальных симптомов инфекции верхних дыхательных путей (например, кашель, боль в горле, ринорея), связанных с виремией лабораторных нарушений (например, лейкопения, лимфопения, анемия, повышение уровня печеночных ферментов и молочной дегидрогеназы). В дополнение, неопределенная сезонность и инкубационный период инфекции SARS-CoV-2, колеблющийся между 2 и 14 днями, чрезвычайно затрудняют достижение ранней диагностики и своевременное начало лечения. Дети считаются значительно менее восприимчивыми к инфекции и имеют более мягкую степень тяжести заболевания, чем взрослые. Инфекция SARS-CoV-2 в настоящее время стала угрозой для общественного здравоохранения для людей во всем мире из-за высокого потенциала передачи и непредсказуемости прогрессирования заболевания. В России на 8 ноября зарегистрировано порядка 2 млн. случаев заболевания COVID-19, в мире - порядка 54 млн. случаев.

На сегодня, многочисленные противовирусные препараты, продолжают изучаться и разрабатываться в качестве потенциальных методов лечения COVID-19: во всем пире проводится несколько сотен клинических исследований. За последнее время был опубликован целый ряд обзоров по этиотропной фармакотерапии COVID-19.

Среди препаратов, которые в том числе находятся на стадии клинических исследований или зарегистрированы в некоторых странах, заслуживающих особого внимания, можно выделить - хлорохин, гидроксихлорохин, лопиновир/ритонавир, умифеновир и ремдесивир.

Ремдесивир - противовирусный препарат широкого спектра действия (разработан компанией Gilead Sciences, Inc), представляет собой нуклеотидный аналог (см. формулу ниже) и является пролекарством. 1 мая 2020 г. ремдесивир получил разрешение на экстренное использование (EUA) от FDA, на основании предварительных данных, продемонстрировавших более короткое время для реконвалесценции у госпитализированных пациентов (детей и взрослых) с тяжелым течением COVID-19.

1 мая 2020 года FDA выпустило EUA ремдесивира, чтобы разрешить экстренное использование препарата для лечения тяжелого COVID-19 (подтвержденного или подозреваемого) у госпитализированных взрослых и детей. Ранее этот препарат был исследован при лихорадке Эбола, но показал ограниченную эффективность. Ремдесивир, как было показано, ингибирует репликацию других коронавирусов человека в культурах клеток, включая коронавирусы SARS-CoV (2003 г.) и MERS-CoV (2012 г.). Эффективность ремдесивира на животных моделях также была показана и в отношении SARS-CoV, и MERS-CoV.

Ремдесивир исследовался в нескольких клинических испытания 3 фазы при COVID-19 в США, Южной Корее и Китае. Первые положительные результаты применения ремдесивира при COVID-19 были зарегистрированы в США в январе 2020 года.

EUA (emergency use authorisation / разрешение на экстренное использование) для ремдесивира было основано на данных предварительного анализе данных адаптивного клинического исследования при COVID-19 (АСТТ), которые были анонсированы 29 апреля 2020 года. Анализ включал 1063 госпитализированных пациента с поздней стадией COVID-19 и поражением легких. Показано, что пациенты, получившие ремдесивир, выздоравливали быстрее, чем пациенты, получавшие плацебо: время до выздоровления было на 31% меньше при применении ремдесивира (р<0,001). Среднее время до выздоровления составляло 11 дней у пациентов, получавших ремдесивир, по сравнению с 15 днями у тех, кто получал плацебо. Результаты также свидетельствуют о преимуществах ремдесивира в отношении влияния на частоту летальных исходов - 8% в группе ремдесивира по сравнению с 11,6% в группе плацебо, но без статистической значимости (р = 0,059) (NIH Clinical Trial Shows Remdesivir Accelerates Recovery from Advanced COVID-19. National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID). 2020 Apr 29).

Результаты исследования ACTT отличаются от другого рандомизированного исследования, проведенного в Китае, опубликованного до пресс-релиза NIH. Результаты этого рандомизированного двойного слепого плацебо-контролируемого многоцентрового исследования (n = 237; 158 - в группе ремдесивира и 79 - в группе плацебо) показали, что ремдесивир не был связан со статистически значимыми клиническими преимуществами, которые определялись как время до клинического улучшения, у взрослых госпитализированных пациентов с тяжелым течением COVID-19. Несмотря на отсутствие статистически значимой разницы, у пациентов, получавших ремдесивир, время до клинического улучшения было меньше, чем у пациентов, получавших плацебо (длительность симптомов до включения у пациентов составляла 10 дней или менее). Авторы пришли к выводу, что численное сокращение времени до клинического улучшения у ранее леченных требует подтверждения в более крупных клинических исследованиях.

Открытое исследование фазы SIMPLE 3 (n = 397) у госпитализированных пациентов с тяжелым течением COVID-19 показало аналогичное улучшение клинического статуса при использовании 5-дневного режима введения ремдесивира по сравнению с 10-дневным курсом, на 14-й день наблюдения (ОР: 0,75 (95% ДИ 0,51-1,12]). В этом исследовании время до клинического улучшения у 50% пациентов составляло 10 дней в группе 5-дневной терапии и 11 дней в группе 10-дневной терапии. Более половины пациентов в обеих группах лечения были выписаны из больницы к 14 дню. Исследование подтвердило возможность применения 5-дневного курса терапии ремдесивиром (Gilead Announces Results From Phase 3 Trial of Investigational Antiviral Remdesivir in Patients With Severe COVID-19. Gilead. 2020 Apr 29).

Вслед за США ремдесивир был одобрен во многих других странах для лечения COVID-19, включая Российскую Федерацию (зарегистрирован 14.10,2020 года). Ремдесивир используется в виде лиофилизата или концентрата с бетадекса сульфобутилатом натрия.

Основная проблема в доступности лечения ремдесивиром связана со сложностью синтеза ремдесивира, который представляет собой фосфорамидатное пролекарство нуклеозида с хиральным атомом фосфора в S-конфигурации.

В патенте ЕА 25252 предложено получение диастереомерной смеси S-изомера ремдесивира и его R-изомера диастереомера. Но у реакции низкий выход (21%) на достаточно дорогой нуклеозид, а также требуется дорогостоящее разделение на ВЭЖХ с хиральной колонкой. Су

В патенте ЕА 32239 для синтеза ремдесивира предложено получать хиральные фосфорамидаты с S-конфигурацией атома фосфора.

А уже полученные хиральные фосфорамидаты вводить в реакцию с необязательно защищенным нуклеозидом для получения ремдесивира.

Предложенный в патенте ЕА 32239 подход по синтезу ремдесивира существенно позволил повысить выход ремдесивира из расчета на нуклеозид (69%).

Однако учитывая дороговизну исходного нуклеозида, используемого в синтезе ремдесивира, а также дороговизну фосфорсодержащих соединений, используемых в синтезе фосфорамидатов, существует потребность в разработке новых способов синтеза ремдесивира и фосфорамидатов.

Таким образом, перед авторами настоящего изобретения стояла задача в расширена арсенала способов получения ремдесивира с использованием фосфорамидатов за счет получени) новых фосфорамидатов, для которых из рацемической смеси изомеров фосфорамидатов выкристаллизовывается S-изомер, необходимый для получения ремдесивира. Желательно, чтобы новые фосфорамидаты обеспечивали более высокие выходы ремдесивира, большую экономическую выгоду и большую экологичность способа получения ремдесивира.

Раскрытие изобретения

Поставленная задача решается тем, что авторами разработан способ синтеза ремдесивира по существу чистого от R-диастереомера ремдесивира, формулы (I)

где R1 и R2 вместе или по отдельности представляют собой Н или защитную группу, фосфорамидатом формулы (III)

где X представляет собой

снятие защитной группы, если R1 и R2 вместе не являются Н, с получением ремдесивира. В предпочтительном варианте осуществления изобретения X представляет собой

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения основание выбирают из третбутилмагния хлорида, N-метилимидазола, гидрида натрия, гексаметилдисилазана натрия, гексаметилдисилазана лития, диизопропиламида лития и третичных алкильных аминов формулы NR3R4R5, где R3, R4 и R5 представляют собой C₁-С₆ алкилы.

В наиболее предпочтительном варианте изобретения фосфорамидат формулы (III) может быть получен взаимодействием (S)-2-этилбутил-2-аминопропаноата или его фармацевтически приемлемой соли с дихлорфенилфосфатом и фенолом формулы Х-ОН, где X представляет собой

с получением фосфорамидата формулы (IV) в виде смеси диастереомеров:

с последующей перекристаллизацией из подходящего растворителя с получением фосфорамидата формулы (III), который представляет собой S-изомер.

В еще одном наиболее предпочтительном варианте изобретения R1 и R2 представляют собой Н или защитные группы, выбранные из бензильной, метилоксиметиленовой, триметилсилильной, третбутилдиметилсилильной, тетрагидропирановой, бензоильной, либо R1 и R2 взятые вместе образуют изопропилиденовую или бензилиденовую защитные группы.

Еще одним вариантом изобретения являются фосфорамидаты формулы (III) в виде (S)-изомеров по атому фосфора

где X представляет собой

Было неожиданно обнаружено, что указанные фосфорамидаты могут быть легко получены при перекристаллизации из диастереомерной смеси по атому фосфору фосфорамидатов.

Осуществление изобретения

В настоящем изобретении предложен способ получения ремдесивира, по существу чистого от R-диастереомера ремдесивира, формулы (I)

где R1 и R2 вместе или по отдельности представляют собой Н или защитную группу, с фосфорамидатом формулы (III)

где X представляет собой

снятие защитной группы, если R1 и R2 вместе не являются Н, с получением ремдесивира.

Реакцию взаимодействия нуклеозида формулы (II) с фосфорамидатом формулы (III) в присутствии основания проводят по известным методикам, например, раскрытым в ЕА 32239, ЕА 25252, которые включены в объем настоящего изобретения.

При этом используют в реакции взаимодействия сильные основания, предпочтительно выбранные из третбутилмагния хлорида, N-метилимидазола, гидрида натрия, гексаметилдисилазана натрия, гексаметилдисилазана лития, диизопропиламида лития и третичных алкильных аминов формулы NR3R4R5, где R3, R4 и R5 представляют собой C₁-С₆ алкилы.

При необходимости гидроксогруппы в положениях 3 и 4 остатка углевода в нуклеозиде формулы (II) могут быть защищены подходящими защитными группами (заместители R1 и R2). Наличие защитных групп способствует незначительному, но все же повышению выхода конечного ремдесивира (на 1-4%).

Подходящими для гидроксогрупп являются следующие защитные группы (заместители R1 и R2), выбранные из бензильной, метилоксиметиленовой, триметилсилильной, третбутилдиметилсилильной, тетрагидропирановой, бензоильной, либо для двух соседних групп может быть использованы изопропилиденовая или бензилиденовая защитные группы.

Устанавливаются и снимаются защитные группы в соответствии с методиками и условиями, известными в уровне техники (см., например, МакОми Дж., 1976, Защитные группы в органической химии). Например, силильные защиты устанавливаются обработкой соответствующих силилхлоридов в присутствии оснований (третичные амины), а снимаются при помощи источников фторида (например, тетрабутиламмония фторидом). Тетрагидропирановая, изопропилиденовая и бензилиденовая защитные группы устанавливаются и снимаются в защитных условиях. Бензильная группа устанавливается обычно обработкой бензилхлоридом в присутствии гидрида натрия, а снимается гидрогенолизом (например, водором на палладиевом катализаторе).

В данном изобретении для ассиметрических хиральных центров используется R/S-система номенклатуры энантиомеров. Так для хиральный центр, относящийся к атому фосфора С или Р, маркируют R или S согласно системе, в которой каждый заместитель на атоме Р определяется старшинством на основе атомного номера согласно правилам старшинства Кана-Ингольда-Прелога (КИП) (J. March, "Advanced Organic Chemistry", John Wiley & Sons (2007)). Правила КИП определяют наименьшее старшинство для конкретного заместителя на хиральном центре С или Р, имеющего наименьший атомный номер.

Например, в случае ремдесивира или фосфорамидата для Р хирального центра этот заместитель представляет собой N. Р-центр затем ориентируется так, что N-заместитель направлен от наблюдателя. Атомы или следующие ближайшие атомы, если есть, к трем атомам О, непосредственно связанным с Р, затем рассматриваются согласно правилам КИП. Если атомный номер этих атомов уменьшается по часовой стрелке, энантиомер маркируется как R. Если атомный номер этих атомов уменьшается в направлении против часовой стрелки, энантиомер маркируется как S.

Термин «по существу чистого от R-диастереомера ремдесивира» обозначает, что ремдесивир, имеющий формулу

не содержит R-диастереоизомер по атому фосфора (Р), либо его содержание не превышает 0,5% по данным ВЭЖХ. Столь низкий процент содержания R-диастереоизомера связан с тем, что в реакцию с нуклеозидом формулы (II) вводят полностью чистый S-изомер фосфорамидата формулы (III).

В рамках настоящего изобретения авторами было неожиданно установлено, что фосфорамидаты формулы (III) в виде S-изомера

где X представляет собой

могут быть легко получены посредством перекристаллизации из смеси диастереоизомеров фосфорамидатов формулы (IV):

где X такое, как определено выше.

Перекристаллизацию смеси диастереоизомеров фосфорамидатов формулы (IV) можно проводить в любых подходящих растворителях. Предпочтительно использовать в качестве растворителя для перекристаллизации углеводороды и эфиры (простые эфиры или сложные эфиры), в которых исходное соединение (IV) растворимо или умеренно растворимо. В качестве углеводородов могут использоваться любые жидкие алифатические и ароматические углеводороды, предпочтительно выбранные из пентана, гексана, гептана, октана, петролейного эфира, бензола, толуола, этилбензола, кумола, ксилолов (о-, м-, п-) или их изомеров (например, 2-метилпентан, 2,2-диметилгексан и другие) и смесей. Наиболее предпочтительно использовать алифатические углеводороды, выбранные из пентана, гексана, гептана, октана, петролейного эфира или их изомеров (например, 2-метилпентан, 2,2-диметилгексан и другие) и смесей. В качестве эфиров могут использоваться любые жидкие эфиры, предпочтительно, выбранные из диэтилового эфира, диизопропилового эфира, метилтретбутилового эфира, этилацетата.

При этом смесь диастереоизомеров фосфорамидатов формулы (IV) по изобретению можно получить взаимодействием (S)-2-этилбутил-2-аминопропаноата или его фармацевтически приемлемой соли с дихлорфенилфосфатом и фенолом формулы Х-ОН, где X представляет собой

Помимо используемых в настоящем изобретении фосфорамидатов формулы (IV), в которых X представляет собой

авторами настоящего изобретения были предприняты попытки получить дополнительно более 30 фосфорамидатов формулы (IV), где X представляет собой различные фенилы и дифенилы с акцепторными заместителями, отличными от вышеупомянутых значений X, однако они либо не образуют фосфорамидаты формулы (IV) (например, если X представляет собой 2,6-динитро-4-трифторметилфенил или 2,3,5,6-тетрафтор-2',3',4',5',6'-пентафтордифенил), либо не позволяют выкристаллизовать фосфорамидат формулы (III) в виде S-изомера (например, если X представляет собой 2,4,6-трибромфенил, 2,4-дибромфенил или 4-цианофенил), либо выкристаллизовывался R-изомер фосфорамидата (например, если X представляет собой 2,4,6-трихлорфенил или 3,5-дифтор-2,6-дихлорфенил).

Неожиданный факт того, что авторам удалось получить диастереомерные фосфорамидаты формулы (IV) и из них при помощи простой перекристаллизации S-изомеры фосфорамидатов формулы (III) только когда X представляет собой

определяет новизну и изобретательский уровень настоящего изобретения. Более того, использование фосфорамидатов формулы (III), в которых X представляет собой

позволило реализовать способ получения ремдесивира с выходами и оптической чистотой не меньшими, чем для известных в уровне техники способов (ЕА 32239).

Полученный согласно заявленному способу ремдесивир выделяют общепринятыми методами, например, отделяют от жидкой фазы при помощи фильтрования, при необходимости, сушат, например, в сушильном или вакуумном шкафу, предпочтительно, под вакуумом. Выделенный ремдесивир при необходимости измельчают и используют для получения готовой лекарственной формы (ГЛФ), например, в виде лиофилизата или концентрата.

При получении ГЛФ в виде лиофилизата или концентрата готовят раствор ремдесивира, полученного по настоящему изобретению, со вспомогательными веществами, такими как циклодекстрины (предпочтительно с бетадекса сульфобутилатом натрия). Для лиофилизата раствор подвергают лиофильной сушке.

Еще одним вариантом изобретения являются фосфорамидаты формулы (III)

где X представляет собой

ПРИМЕРЫ

Представленные ниже примеры иллюстрируют (без ограничения объема притязаний) наиболее предпочтительные варианты осуществления изобретения, а также подтверждают возможность получения ремдесивира и фосфорамидатов и достижения для них указанных технических результатов.

Пример 1. Получение диастереомерного фосфорамидата формулы (IV), в котором X представляет собой пентахлорфенил.

К раствору гидрохлорида (S)-2-этилбутил-2-аминопропаноата (9,74 г) в хлористом метилене (90.0 мл) При охлаждении (от -15 до -10°С) добавляли фенилдихлорфосфат (6,6 мл) и медленно прикапывали раствор N-метилимидазола (27,1 мл) в хлористом метилене (90,0 мл). Реакционную массу перемешивали (на магнитной мешалке, скорость 300 об/мин) при -15°С в течение 1,0 часа и прибавляли пентахлорфенол (9,02 г). Перемешивали 3 часа при охлаждении (от -15 до -10°С) и 16 часов при 23-25°С. Контролировали по ТСХ. Элюент CHCl₃/СН₃ОН=10/1.

После завершения реакции реакционную массу фильтровали на воронке Шотта, промывали водой (2×50 мл), 1N HCl (50 мл), раствором NaHCO₃ (2×50 мл) и рассолом (50 мл) и сушили над Na₂SO₄.

Получили 22,1 г (89,0%) белой кристаллической массы.

MS: 579 (М+1).

Пример 2. Получение диастереомерного фосфорамидата формулы (IV), в котором X представляет собой 2,3,5,6-тетрафторфенил.

К раствору гидрохлорида (S)-2-этилбутил-2-аминопропаноата (9,74 г) в хлористом метилене (90,0 мл) при охлаждении (от -15 до -10°С) добавляли фенилдихлорфосфат (6,6 мл) и медленно прикапывали раствор N-метилимидазола (27,1 мл) в хлористом метилене (90,0 мл). Реакционную массу перемешивали (на магнитной мешалке, скорость 300 об/мин) при -15°С в течение 1,0 часа и прибавляли 2,3,5,6-тетрафторфенол (8,7 г). Перемешивали 3 часа при охлаждении (от -15 до -10°С) и 16,0 часов при 23-25°С.Контролировали по ТСХ. Элюент CHCl₃/СН₃ОН=10/1.

После завершения реакции реакционную массу упаривали на ротационном испарителе. Остаток растворяли в этилацетате (50 мл), промывали водой (2×50 мл), 1N HCl (50 мл), раствором NaHCO₃ (2×50 мл) и рассолом (50 мл). Органический слой сушили над Na₂SO₄. Упаривали на ротационном испарителе.

Получили 16,15 г (88,0%) светлого масла.

MS: 478 (М+1).

Пример 3. Получение диастереомерного фосфорамидата формулы (IV), в котором X представляет собой 4-бром-2,3,5,6-тетрафторфенил.

К раствору гидрохлорида (S)-2-этилбутил-2-аминопропаноата (9,74 г) в хлористом метилене (90,0 мл) при охлаждении (от -15 до -10°С) добавляли фенилдихлорфосфат (6,6 мл) и медленно прикапывали раствор N-метилимидазола (27,1 мл) в хлористом метилене (90,0 мл). Реакционную массу перемешивали (на магнитной мешалке, скорость 300 об/мин) при -15°С в течение 1,0 часа и прибавляли 2,3,5,6-тетрафтор-4-бромфенол (9,5 г). Перемешивали 3 часа при охлаждении (от -15 до -10°С) и 16,0 часов при 23-25°С. Контролировали по ТСХ. Элюент CHCl₃/СН₃ОН=10/1.

После завершения реакции реакционную массу упаривали на ротационном испарителе. Остаток растворяли в этилацетате (50 мл), промывали водой (2×50 мл), 1N HCl (50 мл), раствором NaHCO₃ (2×50 мл) и рассолом (50 мл). Органический слой сушили над Na₂SO₄. Упаривали на ротационном испарителе.

Получили 15,77 г (85,5%) светлого масла.

MS: 557 (М+1).

Пример 4. Кристаллизация S-изомера фосфорамидата формулы (III), в котором X представляет собой пентахлорфенил.

1,0 г диастереомерной смеси пентахлорфенилзамещенного фосфорамидата формулы (IV), полученной в примере 1, растворяли при постоянном перемешивании в 12 мл смеси этилацетата и гексана в соотношении 2:10 в течение 12 часов. В результате выпало 0,45 г бежевых кристаллов S-изомера фосфорамидата формулы (III) (выход 45%).

Соотношение S/R=99,9/0,l (ВЭЖХ).

¹Н NMR (400 MHz, CDCl₃, 323К) δ 7,41-7,32 (m, 2Н), 7,30-7,17 (m, 3Н), 5.01 (hept, J=6.2 Hz, 1H), 4,24-3,89 (m, 3H), 1,59-1,42 (m, 4H), 1,40-1,31 (m, 4H), 0,88 (t, 6H).

LCMS (m/z) вычислено для C₂₁H₂₃Cl₅NO₅P 576.98, 578.98; найдено 576.71, 578.78.

Пример 5. Кристаллизация S-изомера фосфорамидата формулы (III), в котором X представляет собой 2,3,5,6-тетрафторфенил.

800 мг диастереомерной смеси 2,3,5,6-тетрафторфенилзамещенного фосфорамидата формулы (IV), полученной в примере 2, поместили в 8,8 мл смеси этилацетата и петролейного эфира в соотношении 1:10 и перемешивали в течение 12 часов. В результате выпало 409 мг бесцветных игольчатых кристаллов S-изомера фосфорамидата формулы (III) (выход 51%).

Соотношение S/R=99,8/0,2 (ВЭЖХ).

¹Н NMR (400 MHz, CDCl₃, 323К) δ 7.34-7.25 (m, 4Н), 7.23-7.16 (m, 1Н), 6.96-6.83 (m, 1H), 5.04 (hept, J=6.3 Hz, 1H), 4,22-3,89 (m, 3H), 1,58-1,42 (m, 4H), 1,41-1,30 (m, 4H), 0,86 (t, 6H). LCMS (m/z) вычислено для C₂₁H₂₄F₄NO₅P 476.14, 478.13; найдено 476.59, 478.51.

Пример 6. Кристаллизация S-изомера фосфорамидата формулы (III), в котором X представляет собой 4-бром-2,3,5,6-тетрафторфенил.

5,0 г диастереомерной смеси 4-бром-2,3,5,6-тетрафторфенилзамещенного фосфорамидата формулы (IV), полученной в примере 3, растворяли в 33 мл смеси этилацетата и гексана в соотношении 1:10 при перемешивании в течение 4 часов. В результате выпало 2,3 г бесцветных игольчатых кристаллов S-изомера фосфорамидата формулы (III) (выход 46%).

Соотношение S/R=99,8/0,2 (ВЭЖХ).

¹Н NMR (400 MHz, CDCl₃, 50°С) δ 7.40-7.32 (m, 2Н), 7.33-7.17 (m, 3Н), 5.06 (hept, J=6.3 Hz, 1Н), 4,22-3,89 (m, 3Н), 1,57-1,43 (m, 4H), 1,41-1,32 (m, 4H), 0,87 (t, 6H).

LCMS (m/z) вычислено для C₂₁H₂₃BrF₄NO₅P 555.03, 557.00; найдено 554.86, 556.96.

Пример 7. Получение ремдесивира из защищенного нуклеозида формулы (II) и фосфорамидата формулы (III), в котором X представляет собой пентахлорфенил.

К раствору исходного нуклеозида II (9.24 г, 0.028 моль), в котором гидроксогруппы в положениях 3 и 4 защищены ацетонидной группой, в сухом тетра гидрофура не (123.0 мл) добавляли трет-бутилмагния хлорид (20 масс % раствор в ТГФ (35.1 мл, 0.060 моль, 2.12 экв.)). Перемешивали (на магнитной мешалке 300 об/мин) 30 минут при температуре 23-25°С и прикапывали раствор S-изомера пентахлорзамещенного фосфорамидата формулы (III), полученного в примере 4 (18.155 г, 0.034 моль, 1.205 экв.) в ТГФ (308 мл). Перемешивали 96 часов.

Контроль протекания реакции осуществляли при помощи ТСХ. Элюент CHCl₃/СН₃ОН=5/1.

По окончании реакции добавили насыщенный раствор хлорида аммония (100 мл), удалили растворитель на роторном испарителе. Добавили этилацетат (700 мл). Промывали органический слой водой (2×150 мл), насыщенным раствором NaHCO₃ (5×150 мл) и рассолом (2×75 мл). Сушили над безводным сульфатом натрия. Затем осушитель отфильтровали, промыли этилацетатом (30 мл). Органический растворитель из фильтрата удалили на роторном испарителе. Полученный остаток представляет собой затвердевшее буроватое масло. Прибавили к нему тетрагидрофуран (100 мл), смесь охладили до примерно 0°С, прибавили 28 мл концентрированной соляной кислоты.

Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре до прекращения реакции (контроль ТСХ, элюент CHCl₃/CH₃OH=5/1).

После окончания реакции к реакционной смеси добавили насыщенный раствор гидрокарбоната натрия (300 мл) и этилацетат (100 мл). Органическую фазу промывали водой (2×150 мл), насыщенным раствором NaHCO₃ (5×150 мл) и рассолом (2×75 мл). Сушили над безводным сульфатом натрия. Затем осушитель отфильтровали, промыли этилацетатом (20 мл). Органический растворитель из фильтрата удалили на роторном испарителе. Полученный остаток хроматографировали на силикагеле (этилацетат с градиентом метанола от 0% до 25%). После удаления на роторном испарителе элюента, получили 11,99 г ремдесивира (выход 71%), содержание S-диастереомера составило 99,7% (ВЭЖХ).

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆, 323K) δ 8,08 (s, 1H), 7,36-7,28 (m, 3H), 7,23-7,14 (m, 3H), 7,08 (d, J=4,8 Гц, 1H), 4,71 (d, J=5,3 Гц, 1H), 4,45-4,34 (m, 2H), 4,32-4,24 (m, 1H), 4,14 (t, J=5,8 Гц, 1H), 4,08-3,94 (m, 2H), 3,91- 3,83 (m, 1H), 1,50-1,41 (m, 1H), 1,38-1,26 (m, 7H), 0,87 (t, J=7,5 Гц, 6H)

MS: 603 (M+l).

Пример 8. Получение ремдесивира из нуклеозида формулы (II) и фосфорамидата формулы (III), в котором X представляет собой 2,3,5,6-тетрафторфенил.

К раствору исходного нуклеозида (8,14 г, 0.028 моль) формулы (II), в котором R1 и R2 представляют Н, в сухом ацетонитриле (110 мл) добавляли раствор S-изомера 2,3,5,6-тетрафторфенилзамещенного фосфорамидата формулы (III), полученного в примере 5 (14.781 г, 0.034 моль, 1.205 экв.) в ацетонитриле (120 мл), добавили хлорид магния (2,66 г, 0.028 моль), смесь перемешивали 30 минут при комнатной температуре. Добавили диизопропилэтиламин (12,14 мл, 0.07 моль). После прекращения реакции (примерно через 6,5-8 часов) к реакционной смеси добавили этилацетат (200 мл) и насыщенный водный раствор хлорида аммония (200 мл). Органическую фазу отделили, промывали насыщенным водным раствором хлорида аммония (2 по 150 мл), рассолом и сушили надо сульфатом натрия. Затем осушитель отфильтровали, промыли этилацетатом (20 мл). Органический растворитель из фильтрата удалили на роторном испарителе. Полученный остаток хроматографировали на силикагеле (этилацетат с градиентом метанола от 0% до 25%). После удаления на роторном испарителе элюента, получили 11,82 г ремдесивира. (Выход 70,0%), содержание S-диастереомера составило 99,5% (ВЭЖХ).

¹Н NMR (400 MHz, DMSO-d₆, 323К) δ 8,08 (s, 1Н), 7,36-7,28 (m, 3Н), 7,23-7,14 (m, 3Н), 7,08 (d, J=4,8 Гц, 1H), 4,71 (d, J=5,3 Гц, 1H), 4,45-4,34 (m, 2H), 4,32-4,24 (m, 1H), 4,14 (t, J=5,8 Гц, 1H), 4,08-3,94 (m, 2H), 3,91- 3,83 (m, 1H), 1,50-1,41 (m, 1H), 1,38-1,26 (m, 7H), 0,87 (t, J=7,5 Гц, 6H)

MS: 603 (M+l).

Пример 9. Получение ремдесивира из нуклеозида формулы (II) и фосфорамидата формулы (III), в котором X представляет собой 4-бром-2,3,5,6-тетрафторфенил.

Реакцию получения осуществляли по аналогии с примером 8, выход составил 67%, содержание S-диастереомера составило 99,6% (ВЭЖХ).

Изобретение относится к способу получения ремдесивира, включающему взаимодействие в присутствии основания нуклеозида формулы (II)

где R1 и R2 вместе или по отдельности представляют собой Н или защитную группу, с фосфорамидатом формулы (III)

где X представляет собой

а также снятие защитной группы, если R1 и R2 вместе не являются Н. Также изобретение относится к фосфорамидатам формулы III. Предлагаемое изобретение позволяет получить ремдесивир с высоким выходом, химической и оптической чистотой, с использованием простотой технологии. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 9 пр.

1. Способ получения ремдесивира формулы (I)

где R1 и R2 вместе или по отдельности представляют собой Н или защитную группу, с фосфорамидатом формулы (III)

где X представляет собой

а также снятие защитной группы, если R1 и R2 вместе не являются Н.

2. Способ по п. 1, в котором X представляет собой

.

3. Способ по п. 1, в котором основание выбирают из группы, включающей третбутилмагния хлорид, N-метилимидазол, гидрид натрия, гексаметилдисилазан натрия, гексаметилдисилазан лития, диизопропиламид лития и третичные алкильные амины формулы NR3R4R5, где R3, R4 и R5 представляют собой С₁С₆ алкилы.

4. Способ по п. 1, в котором фосфорамидат формулы (III) получают взаимодействием (S)-2-этилбутил-2-аминопропаноата или его фармацевтически приемлемой соли с дихлорфенилфосфатом и фенолом формулы Х-ОН, где X представляет собой

,

с получением фосфорамидата формулы (IV) в виде смеси диастереомеров:

с последующей перекристаллизацией из подходящего растворителя с получением фосфорамидата формулы (III).

5. Способ по п. 1, в котором R1 и R2 представляют собой Н или защитные группы, выбранные из бензильной, метилоксиметиленовой, триметилсилильной, третбутилдиметилсилильной, тетрагидропирановой, бензоильной, либо R1 и R2, взятые вместе, образуют изопропилиденовую или бензилиденовую защитные группы.

6. Фосфорамидаты формулы (III)

где X представляет собой