Среда для культивирования клеток костного мозга, предназначенных для клеточной терапии Российский патент 2021 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для культивирования клеток костного мозга, используемых в персонифицированной клеточной терапии и тканевой инженерии.

В настоящее время одним из перспективных направлений регенеративной медицины является трансплантация стволовых и дифференцированных соматических клеток с целью восстановления структуры и функции поврежденного органа или ткани. Наибольшим регенераторным потенциалом обладает костный мозг, который является основным источником стволовых и прогениторных клеток. Производство препаратов для клеточной терапии включает в себя культивирование клеток in vitro, экспансию и селекцию разных типов клеток. Независимо от назначения клеточной культуры, ключевым фактором для получения жизнеспособных и функционально активных клеток является состав питательной среды, компоненты которой не оказывают негативного влияния на культивируемые клетки и обеспечивают безопасное использование клеточных и тканеинженерных продуктов.

Для культивирования клеток человека и животных обычно используют питательные среды, содержащие 5-10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС). Эта сыворотка содержит оптимальное соотношение факторов роста, гормонов и энергетических субстратов, необходимых для поддержания жизнеспособности клеток in vitro. В то же время хорошо известно, что питательные среды для культивирования клеток человека, предназначенных для клеточной терапии, не должны содержать ксеногенный материал, например, эмбриональную сыворотку или альбумин животного происхождения, так как существует риск инфицирования культивируемых клеток вирусами и прионами животных с последующим их переносом в организм человека [Нечаева Е.А., Радаева И.Ф., Думченко Н.Б., Сумкина Т.П., Богрянцева М.П., Сенькина Т.Ю. Вестник Пермского национального исследовательского политехнического университета. Химическая технология и биотехнология. 2018. №4. С. 85-97]. Кроме того, было показано, что длительное культивирование в присутствии сывороток животных может оказывать негативное влияние на свойства клеток различного происхождения [Патент на изобретение РФ №2620167 «Способ получения средства для стимуляции регенерации на основе продуктов секреции мультипотентных мезенхимных стромальных клеток человека», опубл. 23.05.2017].

Известна бессывороточная среда для культивирования мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, включающая в качестве компонента лизат тромбоцитов, что существенно увеличивает пролиферацию клеток [Astori G., Amati Е., Bambi F., Bemardi M., Chieregato К., Schaefer R., Sella S., Rodeghiero F. Platelet lysate as a substitute for animal serum for the ex-vivo expansion of mesenchymal stem/stromal cells: present and future // STEM CELL RESEARCH & THERAPY. 2016. Vol. 7. Paper No. 93. DOI: 10.1186/s13287-016-0352-х]. Показано, что в лизате, по сравнению с эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС), значительно выше концентрация эстрадиола, тестостерона, инсулина, тромбоцитарного фактора роста, трансформирующего фактора роста-pi и сосудистого эндотелиального фактора роста. Недостатком использования лизата тромбоцитов в составе бессывороточной среды является нестабильность его функциональных свойств в зависимости от способа получения, а также опасность заражения реципиента вирусами и патогенными микроорганизмами донора. Кроме того, после термической инактивации при 56°С лизат тромбоцитов, в отличие от ЭТС, теряет способность стимулировать пролиферацию клеток [Сергеева Н.С., Шанский Я.Д., Свиридова И.К., Кирсанова В.А., Ахмедова С.А., Кувшинова Е.А., Мейснер И.С. Гены и клетки. 2014. Т. 9. № 1. С. 77-85].

Известна бессывороточная среда для культивирования мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, используемых для реконструкции костных и хрящевых сегментов, отличающаяся тем, что для культивирования мезенхимальных стволовых клеток костного мозга среда включает в первом варианте фактор роста фибробластов (FGF-2) в количестве 1-10 нг/мл, линолевую кислоту 6 мкМ, аскорбиновую кислоту 50 мкг/мл, β-меркаптоэтанол 5×10^-5 М, трансферрин 20-50 мкг/мл, дексаметазон 10^-8 М, а также может дополнительно содержать эпидермальный фактор роста EGF в количестве 1-10 нг/мл, инсулин 5 мкг/мл, сывороточный альбумин человека 1%, минимально незаменимую среду Ham F-12; во втором варианте она включает FGF-2 в количестве 1-10 нг/мл, лейкемический ингибиторный фактор LIF и фактор стволовых клеток SCF по 5 нг/мл, пантотенат натрия 17 мкМ, биотин 33 мкм, селен 30 нМ и может дополнительно включать эпидермальный фактор роста EGF, тромбоцитарный фактор роста PDGFbb по 1-10 нг/мл, инсулиноподобный фактор роста IGF-I 5 нг/мл, аскорбиновую кислоту 50 мкг/мл, холестерин 30 мкг/мл, сывороточный альбумин человека 1-2%, β-меркаптоэтанол 5×10^-5 М, дексаметазон 10^-8 М, трансферрин 20-50 мкг/мл, минимально незаменимую среду Ham F-12 [патент на изобретение РФ № 2272839, Бессывороточная среда для культуры клеток, используемых для реконструкции костных и хрящевых сегментов (варианты), 2003. МПК C12N 5/00, C12N 5/08, C12R 1/91].

Известно использование для культивирования гемопоэтических недифференцированных стволовых клеток костного мозга ex vivo ростовой среды, включающей смесь цитокинов, состоящую из фактора роста стволовых клеток, лиганда тирозин киназы 3 из эмбриональной печени, тромбопоэтина, и иономицин [патент на изобретение РФ № 2360965 Способ увеличения количества гемопоэтических недифференцированных стволовых клеток пациента ex vivo. 2009. МПК C12N 5/08, G01N 33/48].

Недостатком двух вышеперечисленных сред для культивирования клеток костного мозга на основе бессывороточных сред является многокомпонентность состава, включение в состав белков ксеногенного происхождения, что затрудняет их использование для культивирования клеток человека, предназначенных для клеточной терапии.

Известно применение для культивирования клеток костного мозга крысы бессывороточной среды RPMI-1640, дополнительно содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, а также рекомбинантный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (ГКСФ) в качестве компонента питательной среды [Pykhtina М.В., Romanov V.P., Miroshnichenko S.M., Beklemishev A.B. Construction of a Pichia pastoris strain efficiently producing recombinant human granulocyte-colony stimulating factor (rhG-CSF) and study of its biological activity on bone marrow cells // Molecular Biology Reports. 2020 / Vol. 47. Issue 1. P. 607-620. DOI: 10.1007/s11033-019-05169-9]. Недостатком указанной среды является опасность контаминации патологическими агентами сывороточных сред или их добавок, какой является эмбриональная телячья сыворотка в составе вышеуказанной среды для культивирования клеток. Применение рекомбинантного ГКСФ в составе культуральной среды способствует пролиферации клеток костного мозга, преимущественно гранулоцитов, при этом сохраняется жизнеспособность клеток костного мозга, а биобезопасность его применения зависит от степени очистки от токсичных примесей.

Наиболее близким аналогом, принятым в качестве прототипа, является бессывороточная среда для культивирования клеток костного мозга, предназначенных для последующей клеточной терапии, содержащая воду, человеческий (в примере выполнения бычий) сывороточный альбумин от 1 до 8 мг/ мл, содержащий связанный с ним холестерин; трансферрин (в примере выполнения человеческий трансферрин) в количестве от 50 до 200 мкг/мл, эффективное количество инсулина (в примере выполнения бычий инсулин от 0,867 до 8,67 мкг/мл) и может дополнительно содержать, по меньшей мере один цитокин [патент США 5766951 Serum-free medium supporting growth and proliferation of normal bone marrow cells. 1998, МПК C12N 5/06, C12N 001/20, вариант по пункту 1 формулы изобретения].

Недостатком прототипа является содержание в составе среды трех и более белков ксеногенного происхождения (сывороточный альбумин, инсулин, трансферрин), общее содержание которых в бессывороточной среде составляет без учета содержания цитокина от 51,9 до 216,7 мкг/мл, что способствует возникновению побочных ксеногенных эффектов при последующей клеточной терапии.

Задачей, на решение которой направлено изобретение, является повышение уровня биобезопасности применения среды для культивирования клеток костного мозга, предназначенных для клеточной терапии, расширение арсенала средств, предназначенных для клеточной терапии.

Техническим результатом является снижение количества и содержания ксеногенных факторов, присутствующих в бессывороточной среде, при сохранении функциональной активности клеток костного мозга.

Решение изобретательской задачи достигается тем, что бессывороточная среда для культивирования клеток костного мозга содержит сывороточный аполипопротеин A-I (апоА-I) в количестве не менее 5 мкг/мл среды, рекомбинантный инсулин в количестве не более 10 мкг/мл среды.

Раскрытие сущности изобретения

Питательная среда для культивирования клеток костного мозга включает бессывороточную питательную среду для культивирования клеток, сывороточный аполипопротеин A-I (апоА-I) в количестве не менее 5 мкг/мл указанной среды, рекомбинантный инсулин в количестве не более 10 мкг/мл среды.

В качестве бессывороточной среды для культивирования клеток костного мозга может быть использована среда RPMI-1640 или подобные ей, например, MEM, ДМЕМ, F12 и др. [Трухан И.С. Питательная среда как ключевой фактор культивирования клеток млекопитающих // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2018. - № 12-1. С. 165-172; URL: https://applied-research.ru/ru/article/view?id=12541, дата обращения: 20.03.2020].

В составе заявленной среды используют апоА-I, выделенный из сыворотки крови. При использовании культуры клеток костного мозга для клеточной терапии предпочтительным является включение в состав питательной среды апоА-I, полученного из сыворотки крови донора, одновременно являющегося реципиентом клеток костного мозга при проведении клеточной терапии.

Заявленная культуральная среда включает рекомбинантный инсулин в количестве не более 10 мкг/мл среды. В качестве компонента среды для культивирования клеток костного мозга может быть использован рекомбинантный инсулин с высокой степенью очистки от токсичных примесей, например, рекомбинантный человеческий инсулин производства компании Serva (Германия), ОАО «Национальные биотехнологии» (Россия). Использование рекомбинантного инсулина позволяет исключить возможный ксеногенный эффект, обусловленный применением сывороточного инсулина.

Сочетание компонентов сывороточного апоА-I и рекомбинантного инсулина обеспечивает стимуляцию функциональной активности клеток костного мозга в заявленной культуральной среде при минимальном содержании в ней данных компонентов, что позволяет снизить побочный эффект ксеногенных факторов.

Перечень фигур

Фиг. 1. Электрофореграмма суммарной фракции ЛПВП и апоА-I, выделенных из плазмы крови человека с помощью процедуры, описанной в примере 1. Обозначения: 1 - апоА-1; 2 - ЛПВП; 3 - белки-стандарты.

Фиг. 2. Снижение скорости биосинтеза ДНК в процессе культивирования клеток костного мозга в бессывороточной питательной среде RPMI-1640 без добавок. По горизонтальной оси указана продолжительность культивирования клеток, по вертикальной оси - скорость включения [Н]-тимидина в ДНК.

Осуществление изобретения

Пример 1. Получение белка апоА-I из сыворотки крови человека и его биохимическая характеристика

Из 50-100 мл сыворотки крови человека выделяют фракцию липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) методом изоплотностного ультрацентрифугирования в растворе KBr при 105000 g [Mills G.L., Lane P.A., Weech P.K. In: Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology: a guidebook to lipoprotein technique / Eds. R.H. Burdon, R.H. Knippenberg P.H. Elsevier, Amsterdam, 1984. - Р. 18-116]. Из полученной фракции ЛПВП удаляют липиды смесью бутанол-диизопропиловый эфир [Cham В.Е., Knowlee B.R. A solvent system for delipidation of plasma or serum without protein precipitation / J. Lipid Res. 17. - 1976. - P. 176-181]. Из полученной белковой фракции выделяют основной белок ЛПВП, используя метод высаливания сульфатом аммония [Jiang L., Неа L., Fountoulakis М. Comparison of protein precipitation methods for sample preparation prior to proteomic analysis / Journal of Chromatography A, 1023. - 2004. - P. 317-320; Пыхтина М.Б., Иванов И.Д., Беклемишев А.Б. Разработка эффективных способов выделения аполипопротеина А-1 из плазмы крови человека. Биофарм. журн. - 2012. - Т. 4. - № 8.- С.37-45.]. Полученный концентрированный белок фильтруют через одноразовые стерильные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм, что позволяет отделить не только потенциально содержащиеся микроорганизмы, но и агрегаты белка. Чистоту выделенного белка и его молекулярную массу оценивают с помощью электрофореза в ПААГ по методу Лэмли, используя набор белковых маркеров. На основании литературных данных о молекулярной массе белков, входящих в состав ЛПВП [Sakata N., Hoshii Y., Nakamura Т., Kiyama M., Arai H., Omoto M., Morimatsu M., Ishihara Т. Colocalization of apolipoprotein AI in various kinds of systemic amyloidosis / J. Histochem Cytochem. 2005. - Feb; 53. - P. 237-42.], делают вывод о соответствии выделенного белка аполипопротеину А-1 (апоА-I). Как видно из фиг. 1, используемый метод позволяет очистить апоА-I от альбумина и минорных белков ЛПВП. С помощью данного способа из 100 мл сыворотки крови человека можно получить не менее 40 мг очищенного апоА-1.

Пример 2. Получение культуры клеток костного мозга для оценки влияния заявленной культуральной среды на функциональную активность клеток

Для демонстрации эффективности заявленной культуральной среды используют культуру клеток костного мозга экспериментальных животных. Клетки получают из бедренной кости крыс линии Wistar стандартным методом [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. Томск. - 1992]. Очистку костного мозга от эритроцитов и лейкоцитов проводят с помощью противоточного центрифугирования в элютриаторном роторе JE-5.0 центрифуги Avanti J-26XP («Beckman Coulter», США) при 2500 об/мин и скорости тока жидкости 14 мл/мин.

Полученную суспензию клеток, содержащую не более 3% эритроцитов и 5% лимфоцитов, культивируют в 24-луночных планшетах (2-5×10⁶ клеток на 1 лунку) в заявленной культуральной среде. Культивирование клеток проводят в СО₂ - инкубаторе («Соlе Parmer», США) в атмосфере, содержащей 5% СО₂ и 95% воздуха, при температуре 37°С.

Пример 3. Оценка функциональной активности клеток костного мозга при их культивировании в заявленной культуральной среде

В качестве интегрального показателя функциональной активности клеток в процессе культивирования используют определение скорости включения радиоактивно меченого предшественника [³Н]-тимидина («Изотоп», Россия) в ДНК [Dawson C.W., Young L.S. In vitro assays to study epithelial cell growth / Methods Mol Biol. - 2001. - Vol. 174. - P. 165-172.]. Данный показатель отражает скорость биосинтеза ДНК, что лежит в основе пролиферативной активности клеток, т.к. [³Н]-тимидин включается в ДНК в синтетической фазе (S-фазе) клеточного цикла. Для оценки данного показателя за 2 ч до окончания инкубации клеток в культуральную среду вносят по 2,0 мкКю/мл меченого предшественника [³Н]-тимидина. После лизиса клеток гомогенат клеток наносят на фильтры, которые проходят многоэтапную отмывку от не связавшейся метки. Радиоактивность проб измеряют с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика. Скорость включения меченого предшественника оценивают в импульсах (имп) в 1 мин на 10⁶ клеток или в % по отношению к контролю. Результаты представляют как среднее значение ± стандартное отклонение от трех независимых экспериментов, выполненных в трех параллелях. Оценку различий между выборками проводят с использованием непараметрического U-критерия Манна-Уитни.

Пример 4. Функциональная активность клеток костного мозга при культивировании в заявленной культуральной среде

В таблице 1 представлена оценка функциональной активности клеток костного мозга при культивировании в заявленной культуральной среде, включающей бессыворотную питательную среду RPMI-1640, 5 мкг/мл среды апоА-I, полученного из сыворотки крови человека согласно примера 1 и 10 мкг/мл среды рекомбинантного человеческого инсулина (производство компании Serva, Германия).

Культура клеток костного мозга получена согласно примеру 2. Оценка функциональной активности клеток костного мозга, выполненная согласно примеру 3, приведена в таблице.

В таблице 1 также дано сравнение функциональной активности клеток костного мозга при культивировании в заявленной культуральной среде в сравнении с контролем (RPMI-1640 без добавок), а также с другими составами культуральной среды на основе RPMI-1640, включающими сывороточный альбумин или сывороточный апоА-I или один из гормонов, выбранных из списка: кортизол, инсулин, β-эстрадиол, или сочетание одного из гормонов с сывороточным апоА-I. Для доказательства эффекта совместного использования сывороточного апоА-I и рекомбинантного инсулина в составе заявленной культуральной среды использовали то же их содержание в культуральных средах сравнения, если сывороточный апоА-I или рекомбинантный инсулин входили в состав этих сред.

Как видно из таблицы 1 и фиг. 2, культивирование клеток костного мозга в бессывороточной питательной среде RPMI-1640 без добавок не обеспечивает достаточного уровня функциональной активности клеток костного мозга и приводит к снижению скорости биосинтеза ДНК в процессе культивирования.

Как видно из таблицы 1, функциональная активность клеток костного мозга при культивировании в заявленной культуральной среде значительно превышает аналогичный показатель во всех других вышеуказанных культуральных средах сравнения. Например, культивирование клеток костного мозга в заявленной культуральной среде приводило к повышению скорости биосинтеза ДНК в клетках костного мозга в 4,5 раза по сравнению с контролем (RPMI-1640 без добавок). При культивировании клеток костного мозга в культуральной среде, включающей RPMI-1640 плюс сывороточный альбумин, данный показатель возрастал в 1,4 раза, а при культивировании в культуральной среде, включающей RPMI-1640 плюс кортизол - в 2,1 раза.

Вместе с тем, эффект добавления в бессывороточную среду одного из гормонов или его сочетания с сывороточным апоА-I имеет неоднозначный эффект. Так, эффект кортизола и сывороточного апоА-I при их совместном включении в состав среды заметно уменьшается, а эффект β-эстрадиола в сочетании с апоА-I несколько увеличивается, но не достигает совместного эффекта сывороточного апоА-I и рекомбинантного инсулина в заявленной культуральной среде.

Известно, что кортизол изменяет вторичную структуру молекулы апоА-I и его регуляторные свойства [Усынин И.Ф., Дударев А.Н., Печенкина А.Ю., Ткаченко Т.А., Мирошниченко С.М. Роль стероидных гормонов в изменении регуляторных свойств аполипопротеина А-1 // Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов. Материалы Восьмой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. Ответственный редактор В.А. Шкурупий. 2018. С. 167-169]. Установлено также, что модификация вторичной структуры апоА-I, например, при его окислении, может значительно снижать его влияние на синтез ДНК в культуре различных клеток [Usynin I.F., Dudarev A.N., Miroshnichenko S.M., Tkachenko T.A., and Gorodetskaya A. Yu. Effect of Native and Modified Apolipoprotein A-I on DNA Synthesis in Cultures of Different Cells // Bull Exp Biol Med. 2017 Dec; 164 (2), P. 247-251. doi: 10.1007/s10517-017-3967-8]. Влияние инсулина на конформацию апоА-I не изучено, и поэтому полученный совместный эффект сывороточного апоА-I и рекомбинантного инсулина в составе заявленной культуральной среды на функциональную активность клеток костного мозга с очевидностью не вытекает из уровня техники.

В таблице 2 приведены результаты влияния разных типов сывороток крови при их добавлении в бессывороточную культуральную среду RPMI-1640 на функциональное состояние клеток костного мозга. Культуру клеток костного мозга получали согласно примеру 2, оценку функционального состояния клеток костного мозга выполняли согласно примеру 3. В одном случае к бессывороточной среде RPMI-1640 добавляли 10% инактивированной при 56°С сыворотки крови человека, в другом - 10% инактивированной при таких же условиях эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС). Из таблицы 2 видно, что через 24 ч в присутствии сыворотки крови человека скорость включения [Н]-тимидина в ДНК возрастает с 734±89 (контроль) до 1401±213 (опыт) имп/мин на 10⁶ клеток, т.е. в 1,9 раза по сравнению с контролем (р<0,05). При внесении в среду ЭТС наблюдается еще более выраженный стимулирующий эффект: скорость включение [³Н]-тимидина в ДНК возрастает с 734±89 (контроль) до 2901±329 (опыт) имп/мин на 10⁶ клеток, т.е. в 4,0 раза по сравнению с контролем (р<0,05). Представленные результаты, с одной стороны, подтверждают известный факт, что наиболее выраженное стимулирующее действие на функциональную активность культивируемых клеток оказывает эмбриональная сыворотка животного происхождения, и этот эффект связан с тем, что эмбриональные сыворотки содержат наиболее оптимальное соотношение факторов роста, гормонов и энергетических субстратов, необходимых для поддержания жизнеспособности клеток в условиях in vitro. С другой стороны, сравнение эффекта заявленной среды для культивирования клеток костного мозга, показанного в таблице 1, с эффектом эмбриональной телячьей сыворотки показывает, что заявленная среда обеспечивает функциональную активность клеток костного мозга, по меньшей мере, не ниже, чем эмбриональная телячья сыворотка.

Таким образом, включение в состав бессывороточной культуральной среды сывороточного апоА-I совместно с рекомбинантным инсулином позволяет повышать функциональную активность клеток костного мозга до уровня, превышающего применение других сывороточных белков, включая альбумин, и гормонов, указанных в таблице 1, а также поддерживать указанную функциональную активность клеток на уровне, сравнимом с таковым при использовании эмбриональной сыворотки животного происхождения. Учитывая, что стимулирующий эффект сывороточного апоА-I совместно с рекомбинантным инсулином достигается при небольшой концентрации сывороточного апоА-I, это позволяет снизить в сравнении с прототипом содержание ксеногенных белков, а использование в составе заявленной питательной среды для культивирования клеток костного мозга апоА-I, выделенного из сыворотки крови донора, одновременно являющегося реципиентом при проведении клеточной терапии, позволит получить практически безопасную питательную среду для культивирования аутологичных клеток костного мозга в целях персонифицированной клеточной терапии и тканевой инженерии.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой среду для культивирования клеток костного мозга, предназначенных для клеточной терапии, включающую бессывороточную питательную среду, сывороточный белок, инсулин, отличающаяся тем, что среда для культивирования клеток костного мозга в качестве бессывороточной питательной среды содержит среду RPMI-1640, а в качестве сывороточного белка она содержит аполипопротеин A-I в количестве 5 мкг/мл среды, рекомбинантный инсулин в количестве 10 мкг/мл среды. Изобретение позволяет снизить количество и содержание ксеногенных факторов, присутствующих в бессывороточной среде, при сохранении функциональной активности клеток костного мозга. 2 ил., 2 табл., 3 пр.

Среда для культивирования клеток костного мозга, предназначенных для клеточной терапии, включающая бессывороточную питательную среду, сывороточный белок, инсулин, отличающаяся тем, что среда для культивирования клеток костного мозга в качестве бессывороточной питательной среды содержит среду RPMI-1640, а в качестве сывороточного белка она содержит аполипопротеин A-I в количестве 5 мкг/мл среды, рекомбинантный инсулин в количестве 10 мкг/мл среды.