УСТРОЙСТВО ДЛЯ АНАЛИЗА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ИЗ ОБРАЗЦОВ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА Российский патент 2021 года по МПК C12Q1/686 G01N21/01 G01N21/64 C12M1/38 

Область техники, к которой относится изобретение.

Изобретение относится к устройствам для анализа нуклеиновых кислот методом полимеразной цепной реакции с флуоресцентной регистрацией в режиме «реального времени». Изобретение может быть использовано в клинической лабораторной диагностике, а также в качестве элемента мобильной лаборатории, для выявления нуклеиновых кислот вирусов из образцов биологического материала.

В описании использованы следующие термины:

Мультиспектральный сенсор, представляет собой сборку единичных фотодиодов, расположенных в общем корпусе. На каждый фотодиод устанавливают собственный интерференционный светофильтр с полосами пропускания, соответствующими спектрам излучения применяемых флуорофоров. При этом для увеличения площади фоточувствительного элемента и равномерного распределения излучения в плоскости фокусировки, фотодиоды с фильтрами каждого спектрального диапазона могут быть объединены в группы.

ПЦР - полимеразная цепная реакция.

Уровень техники.

Известны устройства для анализа нуклеиновых кислот из образцов биологического материала.

Так из патента на изобретение см патент на изобретение № 2371721, опубликован 27.10.2009, известно устройство для диагностики биологических образцов, размещенных на прозрачном носителе, содержащее оптическую приемную систему, осветитель, узел позиционирования образца, содержащий отражающий элемент и прозрачный носитель, установленные друг перед другом вдоль направления оптической оси, и обеспечивающий размещение рабочей поверхности носителя в зоне освещения первого осветителя, размещение отражающего элемента и рабочей поверхности носителя на расстоянии, обеспечивающем прохождение падающего и отраженного света через прозрачный носитель в рабочей зоне оптической системы, отличающееся тем, что устройство дополнительно снабжено вторым осветителем, узел позиционирования образца выполнен с возможностью установки второго прозрачного носителя над поверхностью первого носителя вдоль направления оптической оси, плоскость которого перпендикулярна оптической оси, а рабочая поверхность размещена в зоне освещения, формируемой первым и вторым осветителями, при этом осветители снабжены светопоглощающим слоем для гашения отраженного света от поверхности носителя образца и от поверхности отражающего элемента.

В нем описана оптическая система, которая рассчитана только на одну длину волны. Такое устройство не может регистрировать спектры нескольких флуоресцентных красителей одновременно, то есть не может проводить одновременно анализ нескольких мишеней в пробе.

Из патента на изобретение см. патент на изобретение № 2658599, опубликован 21.06.2018, известна система термоциклирования для проведения полимеразной цепной реакции, содержащая размещенные в корпусе средства нагрева и охлаждения держателя тестируемых образцов, теплообменник и подключенные к контроллеру термодатчик и помпу циркуляции теплоносителя, отличающаяся тем, что корпус выполнен в виде цилиндрического элемента, имеющего основание, боковую цилиндрическую стенку и верхнюю панель для размещения держателя тестируемых образцов, средство нагрева держателя образцов выполнено в виде плоского электронагревательного элемента, установленного на верхней панели так, что его рабочая поверхность выполнена с возможностью теплового контакта с держателем образцов, а тыльная - обращена к средству охлаждения, выполненному в виде струйного оросителя в форме стакана с опорным фланцем по открытому краю, в днище которого по продольной оси стакана размещен патрубок с соплом подачи орошающей воды, а в боковой поверхности стакана - патрубок слива воды, соединенный с входом теплообменника, при этом выход теплообменника и патрубок подачи орошающей воды присоединены к помп.

Главный минус этой системы состоит в том, что ее эффективность зависит от температуры циркулирующий жидкости, которая нагревается с каждым термическим циклом и остывает только за счет теплообмена с окружающей средой. Поэтому по мере разогрева прибора уменьшается эффективность охлаждения вплоть до полной неработоспособности прибора.

Из уровня техники, а именно патента на изобретение № 2406764, опубликовано 20.12.2010, известно устройство для анализа нуклеиновых кислот из образцов биологического материала методом полимеразной цепной реакции с флуоресцентной регистрацией в режиме «реального времени», содержащее

• термоциклер для размещения исследуемого материала,

• оптическую систему, включающую сенсор и источник излучения, соединенные с

• микропроцессорным устройством управления.

Данное устройство является наиболее близкой по технической сути и достигаемому техническому результату и выбрано за прототип предлагаемого изобретения.

Недостатком этого прототипа и остальных аналогов является невысокая скорость нагрева/охлаждения термоциклера, отсутствие многоканальной регистрации и недостаточная компактность и мобильность устройства.

Раскрытие изобретения.

Настоящее изобретение представляет собой устройство для анализа нуклеиновых кислот методом полимеразной цепной реакции с флуоресцентной регистрацией сигнала в режиме «реального времени», позволяющее, обеспечить повышение удобства эксплуатации за счет компактности и мобильности устройства, а также обеспечить возможность многоканальной регистрации для анализа нескольких флуоресцентных меток в пробе одновременно.

Для достижения этой цели

• источник излучения выполнен в виде по меньшей мере двух светодиодов и интерференционных светофильтров, образующих не менее двух отдельных оптических каналов, каждый из которых используется для генерации оптического излучения как минимум одной длины волны;

• приемник излучения выполнен в виде мультиспектрального сенсора с возможностью одновременно регистрировать как минимум две спектральные полосы излучения флуоресценции;

• термоциклер оборудован термотрубками для переноса тепла на радиатор для отвода тепла в окружающую среду.

Все указанные новые признаки решают задачу повышения удобства эксплуатации устройства, кроме того обеспечивается мобильность и компактность устройства, а также возможность многоканальной регистрации сигналов флуоресценции для одновременного анализа нескольких мишеней в пробе.

Таким образом:

-  за счет использования миниатюрного мультиспектрального сенсора оптическая системы становится более компактной; не требуется использование громоздких оптических элементов таких как подвижный блок интерференционных фильтров или дихроические зеркала;

- предлагаемая система позволяет осуществлять одновременную регистрацию излучения нескольких флуоресцентных красителей;

- использование отводящих теплоносителей позволяет освободить место для размещения электронных компонентов, радиатор компактно и органично размещен по всей поверхности задней стенки прибора;

- отсутствуют вентиляционные отверстия, что позволяет обеспечить защиту прибора от пыли и влаги. Для устройства, назначение которого подразумевает работу и в полевых условиях вне стационарной лаборатории, это особенно актуально;

- устройство способно к автономной работе без использования внешнего компьютера, что дополнительно повышает мобильность. 

Существует преимущественный вариант исполнения данного устройства, при котором отдельные оптические каналы имеют по два светодиода с каждой стороны. Благодаря данным характеристикам появляется возможность увеличить количество используемых флуоресцентных красителей при сохранении минимальных габаритов прибора.

Существует еще один вариант исполнения данного устройства, при котором отдельные оптические каналы имеют многополосные интерференционные светофильтры. Благодаря данным характеристикам появляется возможность анализа нескольких флуоресцентных меток в пробе, что позволяет одновременно регистрировать наличие нескольких возбудителей различных заболеваний в пробе.

Существует также вариант исполнения данного устройства, при котором оно имеет выдвижной лоток для размещения чип-картриджа с исследуемым материалом. Благодаря данным характеристикам появляется возможность удобного размещения чипа-картриджа внутри прибора.

Существует еще один вариант исполнения данного устройства, при котором оно имеет автоматический привод прижима чип-картриджа с исследуемым материалом к теплопроводящему элементу, выполненному на базе элемента Пельте. Благодаря данным характеристикам обеспечивается равномерный тепловой контакт нагревательной пластины термоциклера с чипом-картриджем. Конструкция термоциклера с интегрированным элементом Пелтье также приводит к уменьшению толщины нагревательной пластины и избавлению от дополнительных термоконтактов, что позволяет увеличить скорость нагрева/охлаждения. Чип-картридж позволяет увеличить площадь контакта пробы с термоциклером, что ведет к более быстрому нагреву и охлаждению реакционной смеси.

Существует также вариант исполнения данного устройства, при котором микропроцессорное устройство управления соединено с сенсорным дисплеем, то есть выполненным с возможностью ввода данных при его касании пользователем. Благодаря данным характеристикам появляется возможность упрощения пользованием устройством, что также обеспечивает повышение удобства эксплуатации.

Существует еще один вариант исполнения данного устройства, при котором микропроцессорное устройство управления соединено с блоком подключения внешнего оборудования. Благодаря данным характеристикам появляется возможность подключения к внешнему компьютеру, а также для передачи результатов ПЦР на внешний Flash-накопитель.

Наконец, существует и такой вариант исполнения данного устройства, при котором микропроцессорное устройство управления соединено со световыми индикаторами режимов работы устройства, расположенными на внешней поверхности корпуса устройства. Благодаря данным выгодным характеристикам появляется возможность наглядной демонстрации режима работы устройства, что также обеспечивает повышение удобства эксплуатации устройства.

Краткое описание чертежей.

Другие отличительные признаки и преимущества данного изобретения ясно вытекают из описания, приведенного ниже для иллюстрации и не являющегося ограничительным, со ссылками на прилагаемые рисунки, на которых:

- фигура 1 изображает внешний вид устройства для анализа нуклеиновых кислот с частично снятым корпусом, согласно изобретению,

- фигура 2 изображает устройство оптической системы, согласно изобретению.

На фигурах обозначено:

1 – дисплей;

2 – плата обработки сигналов флуоресценции;

3 – плата световой индикации;

4 – оптическая система;

5 – лоток с чип-картриджем;

6 – одноплатный компьютер;

7 – прижим;

8 – термоциклер;

9 – радиатор;

10 – плата управления термоциклированием и периферийными устройствами;

11 – светодиоды возбуждения;

12 – мультиспектральный сенсор;

13 – светофильтры;

14 – плата подключения внешнего оборудования;

15 – фокусирующие линзы.

Согласно фигурам 1-2 устройство для анализа нуклеиновых кислот методом полимеразной цепной реакции с флуоресцентной регистрацией в режиме «реального времени» содержит термоциклер 8 для размещения исследуемого материала, оптическую систему 4, включающую приемник 12 и источник излучения, соединенные с микропроцессорным устройством управления, (представлена как отдельные платы 2, 10 и 6).

Приемник излучения может быть выполнен в виде мультиспектрального сенсора, а источник излучения выполнен в виде светодиодов возбуждения 11, образующих два отдельных оптических канала, соединенных с микропроцессорным устройством управления. Термоциклер 8 имеет термотрубки для переноса тепла на радиатор для отвода тепла в окружающую среду.

Отдельные оптические каналы могут иметь по два светодиода 11 с каждой стороны, а также имеют многополосные интерференционные светофильтры 13.

Оптическая система может содержать одну или несколько фокусирующих линз 15.

Устройство может иметь выдвижной лоток 5 для размещения чипа-картриджа с исследуемым материалом.

Устройство может иметь автоматический привод прижима 7 чипа-картриджа с исследуемым материалом к теплопроводящему элементу, выполненному на базе элемента Пельте.

Микропроцессорное устройство управления может быть соединено с сенсорным дисплеем, с блоком подключения внешнего оборудования и со световыми индикаторами 3 режимов работы устройства, расположенными на внешней поверхности корпуса устройства.

Осуществление изобретения.

Принцип работы устройства для анализа нуклеиновых заключается в следующем:

1) Чип-картридж с заправленной исследуемой пробой помещается в лоток, после чего лоток автоматически по нажатию кнопки заезжает внутрь устройства.

2) На сенсорном дисплее оператор выбирает необходимую программу амплификации и нажимает кнопку старт.

3) Оптический блок с помощью линейного актуатора (привода) опускается сверху на чип-картридж и плотно прижимает его к термоциклеру.

4) Начинается процесс амплификации. Он представляет собой циклическое изменение температуры нагревательной пластины, а, следовательно, и температуры жидкости в пробе в диапазоне 94 – 64°С. Один цикл нагрева - охлаждения длится примерно 1 минуту. Эта операция реализуется термоциклером 8 на базе элемента Пельтье. Все выделяемое тепло в процессе термоциклирования тепловыми трубками отводится на радиатор 9.

5) В процессе работы прибора после каждого цикла происходит измерение уровня флуоресценции флуоресцентных красителей, при этом интенсивность излучения говорит о первоначальном количестве интересующих молекул в исследуемом образце. В работе оптики устройства также есть новшества, главное из которых - использование приемного многоканального интерференционного светофильтра и использование приемного мультиспектрального датчика.

6) За вывод результатов измерений и управление всеми процессами отвечает одноплатный компьютер 6, результаты измерений выводятся на емкостной сенсорный дисплей 1.

7) За работу всех узлов отвечает несколько электронных плат, это платы управления термоциклированием и периферией (двигателем лотка, актуатором прижима, датчиками температуры, концевым выключателем и т.д.), плата обработки сигнала флуоресценции от оптического модуля, плата мультиспектрального сенсора, коммутационная плата USB, плата светодиодов индикации.

8) Кроме этого устройство оснащается двумя внешними USB-разъемами для передачи результатов ПЦР на внешний Flash-накопитель и подключения к внешнему ПК, Wi-Fi-модулем, системой безопасного отключения, светодиодами индикации режимов работы прибора.

Промышленная применимость.

В соответствии с предложенным изобретением изготовлен опытный образец устройства для анализа нуклеиновых кислот из образцов биологического материала.

Испытания опытного образца показали, что устройство обеспечивает возможность повышения удобства эксплуатации за счет компактности и мобильности.

Кроме того, далее приводятся основные функциональные характеристики опытного образца устройства, которые не являются ограничительными и приводятся как пример возможных параметров. Испытания опытного образца показали, что:

Устройство обеспечивает выполнение амплификации нуклеиновых кислот и регистрацию результатов анализа образцов, в которых флуоресцентные метки имеют максимумы поглощения в диапазоне 470-640 нм, а максимумы излучения в диапазоне 520 – 680 нм.

Устройство обеспечивает диапазон температур системы термоциклирования от 40°С до 98°С, с точностью ± 10°С.

Устройство обеспечивает неравномерность температуры нагревательного элемента не более 0.3°С.

Устройство обеспечивает скорость нагрева в диапазоне температур от 20°С до 99°С не менее (2.4±0,3) °С/с.

Устройство обеспечивает скорость охлаждения в диапазоне температур от 99°С до 55°С не менее (2.5±0,3) °С/с.

Устройство обеспечивает абсолютную точность поддержания температуры не хуже 0.3°С.

В устройстве охлаждающим устройством системы термоциклирования был элемент Пельтье, пассивный радиатор.

В устройстве нагревательным устройством системы термоциклирования был элемент Пельтье.

В устройстве источником возбуждения были три светодиода с длинами волн 470 нм, 635 нм и 580 нм. При этом при регистрации сигнала должны использоваться длины волн 520 нм, 560 нм, 610 нм и 680 нм.

Устройство имело цветной дисплей с управлением «touch screen» и разрешение 800 на 480, внешние разъемы USB.

Размеры чипа - не более 35,0 х 35,0 мм, масса чипа - не более 10 г.

Число каналов измерения флуоресценции в приборе - 4.

Устройство проводило анализ пробы за время не более 90 минут.

Объём одной пробы составлял от 25 до 50 мкл.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложено устройство для анализа нуклеиновых кислот. Устройство содержит термоциклер, оптическую систему с источником излучения и приемником, микропроцессорное устройство управления, выдвижной лоток для размещения чип-картриджа, автоматический привод прижима чип-картриджа к выполненному на базе элемента Пельтье теплопроводящему элементу и радиатор. Источник излучения выполнен в виде образующих не менее двух отдельных оптических каналов светодиодов и интерференционных светофильтров. Приемник излучения выполнен в виде мультиспектрального сенсора с возможностью одновременно регистрировать минимум две спектральные полосы излучения флуоресценции. Термоциклер оборудован термотрубками для переноса тепла на радиатор. Изобретение обеспечивает повышение удобства эксплуатации, мобильность и компактность устройства, возможность многоканальной регистрации сигналов флуоресценции для одновременного анализа нескольких мишеней в пробе. 4 з.п. ф-лы, 2 ил.

1. Устройство для анализа нуклеиновых кислот методом полимеразной цепной реакции с флуоресцентной регистрацией сигнала в режиме «реального времени», содержащее термоциклер для обеспечения необходимых температурных режимов исследуемого материала, оптическую систему, включающую источник излучения и приемник, соединенные с микропроцессорным устройством управления, отличающееся тем, что

• источник излучения выполнен в виде по меньшей мере двух светодиодов и интерференционных светофильтров, образующих не менее двух отдельных оптических каналов, каждый из которых используется для генерации оптического излучения как минимум одной длины волны;

• приемник излучения выполнен в виде мультиспектрального сенсора с возможностью одновременно регистрировать как минимум две спектральные полосы излучения флуоресценции;

• термоциклер оборудован термотрубками для переноса тепла на радиатор для отвода тепла в окружающую среду,

• устройство имеет выдвижной лоток для размещения чип-картриджа с исследуемым материалом и

• имеет автоматический привод прижима чип-картриджа с исследуемым материалом к теплопроводящему элементу, выполненному на базе элемента Пельтье, причем

• радиатор расположен перпендикулярно плоскости элемента Пельтье.

2. Устройство по п.1, отличающееся тем, что отдельные оптические каналы имеют многополосный интерференционный светофильтр.

3. Устройство по п.1, отличающееся тем, что микропроцессорное устройство управления соединено с сенсорным дисплеем.

4. Устройство по п.1, отличающееся тем, что микропроцессорное устройство управления соединено с блоком подключения внешнего оборудования.

5. Устройство по п.1, отличающееся тем, что микропроцессорное устройство управления соединено со световыми индикаторами режимов работы устройства, расположенными на внешней поверхности корпуса устройства.