Способ визуальной полуколичественной оценки экспрессии белка CDX-2 в тканях иммуногистохимическим методом Российский патент 2021 года по МПК G01N33/53 G01N1/30 

Ген сdx-2 относится к числу гомеозисных генов, критически важных для обеспечения и поддержания кишечной дифференцировки клеток [J. N. Freund et al., 2015]. Снижение его экспрессии приводит к снижению дифференцировки и экспрессии эпителиоцитами маркеров стволовых клеток (LGR5, BMI1, MSI1) [B. Pereira et al., 2013]. При этом полное исчезновение функции cdx-2, связанное с гомозиготной мутацией гена, является летальным, поскольку приводит к нарушению формирования кишечной трубки.

Помимо влияния на дифференцировку клеток, ген cdx-2 обладает и другими плейотропными эффектами. В частности, cdx-2 оказывает влияние на клеточную миграцию и модифицирует экспрессию молекул адгезии, участвующих в процессах взаимодействия клеток и субстрата, а также клеток между собой: E-кадгерина, LI-кадгерина, Mucdhl, клаудина 2, субъединицы интегрина-β4, цепи ламинина-γ2, гемидсомосомального белка, APC и α-актинина [M. Coskun, et al., 2010]. Кроме того, как фактор транскрипции белок CDX-2 способен тормозить деление клеток за счет связывания с богатыми тимином и аденином участками ДНК, индукции гена-супрессора клеточной пролиферации gut enriched Krupel-like factor ингибирования системы киназ [D. T. Dang et al., 2001].

Таким образом, описанное прямое участие cdx-2 в процессах клеточного деления и дифференцировки позволяет оценить его в качестве онкосупрессора.

Снижение и исчезновение его экспрессии, в частности, ассоциировано с неблагоприятным прогнозом при колоректальном раке [K. Slik et al., 2019]. Диагностическое значение имеет как снижение экспрессии cdx-2, так и появление его аберрантной экспресии. Так, наличие CDX-2-позитивных клеток в слизистой оболочке желудка указывает на изменение программы дифференцировки клеток с желудочной на кишечную и является маркером атрофии – предракового изменения, предшествующего развитию рака желудка (аденокарциномы).

Роль белка CDX-2 в регуляции клеточного цикла и канцерпротекции обусловливает важность его детекции в тканях. Оценку уровня экспрессии CDX-2 в тканях принято проводить иммуногистохимическим методом. Осуществляется она на основе распознавания ядерного окрашивания. Наиболее распространенным подходом является бинарная оценка экспрессии CDX-2 (окрашивание есть / окрашивания нет), позволяющая выделить случаи с полным отсутствием экспрессии CDX-2 с исчезновением его функций. Однако такой упрощенный подход не позволяет распознать ситуации, ассоциированные с развитием предраковых изменений или риском возникновения рака желудка, с учетом недостатка которого B. Peleteiroa и соавт. [B. Peleteiroa et al., 2012] предложили балльную полуколичественную систему оценки уровня экспрессии CDX-2. В их работе, используемой в качестве прототипа, предложено оценивать следующие показатели: процент клеток, экспрессирующих CDX-2 (экспрессия отсутствует (0% клеток), легкая (1–5%), умеренная (5–25%) или выраженная (> 25%)) и паттерн экспрессии (отсутствие – 0, изолированное окрашивание (<3 клеток) – 1, очаговое окрашивание (>3 клеток) – 2, железистое окрашивание (экспрессия в целых железах) – 3).

Такой подход обладает рядом недостатков.

1. Предполагает оценку двух изолированных параметров и не позволяет получить интегральный показатель экспрессии CDX-2 и ранжировать выраженность изменений в ткани.

2. Не учитывает случаи с неравномерной экспрессией CDX-2 в пределах исследуемого объема материала.

3. Низкое пороговое значение для распространенности метки (процента клеток, экспрессирующих CDX-2) приводит к искусственному завышению этого показателя.

Для преодоления недостатков был разработан собственный способ полуколичественной оценки результатов иммуногистохимической окраски белка CDX-2 в тканях. Предлагаемый способ основан на оценке полуколичественного индекса экспрессии CDX-2, учитывающей процент CDX-2-позитивных клеток в биоптате, интенсивность ядерного окрашивания и паттерн экспрессии.

Индекс экспрессии CDX-2 рассчитывается по формуле:

Индекс экспрессии CDX-2 = ПЭ + ПМ × ИМ,

где ПЭ – паттерн экспрессии, оцениваемый в исследуемом материале следующим образом: разрозненные позитивно окрашенные клетки (допускается до трех рядом расположенных клеток) – 1 балл, очаговая экспрессия более чем в трех рядом расположенных клеток без экспрессии во всех клетках железы соответствующей ей зоне покровно-ямочного эпителия – 2, линейная сплошная экспрессия во всей железе и соответствующей ей зоне покровно-ямочного эпителия – 3 балла.

ПМ – протяженность метки со следующей градацией, учитывающей процент CDX-2-позитивных клеток в биоптате: экспрессия отсутствует (0%) – 0 баллов, экспрессия очаговая (1-5%) – 1 балл, фокальная (5-25%) – 2 балла, мультифокальная (25-50%) – 3 балла, распространенная (более 50%) – 4 балла,

ИМ – интенсивность метки, оцениваемая следующим образом: отсутствие метки – 0 баллов; слабая интенсивность, соответствующая светло-коричневому окрашиванию ядра – 1 балл; выраженная интенсивность, соответствующая темно-коричневому окрашиванию ядра – 2 балла.

При сочетании паттернов и/или вариантов интенсивности окрашивания ядра расчет индекса CDX-2 проводится по преобладающему (доминирующему) компоненту.

Преимуществами предлагаемого метода являются.

1. Возможность применения способа в рутинной практике независимо от качества ориентировки биопсийного материала.

2. Позволяет получить интегральный показатель экспрессии CDX-2 и ранжировать выраженность изменений в ткани.

3. Учитывает случаи с неравномерной экспрессией CDX-2 в пределах исследуемого объема материала.

Оценка индекса экспрессии CDX-2 на примере фрагмента слизистой оболочки антрального отдела желудка с признаками очаговой кишечной метаплазии (Фигура 1). При проведении иммуногистохимической реакции в гистологических срезах тканей мы выявили, что позитивные меченые клетки преимущественно представлены во всей железе и соответствующей ей зоне покровно-ямочного эпителия (3 балла). Наличие 75% положительно окрашенных (окрашенных в коричневый цвет) ядер соответствует распространенной протяженности метки (более 50% позитивно окрашенных ядер в клетках в гистологическом препарате – 4 балла). Интенсивность ядерной метки равномерная и выраженная (2 балла). Таким образом, общий индекс экспрессии CDX-2 составил 3 + 4 × 2 = 11 баллов.

Оценка индекса экспрессии CDX-2 на примере фрагмента слизистой оболочки антрального отдела желудка с фенотипически неизмененным желудочным эпителием (Фигура 2). При проведении иммуногистохимической реакции в гистологических срезах тканей мы выявили, что позитивно мечение клетки формируют отдельные скопления из 3-5 линейно скомпонованных клеток (2 балла). Наличие 2% положительно окрашенных (окрашенных в коричневый цвет) ядер клеток соответствует очаговой метке (менее 5% положительно окрашенных ядер в срезе – 1 балл). Интенсивность ядерной метки была выражена равномерно и была низкой (1 балл). Таким образом, общий индекс экспрессии CDX-2 составил 2 + 1 × 1 = 3 балла.

При проведении пробной оценки индекса иммуногистохимической метки белка CDX-2 в гистологических срезах ткани с использованием предлагаемого способа в 131 исследуемом образце тканей слизистой оболочки желудка был получен разброс значений от 0 до 11, что коррелировало с выраженностью атрофических изменений (коэффициент ранговой корреляции Спирмена (r) = 0,4 при р=0,00001).

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммуногистохимическим методам исследования. Для оценки экспрессии белка CDX-2 в тканях проводят расчет индекса экспрессии, полученного путем суммирования паттерна экспрессии и произведения протяженности метки на интенсивность метки. Оценивают паттерн экспрессии по расположению позитивно окрашенных клеток. Оценивают протяженность метки, отражающую процент CDX2-позитивных клеток в исследуемом объеме материала. Оценивают интенсивность метки, отражающую окрашивание ядра. Способ позволяет получить интегральный показатель экспрессии CDX-2, ранжировать выраженность изменений в ткани, учитывать случаи с неравномерной экспрессией CDX-2 в пределах исследуемого объема материала, не зависимо от ориентировки биопсийного материала. 2 ил., 2 пр.

Способ визуальной полуколичественной оценки экспрессии белка CDX-2 в тканях иммуногистохимическим методом, отличающийся тем, что проводят расчет индекса экспрессии, полученного путем суммирования паттерна экспрессии и произведения протяженности метки на интенсивность метки, где оценивают паттерн экспрессии: при выявлении разрозненных позитивно окрашенных клеток допускается до трех рядом расположенных клеток – 1 балл, при очаговой экспрессии более чем в трех рядом расположенных клетках, без экспрессии во всех клетках железы соответствующей ей зоне покровно-ямочного эпителия – 2 балла, при линейной сплошной экспрессии во всей железе и соответствующей ей зоне покровно-ямочного эпителия – 3 балла; оценивают протяженность метки, отражающую процент CDX2-позитивных клеток в исследуемом объеме материала: при отсутствии экспрессии 0% – 0 баллов, при выявлении очаговой экспрессии 1-5% – 1 балл, при фокальной экспрессии 6-25% – 2 балла, при мультифокальной экспрессии 26-50% – 3 балла, при распространенной более 50% – 4 балла; оценивают интенсивность метки, отражающую полуколичественную визуальную оценку интенсивности метки, отражающую окрашивание ядра: при отсутствии метки – 0 баллов, при выявлении слабой интенсивности, соответствующей светло-коричневому окрашиванию ядра – 1 балл, при выраженной интенсивности, соответствующей темно-коричневому окрашиванию ядра – 2 балла; при этом в случае сочетания паттернов экспрессии и/или вариантов интенсивности метки расчет индекса CDX-2 проводят по доминирующему компоненту.