Способ получения высокоочищенного тетрадекапептида Российский патент 2021 года по МПК C07K7/08 C07K1/10 

Настоящее изобретение относится к области пептидной и фармацевтической химии, а именно к способу получения синтетического тетрадекапептида, представленного формулой (А)

и к его промежуточным продуктам.

Тетрадекапептид формулы «Н-Thr-Glu-Lys-Lys- Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu-ОН» (тетрадекапептид формула (A), HEP-I, пептид эзрина), состоящий их 14 аминокислотных остатков, обладает иммуномодулирующим и противовирусным действием.

Лиофилизированный фармацевтический препарат Гепон, содержащий пептид HEP-I, вызывает продукцию альфа- и бета-интерферонов, мобилизует и активирует макрофаги, ограничивает выработку противовоспалительных цитокинов (интерлейкины 1, 6, 8 и фактор некроза опухоли (ФНО)), стимулирует продукцию антител к различным антигенам инфекционной природы, подавляет репликацию вирусов, применяется в качестве лекарственного средства иммуномодулирующего и противовирусного средства применяемого для лечения ВИЧ-инфекции, лечения и профилактики оппортунистических инфекций, вызванных бактериями, вирусами или грибами, повышения иммунной защиты от инфекций, лечении инфекций слизистых оболочек и кожи, вызванных грибами Candida, профилактики кандидоза слизистых оболочек и кожи, в результате терапии антибиотиками, уменьшения воспаления (покраснение, отек, зуд, жжение, боль) слизистых оболочек и кожи, а также сухости слизистых оболочек. У пациентов, инфицированных ВИЧ, снижает концентрацию ВИЧ в клетках крови и в плазме, одновременно активирует иммунные реакции, специфичные в отношении ВИЧ: увеличивает содержание CD4+T клеток и NK-клеток, повышает функциональную активность нейтрофилов и CDS+Тклеток, являющихся ключевыми звеньями защиты организма от бактерий, вирусов и грибов, усиливает выработку антител, специфичных к антигенам ВИЧ, а также к антигенам возбудителей оппортунистических инфекций, предупреждает рецидивы оппортунистических инфекций. («Гепон, лиофилизат для приготовления раствора для приема внутрь», «Гепон, раствор для приема внутрь, раствор для местного и наружного применения», Р N000015/01, ЛСР-001794/07-300614).

Из патента РФ 2694906 (Ниармедик Интернэшнл Лимитед (CY). Дата подачи 01.06.2016) известны пептиды, полученные из эзрина, в частности пептид, содержащий аминокислотную последовательность согласно общей формуле (I) X₁EKKRRETVERE Х₂Х₃, где каждый X представляет собой остаток неполярной аминокислоты. Применение пептидов в качестве иммуностимулирующих агентов, а более конкретно, для применения в лечении и предотвращении противовирусных, антибактериальных и противогрибковых инфекций, и лечении заболеваний желудочно-кишечного тракта. Синтез пептидов в данном изобретении, в том числе и НЕР1, авторы предлагают осуществлять или твердофазным, или жидкофазным способом

Известен способ получения тетрадекапептида формулы (A) (HEP-I) (патент RU 2127599, Ниармедик, Лтд. (CY), 02.06.1995), который заключается в том, что его синтез осуществляется методом твердофазного синтеза путем ступенчатого наращивания пептидной цепи, начиная с С-концевой глутаминовой кислоты, связанной с полимерной матрицей, с использованием соответствующих N-трет-бутилоксикарбониламинокислот в присутствии конденсирующего агента с последующей обработкой полученного защищенного пептида деблокирующими агентами.

Однако, несмотря на то, что при твердофазном синтезе синтезируется тетрадекапептид с защитными группами, и затем осуществляется удаление из смолы и удаление всех защитных групп, с последующей очисткой препаративной ВЭЖХ, очистка требует крупномасштабного оборудования для препаративной системы ВЭЖХ и занимает много времени, места и финансовых затрат. Также ограничивающим фактором для промышленного производства является низкий выход продукта, отсутствие возможности аналитического контроля на всех стадиях синтеза и низкая производительность процесса.

Наиболее близким к заявляемому способу является жидкофазный метод синтеза (патент RU 2175973 С1, Гепвитания Лимитед (GB), 10.08.2000). Согласно этому методу тетрадекапептид может быть синтезирован следующим образом: пентапептид формулы Z-Thr(X)-Glu(X)-Lys(Y)-Lys(Y)-Arg-OH подвергают конденсации с нонапептидом формулы Arg-Glu(X)-Thr(X)-Val-Glu(X)-Arg-Glu(X)-Lys(Y)-Glu(X)-OX с получением защищенного тетрадекапептида формулы Z-Thr(X)-Glu(X)-Lys(Y)-Lys(Y)-Arg-Arg-Glu(X)-Thr(X)-Val-Glu(X)-Arg-Glu(X)-Lys(Y)-Glu(X)-OH, где X, Y, Z -водород или защитные группы, подвергаются взаимодействию с трифторуксусной кислотой, гидрируют в присутствии катализатора и выделяют конечный продукт, отличающийся тем, что X представляет собой третбутильную группу (But), Y- третбутилоксикарбонильную группу (Boc), a Z - бензил карбонил.

У указанного способа есть ряд недостатков. Например, получаемый таким образом конечный продукт содержит большое количество примесей из-за использования труднолетучего растворителя. Кроме этого, при использовании в качестве исходных веществ защищенных аминокислот конечный продукт сильно загрязнен продуктами рацемизации. Эти недостатки в результате приводят к низкому выходу самого тетрадекапептида формулы (А), кроме того, загрязненного побочными продуктами и остатками растворителей.

В качестве технической проблемы рассматривается необходимость усовершенствования способа синтеза НЕР1 для получения высокоочищенного тетрадекапептида формулы (А) с максимально возможным выходом продукта.

Техническая проблема решается способом получения тетрадекапептида треонил-глутамил-лизил-лизил-аргинил-аргинил-глутамил-треонил-валил-глутамил-аргинил-глутамил-лизил-глутамат формулы H-Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu-OH, отличающегося тем, что его получают реакцией конденсации пентапептида формулы Boc-Thr-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH с нонапептидом со свободной аминогруппой формулы H-Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut, при этом пентапептид Boc-Thr-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH получают из аргинина путем последовательного присоединения к нему N-сукцинимидилового эфира Nα-карбобензокси-Nε-трет-бутилоксикарбонил-L-лизина, N-сукцинимидилового эфира Nα-карбобензокси-Nε-трет-бутилоксикарбонил-L-лизина, N-сукцинимидилового эфира Nα-карбобензокси-γ-третбутилглутаминовой кислоты и пентафторфенилового эфира N-третбутилоксикарбонил-L-треонина, а нонапептид получают конденсацией пентапептида Z-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-ArgOH с трипептидом со свободной аминогруппой формулы Н-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut с последующей конденсацией с защищенным аргинином.

В результате усовершенствованного способа получения авторы настоящего изобретения получили высокоочищенный (не менее 98,5%) продукт с выходом не менее 54%.

Краткое описание чертежей:

Фигура 1 - масс-спектр MALDI-TOF для определения молекулярной массы основного иона.

Фигура 2 - масс-спектр MALDI-TOF- TOF для определения фрагментов b-ионов.

Фигура 3 - хроматограмма определения посторонних примесей методом ВЭЖХ.

Осуществление изобретения.

Сущность способа заключается в следующем: пентапептид Boc-Thr-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH конденсируют с нонапептидом со свободной аминогруппой формулы H-Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut, удаляют защитные группы, проводят хроматографическую очистку и лиофилизируют.

Способ получения тетрадекапептида формулы (А) включает в себя несколько стадий. Стадии 1 и 2 проводят независимо друг от друга в произвольном порядке.

Стадия 1: получение пентапептида Boc-Thr-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH.

Пентапептид Boc-Thr-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH получают из аргинина (может представлять собой L-аргинин) путем последовательного присоединения к нему N- сукцинимидилового эфира Nα-карбобензокси-Nε-трет-бутилоксикарбонил-L-лизина, N-сукцинимидилового эфира Nα-карбобензокси-Nε-трет-бутилоксикарбонил-L-лизина, N-сукцинимидилового эфира Nα-карбобензокси-γ-третбутилглутаминовой кислоты и пентафторфенилового эфира N-третбутилоксикарбонил-L-треонина. Конденсации проводят с помощью активированных эфиров. Защитные группы из защищенных промежуточных пептидов удаляют каталитическим.

Стадия 2: получение нонапептида Z-Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut с защищенной аминогруппой.

Его получают в несколько этапов:

1) конденсация дитретбутилового эфира глутаминовой кислоты в виде гидрохлорида и N-сукцинимидилового эфира Nα-карбобензокси-Nε-трет-бутилоксикарбонил-L-лизина с получением дипептида Z -Lys(Boc) -Glu(OtBut) - OtBut.

2) дипептид Z - Lys(Boc) - Glu(OtBut) - OtBut подвергают каталитическому гидрогенолизу, проводят конденсацию с N-сукцинимидиловым эфиром Nα-карбобензокси-γ-третбутилглутаминовой кислоты и получают трипетид Z-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut.

3) трипептид Z-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut подвергают каталитическому гидрогенолизу и получают трипептид со свободной аминогруппой формулы H-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut.

4) пентапептид Z-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-ArgOH получают из аргинина (может представлять собой L-аргинин) в виде свободного основания последовательным присоединением к нему N-сукцинимидилового эфира Nα-карбобензокси-γ-третбутилглутаминовой кислоты, N-сукцинимидилового эфира N-карбобензокси-валина, Nα-карбобензокси -L-треонингидразида и Nα-карбобензокси-γ-третбутилглутаминовой кислоты.

5) проводят конденсацию пентапептида Z-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-ArgOH с трипептидом со свободной аминогруппой формулы Н-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut с помощью дициклокарбодиимида (КДИ) и гидроксибензотриазола (НОВТ) с получением защищенного октапептида Z- Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut.

6) октапептид Z- Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut подвергают каталитическому гидрогенолизу в присутствии формиата аммония и получают октапептид со свободной аминогруппой формулы Н-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut.

7) октапептид со свободной аминогруппой формулы Н- Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut конденсируют с Na-карбобензокси-аргинином с помощью дициклокарбодиимида в присутствии гидроксибензотриазола и N-метилморфолина и получают защищенный нонапептид Z-Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut.

Стадия 3: получение тетрадекапептида формулы (А).

1. Нонапептид со свободной аминогруппой формулы H-Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut получают путем каталитического гидрогенолиза нонапептида Z-Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut

2. Пентапептид Boc-Thr-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH конденсируют с нонапептидом со свободной аминогруппой формулы H-Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut с помощью дициклокарбодиимида в присутствии гидроксибензотриазола и N-метилморфолина и получают защищенный тетрадекапептид формулы Z-Thr-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut.

Стадия 4: удаление защитных групп.

Защитные группы с защищенного тетрадекапептида удаляют трифторуксусной кислотой с последующей обработкой ионообменной смолой и получают тетрадекапептид формулы H-Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu-OH.

Стадия 5: хроматографическая очистка и лиофилизация.

Полученный тетрадекапептид H-Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu-OH очищают методом препаративной обращенно-фазовой хроматографии и лиофильно высушивают.

Преимущества заявленного способа синтеза перед выбранным прототипом:

1. Заявленный тетрадекапептид получают реакцией конденсации пентапептида формулы Boc-Thr-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH (по прототипу Z-Thr(X)-Glu(X)-Lys(Y)-Lys(Y)-Arg-OH) с нонапептидом со свободной аминогруппой формулы H-Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut (по прототипу Arg-Glu(X)-Thr(X)-Val-Glu(X)-Arg-Glu(X)-Lys(Y)-Glu(X)-OX) это позволяет снизить возможность рацемизации и образования побочных продуктов, в том числе стереоизомеров, оптимизировать стадию снятия защитных групп конечного тетрадекапептида.

2. При получении пентапептида Boc-Thr-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH вместо N-карбобензокси-О-трет-бутил-треонина используют пентафторфениловый эфир N-третбутилоксикарбонил-L-треонина, который самостоятельно получают из свободного треонина и ди-трет-бутилдикарбоната. Замена защищенной аминокислоты снижает возможность рацемизации и образования побочных продуктов, в том числе, стереоизомеров на стадии. Полученный пентапептид содержит меньше третбутильных групп, что позволяет оптимизировать стадию снятия защитных групп конечного тетрадекапептида.

3. При получении дипептида Z -Lys(Boc) - Glu(OtBut) - OtBut в качестве основного растворителя используется этилацетат, а не ДМФА. Этилацетат является более летучим, лучше отгоняется, соответственно его в значительно меньшем количестве остается в продукте.

4. При получении дипептида Z-Glu(OtBut)-Arg-OH в отличие от прототипа используют только 1 растворитель - ДМФА, выделение проводится с использованием воды, промежуточный продукт получается менее загрязненным органическими растворителями.

5. Нонапептид получают конденсацией пентапептида Z-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-ArgOH с трипептидом со свободной аминогруппой формулы H-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut с последующей конденсацией с защищенным аргинином. В используемом пентапептиде треонил не содержит дополнительной третбутильной группы, что позволяет оптимизировать стадию снятия защитных групп конечного тетрадекапептида.

6. При получении октапептида Z-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-ArgOH исключена стадия получения трипептида гидрохлорида HCl•Н-Glu(But)-Lys(Boc)-Glu(But)-OBut, это позволяет оптимизировать процесс синтеза: снизить потери на стадии, снизить возможность загрязнения органическими растворителями и побочными продуктами синтеза на стадии.

7. Для получения тетрапептида Z-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-OH используют Z-L-треонингидразид, что способствует снижению рацемизации и минимизирует риск образования оптических изомеров.

8. При снятии защитных групп тетрадекапептида не проводят каталитический гидрогенолиз, а используют ионообменную смолу, это существенно сокращает время проведения стадии, снижает потери при выделении продукта и количество использованных органических растворителей.

9. В отличие от прототипа, где используется только 3 системы для ТСХ, разработано 12 систем элюентов для ТСХ. Такой подход обеспечивает большую селективность и позволяет проводить тщательный постадийный контроль и оценивать полноту протекания реакций/качество отмывки для различных промежуточных продуктов.

Далее приведен пример конкретного воплощения изобретения. Данный пример служит для иллюстрации возможности осуществления заявленного способа и не являются исчерпывающим перечнем возможных вариантов синтеза.

1. Получение нонапептида Z- Arg-Glu(OtBut) - Thr -Val-Glu(OtBut)- Arg- Glu(OtBut)- Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut

Получение дипептида Z-Lys(Boc) - Glu(OtBut) - OtBut

170,0 г H-Glu(OtBut)-OtBut*HCl и 274,5 г Z -Lys(Boc)-OSu растворяют в 700,0 мл этилацетата, добавляют 81,0 мл триэтиламина и оставляют на 24 часа при постоянном перемешивании для протекания реакции при комнатной температуре. Контроль за ходом реакции ведут методом ТСХ в Элюенте 1. Добавляют 5,0 мл 3-диметиламинопропиламина, перемешивают, добавляют 0,5 л воды дистиллированной и 10,0 мл концентрированной соляной кислоты, перемешивают. Раствор фильтруют и промывают водой дистиллированной, контролируют уровень рН, упаривают до полной отгонки летучих компонентов при температуре 70°С.

Получают 360,3 г дипептида Z -Lys(Boc) - Glu(OtBut) - OtBut в виде масла.

Получение трипептида Z-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut.

360,3 г дипептида Z-Lys(Boc) - Glu(OtBut) растворяют в метаноле, гидрируют в присутствии угольно-палладиевого катализатора в течение 24 часов. Контроль полноты прохождения реакции гидрирования проводят методом ТСХ в Элюенте 1.

Полученную суспензию фильтруют, упаривают до прекращения отгонки летучих компонентов при температуре 64°С, добавляют 300 мл ДМФА. Получают дипептид со свободной аминогруппой H-Lys(Boc) -Glu(OtBut) - OtBut - раствор в ДМФА.

251,7 г Z - Glu(OtBut)-OSu растворяют в 400,0 мл этилацетата, добавляют к раствору дипептида со свободной аминогруппой H-Lys(Boc) -Glu(OtBut) - OtBut. Спустя 2 часа проводят контроль прохождения реакции методом ТСХ в Элюенте 2.

Добавляют 10,0 мл 3-диметиламинопропиламина для удаления избытка активированного эфира. Спустя 1 час добавляют 400 мл воды дистиллированной, 400 мл смеси этилацетат/вода (50:50), разделяют фазы, к органической фазе добавляют 300,0 мл этилацетата, 300,0 мл воды дистиллированной и 10,0 мл кислоты соляной концентрированной, контролируют уровень рН реакционной смеси. Органическую фазу промывают водой дистиллированной, контролируют уровень рН реакционной смеси. Органическую фазу упаривают до прекращения отгонки летучих компонентов при температуре 73°С. Добавляют 200,0 мл толуола и отгоняют при температуре в бане 83°С до прекращения конденсации растворителя. Добавляют 700,0 мл толуола, перемешивают без отгонки при температуре 81°С до полного растворения, охлаждают на ледяной бане. Спустя 24 часа смесь гомогенизируют, охлаждают жидким азотом, фильтруют, промывают 700,0 мл петролейного эфира и сушат при комнатной температуре. Получают 250,1 г трипептида Z-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut. Получение дипептида Z-Glu(OtBut)-Arg-OH.

К 217,0 г Z-Glu(OtBut)-OSu и 87,0 г L-аргинина добавляют 500,0 мл ДМФА, перемешивают при температуре 75°С до растворения. Оставляют на ночь для прохождения реакция, добавляют 700 мл воды дистиллированной, охлаждают при температуре -15°С в течение 3 часов, фильтруют. Контроль за выделением продукта ведут методом ТСХ в Элюенте 2. Получают 232,4 г дипептида Z-Glu(OtBut)-Arg-OH.

Получение трипептида Z-Val-Glu(OtBut)-Arg-OH.

223,1 г Z-Glu(OtBut)-ArgOH растворяют в метаноле, гидрируют в присутствии угольно-палладиевого катализатора. Контроль полноты прохождения проводят методом ТСХ в Элюенте 2. Суспензию фильтруют, упаривают до прекращения отгонки летучих при температуре 70°С, добавляют 300 мл ДМФА. Получают раствор дипептида со свободной аминогруппой Н-Glu(OtBut)-ArgOH в ДМФА.

157,5 г Z-Val-OSu растворяют в 500,0 мл ДМФА, добавляют к дипептиду со свободной аминогруппой H-Glu(OtBut)-ArgOH при перемешивании. Спустя 18 часов упаривают до отгона летучих компонентов при температуре бани 71°С.Добавляют 300,0 мл метилтретбутилового эфира, 1,0 кг льда, гомогенизируют, фильтруют, осадок промывают смесью метилтретбутилового эфира и воды сушат при комнатной температуре. Контроль выделения продукта осуществляют методом ТСХ в Элюенте 2 и Элюенте 4. Получают 225,6 г трипептида Z-Val-Glu(OtBut)-Arg-OH.

Получение тетрапептида Z-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-OH.

225,6 г трипептида Z-Val-Glu(OtBut)-Arg-OH растворяют в метаноле при температуре 80°С, гидрируют при комнатной температуре в присутствии угольно-палладиевого катализатора. Контроль полноты прохождения реакции проводят методом ТСХ в Элюенте 2. Суспензию фильтруют, упаривают до прекращения отгонки летучих компонентов при температуре 70°С, добавляют 300 мл ДМФА. Получают раствор трипептида со свободной аминогруппой Н-Val-Glu(OtBu)-Arg-OH в ДМФА.

178,9 г Z-Thr-N₂H₃ растворяют в 500,0 мл ДМФА, добавляют 70,0 мл воды и 83,0 мл трифторуксусной кислоты, перемешивают до полного растворения. Колбу охлаждают жидким азотом до температуры 0°С, добавляют по порциям 259,0 мл раствора хлористого водорода в диоксане, 78,2 мл BuONO. Перемешивание со скоростью 620 rpm ведут до установления постоянной температуры. При охлаждении добавляют по порциям 318,0 мл триэтиламина (для нейтрализации). Гомогенизируют полученную реакционную смесь при комнатной температуре. Получают Z-Thr-N₃.

В предварительно охлажденную колбу с раствором трипептида со свободной аминогруппой H-Val-Glu(OtBu)-Arg-OH) в ДМФА добавляют 77% полученного Z-Thr-N₃, определяют уровень рН. Колбу оставляют для прохождения реакции на 1 час при комнатной температуре. Добавляют 38,0 мл N-метилморфолина, перемешивают. Спустя 20 часов отбирают пробу для контроля полноты протекания реакции методом ТСХ в Элюенте 2 и 4.

Содержимое колбы упаривают до окончания отгонки летучих растворителей при температуре 70°С, добавляют 500,0 мл метилтретбутилового эфира, 1 кг льда, 0,5 л воды, перемешивают. Спустя 20 часов полученную смесь фильтруют, осадок сушат при комнатной температуре. Контроль за выделением продукта ведут методом ТСХ в Элюенте 2 и 4. Получают 271,2 г тетрапептида Z-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-OH.

Получение пентапептида Z-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-OH.

271,2 г Z-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-OH растворяют в метаноле при температуре 80°С, гидрируют в присутствии угольно-палладиевого катализатора при комнатной температуре в течение 6 часов. Контроль за ходом реакции осуществляют методом ТСХ в Элюенте 2 и Элюенте 4.

Полученную суспензию фильтруют, фильтрат упаривают до прекращения отгонки летучих компонентов при температуре 70°С, добавляют 300 мл ДМФА, упаривают до прекращения отгонки летучих компонентов. Получают раствор тетрапептида со свободной аминогруппой H-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-OH в ДМФА.

165,0 г Z-Glu(OtBut)-OSu растворяют в 500,0 мл ДМФА, переносят в колбу с раствором тетрапептида со свободной аминогруппой H-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-OH. Спустя 22 часа отбирают пробу для контроля полноты прохождения реакции методом ТСХ в Элюенте 2. Добавляют 1,5 л метилтретбутилового эфира и 1,5 кг льда, гомогенизируют, нагревают на водяной бане при температуре бани 60°С, охлаждают на ледяной бане. Контроль прохождения реакции осуществляют методом ТСХ в Элюенте 2. Осадок фильтруют, промывают водой дистиллированной, сушат при комнатной температуре.

Получают 206,2 г пентапептида (VI) Z-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-OH.

Получение октапептида Z-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut

185,4 г трипептида Z-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut. растворяют при нагревании в 500,0 мл метанола при температуре 72°С, гидрируют в присутствии угольно-палладиевого катализатора при комнатной температуре в течение 24 часов. Контроль полноты прохождения реакции осуществляют методом ТСХ в Элюенте 1. Полученную суспензию фильтруют, упаривают до прекращения отгонки летучих компонентов при температуре в бане испарителя 74°С, добавляют 200 мл ДМФА, упаривают до прекращения отгонки летучих компонентов. Получают раствор трипептида со свободной аминогруппой H-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut в ДМФА.

206,2 г Z-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-OH растворяют в 500,0 мл ДМФА, добавляют 300,0 мл ДМСО.

62,0 г НОВТ добавляют в колбу с раствором пентапептида Z-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-OH, перемешивают, добавляют раствор трипептида со свободной аминогруппой H-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut в ДМФА, перемешивают, отгоняют при температуре 74°С, охлаждают на ледяной бане.

65,0 г КДИ растворяют в 50,0 мл ДМФА, добавляют к реакционной массе, охлаждают на ледяной бане. Спустя 20 часов отбирают пробу для контроля полноты прохождения реакции методом ТСХ в Элюенте 1 и Элюенте 4. Содержимое колбы фильтруют, фильтрат упаривают на 2/3 объема при температуре в бане испарителя 71°С, добавляют 200,0 мл ДМФА, упаривают до прекращения отгонки летучих компонентов. Добавляют 500,0 мл метилтретбутилового эфира и 500,0 мл петролейного эфира, 600,0 мл 8,3% раствора Na₂CO₃ в воде дистиллированной, около 1,0 кг льда, гомогенизируют, фильтруют. Получают октапептид Z- Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut в виде осадка.

Получение нонапептида Z-Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut.

Октапептид Z-Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut растворяют в 2,0 л изопропанола при температуре 77°С. Концентрированной соляной кислотой при непрерывном перемешивании доводят содержимое колбы до рН=4,5-5,0. Гидрируют в присутствии угольно-палладиевого катализатора при комнатной температуре в течение 20 часов. Содержимое колбы нагревают, температура мешалки около 120°С, добавляют по порциям 50,0 мл формиата аммония, перемешивают в течение 20 минут. Контроль полноты прохождения реакции осуществляют методом ТСХ в Элюенте 1 и Элюенте 4. Фильтруют, фильтрат упаривают до прекращения отгонки летучих компонентов при температуре 77°С.

100,0 мл концентрированной соляной кислоты растворяют в 600,0 мл воды дистиллированной, контролируют рН с помощью рН-метра, при непрерывном перемешивании по порциям добавляют 200,0 мл пиридина.

Добавляют полученный раствор гидрохлорида пиридина в воде к реакционной смеси. Добавляют 1,0 л метилтретбутилового эфира, 1,2 л петролейного эфира и около 1,0 кг льда, гомогенизируют, фильтруют. Осадок на фильтре промывают 500,0 мл петролейного эфира, 600,0 мл воды дистиллированной.

Получают октапептид со свободной аминогруппой H-Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut.

86,0 г Z-Arg-OH растворяют в 400,0 мл ДМФА, добавляют 60,0 мл раствора хлористого водорода в диоксане, перемешивают.

Октапептид со свободной аминогруппой Н- Arg-Glu(OtBut) - Thr -Val-Glu(OtBut)- Arg- Glu(OtBut)- Lys(Boc)- Glu(OtBut)-OtBut растворяют в 600,0 мл ДМФА, добавляют 62,0 г НОВТ, раствор Z-Arg-OH в ДМФА, упаривают до прекращения отгонки летучих компонентов при температуре 74°С, охлаждают на ледяной бане, добавляют 30,0 мл N-метилморфолина.

65,0 г КДИ растворяют в 50,0 мл ДМФА и добавляют к реакционной массе, охлаждают на ледяной бане. Спустя 48 часов отбирают пробу для контроля полноты прохождения реакции методом ТСХ в Элюенте 1 и Элюенте 10. Проводят дополнительную пробоподготовку образцов: Образец переносят в стеклянный флакон, добавляют около 2,0 мл метанола, 2 капли ледяной уксусной кислоты, угольно-палладиевый катализатор на кончике шпателя и 2 капли формиата аммония, перемешивают вручную и нагревают в течение 20 минут. Заключение о полноте протекания реакции делают по исчезновению исходных веществ.

Содержимое колбы нагревают при температуре 60°С, фильтруют, добавляют 45,0 мл концентрированной соляной кислоты, 400,0 мл ДМСО, фильтруют, фильтрат упаривают при температуре 71°С.Добавляют 600,0 мл метилтретбутилового эфира, 600,0 мл петролейного эфира, 600 мл 8,3% раствора Na₂CO₃ в воде, 1,0 кг льда, гомогенизируют реакционную смесь, фильтруют. Контроль выделения продукта осуществляют методом ТСХ в Элюенте 7 и Элюенте 10. Осадок на фильтре отжимают, добавляют 600,0 мл изопропилового спирта, нагревают при температуре 70°С. Маточный раствор перемещают в делительную воронку. После разделения фаз водную фазу утилизируют, органическую переносят в круглодонную колбу объемом 2,0 л и упаривают при температуре 70°С.

Отогнанный растворитель переносят в колбу с суспензией продукта, добавляют 1 кг льда, гомогенизируют, фильтруют. Контроль выделения продукта осуществляют методом ТСХ в Элюенте 7 и Элюенте 10.

Получают нонапептид Z-Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut.

2. Получение пентапептида Boc-Thr- Glu(OtBut) - Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH.

Получение дипептида Z- Lys(Boc)- Arg-OH.

213,0 г Z-Lys(Boc)-OSu и 78,3 г L-аргинина растворяют в 700,0 мл ДМФА при перемешивании на водяной бане, температура бани около 35-40°С. Реакцию проводят при комнатной температуре в течение 18 часов. Контроль осуществляют методом ТСХ в Элюенте 2. Упаривают при температуре 72°С, добавляют 500,0 мл смеси бутанол-вода (3:2), переносят в делительную воронку, добавляют около 2,0 л смеси бутанол-вода (3:2). Органическую фазу промывают 0,5 л воды дистиллированной, переносят в колбу. Водную фазу переносят в делительную воронку и промывают 0,5 л бутанола. Контроль выделения осуществляют методом ТСХ в Элюенте 2. Органическую фазу упаривают при температуре бани 70°С до окончания отгонки летучих растворителей.

Получают дипептид Z-Lys(Boc)-Arg-OH в виде масла.

Получение трипептида Z-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH.

Дипептид Z-Lys(Boc)-Arg-OH растворяют в 1,0 л метанола при перемешивании при температуре 70°С, гидрируют в присутствии угольно-палладиевого катализатора в течение 24 часов при комнатной температуре. Контроль за ходом реакции осуществляют методом ТСХ в Элюенте 1. Полученную суспензию фильтруют, фильтрат упаривают при температуре 70°С, добавляют 200 мл ДМФА, упаривают до прекращения отгонки летучих компонентов при температуре 74°С. Получают раствор дипептида со свободной аминогруппой H-Lys(Boc)-Arg-OH в ДМФА.

213,0 г Z-Lys(Boc)-OSu растворяют в 500,0 мл ДМФА, фильтруют. Фильтрат переносят в колбу с раствором дипептида со свободной аминогруппой H-Lys(Boc)-Arg-OH в ДМФА, оставляют при комнатной температуре для прохождения реакции на 22 часа. Контроль полноты прохождения реакции осуществляют методом ТСХ в Элюенте 1 и Элюенте 4. Упаривают до прекращения отгонки летучих компонентов при температуре 71°С, растворяют в 0,5 л бутанола при температуре 61°С (без отгонки), переносят в делительную воронку, добавляют 1,0 л бутанола и 0,5 л воды. Органическую фазу промывают 700,0 мл воды. Контроль обработки осуществляют методом ТСХ в Элюенте 7. Органическую фазу упаривают до прекращения отгонки летучих компонентов при температуре 68°С.

Полученный продукт растирают с 1,0 л петролейного эфира, декантируют жидкость, процедуру повторяют дважды. Получают трипептид Z-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH в виде вязкого вещества.

Получение тетрапептида Z-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH.

Трипептид Z-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH растворяют в 1,0 л метанола при температуре 61°С, гидрируют в присутствии угольно-палладиевого катализатора в течение 24 часов при комнатной температуре. Контроль за ходом реакции осуществляют методом ТСХ в Элюенте 4. Суспензию фильтруют, фильтрат упаривают до прекращения отгонки летучих компонентов при температуре 65°С. Добавляют 300 мл ДМФА, упаривают до прекращения отгонки летучих компонентов.

Получают раствор трипептида со свободной аминогруппой Н- Lys(Boc)-Lys(Boc)-ArgOH в ДМФА.

193,5 г Z-Glu(OtBut)-OSu растворяют в 400,0 мл ДМФА, переносят в колбу с раствором трипептида со свободной аминогруппой H-Lys(Boc)-Lys(Boc)-ArgOH в ДМФА, перемешивают при температуре 73°С, оставляют при комнатной температуре для прохождения реакции на 19 часов. Контроль за прохождением реакции осуществляют методом ТСХ в Элюенте 2 и Элюенте 4. Добавляют 0,5 л метилтретбутилового эфира, 1 кг льда, гомогенизируют, фильтруют. Контроль выделения продукта осуществляют методом ТСХ в Элюенте 2 и Элюенте 7. Осадок промывают смесью: 300,0 мл воды дистиллированной/300,0 мл метилтретбутилового эфира; 1,5 л метилтретбутилового эфира, сушат при комнатной температуре в течение 24 часов.

Получают 316,0 г тетрапептида (XI) Z-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH.

Выход со стадии 73%.

Получение пентапептида Boc-Thr-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH.

Получение пентафторфенилового эфира N-третбутилоксикарбонил L-треонина (Boc-Thr-OPFP).

238,0 г треонина растворяют в 300,0 мл изопропилового спирта, 600,0 мл воды, добавляют 40% раствор едкого натра до рН=9,5-10,5.

К полученному раствору по порциям добавляют 444,0 г Вос₂О, поддерживая рН на уровне 9,5-10,5 добавлением 40% раствора едкого натра. После стабилизации содержимое колбы фильтруют. Фильтрат упаривают до окончания отгонки летучих растворителей, температура в бане 70°С.

Получают Boc-Thr-ONa в виде масла, доводят рН до уровня 3,0-3,5, добавляют 1 л смеси этилацетат : вода 50:50. Органическую фазу упаривают полностью, температура в бане 70°С. Добавляют 400,0 мл диоксана и упаривают до окончания отгонки летучих растворителей при температуре в бане 70°С.

К реакционной массе добавляют 340,0 г HOPFP, 1,5 л этилацетата, помещают в морозильную камеру при -15°С.

Спустя 18 часов к реакционной массе добавляют раствор 363,0 г КДИ в 300,0 мл этилацетата. Фильтруют, фильтрат упаривают до окончания отгонки летучих растворителей, температура в бане 80°С.Добавляют 1600,0 мл петролейного эфира, охлаждают в морозильной камере при температуре -15°С в течение 2 часов, фильтруют.Контроль выделения продукта осуществляют методом ТСХ в Элюенте 8.

Получают Boc-Thr-OPFP.

Получение пентапептида Boc-Thr-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-ОН.

Тетрапептид Z-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH растворяют в 1,5 л метанола при температуре бани 60°С, гидрируют в присутствии угольно-палладиевого катализатора в течение 20 часов при комнатной температуре. Контроль за ходом реакции осуществляют методом ТСХ в Элюенте 2 и Элюенте 4. Суспензию фильтруют, фильтрат упаривают до прекращения отгонки летучих компонентов при температуре 70°С.

Получают тетрапептид со свободной аминогруппой H-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH.

134,9 г Boc-Thr-OPFP добавляют к тетрапептиду со свободной аминогруппой H-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH и оставляют при комнатной температуре на 2 часа. Добавляют 600, 0 мл метилтретбутилового эфира, 600,0 мл петролейного эфира и 1,0 кг льда, гомогенизируют, добавляют около 27,0 мл концентрированной соляной кислоты, оставляют на ночь при комнатной температуре. Содержимое колбы переносят в делительную воронку и оставляют до разделения фаз. Контроль за выделением осуществляют методом ТСХ в Элюенте 1 и Элюенте 3. К водной фазе добавляют 500,0 мл петролейного эфира и суспензию гидрокарбоната натрия (42,0 г в 200,0 мл воды), 700,0 мл охлажденной воды. Спустя 18 часов к реакционной массе добавляют 500,0 г льда, гомогенизируют, фильтруют, контроль отмывки осуществляют методом ТСХ в Элюенте 3. Осадок промывают водой дистиллированной.

Получают пентапептид Boc-Thr-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH.

3. Получение защищенного тетрадекапептида Z-Thr-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut.

Нонапептид Z-Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut растворяют в 3,0 л метанола при температуре 70°С, гидрируют в присутствии угольно-палладиевого катализатора в течение 20 часов при комнатной температуре. Контроль за ходом реакции осуществляют методом ТСХ в Элюенте 7 и Элюенте 10. Фильтруют, фильтрат доводят до рН=5,0 концентрированной соляной кислотой, упаривают до прекращения отгонки летучих компонентов при температуре 66°С.После отгонки добавляют 500,0 мл петролейного эфира, 500,0 мл метилтретбутилового эфира, 1,5 кг льда, гомогенизируют, фильтруют. Контроль за выделением продукта осуществляют методом ТСХ в Элюенте 4 и Элюенте 7.

Получают 256,4 г нонапептида со свободной аминогруппой H-Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut.

К 256,4 г нонапептида со свободной аминогруппой H-Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut добавляют 162,5 г пентапептида Boc-Thr-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH, 43,2 г НОВТ, 800,0 мл ДМФА и 400,0 мл ДМСО, перемешивают, отгоняют летучие компоненты при температуре 71°С.

К реакционной массе добавляют 48,3 г КДИ и 25,0 мл метилморфолина, оставляют при комнатной температуре на 18 часов. Контроль реакции ведут методом ТСХ в Элюенте 7 и Элюенте 11.

Полученный защищенный тетрадекапептид Z-Thr-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut фильтруют, фильтрат упаривают до отгона ДМФА при температуре 53°С.После отгонки добавляют 600,0 мл метилтретбутилового эфира, 600,0 мл петролейного эфира, 1 кг льда и 600 мл 6,67% раствора Na₂CO₃ в воде, фильтруют, к осадку добавляют 500,0 мл метилтретбутилового эфира, 500,0 мл петролейного эфира и 1,5 л воды дистиллированной. Контроль за выделением продукта осуществляют методом ТСХ в Элюенте 7 и Элюенте 11.

Получают 464,5 г защищенного тетрадекапептида Z-Thr-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut.

4. Получение тетрадекапептида (XIV) H-Thr-Glu-Lys-Lys- Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu-OH.

К 464,5 г защищенного тетрадекапептида Z-Thr-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut добавляют 1200,0 мл трифторуксусной кислоты. Реакцию проводят в течение 60 минут. Контроль за ходом реакции осуществляют методом ВЭЖХ. После прохождения реакции реакционную смесь упаривают при температуре 45°С до прекращения отгонки летучих растворителей, растирают с 2000,0 мл диоксана, декантируют диоксан. Контроль за выделением осуществляют методом ВЭЖХ. Полученный осадок растирают с 2000,0 мл метилтретбутилового эфира, фильтруют осадок промывают метилтретбутиловым эфиром. Контроль за выделением осуществляют методом ВЭЖХ.

Добавляют 2,0 л воды дистиллированной и перемешивают до полного растворения со скоростью 427 rpm около 1 часа. Предварительно подготовленную ионообменную смолу PureLite А500Р фильтруют от лишней жидкости и по порциям титруют раствор тетрадекапептида в воде до рН=3-4, фильтруют промывают водой, доводят объем фильтрата до 10,0 л.

5. Хроматографическая очистка и лиофильное высушивание.

5,0 л раствора тетрадекапептида наносят на хроматографическую колонку, содержащую 2,163 л предварительно регенерированного СПС-БИО-SP, вещество смывают с колонки линейным градиентом пиридин-ацетатного буфера от 0.2 М до 1.5 М со скоростью 700 мл/час (суммарный объем подвижной фазы равен 10,0 литрам). Отбор фракций осуществляют с интервалом 31 минута для каждой фракции. Полученные фракции анализируют методом ТСХ в Элюенте 2 и Элюенте 12 и методом ВЭЖХ. Процедуры повторяют для второй порции раствора.

По результатам ТСХ и ВЭЖХ отбирают фракции, содержащие целевой компонент.Для фракций с содержанием основного компонента менее 97% проводят очистку методом препаративной обращенно-фазовой хроматографии для этого фракции объединяют и упаривают полностью при температуре в бане 50°С.После отгонки к содержимому колбы добавляют 300,0 мл воды дистиллированной и полностью упаривают на роторном испарителе, чтобы избавиться от остатков пиридин-ацетатного буфера. Процедуру повторяют дважды. Полученный сухой остаток растворяют в воде дистиллированной из расчета: 4,0 г целевого вещества на 1 прогонку в 50-100 мл.

Условия для проведения хроматографической очистки:

колонка - Reprosil 100 С18, 10 мкм, 250*50 мм;

объем вводимой пробы: с помощью насосного блока хроматографа на колонку наносят 50,0-100,0 мл раствора тетрадекапептида в воде (объем вводимого раствора варьируют в зависимости от объема полученного раствора);

скорость потока - 50 мл/мин;

время элюирования - 40 минут;

поглощение измеряют при длине волны равной 226 нм, результат хроматографии выводится на бумагу при помощи самописца;

подвижная фаза - линейный градиент от компонента А к компоненту В.

Компонент А: 0,1% трифторуксусная кислота в воде,

Компонент В: 6% изопропанол в 0,1% растворе трифторуксусной кислоты в воде;

после очистки каждой третьей порции колонку промывают 300,0 мл 40% раствора изопропанола в воде и уравновешивают 700,0 мл компонента А подвижной фазы.

Полученные фракции выборочно анализируют методом ВЭЖХ.

Фракции с содержанием целевого компонента более 98,5% объединяют, титруют смолой PureLite А500Р, обработанной уксусной кислотой, до рН=3-4, фильтруют, упаривают фильтрат до объема около 350,0 мл при температуре бани 80°С, замораживают жидким азотом и подвергают лиофильному высушиванию при температуре -100°С, давлении 0,001 мБар в течение 24 часов.

Содержание аминокислот в полученном тетрадекапептиде определяли на аминокислотном анализаторе Clarity Amino Acid Analyzer SW и получили следующие результаты:

что подтверждает заявленный аминокислотный состав TEKKRRETVEREKE.

Получают 95,2 г порошка тетрадекапептида (треонил-глутамил-лизил-лизил-аргинил-аргинил-глутамил-треонил-валил-глутамил-аргинил-глутамил-лизил-глутамат) в виде лиофилизата чистотой не менее 98,5%. Выход продукта составляет 54,0%.

Проведение контроля методом тонкослойной хроматографии.

Тонкослойная хроматография проводится на пластинках Merck -Kieselgel. Пластину с нанесенным веществом сушат с помощью фена при нагревании, остужают, помещают в хроматографическую камеру с хлором (в эксикатор насыпают около 1 г сухого перманганата калия, добавляют около 10 мл концентрированной соляной кислоты, оставляют с закрытой крышкой на 20 мин), после чего их проявляют водным раствором следующего состава: 0,1% о-толидин, 0,5% калий йодистый, 2% кислота уксусная.

Элюент 1: 37 мл смеси: пиридин-уксусная кислота-вода очищенная (20:6:11) + 120 мл этилацетата

Элюент 2: хлороформ - метанол - уксусная кислота - вода (60:45:6,4:13,6).

Элюент 3: этилацетат, х.ч.

Элюент 4: 37 мл смеси: пиридин - уксусная кислота - вода очищенная (20:6:11) + 45 мл этилацетата

Элюент 5: бутанол - уксусная кислота - вода (3:1:1).

Элюент 6: 37 мл смеси пиридин-уксусная кислота-вода очищенная (20:6:11) + 300 мл этилацетата.

Элюент 7: 37 мл смеси пиридин-уксусная кислота-вода очищенная (20:6:11) + 90 мл этилацетата

Элюент 8: этилацетат/ петролейный эфир (50:50);

Элюент 9: хлороформ / метанол / уксусная кислота (10:2:1);

Элюент 10: хлороформ / метанол / уксусная кислота (10:3:1);

Элюент 11: хлороформ / метанол / буфер [пиридин-уксусная кислота-вода очищенная (20:6:11)] (4:2:2)

Элюент 12: бутанол/ трифторэтанол / аммиак (3:2:2)

Проведение контроля методом ВЭЖХ

Контроль осуществляют с использованием хроматографической системы Gilson.

Условия хроматографирования:

Колонка - Luna С18, 5 мкм, 250*4,6 мм

Скорость потока - 1 мл/мин

Объем вкола - 20 мкл

Длина волны - 220 нм

Подвижная фаза:

Компонент А: вода очищенная, содержащая 0,1% трифторуксусной кислоты

Компонент В: ацетонитрил (HPLC grade), содержащий 0,1% трифторуксусной кислоты

Градиент:

Полученный продукт характеризуется удельным вращением в пересчете на сухое вещество -68°.

Аминокислотная последовательность подтверждена методами: времяпролетной масс-спектрометрии MALDI-TOF; тандемной масс-спектрометрии MALDI-TOF-TOF.

Внутренний стандарт - продукты автолиза свиного трипсина.

Основной регистрируемый ион (+Н) имеет моноизотопную молекулярную массу 1817,95 а.е.м (фиг. 1).

В спектре фрагментации присутствуют последовательности фрагментов b-ионов (фиг. 2): 1-2,5-12; b+18-ионов: 5,7,13-14; у-ионов 1,3-6,9,11,13; i-ионов 1-5, 9-13. В сумме полностью перекрывают заявленную аминокислотную последовательность образца и соответствуют заявленной последовательности.

Наличие и количественное содержание примесей подтверждается методом ВЭЖХ:

Критерии приемлемости:

- единичная неидентифицированная примесь - не более 1%,

- сумма примесей - не более 1,5%.

Характерная хроматограмма определения посторонних примесей методом ВЭЖХ представлена на фиг. 3.

Предложенный способ синтеза позволяет получать 100±5 г тетрадекапептида формулы (А) за цикл с чистотой не менее 98,5%. Выход продукта по прототипу за цикл составляет 13 г с чистотой примерно 96%. Выход продукта, полученного заявленным способом, составляет не менее 54%, в то время как в прототипе он равен 44%. Единичная неидентифицированная примесь - не более 1%, сумма примесей - не более 1,5%.

Изобретение относится к пептидной и фармацевтической химии, а именно к способу получения тетрадекапептида H-Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu-OH реакцией конденсации пентапептида формулы Boc-Thr-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH с нонапептидом со свободной аминогруппой формулы H-Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut, при этом пентапептид Вос-Thr-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH получают из аргинина путем последовательного присоединения к нему N-сукцинимидилового эфира Nα-карбобензокси-Nε-трет-бутилоксикарбонил-L-лизина, N-сукцинимидилового эфира Nα-карбобензокси-Nε-трет-бутилоксикарбонил-L-лизина, N-сукцинимидилового эфира Nα-карбобензокси-γ-трет-бутилглутаминовой кислоты и пентафторфенилового эфира N-трет-бутилоксикарбонил-L-треонина, а нонапептид получают конденсацией пентапептида Z-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-ArgOH с трипептидом со свободной аминогруппой формулы H-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut с последующей конденсацией с защищенным аргинином. Способ обеспечивает получение высокоочищенного тетрадекапептида с увеличенным выходом конечного продукта. 4 з.п. ф-лы, 3 ил., 1пр.

1. Способ получения тетрадекапептида треонил-глутамил-лизил-лизил-аргинил-аргинил-глутамил-треонил-валил-глутамил-аргинил-глутамил-лизил-глутамат формулы H-Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu-OH, отличающийся тем, что его получают реакцией конденсации пентапептида формулы Boc-Thr-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH с нонапептидом со свободной аминогруппой формулы H-Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut, при этом пентапептид Вос-Thr-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH получают из аргинина путем последовательного присоединения к нему N-сукцинимидилового эфира Nα-карбобензокси-Nε-трет-бутилоксикарбонил-L-лизина, N-сукцинимидилового эфира Nα-карбобензокси-Nε-трет-бутилоксикарбонил-L-лизина, N-сукцинимидилового эфира Nα-карбобензокси-γ-трет-бутилглутаминовой кислоты и пентафторфенилового эфира N-трет-бутилоксикарбонил-L-треонина, а нонапептид получают конденсацией пентапептида Z-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-ArgOH с трипептидом со свободной аминогруппой формулы H-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut с последующей конденсацией с защищенным аргинином.

2. Способ получения по п. 1, отличающийся тем, что пентапептид Z-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-ArgOH получают из аргинина в виде свободного основания последовательным присоединением к нему N-сукцинимидилового эфира Nα-карбобензокси-γ-трет-бутилглутаминовой кислоты, N-сукцинимидилового эфира N-карбобензоксивалина, Nα-карбобензокси-L-треонингидразида и Nα-карбобензокси-γ-трет-бутилглутаминовой кислоты.

3. Способ получения по п. 1, отличающийся тем, что проводится под постоянным контролем системой из 12 элюэнтов для ТСХ.

4. Способ получения по п. 1, отличающийся тем, что выход полученного тетрадекапептида составляет не менее 54%.

5. Способ получения по п. 1, отличающийся тем, что количество полученного продукта за один цикл составляет 100±5 г.