Способ получения -норлейцин13-мотилина Советский патент 1977 года по МПК C07K7/00 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Ь-НОРЛЕЙЦИН-13-МОТИЛИНА

фрагмент V - 0-трет. - бутил - треонил-Огрег.-бутил-тирозил-глицин (аминокислоты 6-8),

фрагменты VI - Na-трет. - бутилоксикарбонил-фенилаланил - валил - пролил - изолейцил - фенилаланин (аминокислоты 1-5);

полученные фрагменты I-VI конденсируют друг с другом известным способом, например модифицированным карбодиимидным, с по мощью дициклогексилкарбодиимид - Nоксисукпинимида; из полученного защищенного полинептида (аминокислоты 1-22) удаляют защитные группы при помощи трифторуксусной кислоты с последующим выделением делевого продукта известным способом.

В примерах применяются следующие, обычные в химии пептидов, сокращения и символы:

сокращения аминокислот, у которых, как правило, речь идет о трех начальных буквах,

числовые данные в скобках, которые не Ихмеют никакого другого дополнения, если соответствующее соединение еще раз не появляется в форме другого производного, которое имеет подряд дополнения а, Ь, с, и т. д., если исходят из а и получают другие производные,

L - конфигурация,

Z - бензилоксикарбонильный радикал,

вое - третичный бутилоксикарбонильный радикал,

DCCD - способ с дициклогексилкарбодиимидом,

DCCD/HOSU - способ с дициклогексилкарбодиимид-Ы-оксисукцинимидом,

DCCD/HOBt -способ с дициклогексилкарбодиимид-оксибензтриазолом,

РАМ - фосфоразо-метод,

SU - радикал N-оксисукцинимида,

NP -радикал р-нитрофенила,

tBu - радикал третичного бутила,

DBSI - дибензолсульфимид в качестве солеобразователя.

Me - метильный радикал,

TFE - трифторуксусная кислота,

i. У. - «в вакууме.

Пример 1. Получение фрагмента 1 (18- 22): П-Gin-OtBu (22е), полученный из Z-Gin-ОН (22а) этерификацией третичным бутиловым эфиром уксусной кислоты с последующим удалением гидрогенолизом бензилоксикарбонильной защитной группы, соединяют с Z-Gly-OSu (21) в Z-Gly-Gin- -Ot Bu (21-22a); полученный после удаления гидрогенолизом N-защитной группы Н-Gly-Gin-Ot Bu (21-220) соединяют с Z-Asn-Lys (BOG)-OH (19-20) no известному способу с DCGD/HOSu в Z-Asn-Lys (BOG)-Gly-Glu-OtBu (19-22a). Голов1ую компоненту (19-20) можно было получить аминоацилированием Н-Lys (BOG) - ОН (20) с Z-Asn-ONP (19) при обычных условиях.

Удаление защитной группы с Z- Asn-Lys (BOG)-Gly-Gin-OtBu (19-22a) каталитическим гидрогенолизом дает производное тетрапептидного эфира (19-220), которое соединяют с Z-Arg (б,со-Zz) ONP (18) в Z-Arg (5, (О-Za)-Asn-Lys (BOG) - Gly-Gin-OtBu (18-22a).

Эксперимент проводят следующим образом.

A.Дибензолсульфимидная соль L-глутамин-т/ ег.-бутилового сложного эфира.

103 г бензилоксикарбонил-глутамин-трег.бутилового сложного эфира, полученного по известному способу, в 2 л метанола каталитически гидрируют (над палладиевой чернью) известным образом при добавлении 91 г дибензолсульфимида в 500 мл метанола при рН 3,5.

Фильтрат упаривают в вакууме, а затем азеотропной отгонкой с бензолом; из этилацетатного раствора маслянистый остаток при добавлении диэтилового эфира кристаллизуется. Из метанола/диэтилового эфира получают .кристаллы с т. пл. 135-136°G; 1+10,78° (с 1,0; метанол). Выход 146 г (97% от теории).

Б. Бeнзилoкcикapбoнил--глицил-L-глyтaмингрет.-бутиловый сложный эфир.

115 г дибензолсульфимидной соли L-глутамин-т/5ет.-бутилового сложного эфира, суспендированного в 800 мл дихлорметана, смещивают при перемещивании с 32,2 мл триэтила.мина и после этого с70,5г бензилоксикарбонил-глицин-К-оксисукцинимидного сложного эфира. После перемещивания в течение 24 ч при комнатной температуре, концентрирования в вакууме, экстрагирования масла этилацетатом, промывки этого раствора, как обычно, раствором лимонной кислоты, бикарбоната калия и водой, сущки над сульфатом натрия и упаривания в вакууме получают масло. Выход 87 г (93% от теории).

B.Дибензолсульфимидная соль глицил-Lглутамин-грег.-бутилового сложного эфира.

80 г бензилоксикарбонил-глицил - L-глутамин-трег.-бутилового сложного эфира (п. Б) в 900 мл метанола деацилируют (бОгдибензолсульфимида) гидрогенолизом, как описано в п. А. Получают маслянистый остаток, который кристаллизуется при растирании с петролейным эфиром; т. пл. 92°С (с разложением), ,5° (с 1,0; метанол). Выход ПО г

(98% от теории).

Г. Бензилоксикарбонил - L - аспарагинилNe-трег. - бyтилoкcикapбoнил-L-лизин.

51 г Не-грег.-бутилоксикарбонил - L-лизина переводят в бензилтриэтиламмонийную соль и после этого перемещивают в 700 мл диметилформамида с 81 г бензилоксикарбонил-Lаспарагин-4-нитрофенилового сложного эфира в присутствии 1 эквивалента пиридина в течение 48 ч при 20°С. Остаток после упаривания в вакууме одновременно обрабатывают этилацетатом и раствором бисульфата калия. Образующийся осадок отфильтровывают

и перекристаллизовывают из этанола/петролейного эфира, т. пл. 174-175°С (с разложением); 13,8°С (с 1,0; пиридин). Выход 70 г (71 % от теории).

Д. Бензилоксикарбонил - L - аспарагииилМ8-г;7ет.-бутилоксикарбо,нил-Ь - лизил - глицил-Ь-глутамин - трет. - бутиловый сложный эфир.

К 61,5 г дибензолсульфимидной соли глицил-L - глутамлн - трет. - бутилового эфира и 54,5 г бензилоксикарбоиил-Ь-асиарагинилМе-трет.-бутилоксикарбонил - L - лизина в 700 мл диметилформамида добавляют при перемешивании при 0°С сначала 15,5 мл триэтиламина и через 15 мин по 13 г N-оксисукцинимида, и 23 г М,Ы-дици.клогексилкарбодиимида. Реакционную смесь перемешивают 3 ч при 0°С, а затем еш,е 24 ч при комнатной температуре. Фильтрат упаривают в вакууме, остаток кристаллизуют при обработке этилацетатом. Перекристаллизацию производят из метанола/воды и изопропанола/этилапетата, т. пл. 155--156°С; {а -20,8° (с 1,0; ). Выход 63 г (73% от теории).

Е. Хлоргидрат Ь-аспарагинил-Ке - трет.бутилоксикарбонил-L - лизил - глицил - Lглутамин-трет.-бутилового эфира.

47,5 г бензилоксикарбонил-Ь-аспарагинилNg-ТуОет.-бутилоксикарбонил - L - лизил-глипил-L - глутамин-трет.-бутилового эфира (по (п. Д) в 800 мл метанола гидрируют при статических условиях величины рН (рН 5,5; 25,2 мл 2,5 н. раствора хлористого водорода в метаноле). Остаток после упаривания фильтрата в вакууме при растирании с диэтиловым эфиром дает бесцветный порошок, т. пл. 98°С; а12д° +9,5° (с 1,0; метанол). Выход 40 г (97%).

Ж. Na, N6, Мсо-трибензилоксикарбонил-Ьаргинил-Ь-аспарагинил-Ме - трет. - бутилоксикарбонил-Ь-лизил - глицил-L - глутаминтрег.-бутиловый эфир.

К 31,9 г хлоргидрата Ь-аспарагинил-Мвтрег.-бутилоксикарбонил - L - лизил - глицилL-глутамин - т/7ет.-бутилового эфира (по п.Е) и 33,68 г Na,Nб,N(в-тpибeнзилoкcикapбoнилЬ-аргинин-М-оксисукцинимидного эфира в 1 л диметилформамида добавляют при 0°С 7 мл триэтиламина и перемешивают 24 ч при 0°С, а затем при комнатной температуре; далее проводят упаривание в вакууме, переосаждение остатка из метанола/воды и затем перекристаллизация из метанола дают

20

-7,6° (с 1,0;

бесцветный порошок; а

ледяная уксусная кислота). Выход 46,5 г (80% от теории).

3. Дибромгидрат Ь-аргинил(бромгидрат)Ь-аспарагинил-Ме-трет. - бутилоксикарбонилL-лизил-глицил - L - глутамин - TfieT.-бутилового эфира.

45,5 г Ма,Нб,Ыа)-трибензилоксикарбонил-Ьаргинил - L - аспарагинил - Ne-rper. - бутилоксикарбонил-Ь-лизил - глицил - L - глутамин-трет.-бутилового эфира (по п. Ж) в 1,5 л диметилформамида/метанола (2:1) деацилируют гндрогенолизом при статических условиях величины рН (,5; 80 мл 1 н. бромистоводородной кислоты). Упаривание фильтрата в вакууме и переосаждение остатка из этанола/диэтилового эфира дает аморфный порошок: -4,8° (с 1,0; 80%ная уксусная кислота). Выход 37 г (98% от теории). Выход 55%/в пересчете на исходный (22 в)/: -7,6+1° (с 1,0; уксусная кислота).

Продукт хроматографически однороден в н-бутаноле/ледяной уксусной кислоте/воде, 3:1:1 и н-гептане/трет.-бутаноле/ледяной уксЗТной кислоте, 5:1:1.

Вычислено, %: С 57,98; Н 6,69; N 13,29; О 22,02.

Найдено, %: С 57,70; Н 6,56; N 13,29: О 22.45.

После удаления трех бензилоксикарбонильных заш,ит каталитическим гидрогенолизом в присутствии двух эквивалентов бромистого водорода получают требуемую фракцию 1 (18-22в). Выход 98%; al -4,8 + Г (с 1, 80%-ная уксусная кислота); хроматографически однородная в н-бутаноле/ледяной уксусной кислоте/воде, 3:1:1 и третичном амиловом спирте/пиридине/воде, 35 : 35 : 30.

Вычислено, %: С 40,21: Н 6,85; N 16,12; Вг 16,72.

Найдено, %: С 40,46: Н 6,93: N 15,89; Вг 16,51.

Пример 2. Получение фрагмента П (аминокислоты 14-17).

Z-Lys-(ВОС)-Osu (16) и Н-Glu (OtBu)-ОМе(17) соединяют обычным способом в (16-17а); щелочное омыление и последлюшее каталитическое деацилирование приводят к получению Н-Lys (ВОС)-Glu- (OtBu)-ОН (16-176). Присоединением (OtBu)-OSu (14 или 151 получают фрагмент И, а именно Z-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) Lys (ВОС)-Glu (OtBu)-OH (14- 17a).

Эксперимент осуществляют аналогично примеру 1.

Выход 48% (в пересчете на исходный

Н-Glu (OtBu)-ОМе (17); а -9,8+1°

(с 1, диметилформамид); т. пл. 147-149°С.

Продукт хроматографически однороден в циклогексане/хлороформе/ледяной уксусной кислоте, 45 : 45 : 10. Вычислено, %: С 59,02; Н 7,86; N 7,48.

Найдено, %: С 58,70; Н 8,04; N 7,72.

Пример 3. Получение фрагмента III (аминокислоты 12-13) осуществляют аминоацилированием норлейцина (13) Z--Arg (б,(о-Zs)-OSu (12). Выход 86%.

Эксперимент проводят аналогично примеру 1, т. пл. 130-132°С; а +7,2+1° (с 1, ледяная уксусная кислота).

Продукт хроматографически однороден в кгептане/третичном бутаноле/ледяной уксусной кислоте, 5:5:1; и н-бутаноле/ледяной уксусной кислоте/воде 3:1:1. Вычислено, %: С 62,69; Н 6,28; N 10,15. Найдено, %: С 62,45; Н 6,28; N 10,16. Пример 4. Получение фрагмента IV (аминокислоты 9-11). Синтезированный по известному способу дипентид Н-Leu-Gin- on (10-11) связывают с Z-Glu (OtBu) - OSu (9) и получают Z-Glu (OtBu)-LeuGin-ОН (9-11); выход 74%. Эксперимент осуществляют аналогично примеру 1, т. пл. 146-148°С; а -31,6±1° (с 1, метанол). Продукт хроматографически однородный в н-гептане/третичном бутаноле/ледяной уксусной кислоте, 5:1:1 и н-бутаноле/ледяной уксусной кислоте/воде, 3:1:1. Вычислено, %: С 58,12; Н 7,82; N 9,68. Найдено, %: С 58,05; Н 7,84; N 9,48. Пример 5. Получение фрагмента V (аминокислоты 6-8). Синтезированный по известному способу дипептид Н-Туг (tBu)-Gly-ОН (7-8) соединяют с Z-Thr (tBu)-OSu (6), получают защищенный трипептид (6-8а), который дибензилоксикарбонилированием превращают в требуемый фрагмент V, а именно, Н-Thr (tBu)-Туг (tBu)-Gly-OH (6-8е). Эксперимент осуществляют аналогично примеру 1. Выход около 81% (в пересчете на исходный дипептид 7-8); т. пл. 126-127°С; а +7,9+1° (с 1, метанол). Продукт хроматографически однороден в третичном амиловом спирте/пиридине/воде, 35 : 35 : 30. Вычислено, %: С 60,88; Н 8,30; N 8,88. Найдено, %: С 60,69; Н 8,31; N 8,91. Расчеты даны в пересчете на дипептид с 1/4 мол. кристаллизационного этилацетата. Пример 6. Получение фрагмента VI (аминокислоты 1-5). По указанному способу с карбодиимидом Z-Ле-ОН (4) соединяют с Н-Phe-OtBu (5). После каталитического деацилирования промежуточного защищенного дипептида выделяют Н-Ле-Phe-OtBu (4-5в). Выход 90%. вое-Val-ОН (2а) и Н-Pro-ОМе (За) по указанному фосфоразо-методу соединяют в защищенный дипептид (2-За); последующее омыление дает ВОС-Val-Pro-ОН (2-Зв). Выход 70%. Дипептид (2-Зв) получают еще реакцией ВОС-Val-OSu (2е) с двумя эквивалентами пролина (Зв). Выход 83%. Оба производных дипептидов карбодиимидным методом соединяют в ВОС-Val- Pro-Ле-Phe-OtBu (2-5а); обработка трифторуксусной кислотой (2-5а) дает свободный тетрапецтид Н-Val-Pro-Ле- Phe-ОН (2-5в), к которому присоединяют ВОС-Phe-OSu (I) и получают ВОС-Phe- -Val-Pro-Ле-Phe-ОН (1-5а) (фрагмент VI), Эксперимент осуществляют аналогично примеру 1. Выход 63% /в пересчете на (4-5в)/; т. пл. 218°С; а -64,2+Г (с 1, уксусная кислота) , Продукт хроматографически однороден в н-бутаноле/ледяной уксусной кислоте/воде, 3:1:1 и третичном амиловом спирте/пиридипе/воде, 35 : 35 : 30. Вычислено, %: С 64,88; Н 7,64; N 9,70. Найдено, %: С 64,72; Н 7,70; N 9,61. Пример 7. Конденсация фрагментов I-VI (общая последовательность 1-22). Фрагмент II (14-17а) при помощи указанного способа с дициклотексилкарбодиимид-Nоксисукцинимидом соединяют с фрагментом I (18-22е), получают защищенный нонапентид (14-22а), который каталитическим гидрогенолизом переводят в Н-Glu (OtBu) - Glu- (OtBu)-Lys (ВОС-Glu (OtBu)-Arg (HBr)-Asn-Lys (BOC)-Gly-Gin-OtBu (14-22s). Присоединение фрагмента III к (14-22e) осуществляют тем же способом и получают Z-Arg (6,a-Z2)-Nle-Glu (OtBu) Glu (OtBu)-Lys (BOC)-Glu (OtBu)-Arg (HBr)-Asn-Lys (BOC)-Gly-Gin-OtBu (12-22a) Выход около 69% (в пересчете на исходный фрагмент I); {а ,9±Г (с 0,7; метанол). Продукт хроматографически однородный в н-бутаноле /ледяной уксусной кислоте/воде, 3:1:1 и н-гептане/третичном бутаноле/ледяной уксусной кислоте, 3 : 2 :1. Вьпшслено, %: С 55,48; Н 7,29, N 12,82; О 20,92; Вг 3,48. Найдено, %: С 55,24; Н 7,27; N 12,62; О 20,97; В г 3,20. Каталитическим гидрогенолизом в присутствии бромистого водорода производного ундекапептида (12-22а) удаляют бензилоксикарбоиильные защитные группы и получают в виде бромгидрата Н-Arg (HBr)-Nle- Glu (OtBu)-Glu (OtBu)-Lys (BOC)-Glu (OtBu)-Arg (HBr)-Asn-Lys (BOC) - Gly Gln-OtBu (12-220). Конденсацию фрагмента IV (9-11) с (12- 2s) проводят по указанному способу с дициклогексилкарбодиимид - N - оксибензтризолом. После отщепления гидрогенолизом Zащитной группы выделяют в чистом виде -Glu (OtBu)-Leu-Gin-Arg (HBr) - le-Glu (OtBu)-Glu (OtBu)-Lys (BOC) - lu (OtBu)-Arg (HBr)-Asn-Lys (BOC) - ly-Gin-OtBu (9-220). Выход 77%. 6,3± ° (c 0,7, метанол). Продукт хроматографически однороден в -бутаноле/ледяной уксусной кислоте/воде, :1:1. Вычислено, %: С 47,99; Н 7,58; N 13,72 . Найдено, %: С 47,81; Н 7,28; N 13,69. Аминокислотный анализ: Lys 1,99; Arg ,98; Asp 1,03; Glu 6,30; Gly 0,98; Leu 0,97; le 1,01.

Фрагмент V (6-8а) соединяют с N-оксисукцинимидным эфиром фрагмента VI (1 - 5в). Однако не удается получить соеинение (1-8) в чистом виде, а именно ВОС-Phe- Val-Pro-Ле-Phe-Thr (tBu)-Туг (tBu)- Gly-OH. Аминокислотный анализ октанептида (1-8) ноказывает, что он загрязнен 10% (1-5а или в); попытки разделения этой смеси безуспешны. Поэтому «сырой фрагмент (1-8) соединяют с производным тетрадекапентида (9-22в) вышеуказанным способом в ВОС-Phe-Val-Pro-Jle-Phe- Thr (tBu)-Туг (tBu)-Gly-Glu (OtBu) - Leu-Gin-Arg (HBr)-Nle-Glu (OtBu) - Glu (OtBu)-Lys (BOG)-Glu (OtBu)-Arg (HBr)-Asu-Lys (BOG)-Gly-Gin-OtBu (1-22a). Носле отшепления всех заш,итных трупн действием безводной трифторуксусной кислоты и последующего отделения ионов трифторацетата и бромида ионообменной хроматографией на слабоосновной (в ацетатной форме) смоле «Дауэкс 44, получают «сырой Ь-норлейцин-13-мотилин (1-228), который загрязнен введением «нечистого фрагмента (1-8).

Экспериментальное осуществление конденсации фрагментов.

А. Конденсация I с II.

9,2 г фрагмента I (по примеру 1), 9,36 г фрагмента II (по примеру 2) и 1,4 мл триэтиламина в 200 мл диметилформамида смещивают при 0°С с 2,3 г N-оксисукцинимида и затем с 3,1 г М,Ы-дициклогексилкарбодиимида. Реакционную смесь перемешивают 24 ч при 5°G и 4 дня при комнатной температуре, фильтрат упаривают в вакууме. Остаток несколько раз отмывают водой и дважды переосаждают из метанола/этилацетата. Получают г/зег.-бутиловый эфир защищенного нонапептида в виде аморфного порошка, а - --14,6° (с 1,0; диметилформамид). Выход 14,8 г (84% от теории).

12,3 г полученного соединения в 800 мл метанола каталитически гидрируют при статических условиях величины рН (рН 5,5; 7 мл 1 н. бромистоводородной кислоты). Фильтрат упаривают в вакууме, остаток дважды переосаждают из этанола/этилацетата. Получают бромгидрат грег.-бутилового эфира Lглутамил (7-7рет.-бутиловый эфир)-Ь - глутамил (у-трет.-бутиловый эфир)-МЕ-т/5ет.-бутнлоксикарбонил - L - лизил - L - глутамил, (у-трет.-бутиловый эфир) - L - аргинил(бромгидрат) - L - аспарагинил-Ne - трет.бутилоксикарбонил-L - лизил - глицил - тлутамина, сс -21,5° (с 1,0; метанол). Выход 11,4 г (96% от теории).

Б. Конденсация (I-II) с III.

3,4 г производного нонапептида (по п. А), 2,8 г фрагмента III (по примеру 3) в 200 мл диметилформамида и 0,70 г N-оксисукцинимида смешивают при - lOG с 0,28 мл триэтиламина и затем с 0,825 г .,М-дициклогексилкарбодиимида. Смесь перемешивают

24 ч при +4°С и 24 ч при комнатной температуре. После удаления растворителя в вакууме остаток переосаждают из метанола/ /этилацетата, затем промывают водой и еще раз переосаждают из метанола/этилацетата. Получают защиш,енный ундекапептид в виде аморфного порошка, а -4,9° (с 0,7; метанол). Выход 3,9 г (85% от теории).

3,5 г полученного производного ундекапептида в 800 мл метанола каталитически гидрируют при статических условиях величины рН (рН 4,5; 31 мл 0,2 н. раствора бромистого водорода в метаноле). Остаток из упаренного в вакууме фильтрата переосалсдают из метанола/этилацетата. бромгидрат грег.-бутилового эфира Ь-аргинил-Ь-норлейаил-Ь-глутамил (у-трет. - бутиловый эфир)L-глутамил (-грег.-бутиловый эфир) - Neгрег.-бутилоксикарбонил - L - лизил-Ь-глутамил (у-трег.-бутиловый эфир) - L - аргинил1,-аспарагинил- | -трег. - бутилоксикарбонилL-лизил-глицил-глутамина в виде порошка. -21,7° (с1,0; метанол). Выход 3,0 г (95% .от теории).

В. Конденсация (I-II-III) с IV.

2,7 г производного ундекапептида (по п. Б), 1,5 г фрагмента IV (по примеру 4) и 0,405 г 1-оксибензтриазола в 200 мл диметилформамида смешивают при 0°С с 0,182 мл триэтиламина и затем с 0,577 г Ы,Ы-дициклогексилкарбодиимида. Реакционную смесь перемешивают 24 ч при О-5°С и затем еще 5 дней при 25°С. Остаток после упаривания в вакууме переосаждают дважды из метанола/этилацетата, после высушивания в вакууме промывают водой и затем еще раз переосаждают из метанола/диэтилового эфира. Получают защищенный тетрадекапептид (I-II-III-IV) в виде аморфного порошка. -4,3° (с 0,7; метанол). Вы.ход 2,7 г (82% от теории).

2,0 г полученного производного тетрадекапептида в 800 мл метанола каталитически гидрируют -при постоянном значении рН (рН 4,5; 8 мл 0,1 н. бромистоводородной кислоты). Остаток после упаривания фильтрата переосанадают из метанола/этилацетата.

Получают тетрабромгидрат трег.-бутилоеого эфира L-глутамил (у-грег.-бутиловый эфир)-Ь-лейцил-Ь-глутамил - L - аргинил-Lнорлейцил-Ь-глутамил (у - грег.-бутиловый эфир)-L-глутамил (у-трет. - бутиловый эфир)К е-грет.-бутилоксикарбонил - L - лизил - Lглутамил (-у-трег.-бутиловый эфир) - L - аргинил-L-acпapaгинил-Ne-7pe7. - бутилоксикарбoнил-L-лизил-глицил - L - глутамина в виде аморфного порошка. -6,3° (с 0,7; метанол). Выход 1,82 г (94% от теории).

Г. Конденсация V с VI.

21,6 г фрагмента VI и 6,9 г N-оксисукцинимида в 400 мл диметилформамида смешивают при -5°С с 6,3 г Н,М-дициклогексилкарбодиимида, реакционную смесь перемешивают 2 ч при и в течение 10-15 ч -при комнатной температуре. Фильтрат упаривают в вакууме. Маслянистый остаток кристаллизуют из изопропанола. Получают грег.-бутилоксикарбонил-Ь-феиилалаиил - Ь-валил-Ь-пролилЬ-изолейцил-Ь - фенилаланин - N - оксисукцинимидный эфир, т. пл. 190- 192°С; - +59,28° (с 1,0; диоксан). Выход 21,3 г (88% от теории). 12,2 г фрагмента V и 3,8 мл триэтиламина в 400 мл диметилформамида смешивают с 14,8 г полученного N-оксисукцинимидного эфира, реакционную смесь после перемешивания в течение 24 ч при комнатной температуре упаривают в вакууме, маслянистый остаток растворяют в этилацетате и растворе лимонной кислоты. Этилацетатный слой промывают, как обычно, сушат и упаривают в вакууме досуха. Из этилацетата/петролейното эфира получают бесцветные кристаллы трет.бутилоксикарбонил-L - фенилаланил-Ь-валилЬ-пролил-Ь-изолейцил - L - фенилаланил-0грет-.-бутил-Ь - треонил-0-грег. - бутил - Lтирозил-глицина. а 44,0° (с 1, этанол). Выход 18,2 г (87% от теории). . Д. Конденсация (I-II-III-IV) с (V-VI). 1,3 г производного тетрадекапептида (по п. В), 1,17 г заш,ищеиного октапептида (по п. Г), 0,07 мл триэтиламина и 0,175 г N-оксисукцинимида (или 0,20гоксибензтриазола) в 100 мл диметилформамида смешивают при (-10°С) с 0,257 г 1М,Ы-дициклогексилкарбодиимида. Смесь перемешивают 2 дня при 0°С и 3 дня при комнатной температуре. После удаления растворителя в вакууме остаток тщательно растирают с горячим этилацетатом, смолистый продукт переосаждают из метанола/этилацетата, сушат после растирания с этилацетатом и затем 5 ч тщательно обрабатывают водой. После переосаждения из метанола/воды получают аморфный порошок (1,1 г) защищенного докозапептида (I-II- III-IV-V-VI). 0,2 г полученного продукта заливают 20 мл ледяной трифторуксусной кислоты и выдерживают 2 ч при комнатной температуре. Избыток трифторуксусной кислоты удаляют в вакууме по возможности при низкой температуре, остаток растворяют в разбавленной уксусной кислоте, полученный раствор дважды обрабатывают 4 г слабоосновной анионообменной смолы в ОН форме, после чего элюат подвергают лиофилизации. Выход 157 мг. Пример 8. Получение синтетического продукта в чистом виде. А. Проводят ионообменную хроматографию 25 мг полученного сырого Ь-норлейции13-мотилина на существующей в ацетатной форме, сильноосновной анионообменной смоле «QAE-Сефадекс А-25. Экспериментальные условия: колонна см; 25 мг продукта, растворенного в 2 мл 0,5%-ного аммиака; система: 0,025 М раствор ацетата аммония (доведенного разбавленным аммиаком до рН 9,27). скорость потока 18 мл/ч; фракции по 6 мл. Производят разделение на две основные фракции BI и В2. Фракция Вг (около 4 мг) является ожидаемой неправильной последовательностью (1 - 5/9-22), фракция BI (около 12 мт) является искомым Ь-норлейцин-13-мотилином. Полученный сушкой вымораживанием в твердой фазе докозапептид оказывается однородным в системе: н-бутанол/ледяная уксусная кислота/вода/пиридин, 30 : 6 : 24 : 20 и н-бутанол/ледяная уксусная кислота/вода/пиридин, 30:12: : 24 : 20, как при хроматографии на бумаге, так и при тонкослойном хроматографироваАминокислотный анализ фракций BI и Ва -проводят после кислотного гидролиза (6 н. НС1, 20 ч), причем оказывается, что при гидролизе в течение 72 ч получают практически одинаковые величины (табл. 1). Таблица Биологическая активность высушенной вымораживанием фракции В 50%. Опыты по ферментативному гидролизу подтверждают предложенную первичную структуру. Б. Указанную в п. А методику очистки повторяют с применением следующих экспериментальных условий: колонна 80X1,5 см; 235 мг. сырого продукта, растворенного в 15 мл 0,5%-ного аммиака, подают на уравновешенную 0,025 М раствором ацетата аммония (доведенного разбавленным аммиаком до Н 9,20) колонну; растворитель: 0,025 М раствор ацетата аммония (рН 9,20); скорость потока: 47 мл/ч; фракции по 3,5 мл, распределение пептида определяют змерением экстинкции при 220 нм. Осуществляют разделение на две фракции BI (135 мг) и EZ (44 мг), весовые данные лиофилизации относятся к подвергнутым фракциям. В. Для дальнейшей очистки ,135 мг фракции 5 BI обрабатывают хроматографией на колонне на существующей в аммонийной форме сильнокислой катионообменной смоле «SP-Сефадекс С-25. Эксиериментальные условия следующие: ю колонна 80Х1.5 см; растворитель: 10 мл 0,5%-ная уксусная кислота; система: 1 - 0,025 М раствор ацетата аммония, полученный из 0,025 М уксусной кислоты добавлением разбавленного раствора аммиака до рН 5,0; is 2-0,025 М раствор ацетата аммония (рН 5,38); скорость потока: ПО мл/ч; фракции по 37 мл. Получают две основные фракции, а именно С (57 мг) и С2 (48 мг).20 Фракция Cz биологически неактивна, фракция GI показывает биологическую активность выще 90% ио сравнению с природным мотилином. Результаты проведенных аминокислотных 25 анализов приводятся в табл. 2.

H-Phe-Val- ro-DLe-Phe-Thr-Tijr-Gly-CUi-)feu-Gin (1) (2)- (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (П)

Arg - Nle-Glu-Olu- ijs-Olu-Arg-Asn- ijs-Olij-Gln-OM

(12) (13) ()t) (15) (15) (17) (16)09) (20} (21) (22)

отличающийся тем, что получают отдельные защищенные фрагменты:

фрагмент 1-аргинил-(бромтидрат) - аспарагинил-Ne - трет. - бутилоксикарбонил - лизилглицил-глутамин - трег.-бутиловый эфир (аминокислоты 18-22),

фрагмент II - Na-бензилоксикарбонилглутамил- (-т/эет.-бутиловый эфир) -глутамил(-у-грет.-бутиловый эфир) -Ме-грет.-бутилоксикарбонил-лизил-глутаминовая кислота (утрет. - бутиловый эфир (аминокислоты 14-

17),

фрагмент III - Na, N6, Кй)-три(бензилоксикарбонил) - аргинил - норлейцин (аминокислоты 12-13),

фрагмент IV - Na-бензилоксикарбонилглутамил(у-грег.-бутиловый эфир) - лейцилглутамин (аминокислоты 9-11),

фрагмент V-О-грег.-бутил-треонил-О-т-р г.бутил-тирозил-глицин (аминокислоты 6-8),

фрагмент VI - Ыа-г/(г.-бутилоксикарбонил-фенилаланил - валил-цролил - изолейцил-фенилаланин (аминокислоты 1-5);

синтезированные фрагменты I-VI конденсируют друг с другом известным способом, например, модифицированным карбодиимидным, на основе дициклогексилкарбодиимид-Nоксисукцинимида; с полученного производного полипептида (1-22) удаляют защитные группы действием трифторуксусной кислоты с последующим выделением целевого продукта известным способом.