ПРИМЕНЕНИЕ КАРОТИНОИДА МИКРОБНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ, ВЛИЯЮЩЕГО НА СОСТАВ МИКРООРГАНИЗМОВ КИШЕЧНИКА Российский патент 2021 года по МПК A61K31/7028 A61K35/00 A61P29/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к каротиноидам, в частности каротиноидному соединению микробного происхождения формулы I, такому как метилгликозил-апо-8’-ликопиноат или гликозил-апо-8’-ликопин, для применения в восстановлении и/или поддержании полезного для здоровья состава микроорганизмов кишечника у субъекта. В настоящем изобретении дополнительно предусмотрено указанное соединение для применения в лечении и/или предупреждении нарушений, связанных с дефектом целостности кишечного барьера, таких как, например, синдром раздраженного кишечника.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В последнее время каротиноиды привлекли много интереса в индустрии функциональных продуктов питания в связи со своими потенциально полезными для здоровья эффектами. Изначально обнаруженные в растениях, выступая в качестве вспомогательного пигмента во время фотосинтеза, каротиноиды представляют собой липофильные антиоксиданты, которые были связаны со сниженным риском сердечно-сосудистого заболевания, макулярной дегенерации и других хронических заболеваний. Несмотря на то, что образование каротиноидов также было обнаружено в некоторых бактериях и грибах для защиты против повреждения УФ-излучением и оксидантного стресса, люди и другие животные неспособны синтезировать каротиноиды, и в связи с этим они должны быть восполнены из рациона. Всасывание каротиноидов из рациона зависит от эффективного высвобождения каротиноидов из пищевой матрицы и последующей растворимости желчными кислотами и пищеварительными ферментами, завершаясь их включением в смешанные мицеллы. Основная часть метаболизма каротиноидов происходит в тонком кишечнике, в котором они также должны быть растворены в пищевых липидах до того, как они могут пассивно передвигаться из мицеллярной фазы в просвете кишечника к лимфатической и кровеносной системе. В то же время неизвестно, все ли каротиноиды, присутствующие в смешанной мицелле, всасываются, или некоторые остаются связанными с невсосавшимися желчными солями и холестерином, подлежащими всасыванию дистальнее, или опускаются в толстый кишечник, в котором они выполняют другие биологические функции.

Было идентифицировано более 600 встречающихся в природе каротиноидов, из которых примерно 50 могут превращаться в ретинол (т.е. витамин A), и называются каротиноидами провитамина A. Каротиноиды провитамина A могут превращаться ферментативным путем в слизистой оболочке кишечника с образованием ретинола. Ретинол требуется для зрения, поддержания дифференцированного эпителия, секреции слизи и размножения (McCullough et al., 1999, Proc. Nutr Soc, 58(2)). У человека активность в качестве провитамина А является единственной функцией каротиноидов, которая является однозначно признанной и связана с последствиями для здоровья. Помимо своей активности в качестве провитамина A, считается, что многие каротиноиды характеризуются другими биологическими функциями, такими как ингибирование перекисного окисления липидов, подавление опухолевого роста, иммуномодулирование и т.д., которые главным образом связаны с их антиоксидантными свойствами. Противоопухолевая активность каротиноидов была связана с их антиоксидантными свойствами, а также индукцией и стимуляцией межклеточного взаимодействия посредством щелевых контактов, которые играют роль в регуляции клеточного роста, дифференциации и апоптоза. Взаимодействие с помощью щелевых контактов между клетками, по-видимому, не зависит от их антиоксидантного свойства или активности в качестве провитамина A (Zhang et al., 1992, Cancer Res 52). Помимо этого, Vieira et al. (2008, J Pediatr Gastroenterol Nutr 47) показали, что концентрации каротиноидов в сыворотке коррелируют с целостностью кишечного барьера.

Слой кишечного эпителия является окончательным барьером между содержимым просвета кишечника и средой организма. Таким образом, поддержание функции кишечного барьера является крайне важным для общего состояния здоровья и развития у человека и животных и, соответственно, нарушение функции кишечного барьера играет патогенную роль при многих хронических заболеваниях, возникающих вследствие воспаления, таких как воспалительное заболевание кишечника (IBD), синдром раздраженного кишечника (IBS), или при метаболическом контроле. Аналогичным образом, соответствующее созревание функции кишечного барьера (отсутствие такового) оказывает основное влияние на здоровье и продуктивность животных при коммерческом животноводстве, особенно на чувствительных стадиях в условиях раннего периода жизни (Wijtten et al., 2011, Br J Nutr 105).

Целостность кишечного барьера определяется несколькими факторами, в том числе слоем слизистой оболочки кишечника, пролиферацией эпителиальных клеток, плотными контактами, которые образуют связи между прилегающими клетками, и составом микроорганизмов в кишечнике. Изменения одного из этих факторов может приводить к изменениям целостности кишечного барьера. Например, при IBS с преобладанием диареи (IBS-D) исследования с помощью электронной микроскопии показали конденсацию цитоскелета и увеличенные межклеточные промежутки между эпителиальными клетками, что обеспечивает морфологическую основу для повышенной кишечной проницаемости. Было обнаружено, что эти структурные изменения коррелируют как с активацией тучных клеток, так и с симптомами, включающими диарею и боль (Martinez et al., 2013, Gut 62). Эти данные подтверждают более ранние наблюдения, полученные из экспериментов с камерой Уссинга, показавших повышенную проницаемость тканей толстой кишки пациентов с IBS (Piche et al., 2009, Gut 58).

Микробиота кишечника образует сложную экосистему из микроорганизмов в желудочно-кишечном тракте и поддерживает несколько важных функций, в том числе ферментацию пищевых волокон в толстой кишке, экстракцию нутриентов, синтез определенных витаминов, предупреждение колонизации патогенами, созревание кишечного эпителия и иммунной системы, высвобождение метаболитов в системные ткани, а также модуляцию высвобождения гормонов желудочно-кишечного тракта и нервную функцию. Кишечный микробиом состоит из целого сообщества микроорганизмов в кишечнике человека, в том числе бактерий, дрожжей, грибов, архей и вирусов, составляющих от 10¹³ до 10¹⁴ микроорганизмов. Несмотря на сложность экосистемы в кишечнике, главным образом она представлена ограниченным количеством типов бактерий, например, Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, Fusobacteria, Verrucomicrobia и Actinobacteria, при этом Firmicutes и Bacteriodetes являются доминирующими типами. В типе Firmicutes некоторыми важными родами являются Faecalibacterium, Bacillus, Clostridium, Lactobacillus и Roseburia. Эти роды включают виды, которые способны продуцировать битурат, поскольку они принадлежат к определенным кластерам Clostridium.

Кишечные бактерии, продуцирующие бутират, в последнее время привлекли много внимания в связи с тем, что бутират играет основную роль в поддержании здоровья кишечника человека в качестве основного источника энергии для колоноцитов и в качестве важного регулятора экспрессии генов, воспаления, дифференциации и апоптоза в клетках-хозяевах (Hamer et al., 2008, Alimentary Pharmacol. & Therapeutics). Распространенной характеристикой заболеваний кишечника, которые связанных с дефектом целостности кишечного барьера, является снижение количества типов, продуцирующих бутират, в кишечном микробиоме. Pozuela et al., (Nature, 2015) показали, что пациенты с IBS-D характеризуются снижением количества бактерий, продуцирующих бутират, по сравнению со здоровыми индивидами. В частности, бутират играет важную роль на уровне кишечника с помощью усиления защитного барьера эпителия посредством его влияния на продуцирование слизи и экспрессию плотных контактов, приводя к уменьшенному прохождению токсических и провоспалительных веществ вдоль кишечного слоя. Эксперименты в крысиной модели колита, индуцированного натриевой солью сульфата декстрана (DSS), показали, что обработка бутиратом приводит к восстановлению трансэпителиального сопротивления, которое было связано с поддержанием целостности плотных контактов и ингибированием высвобождения TNF-альфа (Venkatraman et al., 2000, Scand J Gastroenterol 35). Аналогичным образом, было показано, что введение бутирата молодым животным, таким как поросята-отъемыши, стимулирует рост организма и потребление пищи, что было связано с улучшенным созреванием желудочно-кишечного тракта (Le Gall et al. 2009, Br J Nutr 102).

Модуляция метаболического профиля посредством модуляции микробиоты кишечника или введения определенных соединений, которые, как известно, модулируют микробиоту кишечника, могла тем самым быть использована в качестве потенциального механизма действия против нарушений, связанных с ухудшением целостности кишечника.

В настоящем изобретении описан неожиданным образом улучшенный эффект каротиноидов микробного происхождения по сравнению с каротиноидами в целом на целостность кишечного барьера в результате модуляции состава микроорганизмов кишечника в направлении сообщества микроорганизмов кишечника, более эффективно продуцирущих бутират.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения неожиданным образом обнаружили, что каротиноидные соединения микробного происхождения способны восстанавливать и/или поддерживать полезный для здоровья состав микроорганизмов кишечника у субъектов. В частности, эти каротиноидные соединения микробного происхождения модулируют состав микроорганизмов кишечника у субъектов в направлении сообщества микроорганизмов кишечника, более эффективно продуцирущих бутират, тем самым воздействуя на целостность кишечного барьера.

Таким образом, в первом аспекте настоящего изобретения предусмотрено каротиноидное соединение микробного происхождения формулы (I),

где X представляет собой CH₃ или COOR₂, где R₂ независимо выбран из метила, этила, метилэтила, пропила, изопропила, бутила, изобутила, втор-бутила и трет-бутила, и где m выбран из 0, 1, 2 или 3, и где R₁ представляет собой H или COC_nH_2n+1, при этом n выбирают из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14, для применения в восстановлении и/или поддержании полезного для здоровья состава микроорганизмов кишечника у субъекта.

В настоящем изобретении дополнительно предусмотрено указанное каротиноидное соединение микробного происхождения формулы (I) для применения в предупреждении и/или лечении состояний, связанных с повышенными концентрациями провоспалительных цитокинов в плазме крови у субъекта; в частности, у человека.

Помимо этого, указанное каротиноидное соединение микробного происхождения предусмотрено для применения в повышении физической работоспособности у человека. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено указанное каротиноидное соединение микробного происхождения формулы (I), где X представляет собой CH₃ или COOR₂, где R₂ независимо выбран из метила, этила, метилэтила, пропила, изопропила, бутила, изобутила, втор-бутила и трет-бутила, и где m выбран из 0, 1, 2 или 3, и где R₁ представляет собой H или COC_nH_2n+1, при этом n выбран из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14, для применения в улучшении созревания кишечника и функции кишечного барьера у сельскохозяйственных животных или рыб, или для применения в улучшении параметров продуктивности у сельскохозяйственных животных или рыб.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено каротиноидное соединение микробного происхождения формулы (I), где X представляет собой CH₃ или COOR₂, где R₂ независимо выбран из метила, этила, метилэтила, пропила, изопропила, бутила, изобутила, втор-бутила и трет-бутила, и где m выбран из 0, 1, 2 или 3, и где R₁ представляет собой H или COC_nH_2n+1, при этом n выбран из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14, для применения в предупреждении и/или лечении нарушений, связанных с дефектом целостности кишечного барьера. В дополнительном варианте осуществления указанные нарушения, связанные с дефектом целостности кишечного барьера, выбраны из группы, включающей синдром раздраженного кишечника, воспалительное заболевание кишечника, кишечный дискомфорт, диарею, запор, болезнь Крона, язвенный колит, целиакию, паучит, мукозит, кишечную инфекцию, дисбиоз микробиоты кишечника, метаболический синдром, ожирение, диабет, синдром хронической усталости, сердечно-сосудистое заболевание, психическое расстройство, нейродегенеративное заболевание, ревматоидный артрит, спондилоартрит, форму рака или любую их комбинацию.

Настоящее изобретение направлено на композицию, содержащую каротиноидное соединение микробного происхождения формулы (I), где X представляет собой CH₃ или COOR₂, где R₂ независимо выбран из метила, этила, метилэтила, пропила, изопропила, бутила, изобутила, втор-бутила и трет-бутила, и где m выбран из 0, 1, 2 или 3, и где R₁ представляет собой H или COC_nH_2n+1, при этом n выбран из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14, для применения в предупреждении и/или лечении состояний, связанных с повышенными концентрациями провоспалительных цитокинов в плазме крови у субъекта; в частности, у человека.

Настоящее изобретение дополнительно относится к каротиноидным соединениям формулы (I) или композиции, содержащей каротиноидное соединение микробного происхождения формулы (I), для применения, как описано в данном документе, в различных вариантах осуществления, указанных выше, где X представляет собой CH₃ или COOCH₃, где m представляет собой 3 и где R₁ представляет собой H или COC_nH_2n+1, при этом n равняется 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к каротиноидным соединениям формулы (I) или композиции, содержащей каротиноидное соединение микробного происхождения формулы (I), для применения, как описано в данном документе, в различных вариантах осуществления, указанных выше, где X представляет собой CH₃ и R₁ представляет собой H или COCnH_2n+1, при этом n равняется 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13. Эти каротиноидные соединения микробного происхождения также могут быть определены в данном документе как гликозил-апо-8’-ликопин или C_n-гликозил-апо-8’-ликопин, при этом n выбран из 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к каротиноидным соединениям микробного происхождения формулы (I) или композиции, содержащей каротиноидное соединение микробного происхождения формулы (I), для применения, как описано в данном документе, в различных вариантах осуществления, указанных выше, где X представляет собой COOCH₃ и R₁ представляет собой H или COCnH_2n+1, при этом n равняется 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11. Эти каротиноидные соединения микробного происхождения также могут быть определены как метилгликозил-апо-8’-ликопиноат или метил-C_n-гликозил-апо-8’-ликопиноат, при этом n выбран из 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12.

Каротиноидное соединение микробного происхождения или композиция для применения, как описано в данном документе, во всех различных вариантах осуществления, дополнительно характеризуется тем, что каротиноидное соединение микробного происхождения получено из вида бактерий, выбранного из Bacillus, Staphylococcus, Streptococcus, Methylobacterium, Rubritalea или Sporosarcina; более конкретно из вида Bacillus indicus. В еще одном дополнительном варианте осуществления каротиноидное соединение микробного происхождения получено из штамма PD01, зарегистрированного под номером доступа LMG P-29664 (зарегистрированного в BCCM 15 июня 2016 г.), или штамма Bacillus indicus HU19 (с номером доступа NCIMB 41359).

Как указано выше, настоящее изобретение направлено на по меньшей мере одно каротиноидное соединение микробного происхождения, как определено в данном документе выше, композицию, содержащую указанное каротиноидное соединение микробного происхождения, как определено в данном документе выше, для применения в восстановлении и/или поддержании полезного для здоровья состава микроорганизмов кишечника у субъекта. Указанный субъект может представлять собой млекопитающее, рыбу или птицу. В конкретном варианте осуществления указанный субъект представляет собой человека. В другом конкретном варианте осуществления указанный субъект представляет собой продуктивное или сельскохозяйственное животное или домашнее животное. Продуктивное или сельскохозяйственное животное может быть выбрано из группы, включающей свинью, овцу, козу, корову, лошадь, курицу, утку, гуся, индюка или кролика. Домашнее животное может быть выбрано из кошки или собаки.

Как уже было указано в данном документе выше, в настоящем изобретении раскрыто каротиноидное соединение для применения в восстановлении и/или поддержании полезного для здоровья состава микроорганизмов кишечника у субъекта. Состав микроорганизмов кишечника, также называемый микробиотой кишечника, представляет собой сложную экосистему в желудочно-кишечном тракте субъекта. Он состоит из целого сообщества микроорганизмов в кишечнике, в том числе бактерий, дрожжей, грибов, архей и вирусов. Микробиота кишечника поддерживает несколько важных функций, в том числе ферментацию пищевых волокон в толстом кишечнике, экстракцию нутриентов, синтез определенных витаминов, предупреждение колонизации патогенами, созревание кишечного эпителия и иммунной системы, высвобождение метаболитов в системные ткани, а также модуляцию высвобождения желудочно-кишечных гормонов и нервную функцию. Общепризнанно, что нарушение нормального баланса в составе микроорганизмов кишечника может приводить к ухудшению целостности кишечного барьера и это часто наблюдается при многих различных заболеваниях. В настоящем изобретении показано, что применение каротиноидного соединения, как определено в данном документе выше, или материала микробного происхождения, или композиции, содержащей указанное каротиноидное соединение, приводит к восстановлению и/или поддержанию полезного для здоровья состава микроорганизмов кишечника у субъекта. Указанное восстановление и/или поддержание полезного для здоровья состава микроорганизмов кишечника включает:

- стимуляцию роста и/или активности одной или ограниченного количества полезных бактерий в кишечном тракте,

- ингибирование роста и/или активности одной или ограниченного количества патогенных бактерий в кишечном тракте,

- повышение прикрепления непатогенных бактерий к слизистой оболочке поверхности желудочно-кишечного тракта,

- снижение неконтролируемого захвата антигенов, провоспалительных бактерий или бактериальных продуктов кишечника,

- обеспечение противовоспалительной активности на поверхности кишечника,

- повышение функций кишечного барьера, и/или

- продуцирование полезных для здоровья метаболитов микробного происхождения.

В дополнительном варианте осуществления соединение или композиция в соответствии с настоящим изобретением, как определено в данном документе выше, предназначены для применения в предупреждении и/или лечении нарушений, связанных с дефектом целостности кишечного барьера. В конкретном варианте осуществления указанное соединение или композиция предназначены для применения в предупреждении и/или лечении синдрома раздраженного кишечника, воспалительного заболевания кишечника, кишечного дискомфорта, диареи, запора, болезни Крона, язвенного колита, целиакии, паучита, мукозита, кишечной инфекции, вызванной патогенами (бактериями, вирусами, грибами), дисбиоза микробиоты кишечника, метаболического синдрома, ожирения, сахарного диабета, синдрома хронической усталости, сердечно-сосудистого заболевания, психического состояния, нейродегенеративного заболевания, ревматоидного артрита, спондилоартрита, формы рака или любой их комбинации. Примеры нейродегенеративных заболеваний включают без ограничения ALS, деменцию, болезнь Альцгеймера, болезнь Парксинсона и болезнь Хантингтона. Примеры типов рака включают без ограничения рак легких, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы и особенно колоректальный рак. Примеры аутоиммунных заболеваний включают без ограничения рассеянный склероз, атопический дерматит, целиакию, псориаз и волчанку.

В другом варианте осуществления указанное соединение или композиция в соответствии с настоящим изобретением, как определено в данном документе, предназначены для применения в предупреждении и/или лечении состояний, связанных с повышенными концентрациями провоспалительных цитокинов в плазме крови у субъекта, в частности, у человека. Указанные повышенные концентрации провоспалительных цитокинов у субъекта, в частности, человека, наблюдаются при нарушениях, выбранных из группы, включающей синдром раздраженного кишечника, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, язвенный колит, целиакию, паучит, мукозит, инфекционные заболевания, ревматизм, ревматоидный артрит, спондилоартрит, гиперхолестеринемия, метаболический синдром, ожирение, диабет, аутоиммунное состояние, ухудшенную иммунную функцию.

В еще одном варианте осуществления соединение или композиция в соответствии с настоящим изобретением, как определено в данном документе выше, предназначены для применения в повышении физической работоспособности.

В еще одном варианте осуществления указанное соединение или композиция в соответствии с настоящим изобретением, как определено в данном документе выше, предназначены для применения в улучшении созревания кишечника и функции кишечного барьера у сельскохозяйственных животных или рыб. В еще одном дополнительном варианте осуществления указанное соединение или композиция предназначены для применения в улучшении параметров продуктивности у сельскохозяйственных животных или рыб. Параметры продуктивности могут включать средний суточный прирост (ADG) или коэффициент конверсии корма (FCR) во время фазы доращивания и откорма. Помимо этого, параметры продуктивности также отражены в смертности растущих животных.

В настоящем изобретении также раскрыт способ лечения и/или предупреждения нарушения, связанного с дефектом целостности кишечного барьера, или нарушения, связанного с дефектом состава микроорганизмов кишечника, в котором каротиноидное соединение, как описано в данном документе выше, используется для стимуляции роста и/или активности одной или ограниченного количества полезных бактерий в кишечном тракте, для ингибирования роста и/или активности одной или ограниченного количества патогенных бактерий в кишечном тракте, для относительного повышения прикрепления непатогенных бактерий к слизистой оболочке поверхности желудочно-кишечного тракта, для снижения неконтролируемого захвата антигенов, провоспалительных бактерий или бактериальных продуктов кишечником, для обеспечения противовоспалительной активности на поверхности кишечника, для повышения функционирования кишечного барьера и/или для продуцирования полезных для здоровья метаболитов микробного происхождения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Посредством конкретной ссылки на фигуры подчеркивается, что показанные подробности приведены лишь с помощью примера и в целях иллюстративного рассмотрения различных вариантов осуществления настоящего изобретения. Они приведены по причине представления того, что считается наиболее применимым и легко доступным описанием идей и концептуальных аспектов настоящего изобретения. В связи с этим не предпринимается попытка показать структурные детали настоящего изобретения подробнее, чем это необходимо для фундаментального понимания настоящего изобретения. Описание, взятое совместно с графическими материалами, поясняет специалистам в данной области техники, как можно реализовать на практике несколько форм настоящего изобретения.

Фиг. 1. Соединение формулы (I).

Фиг. 2. Профиль каротиноидов, содержащихся в вегетативных клетках и спорах штамма Bacillus indicus PD01. A = неэстерифицированные каротиноиды оранжевого цвета, B = неэстерифицированные каротиноиды желтого цвета, C = эстерифицированные каротиноиды оранжевого цвета, D = эстерифицированные каротиноиды желтого цвета.

Фиг. 3. Каротиноидный профиль «свободного O» каротиноидного экстракта штамма Bacillus indicus PD01. Хроматограмму получают при 200-600 нм.

Фиг. 4. Каротиноидный профиль каротиноидного экстракта «сложный эфир Y/O» штамма Bacillus indicus PD01. Хроматограмму получают при 200-600 нм.

Фиг. 5. Суммарные уровни короткоцепочечных жирных кислот (SCFA) (мM) (A) и соотношение бутирата к ацетату (B/A) (B), измеренное в проксимальном отделе толстой кишки (PC) или дистальном отделе толстой кишки (DC) симулятора экосистемы из микроорганизмов кишечника человека (SHIME®), как необработанного (контроль), так и обработанного каротиноидами, экстрагированными из штамма PD01 (CAR), или каротиноидами, содержащимися в вегетативных клетках штамма PD01 (VEG).

Фиг. 6. Профиль на основании денатурирующего градиентного гель-электрофореза (DGGE) при обработке проксимального отдела толстой кишки (PC) (A) или дистального отдела толстой кишки (DC) (B) эксперимента SHIME с использованием каротиноидов, экстрагированных из штамма PD01.

Фиг. 7. Результаты qPCR на основании группы Firmicutes (A) и Clostridium coccoides/Eubacterium rectale (B) при обработке проксимального отдела толстой кишки (PC) и дистального отдела толстой кишки (DC) SHIME, обработанного каротиноидами, экстрагированными из штамма PD01. Результаты выражены в виде повышения/снижения содержания по сравнению с контрольным периодом.

Фиг. 8. Результаты qPCR на основании группы Firmicutes (A) и Clostridium coccoides/Eubacterium rectale (B) при обработке проксимального отдела толстой кишки (PC) и дистального отдела толстой кишки (DC) SHIME, обработанного каротиноидами, содержащимися в спорам штамма PD01. Результаты выражены в виде повышения/снижения содержания по сравнению с контрольным периодом.

Фиг. 9. Дендрограмма, сравнивающая микробиоту кишечника крыс до обработки (T0), крыс, подвергнутых воздействию в течение 8 недель с помощью рациона с низким содержанием жиров (LF), и крыс, подвергнутых воздействию в течение 8 недель с помощью рациона с высоким содержанием жиров (HF).

Фиг. 10. Дендрограмма, сравнивающая микробиоту кишечника крыс до обработки (T0), крыс, подвергнутых воздействию в течение 8 недель с помощью рациона с низким содержанием жиров (LF), крыс, подвергнутых воздействию в течение 8 недель с помощью рациона с высоким содержанием жиров (HF), и крыс, подвергнутых воздействию в течение 8 недель с помощью рациона с высоким содержанием жиров и каротиноидов, содержащихся в вегетативных клетках штамма PD01.

Фиг. 11. Дендрограмма, сравнивающая крыс до обработки (T0), крыс, подвергнутых воздействию в течение 8 недель с помощью рациона с низким содержанием жиров (LF), крыс, подвергнутых воздействию в течение 8 недель с помощью рациона с высоким содержанием жиров (HF), крыс, подвергнутых воздействию в течение 8 недель с помощью рациона с высоким содержанием жиров и лютеина (LUT), и крыс, подвергнутых воздействию в течение 8 недель с помощью рациона с высоким содержанием жиров и каротиноидов, экстрагированных из штамма PD01 (CAR).

Фиг. 12. Трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER), измеренное через 18 ч после обработки совместных культур Caco-2/THP1XB каротиноидами, экстрагированными из вегетативных клеток или спор штамма PD01 или содержащимися в них. Пунктирная линия принята за среднее значение контроля gM для сравнительных целей. (*) представляет собой значимо отличающиеся от контроля значение gM (t-критерий); α-токоф. = альфа-токоферол; CAR = каротиноиды, экстрагированные из штамма PD01; CELL = каротиноиды, содержащиеся в вегетативных клетках штамма PD01, gM ctrl = контроль среды для выращивания (DMEM); SP = каротиноиды, содержащиеся в спорах штамма PD01; IV = исходное значение, т.е. TEER до обработки (0 ч).

Фиг. 13. Концентрации TNF-α в плазме крови (пг/мл) у крыс через 8 недель после воздействия с помощью рациона с низким содержанием жиров (LF), рациона с высоким содержанием жиров (HF), рациона с высоким содержанием жиров и каротиноидов, содержащихся в спорах PD01 (SP), рациона с высоким содержанием жиров и каротиноидов, содержащихся в вегетативных клетках PD01 (CELL) или рациона с высоким содержанием жиров и каротиноидов, экстрагированных из PD01 (CAR).

Фиг. 14. Изменение значения шкалы оценки желудочно-кишечных симптомов (GSRS) в случае синдрома несварения от исходного уровня до конца периода исследования для здоровых индивидов с избыточным весом, получавших лечение каротиноидами штамма PD01 и получавших лечение препаратом плацебо (n равняется 29 и n равняется 31 соответственно). * p<0,1; **p<0,05.

Фиг. 15. Концентрации каротиноидов в плазме крови натощак субъектов с избыточным весом, получавших лечение PD01 (n равняется 29), во время фазы II клинического исследования. Горизонтальные столбцы представляют собой медианы; прямоугольники представляют собой 25-й-75-й процентили и «ящики с усами» указывают на 5-й-95-й процентили. Небольшие кружочки указывают на выбросы.

Фиг. 16. Суммарные уровни короткоцепочечных жирных кислот (SCFA) (мкмоль/г) (A) и соотношения бутирата к ацетату (B/A) (B) в содержимом желудка поросят-отъемышей после 23-дневного добавления каротиноидов, содержащихся в спорах штамма PD01 по сравнению с контрольным рационом (n равняется 2x8).

Фиг. 17. Сравнительная экспрессия генов плотного контакта TJP1 и OCLN (нормализованная на экспрессию HBMS2) в ткани кишечника поросят-отъемышей после 23-дневного добавления каротиноидов, содержащихся в спорах штамма PD01 по сравнению с контрольным рационом (n равняется 2x8). *p<0,1; SI (50%), SI (90%): 50%, 90% длины тонкого кишечника.

Фиг. 18. Сравнительная экспрессия генов IL-1a в ткани кишечника поросят-отъемышей после 23-дневного добавления каротиноидов, содержащихся в спорах штамма PD01 по сравнению с контрольным рационом (n равняется 2x8). SI (90%): 90% длины тонкого кишечника.

Фиг. 19. Анализ главных компонентов (PCA) иммуномодулирующего ответа PBMC при воздействии LPS в отдельности или LPS и каротиноидов PD01, экстрагированных из вегетативных клеток или спор PD01 или содержащихся в них; LPS и бета-каротина при 10 μM или 25 μM; LPS и вегетативных клеток Bacillus clausii; LPS и носителя; по сравнению с необработанными клетками в полной среде (CM) (n = 2 донора, 3 лунки/обработка).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способам, соединениям и композициям, содержащим каротиноидные соединения микробного происхождения, и их применению для модуляции состава микроорганизмов кишечника в направлении более эффективного и полезного для здоровья сообщества микроорганизмов кишечника. В частности, было обнаружено, что способы, соединения и композиции, содержащие каротиноидные соединения микробного происхождения в соответствии с настоящим изобретением, оказывают полезный эффект на продуцирование бутирата в кишечнике, главным образом в результате модуляции микробиоты кишечника в направлении сообщества микроорганизмов, более эффективно продуцирующих бутират.

Состав микроорганизмов кишечника, также называемый кишечным микробиомом, представляет собой сложную экосистему в желудочно-кишечном тракте человека или животного. Он состоит из целого сообщества микроорганизмов в кишечнике, в том числе бактерий, дрожжей, грибов, архей и вирусов. Микробиота кишечника поддерживает несколько важных функций, в том числе ферментацию пищевых волокон в толстом кишечнике, экстракцию нутриентов, синтез определенных витаминов, предупреждение колонизации патогенами, созревание кишечного эпителия и иммунной системы, высвобождение метаболитов в системные ткани, а также модуляцию высвобождения желудочно-кишечных гормонов и нервную функцию. Общепризнанно, что нарушение нормального баланса в составе микроорганизмов кишечника может приводить к ухудшению целостности кишечного барьера и это наблюдается при многих различных заболеваниях, в том числе при синдроме раздраженного кишечника, воспалительном заболевании кишечника, кишечном дискомфорте, диарее, запоре, болезни Крона, язвенном колите, целиакии, паучите, мукозите, кишечной инфекции, вызванной патогенами (бактериями, вирусами, грибами), дисбиозе микробиоты кишечника, а также при аутоиммунных заболеваниях, метаболическом синдроме, сердечно-сосудистых заболеваниях, ожирении, сахарном диабете 2 типа, синдроме хронической усталости, психическом состоянии, нейродегенеративном заболевании, ревматоидном артрите, спондилоартрите, форме рака или любой их комбинации.

Микробиота кишечника также является источником воспалительных молекул, таких как липополисахарид и пептидогликан, которые могут способствовать метаболическому заболеванию.

Кишечный слой образует окончательный барьером между содержимым просвета кишечника и средой организма. Таким образом, поддержание этого барьера является крайне важным, а ухудшение целостности этого кишечного барьера часто является причиной многих заболеваний, таких как воспалительное заболевание кишечника, синдром раздраженного кишечника или целиакия. Таким образом, взаимодействие между эпителиальными клетками кишечного слоя является крайне важным для поддержания целостности кишечного барьера. Эти взаимодействия осуществляются с помощью плотных контактов, десмосом, адгезивных контактов и щелевых контактов между эпителиальными клетками. Изменения целостности кишечника могут возникать в результате изменений слоя слизистой оболочки, изменений пролиферации эпителиальных клеток или клеточной смерти, или изменений связей, например, плотных контактов между прилегающими клетками.

Помимо этого, в кишечнике и во время ферментации анаэробные бактерии расщепляют неперевариваемые углеводы в короткоцепочечные жирные кислоты, в том числе ацетат, пропионат и бутират. Бутират играет основную роль в поддержании здоровья кишечника, поскольку он является основным источником энергии для колоницитов, и важным регулятором экспрессии генов, воспаления, дифференциации и апоптоза в клетках-хозяевах (Louis and Flint, FEMS Microbiol Lett 294, 2009). Помимо этого, бутират играет важную роль на уровне кишечника с помощью усиления защитного барьера эпителия посредством его влияния на продуцирование слизи и экспрессию плотных контактов, приводя к уменьшенному прохождению токсических и провоспалительных веществ вдоль кишечного слоя. Также было показано, что бутират снижает проницаемость кишечника, как в условиях in vitro, так и in vivo, в результате ограничения повышенной проницаемости кишечника, индуцированной в моделях заболеваний. Помимо этого, введение бутирата молодым животным, таким как поросята-отъемыши, стимулирует рост организма и потребление пищи, что связано с улучшенным созреванием желудочно-кишечного тракта.

В настоящем изобретении показано, что каротиноидное соединение микробного происхождения для применения, как определено в данном документе выше, или композиция, содержащая указанное каротиноидное соединение микробного происхождения, для применения, как указано в данном документе выше, оказывают полезный эффект на продуцирование бутирата в кишечнике, главным образом в результате модуляции микробиоты кишечника в направлении сообщества микроорганизмов, эффективно продуцирующих бутират. Этот полезный эффект не наблюдали с использованием каротиноидов растительного происхождения, например, лютеина.

Таким образом, в одном варианте осуществления в настоящем изобретении раскрыто каротиноидное соединение формулы (I) для применения в восстановлении и/или поддержании полезного для здоровья состава микроорганизмов кишечника у субъекта. Как указано в данном документе выше, в одном варианте осуществления настоящего изобретения в формуле (I) X представляет собой CH₃ или COOR₂, где R₂ независимо выбран из метила, этила, метилэтила, пропила, изопропила, бутила, изобутила, втор-бутила и трет-бутила, и где m выбран из 0, 1, 2 или 3, и где R₁ представляет собой H или COC_nH_2n+1, при этом n выбран из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14. Предпочтительными каротиноидными соединениями по настоящему изобретению являются таковые формулы (I), как показано на фигуре 1, где X представляет собой CH₃ или COOCH₃, где m представляет собой 3 и где R₁ представляет собой H или COC_nH_2n+1, при этом n выбран из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13. Предпочтительно X представляет собой CH₃ и R₁ представляет собой H или COC_nH_2n+1, при этом n выбран из 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13. В другом предпочтительном варианте осуществления X представляет собой СООCH₃ и R₁ представляет собой H или COC_nH_2n+1, при этом n выбран из 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления эти каротиноидные соединения микробного происхождения представляют собой гликозил-апо-8’-ликопин или C_n-гликозил-апо-8’-ликопин, при этом n выбран из 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14. В другом предпочтительном варианте осуществления эти каротиноидные соединения микробного происхождения представляют собой метилгликозил-апо-8’-ликопиноат или метил-C_n-гликозил-апо-8’-ликопиноат, при этом n выбран из 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12.

Каротиноидное соединение микробного происхождения по настоящему изобретению принадлежит к группе каротиноидов. В последнее время каротиноиды привлекли много интереса в индустрии функциональных продуктов питания в связи со своими потенциальными полезными для здоровья эффектами. Изначально обнаруженные в растениях, выступая в качестве вспомогательного пигмента во время фотосинтеза, каротиноиды представляют собой липофильные антиоксиданты, которые были связаны со сниженным риском сердечно-сосудистого заболевания, макулярной дегенерации и других хронических заболеваний. Несмотря на то, что образование каротиноидов также было обнаружено в некоторых бактериях и грибах для защиты против повреждения УФ-излучением и оксидантного стресса, люди и другие животные неспособны синтезировать каротиноиды, и в связи с этим нуждаются в их получении из рациона. Всасывание каротиноидов из рациона зависит от эффективного высвобождения каротиноидов из пищевой матрицы и последующей растворимости желчными кислотами и пищеварительными ферментами, завершаясь их включением в смешанные мицеллы. Основная часть метаболизма каротиноидов происходит в тонком кишечнике, в котором они также должны быть растворены в пищевых липидах до того, как они могут пассивно передвигаться из мицеллярной фазы через просвет кишечника к лимфатической и кровеносной системе. В то же время неизвестно, все ли каротиноиды, присутствующие в смешанной мицелле, всасываются, или некоторые остаются связанными с невсосавшимися желчными солями и холестерином, подлежащими всасыванию дистальнее, или опускаются в толстый кишечник, в котором они выполняют другие биологические функции.

Было идентифицировано более 600 встречающихся в природе каротиноидов, из которых примерно 50 могут превращаться в ретинол (т.е. витамин A), и называются каротиноидами провитамина A. Каротиноиды провитамина A могут превращаться ферментативным путем в слизистой оболочке кишечника с образованием ретинола. Ретинол требуется для зрения, поддержания дифференцированного эпителия, секреции слизи и размножения (McCullough et al., 1999, Proc Nutr Society, 58(2)). У человека активность в качестве провитамина А является единственной функцией каротиноидов, которая является однозначно признанной и связана с последствиями для здоровья. Помимо своей активности в качестве провитамина A, считается, что многие каротиноиды характеризуются многими биологическими функциями, такими как ингибирование перекисного окисления липидов, противоопухолевая активность, иммуномодулирование и т. д., которые главным образом связаны с их антиоксидантными свойствами. Противоопухолевая активность каротиноидов была связана с их антиоксидантными свойствами, а также индукцией и стимуляцией межклеточного взаимодействия посредством щелевых контактов, которые играют роль в регуляции клеточного роста, дифференциации и апоптоза. Взаимодействие с помощью щелевых контактов между клетками, по-видимому, не зависит от их антиоксидантного свойства или активности в качестве провитамина A (Zhang et al., 1992, Cancer Res 52). Помимо этого, Vieira et al., (2008, J Pediatr Gastroenterol Nutr 47) показали, что концентрации каротиноидов в сыворотке коррелируют с целостностью кишечного барьера. Таким образом, каротиноиды могут обеспечивать эффективный маркер нарушения функции кишечного барьера.

Каротиноидное соединение микробного происхождения для применения в соответствии с настоящим изобретением может быть получено из спор бактерий, вегетативных бактериальных клеток, экстрактов бактериальных клеток, метаболитов бактериальных клеток или любой их комбинации от вида бактерий, выбранных из Bacillus, Staphylococcus, Streptococcus, Methylobacterium, Rubritalea или Sporosarcina. В особенно предпочтительном варианте осуществления указанное каротиноидное соединение для применения в соответствии с различными вариантами осуществления настоящего изобретения получено из вида Bacillus indicus. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанное каротиноидное соединение получено из штамма Bacillus indicus PD01, зарегистрированного под номером доступа LMG P-29664 (зарегистрированном в BCCM 15 июня 2016 г.), или штамма Bacillus indicus HU19 (с номером доступа NCIMB 41359).

Бактерии в типичном случае находятся в форме спор бактерий или в виде вегетативных бактериальных клеток, или смеси обоих. В особенно предпочтительном случае бактерии находятся в форме спор бактерий, их можно обрабатывать таким образом, что они не могут прорастать. Например, споры могут быть обработаны посредством нагревания, и, например, могут быть подвергнуты автоклавированию для предупреждения прорастания. Во многих случаях бактерии могут быть предусмотрены в форме спор, которые могут прорастать. В другом предпочтительном варианте осуществления бактерии находятся в форме вегетативных клеток. Споры или вегетативные клетки в одном варианте осуществления могут быть представлены в выделенной форме. В еще одном варианте осуществления материал микробного происхождения может представлять собой экстракты бактериальных клеток. В еще одном варианте осуществления материал микробного происхождения может представлять собой метаболиты бактериальных клеток, высвободившиеся во время клеточного роста в среде для культивирования. В другом дополнительном варианте осуществления материал микробного происхождения может представлять собой любую комбинацию спор бактерий, вегетативных бактериальных клеток, экстракта бактериальных клеток или метаболитов бактериальных клеток.

Каротиноидное соединение микробного происхождения для применения в соответствии с различными вариантами настоящего изобретения приводит к повышенному продуцированию бутирата микробиотой кишечника. В частности, указанное каротиноидное соединение микробного происхождения модулирует состав микроорганизмов кишечника в пользу бактерий, продуцирующих бутират. Экспрессируемое различным образом каротиноидное соединение микробного происхождения для применения в соответствии с настоящим изобретением приводит к восстановлению и/или поддержанию полезного для здоровья состава микроорганизмов кишечника в результате индукции изменений состава микроорганизмов кишечника в пользу бактерий, продуцирующих бутират. Помимо этого, каротиноидное соединение микробного происхождения для применения в соответствии с настоящим изобретением также улучшает функцию кишечного барьера посредством снижения проницаемости кишечного барьера и повышения сопротивления кишечного барьера.

Используемое в данном документе каротиноидное соединение, материал микробного происхождения или композиция, как определено в данном документе выше, предназначена для восстановления и/или поддержания полезного для здоровья состава микроорганизмов кишечника у субъекта. Указанное восстановление и/или поддержание полезного для здоровья состава микроорганизмов кишечника включает:

- стимуляцию роста и/или активности одной или ограниченного количества полезных бактерий в кишечном тракте,

- ингибирование роста и/или активности одной или ограниченного количества патогенных бактерий в кишечном тракте,

- повышение прикрепления непатогенных бактерий к слизистой оболочке поверхности желудочно-кишечного тракта,

- снижение неконтролируемого захвата антигенов, провоспалительных бактерий или бактериальных продуктов кишечника,

- обеспечение противовоспалительной активности на поверхности кишечника,

- повышение функций кишечного барьера и/или

- продуцирование полезных для здоровья метаболитов микробного происхождения.

Экспрессируемое различным образом каротиноидное соединение, материал микробного происхождения или композиция в соответствии с настоящим изобретением предназначена для применения в восстановления и/или поддержании нормального гомеостаза в составе микроорганизмов кишечника у субъекта, и, таким образом, также приводит к восстановлению и/или поддержанию общего здоровья кишечника у субъекта.

В связи со своими положительными эффектами на функцию кишечного барьера настоящее изобретение также направлено на каротиноидное соединение микробного происхождения формулы (I), как определено в данном документе выше, или композицию, содержащую указанное соединение, для применения в предупреждении и/или лечении нарушений, связанных с дефектом целостности кишечного барьера. Также в настоящем изобретении раскрыт способ лечения и/или предупреждения нарушения, связанного с дефектом целостности кишечного барьера, при этом соединение или композиция в соответствии с настоящим изобретением и, как определено в данном документе выше, используется для:

- стимуляции роста и/или активности одной или ограниченного количества полезных бактерий в кишечном тракте,

- ингибирования роста и/или активности одной или ограниченного количества патогенных бактерий в кишечном тракте,

- повышения прикрепления непатогенных бактерий к слизистой оболочке поверхности желудочно-кишечного тракта,

- снижения неконтролируемого захвата антигенов, провоспалительных бактерий или бактериальных продуктов кишечника,

- обеспечения противовоспалительной активности на поверхности кишечника,

- повышения функций кишечного барьера и/или

- продуцирования полезных для здоровья метаболитов микробного происхождения.

Нарушения, связанные с дефектом целостности кишечного барьера или связанные с дисфункцией кишечного барьера, выбраны без ограничения из группы, включающей синдром раздраженного кишечника, воспалительное заболевание кишечника, кишечный дискомфорт, диарею, запор, болезнь Крона, язвенный колит, целиакию, паучит, мукозит, кишечную инфекцию, вызванную патогенами (бактериями, вирусами, грибами), дисбиоз микробиоты кишечника, метаболический синдром, ожирение, диабет, синдром хронической усталости, сердечно-сосудистое заболевание, психическое состояние, нейродегенеративное заболевание, ревматоидный артрит, спондилоартрит, форму рака или любые их комбинации.

«Воспалительное заболевание кишечника» (IBD), также называемое «хроническое заболевание толстой кишки», как используется в данном документе, включает любое состояние, характеризующееся устойчивым воспалением слизистой оболочки на различных уровнях желудочно-кишечного тракта, такое как, например, болезнь Крона или язвенный колит.

«Синдром раздраженного кишечника» (IBS), как используется в данном документе, представляет собой распространенное нарушение, которое поражает толстый кишечник или толстую кишку. IBS часто вызывает спазмы, боль в животе, вздутие, газообразование, диарею и запор. В отличие от других желудочно-кишечных заболеваний, таких как болезнь Крона или язвенный колит, IBS представляет собой хроническое состояние, которое не вызывает изменений в ткани кишечника или повышает риск колоректального рака. При IBS с преобладанием диареи исследования с помощью электронной микроскопии показали конденсацию цитоскелета и увеличенные межклеточные промежутки между эпителиальными клетками, что обеспечивает морфологическую основу для повышенной кишечной проницаемости при IBS.

«Язвенный колит», как используется в данном документе, представляет собой хроническую рецидивирующую форму IBD, которая вызывает воспаление и язвы в толстой кишке. Данное заболевания представляет собой тип колита, который представляет собой группу заболеваний, которые вызывают воспаление толстой кишки. Основным симптомом активного язвенного колита является диарея с примесью крови.

«Болезнь Крона» также представляет собой тип IBD, который может поражать любую часть желудочно-кишечного тракта от ротовой полости до анального отверстия. Признаки и симптомы часто включают боль в животе, диарею, которая может быть кровянистой, лихорадку и потерю веса. Другие осложнения могут возникать за пределами желудочно-кишечного тракта и включают анемию, кожную сыпь, артрит, воспаление глаза и ощущение усталости. Также часто встречается кишечная непроходимость и пациенты с этим заболеванием имеют повышенный риск рака кишечника. Болезнь Крона вызвана комбинацией факторов среды, иммунных и бактериальных факторов у генетически предрасположенных индивидов. Она приводит к хроническому воспалительному нарушению, при котором иммунная система организма атакует желудочно-кишечный тракт, возможно с направленностью на антигены микробного происхождения.

Используемый в данном документе термин «паучит» определяется как воспаление кармана подвздошной кишки. Карман подвздошной кишки представляет собой искусственную прямую кишку, созданную хирургическим путем из ткани подвздошной кишки у пациентов, которые подверглись колэктомии. Карман подвздошной кишки часто создается при лечении пациентов с язвенным колитом.

«Целиакия» представляет собой аутоиммунное нарушение, поражающее преимущественное тонкий кишечник. Классические симптомы включают желудочно-кишечные нарушения, такие как хроническая диарея, вздутие живота, нарушение всасывания, потеря аппетита и у детей неспособность к нормальному росту. Заболевание вызвано реакцией на глютен. При воздействии глютена патологический иммунный ответ может приводить к продуцированию нескольких различных аутоантител, которые поражают ряд различных органов. В тонком кишечнике это вызывает воспалительную реакцию и может приводить к укорочению ворсинок, выстилающих тонкий кишечник, способствуя нарушению всасывания нутриентов, часто приводя к анемии.

Примеры нейродегенеративных заболеваний включают без ограничения ALS, деменцию, болезнь Альцгеймера, болезнь Парксинсона и болезнь Хантингтона. Примеры типов рака включают без ограничения рак легких, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы и особенно колоректальный рак. Примеры аутоиммунных заболеваний включают без ограничения рассеянный склероз, атопический дерматит, целиакию, псориаз и волчанку.

Настоящее изобретение также направлено на каротиноидное соединение микробного происхождения формулы (I), как определено в данном документе выше, или композицию, содержащую указанное соединение, для применения в предупреждении и/или лечении повышенных концентраций провоспалительных цитокинов в плазме крови у человека. Нарушения с повышенными концентрациями провоспалительных цитокинов в плазме у субъекта могут быть выбраны без ограничения из группы, включающей синдром раздраженного кишечника, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, язвенный колит, целиакию, паучит, мукозит, инфекционные заболевания, ревматизм, ревматоидный артрит, спондилоартрит, гиперхолестеринемию, метаболический синдром, ожирение, диабет, аутоиммунные заболевания или ухудшеную иммунную функцию.

В еще одном варианте осуществления соединение или композиция в соответствии с настоящим изобретением, как определено в данном документе выше, предназначены для применения в повышении физической работоспособности. Спортсмены, подверженные воздействию физической нагрузки высокой интенсивности, характеризуются повышенной частотой встречаемости желудочно-кишечных симптомов, например, спазмов, диареи, вздутия, тошноты и кровотечения. Эти изменения были ассоциированы с нарушениями кишечной проницаемости и сниженной функцией кишечного барьера. Повышенная желудочно-кишечная проницаемость также способствует эндотоксемии и приводит к повышенной восприимчивости к инфекционным и аутоиммунным заболеваниям в результате всасывания патогенов или токсинов в ткань или кровоток.

В настоящем изобретении также предусмотрено каротиноидное соединение микробного происхождения, как описано в данном документе выше, или композиция, содержащая указанное соединение, для применения в улучшении созревания кишечника и функции кишечного барьера у сельскохозяйственных животных или рыб. В частности, каротиноидное соединение микробного происхождения или композиции в соответствии с настоящим изобретением улучшают общее состояние здоровья кишечника у животных, таких как сельскохозяйственные животные или рыбы, в результате усиления функции кишечного барьера и модуляции состава микробиоты кишечника, тем самым улучшая созревание кишечника.

Общеизвестно, что общие показатели и продуктивность животных, в частности, свиней, сельскохозяйтвенных животных или рыб, связана с общим состоянием здоровья животных. Предупреждение инфекций и обеспечение здорового состояния у животных, таким образом, являются основными моментами для мясной промышленности или рыбоводства. Как в мясной промышленности, так и в рыбоводстве параметры продуктивности являются основными для измерения продуктивности сельскохозяйственного животного или рыбоводства. В случае сельскохозяйственных животных, таких как свиньи, овцы, крупный рогатый скот, лошади или домашняя птица эти параметры включают средний суточный прирост (ADG) или коэффициент конверсии корма (FCR) во время фазы доращивания и откорма. Помимо этого, параметры продуктивности также отражены в смертности растущих животных.

ПРИМЕРЫ

Настоящее изобретение дополнительно описано посредством отсылки на следующие экспериментальные примеры. Эти примеры предусмотрены лишь с целью иллюстрации и не предназначены для ограничения, если не указано иное. Таким образом, настоящее изобретение не следует воспринимать как ограниченное следующими примерами, а, наоборот, необходимо воспринимать как охватывающее любые возможные вариации, которые становятся очевидными в качестве результата идеи, предусмотренной в данном документе.

Без дополнительного описания, считается, что специалист в данной области техники может с помощью предшествующего описания и последующих иллюстративных примеров создавать и использовать соединения по настоящему изобретению и осуществить на практике заявленные способы. Таким образом, следующие демонстрационные примеры конкретно указывают на предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения, и их не следует воспринимать как ограничивающие каким-либо образом оставшуюся часть настоящего раскрытия.

Пример 1. Характеристика каротиноидов, экстрагированных из штамма Bacillus indicus PD01 (LMG P-29664).

Каротиноиды из штамма PD01 (LMG P-29664), полученные как из вегетативных клеток, так и из спор, характеризовали с помощью ультравысокоэффективной жидкостной хроматографии с диодно-матричной детекцией-масс-спектрометрии (UHPLC-DAD-MS). Каротиноиды экстрагировали из бактерий путем оптимизированной экстракции липидов, а их каротиноидный состав и содержание определяли с помощью анализа HPLC на колонке C18. Результаты показали, что экстракты из вегетативных клеток состояли главным образом из каротиноидов, которые поглощают свет при 430/454/484 нм и эти каротиноиды определяли как эстерифицированные и неэстерифицированные каротиноиды желтого цвета (фиг. 2). В отличие от этого, экстракты, полученные из спор, состояли из двух групп каротиноидов, которые поглощают свет при 430/454/484 нм (каротиноиды желтого цвета) и при 440/466/494. Последние определяли как эстерифицированные и неэстерифицированные каротиноиды оранжевого цвета (фиг. 2).

Два различных каротиноидных экстракта из штамма PD01 дополнительно анализировали с помощью UHPLC-DAD-MS и спектрофотометрии в целях определения различных отдельных каротиноидов, присутствующих в смеси.

Первый каротиноидный экстракт, называемый экстракт «свободный O» (для обозначения «свободный оранжевый»), получали из смеси вегетативных клеток и спор. Основным каротиноидом, присутствующим в экстракте, был каротиноид оранжевого цвета метилгликозил-апо-8’-ликопиноат (в свободной форме, фиг. 3, пики 1 и 2), а другие каротиноиды, обнаруженные в меньших количествах в этом экстракте, представляли собой эстерифицированныей формы этого каротиноида оранжевого цвета (фиг. 3, пики 4-10), свободные и эстерифицированные формы каротиноида желтого цвета (фиг. 3, пики 3 и 12-14), а также 8’-апофитоен (пик 18, предшественник каротинода оранжевого/желтого цвета) и менахинон-7 (фиг. 3, пик 19). Спектральные свойства и конкретную идентификацию этих каротиноидов можно найти в таблице 1.

Другой экстракт штамма PD01, называемый экстракт «сложный эфир Y/O» (для обозначения «сложный эфир желтый/оранжевый»), получали из другой смеси вегетативных клеток и спор (другое соотношение). Анализ UHPLC-DAD-MS показал, что этот экстракт состоял главным образом из эстерифицированной формы каротиноидов оранжевого цвета и эстерифицированной формы каротиноидов желтого цвета (фиг. 4, пики 4-17). В этом экстракте содержание менахинона-7 (пик 19) и 8’-апофитоена (пик 18, предшественника каротиноида оранжевого/желтого цвета) было значительным. Идентификация и спектральные свойства различных пиков подробно представлены в таблице 1.

Таблица 1. Спектральные свойства и идентификация каротиноидов штамма PD01

Пример 2. Влияние каротиноидов из штамма PD01 (LMG P-29664) на продуцирование бутирата in vitro .

Для изучения влияния повторного введения каротиноидов из штамма PD01 на продуцирование бутирата проводили эксперименты с использованием динамической модели кишечника, симулятором экосистемы микроорганизмов кишечника человека (SHIME®). Во время экспериментов блоки SHIME состояли из трех последовательных сосудов, представляющих желудок/тонкий кишечник, проксимальный отдел толстой кишки и дистальный отдел толстой кишки соответственно. Для изучения различных составов каротиноидов (т.е., каротиноидов, экстрагированных из бактериальных клеток («CAR») или содержащихся в (вегетативных) бактериальных клетках («VEG»)) идентичные блоки SHIME запускали параллельно. Спустя 2 недели после периода стабилизации осуществляли эталонный контрольный период (2 недели), после которого каротиноиды вводили ежедневно в течение 3 недель во время периода обработки. Каротиноиды вводили как в виде экстракта, так и в виде вегетативных клеток при аналогичных уровнях каротиноидов. В то время как каротиноидный экстракт вводили в желудочный отдел, поскольку он мог выдерживать агрессивные условия желудка, чувствительные к желудочному соку вегетативные клетки вводили в начале инкубации тонкого кишечника, поскольку он симулировал целевую стратегию доставки с помощью защитных от желудочного сока капсул.

Продуцирование короткоцепочеченых жирных кислот (SCFA) контролировали в виде маркера сахаролитической ферментации. Специфическое продуцирование определенных SCFA связано с различными эффектами для здоровья. Ацетат может быть использован в качестве источника энергии для организма. Пропионат снижает синтез холестерина и жирных кислот в печени. Бутират является основным источником энергии для колоноцитов и индуцирует дифференциацию в этих клетках.

Результаты на основании эксперимента SHIME показали, что несмотря на то, что изменения суммарного продуцирования SCFA отсутствовали или были незначительными (фиг. 5A), как свободные каротиноиды, так и каротиноиды, вводимые в виде вегетативных клеток, изменяли профили SCFA посредством индукции сдвига от ацетата к полезному для здоровья бутирату SCFA (фиг. 5B). Для дополнительного подтверждения выполняли другой эксперимент с той же самой схемой, однако в котором каротиноиды вводили в виде спор бактерий. Аналогичным образом введение спор приводило к повышению соотношения бутирата к ацетату.

Таким образом, можно сделать вывод, что введение каротиноидов из штамма PD01 (вводимых как в виде свободных каротиноидов, так и в бактериальных клетках/спорах) оказывает полезное влияние на активность сообщества микроорганизмов.

Пример 3. Влияние каротиноидов из штамма PD01 (LMG P-29664) на состав микробиома кишечника in vitro .

Для изучения влияния повторного введения каротиноидов из штамма PD01 на состав микробиома кишечника проводили эксперименты с использованием динамической модели кишечника SHIME®. Подробные характеристики эксперимента описаны в примере 2.

Профили QPCR и DGGE получали для исследования того, мог ли штамм PD01 влиять на состав сообщества микроорганизмов. qPCR использовали для контроля конкретных групп бактерий, а именно группы Firmicutes, Bacteroidetes, Bifidobacterium, Lactobacillus и Clostridium coccoides/Eubacterium rectale, в то время как профиль DGGE получали исходя из суммарного сообщества микроорганизмов. Firmicutes и Bacteroidetes были 2 наиболее преобладающими типами бактерий в кишечнике человека. Bacteroidetes считаются очень важными бактериями сахаролитической ферментации, поскольку значительная часть белков Bacteroidetes используется для расщепления полисахаридов и метаболизации их сахаров. Некоторые виды, принадлежащие к этой группе, также связаны с продуцированием пропионата. Firmicutes скорее являются потребителями метаболических посредников, продуцируемых в результате метаболизма Bacteroidetes. Они включают несколько продуцентов бутирата (в том числе Clostridium coccoides и Eubacterium rectale), бактериального метаболита, считающегося полезным для здоровья. Bifidobacteria и Lactobacilli представляют собой 2 рода бактерий, известных благодаря своим полезным для здоровья свойствам.

Профили DGGE на основании эксперимента SHIME, проведенного с использованием каротиноидов, экстрагированных из бактериальных клеток, характеризовались значительными изменениями состава сообщества микроорганизмов кишечника (фиг. 6). Результаты профилей DGGE подтверждали с помощью qPCR. Фактически обработка каротиноидами, экстрагированными из штамма PD01, повышала концентрации всех исследуемых групп бактерий, главным образом в проксимальном отделе толстой кишки. Наиболее интересные результаты наблюдали в случае группы Firmicutes и Clostridium coccoides/Eubacterium rectale (фиг. 7). Поскольку Firmicutes включают несколько продуцентов бутирата (в том числе Clostridium coccoides и Eubacterium rectale), то повышенные концентрации могут считаться полезными для здоровья.

Профили QPCR на основании эксперимента SHIME, проводимого с использованием каротиноидов, содержащихся в спорах бактерий, подтвердили эти результаты. Фактически введение спор бактерий аналогичным образом приводило к повышенным концентрациях основных исследуемых групп бактерий, особенно группы Firmicutes и Clostridium coccoides/Eubacterium rectale (фиг. 8).

Таким образом, данный эксперимент подтверждает, что каротиноиды из штамма PD01 влияют на состав микробиома кишечника и специфически стимулируют группы бактерий, продуцирующих бутират.

Пример 4. Влияние каротиноидов из штамма PD01 (LMG P-29664) на состав микробиома кишечника in vivo .

Для оценки влияния каротиноидов из штамма PD01 на состав микробиома кишечника in vivo самцам крыс Sprague-Dawley в возрасте 90 дней ежедневно в течение 8 недель вводили каротиноиды из штамма PD01, как в виде каротиноидного экстракта, так и в виде каротиноидов, содержащихся в спорах или вегетативных клетках. Эксперимент состоял из назначения животным рациона с высоким содержанием жиров (HF), который имитирует стандартный западный рацион и связан с развитием метаболического синдрома в течение 8 недель после назначения. Помимо контрольной группы HF, отдельные группы животных получали рацион HF в комбинации с одним из каротиноидных составов из штамма PD01. Для осуществления этого каротиноидные составы суспендировали в арахисовом масле и вводили крысам с помощью желудочного зонда в дополнение к рациону HF. Соответствующая суточная доза каротиноидов находилась в диапазоне 10-50 мкг/день.

Контрольную группу, получавшую стандартный рацион с низким содержанием жиров (LF), включали для оценки конкретного влияния рациона HF на состав микробиома кишечника. Помимо этого, включали одну дополнительную группу HF, получавшую каротиноид лютеин растительного происхождения в том же количестве, что и каротиноиды бактериального происхождения (т.е., 25 мкг/день). Это позволяет сравнивать влияние каротиноидов бактериального и растительного происхождения на состав микробиома кишечника.

Для контроля эффектов различных составов на микробиту кишечника получали профили DGGE. Экстрагировали суммарную ДНК фекальных образцов из долговременного эксперимента in vivo и использовали в качестве матрицы в реакций гнездовой ПЦР в целях амплификации гипервариабельного участка V4-V6 бактериального гена 16S rDNA.

Подробный кластерный анализ различных групп показал, что через 8 недель после обработки микробиота кишечника крыс, получавших LF или HF, отличалась друг от друга и обе отличались от микробиоты кишечника крыс до обработки (фиг. 9). Это указывает на то, что изменение рациона частично изменяет состав микроорганизмов кишечника. Однако обработка каротиноидами из штамма PD01 оказывала сильное дополнительное влияние на состав микробиома кишечника, как показано в примере кластерного анализа, включающего профили микробиома крыс, обработанных каротиноидами, содержащимися в вегетативных клетках штамма PD01 (фиг. 10) или обработанных каротиноидами, экстрагированными из штамма PD01 (фиг. 11). Те же самые результаты получали при введении каротиноидов, содержащихся в спорах штамма PD01, подтверждая, что каротиноиды из штамма PD01 дополнительно модифицировали микробиом кишечника крыс на рационе с высоким содержанием жиров, безотносительно к используемому каротиноидному составу.

Интересным является то, что профили состава микроорганизмов кишечника крыс, обработанных лютеином, кластеризовались вместе с таковыми контролей HF, что указывает на то, что животные в этих группах были подобными с точки зрения состава микроорганизмов кишечника. В отличие от этого, состав микроорганизмов кишечника крыс, обработанных каротиноидами, экстрагированными из штамма PD01, значительно отличался (фиг. 11). Этот неожиданный эффект показывает, что каротиноиды микробного происхождения изменяют влияние рациона с высоким содержанием жиров на состав микроорганизмов кишечника, в то время как каротиноид растительного происхождения не характеризуется такими свойствами.

Пример 5. Влияние каротиноидов из штамма PD01 (LMG P-29664) на функцию кишечного барьера in vitro .

Влияние каротиноидов из штамма PD01 (полученных как из вегетативных клеток, так и из спор) на функцию кишечного барьера организма изучали в совместных культурах Caco-2/THP1XB в соответствии со способами, описанными в Possemiers et al. (2013, J Agric Food Chem 61). Конечной точкой измерения было изменение по сравнению с контролем трансэпителиального электрического сопротивления (TEER) в условиях трансвела.

Результаты (фиг. 12) показали, что каротиноиды из штамма PD01 защищают кишечный барьер от дестабилизации сопротивления, в то время как α-токоферол (липофильный каротиноид растительного происхождения, получаемый из того же самого предшественника) не индуцировал защиту. Этот неожиданный эффект показывает, что каротиноиды микробного происхождения оказывают модулирующее влияние на функцию кишечного барьера, в то время как у соединения растительного происхождения отсутствуют эти свойства.

Пример 6. Влияние каротиноидов, экстрагированных из штамма PD01 (LMG P-29664) на воспалительный статус in vivo.

Влияние каротиноидов из штамма PD01 на воспалительный статус оценивали в эксперименте на крысах in vivo в условиях рациона HF, как описано в примере 4. Через 8 недель после обработки крысы, вскармливаемые на рационе HF, характеризовались значимо более высокими уровнями TNF-α в плазме крови, чем крысы, вскармливаемые на стандартном рационе LF. Неожиданным образом было обнаружено, что совместное назначение рациона HF с каротиноидами из штамма PD01 (как экстрагированных из штамма PD01, так и содержащихся в вегетативных клетках или спорах штамма PD01) способствовало предупреждению развития провоспалительного состояния, приводя к сниженным концентрациям провоспалительного цитокина TNF-α в плазме крови по сравнению с группой HF (фиг. 13). Этот результат показывает, что каротиноиды из штамма PD01 (вне зависимости от конкретного состава) могут предупреждать развитие воспаления и, тем самым, характеризуются иммунозащитными свойствами.

Пример 7. Влияние каротиноидов, экстрагированных из штамма PD01 (LMG P-29664), на желудочно-кишечные симптомы у человека.

Влияние каротиноидов из штамма PD01 на желудочно-кишечные симптомы оценивали в фазе II 6-недельного исследования эффективности у здоровых индивидов с избыточным весом. Исследование разрабатывали в виде рандомизированного плацебо-контролируемого двойного слепого параллельного исследования. Целью исследования было изучение эффектов ежедневного потребления каротиноидов из штамма PD01 (содержащихся в спорах бактерий) в отношении модуляции микробиома кишечника. Исследуемая популяция состояла из 60 здоровых индивидов с BMI 25-35 кг/м² в возрасте 18-70 лет. При включении участников рандомизировали на PD01 или плацебо в течение периода, составляющего 6 недель. Каждый участник проходил 3-дневное исследование на базе исследовательского центра, а именно (1) в начале исследования, (2) через 3 недели после введения исследуемого продукта и (3) в конце исследования (через 6 недель после введения исследуемого продукта). Исследуемый продукт предоставляли на первый день исследования для применения в течение последующих 6 недель (до 3-го дня исследования) в соответствующей суточной дозе 5*10⁹ КОЕ/день с мальтодекстрином в качестве вещества-носителя в саше. Препарат плацебо состоял из идентичных саше, содержащих только вещество-носитель. Участников информировали касательно способа введения; один саше необходимо было растворять в 150 мл цельного молока и принимать каждое утро до завтрака в одну и ту же временную точку.

Наличие желудочно-кишечных (GI) симптомов оценивали с помощью валидированной шкалы оценивания желудочно-кишечных симптомов (GSRS), состоящей из 16 пунктов, кластеризующихся в пять основных GI синдромов: синдром боли в животе, рефлюкса, диареи, несварения и запора. Частоту дефекации и консистенцию кала оценивали с помощью Бристольской шкалы стула/формы кала. Субъектов просили заполнить эти опросники с недельными интервалами во время периода исследования. Неожиданным образом было обнаружено, что участники, получавшие ежедневно штамм PD01, набирали меньше баллов по подизмерению GSRS в отношении синдрома несварения через 3 недели после введения (p равняется 0,061, фиг. 14), что становилось значимым в конце периода исследования (p равняется 0,045; фиг. 14). Это подтверждает, что каротиноиды бактериального происхождения из штамма PD01 могут предупреждать или снижать желудочно-кишечные симптомы, которые также в типичном случае описаны для IBS.

Пример 8. Биодоступность каротиноидов у человека.

В фазе II исследования, как описано в примере 7, образцы крови собирали для оценки концентрации каротиноидов бактериального происхождения в плазме крови натощак субъектов с избыточным весом (n равняется 29) до ежедневного введения каротиноидов из штамма PD01 (содержащихся в спорах, находящихся в составах при 5*10⁹ КОЕ/день) и через 3 и 6 недель после их введения.

Каротиноиды штамма PD01 не выявляли на исходном уровне, однако они присутствовали натощак в плазме крови всех субъектов через 3 и 6 недель после лечения с помощью штамма PD01 (фиг. 15). Концентрации каротиноидов PD01 в плазме крови значимо возрастали в течение 6 недель после введения (0,044 мкМ через 3 недели, 0,076 мкM через 6 недель) (фиг. 15).

Это исследование показало, что ежедневное введение каротиноидов, содержащихся в спорах штамма PD01, в течение периода, составляющего 6 недель, приводило к накоплению каротиноидов штамма PD01 в плазме крови. Концентрации каротиноидов штамма PD01 в плазме крови поддавались выявлению у всех субъектов, указывая на то, что каротиноиды штамма PD01 всасывались. Помимо этого, уровни каротиноидов штамма PD01 достигали конечной концентрации, аналогичной как в случае с лютеином. Однако, несмотря на то, что ежедневные уровни потребления лютеина в Европе оцениваются в 1-4 мг/день (здоровый рацион с высоким содержанием фруктов), ежедневное потребление каротиноидов штамма PD01 составляло всего лишь 25 мкг/день. Это дополнительно подтверждает неожиданную более высокую биодоступность каротиноидов штамма PD01 по сравнению с каротиноидами растительного происхождения.

Помимо этого, штамм Bacillus PD01, продуцирующий каротиноиды, количественно оценивали в фекалиях человека с помощью чашечного подсчета на планшетах с агаром LB. Результаты показали, что при лечении с помощью штамма PD01 штамм Bacillus был способен существовать в толстой кишке человека в концентрациях 3*10⁷ КОЕ/г, главным образом в форме вегетативных клеток (таблица 2).

Таблица 2. Подсчет штамма PD01 (КОЕ/г) в фекалиях человека от субъектов, получавших лечение с помощью штамма PD01, в интервенционном исследовании у человека, до периода введения (T0), через 3 недели после ежедневного введения штамма PD01 (T3) и через 6 недель после ежедневного введения штамма PD01 (T6). Результаты выражены в виде среднего значения ± SE; n равняется 29; н.о. = не определено

Пример 9. Влияние каротиноидов, экстрагированных из штамма PD01 (LMG P-29664), на функцию кишечного барьера у человека.

В фазе II исследования эффектности, как описано в примере 7, функцию кишечного барьера оценивали на исходном уровне и в конце периода исследования, состоящего из 6 недель, путем осуществления исследования кишечной проницаемости. Участникам необходимо было ввести подслащенный напиток (в 150 мл воды из-под крана), содержащий 1 г сахарозы, 1 г лактулозы, 0,5 г L-рамнозы, 1 г сукралозы и 1 г эритритола после голодания в течение ночи. До введения собирали образец мочи для анализа содержания сахара на исходном уровне. Затем собирали полный объем мочи в течение 24 часов в три отдельные фракции, т.е., 0-2, 2-5 и 5-24 часов. Сахарозу, лактулозу, L-рамнозу, сукралозу и эритритол определяли с помощью жидкостной хроматогафии высокого давления с флуоресцентной детекцией, как описано в литературе.

Исследование показало, что ежедневное введение каротиноидов, содержащихся в спорах штамма PD01, в течение периода, составляющего 6 недель, приводило к снижению экскреции сахарозы (таблица 3), указывая на то, что каротиноиды штамма PD01 улучшали проницаемость тонкого кишечника. Аналогичные эффекты наблюдали в случае проницаемости толстой кишки. Этот результат подтверждает наблюдения in vitro влияния каротиноидов штамма PD01 на функцию кишечного барьера у человека.

Таблица 3. Экскреция сахарозы (μмоль) и соотношения экскретируемых сахаров, измеренных в моче во фракции 0-5, 5-24 и 0-24 ч от исходного уровня до конца периода исследования в случае индивидов, получавших лечения каротиноидами штамма PD01 и получавших лечение препаратом плацебо (n равняется 29 и n равняется 31 соответственно). Значения в скобках представляют собой 25-й-75-й процентили. E = эритриол; L = лактулоза, R = L-рамноза, S = сукралоза

Пример 10. Влияние каротиноидов, экстрагированных из штамма PD01 (LMG P-29664), на здоровье кишечника у свиней.

Проводили 3-недельное исследование с использованием самок и самцов поросят-отъемышей (отнятых в возрасте 19 дней). Исследование разрабатывали в виде рандомизированного плацебо-контролируемого исследования с 8 поросятами на группу. Целью исследования было изучение эффектов включения каротиноидов, содержащихся в спорах штамма PD01 (2*10⁹ спор штамма PD01 на кг рациона), в рацион поросят-отъемышей по сравнению с контрольным рационом, в отношении модуляции микробиома кишечника и параметров здоровья кишечника. В исследование включали шестнадцать поросят-отъемышей. В конце эксперимента (23 дня) всех поросят выводили из эксперимента и собирали содержимое из срезов желудочно-кишечного тракта. Содержимое 75-100% длины тонкого кишечника, содержимое слепой кишки, содержимое в 20 см сегменте, предшествующем среднему отделу толстой кишки, и прямой кишки собирали для анализа SCFA. Сегменты, находящиеся от 50% до 90% длины тонкого кишечника и среднего отдела толстой кишки вырезали и использовали для измерений в камерах Уссинга и анализа экспрессии генов для оценки целостности кишечного барьера.

Результаты SCFA показали, что несмотря на то, что изменения суммарного продуцирования SCFA отсутствовали или были незначительными (фиг. 16A), введение каротиноидов из штамма PD01 изменяло профили SCFA посредством индукции сдвига от ацетата к полезному для здоровья бутирату SCFA (фиг. 16B). Этот результат подтверждает наблюдения in vitro влияния каротиноидов штамма PD01.

Измерения в камерах Уссинга показали значимые эффекты и тенденции в отношении параметров целостности кишечного барьера после введения каротиноидов, содержащихся в спорах штамма PD01 (таблица 4). Как в дистальном отделе тонкого кишечника, так и в среднем отделе толстой кишки целостность ткани, как определено с помощью TEER, была выше после введения каротиноидов штамма PD01 по сравнению с контрольным рационом. В подтверждение этого, количественные снижения парацеллюлярной проницаемости (P_app FD-4) обнаружили после введения каротиноидов штамма PD01 в обоих участках GIT.

Кроме этого, более высокую экспрессию ZO-1 (белок замыкающего контакта 1 или плотного контакта 1 (TJP1)) и OCLN (окклюдина) наблюдали в тонком кишечнике поросят в группе штамма PD01 при сравнении с плацебо, в частности, в сегментах на уровне 50% длины кишечника и в случае окклюдина (фиг. 17). Таким образом, каротиноиды штамма PD01 оказывают защитный эффект на функцию кишечного барьера посредством повышения экспрессии белков плотных контактов. Это соответствует результатам, полученным с использованием камер Уссинга и исследования проницаемости кишечника, описанным в примере 9.

Таблица 4. Влияние экспериментальных рационов, скармливаемых отъемышам, на характеристики слизистой оболочки тонкого кишечника и среднего отдела толстой кишки, определенные в камерах Уссинга (n равняется 2x 8). PappFD-4 видимая проницаемость в случае FITC-4 кДа; SEM = стандартная ошибка среднего; TEER = трансэпителиальное электрическое сопротивление ткани

Пример 11. Более высокое влияние каротиноидов, экстрагированных из штамма PD01 (LMG P-29664), по сравнению с каротиноидами растительного происхождения на состав микробиома кишечника и целостность кишечного барьера.

В целях определения отличия профиля биоактивности между каротиноидами из штамма PD01 и каротиноидами растительного происхождения, проводили эксперименты, как описано в примерах 2, 3, 5 и 10.

Влияние каротиноидов из штамма PD01, лютеина, β-каротина и ликопина на продуцирование бутирата в кишечнике определяли в эксперименте SHIME, как описано в примере 2. При практическом осуществлении различные каротиноиды вводили ежедневно при одном и том же уровне дозы в параллельные блоки SHIME в течение периода, составляющего 2 недели, и контролировали уровни SCFA.

Влияние каротиноидов из штамма PD01, лютеина, β-каротина и ликопина на состав микробиома кишечника определяли в эксперименте SHIME, как описано в примере 3. При практическом осуществлении различные каротиноиды вводили ежедневно при одном и том же уровне дозы в параллельные блоки SHIME в течение периода, составляющего 2 недели, и контролировали уровни групп бактерий, продуцирующих бутират, с помощью QPCR, а также бактериальных фингерпринтов DGGE.

Влияние каротиноидов из штамма PD01, лютеина, β-каротина и ликопина на функцию кишечного барьера in vitro определяли с помощью совместных культур Caco-2/THP1XB, как описано в примере 5. Конечной точкой измерения было изменение по сравнению с контролем трансэпителиального электрического сопротивления (TEER) в условиях трансвела при введении различных каротиноидов при одинаковом уровне дозы в параллельных экспериментах.

Влияние каротиноидов из штамма PD01 или лютеина на параметры, связанные с составом микробиома кишечника и здоровьем кишечника, описывали в исследовании на поросятах, как описано в примере 10.

Пример 12. Влияние каротиноидов, экстрагированных из штамма PD01 (LMG P-29664), на воспаление кишечника у свиней.

Проводили 3-недельное исследование с использованием самок и самцов поросят-отъемышей (отнятых в возрасте 19 дней), как описано в примере 10. Исследование разрабатывали в виде рандомизированного плацебо-контролируемого исследования с 8 поросятами на группу. Целью исследования было изучение эффектов включения каротиноидов, содержащихся в спорах штамма PD01 (2*10⁹ спор штамма PD01 на кг рациона), в рацион поросят-отъемышей по сравнению с контрольным рационом, в отношении модуляции воспалительного тонуса. В исследование включали шестнадцать поросят-отъемышей. В конце эксперимента (23 дня) всех поросят выводили из эксперимента и собирали срезы кишечника. Сегменты на уровне 90% длины тонкого кишечника и среднего сегмента толстой кишки вырезали и готовили для анализа экспрессии генов провоспалительного цитокина IL-1a (интерлейкин 1 альфа).

Как показано на фиг. 18, экспрессия IL-1a был снижена в дистальном отделе тонкого кишечника и среднем отделе толстой кишки поросят в группе штамма PD01 по сравнению с плацебо. Введение каротиноидов штамма PD01 подавляет воспаление кишечника у поросят-отъемышей, что также заметно у крыс, вскармливаемых на рационе HF (пример 6).

Пример 13. Влияние каротиноидов, экстрагированных из штамма PD01 (LMG P-29664) на воспалительный тонус в мононуклеарных клетках периферической крови (PBMC) in vitro .

Для лучшего понимания иммуномодулирующих свойств каротиноидов штамма PD01 их вводили in vitro в мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), выделенные от 2 здоровых доноров. Высвобождение цитокинов PBMC измеряли при активации LPS (500 нг/мл) и сравнивали при обработках. Последнее включало воздействие каротиноидов штамма PD01, содержащихся как в замороженных вегетативных клетках (10⁷ КОЕ/мл), так и в спорах, лиофилизированных на мальтодекстрине (10⁷ КОЕ/мл), или очищенных каротиноидов, экстрагированных из штамма PD01 (6,25 мкг). Помимо этого, вегетативные клетки из Bacillus clausii (без каротиноидов, 10⁷ КОЕ/мл), хорошо известного спорообразующего пробиотического штамма, β-каротин при 2 концентрациях (26,75 мкг и 66,88 мкг), носитель, используемый для растворения очищенных каротиноидов штамма PD01, β-каротин (тетрагидрофуран/0,025% бутилированный гидрокситолуол, как описано Palozza, P. et al., Free Radical Biology & Medicine, vol30, pp1000-1007 (2001)) и полную среду (без каротиноиодов) включали в качестве контролей. Анализ LDH не выявил цитотоксичности при обработке.

Показания этих инкубаций (IL-1β; TNFα, IL-10, IP-10 (или CXCL-10) и уровни MCP-1), нормализованные на таковые необработанных LPS-индуцированных PBMC, обобщали в виде графика PCA (фиг. 19; PC1 52,7% и PC2 26,1%). Все 3 обработки, включающие каротиноиды штамма PD01, кластеризовались вместе и индуцировали неожиданным образом выраженный противовоспалительный ответ по сравнению с β-каротином, носителем, вегетативными клетками Bacillus clausii и самим LPS. Аналогичным образом эти результаты подтверждают более высокую биоактивность каротиноидов штамма PD01 микробного происхождения по сравнению с β-каротином растительного происхождения, поскольку более сильный противовоспалительный ответ индуцировали при использовании более низких уровней воздействия. Более того, без каротиноидов клетки Bacillus clausii были неспособны вызывать аналогичный ответ, в то время как очищенные каротиноиоды штамма PD01 приводили к нему.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к применению каротиноида микробного происхождения для восстановления или поддержания полезного для здоровья состава микроорганизмов кишечника. Изобретение позволяет эффективно лечить нарушения, связанные с дефектом целостности кишечного барьера. 8 з.п. ф-лы, 19 ил., 4 табл., 13 пр.

1. Применение каротиноида микробного происхождения, полученного из вида бактерий, выбранного из Bacillus, Staphylococcus, Streptococcus, Methylobacterium, Rubritalea или Sporosarcina, при этом каротиноид микробного происхождения содержит соединение формулы (I),

где X представляет собой CH₃ или COOR₂, причем R₂ независимо выбран из метила, этила, метилэтила, пропила, изопропила, бутила, изобутила, втор-бутила и трет-бутила, и где m выбран из 0, 1, 2 или 3, и где R₁ представляет собой H или COC_nH_2n+1, при этом n выбран из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14,

для восстановления или поддержания полезного для здоровья состава микроорганизмов кишечника у субъекта.

2. Применение по п. 1, где X представляет собой CH₃ или COOCH₃, где m представляет собой 3 и где R₁ представляет собой H или COC_nH_2n+1, при этом n выбран из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, или 13.

3. Применение по п. 2, где X представляет собой CH₃ и R₁ представляет собой H или COC_nH_2n+1, при этом n равняется 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13.

4. Применение по п. 2, где X представляет собой COOCH₃ и R₁ представляет собой H или COC_nH_2n+1, при этом n равняется 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11.

5. Применение по п. 1, где субъект представляет собой млекопитающее, рыбу или птицу.

6. Применение по п. 1, где субъект представляет собой человека.

7. Применение по п. 1, где субъект представляет собой сельскохозяйственное животное или домашнее животное; в частности, сельскохозяйственное животное выбрано из группы, включающей свинью, овцу, козу, корову, лошадь, курицу, утку, гуся, индюка и кролика.

8. Применение по п. 1, где восстановление или поддержание полезного для здоровья состава микроорганизмов кишечника у субъекта включает:

- стимуляцию роста и/или активности одной или ограниченного количества полезных бактерий в кишечном тракте;

- ингибирование роста и/или активности одной или ограниченного количества патогенных бактерий в кишечном тракте;

- повышение прикрепления непатогенных бактерий к слизистой оболочке поверхности желудочно-кишечного тракта;

- снижение неконтролируемого захвата антигенов, провоспалительных бактерий или бактериальных продуктов кишечником;

- обеспечение противовоспалительной активности на поверхности кишечника;

- повышение функций кишечного барьера; и/или

- продуцирование полезных для здоровья метаболитов микробного происхождения.

9. Применение по п. 1, где каротиноидное соединение микробного происхождения получено из вида Bacillus indicus.