СПОСОБ И БИОРЕАКТОР ДЛЯ ПРОДУКТОВ ФЕРМЕНТАЦИИ ГАЗА Российский патент 2021 года по МПК C12M1/04 C12P7/62 

ЗАЯВЛЕНИЕ ОБ ИССЛЕДОВАНИЯХ И РАЗРАБОТКАХ, ФИНАНСИРУЕМЫХ ПРАВИТЕЛЬСТВОМ

Это изобретение выполнено при правительственной поддержке по N00014-10-1-0310, N00014-11-1-0391, N00014-12-1-0496, N00014-13-1-0463, N00014-14-1-0054, N00014-15-1-0028 и N00014-16-1-2116, выданным в Office of Naval Research, USA. Правительство имеет определенные права на изобретение.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу для получения продуктов ферментации газа и к биореактору, который можно использовать для выполнения способа. Способ и биореактор по настоящему изобретению, в частности, подходят для получения микробных полигидроксиалканоатов (PHA) с использованием газообразного исходного сырья, содержащего CO₂.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

CO₂, высвобождаемый при сжигании ископаемого топлива, является основным парниковым газом. Типичный топочный газ содержит (% об.): CO₂ (6-12), O₂ (6-14), N₂ (66-76), H₂O (6-18) и другие минорные загрязнители. При возрастающем беспокойстве об изменении климата, снижение выброса CO₂ посредством захвата и секвестрации углерода становится серьезным вызовом для больших точечных источников, таких как энергетические станции, цементные заводы и муниципальные печи сжигания отходов твердых отходов. Превращение CO₂ в полезные продукты является привлекательной альтернативой хранению. Водородокисляющие бактерии, такие как Cupriavidus necator, могут фиксировать CO₂, используя H₂ и O₂ в литоаутотрофных условиях. Поскольку H₂ и O₂ можно в целях удобства получать электролизом воды с использованием возобновляемой энергии, такой как энергия солнца и ветра, это является рациональным способом для получения биомассы из CO₂ через ферментацию газа. Важно, что существенное количество (40-80% масс.) клеточной массы C. necator в контролируемых условиях составляет полигидроксиалканоат (PHA), в частности, полигидроксибутират (PHB). Этот сложный биополиэфир, который накапливается в микробных клетках в качестве материала накопления энергии и углерода, можно обрабатывать для получения различных полезных продуктов, включая термопластмассы, высококачественное топливо, алкены и ароматические соединения. Ферментация газа водородокисляющих бактерий исследована почти исключительно для смеси CO₂, H₂ и O₂. По сведениям заявителя, в исследованиях не использовали топочный газ по причине большого количества N₂, который снижает концентрации газообразных субстратов и делает работу биореактора сложной.

Микробная фиксация CO₂ ограничена переносом массы газообразных субстратов в микробные клетки, суспендированные в водном минеральном растворе (т. е. ферментативном бульоне). Низкая растворимость газов, в частности, H₂ и O₂, в ферментативном бульоне создает большую техническую проблему для ферментации газа для высокой скорости фиксации CO₂, высокой плотности клеток и высокой производительности PHB. В стандартном аэрируемом биореакторе, газ вводят на дно и пузырьки газа быстро появляются в водном растворе. Несмотря на то, что перенос массы в отношении пузырьков можно интенсифицировать посредством механического возбуждения, высокая скорость газонаполнения необходима для того, чтобы создавать большой объем задержки газа или площадь поверхности раздела в жидкой фазе. Следовательно, большую часть газа выбрасывают и расходуют впустую. Эту проблему можно решать посредством рециркуляции газа в закрытой системе биореактора. Однако такое решение нельзя применять к топочному газу.

Идеальный биореактор для ферментации газа должен иметь высокий коэффициент переноса массы газа (k_La) даже при очень низкой скорости газонаполнения. Однако в стандартном перемешиваемом биореакторе значение k_La снижается с ростом скорости газонаполнения, что обозначает, что высокая диссипация энергии в жидкой фазе не может обеспечивать высокий k_La при низкой скорости газонаполнения.

Орошаемые колонны использовали в промышленности для абсорбции газа, но преимущественно для быстрых реакций в жидком растворе, таких как абсорбция SO₂ в растворе NaOH и абсорбция CO₂ в растворе амина, где сопротивление переносу массы в первую очередь расположено на стороне газа. В отличие от этого, сопротивление переносу массы CO₂, H₂ и O₂ при микробной ферментации в первую очередь расположено на стороне жидкости и значительно выше, чем сопротивление переносу массы на стороне газа.

Однако, по сведениям заявителя, распыление через сопло не использовали в микробной ферментации.

Сущность изобретения.

Ввиду недостатков известного уровня техники, заявители обратились к проблеме предоставления способа получения продукта ферментации газа, такого как полигидроксиалканоаты (PHA), и биореактора для ферментации газа, который может работать, поддерживая большую скорость переноса массы газа даже при очень низкой скорости потока газа (U_s), т. е. скорости газонаполнения. следовательно, время удержания молекул газа в биореакторе можно контролировать, чтобы достигать высокоэффективной утилизации.

Заявители обнаружили, что вышеуказанных и других преимуществ, которые видны из следующего описания, можно достичь посредством контакта ферментативного бульона (раствора среды) в форме распыляемых капелек с газообразным субстратом в верхней газовой фазе, присутствующей в сосуде ферментации газа биореактора.

Контакта можно достигать несколькими путями. В первом предпочтительном варианте осуществления ферментативный бульон отводят из сосуда, циркулируют через внешний контур и затем повторно вводят в биореактор посредством распыления его в верхнюю газовую фазу, присутствующую в нем, где он входит в контакт с газообразным субстратом, который отдельно подают в газовую фазу биореактора. Ферментативный бульон можно приводить в движение во внешнем контуре, например, посредством насоса прямого вытеснения.

Во втором предпочтительном варианте осуществления газообразный субстрат подают во внешний контур с тем, чтобы получать газожидкостную смесь, которую впоследствии распыляют в газовую фазу биореактора. Благоприятно, в этом втором варианте осуществления, внешний контур также может содержать один или несколько статических смешивателей для улучшения газожидкостного смешивания и контакта при повышенном давлении.

Коэффициент переноса массы газа (k_La), достигаемый с использованием биореактора по настоящему изобретению, измеряли в условиях физической абсорбции и микробной ферментации для того, чтобы демонстрировать повышенную скорость переноса массы газа. Скорость переноса массы увеличивали на 89% по причине биологической интенсификации. В отличие от стандартных перемешиваемых биореакторов, биореактор по настоящему изобретению демонстрирует высокий k_La при низком потреблении энергии. Перенос массы газа также увеличивают за счет высокой частоты контакта жидкости с газом и малой струи распыления в биореакторе. Потребление энергии при очень низкой скорости газонаполнения ниже такового в стандартных перемешиваемых биореакторах.

Согласно наблюдениям, благоприятно высокую скорость циркуляции жидкости можно реализовать при низком падении давления на соплах для того, чтобы поддерживать высокую частоту экспонирования жидкости для газовой фазы. Также это экономит энергию, поскольку низкое падение давления на соплах значительно снижает скорость диссипации энергии. Благоприятно высокой скорости диссипации энергии предпочтительно избегают в распылительном биореакторе по настоящему изобретению, поскольку она не может обеспечивать большую скорость переноса массы, но расходует энергию.

Кроме того, большой струи распыления можно избегать, поскольку перенос массы газа происходит в первую очередь на коротком расстоянии под кончиками сопел. Малая струя распыления позволяет сэкономить расходы на большое верхнее пространство для распыления.

Дополнительно, биологическое потребление газа микробными клетками, суспендированными в ферментативном бульоне, позволяет в значительной степени интенсифицировать перенос массы газа.

Наконец, распылительный биореактор по настоящему изобретению может работать на очень низкой скорости газонаполнения для получения PHA из CO₂, H₂ и O₂, даже в присутствии разбавляющего азота и без циркуляции газа.

Далее в настоящем описании настоящее изобретение описано со ссылкой на способ микробной фиксации CO₂ в присутствии H₂ и O₂ для получения полигидроксиалканоатов. В частности, согласно наблюдениям, полигидроксибутират (PHB) можно получать из газовой смеси водорода, диоксида углерода и кислорода в присутствии или отсутствии большого количества азота.

Однако способ по настоящему изобретению и связанный аппарат для выполнения указанного способа также можно благоприятно использовать в микробной ферментации газа других типов, где используют умеренно растворимые газообразные субстраты.

В соответствии с первым аспектом, настоящее изобретение относится к способу для получения по меньшей мере одного полигидроксиалканоата через ферментацию газа, который включает стадии:

a) предоставления по меньшей мере одного сосуда (2) ферментации газа, имеющего внутренний объем, частично заполненный жидким ферментативным бульоном (11), содержащим:

- воду,

- суспендированные ферментирующие газ микроорганизмы, способные продуцировать по меньшей мере один полигидроксиалканоат,

- питательные вещества для ферментирующих газ микроорганизмов;

остальную часть объема сосуда (2) ферментации газа заполняют газовой фазой (15);

b) непрерывного отведения аликвоты жидкого ферментативного бульона (11) из сосуда (2) ферментации газа;

c) подачи газообразного субстрата (14), содержащего CO₂, H₂ и O₂;

d) смешивания газообразного субстрата (14) с жидким ферментативным бульоном (11), отводимым из сосуда (2) ферментации газа, посредством контакта жидкого ферментативного бульона (11) в форме распыляемых капелек с газообразным субстратом (14) в газовой фазе (15);

e) культивирования ферментирующих газ микроорганизмов с газожидкостной смесью, получаемой на стадии d, чтобы формировать клеточную массу, содержащую по меньшей мере один полигидроксиалканоат;

f) извлечения по меньшей мере одного полигидроксиалканоата из клеточной массы.

В предпочтительном варианте осуществления способ для получения по меньшей мере одного полигидроксиалканоата через ферментацию газа включает:

a) предоставление по меньшей мере одного сосуда (2) ферментации газа, имеющего внутренний объем, частично заполненный жидким ферментативным бульоном (11), содержащим:

- воду,

- суспендированные ферментирующие газ микроорганизмы, способные продуцировать по меньшей мере один полигидроксиалканоат,

- питательные вещества для ферментирующих газ микроорганизмов;

остальную часть объема сосуда (2) ферментации газа заполняют газовой фазой (15);

b) непрерывное отведение аликвоты жидкого ферментативного бульона (11) из сосуда (2) ферментации газа;

c) подачу газообразного субстрата (14), содержащего CO₂, H₂ и O₂, и смешивание газообразного субстрата (14) с жидким ферментативным бульоном (11), отводимым из сосуда (2) ферментации газа;

d) распыление получаемой таким образом газожидкостной смеси в сосуд (2) ферментации газа и культивирование ферментирующих газ микроорганизмов для того, чтобы формировать клеточную массу, содержащую по меньшей мере один полигидроксиалканоат;

e) извлечение по меньшей мере одного полигидроксиалканоата из клеточной массы.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления способ для получения по меньшей мере одного полигидроксиалканоата через ферментацию газа включает стадии:

a) предоставления по меньшей мере одного сосуда (2) ферментации газа, имеющего внутренний объем, частично заполненный жидким ферментативным бульоном (11), содержащим:

- воду,

- суспендированные ферментирующие газ микроорганизмы, способные продуцировать по меньшей мере один полигидроксиалканоат,

- питательные вещества для ферментирующих газ микроорганизмов;

остальную часть объема сосуда (2) ферментации газа заполняют газовой фазой (15);

b) непрерывного отведения аликвоты жидкого ферментативного бульона (11) из сосуда (2) ферментации газа;

c) подачи газообразного субстрата (14), содержащего CO₂, H₂ и O₂, в газовую фазу (15);

d) распыления жидкого ферментативного бульона (11), отводимого из сосуда (2) ферментации газа, в газовую фазу (15);

e) культивирования ферментирующих газ микроорганизмов с газожидкостной смесью, получаемой на стадии d, чтобы формировать клеточную массу, содержащую по меньшей мере один полигидроксиалканоат;

f) извлечения по меньшей мере одного полигидроксиалканоата из клеточной массы.

Предпочтительно, жидкий ферментативный бульон отводят и повторно вводят в сосуд ферментации газа при скорости циркуляции для обеспечения времени удержания жидкости, равного или ниже чем 0,5 мин, предпочтительно равного или ниже чем 0,3 мин. Время удержания жидкости определяют по объему жидкости в биореакторе, деленному на скорость циркуляции жидкости.

Предпочтительно, указанный газообразный субстрат подают в сосуд ферментации газа со скоростью газонаполнения, равной или ниже чем 0,001 м/с, предпочтительно равной или ниже чем 0,0005 м/с.

Предпочтительно, распыление жидкого ферментативного бульона или газожидкостной смеси, образованной газообразным субстратом и ферментативным бульоном, в газовую фазу осуществляют через одно или несколько сопел, каждое имеет падение давления, равное или ниже чем 1,0×10⁵ Па.

Предпочтительно, газообразный субстрат смешивают с жидким ферментативным бульоном, отводимым из сосуда ферментации газа, по меньшей мере в одном статическом смешивателе для того, чтобы формировать газожидкостную смесь, которую распыляют в сосуд ферментации газа.

Предпочтительно, газообразный субстрат представляет собой топочный газ, а именно поток газа, который получают в способе горения.

В соответствии с дополнительным аспектом, настоящее изобретение относится к биореактору (1) для ферментации газа, содержащему:

- сосуд (2), имеющий внутренний объем, частично заполненный жидким ферментативным бульоном (11), содержащим ферментирующие газ микроорганизмы и сбраживаемую среду, остальную часть объема сосуда (2) заполняют газовой фазой (15);

- по меньшей мере один выходной циркуляционный трубопровод (19), сообщающийся со внутренней частью сосуда (2), через который отводят аликвоту жидкого ферментативного бульона (11), трубопровод (19) соединяют с линией (6) циркуляции для циркуляции указанной аликвоты жидкого ферментативного бульона (11) снаружи сосуда (2) и последующего повторного введения его в газовую фазу (15), присутствующую в сосуде (2);

- по меньшей мере одно распыляющее сопло (12), соединенное с с выходной линией (6) циркуляции для распыления жидкого ферментативного бульона (2) в газовую фазу (15);

- систему (30) подачи для подачи в газовую фазу (15) газообразного субстрата (14), содержащего один или несколько газов для того, чтобы культивировать ферментирующие газ микроорганизмы, систему (30) подачи соединяют с газовой фазой (15) через впускной трубопровод (25), сообщающийся с внутренней частью сосуда (2).

В соответствии с дополнительным аспектом, настоящее изобретение относится к биореактору (1) для ферментации газа, содержащему:

- сосуд (2), имеющий внутренний объем, частично заполненный жидким ферментативным бульоном (11), содержащим ферментирующие газ микроорганизмы и сбраживаемую среду, остальную часть объема сосуда (2) заполняют газовой фазой (15);

- по меньшей мере один выходной циркуляционный трубопровод (19), сообщающийся с внутренней частью сосуда (2), через который отводят аликвоту жидкого ферментативного бульона (11), трубопровод (19) соединяют с линией (6) циркуляции для циркуляции указанной аликвоты жидкого ферментативного бульона (11) снаружи сосуда (2) и последующего повторного введения ее в газовую фазу (15), присутствующую в сосуде (2);

- по меньшей мере одно распыляющее сопло (12), соединенное с выходной линией (6) циркуляции для распыления жидкого ферментативного бульона (11) в газовую фазу (15);

- систему (30) подачи для подачи в жидкий ферментативный бульон (11), отводимый из сосуда (2), газообразного субстрата (14), содержащего один или несколько газов, чтобы культивировать ферментирующие газ микроорганизмы, систему (30) подачи соединяют с линией (6) циркуляции с тем, чтобы таким образом полученную газожидкостную смесь распылять в газовую фазу (15), присутствующую в сосуде (2), с помощью указанного распыляющего сопла (12).

Предпочтительно, лини* (6) циркуляции содержит один или несколько статических смешивателей (7) для смешивания жидкого ферментативного бульона (11), отводимого из сосуда (2), с газообразным субстратом (14), чтобы формировать газожидкостную смесь, подлежащую распылению в газовую фазу (15).

Краткое описание фигур

На фиг. 1 представлена схематическая структура распылительного биореактора в соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения (SNBR);

на фиг. 2 представлено схематическое изображение биореактора с распылительными соплами и двумя статическими смешивателями и введением газа по боковой линии (SNSMBR);

на фиг. 3 представлена зависимость времени ответа и оптического зондирования DO (растворенного кислорода) при ступенчатом изменении концентрации растворенного кислорода;

на фиг. 4 представлен объемный коэффициент переноса массы и диссипация мощности при поверхностной скорости газа 0,00028 м×с^-1 в распылительном биореакторе и стандартных перемешиваемых биореакторах, как описано в M. Nocentini, D. Fajner, G. Pasquali, F. Magelli, Ind. Eng. Chem. Res. 32 (1993) 19-26 (α=0,0083, β=0,62 и γ=0,49) и Y. Kawse, M. Moo-Yong, Chem. Eng. Res. Des. 66 (1988) 284-288 (α=0,0126, β=0,65 и γ=0,5);

на фиг. 5 представлены зависимости от времени ферментации со впускным газом I (таблица 1) в отсутствие азота: (A) концентрация биомассы, концентрация остаточной биомассы и содержание PHB, (B) мгновенные и кумулятивные клеточный выход и концентрация растворенного кислорода, и (C) удельная скорость роста;

на фиг. 6 представлены зависимости от времени для ферментации со впускным газом III (таблица 1) в присутствии азота: (A) концентрация биомассы, остаточная биомасса и содержание PHB, (B) мгновенные и кумулятивные клеточный выход и концентрация растворенного кислорода (DO) и (C) удельная скорость роста.

На фиг. 7 проиллюстрирована схематическая структура стандартного перемешиваемого биореактора (CSBR) для микробной ферментации.

На фиг. 8 представлена динамика клеточного роста и увеличение оптической плотности (OD) для ферментации, которую осуществляли в перемешиваемом биореакторе с фиг. 7.

На фиг. 9 представлено схематическое изображение стандартного биореактора с абсорбционной колонной с набитым слоем (стандартный газовый поглотитель - CGA).

На фиг. 10 представлена динамика клеточного роста и увеличение оптической плотности (OD) для ферментации, осуществляемой в стандартном газовом поглотителе с фиг. 9.

На фиг. 11 представлена динамика клеточного роста и увеличение оптической плотности (OD) для ферментации, осуществляемой в биореактор с распылительными соплами SNBR с фиг. 1;

на фиг. 12 представлена динамика клеточного роста и увеличение оптической плотности (OD) для ферментации, осуществляемой в биореакторе с распылительными соплами в соответствии с фиг. 2.

Подробное описание

Через границу раздела перенос массы газ-жидкость происходит под действием движущей силы концентрации. В соответствии с двухпленочной теорией сопротивления, сопротивление переносу массы умеренно растворимого газа, такого как O₂, H₂ и CO₂, преимущественно расположено в пленке жидкости и поток массы (N_i) определяется ур. 1:

N_i=k_i,L(C_i^* - C_i,L)=k_i,L(P_i/H_i - C_i,L) (ур. 1)

где k_i,L представляет собой коэффициент переноса массы жидкой фазы для газа «i», P_i представляет собой парциальное давление в газовой фазе, Hi представляет собой константу Генри, C_i,L^* представляет собой равновесную концентрацию (кмоль/м³) и C_i,L представляет собой концентрацию в жидкой фазе. Пленочная модель Уитмана также указывает на то, что коэффициент переноса массы (k_i,L) определяют с помощью молекулярной диффузивности (D_i,L) газа «i» в воде и сопротивлению переносу массы на стороне жидкости (R_L) как показано в ур. 2

k_i,L=D_i,L/R_L (ур. 2).

В этой работе только объемный коэффициент переноса массы O₂ (k_La) измеряли с использованием надежного зонда, но можно использовать k_La кислорода для того, чтобы найти его для H₂ и CO₂ по их молекулярным диффузивностям в воде (ур. 3)

k_i,La/k_La=k_i,L/k_L=D_i,L/D_L (ур.3).

Объемную скорость утилизации кислорода (OUR) в распылительном биореакторе определяют по потоку кислорода (N), выражаемому с помощью ур. 1, общей эффективной площади поверхности раздела (A_e) и объему жидкости (V_L) (ур. 4)

OUR=N(A_e/V_L)=k_La(P_o/H_o - C_L)=k_La(C_L^* - C_L) (ур.4)

где «a» представляет собой эффективную площадь поверхности раздела на объем жидкости (A_e/V_L), P_o и H_o представляют собой парциальное давление и константу Генри для кислорода, C^*_L представляет собой равновесную концентрацию кислорода при P_o и C_L представляет собой концентрацию растворенного кислорода в жидкой фазе.

Подобно химическим реакциям, биологическое потребление газа микробными клетками в жидком растворе также может снижать сопротивление переносу массы (R_L) и, таким образом, увеличивать коэффициент переноса массы (k_La). Коэффициент усиления (E) определяют с помощью (ур. 5)

E=(k_La)_Bio/(k_La)_Phy (ур.5)

где нижние индексы Bio и Phy указывают, что значения k_La приведены для условий биологической утилизации газа и физической абсорбции в воде, соответственно.

На фиг. 1 и 2 приведены схематические представления распылительного биореактора 1 с соплами в соответствии с двумя вариантами осуществления настоящего изобретения. Круглый стеклянный сосуд 2 (ϕ 15 см, 3 л) на дне содержит водный раствор (ферментативный бульон) 11 (0,5-1,5 л), который перемешивали и нагревали на магнитной мешалке и нагревателе 3. Газообразный субстрат 14 можно вводить в биореактор двумя путями. Используя конфигурацию SNBR в соответствии с фиг. 1, газообразный субстрат 14 подают в сосуд 2 через трубопровод 25. В конфигурации SNSMBR в соответствии с фиг. 2, газообразный субстрат 14 вводят во внешний контур 6.

При демонстрации ферментации газа, pH раствора контролировали раствором основания (2 M аммиак или 2 M NaOH). Диафрагменный насос 4 (максимальная скорость потока 4,9 л/мин), соединенный с выходным отводящим трубопроводом 19, доставлял жидкий ферментативный бульон в сопла 12, установленные в верхней части плексигласового цилиндра 5 (ϕ 20 см × 23 см, 6 л). Жидкость распыляли в полной конической струе (90°) в газовую фазу 15, присутствующую в сосуде 2, и возвращали в жидкостной резервуар 11. Поток 14 газа вводили в линию 6 циркуляции жидкости посредством системы 30 подачи и распыляли с жидкостью через сопло(а) 12 в газовую фазу 15. В варианте осуществления с фиг. 2, поток 14 газа вводили в линию 6 циркуляции жидкости, с помощью системы 30 подачи, перед двумя статическими смешивателями 7 и распыляли с жидкостью через сопло(а) 12 в газовую фазу 15, присутствующую в сосуде 2. В обоих этих вариантах осуществления скорость потока газа и композицию контролировали посредством скоростей потоков индивидуальных газов. Воздух и N₂ контролировали с использованием игольчатых клапанов и измерителей потока (Cole-Parmer, Vernon Hills, IL). CO₂, H₂ и O₂ контролировали с использованием трех массовых расходомеров (Alicat Scientific, Tucson, AZ). Биореактор работал при одной атмосфере, а скорость потока выходящего газа 20 измеряли с использованием расходомера с мыльной пленкой и выпускали его в вытяжной шкаф через вентиляционную трубку. В пустом контроле без микробного потребления газа, впускной газ и выпускной газ имели равную молярную скорость потока (<±5%).

Эффект струи распыления, оказываемый на перенос массы, также исследовали, когда сопло(а) устанавливали непосредственно в верхней части стеклянного сосуда. Расстояние «X» от кончика сопла до поверхности жидкости уменьшали приблизительно до 10 см и объем струи распыления уменьшали на 80%.

Физическая абсорбция кислорода в воде

k_La физической абсорбции кислорода в воде или минеральном растворе (т. е. сбраживаемой среде, содержащей воду и питательные вещества для культивирования микроорганизмов) измеряли динамическим способом. Жидкий раствор (1,5 л) обедняли с использованием N₂, пока концентрация растворенного кислорода не падала до нуля. Затем воздух вводили на 0,3 л/мин (25°C, 1 атм.). Мониторинг концентрации растворенного кислорода осуществляли с использованием оптического DO зонда (ProODO, YSI, Yellow Springs, OH). k_La вычисляли по ур. 6

ln((C_L^* - C_L,0)/(C_L^* - C_L))=(k_La)t (ур. 6)

где C_L^* представляет собой концентрацию насыщения кислородом в атмосфере воздуха, C_L представляет собой концентрацию растворенного кислорода в момент времени t и C_L,0 представляет собой начальную концентрацию кислорода, когда регистрировали измерение. Время ответа зонда определяют как время, затраченное зондом для того, чтобы достигать 63,2% от конечного значения, когда подвергают ступенчатому изменению концентрации. Когда время ответа меньше чем или равно (k_La)^-1, измерение может быть надежным. На фиг. 3 представлена зависимость времени ответа DO зонда, когда его подвергали ступенчатому изменению концентрации растворенного кислорода. Время ответа зонда в экспериментальных условиях составляло приблизительно 6 с и, таким образом, максимальный k_La, который мог быть измерен динамическим способом, составлял 0,17 с^-1 или 600 ч^-1.

Микробное усиление переноса массы кислорода

Скорость переноса массы кислорода при микробной ферментации газа определяли посредством измерения скорости утилизации кислорода (OUR) в условиях устойчивой (или квазиустойчивой) работы. В качестве ферментативного бульона использовали лабораторный штамм C. necator, который растили в минеральном растворе, содержащем (на литр): 2,4 г KH₂PO₄, 2,5 г Na₂HPO₄, 1,2 г (NH₄)₂SO₄, 0,5 г MgSO₄,7H₂O, 1,0 г NaCl, 0,5 г NaHCO₃, 0,1 г цитрата железа аммония и 1 мл раствора микроэлементов. Раствор среды инокулировали с начальной оптической плотностью (OD) 0,91 с использованием 100 мл культуры в бутылке, полученной в том же растворе среды. Бутылку (1 л) продували газовой смесью H₂ (70%), O₂ (20%) и CO₂ (10%) каждые 24 часа и встряхивали при 200 об./мин и 30°C в ротационном инкубаторе.

Раствор среды (0,5 л) в распылительном биореакторе перемешивали на 150 об./мин и его температуру и pH поддерживали на 35°C и 6,8, соответственно. Циркуляцию жидкости осуществляли на 1,2 л/мин с использованием диафрагменного насоса (NF300, KNF Neuberger Inc, USA), и распыляли ее через сопло (диаметр отверстия 1,65 мм, полный угол 90°). Контролировали время удержания в жидкостном резервуаре 0,4 мин. На 100 sccm (стандартный кубический сантиметр в мину при 0°C и 1 атм.) устанавливали впускной газ, содержащий H₂ (70 sccm), O₂ (20 sccm) и CO₂ (10 sccm). Измеряли молярную скорость потока газа (F) и молярную фракцию кислорода (y), чтобы находить объемную скорость утилизации кислорода (OUR) (ур. 7a)

OUR=((Fy)_in - (Fy)_out)/V_L (ур. 7a).

По причине хорошего смешивания жидкости и газа в биореакторе, жидкий раствор гомогенен и парциальное давление кислорода (PO) в газовой фазе равно таковому в выпускном потоке газа. Когда концентрация растворенного кислорода (C_L) в ур. 4 падает до нуля, перенос массы кислорода становится ограничивающей скорость стадией утилизации кислорода. Следовательно, максимальная OUR отражает k_La распылительного биореактора (ур. 7b)

OUR_max=k_La(P_o/H_o) (ур. 7b).

Микробная фиксация CO₂ и биосинтез PHB

Биосинтез PHB из CO₂ проводили в распылительном биореакторе с уменьшенной струей распыления посредством установки сопел (площадь пропускного сечения 10 мм²) на дне стеклянного сосуда. Жидкую среду (1,5 л) поддерживали при 35°C и циркулировали на 4,7 л/мин при падении давления на соплах 48 кПа. pH среды поддерживали равным 6,8 с использованием раствора аммиака (2 M) в начале, чтобы предоставлять азотное питательное вещество, и затем раствора NaOH (2 M), чтобы содействовать формированию PHB. Композицию впускного газа и скорость потока при каждой ферментации поддерживали на постоянных уровнях, как показано в таблице 1. Газообразный N₂ (40-60% об./об.) вводили в биореактор, чтобы исследовать его эффект разбавления, оказываемый на ферментацию газа.

Таблица 1. Композиция впускного газа и скорость потока при ферментации газа для получения PHB

Впускной газ Скорость потока (sccm)* H₂ (моль%) O₂ (моль%) CO₂ (моль%) N₂ (моль%) I 140 60,0 20,0 20,0 0 II 70 60,0 20,0 20,0 0 III 350 40,0 10,8 9,0 40,2 IV 350 10,0 16,2 13,5 60,3

*Стандартный кубический сантиметр в мин (sccm) при 0°C и 100 кПа

Химический анализ

Композицию газа определяли с использованием газового хроматографа (модель 450, Bruker, Fremont, CA). GC оборудовали детектором теплопроводности (TCD) и колонкой Carboxen PLOT 1006 (0,15 мм × 30 м, Sigma-Aldrich, St Louis, MO). Температурный цикл начинали при 35°C в течение 2 мин и затем поднимали до 100°C за 3 мин. Пики интегрировали с использованием программного обеспечения Galaxie и калибровали с использованием газовых стандартов. Стандартные образцы газа с различными молярными композициями получали с использованием газонепроницаемого шприца из чистого газа и азота в качестве фонового газа.

Мониторинг микробного роста осуществляли посредством измерения оптической плотности (OD) раствора среды на 620 нм с использованием спектрофотометра УФ и видимого спектра (DU530, Beckman-Coulter, Fullerton, CA). Раствор среды центрифугировали по 5000 г в течение 5 мин и влажные пеллеты лиофилизировали для того, чтобы определять сухую концентрацию клеточной массы. Содержание PHB в клеточной массе определяли с использованием GC с пламенно-ионизационным детектором (FID) на образце, полученном следующим образом: приблизительно 50 мг PHB-содержащей сухой клеточной массы добавляли в 2 мл метанолового раствора (H₂SO₄ 3% об./об., бензойная кислота 10 г/л в качестве внутреннего стандарта) и 2 мл хлороформа и держали при 100°C в течение 4 часов. Внутриклеточный сложный полиэфир превращали в сложный 3-гидроксибутиратметиловый эфир, который высвобождался в реакционный раствор. После смесь охлаждали до комнатной температуры, добавляли 1 мл дистиллированной воды и раствор энергично перемешивали в течение 1 мин. Смесь оставляли разделяться на водную и органическую фазу. Органический раствор фильтровали через PTFE мембрану (0,45 мкм) и анализировали с использованием GC. Чистый PHB (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) обрабатывали в той же процедуре для калибровки.

Физическая абсорбция кислорода в воде

В таблице 2 приведен k_La физической абсорбции кислорода в воде, как наблюдали при различных рабочих условиях.

Таблица 2. Физическая абсорбция и перенос массы кислорода в воде a

Сопла^b Диаметр отверстия (мм) Площадь пропускного сечения (мм²) Скорость циркуляции (л/мин) Падение давления^c (x10⁵ Па) Скорость капелек (м/с) k_La (с^-1) Диссипация мощности (кВт/м³) 1 1,44 1,63 2,4 2,57 22,7 0,031 6,9 1 1,65 2,14 2,8 2,38 21,9 0,033 7,3 1^e 2,06 3,33 3,5 1,92 19,6 0,044 7,5 2 2,06 6,66 4,6 0,61 11,0 0,062 3,3 3 2,06 9,99 4,7 0,48 9,8 0,064 2,7 3^f 2,06 9,99 4,7 0,48 9,8 0,075 2,7

a. Аэрация 0,2 об./об./мин (объем газа на объем жидкости в мин): 1,5 л воды с 0,3 л/мин воздуха

b. сопла с полным углом 90°

c. Падение давления (ΔP) на сопле(ах)

d. Начальная скорость капелек из сопел (U₀=Cp√(2ΔP/ρ_L), Cp=0,95)

e. То же время удержания жидкости (0,4 мин), как в эксперименте с биологическим усилением

f. Те же сопла и работа с уменьшенной струей распыления.

Поверхностная скорость газа составляла 0,00028 м/с или 0,2 об./об./мин (объем газа на объем жидкости в мин) в отношении скорости газонаполнения жидкости. Когда использовали одно сопло, значение k_La (0,03-0,04 с^-1) находилось в диапазоне стандартных аэрируемых биореакторов.

Когда использовали несколько сопел, чтобы обеспечивать увеличенную площадь пропускного сечения, k_La почти удваивался (0,064 с^-1). Интересно, что это увеличение k_La наблюдали при снижении падения давления на сопле(ах) и скорости капелек жидкости, этот феномен отличается от стандартных знаний. В соответствии с балансом механической энергии около сопла(сопел), большое падение давления будет создавать высокую скорость и турбулентность потока капелек жидкости в газовой фазе. Высокая турбулентность также будет создавать более мелкие капельки, чтобы давать большую площадь поверхности раздела газ-жидкость. Все эти факторы должны интенсифицировать скорость переноса массы газа, но вместо этого наблюдали низкое значение k_La. Без ограничения какой-либо теорией, полагают, что этот стандартный анализ может быть верным для индивидуальных капелек жидкости, но не применим к жидкостному резервуару или целому биореактору. Наблюдали, что скорость циркуляции жидкости в насосе падала для сопла меньшей площади пропускного сечения, что снижало частоту экспонирования жидкости для газовой фазы. При высокой скорости циркуляции (4,7 л/мин), падение давления и скорость жидкости были наименьшими, но время удержания в жидкостном резервуаре (1,5 л) было самым коротким (0,32 мин), т. е. частота контакта жидкости с газом была самой высокой. Чтобы интенсифицировать перенос массы газа в распылительных биореакторах, высокая скорость циркуляции жидкости, ассоциированная с малым падением давления, следовательно, предпочтительна вместо низкой скорости циркуляции, ассоциированной с большим падением давления. Также это верно для экономии энергии, как показано далее.

Когда для распыления использовали несколько сопел, струя была больше и содержала больше капелек жидкости, чем давало одно сопло. Это вызывало вопрос о том, следует ли предоставлять большую струю распыления для того, чтобы интенсифицировать перенос массы газа. Это исследовали, когда удаляли верхний цилиндр, и сопла устанавливали непосредственно сверху стеклянного сосуда. Струю распыления значительно уменьшали с 7,5 л до 1,5 л. Однако при тех же рабочих условиях k_La достигал 0,075 с^-1 или возрастал на 17%, как показано в таблице 2. Другими словами, малая струя не снижала, а интенсифицировала перенос массы газа. Это можно объяснить тем фактом, что перенос массы газ-жидкость происходит в первую очередь под кончиком сопел. Длительное время удержания небольших капелек жидкости в газовой фазе не вносит существенный вклад в перенос массы. Вместо этого, ударение капелек жидкости на свободной поверхности жидкости может в определенной степени интенсифицировать перенос массы газа.

Микробное усиление переноса массы кислорода

В таблице 3 приведены измерения скорости утилизации кислорода (OUR) и k_La в различные моменты времени при ферментации газа.

Таблица 3. Интенсифицированный перенос массы кислорода в распылительном биореакторе с одним соплом^a

Время (ч) OD^b Растворенный O₂ (мг/л) Выпускной газ^c (м л/мин) Выпускной O₂ (моль%) OUR (ммоль/л×мин) k_La (с^-1) E^d (-) 0 1 6,43 104 20,64 0 0 - 16 2,1 2,25 75 21,34 0,45 0,042 0,95 24 6 0,25 64 21,58 0,64 0,055 1,25 32 15,1 0 51 17,83 0,96 0,083 1,89 40 25,1 0 60 16,62 0,86 0,074 1,68 48 23,6 0 62 19,84 0,75 0,073 1,66

a. Диаметр отверстия сопла ϕ 1,65 мм, площадь пропускного сечения 2,14 мм², полный угол 90°

b. Оптическая плотность среды для культивирования при 600 нм (1 OD=0,4 г сухой клеточной массы/л)

c. Выпускная объемная скорость потока газа (25°C, 1 атм.)

d. Сравнение с физической абсорбцией кислорода в воде (k_La=0,044 с^-1) в таблице 2.

Для того, чтобы поддерживать хорошее смешивание и частое экспонирование жидкости для газовой фазы, раствор среды (0,5 л) перемешивали на 100 об./мин и циркулировали на 1,2 л/мин, чтобы получать время удержания жидкости 0,4 мин в резервуаре. Падение давления на сопле (ϕ 1,65 мм) составляло 90 кПа и не менялось с увеличением плотности клеток. При рабочих условиях диссипация энергии в жидком растворе от насоса составляла 3,6 кВт/м³. Оптическая плотность (OD) возрастала от 1 до 25 или концентрация биомассы от 0,4 г/л до 10 г/л. При достаточных азотных питательных веществах, микробные клетки образовывали немного PHA (< 2%) и в первую очередь использовали восстановленный CO₂ для клеточного роста. Элементарная композиция клеточной массы, которую определяли, как описано в S. Kang и J. Yu, Biomass Bioenergy, 74 (2015) 92-95, представляла собой: 45,1% C, 6,3% H, 12,8% N, 27,8% O и 8,0% золы, для которой органическая формула представляет собой CH_1,69O_0,46N_0,25. По причине микробного потребления газа, скорость потока выпускного газа падала со 104 мл/мин в начале до 50-60 мл/мин. Перед следующим измерением верхнюю часть биореактора (приблизительно 9 л) продували в течение 8 часов существующим газом. Каждую скорость потока газа и композицию усредняли для трех измерений, выполненных в пределах 30 минут. По причине относительно низкой биологической активности, полагали квазиустойчивое состояние газовой композиции.

По скорости утилизации кислорода вычисляли k_La с использованием ур. 7. Значение k_La было низким при низкой OD по причине низкой скорости утилизации кислорода, и затем достигало наивысшего уровня, когда концентрация растворенного O₂ падала до нуля, явного индикатора ограничения переноса массы кислорода. Другими словами, самый высокий k_La (0,083 с^-1) отражал максимальный коэффициент переноса массы кислорода в распылительном биореакторе при рабочих условиях. k_La снижался при дальнейшем увеличении плотности клеток. Это свойственно низкой OUR по причине сниженной микробной активности после воздействия на облигатный аэробный штамм истощением кислорода в течение длительного времени. По сравнению с k_La (0,044 с^-1) физической абсорбции в воде при том же времени удержания жидкости (0,4 мин) (таблица 2), вычисляли коэффициент усиления переноса массы кислорода посредством микробной активности, который приведен в таблице 3. Перенос массы газа интенсифицировали в значительной степени посредством биологического потребления кислорода (а также двух других газов) микробными клетками.

Потребление энергии и сравнение

Распылительный биореактор имеет простую структуру. Насос в линии циркуляции жидкости предоставляет механическую энергию как для распыления жидкости, так и для смешивания. Баланс механической энергии между двумя точками (1-1' и 2-2') на фиг. 1 показывает, что подаваемая энергия (W_s) от насоса минус потери на трение равна увеличению кинетической энергии, потенциальной энергии и энергии давления текучего вещества (ур. 8a)

W_s - ∑F=((U₂² - U₁²))/2+g(Z₂ - Z₁)+((P₂-P₁))/ρ_L (Дж/кг) (ур. 8a).

При незначительных потерях на трение, U₁ и разности высот между двумя точками, оно упрощается до ур. 8b

W_s=(U₂²)/2+ΔP/ρ_L (ур. 8b),

где U₂ представляет собой скорость жидкости в трубке (внутренним диаметром 6 мм) и ΔP представляет собой падение давления на сопле. При экспериментальных условиях (таблица 2), динамическая энергия составляет только малую часть (<8%) от вводимой насосом. Энергию в первую очередь использовали для того, чтобы повышать давление жидкости для распыления. Потребление энергии на объем жидкости вычисляли по скорости циркуляции жидкости и падению давления с использованием ур. 8b. Как показано в таблице 2, высокая скорость циркуляции жидкости при малом падении давления имеет значительно более низкую диссипацию энергии (2,7 кВт/м³), чем низкая скорость циркуляции при большом падении давления (7,3 кВт/м³). В последнем случае, происходила диссипация энергии в виде поверхностной энергии и тепла при формировании маленьких капелек жидкости (<50 мкм), даже несмотря на то, что большая площадь поверхности раздела не вносит очень большого вклада в скорость переноса массы газа, как указано выше.

В стандартных перемешиваемых биореакторах коэффициент переноса массы кислорода зависит от поверхностной скорости газа, а также диссипации мощности в жидком растворе. Широко используемая корреляция для перемешиваемых сосудов имеет общую форму (ур. 9)

k_La=α(P/V_L)^βU_s^γ (ур. 9),

где k_La представляет собой коэффициент переноса массы кислорода в единицах с^-1. P представляет собой мощность, диссипируемую перемешивателем в Вт и V_L представляет собой объем жидкости в м³. U_s представляет собой поверхностную скорость газа в м/с, которую определяют как объемную скорость потока газа, деленную на площадь поперечного сечения биореактора. Многие корреляции получены из экспериментальных данных и/или выведены из теории. Две из них показаны на фиг. 4 для сравнения: одна из экспериментальной корреляции (M. Nocentini et al., Ind. Eng. Chem. Res. 32 (1993) 19-26) и другая из теории Колмогорова, которая не ограничена специальной конфигурацией и экспериментальными условиями (Y. Kawse, M. Moo-Yong, Chem. Eng. Res. Des. 66 (1988) 284-288). Большинство экспериментальных корреляций давали вполне согласованные предсказания о k_La, тогда как корреляция на основе теории дает более высокое предсказание (M. Xie, J. Xia, Z. Zhou, J. Chu, Y. Zhuang, S. Zhang, Ind. Eng. Chem. Res. 53 (2014) 5941-5953). Их сравнивают с k_La распылительного биореактора при той же скорости диссипации энергии на фиг. 4. Следует отметить, что эмпирические корреляции получают из специальных экспериментов, в которых минимальная поверхностная скорость газа составляет 0,001 м/с или выше. Когда в настоящем описании корреляции используют при очень низкой скорости газа (0,00028 м/с в таблицах 2 и 3), они служат лишь цели сравнения.

На фиг. 4 раскрыта некоторая интересная информация. Во-первых, когда распылительный биореактор работает при большом падении давления на соплах, высокая диссипация энергии не может гарантировать большой коэффициент переноса массы. При большой диссипации энергии, распылительный биореактор демонстрирует схожий k_La стандартного биореактора при очень низкой скорости газонаполнения. Во-вторых, при низкой диссипации энергии распылительные биореакторы могут обеспечивать более высокие скорости переноса массы, чем стандартные биореакторы. При очень низкой скорости газонаполнения, механическую энергию используют более эффективно для разбиения жидкости на капельки, чем для разбиения пузырьков газа. Следовательно, распылительный биореактор может использовать то же количество энергии, чтобы предоставлять более высокий k_La. В-третьих, уменьшенная струя распыления способствует переносу массы в распылительных биореакторах. Наконец, биологическое потребление газа может усиливать перенос массы газа в раствор среды.

Формирование PHB из CO₂ в отсутствие азота

На фиг. 5 представлены зависимости времени ферментации для впускного газа I (таблица 1). При постоянной скорости потока (140 sccm) H₂ (60%), O₂ (20%) и CO₂ (20%), плотность микробных клеток возрастала непрерывно с течением времени и достигала максимального уровня 21,5 г/л. Большая часть восстановленного углерода накапливалась в PHB и конечное содержание PHB достигало 50% масс. Что интересно, остаточная биомасса, разность масс между клеточной массой и PHB, возрастала в начале при достаточных азотных питательных веществах и приближалась к плато, когда накладывали ограничение по азоту. Этот паттерн схож с таковым у гетеротрофных культур на органическом источнике углерода, как описано, например, в N. Tanadchangsaeng, J. Yu, Biotechnol. Bioeng. 109 (2012) 2808-2818. Мониторинг концентрации растворенного кислорода (DO) в жидком растворе осуществляли в виде процентной доли насыщения воздуха и поддерживали на достаточно высоком уровне (> 70%) до тех пор, пока плотность клеток не достигала 5 г/л. В течение этого периода времени, скорость переноса массы кислорода была достаточно высока для того, чтобы поддерживать высокую микробную активность. Когда концентрация биомассы возрастала до 9 г/л или выше, DO быстро падал до нуля и после этого облигатный аэробный штамм подвергали условиям истощения кислорода. Доступность газообразных субстратов влияла на микробный рост и физиологию. Микробный рост можно грубо разделить на три стадии в соответствии с удельной скоростью роста (μ). На фиг. 5, удельная скорость роста представлена в виде наклона кривой натурального логарифма оптической плотности в зависимости от времени. После начальной lag-фазы удельная скорость роста составляла 0,1 ч^-1 (μ₁) и затем снижалась по причине ограничения кислорода при высоких плотностях клеток. Она снижалась до 0,06 ч^-1 (μ₂) и затем далее до 0,01 ч^-1 (μ3) по мере продолжения ферментации в течение 115 ч.

На фиг. 5 также показано изменение мгновенного и накопительного выхода водорода с течением времени. Водород являлся единственным источником энергии и восстанавливающим средством для микробной фиксации CO₂. Выход водорода определяют как количество биомассы, образуемой на определенное подаваемое количество водорода (г/г). «Квазимгновенный» выход, измеряемый по разности в два момента времени, показывает усредненную биологическую эффективность фиксации CO₂ за этот короткий период времени. Накопительный выход водорода отражает общую эффективность от начала ферментации до определенного момента времени. Мгновенный выход водорода был наибольшим (приблизительно 2 г/г), что соответствует максимальной удельной скорости роста (0,1 с^-1), и затем держался на умеренном уровне (1,2 г/г) в течение достаточно длительного времени, за которое происходило формирование большей части клеточной массы. Он падал до нуля, поскольку происходило формирование малого количества клеточной массы. В качестве важных критериев экономики способа, накопительный выход водорода для ферментации всей партии составлял 0,6 г/г.

С использованием впускного газа II той же газовой композиции, скорость потока газа снижали до 70 sccm и наблюдали схожую динамику. Однако максимальная концентрация биомассы снижалась до 12,4 г/л и содержание PHB снижалось до 17,5% масс. Максимальный мгновенный выход водорода составлял 1,8 г/г, что указывает на схожую скорость переноса массы и эффективность фиксации CO₂. Накопительный выход водорода значительно выше (0,95 г/г) по причине низкого расходования водорода впустую при очень низкой скорости газонаполнения (0,05 об./об./мин). При использовании впускного газа B микробные клетки могли не иметь достаточного источника углерода и энергии для роста.

Эффект азота, оказываемый на образование PHB из CO₂

На фиг. 6 представлена зависимость от времени для ферментации впускного газа III (таблица 1) в присутствии большого количества газообразного N₂ (40 моль%). Также достигали высокой плотности биомассы 21,9 г/л и содержание PHB достигало 61% масс. Высокое содержание PHB можно объяснять снижением остаточной биомассы после длительного времени на плато. Интересно, что растворенный кислород поддерживался на высоком уровне (15-30%) в течение вплоть до 75 часов, в течение которых происходило образование большого количества клеточной массы (16 г/л). Он падал до нуля, когда плотность клеток достигала 17 г/л. Очевидно, что облигатный аэробный штамм имел достаточно кислород для того, чтобы поддерживать хорошую метаболическую активность в течение достаточно длительного времени. Максимальная удельная скорость роста (μ_max) составляла 0,12 ч^-1 (μ₁) в течение периода в 20 я после начальной 8-часовой lag-фазы. Скорость роста снижалась до 0,04 ч^-1 (μ₂) по мере прогрессирования ферментации в течение дополнительных 20 часов или около того. Наконец, удельная скорость роста сохранялась равной 0,01 ч^-1(μ₃) до конца ферментации. Однако выход водорода был ниже в присутствии N₂, который разбавляли газовую композицию. Наибольший мгновенный выход водорода составлял 0,7 г/г и накопительный выход составлял 0,3 г/г. Этот эксперимент показывает, что возможно использовать топочный газ непосредственно в качестве источника CO₂, который экономит расходы на захват CO₂.

Когда очень маленькое количество водорода (10 моль%) предоставляли во впускном газе IV, наблюдали небольшой клеточный рост. Максимальная оптическая плотность (OD) после 32 часов составляла только 1,68 (плотность клеток ≈ 0,81 г/л). Плотность клеток поддерживали на этом уровне при той же скорости газонаполнения на всем протяжении работы. Похоже, что композиции с низким H₂ достаточно просто для поддержания клеток, без достаточного H₂, доступного для фиксации CO₂ и клеточного роста. В таблице 4 сравнивают ферментацию газа для различных впускных газов. Результаты для впускного газа C и D ясно отражают эффект разбавления N₂ (40-60 моль%).

Таблица 4. Эффекты впускного газа, оказываемые на микробную фиксацию CO₂ и синтез PHB

Впускной газ^a I II III IV Максимальная удельная скорость роста (ч^-1) 0,10 0,07 0,12 n/a Максимальный выход водорода (г/г)^b 2,0 1,8 0,7 n/a Кумулятивный выход водорода (г/г)^b 0,6 0,95 0,24 n/a Максимальная плотность клеток (г/л) 21,5 12,4 21,9 0,8 Содержание PHB (% масс.)^c 50 17,5 61 n/a

a. Газовая композиция и скорости потоков можно найти в таблице 1

b. Граммы сухой клеточной массы, образованной на грамм подаваемого водорода

c. Массовая доля PHB в сухой клеточной массе

Придерживаясь настоящего, эффективность биореактора в соответствии с настоящим изобретением в отношении клеточного роста и образования PHB из газообразного субстрата сравнивают с таковыми у двух стандартного биореактора и газового поглотителя.

Эффективность стандартных биореакторов в отношении микробной газовой культуры

Стандартный настольный биореактор (общий объем 3 л, BioFlo 110, New Burnswick, Enfield, CT) использовали для того, чтобы культивировать C. necator на газовой смеси из 70 моль% H₂, 20 моль% O₂ и 10 моль% CO₂. Фиг. 7 иллюстрирует схематическую структуру реактора, очень популярного биореактора для микробной ферментации. Перенос массы газа из пузырьков в суспендированные микробные клетки обеспечивают через возбуждение раствора среды посредством механического перемешивателя. Минеральный раствор (1,5 л), состоящий из фосфата калия 2,3 г/л, моногидрофосфата натрия 4,37 г/л, хлорида аммония 1 г/л, сульфата магния 0,5 г/л, бикарбоната натрия 0,5 г/л, цитрата железа аммония (FAC) 0,05 г/л, безводного хлорида кальция 0,01 г/л и микроэлемента 1 мл предварительно полученного раствора использовали в качестве жидкой среды для культивирования. Скорость возбуждения поддерживали на 900 об./мин для того, чтобы обеспечивать максимальный перенос массы. Барботер использовали для того, чтобы диспергировать поток газа в растворе. Когда среда для культивирования в биореакторе достигала стабильного состояния (pH и температура), инокулировали культуру бутылки. pH и температуру поддерживали на 6,9 и 30°C, соответственно. Осуществляли мониторинг рабочих условий, таких как DO, pH, температура и скорость возбуждения. Осуществляли мониторинг отработавшего газа с использованием газового анализатора (TANDEM Pro, Magellan Instruments Ltd, Norfolk, UK). Брали образцы жидкости, и анализировали ее оптическую плотность (OD при 620 нм), плотность клеток и содержание PHB.

Объемный коэффициент переноса массы (k_La) для O₂ из потока воздуха (21 моль% O₂) измеряли в том же растворе выше и использовали в качестве ориентира для сравнения переноса массы газа в различных биореакторах. В таблице 5 показаны результаты для этого стандартного биореактора. В ферментационной промышленности скорость потока газа часто выражают как «об./об./мин» или объем газа на объем жидкости в мин. Максимальный k_La 234 ч^-1 получали при 900 об./мин и скорости потока воздуха 4,5 л/мин (3,0 об./об./мин). Снижение скорости потока воздуха вызывало значимое снижение k_La. Например, при скорости потока воздуха 0,75 л/мин (0,5 об./об./мин) и скорости возбуждения 900 об./мин k_La составлял только 144 ч^-1, или снижение 38%.

Таблица 5. Объемный коэффициент переноса массы (k_La) для кислорода в стандартном биореакторе с фиг. 7

Скорость возбуждения (об./мин) Объемный коэффициент переноса массы (k_La)(ч^-1) 0,5 об./об./мин^a 1,0 об./об./мин 2,0 об./об./мин 3,0 об./об./мин 200 14,8 18,4 21,6 27,0 500 74,2 75,2 86,2 91,4 900 144,4 170,6 215,6 234,4

^aоб./об./мин=объем газа при стандартных условиях на единичный объем жидкости в минуту, объем жидкости реактора составляет 1,5 л.

На фиг. 8 представлено изменение оптической плотности в зависимости от времени ферментации. Максимальную OD 72,8 наблюдали после 103 часов ферментации. Начальный растворенный кислород (DO) составлял приблизительно 75% и постепенно падал до 0% после 45 ч работы, показывая, что клеточный рост ограничен скоростью переноса массы газа. Максимальную удельную скорость роста (μ_max) 0,08 ч^-1 наблюдали от 20 до 60 ч ферментации. Затем удельная скорость роста снижалась до 0,03 ч^-1, пока она не достигала плато. В конце эксперимента, регистрировали максимальную плотность клеток и содержание PHB 24,16 г/л и 59%, соответственно.

Стандартный газовый поглотитель для микробной газовой культуры

Стандартный газовый поглотитель с колонной с набитым слоем модифицировали в биореактор для микробной газовой культуры C. necator. На фиг. 9 представлено схематическое изображение экспериментальной установки. Реактор (3 л) заполняли 1,5 л той же жидкой среды, что и выше. В течение эксперимента, водный раствор рециркулировали через внешний контур и рассеивали в верхнюю часть 20 см колонны с набитым слоем из стеклянных гранул. Слой обеспечивал область контакта газа и жидкости. Насос прямого вытеснения в контуре рециркуляции создает скорость потока 5,3 л/мин. Поток газа (70% H₂, 20% O₂ и 10% CO₂) 1,5 л/мин вводили в реактор из верхнего впуска газа и выгружали после контакта с сопутствующей жидкостью через отработавший газ выпуск. Осуществляли мониторинг точных концентраций CO₂ и O₂ в отработавшем газе с использованием газового анализатора. После инокуляции с использованием 100 мл посевного раствора, поддерживали те же условия роста, как в стандартном биореакторе. Образцы жидкости собирали с течением времени для OD, плотности клеток и содержания PHB.

На фиг. 10 представлено изменение OD в зависимости от времени ферментации для стандартного газового поглотителя. Наивысшую OD 14,0 наблюдали в течение периода ферментации 90 ч. После 12-часовой lag-фазы, клетки демонстрировали экспоненциальный рост в первые 25 часов при максимальной удельной скорости роста (μ_max) 0,13 ч^-1. Затем удельная скорость роста постепенно снижалась до 0,03 ч^-1, чтобы давать линейное увеличение плотности клеток, признак ограничения переноса массы. Максимальная плотность клеток составляла приблизительно 4,2 г/л при соответствующей OD 14 после периода ферментации 90 ч.

Эффективность биореактора с распылительными соплами в соответствии с настоящим изобретением (SNBR)

В стандартных биореакторах и газовых поглотителях газ рассеивают в непрерывной фазе жидкости. По причине низкой растворимости газа, газ быстро образует пузырьки и покидает жидкий раствор, что ведет к короткому времени контакта для переноса массы. Для того чтобы поддерживать большой объем задержки газа в водном растворе, необходима высокая скорость потока газа, результатом чего является большое расходование газа впустую. Для того чтобы разрешать эти недостатки, биореактор по настоящему изобретению отличается обратным распределением газа в жидкости, как показано на фиг. 1. Раствор 11 среды циркулируют через внешний контур 6 на 3,1 л/мин и распыляют в виде мелких капелек в газовую фазу через распылительное сопло 12 (отверстие 0,18 см, Cole Parmer, Vernon Hills, IL). Газообразный субстрат 14 вводили в верхнюю газовую фазу 15, присутствующую в биореакторе, с желаемой скоростью потока через трубопровод 25. Поскольку контакт газ/жидкость определяют капельки жидкости, а не объем задержки газа в растворе, потоком газа можно управлять при очень низкой скорости потока в зависимости от того, насколько быстро микробные клетки могут использовать газы. Более важно, что большую скорость переноса массы (k_La) можно поддерживать независимо от скорости потока газа. Время удержания потока газа также можно корректировать посредством изменения объема верхнего пространства биореактора. В этом демонстрационном случае распылительное о располагают в 10 см над поверхностью жидкости.

Подобно вышеприведенным экспериментам со стандартным биореактором и газовым поглотителем, те же 1,5 л жидкого раствора использовали в распылительном биореакторе с соплами (общий объем 3 л). После инокуляции с использованием 100 мл посевного раствора, клетки выращивали при потоке газа 0,45 л/мин. pH и температуру поддерживали равными 6,9 и 30,0°C, соответственно. Падение давления на сопле измеряли с использованием цифрового датчика давления (Cole Parmer, Vernon Hills, IL). Подобно предыдущим экспериментам, образцы жидкости анализировали на OD, плотность клеток и содержание PHB. Осуществляли мониторинг компонентов отработавшего газа с помощью газового анализатора.

На фиг. 11 представлен клеточный рост или увеличение оптической плотности в зависимости от времени ферментации. Наивысшую OD 32,2 регистрировали после 72 ч ферментации. Соответствующая плотность клеток составляла 12,7 г/л. Максимальную удельную скорость роста (μ_max) 0,15 ч^-1 наблюдали в течение первых 24 ч периода ферментации и затем она постепенно снижалась до 0,04 ч^-1, указывая на возможное ограничение переноса массы газа. Падение давления на сопле поддерживали между 30,6 и 30,9 фунта/дюйм².

Объемный коэффициент переноса массы (k_La) кислорода измеряли с использованием потока воздуха при различных скоростях потоков. В частности, наивысший k_La 230 ч^-1 наблюдали при скорости потока воздуха 0,75 л/мин. По сравнению со стандартным биореактором (таблица 1), это является значимым усовершенствованием в отношении экономии газа и снижения потребления энергии.

Эффективность биореактора со статическими смешивателями и распылительными соплами (SNSMBR)

Приведенный выше биореактор с распылительными соплами дополнительно усовершенствовали посредством добавления статических смешивателей 7 в контуре 6 циркуляции жидкости и введения потока 14 газа между насосом 4 и смешивателями 7, как показано на фиг. 1. Потоки газа и жидкости предварительно смешивали в статических смешивателях (в этом случае двух) и их контакт значительно увеличивали при высоком напряжении сдвига в сопле. Мелкие капельки смеси жидкость-газ значительно увеличивают скорость переноса массы газа. k_La возрастал до 377 ч^-1 при низкой скорости потока воздуха 0,75 л/мин. По сравнению с реактором с распылительными соплами (SNBR) с фиг. 1, SNSMBR с фиг. 2 демонстрирует 60% увеличение при той же скорости потока газа. При сравнении с данными о k_La стандартного биореактора (таблица 1), SNSMBR дает 150% увеличение k_La (скорость потока воздуха 0,75 л/мин и возбуждение 900 об./мин).

Ту же микробную культуру из эксперимента, который осуществляли в SNBR, тестировали в биореакторе SNSMBR, показанном на фиг. 2. Рабочие параметры, такие как pH и температура, схожи с предыдущими экспериментами, приведенными выше. Раствор среды в реакторе составлял 1,5 л и скорость потока рециркуляции составляла 3,1 л/мин, чтобы давать время удержания жидкости 0,48 мин. Скорость впускного потока газа поддерживали между 0,2 и 0,3 л/мин (скорость газонаполнения 0,13-0,2 об./об./мин; поверхностная скорость газа 0,00019-0,00028 м/с) и композиция газовой смеси была схожа с предыдущими экспериментами (70% H₂, 20% O₂ и 10% CO₂). Образцы жидкости анализировали на OD, плотность клеток и содержание PHB. Мониторинг композиции отработавшего газа осуществляли с помощью газового анализатора.

На фиг. 12 представлена динамика клеточного роста или увеличение оптической плотности в зависимости от времени ферментации в SNSMBR. После инокуляции с использованием 100 мл посевного раствора, оптическая плотность ферментативного бульона возрастала экспоненциально при удельной скорости роста 0,16 ч^-1. Наивысшей OD 70 достигали через 65 ч ферментации. Соответствующая плотность клеток составляла 26,74 г/л и конечное содержание PHB в сухой клеточной массе составляло 52%. Наиболее значимым достижением системы реактора SNSMBR состояло в использовании очень низкой скорости потока газа (< 0,3 л/мин). Следовательно, по сравнению со стандартным биореактором, значительно снижали расходование газа впустую. Этим экономят газообразный H₂, который считают наиболее дорогостоящим исходным сырьем при получении PHB из газообразных субстратов, в частности, когда топочный газ, содержащий CO₂ и O₂, используют в качестве исходного сырья.

Сравнение эффективности биореактора в микробных газовых культурах

Таблица 6 представляет собой сравнение двух стандартных биореакторов (CBR и CGA), описанных выше, и двух биореакторов в соответствии с настоящим изобретением (SNBR и SNSMBR).

Таблица 6. Эффективность биореакторов в микробных газовых культурах

Тип реактора Стандартный биореактор (CBR) Стандартный газовый поглотитель (CGA) Биореактор с распылительными соплами (SNBR) Распылительное сопло с статическими смешивателями (SNSMBR) Максимальная OD 72 14 32 70 Максимальная плотность клеток (г/л) 24,1 4,7 12,4 26,7 Скорость возбуждения (об./мин) 900 n/a n/a n/a Содержание PHB (% сухого вещества) 59 56 53 52 Скорость потока газа (л/мин)^a 1,5 1,5 0,5 0,2-0,3 Скорость жидкости потока (л/мин) n/a 5,3 3,1 3,1 Максимальный k_La (ч^-1) 144 230 280 377 Производительность клеток (г/л×ч) 0,23 0,047 0,18 0,41 Клеточный выход на H₂ (г DCM/г H₂)^b 0,068 0,014 0,16 0,73

a. Скорость потока газа при 1 атм., 30 °C.

b. Грамм сухой клеточной массы, полученной на грамм H₂, введенного в биореакторы.

По сравнению со стандартным биореактором (CBR), SNSMBR дает значительно более высокую производительность клеток и производительность PHB, при этом используя значительно меньше водорода. Выход сухой клеточной массы на основе количества водорода, подаваемого в биореактор, увеличивали более чем в 10 раз.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен способ получения по меньшей мере одного полигидроксиалканоата через ферментацию газа и биореактор для ферментации газа (варианты). Способ включает заполнение сосуда ферментации газа с частично заполненным ферментативным бульоном газовой фазой, непрерывное отведение аликвоты ферментативного бульона из сосуда, подачу газообразного субстрата в сосуд, смешивание газообразного субстрата с отводимым из сосуда ферментативным бульоном, культивирование ферментирующих газ микроорганизмов с газожидкостной смесью, извлечение полигидроксиалканоата из клеточной массы. Биореактор содержит сосуд с ферментативным бульоном и газовой фазой, выходной циркуляционный трубопровод, распыляющее сопло и систему для подачи в газовую фазу газообразного субстрата. Изобретения обеспечивают высокую производительность клеток и полигидроксиалканоата. 3 н. и 9 з.п. ф-лы, 12 ил., 6 табл.

1. Способ получения по меньшей мере одного полигидроксиалканоата через ферментацию газа, который включает стадии:

a) предоставления по меньшей мере одного сосуда (2) ферментации газа, имеющего внутренний объем, частично заполненный жидким ферментативным бульоном (11), содержащим:

- воду,

- суспендированные ферментирующие газ микроорганизмы, способные продуцировать по меньшей мере один полигидроксиалканоат,

- питательные вещества для ферментирующих газ микроорганизмов; и

заполнение остальной части объема сосуда (2) ферментации газа газовой фазой (15);

b) непрерывного отведения аликвоты жидкого ферментативного бульона (11) из сосуда (2) ферментации газа;

c) подачи газообразного субстрата (14), содержащего CO₂, H₂ и O₂, в сосуд (2) ферментации газа;

d) смешивания газообразного субстрата (14) с жидким ферментативным бульоном (11), отводимым из сосуда (2) ферментации газа, посредством контакта жидкого ферментативного бульона (11) в форме распыляемых капелек с газообразным субстратом (14) в газовой фазе (15);

e) культивирования ферментирующих газ микроорганизмов с газожидкостной смесью, получаемой на стадии d в сосуде (2) ферментации газа, чтобы формировать клеточную массу, содержащую по меньшей мере один полигидроксиалканоат;

f) извлечения по меньшей мере одного полигидроксиалканоата из клеточной массы.

2. Способ получения по меньшей мере одного полигидроксиалканоата через ферментацию газа по п. 1, который включает стадии:

a) предоставления по меньшей мере одного сосуда (2) ферментации газа, имеющего внутренний объем, частично заполненный жидким ферментативным бульоном (11), содержащим:

- воду,

- суспендированные ферментирующие газ микроорганизмы, способные продуцировать по меньшей мере один полигидроксиалканоат,

- питательные вещества для ферментирующих газ микроорганизмов;

заполнение остальной части объема сосуда (2) ферментации газа газовой фазой (15);

b) непрерывного отведения аликвоты жидкого ферментативного бульона (11) из сосуда ферментации газа;

c) подачи газообразного субстрата (14), содержащего CO₂, H₂ и O₂, и смешивания газообразного субстрата (14) с жидким ферментативным бульоном (11), отводимым из сосуда (2) ферментации газа;

d) распыления получаемой таким образом газожидкостной смеси в сосуд (2) ферментации газа и культивирования ферментирующих газ микроорганизмов для того, чтобы формировать клеточную массу, содержащую по меньшей мере один полигидроксиалканоат;

e) извлечения по меньшей мере одного полигидроксиалканоата из клеточной массы.

3. Способ получения по меньшей мере одного полигидроксиалканоата через ферментацию газа по п. 1, который включает стадии:

a) предоставления по меньшей мере одного сосуда (2) ферментации газа, имеющего внутренний объем, частично заполненный жидким ферментативным бульоном (11), содержащим:

- воду,

- суспендированные ферментирующие газ микроорганизмы, способные продуцировать по меньшей мере один полигидроксиалканоат,

- питательные вещества для ферментирующих газ микроорганизмов;

заполнение остальной части объема сосуда (2) ферментации газа газовой фазой (15);

b) непрерывного отведения аликвоты жидкого ферментативного бульона (11) из сосуда (2) ферментации газа;

c) подачи газообразного субстрата (14), содержащего CO₂, H₂ и O₂, в газовую фазу (15) в сосуд (2) ферментации газа;

d) распыления жидкого ферментативного бульона (11), отводимого из сосуда (2) ферментации газа, в газовую фазу (15);

e) культивирования ферментирующих газ микроорганизмов с газожидкостной смесью, получаемой на стадии d в сосуде (2) ферментации газа, чтобы формировать клеточную массу, содержащую по меньшей мере один полигидроксиалканоат;

f) извлечения по меньшей мере одного полигидроксиалканоата из клеточной массы.

4. Способ по п. 1, в котором жидкий ферментативный бульон (11) отводят и повторно вводят в сосуд (2) ферментации газа при скорости циркуляции, равной или выше чем 2 л/мин, предпочтительно равной или выше чем 3 л/мин.

5. Способ по п. 1, в котором газообразный субстрат (14) подают в сосуд (2) ферментации газа при скорости газонаполнения, равной или ниже чем 0,001 м/с, предпочтительно равной или ниже чем 0,0005 м/с.

6. Способ по п. 4, в котором газообразный субстрат (14) подают в сосуд (2) ферментации газа при скорости газонаполнения, равной или ниже чем 0,001 м/с, предпочтительно равной или ниже чем 0,0005 м/с.

7. Способ по п. 1, в котором распыление жидкого ферментативного бульона (11), необязательно смешанного с газообразным субстратом (14), осуществляют через одно или несколько сопел (12), каждое имеет падение давления, равное или ниже чем 1,0×10⁵ Па.

8. Способ по п. 2, в котором газообразный субстрат (14) смешивают с жидким ферментативным бульоном (11), отводимым из сосуда ферментации газа, в по меньшей мере одном статическом смешивателе (7) перед циркуляцией и распылением в сосуд (2) ферментации газа.

9. Способ по п. 1, в котором газообразный субстрат (14) представляет собой топочный газ.

10. Биореактор (1) для ферментации газа, содержащий:

- сосуд (2), имеющий внутренний объем, частично заполненный жидким ферментативным бульоном (11), содержащим ферментирующие газ микроорганизмы и сбраживаемую среду, остальная часть объема сосуда (2) заполнена газовой фазой (15);

- по меньшей мере один выходной циркуляционный трубопровод (19), сообщающийся с внутренней частью сосуда (2), через который отводят аликвоту жидкого ферментативного бульона (11), трубопровод (19) соединен с линией (6) циркуляции для циркуляции указанной аликвоты жидкого ферментативного бульона (11) снаружи сосуда (2) и последующего повторного введения ее в газовую фазу (15), присутствующую в сосуде (2);

- по меньшей мере одно распыляющее сопло (12), соединенное с выходной линией (6) циркуляции для распыления жидкого ферментативного бульона (11) в газовую фазу (15);

- систему (30) подачи для подачи в газовую фазу (15) газообразного субстрата (14), содержащего один или несколько газов для того, чтобы культивировать ферментирующие газ микроорганизмы, система (30) подачи соединена с газовой фазой (15) через впускной трубопровод (25), сообщающийся с внутренней частью сосуда (2).

11. Биореактор (1) для ферментации газа, содержащий:

- сосуд (2), имеющий внутренний объем, частично заполненный жидким ферментативным бульоном (11), содержащим ферментирующие газ микроорганизмы и сбраживаемую среду, остальная часть объема сосуда (2) заполнена газовой фазой (15);

- по меньшей мере один выходной циркуляционный трубопровод (19), сообщающийся с внутренней частью сосуда (2), через который отводят аликвоту жидкого ферментативного бульона (11), трубопровод (19) соединен с линией (6) циркуляции для циркуляции указанной аликвоты жидкого ферментативного бульона (11) снаружи сосуда (2) и последующего повторного введения ее в газовую фазу (15), присутствующую в сосуде (2);

- по меньшей мере одно распыляющее сопло (12), соединенное с выходной линией (6) циркуляции для распыления жидкого ферментативного бульона (11) в газовую фазу (15);

- систему (30) подачи для подачи в жидкий ферментативный бульон (11), отводимый из сосуда (2), газообразного субстрата (14), содержащего один или несколько газов, чтобы культивировать ферментирующие газ микроорганизмы, система (30) подачи соединена с линией (6) циркуляции с тем, чтобы газожидкостную смесь, полученную таким образом, распылять в газовую фазу (15), присутствующую в сосуде (2), с помощью указанного распыляющего сопла (12).

12. Биореактор (1) для ферментации газа по п. 11, в котором линия (6) циркуляции содержит по меньшей мере один статический смешиватель (7) для смешивания жидкого ферментативного бульона (11), отводимого из сосуда (2), и газообразного субстрата (14), чтобы формировать газожидкостную смесь.