СПОСОБ ФЕРМЕНТАЦИИ ГАЗООБРАЗНОГО СУБСТРАТА, СОДЕРЖАЩЕГО ВОДОРОД Российский патент 2016 года по МПК C12P7/02 C12P7/06 

Настоящее изобретение относится к способам ферментации газообразного субстрата, содержащего водород. Настоящее описание конкретно относится к способам ферментации газообразного субстрата, содержащего водород, для получения одного или нескольких спиртов.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ранее были предложены способы получения химических соединений, таких как органические кислоты, например уксусная кислота, и спирты, например этанол, путем микробиологической ферментации газовых субстратов, содержащих монооксид углерода и водород, в средах, содержащих подходящие питательные вещества и следовые количества минеральных веществ, с помощью определенных микроорганизмов, таких как род Closthdium. Например, в патенте США №5173429, Gaddy и др., раскрыты Clostridium ljungdahlii ATCC №49587, анаэробные микроорганизмы, производящие этанол и ацетат из синтез-газа. В патенте США №5807722, Gaddy и др., раскрыты способ и аппаратура для превращения отходящих газов в полезные продукты, такие как органические кислоты, с помощью анаэробных бактерий типа Clostridium ljungdahlii ATCC No. 55380. В патенте США №6136577, Gaddy и др., раскрыт способ и аппаратура для превращения отходящих газов в полезные продукты, такие как органические кислоты и спирты (особенно этанол), с помощью анаэробных бактерий типа Clostridium ljungdahlii ATCC №№55988 и 55989.

В патентной заявке США №20070275447 раскрыты бактерии Clostridium (Clostridium carboxidivorans, ATCC BAA-624, "P7"), способные синтезировать из отходящих газов продукты, применяемые в качестве биотоплива. В патенте США №7704723 раскрыты бактерии Clostridium (Clostridium ragsdalei, ATCC BAA-622, "PI 1"), способные синтезировать из отходящих газов продукты, применяемые в качестве биотоплива.

В патенте WO 2007/117157 описано применение Clostridium autoethanogenum (Accession No. DSM 10061, DSMZ, Germany) для получения этанола путем анаэробной ферментации субстратов, содержащих монооксид углерода. В WO 2009/064200 раскрыты другие бактерии (Clostridium autoethanogenum, Accession No. DSM 19630, DSMZ, Germany) для получения этанола анаэробной ферментацией субстратов, содержащих монооксид углерода.

Как известно, скорость образования химических соединений типа спиртов зависит от плотности микробных клеток («плотности клеток») в ферментационной среде. Соответствующая высокая плотность клеток в биореакторе необходима для достижения и поддержания высокой скорости получения химических веществ.

В патенте США №6136577, Gaddy, раскрыт способ получения этанола путем ферментации с использованием рецикла клеток для повышения плотности клеток.

В патенте США №7285402, Gaddy и др., раскрыт способ анаэробной микробиологической ферментации для получения спирта, где для повышения плотности клеток предлагается проводить запуск процесса с использованием маточной культуры при избытке Н₂.

Запуск порции посевного материала из маточной культуры обеспечивает получение не содержащего примесей работоспособного посевного материала, однако процедура инокуляции протекает не всегда успешно в случае малой плотности клеток, особенно если параметры процесса, такие как скорость газа и скорость перемешивания, повышают слишком резко сразу после внесения посевного материала.

В настоящее время необходимы усовершенствованные способы повышения плотности клеток при микробиологической ферментации газообразного субстрата. Настоящее изобретение предлагает способ ускоренного повышения плотности клеток для микробиологической ферментации газообразного субстрата.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение раскрывает способ получения одного или нескольких спиртов из газообразного субстрата, включающий: ферментацию газообразного субстрата, содержащего водород (H₂) либо водород и монооксид углерода (СО), в водной среде в биореакторе; указанный способ включает повышение плотности клеток путем регулирования поглощения СО; причем регулирование поглощения водорода включает определение скорости подачи водорода; определение скорости отвода водорода; регулирование скорости подачи одного или нескольких газовых субстратов и водорода; причем регулирование скорости поглощения водорода включает подачу указанного газообразного субстрата таким образом, чтобы молярное соотношение указанного поглощения водорода и скорости подачи газообразного субстрата находилось в первом заданном интервале; причем регулирование поглощения водорода включает подачу указанного газообразного субстрата таким образом, чтобы молярное соотношение указанного поглощения водорода и скорости подачи водорода находилось во втором заданном интервале; причем указанный первый заданный интервал включает интервал 0.001-1.0; указанный первый заданный интервал включает интервал 0.005-0.5; указанный второй заданный интервал включает интервал примерно 0.01-0.1; указанный второй заданный интервал включает интервал 0.001-1.0; указанный второй заданный интервал включает интервал 0.005-0.5; указанный второй заданный интервал включает интервал 0.01-0.1; причем способ включает также подачу потока водной среды в биореактор; отвод непрерывного потока ферментационного бульона из биореактора; также повышение плотности клеток путем регулирования скорости изменения удельного поглощения СО; причем регулирование изменения удельного поглощения СО включает определение скорости подачи СО; определение скорости отвода СО; определение массы клеток и регулирование скорости подачи СО; причем скорость изменения удельного поглощения СО включает заданные шаги удельного поглощения СО; причем указанные заданные значения удельного поглощения СО включают интервал примерно а 0.001-10.0 ммоль/мин/грамм сухих клеток; указанные заданные значения удельного поглощения СО включают интервал примерно 0.01-5.0 ммоль/мин/грамм сухих клеток; указанные заданные значения удельного поглощения СО включают интервал примерно 0.1-1.0 ммоль/мин/грамм сухих клеток; причем указанная водная среда содержит один или несколько микроорганизмов, в том числе: биологически чистые микроорганизмы; природные микроорганизмы; не встречающиеся в природе микроорганизмы; не встречающиеся в природе генетически модифицированные микроорганизмы; мутанты природных микроорганизмов; мутанты не встречающихся в природе микроорганизмов; рекомбинантные микроорганизмы; микроорганизмы, полученные методами генной инженерии; искусственно синтезированные микроорганизмы; указанный биореактор включает один или несколько реакторов; причем указанный биореактор включает установку для рецикла клеток; указанный СО-содержащий субстрат содержит водород; кроме того, способ включает подачу питательной среды в указанный биореактор.

Настоящее изобретение предлагает: способ ферментации газообразного субстрата, включающий: подачу газообразного субстрата, содержащего водород (H₂) либо водород и монооксид углерода (СО), в водную среду в биореакторе; причем указанная водная среда содержит один или несколько микроорганизмов; указанный способ включает повышение плотности клеток путем регулирования поглощения водорода; причем регулирование поглощения водорода включает определение скорости подачи водорода; определение скорости отвода водорода; и регулирование скорости подачи одного или нескольких газовых субстратов и водорода; причем регулирование скорости поглощения водорода включает такую подачу указанного газообразного субстрата, чтобы молярное соотношение указанного поглощения водорода и скорости подачи газообразного субстрата находилось в первом заданном интервале.

В вариантах настоящего изобретения: регулирование поглощения водорода включает подачу указанного газообразного субстрата таким образом, чтобы молярное соотношение указанного поглощения водорода и скорости подачи водорода находилось во втором заданном интервале, причем указанный заданный интервал составляет примерно 0.001-1.0.

В вариантах настоящего изобретения: указанный первый заданный интервал составляет примерно 0.005-0.5; указанный второй заданный интервал составляет примерно 0.01-0.1; указанный второй заданный интервал составляет примерно 0.001-1.0; указанный второй заданный интервал составляет примерно 0.005-0.5; указанный второй заданный интервал составляет примерно 0.01-0.1.

Вариант настоящего изобретения включает подачу потока водной среды в биореактор и отвод потока ферментационного бульона из биореактора. Вариант настоящего изобретения включает подачу непрерывного потока водной среды в биореактор и отвод непрерывного потока ферментационного бульона из биореактора.

Вариант настоящего изобретения включает: повышение плотности клеток путем регулирования скорости изменения удельного поглощения СО; причем регулирование изменения удельного поглощения СО включает определение скорости подачи СО; определение скорости отвода СО; определение массы клеток; регулирование скорости подачи СО; причем скорость изменения удельного поглощения СО включает заданные значения удельного поглощения СО; указанные заданные значения удельного поглощения СО включают интервал примерно 0.001-10.0 ммоль/мин/грамм сухих клеток; указанные заданные значения удельного поглощения СО включают интервал примерно 0.01-5.0 ммоль/мин/грамм сухих клеток; указанные заданные значения удельного поглощения СО включают интервал примерно 0.1-1.0 ммоль/мин/грамм сухих клеток.

Вариант настоящего изобретения включает: указанные микроорганизмы по настоящему изобретению, которые включают один или несколько микроорганизмов, в том числе биологически чистые микроорганизмы; природные микроорганизмы; не встречающиеся в природе микроорганизмы; не встречающиеся в природе генетически модифицированные микроорганизмы; мутанты природных микроорганизмов; мутанты не встречающихся в природе микроорганизмов; рекомбинантные микроорганизмы; микроорганизмы, полученные методами генной инженерии и искусственно синтезированные микроорганизмы, причем указанные микроорганизмы выбирают из Acetogenium kivui, Acetobacteiium woodii, Acetoanaerobium noterae, Butyribacterium methylotrophicum, Caldanaerobacter subterraneous, Caldanaerobacter subterraneous pacificus, Carboxydothermus hydrogenoformans, Clostridium aceticum, Clostridium acetobutylicum, Clostridium autoethanogenum (DSM 23693), Clostridium autoethanogenum (DSM 19630 of DSMZ Germany), Clostridium autoethanogenum (DSM 10061 of DSMZ Germany), Clostridium thermoaceticum, Eubacterium limosum, Clostridium ljungdahlii PETC (ATCC 49587), Clostridium ljungdahlii ERI2 "(ATCC 55380), Clostridium ljungdahlii C-01 (ATCC 55988), Clostridium ljungdahlii 0-52 (ATCC 55889), Clostridium ultunense, Clostridium ragsdali Pll (ATCC BAA-622), Alkalibaculum bacchi CPU (ATCC BAA-1772), Clostridium coskatii, Clostridium carboxidivorans P7 (ATCC PTA-7827), Geobacter sulfurreducens, Morrella thermacetica, Peptostreptococcus productus, Clostridium drakei, рекомбинантного организма (DSM 24138) и их смесей; причем указанные микроорганизмы включают один или несколько штаммов Clostndium ljundahlii, или один или несколько штаммов Clostndium ragsdalei, или один или несколько штаммов Clostridium carboxidivorans, или один или несколько штаммов Clostridium autoethanogenum; причем указанные микроорганизмы включают один или несколько генетически модифицированных микроорганизмов, полученных введением одного или нескольких выбранных генов в организм хозяина, который выбирают из любых штаммов Clostridium ljundahlii, или любых штаммов Clostridium ragsdalei, или любых штаммов Clostridium carboxidivorans, или любых штаммов Clostridium autoethanogenum; причем указанные микроорганизмы включают один или несколько генетически модифицированных организмов, полученных введением в любой организм хозяина одного или нескольких генов из любых штаммов Clostridium ljundahlii, или любых штаммов Clostridium ragsdalei, или любых штаммов Clostridium carboxidivorans, или любых штаммов Clostridium autoethanogenum.

Варианты способа по настоящему изобретению: указанный биореактор включает один или несколько реакторов; причем указанный биореактор включает установку для рецикла клеток.

Вариант способа по настоящему изобретению, в котором указанный СО-содержащий субстрат содержит водород.

Вариант способа по настоящему изобретению, включающий подачу питательной среды в указанный биореактор.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1 представляет схему, иллюстрирующую вариант способа микробиологической ферментации газообразного субстрата.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Если не указано иное, нижеприведенные термины в описании данного изобретения определены следующим образом и могут включать либо единственную, либо множественные формы указанных ниже терминов.

Термин «примерно», модифицирующий любое количество, относится к вариации этого количества в реальных условиях поддержания культуры микроорганизма, например, в лаборатории, пилотной установке или производственной аппаратуре. Например, количество ингредиента или измеряемая величина в смеси или любое количество, модифицированные словом «примерно», включают вариации и степень точности, обычно применяемые при определении в условиях эксперимента на производстве или в лаборатории. Например, количество компонента продукта, модифицированное словом «примерно», включает вариации порций во многих экспериментах на производстве или в лаборатории и вариации, присущие данному методу анализа. Независимо от того, модифицированы количества термином «примерно» или нет, количества включают эквиваленты этих количеств. Любое количество, приведенное здесь и модифицированное термином «примерно», можно использовать в настоящем изобретении так же, как и количество, не модифицированное термином «примерно».

Термин «ацетоген» или «ацетогенный» относится к бактериям, которые генерируют ацетат в качестве продукта анаэробного дыхания. Эти организмы также называют ацетогенными бактериями, т.к. все известные ацетогены являются бактериями. Ацетогены находятся во многих средах, обычно в анаэробных условиях (в отсутствие кислорода). Ацетогены могут использовать различные соединения в качестве источников энергии и углерода; наилучшие изученные формы ацетогенного метаболизма включают использование диоксида углерода в качестве источника углерода и водорода в качестве источника энергии.

Термины «биореактор», «реактор» или «ферментационный биореактор» включают устройство для ферментации, состоящее из одного или нескольких сосудов и/или колонн или трубопроводов, которое включает поточный реактор с мешалкой (CSTR), барботажную колонну, газлифтовый ферментер, стационарный миксер или другие устройства, осуществляющие контакт газ-жидкость. Для способа по данному изобретению ферментационный биореактор может включать культивационный реактор, из которого ферментационный бульон подают во второй ферментационный биореактор, где получают основную массу продукта - этанол.

Термин «плотность клеток» означает массу клеток микроорганизмов в единице объема ферментационного бульона, например, г/литр.

Термин «рецикл клеток» или «система для рецикла клеток» или «срк» означает вариант отделения жидкости (пермеата) от твердых клеток микроорганизмов в ферментационном бульоне и возвращение всех или части указанных отделенных твердых клеток микроорганизмов в ферментер, в котором с использованием указанных микроорганизмов получают указанный ферментационный бульон. Обычно для указанного разделения используют фильтр. На фильтре получают поток пермеата, не содержащего твердых частиц микроорганизмов, и поток концентрированных твердых частиц микроорганизмов. Поток пермеата, не содержащего твердых частиц, может содержать твердые частицы размером меньше заданного.

Термин «конверсия» означает часть введенного количества, которая превратилась в продукт(ы); она определена следующим уравнением: (введенное количество - количество на выходе)/(введенное количество).

Термин «производительность по этанолу» означает количество этанола, полученного в единице объема ферментера за сутки. Объем ферментера является эффективным объемом или объемом жидкости в ферментере.

Термин «ферментация» означает ферментацию СО до спиртов и ацетата. Известно множество бактерий, способных осуществлять ферментацию СО до спиртов, в том числе бутанола и этанола, а также уксусной кислоты, пригодных для использования в способе по настоящему изобретению. Примеры таких бактерий, пригодных для использования в способе по настоящему изобретению, включают бактерии рода Clostridium, например, штаммы Clostridium ljungdahlii, включая описанные в WO 2000/68407, ЕР 117309, патентах США №№5173429, 5593886 и 6368819, WO 1998/00558 и WO 2002/08438, штаммы Clostiidium autoethanogenum (DSM 10061 и DSM 19630 of DSMZ, Germany), включая описанные в WO 2007/117157 и WO 2009/151342, и Clostn'dium ragsdalei (PI 1, ATCC BAA622), включая описанные соответственно в патенте США №7704723 и "Biofuels and Bioproducts from Biomass-Generated Synthesis Gas," Hasan Atiyeh, изданной в трудах Oklahoma EPSCoR Annual State Conference, April 29, 2010, и Clostiidium carboxidivorans (ATCC BAA-624), описанные в патентной заявке США №20070275447. Другие подходящие бактерии включают бактерии рода Moorella, в том числе Moorella sp HUC22-1, и бактерии рода Carboxydothermus. Описание каждой из этих публикаций полностью введено здесь ссылками. Кроме того, специалисты в данной области могут выбрать другие микроорганизмы для применения в способе по данному изобретению. Важно подчеркнуть, что в способе по настоящему изобретению можно применять смешанную культуру из двух или нескольких микроорганизмов. Одним из видов микроорганизмов, пригодных для применения в настоящем изобретении, является Clostiidium autoethanogenum. Ферментацию можно проводить в любом подходящем биореакторе, таком как проточный реактор с мешалкой (CTSR), барботажная колонна (BCR) или реактор с орошаемым слоем (TBR). Кроме того, в некоторых предпочтительных вариантах изобретения биореактор может включать первый культивационный реактор, в котором выращивают микроорганизмы, и второй ферментационный реактор, в который подают ферментационный бульон из культивационного реактора и в котором получают основную часть продукта ферментации (этанола и ацетата).

Термин «ферментационный бульон» означает: состав ферментационной среды включает все, что приводит к ферментационному бульону, включая исходные субстраты, продукты ферментации, микроорганизм(ы) и производные компоненты, химические добавки, питательные вещества и газы. В ферментационном бульоне присутствуют все три основные фазы: твердая, жидкая и газообразная, между которыми возможно взаимодействие.

Термин «ген» означает сегмент ДНК; он может включать области, предшествующие и следующие за кодирующей ДНК, а также интроны между экзонами; ген может быть единицей наследственности; в данном описании термин «ген» включает сегмент ДНК, который вносит вклад в фенотип/функцию; сегменты ДНК, которые клетки транскрибируют в РНК и транслируют, по крайней мере частично, в белки; последовательность (цепочка) оснований, состоящих из комбинаций А, Т, С и G. В целом, как предлагается в данном изобретении, это определение может иметь либо единственное, либо множественное значение.

Термин «микроорганизм» или «микроб» включает микроорганизмы, грибки, дрожжи, археи и протисты; микроскопические растения (называемые зелеными водорослями); и животные, такие как планктон, планарии и амебы. Иногда сюда включают также вирусы, но обычно их считают неживыми. Микроорганизмы живут во всех частях биосферы, где есть жидкая вода, включая грунт, горячие источники, дно океана, высокие слои атмосферы и трещины в скалах земной коры. Микроорганизмы критичны для рецикла питательных веществ в экосистемах, т.к. они действуют как деструкторы. Микробы также используют в биотехнологии, в традиционном производстве пищи и напитков и в современных технологиях, основанных на генной инженерии. Важно, что в данном изобретении можно применять микроорганизмы смешанных штаммов, которые могут содержать или не содержать штаммы разных микроорганизмов. Также важно, что с помощью направленной эволюции можно селективно подбирать микроорганизмы для применения в настоящем изобретении. Также очевидно, что мутагенез существующих микроорганизмов в результате обработки их различными химическими соединениями (для модифицирования ДНК) может привести к высокоактивным микроорганизмам. Важно также, что техника рекомбинантной ДНК позволяет создавать микроорганизмы путем отбора штаммов существующих микроорганизмов. Важно, что в настоящем изобретении можно применять бактерии, способные превращать СО и воду или Н₂ и CO₂ в этанол и уксусную кислоту. Некоторые примеры полезных бактерий включают Acetogenium kivui, Acetobacterium woodii, Acetoanaerobium noterae, Butyribacterium methylotrophicum, Caldanaerobacter subterraneous, Caldanaerobacter subterraneous pacijicus, Carboxydothermus hydrogenoformans, Clostridium aceticum, Clostridium acetobutylicum, Clostridium autoethanogenum (DSM 23693), Clostridium autoethanogenum (DSM 19630 of DSMZ Germany), Clostridium autoethanogenum (DSM 10061 of DSMZ Germany), Clostridium thermoaceticum, Eubacterium limosum, Clostridium ljungdahlii PETC (ATCC 49587), Clostridium ljungdahlii ERI2 (ATCC 55380), Clostridium ljungdahlii C-01 (ATCC 55988), Clostridium ljungdahlii 0-52 (ATCC 55889), Clostridium ultunense, Clostridium ragsdali Pll (ATCC BAA-622), Alkalibaculum bacchi CPU (ATCC BAA-1772), Clostridium coskatii, Clostridium carboxidivorans P7 (ATCC PTA-7827), Geobacter sulfurreducens, Monella thermacetica, Peptostreptococcus productus, Clostridium drakei, рекомбинантный микроорганизм (DSM 24138J и их смеси. Специалист в данной области может выбрать другие бактерии для применения в этих способах. В целом, как принято в данном изобретении, такое определение может иметь единственное или множественное значение.

Термин «питательная среда» включает среду для культивирования микроорганизмов, которая может содержать один или несколько витаминов и минеральных веществ, способствующих культивированию выбранного микроорганизма. Компоненты разнообразных питательных сред, пригодных для применения в настоящем изобретении, известны и опубликованы в предшествующих работах, например, в Международной патентной заявке № WO 2008/00558, патенте США №7285402, патенте США №5807722; патенте США №5593886 и патенте США №5821111.

Термин «удельное поглощение СО» означает количество СО в ммолях, поглощенное единицей массы клеток микроорганизмов (г) в единицу времени в минутах, например ммоль/г/мин.

Термин «субстрат» означает вещество, которое подвергается действию фермента или микроорганизма и образует продукт ферментации. Например, сахар в ферментации сахара ферментами с образованием этанола; СО, CO₂ и Н₂ в ферментации сингаза микроорганизмами при получении одной или нескольких карбоновых кислот и спирта.

Термин «сингаз» или «синтез-газ» означает синтез-газ; так называется газовая смесь, содержащая различные количества монооксида углерода и водорода. Примеры способов получения включают паровой риформинг природного газа или углеводородов для получения водорода, газификацию угля и некоторые типы газификации газообразных отходов с получением энергии. Это название происходит от их использования в качестве промежуточных продуктов при получении синтетического природного газа (SNG) и синтезе аммиака или метанола. Сингаз также применяют как промежуточный продукт в производстве синтетической нефти для использования в качестве топлива или смазки путем синтеза Фишера-Тропша и ранее метода Мобил для превращения метанола в керосин. Сингаз состоит в основном из водорода, монооксида углерода и очень часто некоторого количества диоксида углерода.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение предлагает: способ ферментации газообразного субстрата, включающий: подачу газообразного субстрата, содержащего водород (Н₂) либо водород и монооксид углерода (СО), в водную среду в биореакторе; причем указанная среда содержит один или несколько микроорганизмов; указанный способ включает повышение плотности клеток путем регулировании поглощения водорода; причем регулирование поглощения водорода включает определение скорости подачи водорода и регулирование скорости поглощения водорода и/или газообразного субстрата; причем регулирование поглощения водорода включает подачу газообразного субстрата таким образом, чтобы молярное соотношение указанного поглощения водорода и скорости подачи газообразного субстрата находилось в первом заданном интервале.

В вариантах настоящего изобретения: регулирование поглощения водорода включает подачу указанного газообразного субстрата таким образом, чтобы молярное соотношение указанного поглощения водорода и скорости подачи водорода находилось во втором заданном интервале; причем указанный первый заданный интервал включает интервал примерно 0.001-1.0.

В вариантах настоящего изобретения: указанный первый заданный интервал включает интервал 0.005-0.5; указанный второй заданный интервал включает интервал примерно 0.01-0.1; указанный второй заданный интервал включает интервал 0.001-1.0; указанный второй заданный интервал включает интервал 0.005-0.5; указанный второй заданный интервал включает интервал 0.01-1.

Один вариант настоящего изобретения включает подачу потока водной среды в биореактор и отвод потока ферментационного бульона из биореактора. В другом варианте изобретение включает подачу непрерывного потока водной среды в биореактор и отвод непрерывного потока ферментационного бульона из биореактора.

Варианты настоящего изобретения включают: повышение плотности клеток путем регулирования скорости изменения удельного поглощения СО; причем регулирование изменения удельного поглощения СО включает определение скорости подачи СО; определение скорости отвода СО; определение массы клеток; и регулирование скорости подачи СО; причем скорость изменения удельного поглощения СО включает заданные интервалы удельного поглощения СО; указанные заданные интервалы удельного поглощения СО включают интервал примерно 0.001-10.0 ммоль/мин/грамм сухих клеток; указанные заднные интервалы удельного поглощения СО включают интервал примерно 0.01-5.0 ммоль/мин/грамм сухих клеток; указанные заданные интервалыудельного поглощения СО включают интервал примерно 0.1-1.0 ммоль/мин/грамм сухих клеток.

Настоящее изобретение предлагает непрерывный способ получения смеси спиртов, включающий: подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода, в водную среду в биореакторе; указанная водная среда содержит один или несколько микроорганизмов; указанный способ включает определение общего поглощения водорода; подачу указанного газообразного субстрата с такой скоростью потока, чтобы молярное соотношение указанного общего поглощения водорода и подаваемого количества указанного газообразного субстрата находилось в заданном интервале примерно 0.001-1.0; также включает подачу непрерывного потока водной среды в биореактор; отвод непрерывного потока ферментационного бульона из биореактора.

Настоящее изобретение предлагает непрерывный способ получения смеси спиртов, включающий: подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода, в водную среду в биореакторе; указанная водная среда содержит один или несколько микроорганизмов; указанный способ включает определение общего поглощения водорода; подачу указанного газообразного субстрата с такой скоростью потока, чтобы молярное соотношение указанного общего поглощения водорода и подаваемого количества газообразного субстрата находилось в заданном интервале примерно 0.001-1.0; способ также включает определение плотности клеток; регулирование подачи газообразного субстрата для повышения плотности клеток; изменение удельного поглощения СО в заданных количествах в интервале примерно 0.001-10.0 ммоль/мин/грамм сухих клеток; способ также включает подачу непрерывного потока водной среды в биореактор; отвод непрерывного потока ферментационного бульона из биореактора.

Настоящее изобретение предлагает непрерывный способ получения смеси спиртов, включающий: подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода, в водную среду в биореакторе; указанная водная среда содержит один или несколько микроорганизмов; указанный способ включает определение общего поглощения водорода и подачу указанного газообразного субстрата, содержащего водород, с такой скоростью потока, чтобы молярное соотношение указанного общего поглощения водорода и подаваемого количества указанного водорода в указанном газовом субстрате поддерживалось в заданном интервале; способ включает также подачу потока водной среды в биореактор; отвод непрерывного потока ферментационного бульона из биореактора.

Настоящее изобретение предлагает непрерывный способ получения смеси спиртов, включающий: подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода, в водную среду в биореакторе; указанная водная среда содержит один или несколько микроорганизмов; определение массы клеток и удельного поглощения водорода и подачу указанного газообразного субстрата, содержащего водород, с такой скоростью потока, чтобы молярное соотношение указанного удельного поглощения водорода и подаваемого количества указанного газообразного субстрата на единицу массы клеток поддерживалось в заданном интервале; способ включает также подачу постоянного потока водной среды в биореактор; отвод постоянного непрерывного потока ферментационного бульона из биореактора.

Настоящее изобретение предлагает непрерывный способ получения смеси спиртов, включающий: подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода, в водную среду в биореакторе; указанная водная среда содержит один или несколько микроорганизмов; определение массы клеток и удельного поглощения водорода и подачу указанного газообразного субстрата, содержащего водород, с такой скоростью потока, чтобы молярное соотношение указанного удельного поглощения водорода и подаваемого количества указанного водорода в указанном газовом субстрате на единицу массы клеток поддерживалось в заданном интервале; способ включает также подачу постоянного потока водной среды в биореактор; отвод постоянного непрерывного потока ферментационного бульона из биореактора.

В вариантах настоящего изобретения: указанные микроорганизмы включают один или несколько видов биологически чистых анаэробных ацетогенных бактерий; причем указанные микроорганизмы включают один или несколько видов природных анаэробных ацетогенных бактерий; указанные микроорганизмы включают один или несколько видов не встречающихся в природе анаэробных ацетогенных бактерий; указанные микроорганизмы включают один или несколько видов не встречающихся в природе анаэробных ацетогенных бактерий, полученных генетическим модифицированием с использованием анаэробных ацетогенных бактерий в качестве организма хозяина; указанные микроорганизмы включают один или несколько видов не встречающихся в природе анаэробных ацетогенных бактерий, полученных введением генов анаэробных ацетогенных бактерий в организм хозяина; указанные микроорганизмы включают один или несколько видов бактерий, которые выбирают из Acetogenium kivui, Acetobacteiium woodii, Acetoanaerobium noterae, Butyribacterium methylotrophicum, Caldanaerobacter subterraneous, Caldanaerobacter subterraneous pacijicus, Carboxydothermus hydrogenofonnans, Clostridium aceticum, Clostridium acetobutylicum, Clostridium autoethanogenum (DSM 23693), Clostridium autoethanogenum (DSM 19630 of DSMZ Germany), Clostridium autoethanogenum (DSM 10061 of DSMZ Germany), Clostridium thermoaceticum, Eubqcterium limosum, Clostridium ljungdahlii PETC (ATCC 49587), Clostridium ljungdahlii ERI2 (ATCC 55380), Clostridium ljungdahlii C-01 (ATCC 55988), Clostridium ljungdahlii 0-52 (ATCC 55889), Clostridium ultunense, Clostridium ragsdali Pll (ATCC BAA-622), Alkalibaculum bacchi CPU (ATCC BAA-1772), Clostridium coskatii, Clostridium carboxidivorans P7 (ATCC PTA-7827), Geobacter sulfurreducens, Morrella thermacetica, Peptostreptococcus productus, Clostridium drakei, рекомбинантного микроорганизма (DSM 24138) и их смесей; причем указанный микроорганизм включает один или несколько штаммов Clostridium ljundahlii, или один или несколько штаммов Clostridium ragsdalei или один или несколько штаммов Clostridium carboxidivorans, или один или несколько штаммов Clostridium autoethanogenum; причем указанные микроорганизмы включают один или несколько генетически модифицированных микроорганизмов, полученных введением одного или нескольких выбранных генов в организм хозяина, который выбирают из любых штаммов Clostridium ljundahlii, или любых штаммов Clostridium ragsdalei, или любых штаммов Clostridium carboxidivorans, или любых штаммов Clostridium autoethanogenum, указанные микроорганизмы включают один или несколько микроорганизмов, полученных введением одного или нескольких выбранных генов в организм хозяина, выбранный из любых штаммов Clostridium ragsdalei или любых штаммов Clostridium carboxidivorans или любых штаммов Clostridium autoethanogenum.

В вариантах настоящего изобретения: указанный биореактор включает один или несколько реакторов; причем указанный биореактор включает установку для рецикла клеток.

В одном варианте данного изобретения указанный СО-содержащий субстрат включает водород.

В одном варианте данного изобретения способ включает подачу питательной среды в указанный биореактор.

На фиг.1 представлен способ получения химических соединений, таких как смесь спиртов, из содержащего монооксид углерод (СО) газообразного субстрата, такого как сингаз, путем ферментации с помощью микроорганизмов, причем способ включает биореактор (100), содержащий ферментационного бульон с указанными клетками микроорганизмов и ферментационную среду. Газовый поток газообразного субстрата, содержащего СО (101), можно подавать в биореактор вместе с потоком ферментационной среды (102). Поток ферментационного бульона (110) с указанными клетками микроорганизмов и указанными полученными химическими соединениями можно отводить из указанного биореактора. Поток отходящего газа из ферментера (120), включающий неиспользованную часть указанного газообразного потока субстрата, отводят из биореактора. В одном варианте поток ферментационного бульона (110) перетекает в аппаратуру для рецикла клеток (200), в котором клетки концентрируют и возвращают (220) в биореактор. Поток пермеата (210) из указанного аппарата для рецикла клеток направляют на стадию выделения указанных химических соединений (не показана на схеме). В одном варианте поток ферментационного бульона (110) направляют на стадию выделения указанной смеси спиртов (не показана на схеме).

В одном варианте биореактор (100) снабжен мешалкой (105) для облегчения контакта газообразного потока субстрата и усиления массопереноса газообразного субстрата с жидкой средой ферментации. Желательно установить хорошую скорость массопереноса и, таким образом, обеспечить перемешивание в биореакторе во время ферментации.

Есть несколько вариантов отбора образцов потока газа, содержащего газовый субстрат, введенного в биореактор (101), и отходящего газа из биореактора (120) (не показаны на фиг.1). Есть вариант отбора образцов ферментационного бульона в реакторе (не показан на фиг.1). Указанные газообразные и жидкие образцы отбирают через определенные интервалы и анализируют на поглощение или образование различных компонентов газа, образование различных продуктов и оптическую плотность ферментационного бульона

Полученные величины можно использовать для расчета удельного поглощения (SCU) монооксида углерода (СО) и плотности клеток в ферментационном бульоне в реакторе с помощью следующих уравнений:

$$\begin{array}{l}Поглощение\text{ CO}\text{, ммоль/мин}=\left(\text{ммоль/мин введенного CO}\right)-(\text{ммоль/мин}\\ отведенного\text{ CO})\left(\text{1}\right)\end{array}$$

$$Поглощение{\text{ H}}_{\text{2}}\text{, ммоль/мин}=\left({\text{подача H}}_{\text{2}}\text{ ммоль/мин}\right)-({\text{отвод H}}_{\text{2}}\text{ ммоль/}\text{мин})\left(\text{2}\right)$$

$$\begin{array}{l}Плотность\text{ клеток}\text{,}\text{}\text{ г/л}=\left(\text{оптическая плотность}\right)\left(\text{фактор разбавления}\right)\\ \left(константа\text{ массы клеток}\right)\left(\text{3}\right)\end{array}$$

$$Масса\text{ клеток}\text{, г}=\left(\text{плотность клеток}\right)\left(объем\text{ биореактора}\right)\left(\text{4}\right)$$

$$Удельное\text{ поглощение CO}\text{, ммоль/мин/г}=\left(\text{поглощение CO}\right)/\left(масса\text{ клеток}\right)\left(\text{5}\right)$$

$$Удельное{\text{ поглощение H}}_{\text{2}}\text{, ммоль/мин/г}=\left({\text{поглощение H}}_{\text{2}}\right)/\left(Масса\text{ клеток}\right)\left(\text{6}\right)$$

Плотность клеток - это масса клеток в единице объема бульона ферментера. Объем реактора - это объем жидкости в биореакторе при отсутствии перемешивания. Константа массы клеток - это масса (г) сухих клеток микроорганизмов в литре ферментационного бульона с оптической плотностью единица (1). Оптическая плотность (OD) - это мера количества света, поглощенного суспензией клеток микроорганизмов в колориметре или спектрофотометре. Эти величины можно использовать для определения мутности, которую в свою очередь можно использовать для определения массы или числа микроорганизмов в растворе или ферментационном бульоне. Оптическую плотность образца часто определяют после разбавления бульона в ферментере подходящим растворителем, таким как солевой раствор.

Микроорганизмы, применяемые в способе по настоящему изобретению, могут включать один или несколько видов биологически чистых анаэробных ацетогенных бактерий.

Микроорганизмы, применяемые в способе по настоящему изобретению, могут включать один или несколько видов природных анаэробных ацетогенных бактерий.

Микроорганизмы, применяемые в способе по настоящему изобретению, могут включать один или несколько видов не встречающихся в природе анаэробных ацетогенных бактерий.

Микроорганизмы, применяемые в способе по настоящему изобретению, могут включать один или несколько видов не встречающихся в природе анаэробных ацетогенных бактерий, полученных генетическим модифицированием с использованием анаэробных ацетогенных бактерий в качестве организма хозяина.

Микроорганизмы, применяемые в способе по настоящему изобретению, могут включать один или несколько видов не встречающихся в природе анаэробных ацетогенных бактерий, полученных введением генов анаэробных ацетогенных бактерий в организм хозяина.

Микроорганизмы, прменяемые в способе по настоящему изобретению, могут включать один или несколько видов бактерий, которые выбирают из Acetogenium kivui, Acetobactehum woodii, Acetoanaerobium noterae, Butyribacteiium methylotrophicum, Caldanaerobacter subterraneous, Caldanaerobacter subterraneous pacificus, Carboxydothermus hydrogenoformans, Clostridium aceticum, Clostridium acetobutylicum, Clostridium autoethanogenum (DSM 23693), Clostridium autoethanogenum (DSM 19630 of DSMZ Germany), Clostridium autoethanogenum (DSM 10061 of DSMZ Germany), Clostridium thermoaceticum, Eubacterium limosum, Clostridium ljungdahlii PETC (ATCC 49587), Clostridium ljungdahlii ERI2 (ATCC 55380), Clostridium ljungdahlii C-01 (ATCC 55988), Clostridium ljungdahlii 0-52 (ATCC 55889), Clostridium ultunense, Clostridium ragsdali P11 (ATCC BAA-622), Alkalibaculum bacchi CPU (ATCC BAA-1772), Clostridium coskatii, Clostridium carboxidivorans P7 (ATCC PTA-7827), Geobacter sulfurreducens, Morrella thermacetica, Peptostreptococcus productus, Clostridium drakei, рекомбинантного микроорганизма (DSM 24138) и их смесей.

В одном варианте микроорганизмы, применяемые в способе по настоящему изобретению, включают один или несколько штаммов Clostridium ljundahlii или один или несколько штаммов Clostridium ragsdalei или один или несколько штаммов Clostridium carboxidivorans или один или несколько штаммов Clostridium autoethanogenum.

В одном варианте микроорганизмы, применяемые в способе по настоящему изобретению, включают один или несколько генетически модифицированных микроорганизмов, полученных введением одного или нескольких выбранных генов в организм хозяина, выбранный из любых штаммов Clostridium ljundahlii или любых штаммов Clostridium ragsdalei или любых штаммов Clostridium carboxidivorans или любых штаммов Clostridium autoethanogenum.

В одном варианте микроорганизмы, применяемые в способе по настоящему изобретению, включают один или несколько генетически модифицированных микроорганизмов, полученных введением в организм любого хозяина одного или нескольких генов из любых штаммов Clostridium ljundahlii или любых штаммов Clostridium ragsdalei или любых штаммов Clostridium carboxidivorans или любых штаммов Clostridium autoethanogenum.

удельное поглощение водорода постепенно уменьшают до нужного значения удельного поглощения водорода.

В одном варианте настоящего изобретения способ включает определение общего поглощения водорода и подачу указанного газообразного субстрата, содержащего водород, с такой скоростью потока, чтобы молярное соотношение указанного общего поглощения водорода и подаваемого количества указанного газообразного субстрата, содержащего водород, поддерживать в заданном интервале.

В одном варианте указанный заданный интервал мольных соотношений указанного общего поглощения водорода и подаваемого количества указанного газообразного субстрата, содержащего водород, включает интервал от примерно 0.1% до примерно 1.0%.

В одном варианте способ также включает подачу потока ферментационной среды.

В одном варианте способ также включает рецикл клеток и отвод пермеата в регулируемом интервале величин.

В одном варианте указанный газовый субстрат, содержащий водород, содержит также СО. В одном варианте способ также включает определение плотности клеток и удельного поглощения СО и повышение плотности клеток путем регулирования подачи газообразного субстрата; причем удельное поглощение СО увеличивают или уменьшают с помощью шагов заданного размера.

В одном варианте также предлагается дополнительный способ определения плотности клеток и удельного поглощения СО, и, если плотность клеток меньше заданной величины, то выбор заданного удельного поглощения СО и регулирование газообразного потока, содержащего газовый субстрат, проводят так, чтобы удельное поглощение СО было равно заданному удельному поглощению СО.

В одном варианте указанный дополнительный способ повторяют до достижения желательной плотности клеток или желательного удельного поглощения СО или достижения желательной концентрации этанола в ферментационном бульоне.

В одном варианте способ по настоящему изобретению включает определение общего поглощения водорода и подачу указанного газообразного субстрата, содержащего водород, с такой скоростью потока, чтобы молярное соотношение указанного общего поглощения водорода и подаваемого количества указанного водорода в указанном газовом субстрате, содержащем водород, поддерживалось в заданном интервале.

Один вариант способа по настоящему изобретению включает определение массы клеток микроорганизмов и удельного поглощения водорода и подачу указанного газообразного субстрата, содержащего водород, с такой скоростью потока, чтобы молярное соотношение указанного удельного поглощения водорода и подаваемого количества указанного газообразного субстрата, содержащего водород, на единицу массы клеток микроорганизмов поддерживалось в заданном интервале.

Один вариант способа по настоящему изобретению включает определение массы клеток микроорганизмов и удельного поглощения водорода и подачу указанного газообразного субстрата, содержащего водород, с такой скоростью потока, чтобы молярное соотношение указанного удельного поглощения водорода и подаваемого количества указанного водорода в указанном газовом субстрате, содержащем водород, на единицу массы клеток микроорганизмов поддерживалось в заданном интервале.

Указанный заданный интервал значений мольного соотношения указанного общего поглощения водорода и подаваемого количества указанного водорода в указанном газовом субстрате, содержащем водород, составляет примерно 0.1%-1.0%.

Указанный заданный интервал значений мольного соотношения указанного удельного поглощения водорода и подаваемого количества водорода в указанном газовом субстрате, содержащем водород, на единицу массы клеток микроорганизмов составляет примерно 0.1%-1.0%.

Указанный заданный интервал значений мольного соотношения указанного удельного поглощения водорода и подаваемого количества указанного газообразного субстрата, содержащего водород, на единицу массы клеток микроорганизмов составляет примерно 0.1%-1.0%.

Величина заданного удельного поглощения СО может составлять примерно 0.1-10.0 ммоль СО в минуту на грамм сухого микроорганизма. Величина указанного желательного удельного поглощения СО может составлять примерно 0.1-10.0 ммоль/мин/г.

Величина заданной плотности клеток может составлять примерно 0.1-50 г/л. Величина заданной плотности клеток может составлять примерно 0.5-50 г/л.

Величина заданной производительности по этанолу составляет 1-50 г/л/сутки.

Величина заданной концентрации этанола в ферментационном бульоне составляет 1-20 г/л.

Величина указанной желательной концентрации этанола в ферментационном бульоне составляет 1-20 г/л.

Обычно в лабораторном биореакторе типа New Brunswick Bioflow I скорость вращения мешалки в интервале 300-900 оборотов в минуту (об/мин) обеспечивает адекватное перемешивание для регулирования нужной скорости массопереноса. В другом варианте применяют скорость вращения мешалки в интервале 500-700 об/мин. В одном варианте применяют скорость вращения мешалки в интервале 550-650 об/мин. В другом варианте применяют скорость вращения мешалки примерно 600 об/мин.

В другом варианте для реактора большего масштаба с объемом примерно 100-500 л скорость вращения мешалки составляет примерно 50-500 об/мин. В одном варианте для промышленного биореактора объемом примерно 100000-1000000 л скорость вращения мешалки составляет примерно 1-50 об/мин. В различных вариантах больший биореактор требует меньшей интенсивности перемешивания по сравнению с меньшим реактором.

В одном варианте настоящее изобретение предлагает регулирование температуры в биореакторе в интервале 25-50°C.

В одном варианте способа по настоящему изобретению указанный биореактор включает один реактор. В другом варианте способа по настоящему изобретению указанный биореактор включает два или более реакторов.

В одном варианте способа по настоящему изобретению указанный биореактор включает установку для рецикла клеток.

В одном варианте соотношение поглощения водорода и скорости подачи газообразного субстрата регулируют для достижения оптимального культивирования. В других вариантах композиция СО и Н₂ содержит 38% и 25% соответственно, в газовой подаче заданное молярное соотношение поглощения H₂ и общего поглощения газовых молекул составляет 11 к 14 (например, первый заданный интервал); причем композиция СО и H₂ включает 30% и 15% соответственно, при подаче газа с заданным мольным соотношением поглощение H₂ и общего поглощения газовых молекул составляет 3 к 4.5 (например, второй заданный интервал).

В одном варианте способа по настоящему изобретению указанный поток содержащего СО газообразного субстрата включает также водород. В одном варианте указанный поток содержащего СО газообразного субстрата представляет собой сингаз. В одном варианте указанный поток содержащего СО газообразного субстрата представляет собой отходящий газ сталелитейного производства. В другом варианте указанный поток содержащего СО газообразного субстрата представляет собой сингаз, полученный газификацией углеродных материалов, в том числе биомассы.

В одном варианте один или несколько ферментеров для культивирования или посева бактерий включают исходный посевной материал клеток микроорганизмов. В другом варианте один или несколько ферментеров для культивирования или посева продолжают поставлять клетки микроорганизмов в биореактор согласно способу по данному изобретению. В одном варианте по настоящему изобретению способ включает рецикл клеток.

Питательная среда включает среду для культивирования микроорганизмов, которая может содержать один или несколько витаминов и минеральных веществ, способствующих культивированию выбранных микроорганизмов. В таблице 1 предложен вариант питательной среды по настоящему изобретению. Специалистам известна и другая питательная среда, пригодная для данного изобретения. Кроме того, в настоящем изобретении можно применять питательную среду, которая здесь не описана, но приготовлена из различных компонентов, указанных в таблице 1. Настоящее изобретение предлагает улучшенные композиции питательной среды.

Таблица 1. Компоненты среды и их концентрации Компонент/ион Добавлено в виде Конц-ия в м.д. NH₄ ⁺ NH₄Cl/(NH₄)₂HPO₄ ≤838 Fe FeCl₂·4H₂O ≤17 Ni NiCl₂·6H₂O ≤0.2 Со СОС1₂·6H2O ≤1.0 Se Na₂SeO₃ ≤0.1 Zn ZnSO₄·7H₂O ≤0.5 Mo Na₂MoO₄·2H₂O ≤0.3 Mn MnCl₂·4H₂O ≤0.2 В Н₃ВО₃ ≤1.1 Cu CuCl₂·2H₂O ≤0.15 W Na₂WO₄·2H₂O ≤1.2 К KCl ≤79 Mg MgCl₂·6H₂O ≤60 Na NaCl ≤80* Са CaCl₂·H₂O ≤55 Цистеин-HCl Цистеин-HCl ≤250 РО₄ H₃PO₄/(NH₄)2HPO₄ ≤820 Пантотеновая кислота Пантотеновая кислота ≤0.04 Биотин Биотин ≤0.02 Тиамин Ттиамин ≤0.05 * Концентрация Na⁺только из NaCl. Она не включает Na из других компонентов типа Na₂WO₄·2H₂O. ** Концентрация Са⁺² не включает ионы кальция из соли кальция пантотеновой кислоты, (например, d-пантотенат кальция).

ПРИМЕРЫ

Сравнительный пример (см. пример 11 из патента США 7285402)

Для приготовления маточной культуры для посева в реактор выращивали культуры Clostridium ljungdahlii, штамм С-01 (АТСС Accession No. 55988) в 150 мл бутылках с сывороткой на СО, CO₂ и Н₂ в среде, содержащей 1 г/л дрожжевого экстракта и 1 г/л триптиказы в растворе солей и витаминов. Концентрация витамина составляла 0.4 мл/л среды из водного раствора, содержащего 50.5 мг/л пантотената кальция, 20.6 мг/л d-биотина и 50.6 мг/л тиамина HCl. Бутылки инкубировали при 37°C во встряхиваемом инкубаторе. Культуры выращивали до визуально наблюдаемой фазы экспоненциального роста. При каждой инокуляции переносили примерно 90 мл маточной культуры из бутылок с сывороткой в 1 л среды, что составляло 9% объема инокуляции. Работоспособная инокуляция описана ниже. Для получения работоспособной инокуляции всю описанную процедуру повторяли несколько раз.

Получив посевную культуру, 90 мл/л культуры добавили в 1 л порцию основной среды, содержащей 0.4 мл/л витаминов и солей (момент времени t=0). Скорость перемешивания составила 240 об/мин и рН 5.3, температура 38.5°C и время пребывания газа в реакторе (непрерывный поток газа) 110 минут. Газовое сырье содержало 62% Н₂, 31% СО и 7% С₂Н₆. Через 13 час (момент времени t=13 час) отметили некоторую конверсию СО и при t=23 час скорость перемешивания повысили от 240 об./мин. до 300 об./мин. Время пребывания газа уменьшили до 100 мин при t=27 час, и при t=46 час время пребывания газа уменьшили еще раз. Скорость перемешивания также повышали на 100 об/мин при t=28 час, 59 час, 72 час и 85 час.

В момент времени t=110 час система работала с временем пребывания газа 80 минут и скоростью перемешивания 600 об/мин. Концентрация клеток составила 0.5 г/л и конверсия СО была равна 35%. Превращения H₂ не наблюдалось, но некоторые количества этанола и ацетата (примерно 1 г/л каждого) накапливались в данной порции культурного бульона. До этого момента времени наблюдалось повышение количества клеток в реакторе.

Поток среды с такой же концентрацией, как и в основной среде, был подан при скорости 0.4 мл/мин в момент времени t=120 час. Затем была запущена программа номинального повышения скорости газа, скорости перемешивания и скорости подачи среды при тщательном сохранении в системе избытка H₂. В момент времени t=210 час концентрация этанола составила 17 г/л, концентрация ацетата 1 г/л, концентрация клеток 1.6 г/л, конверсия СО почти 100% и конверсия H₂ 90%. Производительность по этанолу достигла 11.4 г/л-сутки.

Снова запустили программу постепенного повышения скорости подачи газа. Одновременно повышали количество витамина и достигли скорости подачи витамина 0.7 мл/л среды. При t=610 час реактор производит 20 г/л этанола и примерно 2 г/л ацетата. Конверсия СО составила почти 100%, а конверсия H₂ 85%. Производительность по этанолу составила 14 г/л-сутки.

Среда ферментации в примерах 1-7 содержала один или несколько компонентов из тех, которые приведены в таблице 1.

Пример 1: Clostridium ljungdahlii PETC: повышение плотности бактерий в реакторе путем поддержания поглощения водорода на уровне 4.5% от всего газа, подаваемого в реактор

Реактор New Brunswick bioflow I с ферментационной средой запустили при скорости активного роста штамма Clostridium ljungdahlii PETC, равной 0.34 г/л. Скорость перемешивания в реакторе в начале эксперимента установили равной 500 об/мин. Такую скорость перемешивания поддерживали в течение всего опыта. Температуру в биореакторе в ходе опыта поддерживали на уровне примерно 38-39°C. Образцы подаваемого в биореактор сингаза и отходящего газа из биореактора и ферментационного бульона биореактора отбирали через определенные интервалы времени (например, через 1 интервал) и анализировали на поглощение или образование различных компонентов газа, концентрацию ацетата в бульоне, концентрацию этанола в бульоне и оптическую плотность культуры.

Молярное отношение общего поглощения Н₂ и подачи сингаза установили равным 4.5%. Необходимый поток сингаза, соответствующий указанному мольному соотношению (4.5%), рассчитали с помощью уравнений (1)-(6). Сингаз подавали в биореактор с заданной скоростью.

В этом примере для повышения стабильности культуры максимальное повышение потока газа в любой момент времени ограничили 30% от потока газа в данный момент. Также поток газа не повышали, если культура не поглощала 70% СО, подаваемого в реактор в любой данной точке.

Система рецикла клеток (CRS) была присоединена к реактору через 21 час после инокуляции.

После присоединения системы рецикла клеток установили поток среды (питательных веществ) в реактор со скоростью 1.1 мл/мин и отбирали из реактора через систему рецикла клеток 1 мл/мин пермеата.

Указанное модифицирование реактора провели для предотвращения накопления ингибирующих количеств уксусной кислоты и этанола в культуре и также для подачи к культуре адекватных количеств питательных веществ. Масса клеток увеличивалась во времени и через 46 час после инокуляции в реактор достигла 3.2 г/л. В этот момент культура производила 6.9 г/л этанола и 4.86 г/л уксусной кислоты.

В данном конкретном опыте рН культуры поддерживали между 4.78 и 5.00 в течение всего опыта.

После начала активного роста бактерий в реакторе (когда плотность клеток в реакторе достигла величины, примерно на 50% превышающей начальную плотность клеток), в культуру добавили композицию витаминов (кроме витаминов, уже находящихся в среде), если концентрация уксусной кислоты в культуральном бульоне была ниже заданной величины. Критерий для добавления в культуру коктейля из витаминов был следующим: если содержание уксусной кислоты в культуральном бульоне было меньше примерно 2.5 г/л, добавляли примерно 0.34 мл витаминов на литр культуры, если содержание уксусной кислоты в культуральном бульоне было меньше примерно 2 г/л, добавляли примерно 0.67 мл витаминов на литр культуры, если содержание уксусной кислоты в культуральном бульоне было меньше примерно 1.5 г/л, добавляли примерно 1 мл витаминов на литр. Использованная в этих опытах композиция витаминов включала:

Биотин 0.08-1 мкМ Тиамин HCl 0.12-1.5 мкМ Кальций d-пантотенат 0.15-2 мкМ

Наряду с биотином, тиамином и пантотенатом кальция к образцу РЕТС добавили витамины АТСС (catalog No. MD-VS) до конечной концентрации 1% (от среды ферментации).

Пример 2: Clostridium ljungdahlii C-QA: повышение плотности микроорганизмов в реакторе путем поддержания поглощения водорода на уровне примерно 3% от всего газа, подаваемого в реактор

Биореактор New Brunswick Bioflow I с примерно 1.5 л (например, в интервале 1.45-1.6 л) ферментационной среды был запущен с примерно 0.38 г/л активно растущего штамма Clostridium ljungdahlii C-01. Скорость перемешивания в реакторе перед началом опыта установили равной 600 об/мин. Такую скорость перемешивания поддерживали в ходе всего опыта. Температуру в биореакторе во время опыта поддерживали на уровне примерно 36-37.5°C. Образцы подаваемого в биореактор сингаза и отходящего газа из биореактора и ферментационного бульона биореактора отбирали через определенные промежутки времени (например, через 1 час) и анализировали на поглощение или образование различных компонентов газа, концентрацию уксусной кислоты в бульоне, концентрацию этанола в бульоне и оптическую плотность культуры.

Молярное соотношение общего поглощения H₂ и подачи сингаза установили равным примерно 3%. Необходимый поток сингаза, соответствующий указанному мольному соотношению (3%), рассчитали по уравнениям (1)-(6). В биореактор подавали сингаз с рассчитанной скоростью. Через примерно 12 часов после инокуляции в реактор запустили поток ферментационной среды со скоростью 0.1 мл/мин (примерное время пребывания клеток 250 часов). Примерно через 32 часа после инокуляции скорость потока ферментационной среды повысили до 0.3 мл/мин (примерное время пребывания клеток 75 часов). Примерно через 47 часов после инокуляции, когда концентрация этанола в ферментационном бульоне в реакторе достигла 9.4 г/л, к реактору присоединили систему рецикла клеток («срк» или «СРК»). После присоединения СРК к реактору поток ферментационной среды повысили от 0.3 до 0.8 и отводили поток 0.5 мл/мин не содержащего клеток пермеата из реактора через СРК. При таком количестве пермеата экстракцию культуры поддерживали на уровне 12 г/течение 56 часов после инокуляции.

Плотность клеток повышали во времени, и через примерно 56 часов после инокуляции в биореактор она достигла 2.8 г/л клеток.

Пример 3: Clostridium ljungdahlii C-01: повышение плотности микроорганизмов в реакторе путем поддержания поглощения водорода на уровне 4.5% от всего газа, подаваемого в реактор

Биореактор New Brunswick Bioflow I с примерно 1.5 л (например, в интервале 1.5-1.675 л) ферментационной среды был запущен с примерно 0.37 г/л активно растущего штамма Clostridium ljungdahlii C-01. Скорость перемешивания в реакторе перед началом опыта установили равной 600 об/мин. Такую скорость перемешивания поддерживали во время всего опыта. Температуру в биореакторе во время опыта поддерживали на уровне примерно 36-37.5°C. Образцы подаваемого в биореактор сингаза и отходящего газа из биореактора и ферментационного бульона биореактора отбирали через определенные промежутки времени (например, через 1 час) и анализировали на поглощение или образование различных компонентов газа, концентрацию уксусной кислоты в бульоне, концентрацию этанола в бульоне и оптическую плотность культуры.

Молярное соотношение общего поглощения H₂ и подачи сингаза установили равным примерно 4.5%. Необходимый поток сингаза, соответствующий указанному мольному соотношению (4.5%), рассчитали по уравнениям (1)-(6). В биореактор подавали сингаз с заданной скоростью. Через примерно 13 часов после инокуляции в реактор подали поток ферментационной среды со скоростью 0.1 мл/мин (примерное время пребывания клеток 250 часов). Примерно через 47.5 часа после инокуляции скорость потока ферментационной среды повысили до 0.23 мл/мин (примерное время пребывания клеток 116 часов). Примерно через 71.42 часов после инокуляции поток среды в реактор повысили до 0.315 мл/мин (примерное время пребывания клеток 85 часов). В этом примере систему рецикла клеток не присоединяли к реактору.

Плотность клеток увеличивалась во времени, и через примерно 99 часов после инокуляции в биореактор она достигла 2.75 г/л клеток. В этот момент культура производила 1.6 г/л/сутки этанола.

Пример 4: Clostridium autoethanogenum

Биореактор New Brunswick Bioflow I с ферментационной средой был запущен с 0.46 г/л активно растущего штамма Clostridium ljungdahlii C-01. Скорость перемешивания в реакторе перед началом опыта установили равной 600 об/мин. Такую скорость перемешивания поддерживали во время всего опыта. Температуру в биореакторе во время опыта поддерживали на уровне примерно 36-37.5°C. Образцы подаваемого в биореактор сингаза и отходящего газа из биореактора и ферментационного бульона биореактора отбирали через определенные промежутки времени (например, через 1 час) и анализировали на поглощение или образование различных компонентов газа, концентрацию уксусной кислоты в бульоне, концентрацию этанола в бульоне и оптическую плотность культуры.

Молярное соотношение общего поглощения Н₂ и подачи сингаза установили равным примерно 4.5%. Необходимый поток сингаза, соответствующий указанному мольному соотношению (4.5%), рассчитали по уравнениям (1)-(6). В биореактор подавали сингаз с заданной скоростью. В этом примере для повышения стабильности культуры ток газа не повышали, если культура не поглощала 80% СО, подаваемого в реактор в любой данной точке.

Через примерно 8.37 часов после инокуляции в реактор подали поток среды со скоростью 0.1 мл/мин (примерное время пребывания клеток 233 часов). Через 20.40 час после инокуляции поток среды в реактор повысили до 0.21 мл/мин (примерное время пребывания клеток 109 часов). Через 42.15 часов после инокуляции поток среды в реактор повысили до 0.32 мл/мин (примерное время пребывания клеток 75.5 часа).

Через 43.75 часа после инокуляции, когда концентрация этанола в бульоне достигла 12.5 г/л, к реактору присоединили систему рецикла клеток (СРК). После присоединения СРК к реактору поток среды повысили до 0.6 мл/мин и отводили поток 0.3 мл/мин пермеата из реактора через СРК (примерное время пребывания клеток 80.5 часа). При таком количестве отводимого пермеата культуру поддерживали на уровне ниже 19 г/л этанола течение 57 часов после инокуляции. Такое модифицирование системы (введение СКР) было проведено для быстрого удаления этанола из реактора.

Как показано на фиг.1, плотность клеток повышалась во времени и через примерно 58 часов после инокуляции в биореактор масса клеток достигла величины 3.7 г/л. В этот момент времени культура производила более 18.4 г/л этанола.

Пример 5: Clostridium ljungdahlii C-01

Биореактор New Brunswick Bioflow I с ферментационной средой примерно 1.5 (например, от 1.45 до 1.65 л) был запущен с 0.3 г/л активно растущего штамма Clostridium ljungdahlii C-01. Скорость перемешивания в реакторе перед началом опыта установили равной 600 об/мин. Такую скорость перемешивания поддерживали во время всего опыта. Температуру в биореакторе в ходе опыта поддерживали на уровне примерно 36-37.5°C. Образцы подаваемого в биореактор сингаза, отходящего газа из биореактора и ферментационного бульона биореактора, отбирали через определенные промежутки времени (например, через 1-4 час) и анализировали. Проводили анализ образца на поглощение различных компонентов газа, образование различных компонентов газа, концентрацию уксусной кислоты в бульоне, концентрацию этанола и оптическую плотность культуры в ферментационном бульоне.

Удельное поглощение СО (SCU) определили с помощью приведенных выше уравнений (1)-(6).

Вначале величину подачи сингаза рассчитали с помощью приведенных уравнений для величины SCU примерно 1.4 ммоль/мин/г и поток сингаза поддерживали на этом рассчитанном уровне до тех пор, пока плотность клеток не возросла и достигла примерно 1.5 г/л.

Когда плотность клеток в реакторе достигла примерно 1.5 г/л регулируемое значение SCU уменьшили до примерно 1.2 ммоль/мин/г. Затем, когда масса клеток в реакторе достигла примерно 2.5 г/л, регулируемое значение SCU уменьшили до примерно 1.0 ммоль/мин/г. Масса клеток увеличивалась во времени и через примерно 79 часов после инокуляции в биореактор достигла ожидаемой величины 2.8 г/л. В этот момент времени культура производила более примерно 20 г/л этанола.

Через 13.97 часа после инокуляции подали поток среды в реактор при скорости 0.2 мл/мин (примерное время пребывания клеток 125 часов). Через 28.08 часов после инокуляции поток среды в реактор увеличили до примерно 0.5 мл/мин (примерное время пребывания клеток 52 часа). Во время опыта значение рН поддерживали равным примерно 4.5.

Постепенное понижение регулируемого значения SCU путем процедуры запуска имеет целью облегчить постепенное превращение культуры до низкого значения SCU (примерно 0.7-0.9 ммоль/мин/г), которое поддерживают во время работы (стационарное состояние) реактора.

Указанный способ требует менее примерно 80 часов для достижения поставленной задачи по достижению уровня массы клеток (примерно 2.8 г/л) в реакторе.

Пример 6: Clostridium autoethanogenum

Биореактор New Brunswick Bioflow 1 с ферментационной средой примерно 1.5 (например, от 1.45 до 1.65 л) был запущен с 0.47 г/л активно растущих Clostridium autoethanogenum. Скорость перемешивания в реакторе перед началом опыта установили равной 600 об/мин. Такую скорость перемешивания поддерживали в ходе всего опыта. Температуру в биореакторе во время опыта поддерживали на уровне примерно 36-37.5°C. Образцы подаваемого в биореактор сингаза, отходящего газа из биореактора и ферментационного бульона биореактора, отбирали и анализировали через определенные промежутки времени (например, через 1-4 час). Проводили анализ образца на поглощение различных компонентов газа, образование различных компонентов газа, концентрацию уксусной кислоты в бульоне, концентрацию этанола и оптическую плотность культуры в ферментационном бульоне.

Удельное поглощение СО (SCU) определяли с помощью приведенных выше уравнений (1)-(6).

Вначале скорость подачи сингаза рассчитали с помощью приведенных уравнений для величины SCU примерно 0.4 ммоль/мин/г, и поток сингаза поддерживали на этом рассчитанном уровне до тех пор, пока плотность клеток не возросла. Поток газа, соответствующий заданному значению SCU примерно 0.4 ммоль/мин/г, поддерживали в течение примерно 19 часов. В моменты времени 19 и 21 час после инокуляции заданное значение SCU составляло примерно 0.5 ммоль/мин/г. Примерно через 21 час после инокуляции заданное значение SCU установили примерно 0.6. Плотность клеток повышалась во времени и достигла величины примерно 3 г/л через примерно 79 часов после инокуляции. В этот момент времени культура производила более примерно 15 г/л этанола. Через примерно 26 часов после инокуляции подали поток среды со скоростью примерно 0.1 мл/мин (примерное время пребывания клеток 240 часов). Через примерно 50 часов после инокуляции поток среды в реактор повысили до примерно 0.2 мл/мин (примерное время пребывания клеток 119 часов). Через примерно 71 час после инокуляции поток среды в реактор повысили до примерно 0.5 мл/мин (примерное время пребывания клеток 50 часов). Во время всего опыта рН поддерживали на уровне примерно 4.5.

Пример 7: Butyribacterium Methylotrophicum (ATCC 33266): повышение плотности бактерий в реакторе путем поддержания поглощения водорода на уровне 4.5% от общего тока газа, подаваемого в реактор

В этом опыте способ запуска поглощения Н₂ протестировали на примере хорошо изученного неклостридиального ацетогена.

Этот опыт провели в реакторе New Brunswick bioflow I, содержащем 0.78 г/л активно растущих Butylibacteiium Methylotrophicum в описанной выше ферментационной среде. Скорость перемешивания в реакторе перед началом эксперимента установили равной 700 об/мин. Такую скорость перемешивания поддерживали в ходе всего опыта. Температуру в биореакторе во время опыта поддерживали на уровне примерно 38-38.6°C. Образцы подаваемого в биореактор сингаза, отходящего газа из биореактора и ферментационного бульона биореактора, отбирали через определенные промежутки времени (например, через 1-4 час) и анализировали на поглощение или образование различных компонентов газа, газа, концентрацию уксусной кислоты в бульоне, концентрацию этанола кислоты в бульоне и оптическую плотность культуры.

Заданное молярное соотношение общего поглощения H₂ и подачи сингаза установили равным 4.5%. Необходимый поток сингаза, соответствующий указанному мольному соотношению (4.5%), рассчитали с помощью уравнений (1)-(6). Сингаз подавали в биореактор с рассчитанной скоростью.

В этом примере для повышения стабильности культуры максимальное повышение потока газа в любой момент времени ограничили 30% от текущего значения потока газа. Также поток газа не повышали, если культура не поглощала 80% СО, подаваемого в реактор в любой данной точке.

Поток культивационной среды (питательной среды) в реактор подали со скоростью 1 мл/мин через систему рецикла клеток (СРК), присоединенной к реактору, при отводе 1 мл/мин пермеата из реактора.

Плотность клеток в реакторе повышалась во времени, и через примерно 34 часов после инокуляции в биореактор масса клеток достигла 5.12 г/л. В этот момент времени культура производила 10.81 г/л/сутки этанола и 3.96 г/л уксусной кислоты. В этом опыте рН культуры поддерживали на уровне между 4.67 и 5.00 в ходе всего опыта.

Специалисты в данной области могут осуществить многие модификации и вариации настоящего изобретения, не отклоняясь от объема настоящего изобретения, включая конкретные варианты, примеры, формулу, заявку и т.д. Все опубликованные документы включены здесь ссылками.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ получения одного или нескольких спиртов из газообразного субстрата. Способ включает ферментацию газообразного субстрата, содержащего один или более из водорода (Н₂) и монооксида углерода (СО), в водной среде в биореакторе, повышение плотности клеток путем регулирования поглощения водорода. Причем регулирование поглощения водорода включает определение скорости подачи водорода, скорости отвода водорода и регулирование скорости подачи одного или более из газообразного субстрата и водорода. Регулирование поглощения водорода включает подачу указанного газообразного субстрата таким образом, чтобы молярное соотношение указанного поглощения водорода и скорости подачи газообразного субстрата находилось в первом заданном интервале от 0.001 до 1.0 и во втором заданном интервале от 0.001 до 1.0. Изобретение обеспечивает ускоренное повышение плотности клеток при микробиологической ферментации газообразного субстрата. 14 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 7 пр.

1. Способ получения одного или нескольких спиртов из газообразного субстрата, включающий:
ферментацию газообразного субстрата, содержащего один или более из водорода (Н₂) и монооксида углерода (СО), в водной среде в биореакторе;
повышение плотности клеток путем регулирования поглощения водорода, причем регулирование поглощения водорода включает определение скорости подачи водорода, скорости отвода водорода и регулирование скорости подачи одного или более из газообразного субстрата и водорода, причем регулирование поглощения водорода включает подачу указанного газообразного субстрата таким образом, чтобы молярное соотношение указанного поглощения водорода и скорости подачи газообразного субстрата находилось в первом заданном интервале от 0.001 до 1.0 и во втором заданном интервале от 0.001 до 1.0.

2. Способ по п. 1, в котором указанный первый заданный интервал включает интервал от 0.005 до 0.5.

3. Способ по п. 1, в котором указанный второй заданный интервал включает интервал от 0.01 до 0.1.

4. Способ по п. 1, в котором указанный второй заданный интервал включает интервал от 0.005 до 0.5.

5. Способ по п. 1, в котором указанный второй заданный интервал включает интервал от 0.01 до 0.1.

6. Способ по п. 1, который включает также подачу потока водной среды в биореактор и отвод потока ферментационного бульона из биореактора.

7. Способ по п. 1, который включает также подачу непрерывного потока водной среды в биореактор и отвод непрерывного потока ферментационного бульона из биореактора.

8. Способ по п. 1, включающий также повышение плотности клеток путем регулирования скорости изменения удельного поглощения СО, причем регулирование скорости изменения удельного поглощения СО включает определение скорости подачи СО; определение скорости отвода СО; определение массы клеток и регулирование скорости подачи СО, причем скорость изменения удельного поглощения СО находится в интервале 0.001-10.0 ммоль/мин/грамм сухих клеток.

9. Способ по п. 8, в котором указанные заданные интервалы удельного поглощения СО включают интервал 0.01-5.0 ммоль/мин/грамм сухих клеток.

10. Способ по п. 8, в котором указанные заданные интервалы удельного поглощения СО включают интервал 0.1-1.0 ммоль/мин/грамм сухих клеток.

11. Способ по п. 1, в котором указанная водная среда включает один или несколько микроорганизмов, включающих биологически чистые микроорганизмы; природные микроорганизмы; не встречающиеся в природе микроорганизмы; не встречающиеся в природе генетически модифицированные микроорганизмы; мутанты природных микроорганизмов; мутанты не встречающихся в природе микроорганизмов; рекомбинантые микроорганизмы; микроорганизмы, полученные методом генной инженерии; искусственно синтезированные микроорганизмы.

12. Способ по п. 1, в котором указанный биореактор включает один или несколько реакторов.

13. Способ по п. 1, в котором указанный биореактор включает установку для рецикла клеток.

14. Способ по п. 1, в котором указанный СО-содержащий субстрат включает водород.

15. Способ по п. 1, включающий также подачу питательной среды в указанный биореактор.