Область, к которой относится изобретение
Изобретение относится к способу продуцирования этанола и/или ацетата из субстратов монооксида углерода и/или диоксида углерода и водорода посредством анаэробной ферментации с использованием карбоксидотрофных микроорганизмов. Более конкретно изобретение относится к использованию специфических источников неорганической сферы для обеспечения потребности микроорганизмов в биологическом соединении серы с применением способа, который является экономически более эффективным и предпочтительным для такого продуцирования этанола и ацетата.
Предшествующий уровень техники
Производство биотоплива для его использования в качестве жидкого моторного топлива или для смешивания со стандартным бензином или с дизельным моторным топливом находит все большее применение во всем мире. Таким биотопливом является, например, этанол и н-бутанол. Одним из главных стимулов для производства биотоплива является то, что оно может быть получено из возобновляемых ресурсов методами ферментации и биотехнологии. Обычно биотопливо получают из легко поддающихся ферментации углеводов, таких как сахара и крахмалы. Поскольку такие сырьевые источники конкурируют с источниками получения пищевых продуктов для человека, то в последнее время, основное внимание ученых было направлено на альтернативные источники для получения биотоплива и других химических соединений.
Одним из альтернативных источников питания микроорганизмов является лигноцеллюлозные сырьевые продукты, такие как остатки при рубке леса, деревья лесных насаждений, солома, трава и другие отходы сельскохозяйственного производства. Однако в высокой степени гетерогенная природа лигноцеллюлозных материалов, которые служат в качестве механического каркаса структуры растений и деревьев, делает их, по существу, не поддающимися биоконверсии. Кроме того, эти материалы содержат преимущественно отдельные компоненты трех классов, которые служат в качестве структурных элементов, такие как целлюлоза (сахарные С6-полимеры), гемицеллюлоза (различные сахарные C5- и C6-полимеры) и лигнин (ароматические гетерополимеры и гетерополимеры, связанные эфирными связями). Затем, с применением других хорошо известных методов такая лигноцеллюлозная сырьевая биомасса может быть впоследствии превращена в синтез-газ (также известный как синтетический газ, состоящий, главным образом, из смеси CO, H2 и CО2 с другими компонентами, такими как CH4, N2, NH3, H2S, и другими газами в следовых количествах). Впоследствии такой синтез-газ подвергают ферментации с использованием анаэробных микроорганизмов, в результате чего получают биотопливо, такое как этанол, н-бутанол или другие химические соединения, такие как уксусная кислота, масляная кислота и т.п. В патенте США 7285402, описание которого вводится в настоящее описание посредством ссылки, описаны методы превращения монооксида углерода, диоксида углерода и водорода в уксусную кислоту и этанол путем ферментации с использованием анаэробных бактерий.
Для анаэробной ферментации, осуществляемой в целях получения биотоплива и других химических соединений, могут быть использованы любые газообразные субстраты, которые продуцируют монооксид углерода, диоксид углерода и водород из различных источников. Так, например, в публикации заявки на патент США 2011/0300593 описаны источники, такие как отходящий газ, образующийся из отходов сталеплавильного производства, а именно источник монооксида углерода, и содержание этой публикации вводится в настоящее описание посредством ссылки. Могут быть также использованы и многие другие источники субстратов. Так, например, синтез-газ может быть получен из множества других углеродных источников, таких как природный газ; газ, полученный путем перегонки; торфяной газ; газ, полученный из нефтяного кокса, угля, твердых отходов и органических отходов.
Этанол может быть продуцирован из CO, CО2 и H2 с использованием различных анаэробных бактерий, в частности бактерий, принадлежащих к роду Clostridium. Так, например, в литературе описаны различные штаммы бактерий, которые продуцируют этанол из газов, и такими бактериями являются Clostridium ljungdahlii, Clostridium autoethanogenum и Clostridium coskatii, которые также описаны в настоящей заявке.
Продуцирование этанола и других продуктов анаэробными микроорганизмами зависит от многих рабочих условий в зоне ферментации (см. патенты США NN 5173429, 5593886 и 6368819, WO 98/00558 и WO 02/08438). Два главных условия, влияющих на продуктивность микроорганизмов, являются pH и окислительно-восстановительный потенциал (ОВП) зоны ферментации. В WO 2009/022925 описано влияние pH и ОВП на превращение газообразных субстратов в продукты.
Микроорганизмам, участвующим в процессах метаболизма, необходимы питательные элементы и микроэлементы, и соответствующая подача конкретных питательных элементов может оказывать большое влияние на рост и жизнеспособность микроорганизмов. Фактически эти питательные вещества могут потребоваться для обеспечения потребления микроорганизмами монооксида углерода в качестве источника энергии. Так, например, для такого микроорганизма может потребоваться присутствие кофакторов металлов для обеспечения метаболических функций монооксид углерода-дегидрогеназы (CODH) и ацетил-CoA-синтазы (ACS). Важно отметить, что все необходимые питательные элементы должны присутствовать в нужном количестве и в биологически доступной форме.
Другим необходимым питательным элементом является источник восстановленной серы, которая обычно присутствует в форме органического сульфида, такого как цистеин. Цистеин представляет собой источник серы, необходимый для осуществления ферментативных процессов в микробной культуре. Хорошо известно, что микроорганизмам для осуществления ими ферментативных процессов требуется сера. Действительно, медиатор переноса электронов, ферредоксин, а также ферменты пути Вуда-Льюнгдала, такие как ацетил-CoA-синтаза и монооксид углерода-дегидрогеназа содержат серу. Поэтому важно, чтобы сера была добавлена в биологически доступной форме и в количестве, достаточном для предотвращения ингибирования роста микроорганизмов или продуцирования продуктов этими микроорганизмами.
Во многих случаях альтернативой цистеину является сульфид водорода, который служит источником восстановленной серы, необходимой для осуществления метаболических процессов данными микроорганизмами. В обычной сбраживаемой среде источник серы, такой как сульфид, находится в равновесии с сульфидом водорода. Хотя сульфид водорода является менее дорогостоящим, чем цистеин, однако он является токсичным, а поэтому требует специальных условий транспортировки, и представляет особую опасность при его использовании в чистом виде. Подача в ферментер серы в форме сульфидной соли, такой как сульфид натрия, способствует образованию сульфида водорода в концентрации, которая может со временем снижаться из-за испарения. Кроме того, сульфид водорода имеет ограниченную растворимость в среде. Сульфид водорода может становиться в высокой степени летучим в определенных условиях, что может оказаться желательным в зоне ферментации и будет приводить к повышению его потребления в качестве источника серы. В результате ограниченной растворимости сульфида водорода в воде концентрация серы в растворе может значительно снижаться в зависимости от условий в сбраживаемой среде. В соответствии с этим идентификация улучшенных или альтернативных источников серы для продуцирования спирта микроорганизмами, необходимых в системах ферментации с использованием таких газов, как монооксид углерода или водород и диоксид углерода, в качестве сырьевых материалов, позволит повысить производительность и рентабельность такой технологи производства спирта.
В соответствии с этим способы производства этанола или ацетата путем анаэробной ферментации были бы более эффективными, если будут обнаружены такие соединения серы, которые могут быть применены для рентабельного производства биологической серы, необходимой микроорганизмам для ее утилизации в благоприятных условиях ферментации, что позволило бы решить проблемы, связанные с использованием сульфида водорода в качестве источника серы.
В публикации патентной заявки США 20110300593 описано применение альтернативных источников серы. В этом документе описаны, в частности, только полисульфиды, элементарная и коллоидная сера, как неорганические соединения серы, используемые в качестве альтернативного источника серы. Еще более важно отметить, что в этом документе описано использование этих конкретных соединений серы, как средства для получения сульфида водорода в виде активных молекул в сбраживаемой среде. Таким образом, в цитируемой работе не сообщается о каких-либо серных добавках, которые при их использовании вместо сульфида водорода позволили бы продуцировать другие соединения серы в биологически доступной форме, а поэтому, в указанной работе не представлено каких-либо решений проблем, связанных с высокой летучестью сульфида водорода.
Таким образом, необходимо разработать экономически рентабельные способы ферментации синтетического газа для продуцирования окисленных C2-органических соединений, где подача микроэлементов серы может быть осуществлена в «необходимых» количествах с применением эффективной и недорогостоящей технологии.
Описание сущности изобретения
Изобретение относится к способам биоконверсии синтетического газа (синтез-газа) в окисленные C2-органические соединения, такие как этанол и ацетат, где подача микроэлементов серы обеспечивается серной добавкой, которая поставляет в жидкую питательную среду оксианионы серы или оксианионы сероводорода в форме, необходимой для осуществления микроорганизмами метаболических процессов и при этом облегчающей такие процессы в зоне ферментации при pH, ингибирующем рост примесных микроорганизмов. Было обнаружено, что такие соединения могут обеспечивать потребности карбоксидотрофных микроорганизмов в микроэлементе серы, необходимом для продуцирования этанола и ацетата из субстратов CO, CO2 и H2. Соединения этого класса включают бисульфиты, которые обычно используются в качестве антимикробных агентов в различных пищевых продуктах. При этом обычно предполагается, что такие соединения будут негативно влиять на рост и жизнеспособность микроорганизмов. Таким образом, было обнаружено, что такие соединения могут быть с успехом использованы для получения молекул серы, которые будут удовлетворять потребности микроорганизмов в метаболизме и позволят решить проблему, связанную с летучестью сульфида водорода при низких pH в зоне ферментации.
В своем широком аспекте изобретение относится к способу получения C2-оксигенатов с использованием этанол-продуцирующих карбоксидотрофных микроорганизмов путем доставки серы в сбраживаемую среду в биологически доступной и в высокой степени растворимой форме. Поддерживание pH ниже 5,3, а более предпочтительно ниже 5,1 является в высокой степени эффективным для ингибирования роста примесных микроорганизмов в зоне ферментации. Типичными примесями, которые могут влиять на процесс ферментации или нарушать этот процесс, являются микроорганизмы, которые продуцируют бутираты, и могут снижать селективность процесса получения более желательных этаноловых продуктов.
В изобретении для подачи серы с более высокой степенью окисления используются микроорганизмы, способствующие снижению степени окисления серы до приемлемых уровней. Было высказано предположение, что благодаря такому процессу микроорганизм продуцирует гидросульфид (HS-), который ассимилируется в используемой клетке. Это способствует снижению уровня HS- в жидкой питательной среде и минимизации любого сульфида в равновесной концентрации с сульфидом водорода, которая вносит свой вклад в выделение сульфида водорода из сбраживаемой среды.
В своих конкретных вариантах изобретение относится к способу продуцирования C2-оксигенатов путем анаэробной ферментации с использованием этанол-продуцирующего карбоксидотрофного микроорганизма. Этот способ включает получение серной добавки, включающей неорганическое соединение серы S(II)-S(IV), которое способствует образованию анионов серы, содержащих атомы кислорода и/или атомы кислорода и водорода в водной сбраживаемой среде; контактирование микробной культуры микроорганизма с субстратом, содержащим монооксид углерода; поддерживание микробной культуры в сбраживаемой среде, включающей серную добавку, при pH менее 5,3; и выделение одного или более C2-оксигенатов из сбраживаемой среды. В другом варианте осуществления изобретения указанная серная добавка включает неорганическое соединение серы S(III)-S(IV).
В конкретном варианте осуществления изобретения серной добавкой является сернистая кислота, бисульфит, метабисульфит, дитионит, тиосульфат или их комбинации. В предпочтительном варианте осуществления изобретения серной добавкой является сернистая кислота, бисульфит, метабисульфит или их комбинации. В других вариантах осуществления изобретения серной добавкой могут быть бисульфит натрия, метабисульфит натрия.
В конкретном варианте осуществления изобретения серная добавка присутствует в сбраживаемой среде в концентрации по меньшей мере 0,1, обычно в пределах от 0,1 до 10, а предпочтительно в пределах от 0,5 до 2 ммоль серы на грамм сухой клеточной массы микроорганизма.
В конкретном варианте осуществления изобретения контактирование микроорганизмов с серной добавкой происходит в присутствии дополнительного органического источника серы, и концентрация органической серы в сбраживаемой среде со временем снижается. В предпочтительном варианте осуществления изобретения концентрация органической серы в сбраживаемой среде составляет менее чем 0,3 ммоль органической серы на грамм сухой клеточной массы микроорганизма, а более предпочтительно менее чем 0,1 ммоль органической серы на грамм сухой клеточной массы микроорганизма.
В другом своем аспекте изобретение относится к способу удаления цистеина, используемого в качестве аминокислоты и источника серы, из жидкой питательной сбраживаемой среды. В конкретном варианте осуществления изобретения концентрация цистеина в сбраживаемой среде может быть значительно снижена, а предпочтительно снижена до менее чем 0,3 ммоль на грамм сухой клеточной массы микроорганизма. В конкретном варианте осуществления изобретения добавление цистеина в сбраживаемую среду может быть полностью прекращено.
В другом аспекте изобретения pH сбраживаемой среды поддерживают в пределах от 4,3 до 5,1, а предпочтительно ниже 4,9.
В другом аспекте изобретения указанный способ включает добавление хелатообразующего агента в сбраживаемую среду. В предпочтительном варианте осуществления изобретения в качестве хелатообразующего агента используют этилендиаминтетрауксусную кислоту, диэтилентриаминпентауксусную кислоту, нитрилотриуксусную кислоту, цитрат натрия и их смеси.
Вообще говоря, этанол является предпочтительным метаболитом, продуцируемым микроорганизмами. Другие метаболиты продуцируются в большинстве случаев вместе с ацетатом при ферментации субстрата. Было обнаружено, что способы согласно изобретению позволяют увеличить отношение спиртового продукта к кислотному продукту. Было обнаружено, что отношение этанола к ацетату составляет в пределах от более чем 5:1 до более чем 10:1, причем отношение спирта к ацетату может быть увеличено до 20:1 или более.
Изобретение применяется в случае, когда источник органической серы, такой как цистеин, находится в первом сосуде, используемом для роста микробной культуры, а затем эту микробную культуру переносят во второй сосуд. Первый сосуд, если это необходимо, может также содержать серную добавку. Контактирование микробной культуры, выращенной в первом сосуде с субстратом, может быть затем осуществлено во втором отдельном сосуде. Второй сосуд может содержать сбраживаемую среду с небольшим количеством цистеина или без цистеина. В конкретных вариантах осуществления изобретения второй сосуд для ферментации может иметь больший объем, как это практически используется при последовательном пассировании в целях переноса микробной культуры в сосуды большого объема для промышленного производства. Такое пассирование микробной культуры может продолжаться до переноса в третью зону ферментации и в дополнительные зоны ферментации большего объема. В предпочтительном варианте осуществления изобретения концентрация органической серы, такой как цистеин, будет снижаться по мере увеличения объема зоны ферментации. В другом варианте осуществления изобретения добавление цистеина в зону ферментации можно продолжить только в те зоны ферментации, которые имеют объем менее чем 40000 л, а более предпочтительно менее чем 4000 л.
В соответствии с другим своим вариантом изобретение относится к способу снижения уровня цистеина при продуцировании этанола или ацетата посредством анаэробной ферментации. Указанный способ включает контактирование микробной культуры карбоксидотрофного микроорганизма с субстратом, содержащим монооксид углерода, и культивирование микробной культуры в анаэробных условиях в первой зоне ферментации, содержащей цистеин в первой концентрации, с получением выращенной на цистеине микробной культуры в первой зоне ферментации. Некоторые или все выращенные на цистеине микробные культуры переносят во вторую зону ферментации, содержащую серную добавку, включающую неорганическое соединение серы, имеющее степень окисления от +2 до +4 (S(II)-S(IV)), так чтобы во второй зоне ферментации образовывались анионы, состоящие из атомов серы в комбинации с атомами кислорода и/или водорода. Субстрат, содержащий (i) монооксид углерода, (ii) диоксид углерода и водород или (iii) смеси компонентов (i) и (ii), добавляют во вторую зону ферментации для превращения субстрата в C2-оксигенаты. Из второй зоны ферментации выделяют один или более C2-оксигенатов.
Краткое описание графического материала
На фиг. 1-22 представлены графики ферментации, на которых указаны данные поглощения газа и продуцирования продукта при проведении непрерывной серии реакций ферментации с использованием серной добавки согласно изобретению.
Определения
«Биореактор» представляет собой любой аппарат для ферментации, имеющий по меньшей мере один сосуд для сохранения микроорганизмов в присутствии сбраживаемой среды, где термин «сосуд» означает устройство любой конфигурации, включающее трубы, колонки, мембраны, экран и другие подобные устройства, которые представляют собой реакторы непрерывного или периодического действия и могут включать барботирующий колоночный биореактор (BCBR), проточный реактор непрерывного действия, снабженный мешалкой (CSTR), реактор с иммобилизованными клетками (ICR), такой как биореактор, снабженный мембраной (MSBR), эжекторные циркуляционные реакторы, реакторы со струйным течением жидкости, трубные реакторы или любое другое устройство, которое обеспечивает контактирование микроорганизмов с субстратом в газо-жидкостной среде. Ферментеры, используемые в изобретении, могут иметь любую подходящую конфигурацию, однако предпочтительно, чтобы их конфигурация и режим работы обеспечивали высокий уровень превращения монооксида углерода и водорода в окисленное органическое соединение.
Термин «C2-оксигенат» означает любую молекулу, содержащую 2 атома углерода, атомы водорода и по меньшей мере один атом кислорода. При этом предпочтительно, чтобы С2-оксигенаты содержали этанол, уксусную кислоту и анионы ацетата.
Термин «микробная культура» означает смесь микроорганизмов с жидкой сбраживаемой средой, где микроорганизмы присутствуют в виде взвеси, суспензии или фиксированных колоний. Микробная культура включает микроорганизмы, суспендированные на подвижной среде-носителе, такой как трубчатые кольца или биочипы, или фиксированные на среде-носителе, такой как мембраны или другие пористые или полупористые среды. Термин «микробная культура» включает культуры, приготовленные из одного штамма микроорганизма или множества штаммов микроорганизмов.
Термин «сбраживаемая среда» означает водную жидкость, которая контактирует с микроорганизмами и содержит питательные элементы, такие как витамины, микроэлементы, аминокислоты и т.п., необходимые микроорганизму для сохранения своих биологических функций, а также продукты метаболизма, которые продуцируются микроорганизмами и выделяются из сбраживаемой среды. Сбраживаемая среда может поддерживать микроорганизмы, суспендированные в виде планктона, либо она может служить в качестве суспензионной среды для сохранения материала-носителя, на котором растут микроорганизмы, либо она может служить для подачи микробной культуры или ее выведения через носитель, такой как мембрана. В сбраживаемую среду может быть непосредственно добавлен газообразный субстрат, и такая среда будет служить средством для подачи субстрата к микроорганизмам.
Термин «сбраживание» или «ферментация» означает любое превращение субстрата под действием микроорганизма независимо от того, находится ли данный микроорганизм в фазе первичного роста или в фазе первоначального продуцирования продуктов-метаболитов.
Термин «среднее время удерживания клеток» при непрерывной ферментации означает общую массу клеток в ферментере, деленную на скорость истощения биомассы в ферментере.
Термин «питательная жидкость» означает водную жидкость, содержащую один или более питательных элементов, таких как витамины, микроэлементы или аминокислоты, необходимые микроорганизму для сохранения или улучшения своих биологических функций, где указанная водная жидкость может быть добавлена в сбраживаемую среду, либо она может непосредственно контактировать с микробной культурой.
Термин «органическая сера» означает любое сероорганическое соединение, определяемое как любое производное серы, имеющее по меньшей мере одну алкильную или арильную группу.
Термин «окислительно-восстановительный потенциал» или «ОВП» при его количественном определении означает величину разности потенциалов между водным раствором и электродом типа Ag/Ag-Cl, измеряемую с использованием солевого мостика, содержащего 3,8M электролита KCl.
Термины «S(II)», «S(III)» и «S(IV)» означают атомы серы в соединении серы, имеющие степень окисления «+2», «+3» и «+4» соответственно.
Термин «субстрат(ы)» означает газ или газы, которые представляют собой первичный источник углерода и энергии для микроорганизмов и включают по меньшей мере один из таких компонентов, как монооксид углерода или смесь диоксида углерода и водорода.
Подробное описание изобретения
В изобретении используются неорганические соединения серы уникального класса, которые обеспечивают доставку серы, необходимую для осуществления ферментации в целях продуцирования С2-оксигенатов из газообразных субстратов, содержащих один или более из таких компонентов, как монооксид углерода и/или смесь диоксида углерода и водорода. В большинстве случаев главное преимущество такого способа заключается в том, что присутствие цистеина в зоне ферментации не является необходимым. В некоторых вариантах осуществления изобретения цистеин может быть удален в начале реакции ферментации, либо количество цистеина может быть снижено, и/или цистеин может быть полностью удален по мере прохождения реакции ферментации. Это означает, что количество цистеина может быть снижено до значительно более низких уровней, чем это может потребоваться в случае, когда цистеин представляет собой первичный источник биологически доступной серы, либо это означает, что цистеин может быть удален во время непрерывного процесса ферментации не только как источник серы, но и как прямой источник аминокислоты. Было обнаружено, что неорганические серные добавки согласно изобретению обеспечивают поддерживание высокого уровня серы в зоне ферментации, а также позволяют микроорганизму размножаться на фазах роста и продуцирования, так чтобы в зоне ферментации могли достигаться высокие титры этанола.
Главной целью изобретения является получение серной добавки конкретного типа. Такая серная добавка, которая может быть использована в изобретении, может содержать соединения серы, имеющее атомы серы со степенью окисления от +2 до +4 (S(II)-S(IV)). Эти добавки могут представлять собой соединения серы любого типа, содержащие оксоанионы серы и/или оксоанионы сероводорода. Конкретными анионными формами такой добавки являются сульфит, бисульфит, метабисульфит, диоксид серы, дитионит и тиосульфат. Такая добавка может быть получена путем добавления различных соединений серы, таких как сернистая кислота, бисульфит натрия, метабисульфит натрия, метабисульфит калия, дитионовая кислота, дитионит натрия, тиосульфат натрия.
Серная добавка после ее диспергирования в водную жидкость сбраживаемой среды может присутствовать в активной анионной форме. Оксоанионы серы и оксоанионы сероводорода, которые являются эффективными для осуществления изобретения, содержат сульфитную форму SО32- и форму сульфита водорода НSО3- (бисульфитную форму). Не претендуя на какую-либо конкретную теорию, авторы изобретения лишь указывают на способность микроорганизмов переносить эти оксоанионы серы через мембрану клеточной структуры. После переноса оксианионов вовнутрь клеток микроорганизмы восстанавливают эти оксианионы до HS-. Реакции протекают в следующей последовательности: SO3-2=>H2S под действием сульфит-редуктазы, а затем HS-+O-ацетилсерин => цистеин под действием O-ацетилсерин-сульфгидрилазы. Под действием воды соединения серы диссоциируют с образованием равновесных смесей аниона сульфита и других положительно заряженных или нейтральных молекул. Так, например, с использованием раствора сернистой кислоты в воде в качестве добавки может быть достигнуто равновесие диоксида серы и иона бисульфита в соответствии со следующей формулой:
H2SO3+H2O
HSO3-+H+
с константой диссоциации
Κa=1,38×l0-2; pΚa=1,86.
Аналогичным образом, водный диоксид серы будет связываться с водой и подвергаться депротонированию в соответствии с общей формулой и pKa
SO2+H2OHSO3-+H+
с константой диссоциации
Κa=1,54×l0-2; pΚa=1,81.
Сульфит водорода также находится в равновесии с ионом сульфита в соответствии с формулой
HSO3-SO32-+H+
и представляет собой слабую кислоту с pΚa=6,97.
Используемый в изобретении анион дитионита ([S2O4]2-) представляет собой другой оксоанион серы, который может быть получен из дитионовой кислоты и H2S2O4, и который после гидролиза образует равновесную смесь тиосульфата и бисульфита в соответствии с формулой
2S2O4-2+H2O→S2O3-2+2HSO3-1
Подходящие серные добавки могут быть получены в различных формах широкого ряда, которые обеспечивают утилизацию серных добавок и оксоанионов серы микроорганизмами. Специалистам известно, что для получения серных добавок согласно изобретению могут быть использованы подходящие неорганические соли серы. Обычно используемые формы добавок включают бисульфит натрия, метабисульфит натрия, сернистую кислоту, метабисульфит калия, бисульфит калия или любую другую комбинацию катиона-оксоаниона-серы. Особенно предпочтительно, чтобы соединение серы было, по существу, растворимым в сбраживаемой среде и нетоксичным для микробной культуры в эффективной концентрации серной добавки на любой стадии роста микробной культуры.
Изобретение позволяет сохранять серную добавку на предварительно определенном или более высоком уровне. Серная добавка может быть введена в количестве, достаточном для того, чтобы все это количество серы или ее части удовлетворяло биологическим потребностям микроорганизмов. Серную добавку обычно вводят в количестве, достаточном для того, чтобы отдельные атомы серы удовлетворяли биологическим потребностям микроорганизмов. Для создания стационарных условий ферментации, при которых все количество серы будет удовлетворять биологическим потребностям микроорганизмов, серу обычно добавляют в концентрации, составляющей по меньшей мере 0,25 ммоль серной добавки на грамм сухой клеточной массы микроорганизма в случае ионов одноатомной серы, причем такое количество может быть скорректировано для ионов многоатомной серы. Предпочтительная концентрация добавленной серы составляет в пределах от 0,67 до 2 ммоль серы на грамм сухой клеточной массы микроорганизма.
Серная добавка может включать различные источники неорганической серы, которые могут разлагаться и/или высвобождаться с образованием биологически доступных молекул серы согласно изобретению в различных количествах в зависимости от таких параметров, как pH, температура, давление и т.п. Может оказаться необходимым, чтобы со временем добавление серной добавки варьировалось в зависимости от скорости разложения и диссоциации конкретно используемой серной добавки. Такое изменение типа и/или количества добавляемой серной добавки может оказаться необходимым для поддержания роста и/или продуктивности микробной культуры. Поэтому эффективность ферментации может быть повышена посредством увеличения концентрации молекул серы нужного вида путем добавления большего количества серной добавки или изменения типа серной добавки в различные периоды времени и на различных стадиях ферментации.
В конкретных вариантах осуществления изобретения одно или более неорганических соединений серы представляют собой раствор бисульфитного соединения, такого как бисульфит натрия, приготовленный в форме предпочтительно 5-молярного раствора бисульфита и разведенный с получением маточного раствора в предпочтительной концентрации приблизительно 1,2 мМ. Концентрация бисульфита в растворе зависит от различных факторов, включая pH и растворимость.
В другом варианте осуществления изобретения было обнаружено, что карбоксидотрофные микроорганизмы могут выживать в культуральной среде, которая не содержит каких-либо дополнительных аминокислот, включая цистеин, и источником серы для этих микроорганизмов является сернистая кислота (H2SO3). Атомы серы сернистой кислоты и метабисульфита имеют степень окисления +4. Известно, что метабисульфит, сернистая кислота, сульфит, диоксид серы и бисульфит могут присутствовать в воде в равновесном состоянии. T. Fazio & C.R. Warner. 1990. A Review of Sulphites in Foods: analytical methodology and findings. Food Addit. Contam. 7:433-454.
В этом конкретном варианте осуществления изобретения рост микробной культуры может быть инициирован цистеином, используемым в качестве серной добавки, с последующим снижением концентрации цистеина (наряду с пропорциональным увеличением количества серной добавки) и небольшой постоянной коррекцией поглощения водорода. При необходимости для регуляции переноса газовой массы могут быть изменены режим перемешивания и скорость потока газа. Удовлетворительные результаты могут быть получены даже в том случае, когда питательная жидкость абсолютно не содержит метабисульфита и цистеина в течение 800 ч, а в качестве источника серы остается только сернистая кислота, поставляемая с питательной жидкостью для ее утилизации микроорганизмами. (Анионы сульфата присутствуют в среде, однако стандартные микроорганизмы, используемые в изобретении, не утилизуют сульфат ни по механизму ассимиляции, ни по механизму диссимиляции). В некоторых случаях может быть также добавлен серин.
В некоторых случаях добавление избыточного количества соединений S(IV) может несмотря на изменение KLa приводить к снижению уровня поглощения водорода. Это может быть обусловлено известным действием соединений S(IV), используемых в качестве ингибиторов роста микробов. Поэтому изобретение может иметь то преимущество, что оно позволяет проводить мониторинг количества полученного соединения S(IV), которое должно быть достаточным для предотвращения каких-либо побочных эффектов, обусловленных присутствием слишком малого количества биологически доступной серы, а также токсических эффектов, обусловленных слишком большим количеством соединения S(IV). И в этом случае добавление избыточного количества серы может также приводить к высвобождению микробной культурой больших количеств сульфида водорода, которые представляют определенную опасность и удаление которых требует значительных материальных затрат.
Предложенный метод ассимиляции сернистой кислоты в клетках инициируется сульфит-редуктазой. При рН рабочей культуры 4,5-5,3 сернистая кислота будет подвергаться химическому депротонированию с образованием, главным образом, формы HSO3-, где величины двух pΚa составляют 7,2 и 1,9. Затем этот бисульфит подвергается биологическому превращению в H2S под действием указанного фермента, и на этой стадии, очевидно, происходит ассимиляция цистеина посредством связывания ацетилсерина. Хотя неизвестно, присутствует ли ген O-ацетилсерин-сульфгидролазы, используемой в этой реакции, в геноме карбоксидотрофных микроорганизмов согласно изобретению, однако известно, что в геноме карбоксидотрофных микроорганизмов согласно изобретению присутствует ген сульфит-редуктазы. Кроме того, присутствие сульфида водорода в отходящем газе ферментера, хотя этот сульфид водорода и не подавался в ферментер с питательной жидкостью, а также способность микроорганизмов выживать на соединении S(IV) указывают на наличие гена O-ацетилсерин-сульфгидролазы.
Сера может быть добавлена в сбраживаемую среду любым подходящим способом. В соответствии с изобретением серная добавка может быть добавлена любым методом, обеспечивающим биологическую доступность нужных молекул серы для микроорганизма в предварительно определенных количествах и в определенное время проведения ферментации. Эту добавку предпочтительно вводят непосредственно в сбраживаемую среду в процессе добавления питательной жидкости, которая обеспечивает микробную культуру другими микроэлементами. Таким образом, серная добавка может быть введена периодически или непрерывно в виде смесей в концентрации, которая может варьироваться в процессе ферментации. Серная добавка может подаваться в различные участки микробной культуры, например, во множество различных отделений биореактора, снабженного сосудом для ферментации, в котором микроорганизмы суспендированы в форме планктона. Подачу серной добавки обычно осуществляют после инокуляции биореактора микробной культурой, и такая подача может быть увеличена по мере роста культуры и по мере повышения потребности в метаболическом соединении серы в процессе ферментации. Подачу серной добавки обычно регулируют для поддержания предварительно определенной концентрации одного или более оксоанионов сероводорода или серы на уровне, достаточном для их утилизации микроорганизмами в биореакторе.
Для определения концентрации серной добавки в растворе может быть применен любой подходящий метод. Подача серной добавки может регулироваться в зависимости от присутствия сульфида в отходящем газе зоны ферментации. При ферментации сульфид обычно высвобождается в область «хэд-спейса» или в газовую фазу, расположенные выше сбраживаемой среды. Этот сульфид может образовываться из сульфида, присутствующего в сбраживаемой среде, и никогда не усваивается микроорганизмом (внеклеточный сульфид), либо он может образовываться из сульфида, высвобождаемого микроорганизмом (внутриклеточный сульфид). Преимуществом изобретения является возможность минимизации любого образования внеклеточного сульфида, а присутствие и высвобождение сульфида является показателем переизбытка серной добавки в сбраживаемой среде. Поэтому мониторинг концентрации сульфида в отходящем газе позволяет точно определить, присутствует ли сера в количестве, достаточном для удовлетворения биологических потребностей микроорганизмов, или в избыточном количестве. Высокий уровень сульфида в отходящем газе, обычно более чем 0,05 об.%, указывает на избыток подаваемой серной добавки. Обычно концентрация сульфида в отходящем газе, составляющая 0,01-0,025%, указывает на приемлемый уровень добавления серной добавки. Отсутствие сульфида в отходящем газе может указывать на недостаточное удовлетворение биологических потребностей микроорганизмов и со временем может влиять на продуктивность микроорганизмов.
В некоторых вариантах изобретения может оказаться предпочтительным использование цистеина для инициации реакции ферментации. Цистеин может оказаться предпочтительным при начальном пассировании микробной культуры в сбраживаемую среду большего объема. Однако относительно низкие объемы сбраживаемой среды, используемой на начальных стадиях ферментации при росте микроорганизмов все еще позволяют экономически эффективно использовать цистеин как на начальном этапе ферментации, так и при ферментации в промышленных объемах. Так, например, объемы цистеина в первой серии сосудов для ферментации, в которых осуществляют первое пассирование культуры и которые расположены в серии реакторов, должны составлять только в пределах от нескольких литров до нескольких тысяч литров, и такие объемы используемого цистеина не приносят какого-либо значительного экономического ущерба. Самые главные преимущества изобретения были достигнуты благодаря обнаружению того факта, что количество цистеина может быть значительно снижено, либо он может быть вообще удален из зоны ферментации промышленного реактора, который имеет объемы жидкости в один миллион литров или более, и при использовании цистеина в качестве первичного источника серы для такой ферментации требуется 100 кг или более цистеина в день.
В других вариантах осуществления ферментации согласно изобретению может оказаться преимущественным добавление в сбраживаемую среду некоторых аминокислот. В случае постепенного удаления цистеина из среды на начальной стадии ферментации может оказаться предпочтительным добавление одной или дополнительных аминокислот в сбраживаемую среду в процессе перехода от микробной культуры с цистином к микробной культуре с серными добавками согласно изобретению. В этом случае могут быть использованы такие аминокислоты, как метионин и серин, в частности серин.
Жидкая питательная среда может включать помимо серы другие компоненты широкого ряда, такие как микроэлементы, следовые количества металлов и витамины. Металлы в следовых количествах составляют часть жидкой питательной среды, и ими обычно являются один или более из таких металлов, как марганец, цинк, молибден, селен, вольфрам, железо, кобальт и никель. Составы различных питательных сред для анаэробной ферментации хорошо известны специалистам и описаны в патентах США 5173429 и 5593886. Типичные соединения и конечные концентрации микроэлементов представлены в таблицах 1-3.
Микроэлементы
Следовые количества металлов
Витамины
Любые или все питательные вещества могут быть смешаны с получением одной или более питательных жидкостей, добавляемых в микробную культуру. Питательные жидкости обычно добавляют в сбраживаемую среду, которая контактирует с микроорганизмами. Различные смеси питательной жидкости, содержащей различные питательные вещества, могут быть смешаны с получением периодической культуры и добавлены в сбраживаемую среду для непрерывной или периодической ферментации. В предпочтительном варианте осуществления изобретения питательная жидкость непосредственно перед ее добавлением в сбраживаемую среду может быть смешана путем периодического добавления растворов, содержащих питательные компоненты. Добавление раствора с многокомпонентной питательной жидкостью непрерывным потоком и/или его периодическое добавление позволяет предотвратить осаждение питательных компонентов.
Скорость добавления различных питательных веществ в микробную культуру может быть определена любым подходящим методом. Такие методы включают определение средней потребности микробной культуры в данных питательных веществах на различных стадиях ее роста и продуктивности и вычисление скорости добавления различных компонентов в различные периоды времени. Может быть также проведен мониторинг путем вычисления выборочных средних, где непосредственно измеряют уровни различных питательных компонентов, а скорость добавления устанавливают или корректируют в зависимости от предварительно определенных интервалов количества этих питательных веществ. Выборка может быть проведена с использованием зондов или с помощью прямого анализа взятых образцов. Методика проведения такого анализа хорошо известна специалистам и включает, например, масс-спектроскопию, плазменную масс-спектроскопию с индуктивной связью, высокоэффективную жидкостную хроматографию, ионообменную хроматографию, атомную абсорбционную спектроскопию и/или атомную абсорбционную масс-спектроскопию.
Добавление питательных веществ, в частности следовых количеств металлов, может приводить к осаждению металлов в сбраживаемой среде. Такое осаждение может быть ассоциировано с общей или локальной концентрацией металла в сбраживаемой среде, либо осадок может образовываться при приготовлении различных питательных жидких растворов. Удаление цистеина, используемого в качестве питательной добавки, может стимулировать образование такого осадка, поскольку добавление цистеина приводит к образованию хелатного комплекса в питательной жидкости и в сбраживаемой среде.
Образование металлического осадка можно предотвратить путем добавления хелатного комплекса металла в питательную жидкость и/или в сбраживаемую среду. Подходящими хелатными комплексами металлов, которые могут быть включены в питательное вещество и/или в сбраживаемую среду, являются этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), диэтилентриаминпентауксусная кислота (DTPA), нитрилотриуксусная кислота (NTA) и цитрат натрия. Хелатный комплекс металла может быть добавлен в любой концентрации, которая позволяет предотвратить образование осадка. Желаемые концентрации хелатного комплекса металла могут варьироваться, главным образом, в зависимости от концентрации металлов в сбраживаемой среде или в питательной жидкости, от температуры жидкости и от pH жидкости. Типичные концентрации хелатного комплекса металла представляют собой молярное отношение хелатного комплекса ко всем переходным металлам (определенным в соответствии с номенклатурой ИЮПАК как металлы Группы 3-12 Периодической таблицы элементов), составляющее от 0,1:1 до 5:1, предпочтительно от 0,1 до 1,0, а более предпочтительно в пределах от 0,2 до 0,5.
В некоторых случаях может оказаться желательной регуляция окислительно-восстановительного потенциала микробной культуры. Такая регуляция включает изменение окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) микробной культуры путем изменения коэффициента переноса масс KLa. Иногда восстановители могут быть непосредственно добавлены в непрерывную или периодическую культуру путем прямой инъекции в саму культуру, в сбраживаемую среду или в питательную жидкость. В частности, сульфиты и бисульфиты являются восстановителями, то есть их добавление приводит к снижению окислительно-восстановительного потенциала сбраживаемой среды. Окислительно-восстановительный потенциал обычно доводят до уровня менее чем -200 мВ, предпочтительно в пределах от -300 мВ до -500 мВ, а более предпочтительно, в пределах от -350 мВ до -450 мВ. Окислительно-восстановительный потенциал может быть легко измерен с помощью хорошо известного средства, такого как ОВП-зонд. Также известно, что снижение ОВП может стимулировать продуцирование преимущественно спиртов, а не кислот посредством восстановления таких кислот.
Подходящие восстановители, в частности металлические восстановители, используемые для снижения ОВП, хорошо известны специалистам. Подходящими восстановителями являются Cr(II) и Ti(IV).
Предпочтительно, чтобы pH поддерживался на относительно постоянном уровне, а ОВП был скорректирован. Подходящие условия прохождения реакции могут быть обеспечены при pH 5,3. Предпочтительный рН микробной культуры составляет в пределах от 5,1 до 4,3. Чаще всего используется pH ниже 5,1. Иногда приемлемым может быть pH 4,9 или ниже, а более предпочтительным является pH в пределах от 4,3 до 4,9. Снижение pH может также замедлять рост нужных этанол-продуцирующих микроорганизмов, а поэтому рН обычно поддерживают при 4,3 или выше, но для некоторых микроорганизмов может быть использован еще более низкий pH. Более низкий pH ингибирует рост инвазивных видов микроорганизмов, таких как бутиригены, которые продуцируют такие химические соединения, как бутанол и масляная кислота. Кроме того, более низкий рН, а предпочтительно 4,9 или ниже, способствует поддержанию низкого ОВП в микробной культуре.
В качестве субстрата для ферментации согласно изобретению может служить любой источник монооксида углерода и/или диоксида углерода и водорода. Источниками газа с высоким содержанием монооксида углерода являются газ коксовой печи, газы из промышленных отходов, образующиеся в результате перегонки нефтепродуктов, или газ, образующийся из отходов сталеплавильного производства. Изобретение может быть, в частности, осуществлено с использованием субстратов, содержащих синтез-газ. Синтез-газ может быть получен из различных источников, включая, но не ограничиваясь ими, газ, образующийся из углеродного сырья, такого как биомасса; газ органических отходов, уголь, природный газ и нефть.
В соответствии с широкими аспектами изобретения источник синтез-газа не имеет существенного значения. Однако синтез-газ не должен содержать компоненты в концентрациях, которые могут оказывать негативное влияние на микроорганизмы, используемые для ферментации, например, такие компоненты, но не ограничивающиеся ими, как цианид водорода, алкены и алкины, и компоненты, которые могут оказывать негативное влияние в том случае, когда они присутствуют в требуемом окисленном органическом соединении, таком как деготь, и ароматические соединения, если таким нужным продуктом является этанол. В большинстве случаев синтез-газ содержит 25-70, например, 30-65 молярных процентов монооксида углерода; 0-70, например, 30-65 молярных процентов водорода; и 1-20, например, 3-15 молярных процентов диоксида углерода, за исключением азота, метана и водяного пара, как было определено при вычислениях концентраций.
Синтез-газ может быть подвергнут обработке для повышения его качества, необходимого для ферментации. Такая обработка может включать удаление крупных частиц. Может также оказаться желательным удаление примесей, которые могут оказывать токсическое действие на микроорганизмы и ингибировать их рост или повышать их смертность. Особенно желательным является удаление цианида, дегтя и ацетиленовых соединений.
Контактирование синтез-газа с микроорганизмами может быть осуществлено в биореакторе любого типа. Такие биореакторы могут быть использованы для непрерывной или периодической ферментации субстрата под действием микроорганизмов. К биореактору может быть подсоединено множество отдельных сосудов. Отдельные сосуды могут располагаться таким образом, чтобы по меньшей мере один сосуд был предназначен для фазы роста микроорганизмов, а по меньшей мере другой сосуд был предназначен для фазы продуцирования, где продукты-метаболиты продуцируются на более высоком уровне, чем в биореакторах для фазы роста.
Синтез-газ получают в целях обеспечения переноса массы водорода и монооксида углерода в водную сбраживаемую среду для их биоконверсии микроорганизмами в С2-оксигенаты, такие как этанол или ацетат. Предпочтительно, чтобы синтез-газ подавался непрерывно.
Условия ферментации, включая плотность микроорганизмов, состав жидкой питательной среды и время пребывания синтез-газа в реакторе, должны быть предпочтительно достаточными для достижения нужной эффективности конверсии водорода и монооксида углерода и могут варьироваться в зависимости от конструкции реактора для ферментации и от способа проведения ферментации. Типичные условия ферментации, которые могут быть созданы в биореакторах, хорошо известны специалистам. Условиями ферментации под действием микроорганизмов типа планктона, которые суспендированы в жидкой сбраживаемой среде, являются давление, температура, скорость потока газа, рН, ОВП, скорость перемешивания, скорость подачи среды и среднее время удерживания клеток для непрерывной реакции ферментации.
Сбраживаемую среду поддерживают в подходящих условиях ферментации, а синтез-газ подают так, чтобы обеспечивалась его максимальная утилизация. Давление может быть ниже атмосферного, атмосферным или выше атмосферного, причем обычно абсолютное давление составляет в пределах приблизительно от 90 до 1000 кПа, а в некоторых случаях для пленочного ферментера может оказаться желательным более высокое давление. В большинстве случаев конструкция реактора, особенно промышленного реактора, должна обеспечивать достаточную высоту водного растворителя для ферментации, а давление в ферментере может варьироваться в зависимости от статического напора. Давление влияет на продуктивность ферментации, и оптимизация такого давления наряду с прочими факторами зависит от конкретно используемых микроорганизмов, состава субстрата и типа биореактора. Условия с более высоким давлением могут способствовать повышению скорости переноса субстрата в водную фазу, что, в свою очередь, будет снижать время удерживания компонентов газовой фазы в данном объеме жидкости и обеспечивать желаемую конверсию субстрата. В WO 02/08438 сообщалось, что повышение уровня этанола в 10-20 раз в граммах на литр в день может быть достигнуто путем ферментации при более высоком давлении порядка 2-5 атмосфер. Однако снижение времени удерживания и повышение продуктивности должно быть сбалансировано в соответствии со структурными требованиями, предъявляемыми к крупномасштабной ферментации в сосудах с высоким давлением. Исходя из этих соображений, может оказаться наиболее предпочтительным проводить ферментацию в промышленных биореакторах при атмосферном давлении и при давлении, близком к атмосферному. Более высокое давление может быть преимущественно использовано в биореакторах, в которых микроорганизмы фиксированы на различных носителях, поэтому они имеют относительно более низкие объемы локализации, которые практически позволяют использовать более высокое давление.
Парциальное давление CO может быть также ограничивающим условием при ферментации, а более высокое рабочее давление будет оказывать еще большее влияние на ферментацию. Для гарантии непрерывного роста и продуктивности микроорганизмов необходимо достаточное количество субстрата, однако при слишком высоком парциальном давлении CO может быть токсичным для микроорганизмов и может ингибировать их рост и дальнейшую жизнеспособность.
Один или более карбоксидотрофных микроорганизмов могут быть использованы в ферментации для продуцирования желаемого окисленного органического соединения. В конкретных вариантах осуществления изобретения реакцию ферментации осуществляют с использованием одного или более штаммов ацетогенных бактерий.
Биоконверсия CO и H2/CO2 в этанол и ацетат хорошо известна специалистам. Так, например, в недавно вышедшем издании приводится краткое описание биохимических реакций и энергетических уровней таких биоконверсий, которые были систематизированы A. Das и L.G. Ljungdahl в «Electron Transport System in Acetogens» и H.L. Drake и K. Kusel в «Diverse Physiologic Potential of Acetogens», и представлены соответственно в главах 14 и 13 издания «Biochemistry and Physiology of Anaerobic Bacteria», L.G. Ljungdahl eds,. Springer (2003). При этом могут быть использованы любые подходящие микроорганизмы, которые обладают способностью к конверсии компонентов CO, H2, CO2 как отдельно, так и в комбинации с друг с другом или с другими компонентами, которые обычно присутствуют в синтез-газе. Описание подходящих микроорганизмов и/или условий их роста можно найти в публикации заявки на патент США pег. №11/441392, поданной 25 мая, 2006, под названием «Indirect Or Direct Fermentation of Biomass to Fuel Alcohol», где описана биологически чистая культура микроорганизма Clostridium carboxidivorans, имеющего все идентификационные данные ATCC no. BAA-624; и в патенте США 7704723, озаглавленном «Isolation and Characterization of Novel Clostridial Species», в котором описана биологически чистая культура микроорганизма Clostridium ragsdalei, все идентификационные данные которого имеются в ATCC No. BAA-622; где все указанные публикации во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки. Бактерия Clostridium carboxidivorans может быть использована, например, для ферментации синтез-газа в этанол и н-бутанол. Бактерия Clostridium ragsdalei может быть использована, например, для ферментации синтез-газа в этанол.
Подходящими микроорганизмами с подходящими условиями их роста являются анаэробные бактерии Butyribacterium methylotrophicum, которые имеют идентификационные данные ATCC 33266 и которые могут быть адаптированы для утилизации CO в целях продуцирования н-бутанола, а также масляной кислоты, как описано в работах: «Evidence for Production of n-Butanol from Carbon Monoxide by Butyribacterium methylotrophicum» Journal of Fermentation and Bioengineering, vol. 72, 1991, p. 58-60, и «Production of butanol and ethanol from synthesis gas via fermentation» FUEL, vol. 70, May 1991, p. 615-619. Другими подходящими микроорганизмами являются штаммы Clostridium ljungdahlii, идентификационные данные которых представлены в ATCC 49587 (US-A-5173429) и в ATCC 55988 и 55989 (US-A-6136577), и которые способны продуцировать этанол и уксусную кислоту; Clostridium autoethanogenum -sp. nov., то есть анаэробная бактерия, которая продуцирует этанол из монооксида углерода, Jamal Abrini, Henry Naveau, Edomond-Jacques Nyns, Arch Microbiol., 1994, 345-351, Archives of Microbiology 1994, 161: 345-351; и бактерия Clostridium coskatii, имеющая идентификационные данные, представленные в ATCC No. PTA- 10522 и описанная в патенте США 8143037. Все указанные документы во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
Микроорганизмы, подходящие для биоконверсии синтез-газа в С2-оксигенаты, такие как этанол и ацетат, согласно изобретению живут и растут в анаэробных условиях, а это означает, что в зоне ферментации растворенный кислород, в основном, отсутствует. При добавлении к микробной культуре больших количеств питательной жидкости или сбраживаемой среды определенного состава, такой как сбраживаемая среда непрерывного действия с низким средним временем удерживания клеток, эффективность ферментации может быть увеличена путем введения одного или более восстановителей для поддержания анаэробных условий и ОВП в предварительно определенных интервалах.
Другие добавки в сбраживаемую среду могут включать забуферивающие агенты, следовые количества металлов, витамины, микроэлементы, соли и т.п. Путем коррекции состава сбраживаемой среды можно создавать различные условия в различные периоды времени, такие как условия для роста и для прекращения роста, которые могут влиять на продуктивность микроорганизмов. В патенте США 7704723, который во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки, описаны условия и составы сбраживаемых сред, подходящих для биоконверсии CO и H2/CO2 с использованием анаэробных микроорганизмов.
Анаэробную ферментацию осуществляют при соответствующей температуре, например, при 25-60°C, а чаще всего приблизительно при 30-40°C. Особенно предпочтительной температурой для проведения такой ферментации является температура в пределах от 36 до 38°C.
Ферментация может быть осуществлена в любом биореакторе, описанном ранее. Предпочтительными реакторами являются реакторы, которые могут обеспечивать высокий уровень продуцирования С2-оксигенатов в промышленном масштабе. Колоночные биореакторы барботажного типа имеют то преимущество, что они удовлетворяют требованиям сохранения энергии при циркуляции и смешивании субстрата в жидкой фазе. Мембранные биореакторы могут иметь значительные преимущества в промышленном производстве благодаря возможности проведения реакций при повышенном давлении и снижения потребности в воде при проведении ферментации.
Извлечение продукта обычно осуществляют путем выделения нужных продуктов из сбраживаемой среды. При этом может быть проведена любая процедура по извлечению продукта, которая позволяет выделять нужные продукты из микробной культуры. В большинстве случаев, продукты выделяют из сбраживаемой среды, которая поглощает метаболиты из микроорганизмов при их тесном контакте с этой средой. Обычно для такого извлечения продукта часть сбраживаемой среды время от времени или непрерывно удаляют из биореактора. В случае ферментации, при которой микроорганизмы суспендируются в виде планктона или на материале-носителе, такое удаление сбраживаемой среды обычно осуществляют в определенное время в верхней части жидкой поверхности сосуда. В случае биореакторов, сконструированных так, чтобы микроорганизмы были фиксированы на твердом носителе, например, в случае мембранных биореакторов или биореакторов со струйным течением жидкости, сбраживаемая среда содержит циркулирующую жидкость, часть которой была удалена.
Извлечение продукта из сбраживаемой среды может быть осуществлено на любом известном оборудовании для удаления остаточного клеточного материала, для выделения и извлечения жидких продуктов из сбраживаемой жидкости, для возвращения выделенной сбраживаемой жидкости и для удаления потока отходов и загрязняющих веществ путем продувки. Этанол или ацетат могут быть выделены из сбраживаемой жидкости методами, хорошо известными специалистам. Подходящим оборудованием могут служить фильтры, дистилляционные колонки, мембранные системы и другие сепараторы. В заявке США 2009/0215139 A1 описана конструкция оборудования для извлечения этанолового продукта из биореактора, где указанная заявка во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки. Методы перегонки для извлечения этанола из сбраживаемой среды позволяют получить этанолсодержащий поток азеотропной смеси этанола и воды (то есть 95% этанола и 5% воды). Если желательно получить безводный этанол, то такой этанолсодержащий поток может быть подвергнут дополнительной очистке хорошо известными методами, такими как метод дегидратации этанола на молекулярных ситах.
Обычно ферментация приводит к неполной утилизации субстрата. В результате может оказаться желательным извлечение компонентов субстрата из отходящего газа биореактора или из сбраживаемой среды. В частности, диоксид углерода может быть удален из биореактора или из отходящего газа биореактора. При этом может быть применен любой подходящий способ удаления диоксида углерода, включая экстракцию амина, экстракцию щелочных солей, поглощение воды, разделение на мембране, адсорбцию/десорбцию и физическую абсорбцию в органических растворителях. В предпочтительных аспектах изобретения отходящий газ, образующийся после удаления диоксида углерода, содержит по меньшей мере приблизительно 15, например, 15-50 молярных процентов общего водорода и монооксида углерода. При этом предпочтительно, чтобы концентрация диоксида углерода в отходящем газе, образующемся после удаления диоксида углерода, составляла приблизительно 2-40, а более предпочтительно приблизительно 5 или 10-20 молярных процентов. Отходящий газ, образующийся после удаления диоксида углерода, может содержать по меньшей мере приблизительно 5, а в большинстве случаев приблизительно 10-20 молярных процентов азота.
Предпочтительный способ удаления диоксида углерода из газов включает контактирование газа с водным раствором, содержащим окисленные органические соединения. Такой способ удаления диоксида углерода из газа, подаваемого в реактор, включая удаление диоксида углерода в промежутке между последовательными стадиями ферментации, описан в публикации заявки на патент США No. 2008/0305539, поданной 23 июля 2007, которая во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки. См., также заявку на патент США рег. No. 12/826991, поданную 30 июня 2010, которая во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки и в которой описаны: контактирование потока газа со смесью воды и поверхностно-активного вещества под давлением для поглощения диоксида углерода, и фаза разделения потоков газа и жидкости с получением потока газа, имеющего пониженную концентрацию диоксида углерода, подаваемого в реактор. В публикации заявки на патент США No. 2008/0305539 описано использование мембран для удаления диоксида углерода из мембранной системы ферментации в целях предупреждения разведения концентраций монооксида углерода и водорода в многостадийной системе. При необходимости часть диоксида углерода, растворенного в жидкой фазе сбраживаемой среды, может быть удалена. При этом может быть проведена любая типовая химическая процедура по удалению диоксида углерода, однако предпочтительной процедурой является разделение при снижении давления до атмосферного или до более низкого давления для мгновенного удаления газообразного диоксида углерода из жидкой фазы.
Примеры
Общие процедуры
Была проведена серия экспериментов по непрерывной ферментации, в результате которой различные штаммы микроорганизмов продуцируют этанол и ацетат в анаэробных условиях сбраживания с использованием серной добавки согласно изобретению. Эти эксперименты проводили с использованием исходной сбраживаемой среды, содержащей микроэлементы, концентрация которых указана в таблицах 4-6. Такая культуральная среда служит в качестве основной жидкой среды для проведения экспериментов.
Микроэлементы
Следовые количества металлов
Витамины
Основная жидкая среда, описанная выше, была приготовлена путем введения 10 л воды в 10-литровую бутыль с питательной средой и добавления химических компонентов, за исключением соединений железа, в основную среду в количествах, которые должны обеспечивать наличие вышеперечисленных питательных веществ в вышеуказанных пределах. Перед добавлением соединений железа и любых других соединений бутыли с питательной средой продували по меньшей мере в течение одного дня газообразным азотом для удаления растворенного кислорода.
Процедуры по проведению реакций ферментации в различных экспериментах осуществляли одними и теми же методами, если это не оговорено особо. Стандартную процедуру для проведения экспериментов начинали с введения «посевной» культуры в сосуд для посева, содержащий Biostat B, поставляемый Sartorius Stedim Biotech, Germany. Инокулят добавляли в 4,5 л или в 9 л жидкой среды в сосуде для посева в зависимости от объема этого сосуда для посева. Ферментацию в сосуде для посева непрерывно проводили до достижения оптической плотности (ОП) по меньшей мере 1,5. Все измерения ОП проводили на спектрофотометре на длине волны 600 нм. После достижения ОП=1,5 в сосуде для посева 1 л микробной культуры, взятой из сосуда для посева, добавляли с помощью коллектора для инокуляции, управляемого перистальтическим насосом Masterflex, в 10-литровый ферментер, содержащий 9 л описанной выше жидкой среды. Если это не оговорено особо, то все непрерывные реакции ферментации проводили в 10-литровых ферментерах Biostat модели C-DCU, поставляемых от Sartorius Stedim Biotech, Germany. Поток газа и профили перемешивания, а также модификацию, проводимую вручную, или комбинацию этих процедур регулировали в целях сохранения жизнеспособности и активности микробных культур, как было определено по профилям поглощения газа, ОП и продукта. Среднее время удерживания клеток (MCRT) ежедневно по уравнению MCRT=15/ОП. Жидкую среду, взятую из бутыли, стерилизовали на фильтре при добавлении в ферментер. Все реакции ферментации в 10-литровых ферментерах проводили под давлением выше атмосферного, а величины давления представляли собой величины манометрического давления, если это не оговорено особо. Затем проводили непрерывный мониторинг отходящего газа, поступающего из ферментера, на масс-спектрометре для измерения поглощения CO и водорода. Концентрацию продуктов-метаболитов в ферментере анализировали на газовом хроматографе, снабженном плазменно-ионизационным детектором.
Пример 1
Посевную культуру, содержащую Clostridium coskatii и полученную из криогенных маточных растворов микроорганизма, депонированного в ATCC No. PTA-10522 и описанного в патенте США 8143037, культивировали в сосуде для посева, а затем вводили в ферментер для проведения непрерывной реакции ферментации в соответствии с общими процедурами, описанными выше. В начале эксперимента (час 0) основная жидкая среда, вводимая в ферментер, содержала цистеин в молярной концентрации 0,6 мМ, которая приблизительно в 0,5 раз превышала типичную эталонную молярную концентрацию цистеина, который служил в качестве единственного источника серы, добавляемого в ферментер. Кроме того, в жидкую среду добавляли 1,2 мМ метабисульфита (в среднем 0,2 мМ/день/ОП) так, чтобы обеспечивалось 2Х-добавление атомов серы вместе с введением 1,2 мМ серина, которое обеспечивало 1Х-добавление аминокислотного компонента. В этом эксперименте DTPA использовали в качестве хелатообразующего агента в концентрации 0,79 г/л. На протяжении всего эксперимента поток газа имел относительно постоянную скорость, варьирующуюся приблизительно в пределах 100-300 мл/мин, и волюметрический состав: 34% CO, 8% CO2, 43% H2 и 13% CH4. Количество добавляемой основной жидкой среды варьировалось в пределах приблизительно 1,6-3,0 л в день. На протяжении всего эксперимента давление поддерживали на уровне 910 мбар, а температура оставалась постоянной и составляла приблизительно 37°C. Через 185 ч проведения эксперимента из 10-литровой бутыли брали основную жидкую среду, которая уже не содержала цистеина. Через 688 ч концентрацию серина снижали до 0,5X, а затем через 808 ч до 0. pH в ферментере сначала поддерживали приблизительно на уровне 5,3, а затем через 185 ч рН снижали до тех пор, пока он не достигал величины приблизительно 4,5 примерно на 288-й час. Затем его снова доводили до значения 4,8 приблизительно на 330-й час и поддерживали в пределах 4,8-4,5 приблизительно в течение 800 ч.
На фиг. 1 представлены рабочие величины для фазы эксперимента, продолжающейся от 0 до 900 ч. Перемешивание проводили со скоростью, варьирующейся приблизительно от 290 до 475 об/мин для соответствующей коррекции KLa в целях стабилизации поглощения газа. На фиг. 1 проиллюстрировано относительно стабильное поглощение CO в этой фазе эксперимента и показана хорошая утилизация CO в отсутствии цистеина. Эта фаза эксперимента продемонстрировала в целом хорошую утилизацию водорода, на что указывал высокий уровень его поглощения на протяжении почти всего времени прохождения реакции ферментации. После полного удаления серина на 808-й час в остальных фазах эксперимента наблюдалось снижение уровня поглощения CO и водорода. Колориметрический анализ отходящего газа показал, что концентрация сульфида составляла от 0 до 1350 м.д. Через 808 ч параметры эксперимента становились нестабильными, и после безуспешных попыток их стабилизации, эксперимент прекращали.
На фиг. 2 представлен график выхода продуктов в течение фазы эксперимента, продолжающейся от 0 до 900 ч. Вообще говоря, несмотря на удаление цистеина из жидкой питательной среды результаты анализа продукта указывали на высокую концентрацию этанола в ферментере на протяжении всей фазы эксперимента. Полученные данные также указывали на относительно низкий уровень продуцирования свободной уксусной кислоты и общего ацетата. На протяжении всей фазы эксперимента уровень продуцирования бутанола и бутирата был ниже детектируемого предела газового хроматографа (~0,1 г/л).
Пример 2
Посевную культуру, содержащую Clostridium coskatii и полученную из того же самого криогенного маточного раствора, который был описан в примере 1, вводили в ферментер для проведения непрерывной реакции ферментации. В начале проведения эксперимента жидкая среда, вводимая в ферментер, содержала цистеин в молярной концентрации 0,96 мМ, которая обеспечивала нормализованную молярную 0,8Х-концентрацию серы, добавляемой в ферментер (~0,064 мМ/день/ОП). Газ в ферментер подавали сначала со скоростью приблизительно 100 мл/мин, и затем скорость постепенно увеличивали примерно в течение 200 ч до достижения величины приблизительно 200 мл/мин и в остальное время эксперимента поддерживали в пределах приблизительно от 190 до 200 мл/мин. Газ имел волюметрический состав: 34% CO, 10% CO2, 43% H2 и 12% CH4.
Количество добавляемой основной жидкой среды варьировалось в пределах приблизительно 1,7-2,9 л в день. В этом эксперименте DTPA использовали в качестве хелатообразующего агента в концентрации 0,79 г/л. На протяжении всего эксперимента давление поддерживали на уровне 910 мбар, а температура оставалась равной приблизительно 37°C. На протяжении всего эксперимента рН сбраживаемой среды поддерживали приблизительно на уровне 5,3. Приблизительно через 250 ч в жидкую среду добавляли тиосульфат в концентрации 1,9 мМ для обеспечения 1,6X-добавления тиосульфата в качестве биологически доступной серы. Кроме того, в то же самое время в жидкую среду добавляли 1,2 мМ (~0,8 мМ/день/ОП) L-серина для обеспечения 1X-уровня аминокислотного компонента и L-метионина в концентрации 0,02 мМ/день/ОП для обеспечения 0,25X-уровня другого аминокислотного компонента. Эти условия были созданы до удаления цистеина приблизительно на 260-й час для акклиматизации культур к новому источнику серы. Данный эксперимент продолжали в течение приблизительно 200 ч со снижением расхода водорода. Приблизительно на 457-й час снова добавляли цистеин в концентрации 0,6 мМ для достижения 0,5Х-концентрации (0,48 мМ/день/ОП), а добавление тиосульфата прекращали. Расход водорода продолжал снижаться до тех пор, пока величина такого расхода, примерно на 540-й час, не достигала приблизительно 18 ммоль/ч, после чего расход водорода быстро повышался приблизительно до 160 ммоль/ч примерно на 600-й час. Поглощение CO достигало максимальной величины приблизительно 200 ммоль/ч примерно на 260-й час, а затем снижалось приблизительно до 170-140 ммоль/ч и оставалось на этом уровне до конца эксперимента.
Были проанализированы продукты-метаболиты в сбраживаемой среде. Концентрация этанола возрастала, в основном, линейно до тех пор, пока она не достигала своего максимального значения, составляющего приблизительно от 16 до 18 г/л за период времени 250-430 ч, а затем снижалась приблизительно до 11 г/л приблизительно на 575-й час. Концентрация общего ацетата оставалась на уровне 6-8 г/л в течение приблизительно 90-275 ч, а затем приблизительно на 390-й час снижалась до значения ниже 2 г/л, и оставалась на этом уровне до конца эксперимента. Полученные данные также указывали на относительно низкий уровень продуцирования свободной уксусной кислоты, то есть ниже 2 г/л в течение всего эксперимента. На протяжении всего эксперимента по ферментации уровень продуцирования бутанола и бутирата был ниже детектируемого предела газового хроматографа (~0,1 г/л). Колориметрический анализ отходящего газа также показал, что концентрация сульфида составляла 20-360 м.д.
Пример 3
В этом примере описан новый эксперимент, который проводили с использованием партии культуры, полученной по окончании эксперимента, описанного в примере 2. В начале этого эксперимента (час 0) основная жидкая среда, вводимая в ферментер, содержала цистеин в концентрации 0,6 мМ (~0,03 мМ/день/ОП), которая обеспечивала типичную основную эталонную 0,5Х-концентрацию, а именно стандартную молярную концентрацию цистеина. Кроме того, в жидкую среду добавляли 2,4 мМ метабисульфита в начале проведения эксперимента, что обеспечивало 4Х-добавление атомов серы. Кроме того, в начале проведения эксперимента к основной жидкой среде добавляли L-метионин в концентрации 0,30 мМ для обеспечения 0,25X-добавления серной аминокислоты, после чего к основной среде добавляли серин в средней концентрации 1,2 мМ (~0,066 мМ/день/ОП), что обеспечивало 1X-добавление аминокислоты, не содержащей серу. В этом эксперименте использовали хелатообразующий агент DTPA, то есть диэтилентриаминпентауксусную кислоту, в концентрации 0,079 г/л. Добавление цистеина и метионина к основной жидкой среде прекращали приблизительно через 185 ч. Приблизительно на 360-й час к основной жидкости добавляли 1,2 мМ метабисульфита, что обеспечивало 2Х-добавление серы. Приблизительно на 670-й час к основной жидкой среде добавляли сернистую кислоту в концентрации 0,6 мМ (~0,04 мМ/день/ОП), что обеспечивало 0,5X-добавление серы с использованием сернистой кислоты, а концентрацию метабисульфита снижали с 1,2 мМ до 0,6 мМ, что обеспечивало 1X-добавление серы с использованием метабисульфита. Затем добавление метабисульфита к основной жидкой среде прекращали приблизительно на 800-й час, и в это время концентрацию сернистой кислоты увеличивали до 1,2 мМ, что обеспечивало 1X-добавление серы посредством сернистой кислоты. Концентрацию добавляемой сернистой кислоты снижали в среднем до 0,6 мМ (~0,04 мМ/день/ОП) на 1000-й час, что обеспечивало 0,5X-добавление общей серы. На протяжении всего эксперимента поток газа оставался относительно постоянным, и его скорость на 1080-й час составляла 180 мл/мин, после чего его скорость снижали приблизительно до значения 130 мл/мин, а затем увеличивали до значения приблизительно 260 мл/мин в целях повышения стабильности эксперимента. Этот газ имел волюметрический состав: 34% CO, 8% CO2, 44% H2 и 13% CH4. После стабилизации условий эксперимента количество добавляемой основной жидкой среды варьировалось в пределах приблизительно 2,5-3,3 л в день. На протяжении всего эксперимента, давление поддерживали на уровне 910 мбар, а температура оставалась равной приблизительно 37°C. pH в ферментере сначала поддерживали приблизительно на уровне 5,3 примерно на 1080-й час, а затем рН поддерживали на уровне 4,8-4,9.
На фиг. 3 представлены рабочие величины для фазы эксперимента, продолжающейся от 0 до 1300 ч. Перемешивание проводили со скоростью, варьирующейся в узком интервале от 405 до 480 об/мин на протяжении почти всей фазы эксперимента. На фиг. 3 проиллюстрировано достаточно стабильное поглощение CO на этой фазе эксперимента и показана хорошая утилизация CO в отсутствии цистеина или любой другой аминокислоты. Эта фаза эксперимента продемонстрировала в целом хорошую утилизацию водорода, на что указывал высокий уровень его поглощения на протяжении почти всего времени прохождения реакции ферментации. Поглощение водорода также оставалось относительно стабильным вплоть до 900-го часа, а затем уровень поглощения водорода снижался и, в конечном счете, становился нестабильным. Колориметрический анализ отходящего газа также показал, что концентрация сульфида почти на всем протяжении эксперимента составляла в пределах от 60 до 2600 м.д.
На фиг. 4 представлен график выхода продуктов в течение фазы эксперимента, продолжающейся от 0 до 1300 ч. Концентрации продуктов-метаболитов в ферментере анализировали методами, описанными выше. Вообще говоря, несмотря на удаление цистеина результаты анализа продукта указывали на высокий титр этанола в ферментере на протяжении всей фазы эксперимента с добавлением метабисульфита или сернистой кислоты. Как показано на фиг. 4, после стабилизации условий эксперимента наблюдался относительно низкий уровень продуцирования уксусной кислоты и общего ацетата на протяжении почти всего эксперимента. Во время всего эксперимента уровень продуцирования бутанола и бутирата был ниже детектируемого предела газового хроматографа (~0,1 г/л).
Пример 4
Посевную культуру, содержащую Clostridium coskatii и полученную из тех же самых криогенных маточных растворов, которые были описаны в примере 1, культивировали в сосуде для посева, а затем вводили в ферментер для проведения непрерывной реакции ферментации в соответствии с общими процедурами, описанными выше. В начале эксперимента (час 0) основная жидкая среда, вводимая в ферментер, содержала серин в средней концентрации 1,2 мМ (~0,14 мМ/день/ОП), что обеспечивало 1Х-концентрацию аминокислотного компонента. Кроме того, в жидкую среду добавляли в среднем 0,6 мМ (~0,06 мМ/день/ОП) метабисульфита, что обеспечивало 1Х-добавление атомов серы, и посевную культуру культивировали на метабисульфите без добавления цистеина. В этом эксперименте DTPA использовали в качестве хелатообразующего агента в концентрации 0,79 г/л. Поток газа увеличивали приблизительно в первые 120 ч приблизительно до 140 мл/мин и поддерживали в пределах 140-200 мл/мин в первые 500 ч, а затем увеличивали приблизительно до 300 мл/мин, и на этом уровне он сохранялся в остальное время эксперимента. Газ имел волюметрический состав: 34% CO, 8% CO2, 44% H2 и 13% CH4. Количество добавленной основной жидкой среды варьировалось в пределах приблизительно 1-3,6 л в день. На протяжении всего эксперимента манометрическое давление увеличивали в первые 100 ч, а затем поддерживали на уровне 930 мбар, а температура оставалась равной приблизительно 37°C. На 337-й час концентрацию добавляемого серина снижали до 0,6 мМ для обеспечения 0,5Х-концентрации, а затем до 0 приблизительно на час 500. На час 337, концентрацию добавляемого метабисульфита снижали в среднем до 0,3 мМ (~0,04 мМ/день/ОП) для обеспечения 0,5Х-добавления атомов серы. Приблизительно на час 650 концентрацию добавляемого метабисульфита повышали в среднем до 0,5 мМ для обеспечения 0,8Х-добавления атомов серы. На протяжении этой фазы эксперимента рН в ферментере поддерживали приблизительно на уровне 4,8.
На фиг. 5 представлены рабочие величины для фазы эксперимента, продолжающейся от 0 до 760 ч. После получения первоначальной линейно возрастающей характеристики, скорость перемешивания в этом эксперименте была относительно постоянной и составляла 400 об/мин. На фиг. 5 проиллюстрировано относительно стабильное поглощение CO на этой фазе эксперимента, причем сначала скорость поглощения CO в потоке газа составляла в пределах 140-200 мл/мин, а затем через 500 ч она снова увеличивалась, если скорость потока газа поддерживалась на уровне 300 мл/мин. Поглощение водорода также оставалось относительно стабильным сначала на более низких величинах, а затем повышалось до более высоких величин, что соответствовало изменению скорости потока газа. Такая хорошая утилизация СО и водорода наблюдалась при полном отсутствии цистеина в жидкой среде. Колориметрический анализ отходящего газа также показал, что концентрация сульфида в потоке отходящего газа составляла в пределах от 0 до 600 м.д.
На фиг. 6 представлен график выхода продуктов в течение фазы эксперимента, продолжающейся от 0 до 760 ч. Вообще говоря, несмотря на прекращение добавления цистеина к жидкой питательной среде результаты анализа продукта указывали на высокую концентрацию этанола в ферментере на протяжении всей фазы эксперимента. Несмотря на полное прекращение добавления серина концентрация этанола значительно увеличивалась по мере увеличения скорости потока газа. Полученные данные также указывали на очень низкий уровень продуцирования свободной уксусной кислоты и общего ацетата в начальной фазе эксперимента, но на более высокие их концентрации по мере увеличения скорости потока газа, а также удаление серина по мере увеличения концентрации ацетата. На протяжении всей фазы эксперимента уровни продуцирования бутанола и бутирата были ниже 0,3 г/л.
Пример 5
Посевную культуру, содержащую штамм PETC Clostridium ljungdahlii, полученный из ATCC и имеющий рег. номер ATCC 55383, культивировали в сосуде для посева, а затем вводили в ферментер для проведения непрерывной реакции ферментации в соответствии с общими процедурами, описанными выше. В начале эксперимента (час 0) основная жидкая среда, вводимая в ферментер, содержала цистеин в средней концентрации 1,2 мМ (~0,4 мМ/день/ОП), что обеспечивало 1Х-концентрацию аминокислотного компонента и серного компонента. Кроме того, на час 533 в жидкую среду добавляли метабисульфит в средней концентрации 0,3 мМ (~0,03 мМ/день/ОП), что обеспечивало 0,25Х-добавление метабисульфита и 0,5Х-добавление атомов серы. В этом эксперименте DTPA использовали в качестве хелатообразующего агента в концентрации 0,79 г/л. На этой фазе эксперимента скорость потока газа увеличивали приблизительно в первые 200 ч приблизительно до 200 мл/мин и поддерживали приблизительно в пределах 200-250 мл/мин в остальное время эксперимента. Газ имел волюметрический состав: 29-31% CO, 18-19% CO2, 39-41% H2 и 11% метана. После стабилизации условий эксперимента количество добавляемой основной жидкой среды варьировалось в пределах приблизительно 2-2,9 л в день. На протяжении всей фазы эксперимента давление увеличивали в первые 30 ч, а затем поддерживали на уровне 930 мбар, а температура оставалась равной приблизительно 37°C. На час 644 добавление цистеина прекращали. На час 700 концентрацию добавляемого метабисульфита повышали в среднем до 0,4 мМ (~0,04 мМ/день/ОП), что обеспечивало 0,35Х-добавление. Приблизительно на час 920 концентрацию добавляемого метабисульфита повышали в среднем до 0,5 мМ (~0,07 мМ/день/ОП) для обеспечения 0,45Х-добавления и поддерживали на этом уровне в остальной фазе эксперимента. pH в ферментере сначала поддерживали приблизительно на уровне 5,3 примерно на час 814, а затем постепенно снижали до 5,0 приблизительно на час 900 и оставляли на уровне 4,9-5,1 в остальной фазе эксперимента.
На фиг. 7 представлены рабочие величины для фазы эксперимента, продолжающейся от 0 до 1150 ч. После получения первоначальной линейно возрастающей характеристики скорость перемешивания в этом эксперименте была относительно постоянной и составляла 400-425 об/мин. На фиг. 7 проиллюстрировано в высокой степени стабильное поглощение CO и водорода сразу после начала проведения эксперимента и вплоть до часа 900. Поглощение CO было стабильным и сохранялось в течение 250 ч после полного прекращения добавления цистеина. Поглощение водорода также оставалось относительно стабильным в течение 200 ч после полного прекращения добавления цистеина. Колориметрический анализ отходящего газа также показал, что концентрация сульфида водорода составляла в пределах от 0 до 350 м.д.
На фиг. 8 представлен график выхода продуктов во время фазы эксперимента, продолжающейся 1150 ч. Результаты анализа продукта показали, что в ферментере продолжалось продуцирование очень высоких титров объединенных продуктов этанола и ацетата. Было также отмечено, что удаление цистеина, вероятно, способствует повышению селективности ферментера в отношении продуцирования этанола. Полученные данные, за исключением выброса свободной уксусной кислоты приблизительно на час 500, также указывали на относительно низкий уровень продуцирования свободной уксусной кислоты во время всего эксперимента. Такой выброс уксусной кислоты совпадал по времени с переходом цистеина как источника серы на метабисульфит, который также является источником серы. На протяжении всей фазы эксперимента уровни продуцирования бутанола и бутирата были ниже 0,22 г/л.
Пример 6
Посевную культуру, содержащую Clostridium coskatii, полученную из того же самого криогенного маточного раствора, который был описан в примере 1, культивировали в сосуде для посева, а затем вводили в ферментер для проведения непрерывной реакции ферментации в соответствии с общими процедурами, описанными выше. В начале эксперимента (час 0) основная жидкая среда, вводимая в ферментер, содержала цистеин в средней концентрации 1,2 мМ (~0,14 мМ/день/ОП), что обеспечивало 1Х- концентрацию аминокислотного компонента и серного компонента. На час 172 концентрацию цистеина снижали в среднем до 0,24 мМ (~0,02 мМ/день/ОП), что обеспечивало 0,2Х-добавление серы в среду, а добавление сернистой кислоты в жидкую среду начинали при средней концентрации 0,3 мМ (~0,03 мМ/день/ОП), что соответствовало 0,25Х-добавлению атомов серы. В этом эксперименте DTPA использовали в качестве хелатообразующего агента в концентрации 0,79 г/л. Скорость потока газа увеличивали приблизительно в первые 150 ч приблизительно до 200-230 мл/мин и поддерживали на этом уровне в течение всего эксперимента. Газ имел волюметрический состав: 29-31% CO, 18-19% CO2, 39-41% H2 и 11-12% СН4. После стабилизации условий эксперимента, количество добавляемой основной жидкой среды варьировали в пределах приблизительно 2,8-2,9 л в день приблизительно до часа 511, а затем его увеличивали приблизительно до 3,3-3,4 л в день. На протяжении всей фазы эксперимента давление увеличивали в первые 50 ч, а затем поддерживали на уровне 930 мбар, а температура оставалась равной приблизительно 37°C. На час 283 концентрацию добавляемого цистеина снижали до 0, а концентрацию добавляемой сернистой кислоты повышали в среднем до 0,6 мМ (~0,07 мМ/день/ОП) так, чтобы обеспечивалось 0,5Х-добавление серы в остальной части эксперимента. pH в ферментере поддерживали приблизительно на уровне 5,3 примерно на час 350, а затем снижали приблизительно до 5,0 на час 450 и оставляли на уровне 4,9-4,6 на протяжении этой фазы эксперимента.
На фиг. 9 представлены рабочие величины для фазы эксперимента, продолжающейся от 0 до 788 ч. После получения первоначальной линейно возрастающей характеристики, скорость перемешивания в этом эксперименте поддерживалась в пределах 420-435 об/мин. На фиг. 9 проиллюстрировано относительно стабильное поглощение CO в течение 200 ч, когда ферментация была стабилизирована после замены источника серы и удаления цистеина. После стабилизации реакции ферментации уровень поглощения водорода оставался относительно высоким почти до самого конца эксперимента. Таким образом, было обнаружено, что хорошая утилизация СО и водорода происходила после удаления цистеина из жидкой среды. Колориметрический анализ отходящего газа также показал, что концентрация сульфида водорода составляла в пределах от 0 до 153 м.д.
На фиг. 10 представлен график выхода продукта во время фазы эксперимента, продолжающейся от 0 до 788 ч. Результаты анализа продукта указывали на высокую концентрацию этанола в ферментере в первые 200 ч. Концентрация этанола в ферментере оставалась такой же высокой после удаления цистеина из жидкой среды и сохранялась на том же уровне вплоть до окончания эксперимента. Полученные данные также указывали на высокую концентрацию свободной уксусной кислоты и общего ацетата в начальной фазе эксперимента и на последующее их снижение по мере увеличения концентрации этанола. На протяжении всей фазы эксперимента уровни продуцирования бутанола и бутирата были ниже детектируемого предела ГХ.
Пример 7
Посевную культуру, содержащую Clostridium coskatii, полученную из того же самого криогенного маточного раствора, который был описан в примере 1, культивировали в сосуде для посева, а затем вводили в ферментер для проведения непрерывной реакции ферментации в соответствии с общими процедурами, описанными выше. В начале эксперимента (час 0) основная жидкая среда, вводимая в ферментер, содержала цистеин в средней концентрации 1,2 мМ, в результате чего обеспечивалась 1Х- концентрация аминокислотного компонента и серного компонента. На 172-й час концентрацию добавляемого цистеина снижали в среднем до 0,24 мМ в целях обеспечения 0,2Х-добаления серы в жидкую среду, а добавление бисульфита в жидкую среду начинали при средней концентрации приблизительно 0,4 мМ (~0,04 мМ/день/ОП), так, чтобы обеспечивалось 0,33Х-добавление атомов серы. В этом эксперименте в часы 0-818 использовали DTPA в качестве хелатообразующего агента в концентрации 0,79 г/л. На час 818 хелатообразующий агент не использовали. В это время скорость потока газа увеличивали приблизительно до 230 мл/мин и поддерживали на уровне 200-250 мл/мин приблизительно до часа 800, после чего ее доводили приблизительно до 300 мл/мин и оставляли на этом уровне в течение всей остальной фазы эксперимента. Газ имел волюметрический состав: 29-31% CO, 18-19% CO2, 39-41% H2 и 11-12% СН4. После стабилизации условий эксперимента количество добавляемой основной жидкой среды варьировали в пределах приблизительно 2,5-2,9 л в день приблизительно до часа 509, а затем повышали приблизительно до значения 3,3-3,4. На протяжении всей фазы эксперимента давление увеличивали в первые 50 ч, а затем поддерживали на уровне 930 мбар, а температура оставалась равной приблизительно 37°C. На час 283 концентрацию добавляемого цистеина снижали до 0, а уровень добавляемого бисульфита повышали в среднем до 0,8 мМ (~0,1 мМ/день/ОП) в целях достижения 0,66Х-концентрации до часа 988, а затем повышали приблизительно до 1,6 мМ (~0,2 мМ/день/ОП) в целях достижения 1,33Х-концентрации в остальной фазе эксперимента. pH в ферментере поддерживали на уровне 5,3 примерно на час 400, а затем снижали приблизительно до 5,0 на час 620 и оставляли на уровне 4,7 на протяжении остальной фазы эксперимента.
На фиг. 11 представлены рабочие величины для фазы эксперимента, продолжающейся от 0 до 1100 ч. После получения первоначальной линейно возрастающей характеристики скорость перемешивания в этом эксперименте оставалась в пределах 400-435 об/мин. На фиг. 9 показан высокий уровень поглощения СО в ферментере приблизительно на час 200 наряду с общим увеличением уровня поглощения СО на протяжении всей фазы эксперимента даже после удаления цистеина. Уровень поглощения водорода, по существу, соответствовал уровню поглощения СО но с большей вариабельностью, причем оценка поглощения того и другого продемонстрировала способность ферментера утилизовать еще больший поток газа без постоянного добавления цистеина в жидкую среду. Через 1100 ч уровень поглощения СО и водорода резко снижался, после чего эксперимент прекращали. Колориметрический анализ отходящего газа также показал, что концентрация сульфида водорода составляла в пределах от 17 до 206 м.д. На фиг. 12 представлен график выхода продукта в той же самой фазе эксперимента. Результаты анализа продуктов показали, что в первые 200 ч в ферментере продуцировался этанол в высокой концентрации. Концентрация этанола в ферментере оставалась на том же самом высоком уровне после удаления цистеина из жидкой среды и вплоть до окончания этой фазы эксперимента, когда условия эксперимента становились нестабильными. Полученные данные также указывали на высокую концентрацию свободной уксусной кислоты и общего ацетата в начале этой фазы эксперимента, и эта концентрация снижалась по мере повышения концентрации этанола.
Пример 8
Посевную культуру, содержащую Clostridium coskatii, полученную из того же самого криогенного маточного раствора, который был описан в примере 1, культивировали в сосуде для посева, а затем вводили в ферментер для проведения непрерывной реакции ферментации в соответствии с общими процедурами, описанными выше. В начале эксперимента (час 0) основная жидкая среда, вводимая в ферментер, содержала цистеин в средней концентрации 1,2 мМ, что обеспечивало 1Х-концентрацию аминокислотного компонента и серного компонента. На 172-й час концентрацию добавляемого цистеина снижали в среднем приблизительно до 0,24 мМ для обеспечения 0,2Х-добавления серы в жидкую среду, а добавление метабисульфита в жидкую среду начинали при средней концентрации приблизительно 0,3 мМ (~0,03 мМ/день/ОП) для обеспечения 0,25Х-добавления атомов серы. В этом эксперименте в часы 0-796 использовали DTPA в качестве хелатообразующего агента в концентрации 0,79 г/л. На час 796 хелатообразующий агент не использовали. В это время скорость потока газа доводили приблизительно до 230 мл/мин и поддерживали на уровне 180-230 мл/мин приблизительно до часа 800, после чего эту скорость доводили приблизительно до 300 мл/мин и оставляли на этом уровне в течение всей остальной фазы эксперимента. Газ имел волюметрический состав: 29-31% CO, 18-19% CO2, 39-41% H2 и 11-12% СН4. После стабилизации условий эксперимента количество добавляемой основной жидкой среды варьировали в пределах приблизительно 2,5-2,9 л в день приблизительно в первые 500 ч, а затем повышали приблизительно до 3,3-4,0 л в день. Добавление основной жидкой среды варьировали в пределах приблизительно 2,2-3,0 л в день. На протяжении всей фазы эксперимента давление увеличивали в первые 50 ч, а затем поддерживали на уровне 930 мбар, а температура оставалась равной приблизительно 37°C. На час 283 концентрацию добавляемого цистеина снижали до 0. На час 340 концентрацию добавляемого метабисульфита повышали в среднем приблизительно до 0,4 мМ (~0,06 мМ/день/ОП) для обеспечения 0,35Х-добавления метабисульфита и 0,7Х-добавления серы на час 548, а затем концентрацию повышали приблизительно до 0,54 мМ для обеспечения 0,45Х-добавления метабисульфита и 0,9Х-добавления серы в остальной фазе эксперимента. pH в ферментере поддерживали на уровне приблизительно 5,3 примерно на час 170, а затем повышали приблизительно до 5,4 примерно на час 215, после чего снова снижали до 5,3 и оставляли на этом уровне приблизительно до часа 360, а затем постепенно снижали до 4,5-4,7 на протяжении остальной фазы эксперимента.
На фиг. 13 представлены рабочие величины для фазы эксперимента, продолжающейся от 0 до 950 ч. После получения первоначальной линейно возрастающей характеристики, скорость перемешивания на этой фазе эксперимента оставалась в пределах 390-420 об/мин. На фиг. 13 показан высокий уровень поглощения СО и водорода в ферментере приблизительно на час 173. Поглощение СО и водорода поддерживалось на протяжении всей фазы эксперимента даже после удаления цистеина. Уровень поглощения водорода, по существу, соответствовал уровню поглощения СО, но с большей вариабельностью, причем оценка поглощения того и другого продемонстрировала способность ферментера утилизовать еще больший поток газа без постоянного добавления цистеина в жидкую среду. Через 1100 ч уровень поглощения СО и водорода резко снижался, после чего эксперимент прекращали. Колориметрический анализ отходящего газа также показал, что концентрация сульфида водорода составляла в пределах от 18 до 200 м.д. На фиг. 14 представлен график выхода продуктов в той же самой фазе эксперимента. Результаты анализа продукта показали, что в ферментере продуцировался этанол в высокой концентрации в первые 200 ч. Концентрация этанола в ферментере оставалась на том же самом высоком уровне после удаления цистеина из жидкой среды и вплоть до окончания этой фазы эксперимента, когда условия эксперимента становились нестабильными. Полученные данные также указывали на высокую концентрацию свободной уксусной кислоты и общего ацетата в начале этой фазы эксперимента, и эта концентрация снижалась по мере повышения концентрации этанола. Во время всего эксперимента уровень продуцирования бутанола и бутирата был ниже детектируемого предела газового хроматографа (~0,1 г/л).
Пример 9
Посевную культуру, содержащую Clostridium autoethanogenum, полученную из Коллекции микроорганизмов DSMZ и имеющую DSM No. 10061, культивировали в сосуде для посева, а затем вводили в ферментер для проведения непрерывной реакции ферментации в соответствии с общими процедурами, описанными выше. В начале эксперимента (час 0) основная жидкая среда, вводимая в ферментер, содержала цистеин в средней концентрации 1,2 мМ, что обеспечивало 1Х-концентрацию аминокислотного компонента и серного компонента. На час 150 концентрацию добавляемого цистеина снижали в среднем приблизительно до 0,24 мМ для обеспечения 0,2Х-добавления серы цистеина в жидкую среду, а добавление метабисульфита в жидкую среду начинали при средней концентрации приблизительно 0,3 мМ (~0,04 мМ/день/ОП) для обеспечения 0,5Х-добавления атомов серы. В этом эксперименте DTPA использовали в качестве хелатообразующего агента в концентрации 0,79 г/л. На час 144 скорость потока газа доводили приблизительно до 220 мл/мин и поддерживали на уровне 220-240 мл/мин приблизительно до часа 500, после чего условия эксперимента становились нестабильными, и эксперимент прекращали. Газ имел средний волюметрический состав: 29-30% CO, 17-19% CO2, 39-41% H2 и 11-12% СН4. Добавление основной жидкой среды варьировали в пределах приблизительно 2,8-2,9 л в день. На протяжении всей фазы эксперимента давление увеличивали в первые 30 ч, а затем поддерживали на уровне 930 мбар, а температура оставалась равной приблизительно 37°C. На час 262 концентрацию добавляемого цистеина снижали до 0. pH в ферментере поддерживали на уровне приблизительно 5,3 примерно на час 431, а затем постепенно снижали приблизительно до 4,9 на протяжении этой фазы эксперимента.
На фиг. 15 представлены рабочие величины для фазы эксперимента, продолжающейся от 0 до 900 ч. После получения первоначальной линейно возрастающей характеристики скорость перемешивания на этой фазе эксперимента оставалась в пределах 415-425 об/мин. На фиг. 15 показан наивысший уровень поглощения СО и водорода в ферментере приблизительно на час 150, причем этот уровень снижался, но все же оставался высоким и стабильным на протяжении остальной фазы эксперимента даже после удаления цистеина. Поглощение водорода, по существу, соответствовало поглощению СО, но с большей вариабельностью, причем оценка поглощения того и другого продемонстрировала способность ферментера утилизовать большой поток газа без добавления цистеина в жидкую среду. Через 550 ч уровень поглощения СО и водорода резко снижался, после чего эксперимент прекращали. Колориметрический анализ отходящего газа также показал, что концентрация сульфида водорода составляла в пределах от 0 до 335 м.д. На фиг. 16 представлен график выхода продуктов в той же самой фазе эксперимента. Результаты анализа продукта показали, что в ферментере продуцировался этанол в высокой концентрации в первые 200 ч. Концентрация этанола в ферментере оставалась на том же самом высоком уровне после удаления цистеина из жидкой среды и вплоть до окончания этой фазы эксперимента, когда условия эксперимента становились нестабильными. Полученные данные также указывали на высокую концентрацию общего ацетата в начале этой фазы эксперимента, и эта концентрация снижалась по мере повышения концентрации этанола. На протяжении почти всей фазы эксперимента уровни продуцирования бутанола и бутирата были ниже детектируемого предела ГХ.
Пример 10
Посевную культуру, содержащую бактерию Clostridium coskatii, полученную из того же самого криогенного маточного раствора, который был описан в примере 1, культивировали в сосуде для посева, а затем вводили в ферментер для проведения непрерывной реакции ферментации в соответствии с общими процедурами, описанными выше, за исключением того, что данный ферментер представляя собой Biostat B Plus, а давление составляло 1 атмосферу. В начале эксперимента (час 0) основная жидкая среда в сосуде содержала 0,12 мМ бисульфита, что обеспечивало 0,1Х-добавление серы, и не содержала цистеина, кроме того цистеина, который присутствовал в культуре, перенесенной из сосуда для посева. В этом эксперименте питательная среда содержала бисульфит в концентрации 0,6 мМ, что обеспечивало 0,5Х-добавление атомов серы. В этом эксперименте в часы 0-318 использовали DTPA в качестве хелатообразующего агента в концентрации 0,79 г/л. На час 318 хелатообразующий агент не использовали. В это время скорость потока газа быстро доводили до 100 мл/мин и на час 242 ее доводили до 200 мл/мин и поддерживали на этом уровне в первые 600 ч данной фазы эксперимента. Газ имел средний волюметрический состав: 29-30% CO, 17-18% CO2, 40-41% H2 и 11% СН4. Количество добавляемой основной жидкой среды поддерживали приблизительно на уровне 1 л в день до часа 313, а затем доводили до 2 л в день в остальной фазе эксперимента. На протяжении всего эксперимента ферментер работал под давлением окружающей среды. Температуру поддерживали приблизительно при 37°C. pH в ферментере поддерживали на уровне приблизительно 5,3 примерно на час 214, а затем снижали приблизительно до 4,9 на протяжении остальной фазы эксперимента.
На фиг. 17 представлены рабочие величины для фазы эксперимента, продолжающейся от 0 до 600 ч. После начала проведения эксперимента перемешивание в ферментере ускоряли от 375 до 450 об/мин до часа 195, а затем скорость перемешивания снижали до 430 об/мин приблизительно за 20 ч, после чего ее постепенно увеличивали приблизительно до часа 350 до тех пор, пока она не достигала значений 425-520, и поддерживали на этом уровне в остальной фазе описанного эксперимента. На фиг. 17 показано устойчивое повышение уровня поглощения СО и водорода в ферментере, которое достигало своего пика приблизительно на час 350 и снижалось в остальной фазе эксперимента. Через 600 ч условия эксперимента становились нестабильными, и этот эксперимент быстро прекращали.
На фиг. 18 представлен график выхода продуктов в той же самой фазе эксперимента. Результаты анализа продукта показали, что в ферментере продуцировался этанол в стабильно возрастающей концентрации в течение всей фазы эксперимента. Концентрация этанола в ферментере сохранялась на самом высоком уровне в течение 300 ч. Полученные данные указывали на повышенный первоначальный уровень общего ацетата, который снижался, но оставался стабильным почти до конца этой фазы эксперимента. На протяжении почти всей фазы эксперимента уровни продуцирования бутанола и бутирата были ниже детектируемого предела ГХ. В описанной фазе эксперимента, высокие концентрации С2-оксигенатов могут быть получены, в основном, только при добавлении в сбраживаемую среду бисульфита как источника серы.
Пример 11
Посевную культуру, содержащую бактерию Clostridium coskatii, полученную из того же самого криогенного маточного раствора, который был описан в примере 1, культивировали в сосуде для посева, а затем вводили в ферментер для проведения непрерывной реакции ферментации в соответствии с процедурой, описанной выше в примере 10. В начале эксперимента (час 0) основная жидкая среда, вводимая в ферментер, не содержала цистеина, кроме того цистеина, который присутствовал в культуре, перенесенной из сосуда для посева. Во время этого эксперимента бисульфит в концентрации 0,6 мМ поступал из питательной среды, что обеспечивало 0,5Х-добавление атомов серы. В последние 40 ч этого эксперимента концентрацию добавленного бисульфита доводили до 1Х. В этом эксперименте в часы 0-122 использовали DTPA в качестве хелатообразующего агента в концентрации 0,79 г/л. На час 122 хелатообразующий агент не использовали. В это время скорость потока газа быстро доводили до 100 мл/мин, и на час 177 и в последующие 20 ч ее доводили до 120 мл/мин, на 312-й час ее повышали до 130 мл/мин и поддерживали на этом уровне в остальной фазе эксперимента. Газ имел средний волюметрический состав: 29-30% CO, 18% CO2, 40-41% H2 и 11% СН4. Добавляемую основную жидкую среду поддерживали на уровне приблизительно 1,25 л в день до часа 313, а затем доводили до 1,43 л в день в остальной фазе эксперимента. На протяжении всего эксперимента ферментер работал под давлением окружающей среды. Температуру поддерживали приблизительно при 37°C. pH, за исключением непродолжительного увеличения до 5,1 на час 122, поддерживали на уровне 4,9 до часа 220, а затем снижали до 4,7 приблизительно за 40 ч и приблизительно в час 290 снова доводили до 4,8 в течение остальной фазы эксперимента.
На фиг. 19 представлены рабочие величины для фазы эксперимента, продолжающейся от 0 до 360 ч. Скорость перемешивания быстро увеличивали и сохраняли на уровне 377 об/мин в первые 20 ч эксперимента, а затем на час 232 постепенно повышали до максимального значения 568 об/мин и сохраняли на этом уровне до часа 288, после чего скорость снижали до значения 543 в конце эксперимента. На фиг. 19 показано устойчивое повышение уровня поглощения СО приблизительно на час 200, а затем такое поглощение оставалось на стабильно высоком уровне вплоть до конца эксперимента. Аналогичным образом наблюдалось увеличение поглощения водорода приблизительно на час 200, после чего наблюдались некоторые флуктуации, но этот высокий уровень поглощения сохранялся до конца эксперимента. На фиг. 20 представлен график выхода продуктов в той же самой фазе эксперимента. Результаты анализа продукта показали, что в ферментере продуцировался этанол в стабильно возрастающей концентрации в течение всей фазы эксперимента, и такая концентрация составляла почти 16 г/л на час 300. Полученные данные указывали на повышенный первоначальный уровень общего ацетата, который достигал своих наивысших значений приблизительно на час 100, а затем снижался до 2,5 г/л и оставался на этом уровне вплоть до конца эксперимента. На протяжении почти всей фазы эксперимента, уровни продуцирования бутанола и бутирата были ниже детектируемого предела ГХ. В описанной фазе эксперимента высокие концентрации С2-оксигенатов могут быть получены, в основном, только при добавлении в сбраживаемую среду бисульфита как источника серы при рН значительно ниже 5.
Пример 12
Посевную культуру, содержащую бактерию Clostridium coskatii, полученную из того же самого криогенного маточного раствора, который был описан в примере 1, культивировали в сосуде для посева, а затем вводили в ферментер для проведения непрерывной реакции ферментации в соответствии с вышеописанными процедурами. В начале эксперимента (час 0) основная жидкая среда, вводимая в ферментер, не содержала цистеина, кроме того цистеина, который присутствовал в культуре, перенесенной из сосуда для посева. Во время этого эксперимента бисульфит в концентрации 0,6 мМ поступал из питательной среды, что обеспечивало 0,5Х-добавление серного компонента на час 120. Концентрацию добавленного бисульфита доводили до 0,9 мМ, что обеспечивало 0,75Х-концентрацию приблизительно на час 120 (~0,150 мМ/день/ОП). Концентрацию бисульфита повышали до 1,2 мМ, что обеспечивало 1Х-концентрацию серы на час 224. Количество хелатообразующего агента, используемого в этом эксперименте, составляло 0,018 г/л цитрата натрия. Поток газа сначала подавали со скоростью приблизительно 100 мл/мин, а затем эту скорость постепенно увеличивали, и на час 488 она составляла 400 мл/мин, после чего ее поддерживали на этом уровне до конца эксперимента. Газ имел средний волюметрический состав: 29% CO, 20% CO2, 39% H2 и 11% СН4. Основную жидкую среду добавляли сначала в количестве приблизительно 1,25 л в день на час 26, а затем доводили до 1,63 л в день на час 95, до 2,5 л/день на час 120, до 2,83 л/день на час 153, до 3,31 3,31 л/день на час 177 и до 4 л в день в остальной фазе эксперимента. Ферментер работал под давлением окружающей среды до часа 428, а затем давление повышали до 931. Температуру поддерживали приблизительно при 37°C. pH в начале эксперимента составлял 4,9, а затем его постепенно снижали до 4,5 на час 460 и сохраняли на этом уровне до конца эксперимента.
На фиг. 21 представлены рабочие величины для фазы эксперимента, продолжающейся от 0 до 360 ч. Скорость перемешивания в начале составляла 355, а затем ее постепенно увеличивали до значения 515 на час 295 и сохраняли на этом уровне до конца эксперимента. На фиг. 19 показано устойчивое повышение уровня поглощения СО приблизительно на час 200, а затем такое поглощение оставалось на стабильно высоком уровне вплоть до конца эксперимента. Аналогичным образом наблюдалось увеличение поглощения водорода приблизительно на час 200, после чего наблюдались некоторые флуктуации, но этот высокий уровень поглощения сохранялся до конца эксперимента.
На фиг. 22 представлен график выхода продуктов в той же самой фазе эксперимента. Результаты анализа продукта показали, что в ферментере продуцировался этанол в стабильно возрастающей концентрации в течение всей фазы эксперимента, и такая концентрация составляла почти 20 г/л на час 700. Полученные данные указывали на повышенный первоначальный уровень общего ацетата, который достигал своих наивысших значений приблизительно на час 100, а затем снижался до значения ниже 5 г/л и оставался на этом уровне до конца эксперимента. На протяжении почти всей фазы эксперимента уровни продуцирования бутанола и бутирата были, в основном, равны нулю. В описанной фазе эксперимента высокие концентрации С2-оксигенатов могут быть получены, в основном, только при добавлении в сбраживаемую среду бисульфита как источника серы при рН значительно ниже 5.
Как было описано, изобретение имеет ряд преимуществ, некоторые из которых были описаны выше, а другие являются неотъемлемой частью изобретения. Кроме того, в изобретение могут быть внесены модификации, не выходящие за рамки описанной здесь идеи изобретения. В соответствии с этим объем изобретения ограничен только прилагаемой формулой изобретения.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| СПОСОБ И СРЕДА ДЛЯ ФЕРМЕНТАЦИИ СИНТЕЗ-ГАЗА | 2013 |
|
RU2639525C2 |
| СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ АЦЕТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ НА СИНТЕЗ-ГАЗЕ | 2013 |
|
RU2629997C2 |
| СПОСОБ И СРЕДА ДЛЯ СНИЖЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ СЕЛЕНА В БИОМАССЕ ПОСЛЕ ФЕРМЕНТАЦИИ СОДЕРЖАЩИХ СО ГАЗООБРАЗНЫХ СУБСТРАТОВ | 2014 |
|
RU2654591C2 |
| РЕГУЛИРОВАНИЕ ПРОВОДИМОСТИ В ПРОЦЕССЕ АНАЭРОБНОЙ ФЕРМЕНТАЦИИ | 2014 |
|
RU2639503C2 |
| МИКРООРГАНИЗМЫ ДЛЯ ПОВЫШЕННОГО ПРОДУЦИРОВАНИЯ АМИНОКИСЛОТ И СВЯЗАННЫЕ С НИМИ СПОСОБЫ | 2015 |
|
RU2688486C2 |
| СПОСОБ ФЕРМЕНТАЦИИ ГАЗООБРАЗНОГО СУБСТРАТА, СОДЕРЖАЩЕГО ВОДОРОД | 2011 |
|
RU2573920C2 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСШИХ СПИРТОВ | 2016 |
|
RU2709952C2 |
| ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ | 2017 |
|
RU2758387C2 |
| МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ КОНВЕРСИЯ МЕТАНА | 2014 |
|
RU2658440C2 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА | 2006 |
|
RU2402610C2 |
Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ продуцирования С2-оксигенатов путем анаэробной ферментации с использованием микробной культуры карбоксидотрофного микроорганизма. Способ включает получение серной добавки, контактирование микробной культуры микроорганизма с содержащим монооксид углерода субстратом, поддерживание микробной культуры при рН менее 5,3 в водной сбраживаемой среде, содержащей серную добавку, и выделение одного или более С2-оксигенатов из водной сбраживаемой среды. Причем серная добавка содержит способствующее в водной сбраживаемой среде образованию оксоанионов серы неорганическое соединение серы S(II)-S(IV). Изобретение обеспечивает достижение в зоне ферментации высоких титров этанола, а также необязательное присутствие цистеина в зоне ферментации. 15 з.п. ф-лы, 22 ил., 6 табл., 12 пр.
1. Способ продуцирования С2-оксигенатов путем анаэробной ферментации с использованием микробной культуры карбоксидотрофного микроорганизма, который продуцирует по меньшей мере этанол или бутанол, где указанный способ включает (а) получение серной добавки, включающей неорганическое соединение серы S(II)-S(IV), которое способствует образованию оксоанионов серы, в водной сбраживаемой среде; (b) контактирование указанной микробной культуры микроорганизма с субстратом, содержащим монооксид углерода; и поддерживание указанной микробной культуры в водной сбраживаемой среде, включающей указанную серную добавку, при рН менее 5,3; и (с) выделение одного или более С2-оксигенатов из водной сбраживаемой среды.
2. Способ по п. 1, где при продуцировании этанола или ацетата уровень цистеина снижают путем (а) контактирования указанной микробной культуры карбоксидотрофного микроорганизма с субстратом, содержащим монооксид углерода, и культивирования указанной микробной культуры в анаэробных условиях в первой зоне ферментации, содержащей цистеин в первой концентрации, с получением выращенной на цистеине микробной культуры в первой зоне ферментации; (b) добавления выращенной на цистеине микробной культуры во вторую зону ферментации, содержащую серную добавку, включающую неорганическое соединение серы, имеющее степень окисления от +2 до +4, для того, чтобы во второй зоне ферментации образовывались анионы, состоящие из атомов серы в комбинации с атомами кислорода и/или водорода, а цистеин присутствовал в более низкой концентрации, чем в первой зоне ферментации; (с) добавления субстрата во вторую зону ферментации для его превращения по меньшей мере в один С2-оксигенат; и (d) выделения одного или более С2-оксигенатов из второй зоны ферментации.
3. Способ по п. 1, где оксоанионами серы являются оксоанионы сероводорода.
4. Способ по п. 1, где указанной серной добавкой является неорганическое соединение серы S(III)-S(IV).
5. Способ по п. 1 или 2, где указанная серная добавка выбрана из группы, состоящей из сернистой кислоты, бисульфита, метабисульфита, дитионита, тиосульфата, бисульфита натрия и их комбинаций.
6. Способ по п. 1, где стадию контактирования (b) осуществляют в присутствии органического источника серы, а концентрацию органической серы снижают в течение предварительно определенного периода времени.
7. Способ по пп. 1, 2 или 4, где концентрация органической серы, добавленной в водную сбраживаемую среду, составляет менее чем 0,3 ммоль органической серы на грамм сухой клеточной массы микроорганизма.
8. Способ по п. 1 или 2, где указанная серная добавка присутствует в водной сбраживаемой среде в концентрации 0,1-10 ммоль, более предпочтительно в концентрации 0,5-2 ммоль серы на грамм сухой клеточной массы микроорганизма.
9. Способ по п. 1 или 2, где рН водной сбраживаемой среды составляет в пределах от 4,3 до 5,1, предпочтительно в пределах от 4,3 до 4,9.
10. Способ по п. 1 или 2, где водная сбраживаемая среда, которая продуцирует оксигенат, содержит хелатообразующий агент в молярном отношении хелатообразующий агент : общие металлы переходной группы, равном 0,1:1,0.
11. Способ по п. 10, где указанный хелатообразующий агент выбран из группы, состоящей из этилендиаминтетрауксусной кислоты, диэтилентриаминпентауксусной кислоты, нитрилотриуксусной кислоты, цитрата натрия и их смесей.
12. Способ по п. 1, где указанный способ позволяет продуцировать С2-оксигенат, содержащий этанол.
13. Способ по п. 12, где указанный способ позволяет продуцировать ацетат, а отношение этанола к ацетату в сбраживаемой среде стадии (с) составляет 5:1.
14. Способ по п. 1 или 2, где указанные микроорганизмы представляют собой по меньшей мере бактерии Clostridium Coskatii, Clostridium Ljungdahlii, Clostridium autoethanogenum, Clostridium ragsdalei, Clostridum carboxidivorrans или Butyribacterium methlyotrophicim.
15. Способ по п. 2, где вторая зона ферментации содержит серную добавку в концентрации 0,5-2 ммоль серы на грамм сухой клеточной массы микроорганизма.
16. Способ по п. 2, где указанную микробную культуру удаляют из второй зоны ферментации и переносят в третью зону ферментации, содержащую серную добавку и цистеин в более низкой концентрации, чем во второй зоне ферментации.
| US 20110300596 A1, 08.12.2011 | |||
| US 20110229947 A1, 22.09.2011 | |||
| US 20090215142 A1, 27.08.2009 | |||
| ШТАММ БАКТЕРИЙ CLOSTRIDIUM ACETOBUTYLICUM - ПРОДУЦЕНТ Н-БУТИЛОВОГО СПИРТА, АЦЕТОНА И ЭТАНОЛА | 2008 |
|
RU2393213C1 |
