Способ синхронизации эстрального цикла у самок мышей в эксперименте Российский патент 2021 года по МПК G09B23/28 A61D19/00 A61K31/57 A61K31/5575 

Описание патента на изобретение RU2761137C1

Изобретение относится к экспериментальной фармакологии и может быть использовано для коррекции эстрального цикла у самок мышей для дальнейшего изучения различных патологий беременности и постнатального периода у человека и сельскохозяйственных животных.

В настоящее время, увеличивается темп работы лабораторий, основным модельным организмом которых являются мыши различных линий. В связи с чем всё более актуальной становится необходимость в создании эффективного и экономически менее затратного способа получения экспериментальных животных, в частности мышей.

Известно применение простагландина F2α, который способствует овуляции у телок препубертатного возраста (C.E.P. Leonardi L.F.M., Pfeifer M.I.B., Rubin J., SinghR.J., Mapletoft G.A., Pessoa A.M., Bainy C.A.M. Silva. Prostaglandin F2α promotes ovulation in prepubertal heifers Theriogenology. 2012. V. 78, N 7. P. 1578–82. DOI:10.1016/j.theriogenology), которое заключалось в   том, чтобы определить влияние экзогенного простагландина F (2α) (PGF) с или без лечения прогестероном на первую овуляцию у телок препубертатного возраста. Телкам вводили интравагинальную вставку, высвобождающую прогестерон (CIDR; Pfizer Animal Health, Монреаль, Квебек, Канада), и вызывали фолликулярную волну с помощью 50 мг прогестерона + 2 мг эстрадиолбензоата внутримышечно, а также вводили аналог PGF в больнице. время удаления CIDR, на 5 день фолликулярной волны (в среднем 8,6 ± 0,5 дня после введения CIDR); и (3) телки контрольной группы не получали лечения (N = 14). Телок обследовали ежедневно с помощью трансректального ультразвукового исследования с начала эксперимента для подтверждения того, что овуляция произошла, или до 5 дней после инъекции PGF (группы PG и PPG) или до тех пор, пока доминантные фолликулы следующей фолликулярной волны не достигли 8 мм (контрольная группа). 

Также известна роль простагландина F2α в функции и структуре жёлтого тела при лютеолизе у тёлок. (Pinaffi F.L.V., Araujo E.R., Ginther O.J. Role of luteal biosynthesis of prostaglandin F2α on function and structure of the corpus luteum during luteolysis in heifers. Domest Anim Endocrinol. 2018. N 63. P.10–14. DOI: 10.1016/j.domaniend ). Группы были контрольными (n = 8), обработанными PGF (n = 8) и обработанными FM + PGF (n = 9). Лечение проводилось через 10 дней постовуляции в 0, 8 и 16 часов. Протокол был основан на предположении, что лютеолитические характеристики экзогенного PGF будут изменены, если синтез эндогенного PGF будет одновременно подавляться, и сообщения о том, что Лютеолиз включает прямое действие маточного PGF на большие лютеиновые клетки с последующим воздействием крупных клеток на мелкие. На 48 час концентрация прогестерона была выше в контрольной группе (7,6 ± 0,8 нг / мл), чем в группе FM + PGF (3,0 ± 0,5 нг / мл), и ниже в группе PGF (0,7 ± 0. 3 нг / мл), чем в группе FM + PGF (взаимодействие, P <0,0001).

Данные способы синхронизации эстрального цикла невозможно применить на мышиной модели в эксперименте, так как эстральные циклы крупного рогатого скота, в частности коров, существенно отличается от такового у мышей. Так у крупного рогатого скота эстральный цикл длится от 18 до 24 дней, в то время как у мышей эстральный цикл длится 4-5 дней.

Задачей изобретения является создание эффективного способа фармакологической гормон-регулирующей синхронизации эстрального цикла самок мышей в эксперименте.

Технический результат заключается в эффективном способе синхронизации эстрального цикла у самок мышей в эксперименте, позволяющем получить большее количество оплодотворенных особей в запланированные сроки с минимальной погрешностью в дате родов, и как следствие большее количество экспериментальных животных.

Задача решается с помощью предлагаемого способа, включающего внутримышечное введение самкам мышей суспензию на основе прогестерона в дозе 4,5 мг / 100 г вне зависимости от фазы эстрального цикла, а через 6 суток после введения суспензии прогестерона, осуществляют внутримышечное введение простагландина F2α в дозе 0,083 мг / 100 г. Предполагаемое время наступления овуляции – 34–72 часа после введения второго препарата.

Способ осуществляется следующим образом.

Животные трех линий были разделены на три группы: интактные (естественное спаривание) (n=20), эстральная синхронизация (цитологическое исследование вагинального секрета перед спариванием с определением фазы эструса) (n=20), гормон-регулирующая синхронизация эстрального цикла (n=20). Особи, относящиеся к контрольной группе, были отобраны в случае установления у них эструса. У самок интактной и экспериментальной группы предварительной выборки не проводилось. Самки, вне зависимости от группы, рассаживались к самцам 2:1 соответственно. Запланированной датой родов считались 22 сутки с начала спаривания.

В контрольных группах животные были допущены к спариванию после подтверждения у них фазы эструса путем оценки влагалищного секрета.

Для осуществления первого этапа гормональной синхронизации овуляции у мышей внутримышечно вводился суспензия прогестерона в дозе 4,5 мг / 100 г вне зависимости от фазы эстрального цикла самок. Через 6 суток после введения прогестерона, осуществлялось внутримышечное введение простагландина F2α (ЗАО «Мосагроген», РФ) в дозе 0,083 мг / 100 г. Предполагаемое время наступления овуляции – 34–72 часа после введения второго препарата.

Оценка фармакологической синхронизации эстрального цикла самок мышей проводилась путем исследования цитологической картины влагалищного секрета. Манипуляция проводилась на следующий день после инъекции прогестерона, через 3 дня и непосредственно перед введением простагландина F2α и на следующий день после.

У фиксированной самки производится забор влагалищного секрета с целью цитологической оценки фазы эстрального цикла. Осторожно вводили во влагалище небольшое количество (20 мкл) дистиллированной воды с использованием пипетки с последующим втягиванием в пипетку ранее введенной жидкости. Данную процедуру повторяют 4–5 раз. Важно убедиться, что пипетка помещена на входе влагалищного канала и не проникает во влагалищное отверстие. Жидкость, содержащую несколько капель клеточной суспензии, после этого помещают на предметное стекло, высушивают на воздухе и окрашивают по методу Романовского-Гимзе. (Гайдай Е.А., Гайдай Д.С. Генетическое разнообразие экспериментальных мышей и крыс: история возникновения, способы получения и контроля. Лабораторные животные для научных исследований. 2019. – № 4. – 9 с. DOI: 10.29926/2618723X-2019-04-09; Achiraman S., Archunan G., Sankar Ganesh D., Rajagopal T., Rengarajan R.L., Kokilavani P., Kamalakkannan S., Kannan S. Biochemical analysis of female mice urine with reference to endocrine function: a key tool for estrus detection. Zool Sci. 2011. N 28. P. 600–605. DOI: 10.2108/zsj.28.600). Затем предметное стекло накрывали покровным стеклом и немедленно исследовали количественно и качественный состав клеток секрета под световым микроскопом (Биомед 5) при увеличении 40×.

На следующий день после инъекции суспензии прогестерона самке мыши отмечается смешанная цитологическая картина, не позволяющая отнести видимый результат к определенной фазе цикла. Полиморфноядерные лейкоциты и небольшое количество ороговевших клеток отмечается на 3 сутки после введения прогестерона, что соответствует фазе диеструса. На шестые сутки перед введением простагландина F2α, отмечается преобладание округлых ядроседержащих клеток с небольшим вкраплением между ними ороговевших эпителиальных клеток и полиморфноядерных лейкоцитов. Во влагалищном мазке взятом на следующий день после инъекции простагландина F2α отмечается преобладание обильных неядерных ороговевших эпителиальных клеток с клетками неправильной формы имеющих зернистую цитоплазму.

Пример конкретного выполнения.

Исключая племенную выборку для эксперимента, были отобраны самки мышей одинакового возраста и веса линий CBA/lac, C57BL/6, BALB/ в каждой по 60 особей, и самцы соответствующих линий в количестве 30 особей, полученные из питомника лабораторных животных «Столбовая» (Московская область, п. Столбовая).

Выбор особей данных линий обоснован наиболее частым их использованием в биомедицинских исследованиях [Auta T., Hassan A.T. Alteration in oestrus cycle and implantation in Mus musculus administered aqueous wood ash extract of Azadirachta indica (neem) Asian Pacific J Reproduction. 2016. V. 5, N 3. P. 188–192. DOI: 10.1016/j.apjr.2016.03.003 ].

Животные трех линий были разделены на три группы: интактные (естественное спаривание) (n=20), эстральная синхронизация (цитологическое исследование вагинального секрета перед спариванием с определением фазы эструса) (n=20), гормональная синхронизации эстрального цикла (n=20). Особи, относящиеся к контрольной группе, были отобраны в случае установления у них эструса. Для осуществления первого этапа гормональной синхронизации овуляции у мышей внутримышечно вводили суспензию прогестерона (прогестерон, ЗАО «Мосагроген», РФ «Прогестомаг» рег. 32-3-4.15-2649 № ПВР-3-4.15/03139 от 27.06.2018) в дозе 4,5 мг / 100 г вне зависимости от фазы эстрального цикла самок. Приготовление раствора суспензии прогестерона осуществляли следующим образом.

В предварительно подготовленную стерильную пластиковую или стеклянную объёмом не более 100 мл ёмкость с крышкой помещается 9,95 мл дистиллированной воды. Далее данная ёмкость нагревается на водяной бане до 40°С, после чего в неё помещается с помощью инсулинового шприца 0,05 мл полисорбата Твин-80 и перемешивается стеклянной палочкой до полного растворения. Полученный раствор охлаждают до температуры ниже 25°С для того, чтобы избежать разрушение гормона, оптимальная температура (20-23°С). После охлаждения, струйно, вводим в раствор 1 мл препарата прогестерона. Добиваются гомогенности среды с помощью размешивания стеклянной палочкой или быстрого взбалтывания закрытой ёмкости. Используется непосредственно после приготовления в объеме индивидуальном для каждой особи из расчёта 4,5мг/100г. Хранению и повторному использованию полученная суспензия не подлежит во избежание потери гомогенности и распада среды на фазы, потери специфических свойств гормоном, а также развитии патогенной флоры.

Через 6 суток после введения прогестерона, осуществлялось внутримышечное введение простагландина F2α (ЗАО «Мосагроген», РФ «Магестрофан» рег. 32- 3-4.15-2649 № ПВР-3-4.15/03139 от 11.06.15) в дозе 0,083 мг / 100 г. Предполагаемое время наступления овуляции – 34–72 часа после введения второго препарата. Самки, вне зависимости от группы, рассаживались к самцам 2:1 соответственно. Запланированной датой родов считались 22 сутки с начала спаривания.

В ходе исследования было установлено, что гормональная синхронизация группы самок увеличивает количество оплодотворенных особей на 55% относительно интактных групп и на 18,3% относительно контрольных групп. Отбор особей опирающийся на цитологическое исследование влагалищного секрета увеличивает количество беременных самок на 36% (р<0,05). Индекс синхронизации овуляции представлен в таблице 1.

Таблица 1.

Гормон-регулирующая синхронизация увеличивает вероятность родов самки на 22 сутки на 53% (р<0,05) в сравнении с контрольной группой и на 85,5% (р<0,05) в сравнении с интактной группой. Количество самок, разродившихся на 22 сутки представлено в таблице 2.

Таблица 2.

В линии С57BL/6 в интактной группе на 14 сутки после спаривания беременность отмечалась у 25% самок. Эстральная синхронизация цикла увеличила количество беременных особей относительно контроля на 35%. Гормон-регулирующая синхронизация овуляторного цикла увеличила количество оплодотворенных особей на 50% относительно интактной и на 10% относительно эстральной синхронизации (р<0,05).

В линии СBA/lac в интактной группе на 14 сутки после спаривания беременность отмечалась у 25% самок. Эстральная синхронизация цикла увеличила количество беременных особей относительно контроля на 40%. Гормон-регулирующая синхронизация овуляторного цикла увеличила количество оплодотворенных особей на 55% относительно интактной и на 15% относительно эстральной синхронизации (р<0,05).

В линии СBA/lac в интактной группе на 14 сутки после спаривания беременность отмечалась у 25% самок. Эстральная синхронизация цикла увеличила количество беременных особей относительно контроля на 35%. Гормон-регулирующая синхронизация овуляторного цикла увеличила количество оплодотворенных особей на 35% относительно интактной и не изменилось в эстральной синхронизации (р<0,05). А также количество потомства у экспериментальных животных в группах гормон-регулирующей стимуляции выше в сравнении с интактными и группами эстральной синхронизации. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3

Таким образом, полученные результаты убедительно свидетельствуют о выраженном эффекте гормон-регулирующей синхронизации овуляторного цикла у самок мышей, позволяющего получить большее количество оплодотворенных особей в запланированные сроки с минимальной погрешностью в дате родов, и как следствие большее количество экспериментальных животных.

Похожие патенты RU2761137C1

название год авторы номер документа
Коррекция овуляторного цикла у самок реципиентов кролика для трансплантации эмбрионов, измененных методами генной инженерии 2022
  • Покровский Владимир Михайлович
  • Патраханов Евгений Александрович
  • Дейкин Алексей Васильевич
  • Покровский Михаил Владимирович
  • Корокин Михаил Викторович
  • Карагодина Анастасия Юрьевна
  • Казбан Николай Егорович
  • Сушкова Дарья Николаевна
  • Воронина Диана Георгиевна
  • Кочкарова Индира Султановна
  • Алтухова Оксана Борисовна
RU2788203C1
Способ синхронизации половой охоты у высокопродуктивных коров 2022
  • Гальченко Виктория Алексеевна
  • Перерядкина Светлана Петровна
  • Авдеенко Владимир Семенович
  • Кочарян Валентина Даниловна
  • Лисиченко Галина Олеговна
  • Солуянова Юлия Владимировна
RU2795159C1
КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ПОВЫШЕНИЯ РЕПРОДУКТИВНОЙ АКТИВНОСТИ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ, НЕ ЯВЛЯЮЩИХСЯ ЧЕЛОВЕКОМ, С ПРИМЕНЕНИЕМ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО РЕКОМБИНАНТНОГО ФОЛЛИКУЛОСТИМУЛИРУЮЩЕГО ГОРМОНА (rFSH) 2013
  • Суза Александр
  • Исака Наоми
  • Карри Од
  • Тибо Доминик
RU2679944C2
СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ВОСПРОИЗВОДСТВА ЖИВОТНЫХ 2014
  • Карипов Рамзиль Салахович
  • Бурков Павел Валерьевич
  • Безин Александр Николаевич
  • Романов Александр Алексеевич
  • Брейгин Дмитрий Александрович
  • Шестаков Александр Леонидович
RU2557779C1
СРЕДСТВО ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ ГЕНЕРАТИВНОЙ ФУНКЦИИ 2014
  • Катаев Валерий Алексеевич
  • Сергеева Светлана Александровна
  • Черненко Олег Валерианович
  • Бугаева Любовь Ивановна
RU2564016C1
СПОСОБ РЕГУЛЯЦИИ ВОСПРОИЗВОДИТЕЛЬНОЙ ФУНКЦИИ У САМОК 1994
  • Безбородов Н.В.
  • Горшков Г.И.
RU2076593C1
ПРИМЕНЕНИЕ СОЛЕЙ ВОЛЬФРАМА (VI) ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЖЕНСКОГО БЕСПЛОДИЯ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ, НЕ СТРАДАЮЩИХ ДИАБЕТОМ 2014
  • Канальс Альмасан Игнасио
  • Арбат Бухье Агнес
RU2635507C2
СПОСОБ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ИЛИ ЗАДЕРЖКИ ОПЛОДОТВОРЕНИЯ 1994
  • Гари Д.Ходжен
RU2139055C1
Способ интенсивного воспроизводства диких и одомашненных охотничьих животных 2019
  • Карипов Рамзиль Салахович
  • Бурков Павел Валерьевич
  • Дворников Михаил Григорьевич
  • Козлов Владимир Васильевич
RU2712884C1
Фармацевтическая композиция с пролонгированным действием гонадотропинов для проведения индукции суперовуляции у самок млекопитающих 2016
  • Косовский Глеб Юрьевич
  • Попов Дмитрий Владимирович
  • Бригида Артём Владимирович
RU2633079C2

Реферат патента 2021 года Способ синхронизации эстрального цикла у самок мышей в эксперименте

Изобретение относится к экспериментальной фармакологии и может быть использовано для коррекции эстрального цикла у самок мышей для дальнейшего изучения различных патологий беременности и постнатального периода у человека и сельскохозяйственных животных. Способ синхронизации эстрального цикла у самок мышей в эксперименте заключается в том, что осуществляют внутримышечное введение самкам мышей суспензии на основе прогестерона в дозе 4,5 мг/100 г вне зависимости от фазы эстрального цикла. Далее вводят через 6 суток простагландин F2а в дозе 0,083 мг/100 г. Изобретение позволяет осуществлять гормон-регулирующую синхронизацию овуляторного цикла у самок мышей и получить большее количество оплодотворенных особей в запланированные сроки с минимальной погрешностью в дате родов и, как следствие, большее количество экспериментальных животных. 1 пр., 3 табл.

Формула изобретения RU 2 761 137 C1

Способ синхронизации эстрального цикла у самок мышей в эксперименте, характеризующийся тем, что осуществляют внутримышечное введение самкам мышей суспензии на основе прогестерона в дозе 4,5 мг/100 г вне зависимости от фазы эстрального цикла, с последующим введением через 6 суток простагландина F2а в дозе 0,083 мг/100 г.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2021 года RU2761137C1

СПОСОБ РЕГУЛЯЦИИ ВОСПРОИЗВОДИТЕЛЬНОЙ ФУНКЦИИ У САМОК 1994
  • Безбородов Н.В.
  • Горшков Г.И.
RU2076593C1
СПОСОБ СИНХРОНИЗАЦИИ ЭСТРУСА У КОРОВ-РЕЦИПИЕНТОВ ПРИ ПОДГОТОВКЕ К ТРАНСПЛАНТАЦИИ ЭМБРИОНОВ 2019
  • Зубова Татьяна Владимировна
  • Плешков Владимир Александрович
  • Прохоров Олег Николаевич
  • Смоловская Оксана Владимировна
  • Миронов Александр Николаевич
  • Соломина Юлия Николаевна
RU2704270C1
ИВАНОВ Ю.Н
и др
ИССЛЕДОВАНИЯ СИНХРОНИЗАЦИИ ПОЛОВОГО ЦИКЛА У САМОК СЕРОЙ КРЫСЫ (RATTUS NORVEGICUS) ПРИ СОВМЕСТНОМ СОДЕРЖАНИИ / Вавиловский журнал генетики и селекции, 2011, т
Прибор для нагревания перетягиваемых бандажей подвижного состава 1917
  • Колоницкий Е.А.
SU15A1
Скоропечатный станок для печатания со стеклянных пластинок 1922
  • Дикушин В.И.
  • Левенц М.А.
SU35A1
КЛОЧКОВ Д.В
и др
СЕЛЕКЦИЯ НА УСИЛЕНИЕ КАТАТОНИЧЕСКОЙ РЕАКТИВНОСТИ КРЫС, ПОЛОВАЯ ФУНКЦИЯ И

RU 2 761 137 C1

Авторы

Покровский Владимир Михайлович

Патраханов Евгений Александрович

Покровский Михаил Владимирович

Лебедев Петр Романович

Белашова Анастасия Викторовна

Архипов Иван Сергеевич

Карагодина Анастасия Юрьевна

Пученкова Олеся Андреевна

Голиусов Артем Иванович

Нагих Андрей Сергеевич

Даты

2021-12-06Публикация

2021-04-30Подача