Способ диагностики бактериемии, ассоциированной с грамотрицательными микроорганизмами, у реципиентов сердца или легких Российский патент 2022 года по МПК G01N33/50 G01N33/68 G01N33/49 

Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантации органов и клинической лабораторной диагностике, может быть использовано при ведении пациентов после трансплантации сердца или легких для скрининга бактериемии, вызванной грамотрицательными возбудителями.

На сегодняшний день уровень развития трансплантации сердца и легких позволяет обеспечить высокое качество жизни и социальной активности пациентам с терминальной стадией заболеваний дыхательной и сердечно-сосудистой систем, однако результат трансплантации во многом определяется своевременностью диагностики осложнений, а также технологией лекарственного и нелекарственного ведения реципиентов.

Несмотря на последние достижения хирургии, проведение подобных высокотехнологичных вмешательств сопряжено с риском развития инфекционных осложнений бактериальной природы, которые продолжают оставаться одной из причин смертности реципиентов в раннем госпитальном периоде [Biderman Р, Bugaevsky Y, Ben-Zvi Н, et al. Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii infections in lung transplant patients in the cardiothoracicintensive care unit. Clin Transplant. 2015;29(9):756-62. doi: 10.1111/ctr.12575].

При этом на фоне иммуносупрессивной терапии инфекционные осложнения после трансплантации часто имеют атипичное течение, что затрудняет своевременную диагностику и начало этиотропной терапии [Barkanova O.N., Perlin D.V., Shepeleva Yu.B., et al. Infectious complications of early postoperative period in patients after kidney transplantation. Journal of VolgSMU. 2016;2(58):32-34. (In Russ.)].

Осведомленность о спектре ведущей микрофлоры и об уровне ее антибиотикочувствительности ориентирует врачей на назначение адекватной лекарственной терапии тяжелым больным и является базой для разработки алгоритмов рационального антибактериального лечения [Zemko V.Ju., Okulich V.K., Dzjadz'ko A.M. Monitoring antibiotikorezistentnosti mikroorganizmov v otdelenii reanimacii i intensivnoj terapii mnogoprofil'nogo stacionara. Transplantologija. 2018; 10(4):284-297. (In Russ.). doi: 10.23873/2074-0506-2018-10-4284-297].

Среди наиболее тяжелых форм выделяют бактериальную инфекцию кровотока (бактериемию), вызванную карбапенем-резистентными грамотрицательными бактериями [Lee JS, Lee SH, Kim KS, et al. Bacterial infection monitoring in the early period after liver transplantation. Ann Surg Treat Res. 2018;94(3):154-158. doi: 10.4174/astr.2018.94.3.154].

Основным методом определения бактериемии на сегодняшний день является микробиологическое обследование (бактериологический анализ посевов крови [Opota О., Croxatto A., Prod'hom G., Greub G., Blood culture-based diagnosis of bacteraemia: state of the art. Clin Microbiol Infect. 2015; 21(4):313-22. doi: 10.1016/j.cmi.2015.01.003].

Однако применение методов микробиологического обследования имеет ряд недостатков: во-первых, в зависимости от особенностей возбудителей бактериемии, потенциально присутствующих в образце крови, длительность выявления роста микроорганизма может занимать до нескольких суток; во-вторых размещение в клинике лабораторного подразделения, занимающегося микробиологической диагностикой, требует существенных экономических затрат и выполнения жестких организационно-технических требований, что не всегда доступно многим стационарам, и влечет перевод микробиологических исследований на аутсорсинг, не позволяя проводить регулярный стабильный мониторинг вспышек инфекции и еще более оттягивая сроки выявления опасного инфекционного осложнения [Friedrich AW. Control of hospital acquired infections and antimicrobial resistance in Europe: the way to go. Wien Med Wochenschr. 2019;169 [suppl. 1]:25-30. doi: 10.1007/s10354-018-0676-5].

В связи с этим особую актуальность приобретает поиск ранних предикторов бактериемии. Особенно остро стоит данный вопрос в условиях трансплантологических отделений, пациенты которых наиболее подвержены развитию инфекционных осложнений ввиду необходимости применения иммуносупрессивных препаратов.

Отдельную группу эффективных биологических агентов, способных выступать индикаторами осложнений после трансплантации солидных органов, составляют сигнальные молекулы микроРНК, семейство малых эндогенных некодирующих одноцепочечных РНК длиной от 18 до 25 нуклеотидов, выступающих в качестве посттранскрипционных регуляторов, играющих ключевую роль во множестве биологических процессов. Исследования последних лет позволили выявить участие микроРНК в развитии и дифференцировке кроветворных клеток, пролиферации и апоптозе, нарушении обмена веществ, аутоиммунных заболеваниях, канцерогенезе и отторжении трансплантированных органов.

Показан диагностический потенциал оценки уровня экспрессии ряда микроРНК в образцах крови реципиентов солидных органов в отношении развития и течения различных посттрансплантационных осложнений [MicroRNAs: potential biomarker in organ transplantation / J. Shan, L. Feng, L. Luo [et al.]. - Текст: непосредственный // Transplant Immunology. - 2011. - Vol. 24. - №4. - P. 210-215.].

В работе Abha Sahni отмечается участие микроРНК-424 в механизмах иммунного ответа и индуцировании экспрессии CX3CL1 при инфекции, вызванной грамотрицательным возбудителем Rickettsia rickettsii [MicroRNA-424 regulates the expression of CX3CL1 (fractalkine) in human microvascular endothelial cells during Rickettsia rickettsii infection/ Abha Sahni, Hema P. Narra, Sanjeev K. Sahni. // Biochemistry and Biophysics Reports. - 2021. - Vol. 25. - 100897].

Однако авторами не установлено наличие конкретных диагностически значимых уровней экспрессии микроРНК-424, свидетельствующих о развитии инфекции и неясна динамика экспрессии при бактериемии, вызванной другими грамотрицательными возбудителями.

Также показано изменение экспрессии микроРНК-424, специфичное для пациентов с инвазивным аспергиллезом после трансплантации легких [Identifying host microRNAs in bronchoalveolar lavage samples from lung transplant recipients infected with Aspergillus / Wajiha Gohir, William Klement, Lianne G Singer et al. // J Heart Lung Transplant - 2020. - doi: 10.1016/j.healun.2020.07.014.], при этом оценка экспрессии микроРНК-424 проводилась в образцах бронхо-альвеолярного лаважа.

У реципиентов сердца и/или легких описана роль прокальцитонина в диагностике инфекционных осложнений после трансплантации [Procalcitonin for differential diagnosis of graft rejection and infection in patients with heart and/or lung grafts / S. Hammer, F. Meisner, P. Dirschedl et al. // Intensive Care Med. - 2000. - Vol. 26. - P. S182-S186], при этом не описаны различия в выделении грамотрицательных и грамположительных возбудителей.

Еще одним широко известным маркером воспаления и инфекции является С-реактивный белок (СРБ) - классический белок острой фазы, который рассматривается как наиболее чувствительный лабораторный маркер инфекции, воспаления и тканевого повреждения и широко применяется в клинической практике. Установлена его высокая чувствительность при бактериальных инфекциях у реципиентов сердца [Serial study of С reactive protein concentrations in cardiac allograft recipients / Gd Harkiss // J Clin Pathol. - 1985. - Vol. 38. - P. 193-197].

Данные о концентрации сывороточного СРБ могут использоваться в качестве прогностического маркера, который отражает уровни системного воспаления, в том числе для мониторинга эффективности терапии и возможности ее коррекции [Effect of C-Reactive Protein-Guided Antibiotic Treatment Duration, 7-Day Treatment, or 14-Day Treatment on 30-Day Clinical Failure Rate in Patients With Uncomplicated Gram-Negative Bacteremia / E. von Dach, W. Albrich, A.-S. Brunei et al. // JAMA. - 2020. - Vol. 323. - Iss. 21. - P. 2160-2169. doi: 10.1001/jama.2020.6348].

Однако СРБ не обладает высокой специфичностью у реципиентов трансплантированного сердца [Serial measurement of presepsin, procalcitonin, and C-reactive protein in the early postoperative period and the response to antithymocyte globulin administration after heart transplantation / J. Franekova, P. Sečník Jr., P. Lavríková, Z et al. // Clin Transplant. - 2017. - Vol. 31. - Iss.1. doi: 10.1111/ctr.12870].

Нами поставлена задача диагностики бактериемии, ассоциированной с грамотрицательными микроорганизмами, у пациентов после трансплантации сердца или легких путем определения уровня микроРНК-424 в плазме крови и концентрации СРБ в сыворотке крови реципиентов.

Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретения, заключается в обеспечении диагностики бактериемии, ассоциированной с грамотрицательными микроорганизмами, у реципиентов сердца или легких путем определения уровня экспрессии микроРНК-424 в плазме крови совместно с измерением уровня СРБ в сыворотке крови.

Использование данного сочетания маркеров позволяет:

• осуществлять раннюю диагностику инфекционных осложнений независимо от наступления клинических проявлений, многие из которых также характерны и для картины острого отторжения трансплантата;

• выявлять бактериемию, ассоциированную с грамотрицательными микроорганизмами, отличающимися высокой резистентностью к антимикробным агентам, и тем самым прогнозировать у пациентов тяжелое течение инфекционных осложнений;

• своевременно назначить бактериологическое обследование для уточнения возбудителя и его антибиотикочувствительности;

• снизить медикаментозную нагрузку на пациента путем отказа от назначения препаратов, предусмотренных стандартным протоколом лечения, но неэффективных в отношении выделенных микроорганизмов, и сформировать индивидуальную терапевтическую тактику;

• применять предложенный способ диагностики как у реципиентов сердца, так и реципиентов легких, что отражает универсальность маркера;

• снизить экономическую нагрузку клиники за счет улучшения результатов реабилитации и сокращения сроков пребывания пациентов в стационаре ввиду нестабильного состояния.

Сущность изобретения состоит в следующем.

Для диагностики бактериемии, ассоциированной с грамотрицательными микроорганизмами, у пациентов после трансплантации сердца или легких в плазме крови определяют уровень экспрессии микроРНК-424 по формуле:

Э=log₂(2^-(Ct1-Ct2)),

где

Э - уровень экспрессии микроРНК-424,

Ct1 - значение порогового цикла ПЦР для образца микроРНК-424,

Ct2 - значение порогового цикла ГТЦР для внутреннего контроля, представленного Cel-miR-39.

Посредством биохимического анализа крови в сыворотке крови определяют концентрацию СРБ (мг/л).

При величине Э более -5,72 и СРБ более 7 мг/л диагностируют наличие бактериемии, ассоциированной с грамотрицательными микроорганизмами.

Способ осуществляется следующим образом.

В качестве материала для исследования величины экспрессии микроРНК используется плазма крови. Взятие крови для исследования производят, как правило, одновременно с плановым обследованием пациентов.

Кровь собирают в одноразовые пробирки с антикоагулянтом ЭДТА (BD Vacutainer, Becton Dickinson, США) и центрифугируют в течение 10 минут при 3500/1500 g оборотах при комнатной температуре. Полученную плазму замораживают и хранят при температуре -20°С.

Уровень экспрессии микроРНК-424 определяют методом полимеразной цепной реакции (ПНР), например, с помощью наборов реагентов SerumPlasma (Qiagen, США).

Определение проводится в соответствии с инструкцией к наборам.

РНК выделяют из 100 мкл плазмы крови с использованием наборов SerumPlasma (Qiagen, США). После инкубации плазмы с фенольной смесью Qiazol добавляется 1,6 х 10⁸ копий синтетической микроРНК Caenorhabditis elegans (Cel-miR-39) (Qiagen) в качестве внутреннего контроля экстракции РНК.

Выделенные образцы с тотальной РНК конвертируются путем проведения реакции обратной транскрипции в кДНК: при t°=37°C в течение 60 минут с последующей инкубацией при 95°С в течение 5 минут, охлаждением на льду и доведением объема образца деионизированной водой до 200 мкл. Далее для выявления исследуемых микроРНК выполняется ПЦР с детекцией в режиме реального времени. Условия реакции ПЦР: 15 минут при to=95°C с последующим проведением 40 циклов по 15 секунд при t°=94°C, 30 секунд при to=55°C и 30 секунд при t°=70°C в амплификаторе.

Значение уровня экспрессии микроРНК исследуемых образцов плазмы крови выражают в относительных единицах (отн.ед.) и рассчитывают по формуле:

Э=log₂(2^-(Ct1-Ct2)),

где

Э - уровень экспрессии микроРНК-424, отн. ед.

Ct1 - значение порогового цикла ПЦР для образца микроРНК-424

(то есть значение порогового цикла микроРНК-424 на анализаторе нуклеиновых кислот или амплификаторе),

Ct2 - значение порогового цикла ПЦР для внутреннего контроля, представленного Cel-miR-39 (то есть значение порогового цикла внутреннего контроля, представленного Cel-miR-39, на анализаторе нуклеиновых кислот или амплификаторе).

Концентрация СРБ определяется в сыворотке крови при биохимическом анализе крови.

У реципиентов сердца или легких с величиной экспрессии микроРНК-424 Э выше -5,72 отн. ед. в плазме крови и концентрацией СРБ в сыворотке выше 7 мг/л определяют наличие бактериемии, ассоциированной с грамотрицательными микроорганизмами.

После этого образцы крови пациента направляют на бактериологический посев для выделения возможного возбудителя, с последующим определением его чувствительности к спектру антибиотиков и формированием адекватной тактики лекарственной терапии.

Для доказательств возможности реализации заявленного назначения и достижения указанного технического результата приводим следующие данные.

Клинический пример 1.

Пациенту Г., 30 лет, выполнена двусторонняя трансплантация легких. Иммуносупрессивная терапия назначена по стандартной схеме. Измеренный на 19 сутки после трансплантации уровень экспрессии микроРНК-424 в плазме крови (в соответствии с методикой, представленной на страницах на страницах 6-8 описания) составил -3,80 отн. ед., а концентрация СРБ в сыворотке крови составила 305 мг/л. В соответствии с предлагаемым способом у пациента диагностирована бактериемия, ассоциированная с грамотрицательными микроорганизмами. Методом бактериологического обследования диагноз подтвержден: из образца посева крови выделен штамм грамотрицательной бактерии Acinetobacter baumannii, проведена развернутая антибиотикограмма, по результатам которой скорректирована схема антимикробной терапии.

Клинический пример 2.

Пациенту Г., 53 лет, выполнена ортотопическая трансплантация сердца. Послеоперационный период протекал гладко. Иммуносупрессивная терапия назначена по стандартной схеме лечения. Измеренный на 41 сутки после операции уровень экспрессии микроРНК-424 в плазме крови (в соответствии с методикой, представленной на страницах на страницах 6-8 описания) составил -10,71 отн. ед., а концентрация СРБ в сыворотке крови составила 5 мг/л. В соответствии с предлагаемым способом у пациента диагностировано отсутствие бактериемии, ассоциированной с грамотрицательными микроорганизмами. Методом бактериологического обследования посева крови диагноз подтвержден: в посеве крови роста микроорганизмов не выявлено.

Клинический пример 3.

Пациенту Р., 40 лет, выполнена двусторонняя трансплантация легких. Иммуносупрессивная терапия назначена по стандартной схеме. Измеренный на 109 сутки после трансплантации уровень экспрессии микроРНК-424 в плазме крови (в соответствии с методикой, представленной на страницах на страницах 6-8 описания) составил -5,72 относительных единиц; концентрация СРБ в сыворотке крови составила 4 мг/л. В соответствии с предлагаемым способом у пациента диагностировано отсутствие бактериемии, ассоциированной с грамотрицательными микроорганизмами. По данным бактериологического обследования диагноз подтвержден, роста микроорганизмов в посеве крови не выявлено.

Предложенный способ апробирован в клинической практике на реципиентах сердца и легких в раннем госпитальном периоде (с первых и до 110 суток после трансплантации). Уровень экспрессии микроРНК-424 и концентрации СРБ после трансплантации выше установленных нами пороговых значений наблюдались у 6 реципиентов, из них в 5 (83,3%) случаях результатами бактериологического обследования была верифицирована бактериемия, ассоциированная с грамотрицательными возбудителями.

Чувствительность и специфичность предложенного способа диагностики составляет 83,3% и 90,1% соответственно.

Использование в клинической практике патентуемого способа дает возможность в госпитальном периоде у реципиентов сердца или легких диагностировать развитие инфекционных осложнений бактериальной природы.

Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантации органов и клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано при ведении пациентов после трансплантации сердца или легких для скрининга бактериемии, вызванной грамотрицательными возбудителями. У реципиента в плазме крови определяют уровень экспрессии микроРНК-424 (Э), а в сыворотке крови определяют концентрацию С-реактивного белка (СРБ). При величине Э выше -5,72 и концентрации СРБ выше 7 мг/л диагностируют наличие бактериемии, ассоциированной с грамотрицательными микроорганизмами. Способ обеспечивает эффективную диагностику бактериемии, ассоциированной с грамотрицательными микроорганизмами, у реципиентов сердца или легких путем определения уровня экспрессии микроРНК-424 в плазме крови совместно с измерением уровня СРБ в сыворотке крови. 3 пр.

Способ диагностики бактериемии, ассоциированной с грамотрицательными микроорганизмами, у реципиента сердца или легких, отличающийся тем, что у реципиента в плазме крови определяют уровень экспрессии микроРНК-424 по формуле:

Э=log₂(2^-(Ct1-Ct2),

где

Э - уровень экспрессии микроРНК-424,

Ct1 - значение порогового цикла ПЦР для образца микроРНК-424,

Ct2 - значение порогового цикла ПЦР для внутреннего контроля, представленного Cel-miR-39;

а в сыворотке крови определяют концентрацию С-реактивного белка (СРБ) и при величине Э выше -5,72 и концентрации СРБ выше 7 мг/л диагностируют наличие бактериемии, ассоциированной с грамотрицательными микроорганизмами.