Способ повышения аутологичной противоопухолевой активности нейтрофилов in vitro Российский патент 2021 года по МПК A61K38/00 C12N5/78 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для клеточной иммунотерапии лиц с онкологическими заболеваниями.

По данным ВОЗ рак является одной из основных причин смерти в мире. В России, как и во всем мире, отмечается рост заболеваемости на 1,5% в год [7]. Внедрение клеточных иммунотерапевтических технологий в практическое здравоохранение позволит улучшить прогноз для многих больных с онкологическими заболеваниями. Таким примером является внедрение технологии дендритноклеточных вакцин [5, 14]. Нейтрофилы являются высокореактивыми клетками, которые быстро реагируют на любые патогенные воздействия, включая опухолевый рост [4, 9]. Однако в процессе роста опухоли противоопухолевая активность нейтрофилов может меняться на проопухолевую [1, 12], что определяет необходимость разработки методов повышения противоопухолевой активности данных клеток.

В эксперименте на лабораторных животных исследовано действие золедроновой кислоты (zoledronic acid) на нейтрофилы на фоне роста протоковой аденокарциномы поджелудочной железы [11]. Установлено, что обработанные золедроновой кислотой нейтрофилы стимулируют противоопухолевую активность γδТ-лимфоцитов.

Однако золедроновая кислота слабо повышает противоопухолевую активность самих нейтрофилов и будет ли подобный эффект достигнут на пациентах с онкологическими заболеваниями остается неизвестным.

Известно, что блокаторы трансформирующего ростового фактора-β (TGFβ) стимулируют противоопухолевую активность нейтрофилов [1].

Однако применение блокаторов TGFβ затруднено, что определяется недостаточными знаниями всего комплекса регуляторных эффектов, которые они могут реализовать.

Известен способ стимуляции заживления кожных ран и функциональной активности нейтрофилов при введении комбинации пептидов Gly-His-Lys и тимогена парентерально в эквимолярных разовых дозах по 0,5 мкг/кг массы тела один раз в сутки, в течение десяти дней [2]. Способ обеспечивает сокращение сроков заживления за счет улучшения ранозаживляющей способности кожи и функциональной активности нейтрофилов.

Недостатком способа является то, что, во-первых, данный способ не применяется при онкологических заболеваниях и, во-вторых, введение данной комбинации в организм пациентов с онкологическими заболеваниями может привести к неконтролируемому ответу со стороны самой опухоли.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу является способ активации цитотоксических лимфоцитов человека, заключающийся в том, что выделенные мононуклеарные клетки онкологических больных или доноров культивируют в бессывороточной среде ex-vivo с добавлением рекомбинантных человеческих IL-2 в концентрации от 125 нг/мл до 500 нг/мл и IL-15 в концентрации от 2,5 нг/мл до 5 нг/мл [3]. Полученные с большим выходом цитотоксические лимфоциты обладают повышенной жизнеспособностью, пролиферативной активностью и функциональной противоопухолевой активностью.

Недостатком способа является то, что он ориентирован на активацию лимфоцитов и не затрагивает нейтрофилы.

Известно, что за счет широкого спектра регуляторных факторов, синтезируемых опухолью, меняется активность метаболизма и, соответственно, функциональной активности клеток иммунной системы, включая нейтрофилы [4, 13]. Следовательно, стимулирование метаболических процессов (энергетика, синтез активных форм кислорода и др.) в нейтрофилах будет приводить к повышению их функциональной активности, в том числе и противоопухолевой. В качестве таких метаболитов предлагается использовать глутаминовую кислоту, глицеральдегид-3-фосфат и аргинин. Глутаминовая кислота вовлекается в систему внутриклеточного обмена азота, а через глутаматдегидрогеназы включается в реакции цикла трикарбоновых кислот, стимулируя аэробную энергетику [8]. Глицеральдегид-3-фосфат включается в гликолиз (анаэробная энергетика) на уровне окислительно-восстановительной стадии [10]. Аргинин играет важную роль в различных реакциях в системе внутриклеточного обмена веществ, включая синтез белка и энергетические процессы, но в нейтрофилах аргинин также включается в реакции синтеза активных форм азота, стимулируя противоопухолевую активность клеток [8].

Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение аутологичной противоопухолевой активности нейтрофилов при онкологических заболеваниях путем метаболической активации нейтрофилов in vitro.

Технический результат достигают тем, что в способе повышения аутологичной противоопухолевой активности нейтрофилов in vitro у больных с онкологическими заболеваниями, включающем выделение клеток из венозной крови, их культивирование в условиях CO₂-инкубатора при 37°С в питательной среде при концентрации клеток 1⋅10⁶ кл/мл, новым является то, что инкубацию осуществляют в течение 4-х часов в среде, дополнительно содержащей 0,5 М глутаминовой кислоты и 48,5 мМ глицеральдегид-3-фосфата, при этом через 2 часа после начала инкубации в среду вносят раствор аргинина в конечной концентрации 2М.

Способ осуществляют следующим образом.

У пациентов с онкологическими заболеваниями во время проведения операции по поводу хирургического удаления опухоли забирают венозную крови в количестве не менее 4 мл из локтевой вены свободным током в пробирки с гепарином. Нейтрофилы выделяют из цельной гепаринизированной крови центрифугированием в двойном градиенте плотности фиколл-урографина: ρ=1,077 г/см³ - для отделения лимфоцитов, ρ=1,119 г/см³ - для выделения нейтрофилов. Подсчитывают количество нейтрофилов, например, в камере Горяева. При контроле морфологического состава лейкоцитарных взвесей определяют чистоту выхода нейтрофилов, которая составляет не менее 97%. Метаболическую активацию нейтрофилов осуществляют в течение 4 часов инкубации при 37°С в СО₂-инкубаторе (Sanyo, Япония) во флаконах для культивирования (Greiner Bio One, Германия) в количестве 1 млн клеток на 1 мл среды RPMI-1640, содержащей дополнительно 0,5 М глутаминовой кислоты (Sigma, США) и 48,5 мМ глицеральдегид-3-фосфата (Sigma, США). Через 2 часа после начала инкубации в культуральную среду вносят раствор аргинина (Sigma, США) в конечной концентрации 2,0 М. По окончанию инкубации оценивают уровень аутологичной противоопухолевой активности нейтрофилов, например, с помощью хемилюминесцентного метода [6].

Данный способ апробирован на 17 больных раком почки и мочевого пузыря. Больные раком почки и мочевого пузыря (T3N0M0) в возрасте 40-55 лет были обследованы на базе КГБУЗ «Красноярский краевой клинический онкологический диспансер имени А.И. Крыжановского» до хирургического лечения. Диагноз был верифицирован гистологически. У больных во время проведения операции по поводу хирургического удаления опухоли забирали венозную крови в количестве не менее 4 мл из локтевой вены свободным током в пробирки с гепарином и опухолевую ткань (объем - не менее 0,5 см³, помещают во флаконы с физиологическим раствором). Опухолевую ткань гомогенизировали и трижды отмывали для отделения крупных клеточных агрегатов, подсчитывали количество и доводили до уровня 10 млн/мл. Уровни аутологичной противоопухолевой активности нейтрофилов исследовали в двух пробах: контрольная - инкубация осуществлялась без добавления метаболических активаторов; опытная - по заявленному способу. С помощью хемилюминесцентного метода определяли величину индекса аутологичной противоопухолевой активности нейтрофилов (ИАПАН), представляющий собой отношение площади под кривой люцигенин-зависимой зимозан-индуцированной хемилюминесценции (Sзим) к площади под кривой люцигенин-зависимой хемилюминесценции, индуцированной аутологичными опухолевыми клетками (Sок): ИАПАН = Sзим/Sок [6]. В таблице 1 представлены результаты определения величины ИПАН в контрольной пробе (ИПАНконтр.) и по заявленному способу (ИПАНопыт).

У 6 (35,3%) обследованных пациентов с раком почки и мочевого пузыря в контрольных пробах величина ИПАН была выше значения 2,0, что определяет низкий уровень аутологичной противоопухолевой активности нейтрофилов. При проведении метаболической активации нейтрофилов по заявленному способу у всех обследованных больных величина ИПАН стала ниже 2,0, что отражает высокий уровень аутологичной противоопухолевой активности нейтрофилов. При этом у тех пациентов, у которых величина ИПАН в контрольных пробах была ниже значения 2,0, при проведении метаболической активации нейтрофилов по заявленному способу величина ИПАН дополнительно снизилась. Таким образом, метаболическая активация по заявленному способу у больных с онкологическими заболеваниями в 100% случаев приводит к повышению уровня аутологичной противоопухолевой активности нейтрофилов.

Клинический пример. Больной А., 50 лет. Находился на стационарном лечении в урологическом отделении КГБУЗ «Красноярский краевой клинический онкологический диспансер им. А.И. Крыжановского» с 11.02.2019 по 26.04.2019 с диагнозом: рак правой почки, T₃N₀M₀. Операция 12.03.2019, проведена лапаротомия, радикальная нефрэктомия слева, дренирование забрюшинного пространства. Результаты гистологического исследования: светлоклеточный рак почки. Течение послеоперационного периода гладкое.

Проведено исследование заявленным способом. Определение уровня аутологичной противоопухолевой активности нейтрофилов осуществлялось хемилюминесцентным методом с подсчетом величины ИПАН. Установлено, что в контрольной пробе (без метаболической активации) ИПАН составил 1,72, при метаболической активации по заявленному способу ИПАН составил 1,28. Таким образом, метаболическая активация позволила повысить уровень аутологичной противоопухолевой активности нейтрофилов у пациента.

Технический результат предлагаемого способа заключается в повышении аутологичной противоопухолевой активности нейтрофилов in vitro путем 4-х часовой инкубации клеток с глутаминовой кислотой и глицеральдегид-3-фосфатом и дополнительным введением через 2 часа после начала инкубации аргинина.

Разработка способа выполнена в рамках проекта «Механизмы метаболического репрограммирования клеток врожденного иммунитета при опухолевом росте», финансируемого Краевым государственным автономным учреждением «Красноярский краевой фонд поддержки научной и научно-технической деятельности».

Источники информации

1. Москалев А.В., Рудой АС, Апчел А.В., Шангин А.Б. Роль нейтрофильных гранулоцитов в иммуновоспалительном процессе // Вестник Российской военно-медицинской академии. - 2016. - №4(56). - С. 191-195.

2. Патент №2452508 РФ. Способ стимуляции заживления кожных ран и функциональной активности нейтрофилов / Чердаков В.Ю., Смахтин М.Ю., Дубровин Г.М. и др. Опубл. 10.06.2012.

3. Патент №2603079 РФ. Способ активации цитотоксических лимфоцитов человека/ Каприн А.Д., Абакушина Е.В., Маризина Ю.В., Неприна Г.С. Опубл. 20.11.2016.

4. Савченко А.А., Борисов А.Г., Кудрявцев И.В., Гвоздев И.И., Мошев А.В. Взаимосвязь фенотипа и метаболизма нейтрофилов крови у больных раком почки // Медицинская иммунология. - 2020. - Т. 22, №5. - С. 887-896.

5. Савченко А.А., Борисов А.Г., Кудрявцев И.В., Гвоздев И.И., Мошев А.В. Особенности фенотипа дендритных клеток, дифференцированных из моноцитов крови, у больных раком почки // Медицинская иммунология. - 2018. - Т. 20, №2. - С. 215-226.

6. Патент №2737495 РФ. Способ определения аутологической противоопухолевоой активности нейтрофилов крови при онкологических заболеваниях /Савченко А.А., Борисов А.Г., Модестов А.А. и др. Опубл. 01.12.2020.

7. Соленова Л.Г. Современные подходы к оценке влияния загрязнения окружающей среды на онкологический риск // Успехи молекулярной онкологии. - 2020. - Т. 7, №1. - С. 17-22.

8. Bader J.E., Voss К., Rathmell J.C. Targeting Metabolism to Improve the Tumor Microenvironmentfor Cancer Immunotherapy // Mol. Cell. 2020. Vol. 78, no. 6. P. 1019-1033.

9. Masucci M.T., Minopoli M., Del Vecchio S., Carriero M.V. The Emerging Role of Neutrophil Extracellular Traps (NETs) in Tumor Progression and Metastasis // Front. Immunol. - 2020. Vol. 11. P. 1749.

10. Muronetz V.I., Melnikova A.K., Saso L., Schmalhausen E.V. Influence of Oxidative Stress on Catalytic and Non-glycolytic Functions of Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase // Curr. Med. Chem. - 2020. - Vol. 27, no. 13. - P. 2040-2058.

11. Oberg H.H., Wesch D., Kalyan S., Kabelitz D. Regulatory Interactions Between Neutrophils, Tumor Cells and T Cells // Front. Immunol. - 2019. - Vol. 10. - P. 1690.

12. Saini M., Szczerba B.M., Aceto N. Circulating Tumor Cell-Neutrophil Tango along the Metastatic Process // Cancer Res. - 2019. - Vol. 79, no. 24. - P. 6067-6073.

13. Veglia F., Tyurin V.A., Blasi M., De Leo A., Kossenkov A.V., Donthireddy L., To T.K.J., Schug Z., Basu S., Wang F., Ricciotti E., DiRusso C, Murphy M.E., Vonderheide R.H., Lieberman P.M., Mulligan C, Nam В., Hockstein N., Masters G., Guarino M., Lin C., Nefedova Y., Black P., Kagan V.E., Gabrilovich D.I. Fatty acid transport protein 2 reprograms neutrophils in cancer // Nature. - 2019. - Vol. 569, no. 7754. - P. 73-78.

14. Wang Q.T., Nie Y., Sun S.N., Lin Т., Han R.J., Jiang J., Li Z., Li J.Q., Xiao Y.P., Fan Y.Y., Yuan X.H., Zhang H., Zhao B.B., Zeng M., Li S.Y., Liao H.X., Zhang J., He Y.W. Tumor-associated antigen-based personalized dendritic cell vaccine in solid tumor patients // Cancer Immunol. Immunother. - 2020. - Vol.69, no. 7. - P. 1375-1387.

Изобретение относится к области биотехнологии. Способ повышения аутологичной противоопухолевой активности нейтрофилов in vitro у больных с онкологическими заболеваниями включает выделение клеток из венозной крови, их культивирование в условиях CO₂-инкубатора при 37°С в питательной среде при концентрации клеток 1⋅106 кл/мл, новым является то, что инкубацию осуществляют в течение 4-х часов в среде, дополнительно содержащей 0,5 М глутаминовой кислоты и 48,5 мМ глицеральдегид-3-фосфата, при этом через 2 часа после начала инкубации в среду вносят раствор аргинина в конечной концентрации 2М. Изобретение позволяет повысить аутологичную противоопухолевую активность нейтрофилов при онкологических заболеваниях путем метаболической активации нейтрофилов in vitro. 1 табл.

Способ повышения аутологичной противоопухолевой активности нейтрофилов in vitro у больных раком почки и мочевого пузыря, включающий выделение клеток из венозной крови, их культивирование в условиях CO₂-инкубатора при 37°С в питательной среде при концентрации клеток 1⋅10⁶ кл/мл, отличающийся тем, что инкубацию осуществляют в течение 4-х часов в среде, дополнительно содержащей 0,5 М глутаминовой кислоты и 48,5 мМ глицеральдегид-3-фосфата, при этом через 2 часа после начала инкубации в среду вносят раствор аргинина в конечной концентрации 2М.