СПОСОБ УПРАВЛЕНИЯ РИТМОМ СЕРДЦА И СОКРАЩЕНИЕМ ОТДЕЛЬНЫХ КАРДИОМИОЦИТОВ ПРИ ПОМОЩИ ТЕРМОГЕНЕТИКИ Российский патент 2023 года по МПК A61N1/36 A61N5/67 A61N7/02 C12N15/86 G09B23/28 

Настоящее изобретение относится к области медицины и биотехнологии, а именно к технологиям управления активностью возбудимых тканей, и может быть использовано для управления ритмом сердца in vivo, а также для управления сокращениями кардиомиоцитов in vitro.

Нарушения ритма и проводимости сердца являются существенной медико-социальной проблемой. Так, например, при синдроме слабости синусового узла синоатриальный водитель ритма не генерирует импульсы с достаточной частотой, что приводит к снижению частоты сердечных сокращений и возникновению пауз в работе сердца. Эти паузы могут приводить к обморокам и быть потенциально жизнеугрожающими. Другие нарушения ритма могут приводить к внезапному развитию фибрилляции желудочков и гибели пациентов в течение минут (внезапная сердечная смерть). Наиболее распространенная практика таких нарушений ритма – установка кардиостимулятора иди автоматического кардиовертера-дефибриллятора с имплантацией одного или двух электродов в полости сердца. Такой подход достаточно эффективен, однако существует риск перфорации стенки сердца при установке электродов, вероятность возникновения эндокардита, тромбозов, дислокации электродов и прочих осложнений как в раннем постоперационном, так и в отдалённом периодах. Автоматические кардиовертеры-дефибрилляторы, кроме того, при своём срабатывании генерируют крайне болезненные для пациента разряды, что приводит к существенному снижению качества жизни.

Из уровня техники известны технические решения, позволяющие стимулировать сердечную ткань при помощи света.

Известен способ оптической деполяризации ткани сердца при помощи экспрессии в кардиомиоцитах каналородопсинов – белковых ионных каналов, открывающихся под воздействием света (патент US9138596B2). Ген каналородопсина может доставляться в кардиомиоциты при помощи вирусного вектора. Для деполяризации используется имплантируемое устройство с источником света. При облучении сердца серией вспышек можно задавать частоту сердечного ритма, соответствующую частоте вспышек. Кроме того, Bruegmann и соавт. использовали трансгенных мышей, несущих ген каналородопсина-2 и стимуляцию сердца светом лазера (Bruegmann, T., Malan, D., Hesse, M. et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nat Methods 7, 897–900 (2010). https://doi.org/10.1038/nmeth.1512). Из уровня техники известен способ оптического контроля сердечной функции, позволяющий избежать генетической модификации тканей пациента (патент WO2012054484A1). Он предполагает использование биологического устройства, состоящего из невозбудимых клеток, несущих каналородопсины, деполяризуемых светом и формирующих щелевые контакты с клетками сердца.

Недостатком перечисленных выше способов является использование каналородопсинов, не встречающихся в организмах млекопитающих и вызывающих иммунную реакцию. Иммунная реакция в относительно короткий срок приводит к гибели клеток, экспрессирующих каналородопсины, будь то клетки собственно сердца или биологического устройства.

Из уровня техники известны технические решения, позволяющие управлять клетками при помощи термочувствительных ионных каналов. Однако эти решения не используются для управления ритмом сердца.

Известны, в частности, способы, позволяющие стимулировать иммунные клетки путём экспрессии в них механо- и термочувствительных ионных каналов c последующим воздействием при помощи ультразвука (патент WO2018098315A1). Регулирование клеточной активности с использованием термически активируемых каналов суперсемейства TRP (Transient Receptor Potential) является перспективным подходом, поскольку эти каналы присутствуют в организме человека и, таким образом, их экспрессия в ткани сердца не будет вызывать иммунную реакцию.

Наиболее близким к заявляемому техническому решению является способ неинвазивной нейромодуляции глубоких отделов мозга (Yang Y, Pacia CP, Ye D, Zhu L, Baek H, Yue Y, Yuan J, Miller MJ, Cui J, Culver JP, Bruchas MR, Chen H. Sonothermogenetics for noninvasive and cell-type specific deep brain neuromodulation. Brain Stimul. 2021 Jul-Aug;14(4):790-800. doi: 10.1016/j.brs.2021.04.021). В этом способе используются термочувствительные ионные каналы TRPV1 и нагрев клеток мозга при помощи высокоинтенсивного фокусированного ультразвука. Однако в этом способе не была реализована ритмическая стимуляция с достаточной частотой и он не использовался для управления ритмом сердца.

Раскрытие изобретения

Техническая проблема, решаемая настоящим изобретением, заключается в невозможности неинвазивного (без использования устройств, имплантируемых непосредственно в миокард) управления ритмом сердца.

При решении заявленной технической проблемы достигается следующие технические результаты: возможность неинвазивного управления ритмом сердца, а также возможность управления сокращениями отдельных кардиомиоцитов при помощи нагрева.

Для решения заявленной технической проблемы и достижения заявленного технического результата предлагается способ управления ритмом сердца и сокращением отдельных кардиомиоцитов при помощи термогенетики, включающий в себя следующие действия:

- создание генетических конструкций, содержащих в своём составе кардиоспецифический промотер и гены термически активируемых каналов суперсемейства TRP;

- доставку указанных конструкций в кардиомиоциты для последующей экспрессии соответствующего канала;

- нагрев сердца или отдельных кардиомиоцитов при помощи импульсов тепла заданной частоты или в постоянном режиме.

Краткое описание фигур

Фиг. 1. Карта генетической конструкции на основе плазмиды AAV, содержащей кардиоспецифичный промотер гена куриного тропонина Т (cTnT), а также последовательность человеческого термически активируемого канала TRPV1 с пришитой к нему последовательностью сигнального пептида FLAG-tag.

Фиг. 2. Результаты нагрева сердца мыши, которой были введены вирусные частицы, содержащие конструкцию AAV-cTnT-hTRPV1-FLAG. Нагрев осуществляется с частотой 5 Гц при помощи ИК лазера. Нижний график в крупном масштабе показывает момент синхронизации нагрева и ритма сердца (с 5-й по 7-ю секунду записи).

Фиг. 3. Карта генетической конструкции на основе плазмиды AAV, содержащей последовательность человеческого термически активируемого канала TRPV1 (укороченного для лучшей упаковки в вирусные частицы без потери функциональности), саморасщепляющийся пептид P2A, а также флюоресцентный белок mRuby.

Фиг. 4. Запись мембранного потенциала единичных кардиомиоцитов во время их нагрева при помощи ИК лазера. На верхнем графике представлена запись кардиомиоцита, содержащего конструкцию AAV-cTnT-hTRPV1(-110AA)-P2A-mRuby, на нижнем графике представлена запись контрольного кардиомиоцита без конструкции. Кардиомиоциты с конструкцией, в отличие от контрольных, демонстрируют синхронизацию потенциалов действия с нагревом.

Осуществление изобретения

В общем виде способ управления ритмом сердца и сокращением отдельных кардиомиоцитов при помощи термогенетики включает следующие этапы:

- создание генетической конструкции, посредством клонирования в коммерчески доступный вектор кардиоспецифического промотера и гена термически активируемого канала, а также репортера, позволяющего, в случае необходимости, визуализировать экспрессию термически активируемого канала в кардиомиоцитах;

- наработку полученной генетической конструкции при помощи трансформации бактерий E. coli с последующим их наращиванием и выделением плазмидной ДНК;

- генерацию вирусного вектора, подходящего для доставки вышеупомянутой генетической конструкции в кардиомиоциты;

- доставку генетической конструкции посредством внутривенной инъекции вирусных частиц, полученных на предыдущем этапе, либо трансдукцию кардиомиоцитов вирусными частицами in vitro;

- бесконтактное термическое воздействие на сердце или отдельные кардиомиоциты при помощи инфракрасного (ИК) лазера или высокоинтенсивного сфокусированного ультразвука с одновременной регистрацией электрической активности.

Примеры

Пример 1. Управление ритмом сердца мыши при помощи термогенетики

Создание и наработка генетической конструкции

Для создания генетических конструктов пользовались методом AQUA cloning (Beyer et al., 2015). В качестве основы для клонирования была взята плазмида AAV, в которую были клонированы кардиоспецифичный промотер гена куриного тропонина Т (cTnT), а также последовательность человеческого термически активируемого канала TRPV1 с пришитой к нему последовательностью сигнального пептида FLAG. Этот сигнальный пептид необходим для последующего выявления TRPV1 в тканях сердца при помощи иммуногистохимии. Карта полученной конструкции (SEQ ID NO:1) AAV-cTnT-hTRPV1-FLAG приведена на фиг.1

Генерация вирусного вектора и доставка генетической конструкции

Аденоассоциированные вирусы, несущие конструкцию AAV-cTnT-hTRPV1-FLAG, были сгенерированы при помощи коммерчески доступного сервиса. Трансдукция тканей миокарда для последующего управления ритмом сердца осуществляли посредством внутривенной инъекции за 28 дней до эксперимента согласно следующему протоколу:

1. Анестезировать животное изофлураном (5% изофлуран для индукции наркоза, 1.5% для проведения хирургического вмешательства).

2. Локально обезболить кожу и подкожную клетчатку при помощи 0,25% бупивакаина.

3. Под операционным микроскопом выполнить разрез кожи в районе шеи животного для получения доступа к яремной вене.

4. С помощью инсулинового шприца со стерильной иглой 30G набрать вирусную суспензию, содержащая AAV частицы AAV-cTnT-hTRPV1-FLAG (100 мкл, концентрация не менее 10¹² геномов в мл).

5. Ввести суспензию в ярёмную вену, удалить иглу, прижать место инъекции стерильным ватным тампоном на 2 мин.

6. Наложить швы на кожу, вывести животное из анестезии

Бесконтактное термическое воздействие на сердце при помощи ИК лазера

Для определения возможности управления ритмом сердца при помощи термогенетики применялся программно-аппаратный комплекс, включающий в себя усилитель электрокардиографического сигнала, генератор импульсов, источник ИК лазерного излучения с блоком охлаждения, источник видимого лазерного излучения, оптическую систему с выводным оптоволокном, закреплённым на стереотаксической системе, термопару с усилителем, аналого-цифровой преобразователь (АЦП) и компьютер с программным обеспечением, обеспечивающим регистрацию сигнала с АЦП. Усилитель электрокардиографического сигнала и усилитель термопары подключаются непосредственно к АЦП, обеспечивая регистрацию электрокардиограммы (ЭКГ) и температуры миокарда соответственно. Генератор импульсов имеет выход, управляющий сигнал с которого одновременно подаётся на источник лазерного излучения и АЦП. Таким образом, обеспечивается синхронная регистрация режима работы лазера, температуры в области нагрева и ЭКГ. Оптическая система осуществляет смешивание ИК излучения и видимого света в выводном оптоволокне. Перемещение этого оптоволокна при помощи стереотаксической системы позволяет прицельно нагревать целевую область миокарда и визуализировать область нагрева.

1. Для анестезии внутрибрюшинно ввести тилетамина гидрохлорид/золазепама гидрохлорид (Золетил, Virbac Sante Animale, Франция) – 40 мг/кг и ксилазина гидрохлорид (Рометар, Bioveta, Чехия) – 10 мг/кг.

2. При помощи депиляционного крема удалить шерсть с конечностей животного.

3. Нанести на конечности животного гель для регистрации ЭКГ.

4. Фиксировать конечности животного к подогреваемому столику при помощи одноразовых самоклеящихся электродов для регистрации ЭКГ.

5. Подключить к одноразовым электродам провода усилителя ЭКГ-сигнала.

6. Интубировать животное

7. Подключить вентилятор для мелких животных. Использовать следующие параметры искусственной вентиляции лёгких: частота – 90 мин^-1, дыхательный объём – 0,25 мл, отношение времени вдоха ко времени выдоха – 50%, положительное давление в конце выдоха (PEEP) – 5 см водного столба.

8. Локально обезболить кожу и подкожную клетчатку при помощи 0,25% бупивакаина.

9. Вскрыть грудную клетку путём рассечения грудины по срединной линии.

10. Имплантировать термопару в место нагрева

11. Включить источник видимого света и подвести оптоволокно к месту нагрева

12. Задать при помощи генератора импульсов желаемую частоту и интенсивность нагрева.

13. Начать регистрацию сигналов АЦП, после чего при помощи генератора импульсов запустить источник ИК излучения.

В проведённом эксперименте было показано, что при импульсном нагреве верхушки сердца мыши при помощи ИК лазера позволяет навязывать ритм с частотой до 7 Гц (420 ударов в минуту). Пример навязывания ритма с частотой 5 Гц показан на фиг. 2.

Пример 2. Управление сокращениями отдельных кардиомиоцитов in vitro при помощи термогенетики

Создание и наработка генетической конструкции, генерация вирусного вектора

Для создания генетических конструктов пользовались методом AQUA cloning (Beyer et al., 2015). В качестве основы для клонирования была взята плазмида AAV, в которую были клонированы кардиоспецифичный промотер гена куриного тропонина Т (cTnT), последовательность человеческого термически активируемого канала TRPV1 (укороченного на 110 аминокислот для лучшей упаковки в вирусные частицы без потери функциональности), саморасщепляющийся пептид P2A, а также флюоресцентный белок mRuby. Такая конструкция обеспечивает визуализацию трансдуцированных клеток при помощи флюоресцентного микроскопа. Карта полученной конструкции (SEQ ID NO:2) AAV-cTnT-hTRPV1(-110AA)-P2A-mRuby приведены на фиг. 3. Аденоассоциированные вирусы, несущие конструкцию AAV-cTnT-hTRPV1(-110AA)-P2A-mRuby, были сгенерированы при помощи коммерчески доступного сервиса.

Выделение и трансдукция неонатальных кардиомиоцитов

Для выделения первичной культуры неонатальных кардиомиоцитов использовались мыши в возрасте от 1 до 3 дней с использованием набора для диссоциации сердечной ткани (Miltenyi biotec) и буфера для лизиса эритроцитов (Miltenyi biotec) Подготовка к выделению производилась по следующему протоколу:

1. Декапитировать животное ножницами, зафиксировать конечности на подложке при помощи игл.

2. Сделать разрез вдоль грудной клетки. Пинцетом извлечь сердце и поместить в чашку Петри с PBS на льду. Выдавить остатки крови при помощи пинцета. Повторить пункты 1-2 для получения нужного количества сердец. Суммарный выход клеток с одного сердца составляет около 700 000.

3. Очистить сердца от соединительных тканей. При наличии остатков крови выдавить их при помощи пинцета.

Далее процедура проводилась согласно протоколу производителя набора реагентов. Клетки высаживались на стёкла, покрытые желатином, из расчёта 10000 клеток на см². На следующий после выделения день осуществляли трансдукцию, внося в культуральную среду вирусные частицы AAV, несущие конструкцию AAV-cTnT-hTRPV1(-110AA)-P2A-mRuby из расчёта 7,5 тысяч частиц на клетку. Через сутки осуществляли замену культуральной среды, ещё через трое суток проводили эксперименты по управлению сокращениями отдельных кардиомиоцитов.

Бесконтактное термическое воздействие на кардиомиоциты при помощи ИК лазера

Для управления сокращениями отдельных кардиомиоцитов была использована установка, аналогичная описанной в примере 1, однако вместо ЭКГ регистрировался мембранный потенциал кардиомиоцитов при помощи электрофизиологических установок, известных из уровня техники. Использовалось оптоволокно диаметром 100 мкм, что позволяло нагревать единичные клетки. Для соотнесения интенсивности лазерного излучения с температурой в пятне нагрева предварительно производилась калибровка.

В проведённом эксперименте было показано, что при импульсном нагреве отдельных кардиомиоцитов при помощи ИК лазера возникают потенциалы действия, что позволяет вызывать сокращения с частотой до 7 Гц. Пример возникновения потенциалов действия при стимуляции с частотой 2 Гц приведён на фиг.4.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of

the Russian Academy of Sciences

<120> СПОСОБ УПРАВЛЕНИЯ РИТМОМ СЕРДЦА И СОКРАЩЕНИЕМ ОТДЕЛЬНЫХ

КАРДИОМИОЦИТОВ ПРИ ПОМОЩИ ТЕРМОГЕНЕТИКИ

<130> 0

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 6898

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Plasmid for adeno-associated viruses generation

<220>

<221> exon

<222> (1045)..(3561)

<400> 1

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc

60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca

120

actccatcac taggggttcc tgcggccgca cgcgtggagc tagttattaa tagtaatcaa

180

ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa

240

atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg

300

ttcccatagt aacgtcaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt

360

aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg

420

tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc

480

ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggttcgc ccttacgggc

540

cccccctcga ggtcgggata aaagcagtct gggctttcac atgacagcat ctggggctgc

600

ggcagagggt cgggtccgaa gcgctgcctt atcagcgtcc ccagccctgg gaggtgacag

660

ctggctggct tgtgtcagcc cctcgggcac tcacgtatct ccgtccgacg ggtttaaaat

720

agcaaaactc tgaggccaca caatagcttg ggcttatatg ggctcctgtg ggggaagggg

780

gagcacggag ggggccgggg ccgctgctgc caaaatagca gctcacaagt gttgcattcc

840

tctctgggcg ccgggcacat tcctgctggc tctgcccgcc ccggggtggg cgccgggggg

900

accttaaagc ctctgccccc caaggagccc ttcccagaca gccgccggca cccaccgctc

960

cgtgggacga tccccgaagc tctagagctt tattgcggta gtttatcaca gttaaattgc

1020

taacgcagtc aggagctcgc cacc atg aag aaa tgg agc agc aca gac ttg

1071

Met Lys Lys Trp Ser Ser Thr Asp Leu

1 5

ggg gca gct gcg gac cca ctc caa aag gac acc tgc cca gac ccc ctg

1119

Gly Ala Ala Ala Asp Pro Leu Gln Lys Asp Thr Cys Pro Asp Pro Leu

10 15 20 25

gat gga gac cct aac tcc agg cca cct cca gcc aag ccc cag ctc tcc

1167

Asp Gly Asp Pro Asn Ser Arg Pro Pro Pro Ala Lys Pro Gln Leu Ser

30 35 40

acg gcc aag agc cgc acc cgg ctc ttt ggg aag ggt gac tcg gag gag

1215

Thr Ala Lys Ser Arg Thr Arg Leu Phe Gly Lys Gly Asp Ser Glu Glu

45 50 55

gct ttc ccg gtg gat tgc cct cac gag gaa ggt gag ctg gac tcc tgc

1263

Ala Phe Pro Val Asp Cys Pro His Glu Glu Gly Glu Leu Asp Ser Cys

60 65 70

ccg acc atc aca gtc agc cct gtt atc acc atc cag agg cca gga gac

1311

Pro Thr Ile Thr Val Ser Pro Val Ile Thr Ile Gln Arg Pro Gly Asp

75 80 85

ggc ccc acc ggt gcc agg ctg ctg tcc cag gac tct gtc gcc gcc agc

1359

Gly Pro Thr Gly Ala Arg Leu Leu Ser Gln Asp Ser Val Ala Ala Ser

90 95 100 105

acc gag aag acc ctc agg ctc tat gat cgc agg agt atc ttt gaa gcc

1407

Thr Glu Lys Thr Leu Arg Leu Tyr Asp Arg Arg Ser Ile Phe Glu Ala

110 115 120

gtt gct cag aat aac tgc cag gat ctg gag agc ctg ctg ctc ttc ctg

1455

Val Ala Gln Asn Asn Cys Gln Asp Leu Glu Ser Leu Leu Leu Phe Leu

125 130 135

cag aag agc aag aag cac ctc aca gac aac gag ttc aaa gac cct gag

1503

Gln Lys Ser Lys Lys His Leu Thr Asp Asn Glu Phe Lys Asp Pro Glu

140 145 150

aca ggg aag acc tgt ctg ctg aaa gcc atg ctc aac ctg cat gac gga

1551

Thr Gly Lys Thr Cys Leu Leu Lys Ala Met Leu Asn Leu His Asp Gly

155 160 165

cag aac acc acc atc ccc ctg ctc ctg gag atc gcg cgg caa acg gac

1599

Gln Asn Thr Thr Ile Pro Leu Leu Leu Glu Ile Ala Arg Gln Thr Asp

170 175 180 185

agc ctg aag gag ctt gtc aac gcc agc tac acg gac agc tac tac aag

1647

Ser Leu Lys Glu Leu Val Asn Ala Ser Tyr Thr Asp Ser Tyr Tyr Lys

190 195 200

ggc cag aca gca ctg cac atc gcc atc gag aga cgc aac atg gcc ctg

1695

Gly Gln Thr Ala Leu His Ile Ala Ile Glu Arg Arg Asn Met Ala Leu

205 210 215

gtg acc ctc ctg gtg gag aac gga gca gac gtc cag gct gcg gcc cat

1743

Val Thr Leu Leu Val Glu Asn Gly Ala Asp Val Gln Ala Ala Ala His

220 225 230

ggg gac ttc ttt aag aaa acc aaa ggg cgg cct gga ttc tac ttc ggt

1791

Gly Asp Phe Phe Lys Lys Thr Lys Gly Arg Pro Gly Phe Tyr Phe Gly

235 240 245

gaa ctg ccc ctg tcc ctg gcc gcg tgc acc aac cag ctg ggc atc gtg

1839

Glu Leu Pro Leu Ser Leu Ala Ala Cys Thr Asn Gln Leu Gly Ile Val

250 255 260 265

aag ttc ctg ctg cag aac tcc tgg cag acg gcc gac atc agc gcc agg

1887

Lys Phe Leu Leu Gln Asn Ser Trp Gln Thr Ala Asp Ile Ser Ala Arg

270 275 280

gac tcg gtg ggc aac acg gtg ctg cac gcc ctg gtg gag gtg gcc gac

1935

Asp Ser Val Gly Asn Thr Val Leu His Ala Leu Val Glu Val Ala Asp

285 290 295

aac acg gcc gac aac acg aag ttt gtg acg agc atg tac aat gag att

1983

Asn Thr Ala Asp Asn Thr Lys Phe Val Thr Ser Met Tyr Asn Glu Ile

300 305 310

ctg atc ctg ggg gcc aaa ctg cac ccg acg ctg aag ctg gag gag ctc

2031

Leu Ile Leu Gly Ala Lys Leu His Pro Thr Leu Lys Leu Glu Glu Leu

315 320 325

acc aac aag aag gga atg acg ccg ctg gct ctg gca gct ggg acc ggg

2079

Thr Asn Lys Lys Gly Met Thr Pro Leu Ala Leu Ala Ala Gly Thr Gly

330 335 340 345

aag atc ggg gtc ttg gcc tat att ctc cag cgg gag atc cag gag ccc

2127

Lys Ile Gly Val Leu Ala Tyr Ile Leu Gln Arg Glu Ile Gln Glu Pro

350 355 360

gag tgc agg cac ctg tcc agg aag ttc acc gag tgg gcc tac ggg ccc

2175

Glu Cys Arg His Leu Ser Arg Lys Phe Thr Glu Trp Ala Tyr Gly Pro

365 370 375

gtg cac tcc tcg ctg tac gac ctg tcc tgc atc gac acc tgc gag aag

2223

Val His Ser Ser Leu Tyr Asp Leu Ser Cys Ile Asp Thr Cys Glu Lys

380 385 390

aac tcg gtg ctg gag gtg atc gcc tac agc agc agc gag acc cct aat

2271

Asn Ser Val Leu Glu Val Ile Ala Tyr Ser Ser Ser Glu Thr Pro Asn

395 400 405

cgc cac gac atg ctc ttg gtg gag ccg ctg aac cga ctc ctg cag gac

2319

Arg His Asp Met Leu Leu Val Glu Pro Leu Asn Arg Leu Leu Gln Asp

410 415 420 425

aag tgg gac aga ttc gtc aag cgc atc ttc tac ttc aac ttc ctg gtc

2367

Lys Trp Asp Arg Phe Val Lys Arg Ile Phe Tyr Phe Asn Phe Leu Val

430 435 440

tac tgc ctg tac atg atc atc ttc acc atg gct gcc tac tac agg ccc

2415

Tyr Cys Leu Tyr Met Ile Ile Phe Thr Met Ala Ala Tyr Tyr Arg Pro

445 450 455

gtg gat ggc ttg cct ccc ttt aag atg gaa aaa att gga gac tat ttc

2463

Val Asp Gly Leu Pro Pro Phe Lys Met Glu Lys Ile Gly Asp Tyr Phe

460 465 470

cga gtt act gga gag atc ctg tct gtg tta gga gga gtc tac ttc ttt

2511

Arg Val Thr Gly Glu Ile Leu Ser Val Leu Gly Gly Val Tyr Phe Phe

475 480 485

ttc cga ggg att cag tat ttc ctg cag agg cgg ccg tcg atg aag acc

2559

Phe Arg Gly Ile Gln Tyr Phe Leu Gln Arg Arg Pro Ser Met Lys Thr

490 495 500 505

ctg ttt gtg gac agc tac agt gag atg ctt ttc ttt ctg cag tca ctg

2607

Leu Phe Val Asp Ser Tyr Ser Glu Met Leu Phe Phe Leu Gln Ser Leu

510 515 520

ttc atg ctg gcc acc gtg gtg ctg tac ttc agc cac ctc aag gag tat

2655

Phe Met Leu Ala Thr Val Val Leu Tyr Phe Ser His Leu Lys Glu Tyr

525 530 535

gtg gct tcc atg gta ttc tcc ctg gcc ttg ggc tgg acc aac atg ctc

2703

Val Ala Ser Met Val Phe Ser Leu Ala Leu Gly Trp Thr Asn Met Leu

540 545 550

tac tac acc cgc ggt ttc cag cag atg ggc atc tat gcc gtc atg ata

2751

Tyr Tyr Thr Arg Gly Phe Gln Gln Met Gly Ile Tyr Ala Val Met Ile

555 560 565

gag aag atg atc ctg aga gac ctg tgc cgt ttc atg ttt gtc tac atc

2799

Glu Lys Met Ile Leu Arg Asp Leu Cys Arg Phe Met Phe Val Tyr Ile

570 575 580 585

gtc ttc ttg ttc ggg ttt tcc aca gcg gtg gtg acg ctg att gaa gac

2847

Val Phe Leu Phe Gly Phe Ser Thr Ala Val Val Thr Leu Ile Glu Asp

590 595 600

ggg aag aat gac tcc ctg ccg tct gag tcc acg tcg cac agg tgg cgg

2895

Gly Lys Asn Asp Ser Leu Pro Ser Glu Ser Thr Ser His Arg Trp Arg

605 610 615

ggg cct gcc tgc agg ccc ccc gat agc tcc tac aac agc ctg tac tcc

2943

Gly Pro Ala Cys Arg Pro Pro Asp Ser Ser Tyr Asn Ser Leu Tyr Ser

620 625 630

acc tgc ctg gag ctg ttc aag ttc acc atc ggc atg ggc gac ctg gag

2991

Thr Cys Leu Glu Leu Phe Lys Phe Thr Ile Gly Met Gly Asp Leu Glu

635 640 645

ttc act gag aac tat gac ttc aag gct gtc ttc atc atc ctg ctg ctg

3039

Phe Thr Glu Asn Tyr Asp Phe Lys Ala Val Phe Ile Ile Leu Leu Leu

650 655 660 665

gcc tat gta att ctc acc tac atc ctc ctg ctc aac atg ctc atc gcc

3087

Ala Tyr Val Ile Leu Thr Tyr Ile Leu Leu Leu Asn Met Leu Ile Ala

670 675 680

ctc atg ggt gag act gtc aac aag atc gca cag gag agc aag aac atc

3135

Leu Met Gly Glu Thr Val Asn Lys Ile Ala Gln Glu Ser Lys Asn Ile

685 690 695

tgg aag ctg cag aga gcc atc acc atc ctg gac acg gag aag agc ttc

3183

Trp Lys Leu Gln Arg Ala Ile Thr Ile Leu Asp Thr Glu Lys Ser Phe

700 705 710

ctt aag tgc atg agg aag gcc ttc cgc tca ggc aag ctg ctg cag gtg

3231

Leu Lys Cys Met Arg Lys Ala Phe Arg Ser Gly Lys Leu Leu Gln Val

715 720 725

ggg tac aca cct gat ggc aag gac gac tac cgg tgg tgc ttc agg gtg

3279

Gly Tyr Thr Pro Asp Gly Lys Asp Asp Tyr Arg Trp Cys Phe Arg Val

730 735 740 745

gac gag gtg aac tgg acc acc tgg aac acc aac gtg ggc atc atc aac

3327

Asp Glu Val Asn Trp Thr Thr Trp Asn Thr Asn Val Gly Ile Ile Asn

750 755 760

gaa gac ccg ggc aac tgt gag ggc gtc aag cgc acc ctg agc ttc tcc

3375

Glu Asp Pro Gly Asn Cys Glu Gly Val Lys Arg Thr Leu Ser Phe Ser

765 770 775

ctg cgg tca agc aga gtt tca ggc aga cac tgg aag aac ttt gcc ctg

3423

Leu Arg Ser Ser Arg Val Ser Gly Arg His Trp Lys Asn Phe Ala Leu

780 785 790

gtc ccc ctt tta aga gag gca agt gct cga gat agg cag tct gct cag

3471

Val Pro Leu Leu Arg Glu Ala Ser Ala Arg Asp Arg Gln Ser Ala Gln

795 800 805

ccc gag gaa gtt tat ctg cga cag ttt tca ggg tct ctg aag cca gag

3519

Pro Glu Glu Val Tyr Leu Arg Gln Phe Ser Gly Ser Leu Lys Pro Glu

810 815 820 825

gac gct gag gtc ttc aag agt cct gcc gct tcc ggg gag aag

3561

Asp Ala Glu Val Phe Lys Ser Pro Ala Ala Ser Gly Glu Lys

830 835

gattacaagg acgacgacga taaggattac aaggacgacg acgataagga ttacaaggac

3621

gacgacgata agtaaagatc tacgggtggc atccctgtga cccctcccca gtgcctctcc

3681

tggccctgga agttgccact ccagtgccca ccagccttgt cctaataaaa ttaagttgca

3741

tcattttgtc tgactaggtg tccttctata atattatggg gtggaggggg gtggtatgga

3801

gcaaggggca agttgggaag acaacctgta gggcctgcgg ggtctattgg gaaccaagct

3861

ggagtgcagt ggcacaatct tggctcactg caatctccgc ctcctgggtt caagcgattc

3921

tcctgcctca gcctcccgag ttgttgggat tccaggcatg catgaccagg ctcagctaat

3981

ttttgttttt ttggtagaga cggggtttca ccatattggc caggctggtc tccaactcct

4041

aatctcaggt gatctaccca ccttggcctc ccaaattgct gggattacag gcgtgaacca

4101

ctgctccctt ccctgtcctt ctgattttgt aggtaaccac gtgcggaccg agcggccgca

4161

ggaaccccta gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc

4221

cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg

4281

agcgcgcagc tgcctgcagg ggcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg

4341

tatttcacac cgcatacgtc aaagcaacca tagtacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc

4401

gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc

4461

gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct

4521

ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa

4581

aaacttgatt tgggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc

4641

cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct tgttccaaac tggaacaaca

4701

ctcaacccta tctcgggcta ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat ttcggcctat

4761

tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga attttaacaa aatattaacg

4821

tttacaattt tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag

4881

ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc

4941

gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca

5001

tcaccgaaac gcgcgagacg aaagggcctc gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc

5061

atgataataa tggtttctta gacgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc

5121

cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc

5181

tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc

5241

gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg

5301

gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat

5361

ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc

5421

acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa

5481

ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc agtcacagaa

5541

aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt

5601

gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct

5661

tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat

5721

gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg

5781

cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg

5841

atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt

5901

attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg

5961

ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca ggcaactatg

6021

gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg

6081

tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa

6141

aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt

6201

tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt

6261

tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt

6321

ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag

6381

ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta

6441

gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat

6501

aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg

6561

ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg

6621

agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac

6681

aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga

6741

aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt

6801

ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta

6861

cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgt

6898

<210> 2

<211> 7285

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Plasmid for adeno-associated viruses generation

<220>

<221> exon

<222> (1045)..(3234)

<220>

<221> exon

<222> (3310)..(4020)

<400> 2

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc

60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca

120

actccatcac taggggttcc tgcggccgca cgcgtggagc tagttattaa tagtaatcaa

180

ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa

240

atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg

300

ttcccatagt aacgtcaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt

360

aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg

420

tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc

480

ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggttcgc ccttacgggc

540

cccccctcga ggtcgggata aaagcagtct gggctttcac atgacagcat ctggggctgc

600

ggcagagggt cgggtccgaa gcgctgcctt atcagcgtcc ccagccctgg gaggtgacag

660

ctggctggct tgtgtcagcc cctcgggcac tcacgtatct ccgtccgacg ggtttaaaat

720

agcaaaactc tgaggccaca caatagcttg ggcttatatg ggctcctgtg ggggaagggg

780

gagcacggag ggggccgggg ccgctgctgc caaaatagca gctcacaagt gttgcattcc

840

tctctgggcg ccgggcacat tcctgctggc tctgcccgcc ccggggtggg cgccgggggg

900

accttaaagc ctctgccccc caaggagccc ttcccagaca gccgccggca cccaccgctc

960

cgtgggacga tccccgaagc tctagagctt tattgcggta gtttatcaca gttaaattgc

1020

taacgcagtc aggagctcgc cacc atg agg ctc tat gat cgc agg agt atc

1071

Met Arg Leu Tyr Asp Arg Arg Ser Ile

1 5

ttt gaa gcc gtt gct cag aat aac tgc cag gat ctg gag agc ctg ctg

1119

Phe Glu Ala Val Ala Gln Asn Asn Cys Gln Asp Leu Glu Ser Leu Leu

10 15 20 25

ctc ttc ctg cag aag agc aag aag cac ctc aca gac aac gag ttc aaa

1167

Leu Phe Leu Gln Lys Ser Lys Lys His Leu Thr Asp Asn Glu Phe Lys

30 35 40

gac cct gag aca ggg aag acc tgt ctg ctg aaa gcc atg ctc aac ctg

1215

Asp Pro Glu Thr Gly Lys Thr Cys Leu Leu Lys Ala Met Leu Asn Leu

45 50 55

cat gac gga cag aac acc acc atc ccc ctg ctc ctg gag atc gcg cgg

1263

His Asp Gly Gln Asn Thr Thr Ile Pro Leu Leu Leu Glu Ile Ala Arg

60 65 70

caa acg gac agc ctg aag gag ctt gtc aac gcc agc tac acg gac agc

1311

Gln Thr Asp Ser Leu Lys Glu Leu Val Asn Ala Ser Tyr Thr Asp Ser

75 80 85

tac tac aag ggc cag aca gca ctg cac atc gcc atc gag aga cgc aac

1359

Tyr Tyr Lys Gly Gln Thr Ala Leu His Ile Ala Ile Glu Arg Arg Asn

90 95 100 105

atg gcc ctg gtg acc ctc ctg gtg gag aac gga gca gac gtc cag gct

1407

Met Ala Leu Val Thr Leu Leu Val Glu Asn Gly Ala Asp Val Gln Ala

110 115 120

gcg gcc cat ggg gac ttc ttt aag aaa acc aaa ggg cgg cct gga ttc

1455

Ala Ala His Gly Asp Phe Phe Lys Lys Thr Lys Gly Arg Pro Gly Phe

125 130 135

tac ttc ggt gaa ctg ccc ctg tcc ctg gcc gcg tgc acc aac cag ctg

1503

Tyr Phe Gly Glu Leu Pro Leu Ser Leu Ala Ala Cys Thr Asn Gln Leu

140 145 150

ggc atc gtg aag ttc ctg ctg cag aac tcc tgg cag acg gcc gac atc

1551

Gly Ile Val Lys Phe Leu Leu Gln Asn Ser Trp Gln Thr Ala Asp Ile

155 160 165

agc gcc agg gac tcg gtg ggc aac acg gtg ctg cac gcc ctg gtg gag

1599

Ser Ala Arg Asp Ser Val Gly Asn Thr Val Leu His Ala Leu Val Glu

170 175 180 185

gtg gcc gac aac acg gcc gac aac acg aag ttt gtg acg agc atg tac

1647

Val Ala Asp Asn Thr Ala Asp Asn Thr Lys Phe Val Thr Ser Met Tyr

190 195 200

aat gag att ctg atc ctg ggg gcc aaa ctg cac ccg acg ctg aag ctg

1695

Asn Glu Ile Leu Ile Leu Gly Ala Lys Leu His Pro Thr Leu Lys Leu

205 210 215

gag gag ctc acc aac aag aag gga atg acg ccg ctg gct ctg gca gct

1743

Glu Glu Leu Thr Asn Lys Lys Gly Met Thr Pro Leu Ala Leu Ala Ala

220 225 230

ggg acc ggg aag atc ggg gtc ttg gcc tat att ctc cag cgg gag atc

1791

Gly Thr Gly Lys Ile Gly Val Leu Ala Tyr Ile Leu Gln Arg Glu Ile

235 240 245

cag gag ccc gag tgc agg cac ctg tcc agg aag ttc acc gag tgg gcc

1839

Gln Glu Pro Glu Cys Arg His Leu Ser Arg Lys Phe Thr Glu Trp Ala

250 255 260 265

tac ggg ccc gtg cac tcc tcg ctg tac gac ctg tcc tgc atc gac acc

1887

Tyr Gly Pro Val His Ser Ser Leu Tyr Asp Leu Ser Cys Ile Asp Thr

270 275 280

tgc gag aag aac tcg gtg ctg gag gtg atc gcc tac agc agc agc gag

1935

Cys Glu Lys Asn Ser Val Leu Glu Val Ile Ala Tyr Ser Ser Ser Glu

285 290 295

acc cct aat cgc cac gac atg ctc ttg gtg gag ccg ctg aac cga ctc

1983

Thr Pro Asn Arg His Asp Met Leu Leu Val Glu Pro Leu Asn Arg Leu

300 305 310

ctg cag gac aag tgg gac aga ttc gtc aag cgc atc ttc tac ttc aac

2031

Leu Gln Asp Lys Trp Asp Arg Phe Val Lys Arg Ile Phe Tyr Phe Asn

315 320 325

ttc ctg gtc tac tgc ctg tac atg atc atc ttc acc atg gct gcc tac

2079

Phe Leu Val Tyr Cys Leu Tyr Met Ile Ile Phe Thr Met Ala Ala Tyr

330 335 340 345

tac agg ccc gtg gat ggc ttg cct ccc ttt aag atg gaa aaa att gga

2127

Tyr Arg Pro Val Asp Gly Leu Pro Pro Phe Lys Met Glu Lys Ile Gly

350 355 360

gac tat ttc cga gtt act gga gag atc ctg tct gtg tta gga gga gtc

2175

Asp Tyr Phe Arg Val Thr Gly Glu Ile Leu Ser Val Leu Gly Gly Val

365 370 375

tac ttc ttt ttc cga ggg att cag tat ttc ctg cag agg cgg ccg tcg

2223

Tyr Phe Phe Phe Arg Gly Ile Gln Tyr Phe Leu Gln Arg Arg Pro Ser

380 385 390

atg aag acc ctg ttt gtg gac agc tac agt gag atg ctt ttc ttt ctg

2271

Met Lys Thr Leu Phe Val Asp Ser Tyr Ser Glu Met Leu Phe Phe Leu

395 400 405

cag tca ctg ttc atg ctg gcc acc gtg gtg ctg tac ttc agc cac ctc

2319

Gln Ser Leu Phe Met Leu Ala Thr Val Val Leu Tyr Phe Ser His Leu

410 415 420 425

aag gag tat gtg gct tcc atg gta ttc tcc ctg gcc ttg ggc tgg acc

2367

Lys Glu Tyr Val Ala Ser Met Val Phe Ser Leu Ala Leu Gly Trp Thr

430 435 440

aac atg ctc tac tac acc cgc ggt ttc cag cag atg ggc atc tat gcc

2415

Asn Met Leu Tyr Tyr Thr Arg Gly Phe Gln Gln Met Gly Ile Tyr Ala

445 450 455

gtc atg ata gag aag atg atc ctg aga gac ctg tgc cgt ttc atg ttt

2463

Val Met Ile Glu Lys Met Ile Leu Arg Asp Leu Cys Arg Phe Met Phe

460 465 470

gtc tac atc gtc ttc ttg ttc ggg ttt tcc aca gcg gtg gtg acg ctg

2511

Val Tyr Ile Val Phe Leu Phe Gly Phe Ser Thr Ala Val Val Thr Leu

475 480 485

att gaa gac ggg aag aat gac tcc ctg ccg tct gag tcc acg tcg cac

2559

Ile Glu Asp Gly Lys Asn Asp Ser Leu Pro Ser Glu Ser Thr Ser His

490 495 500 505

agg tgg cgg ggg cct gcc tgc agg ccc ccc gat agc tcc tac aac agc

2607

Arg Trp Arg Gly Pro Ala Cys Arg Pro Pro Asp Ser Ser Tyr Asn Ser

510 515 520

ctg tac tcc acc tgc ctg gag ctg ttc aag ttc acc atc ggc atg ggc

2655

Leu Tyr Ser Thr Cys Leu Glu Leu Phe Lys Phe Thr Ile Gly Met Gly

525 530 535

gac ctg gag ttc act gag aac tat gac ttc aag gct gtc ttc atc atc

2703

Asp Leu Glu Phe Thr Glu Asn Tyr Asp Phe Lys Ala Val Phe Ile Ile

540 545 550

ctg ctg ctg gcc tat gta att ctc acc tac atc ctc ctg ctc aac atg

2751

Leu Leu Leu Ala Tyr Val Ile Leu Thr Tyr Ile Leu Leu Leu Asn Met

555 560 565

ctc atc gcc ctc atg ggt gag act gtc aac aag atc gca cag gag agc

2799

Leu Ile Ala Leu Met Gly Glu Thr Val Asn Lys Ile Ala Gln Glu Ser

570 575 580 585

aag aac atc tgg aag ctg cag aga gcc atc acc atc ctg gac acg gag

2847

Lys Asn Ile Trp Lys Leu Gln Arg Ala Ile Thr Ile Leu Asp Thr Glu

590 595 600

aag agc ttc ctt aag tgc atg agg aag gcc ttc cgc tca ggc aag ctg

2895

Lys Ser Phe Leu Lys Cys Met Arg Lys Ala Phe Arg Ser Gly Lys Leu

605 610 615

ctg cag gtg ggg tac aca cct gat ggc aag gac gac tac cgg tgg tgc

2943

Leu Gln Val Gly Tyr Thr Pro Asp Gly Lys Asp Asp Tyr Arg Trp Cys

620 625 630

ttc agg gtg gac gag gtg aac tgg acc acc tgg aac acc aac gtg ggc

2991

Phe Arg Val Asp Glu Val Asn Trp Thr Thr Trp Asn Thr Asn Val Gly

635 640 645

atc atc aac gaa gac ccg ggc aac tgt gag ggc gtc aag cgc acc ctg

3039

Ile Ile Asn Glu Asp Pro Gly Asn Cys Glu Gly Val Lys Arg Thr Leu

650 655 660 665

agc ttc tcc ctg cgg tca agc aga gtt tca ggc aga cac tgg aag aac

3087

Ser Phe Ser Leu Arg Ser Ser Arg Val Ser Gly Arg His Trp Lys Asn

670 675 680

ttt gcc ctg gtc ccc ctt tta aga gag gca agt gct cga gat agg cag

3135

Phe Ala Leu Val Pro Leu Leu Arg Glu Ala Ser Ala Arg Asp Arg Gln

685 690 695

tct gct cag ccc gag gaa gtt tat ctg cga cag ttt tca ggg tct ctg

3183

Ser Ala Gln Pro Glu Glu Val Tyr Leu Arg Gln Phe Ser Gly Ser Leu

700 705 710

aag cca gag gac gct gag gtc ttc aag agt cct gcc gct tcc ggg gag

3231

Lys Pro Glu Asp Ala Glu Val Phe Lys Ser Pro Ala Ala Ser Gly Glu

715 720 725

aag gcgggaagcg gagctactaa cttcagcctg ctgaagcagg ctggagacgt

3284

Lys

730

ggaggagaac cctggaccta gatct atg gtg tct aag ggc gaa gag ctg atc

3336

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Ile

735

aag gaa aat atg cgt atg aag gtg gtc atg gaa ggt tcg gtc aac ggc

3384

Lys Glu Asn Met Arg Met Lys Val Val Met Glu Gly Ser Val Asn Gly

740 745 750 755

cac caa ttc aaa tgc aca ggt gaa gga gaa ggc aat ccg tac atg gga

3432

His Gln Phe Lys Cys Thr Gly Glu Gly Glu Gly Asn Pro Tyr Met Gly

760 765 770

act caa acc atg agg atc aaa gtc atc gag gga gga ccc ctg cca ttt

3480

Thr Gln Thr Met Arg Ile Lys Val Ile Glu Gly Gly Pro Leu Pro Phe

775 780 785

gcc ttt gac att ctt gcc acg tcg ttc atg tat ggc agc cgt act ttt

3528

Ala Phe Asp Ile Leu Ala Thr Ser Phe Met Tyr Gly Ser Arg Thr Phe

790 795 800

atc aag tac ccg aaa ggc att cct gat ttc ttt aaa cag tcc ttt cct

3576

Ile Lys Tyr Pro Lys Gly Ile Pro Asp Phe Phe Lys Gln Ser Phe Pro

805 810 815

gag ggt ttt act tgg gaa aga gtt acg aga tac gaa gat ggt gga gtc

3624

Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg Val Thr Arg Tyr Glu Asp Gly Gly Val

820 825 830 835

gtc acc gtc atg cag gac acc agc ctt gag gat ggc tgt ctc gtt tac

3672

Val Thr Val Met Gln Asp Thr Ser Leu Glu Asp Gly Cys Leu Val Tyr

840 845 850

cac gtc caa gtc aga ggg gta aac ttt ccc tcc aat ggt ccc gtg atg

3720

His Val Gln Val Arg Gly Val Asn Phe Pro Ser Asn Gly Pro Val Met

855 860 865

cag aag aag acc aag ggt tgg gag cct aat aca gag atg atg tat cca

3768

Gln Lys Lys Thr Lys Gly Trp Glu Pro Asn Thr Glu Met Met Tyr Pro

870 875 880

gca gat ggt ggt ctg agg gga tac act cat atg gca ctg aaa gtt gat

3816

Ala Asp Gly Gly Leu Arg Gly Tyr Thr His Met Ala Leu Lys Val Asp

885 890 895

ggt ggt ggc cat ctg tct tgc tct ttc gta aca act tac agg tca aaa

3864

Gly Gly Gly His Leu Ser Cys Ser Phe Val Thr Thr Tyr Arg Ser Lys

900 905 910 915

aag acc gtc ggg aac atc aag atg ccc ggt atc cat gcc gtt gat cac

3912

Lys Thr Val Gly Asn Ile Lys Met Pro Gly Ile His Ala Val Asp His

920 925 930

cgc ctg gaa agg tta gag gaa agt gac aat gaa atg ttc gta gta caa

3960

Arg Leu Glu Arg Leu Glu Glu Ser Asp Asn Glu Met Phe Val Val Gln

935 940 945

cgc gaa cac gca gtt gcc aag ttc gcc ggg ctt ggt ggt ggg atg gac

4008

Arg Glu His Ala Val Ala Lys Phe Ala Gly Leu Gly Gly Gly Met Asp

950 955 960

gag ctg tac aag taaagatcta cgggtggcat ccctgtgacc cctccccagt

4060

Glu Leu Tyr Lys

965

gcctctcctg gccctggaag ttgccactcc agtgcccacc agccttgtcc taataaaatt

4120

aagttgcatc attttgtctg actaggtgtc cttctataat attatggggt ggaggggggt

4180

ggtatggagc aaggggcaag ttgggaagac aacctgtagg gcctgcgggg tctattggga

4240

accaagctgg agtgcagtgg cacaatcttg gctcactgca atctccgcct cctgggttca

4300

agcgattctc ctgcctcagc ctcccgagtt gttgggattc caggcatgca tgaccaggct

4360

cagctaattt ttgttttttt ggtagagacg gggtttcacc atattggcca ggctggtctc

4420

caactcctaa tctcaggtga tctacccacc ttggcctccc aaattgctgg gattacaggc

4480

gtgaaccact gctcccttcc ctgtccttct gattttgtag gtaaccacgt gcggaccgag

4540

cggccgcagg aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc

4600

actgaggccg ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct ttgcccgggc ggcctcagtg

4660

agcgagcgag cgcgcagctg cctgcagggg cgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat

4720

ctgtgcggta tttcacaccg catacgtcaa agcaaccata gtacgcgccc tgtagcggcg

4780

cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc

4840

tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc

4900

gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg

4960

accccaaaaa acttgatttg ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg

5020

tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag tggactcttg ttccaaactg

5080

gaacaacact caaccctatc tcgggctatt cttttgattt ataagggatt ttgccgattt

5140

cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat tttaacaaaa

5200

tattaacgtt tacaatttta tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt

5260

taagccagcc ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc

5320

cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt

5380

caccgtcatc accgaaacgc gcgagacgaa agggcctcgt gatacgccta tttttatagg

5440

ttaatgtcat gataataatg gtttcttaga cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc

5500

gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac

5560

aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt

5620

tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag

5680

aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg

5740

aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa

5800

tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtatt gacgccgggc

5860

aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag tactcaccag

5920

tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt gctgccataa

5980

ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc

6040

taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg

6100

agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta gcaatggcaa

6160

caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg caacaattaa

6220

tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg

6280

gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag

6340

cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg

6400

caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt

6460

ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt

6520

aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac

6580

gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag

6640

atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg

6700

tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca

6760

gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga

6820

actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca

6880

gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc

6940

agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca

7000

ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa

7060

aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc

7120

cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc

7180

gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg

7240

cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgt

7285

<---

Изобретение относится к медицине и биотехнологии, и может быть использовано для управления сокращением кардиомиоцитов с помощью термогенетики. В кардиомиоциты доставляют генетическую конструкцию, содержащую кардиоспецифический промотер и ген человеческого термически активируемого канала TRPV1 с последующим нагревом при помощи импульсов лазерного или ультразвукового излучения с частотой от 2 до 7 Гц. Способ обеспечивает возможность неинвазивного управления ритмом сердца и сокращениями отдельных кардиомиоцитов за счет навязывания ритма с частотой от 2 до 7 Гц. 5 з.п. ф-лы, 4 ил., 2 пр.

1. Способ управления сокращением кардиомиоцитов с помощью термогенетики, характеризующийся тем, что в кардиомиоциты доставляют генетическую конструкцию, содержащую кардиоспецифический промотер и ген человеческого термически активируемого канала TRPV1, с последующим нагревом кардиомиоцитов при помощи импульсов лазерного или ультразвукового излучения с частотой от 2 до 7 Гц.

2. Способ по п.1, характеризующийся использованием векторов на основе аденоассоциированных вирусов в качестве способа доставки генетических конструкций.

3. Способ по п.1, характеризующийся тем, что в отдельные кардиомиоциты in vitro доставляют генетическую конструкцию, содержащую кардиоспецифический промотер и ген человеческого термически активируемого канала TRPV1 посредством трансдукции, с последующим нагревом отдельных кардиомиоцитов.

4. Способ по п.1, характеризующийся тем, что в кардиомиоциты, находящиеся в составе миокарда in vivo, доставляют генетическую конструкцию, содержащую кардиоспецифический промотер и ген человеческого термически активируемого канала TRPV1, посредством внутривенной инъекции, с последующим нагревом миокарда.

5. Способ по п.1, характеризующийся использованием для нагрева инфракрасного лазера.

6. Способ по п.1, характеризующийся использованием для нагрева излучателя высокоинтенсивного фокусированного ультразвука.