ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к конструкциям нуклеиновых кислот и векторам для генотерапии для применения для лечения болезни Вильсона и других состояний.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Существующий уровень техники относительно генной терапии болезни Вильсона был рассмотрен Merle et al. (Current Gene Therapy 2007; 7: 217-220) и в настоящем документе был обобщен и дополнен более поздними раскрытыми ссылками.

Болезнь Вильсона (БВ) представляет собой аутосомно-рецессивное наследственное нарушение метаболизма меди со средней распространенностью 1:30,000. БВ вызывают мутации в гене ATP7B, расположенном на хромосоме 13, который кодирует транспортирующую медь АТФазу P-типа. ATP7B, в основном, экспрессируется в гепатоцитах и участвует в трансмембранном транспорте меди. Отсутствие белка или сниженная функция белка ATP7B приводит к сниженной гепатоцеллюлярной экскреции меди в желчь и к накоплению меди сначала в печени, а затем в нервной системе и других тканях. Дополнительным следствием потери функционального белка ATP7B является неспособность включать медь в церулоплазмин.

БВ может присутствовать клинически как заболевание печени, как прогрессирующее неврологическое нарушение или как психиатрическое заболевание. Пациенты с печеночной БВ, как правило, находятся в позднем детском или подростковом возрасте, и демонстрируют признаки острого гепатита, молниеносной печеночной недостаточности или прогрессирующего острого заболевания печени. Неврологические проявления БВ, как правило, случаются позже, чем заболевание печени, наиболее часто во второй или третьей декаде жизни и включают экстрапирамидные, мозжечковые и церебральные симптомы.

Целью медицинского лечения БВ является удаление токсического накопления меди из организма и предотвращение ее повторного накопления. В настоящее время для БВ одобрены три лекарственных средства против меди: D-пеницилламин, триентин и соли цинка. Медицинское лечение эффективно у большинства, но не у всех пациентов с БВ. Вариантом терапии у пациентов с БВ с молниеносной печеночной недостаточностью или прогрессирующей печеночной недостаточностью является пересадка печени. Было показано, что она корректирует фенотип БВ и обеспечивает прекрасное длительное выживание.

Однако, прерывание терапии или несоответствующее лечение могут привести к летальным исходам в течении нескольких месяцев. Из-за того, что препараты при БВ следует принимать регулярно, режим лечения у некоторых пациентов, особенно у пациентов подросткового возраста с БВ, соблюдается плохо.

При терапии относительно распространены остаточные неврологические симптомы и даже могут возникать прогрессирующие симптомы. Поскольку текущие варианты лечения эффективны не у всех пациентов с БВ, и соблюдение режима представляет собой проблему, более кардинальное решение может включать генотерапию.

Теоретически, экспрессия ATP7B дикого типа в гепатоцитах могла бы обратить вспять все нарушения, связанные с заболеванием, спасти печень и избавить от неврологических симптомов. Конечной целью идеальной генотерапии для БВ была бы доставка ATP7B, в достаточном количестве, конкретно, в гепатоциты в течение всего срока жизни.

Все опубликованные исследования по аденовирусному переносу генов для БВ, использовали аденовирусные векторы ранних поколений, создающие только временную экспрессию трансгена. Terada et al. [Terada et al. J. Biol. Chem. 1998; 273:1815-1820; Terada et al. FEBS Lett. 1999; 448: 53-56] продемонстрировали успешный перенос гена при помощи доставки генов посредством аденовирусом на крысиной модели линии LEC. Было показано восстановление синтеза холоцерулоплазмина, активности сывороточной церулоплазминоксидазы и экскреции меди в желчь, что указывало на терапевтический эффект переноса генов. Эти воздействия имели ограниченный срок действия, с максимальным уровнем на сутки 3 и с последующим снижением. Ha-Hao et al. [Z. Gastroenterol. 2002; 40: 209-216] также продемонстрировали повышенное содержание меди в испражнениях крыс линии LEC после переноса гена ATP7B, опосредованного аденовирусом, что указывает на повышенную экскрецию меди в желчь. Кроме того, терапевтический эффект был продемонстрирован путем восстановления холоцерулоплазмина и его феррооксидазной активности. Однако снова продолжительность терапевтического эффекта в этих экспериментах была только временной с ограниченной длительностью в несколько суток.

До сих пор для этих целей не тестировали «выпотрошенные» аденовирусные векторы.

Другую широко используемую не интегрирующую векторную систему на основе вируса, аденоассоциированный вирус (AAV), также до сих пор никогда не тестировали для БВ, в основном, поскольку ген ATP7B (приблизительно величиной 4,4 т.п.н.) оставляет минимум пространства для размещения остальных необходимых последовательностей (например, промотора, сигнальной последовательности поли A, и т.п.) внутри вектора AAV, чья емкость упаковки составляет 4,4-4,7 т.п.н. Немецкая патентная заявка DE 100156121A1 (опубликована в 2003) предлагает рекомбинантный адено-ассоциированный вирусный вектор для генотерапии БВ, который обладает укороченным металло-чувствительным промотором (промотор металлотионеина-I) для получения экспрессии трансгена ATP7B, индуцируемой цинком или медью. Однако, ни в этом документе, ни позже не описано никакой информации относительно терапевтической эффективности и качеств вектора.

С другой стороны, на модели животных с БВ были исследованы несколько лентивирусных векторов, несущих ATP7B дикого типа. Merle et al. [Scan. J. Gastroenterol. 2006; 41: 974-982] описали системную генотерапию у крыс линии LEC при помощи лентивирусных векторов, экспрессирующих ATP7B под контролем фосфоглицерокиназного промотора. Через двадцать четыре недели после переноса гена в печень содержание меди было значительно снижено, а гистология печени улучшилась у обработанных крыс по сравнению с необработанными контролями, но эффект был только частичным. Активность церулоплазминоксидазы в сыворотке была повышена через две недели после переноса гена по сравнению с контролями, однако, она опустилась до нижних уровней через 24 недели после лечения. Относительно недавно, Roybal et al. [Gene Therapy 2012; 19: 1085-1094] описали перенос генов на ранней стадии беременности у мышей ATP7B^-/- при помощи лентивируса, несущего ATP7B человека под транскрипционным контролем специфического для печени промотора, который содержал элемент аполипопротеина E и альфа-1 антитрипсина. Введение вектора в матку обеспечило снижение уровней меди в печени, сохранение нормальной гистологии печени, восстановление включения меди в церулоплазмин и улучшенный биосинтез холестерина. Однако эффективность лечения сильно отличалась от мышей к мышам и снижалась со временем, и никогда не приводила к полной коррекции различных патологически измененных параметров.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы изобретения сконструировали и протестировали несколько вирусных векторов, несущих трансгены, которые кодируют различные укороченные формы фермента ATP7B: например, вектор AAV2/8-AAT-ATP7B(d223-366), кодирующий ATP7B(d223-366) [ATP7B-T1]; и вектор AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486), кодирующий ATP7B(d57-486) [ATP7B-T2]. При введении мышам, нокаутным по ATP7B, (известная модель болезни Вильсона на животных), вектор на основе AAV, несущий ATP7B-T2, корректировал основные патологические характеристики болезни Вильсона, по меньшей мере, в течение 24 недель после лечения, в то время как вектор на основе AAV, несущий ATP7B-T1, имел только частичный эффект. Экскреция Cu (содержание Cu в моче) и содержание Cu в печени были значительно снижены у мышей с болезнью Вильсона, которых лечили вектором AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486), а активность церулоплазмина была значительно восстановлена. С другой стороны, введение вектора привело к нормализации уровней трансаминаз в сыворотке и к нормализации гистологии печени, в совокупности со значительным уменьшением воспалительного инфильтрата, пролиферации в желчных протоках и фиброза.

Кроме того, было показано, что доза 1×10¹⁰ вирусных геномов/на мышь вектора AAV2/8-AAT-wtATP7B является «субоптимальной дозой» для конструкции с wt, как для получения нормализации активности церулоплазмина в сыворотке, так и для снижения накопления Cu в печени (фигуры 10A и 11A); в свою очередь было показано, что вектор, несущий укороченную форму, обеспечивает статистически значимые терапевтические эффекты (по сравнению с нелеченными) в указанной субоптимальной дозе (фигура 10B и 11B). Кроме того, было также показано, что наблюдаемые различия в активности между полноразмерным ATP7B и конструкциями T2 в дозе 1×10¹⁰ вирусных геномов/на мышь являются статистически значимыми для этих двух терапевтических эффектов (фиг. 12 и Фиг.14).

Эти наблюдения указывают на то, что и конструкция нуклеиновой кислоты, кодирующая укороченную форму ATP7B(d57-486), и несущие ее векторы, в частности, векторы на основе AAV, позволяют преодолеть наиболее важные патологические эффекты накопления меди, связанные с недостатком или нарушением функции ATP7B, и, таким образом, могут очень подходить для генотерапии, применяемой для состояния, связанного с недостаточностью или нарушенной функцией медь-транспортирующей АТФазы 2, такого как болезнь Вильсона, или заболевания и/или состояния, ассоциированного со снижением ATP7B-зависимого лизосомального экзоцитоза и накоплением меди. Кроме того, неожиданно было показано, что укороченная форма ATP7B(d57-486) и несущие ее векторы нормализуют некоторые из этих патологических проявлений заболевания в дозах, при которых полноразмерный белок ATP7B и кодирующие его векторы оказались менее эффективными.

Таким образом, в первом аспекте изобретение относится к конструкции нуклеиновой кислоты (далее в настоящем документе также обозначаемой как «конструкция нуклеиновой кислоты по изобретению»), которая содержит: a) нуклеотидную последовательность эукариотического промотора; b) нуклеотидную последовательность, кодирующую укороченную медь-транспортирующую АТФазу 2 (ATP7B), в которой N-концевые участки HMA1, HMA2, HMA3 и HMA4, ассоциированные с тяжелыми металлами, полностью удалены, а HMA 5 и HMA 6 оставлены неудаленными; и c) последовательность сигнала полиаденилирования.

В другом аспекте изобретение относится к экспрессирующему вектору (далее в настоящем документе обозначаемому как «экспрессирующий вектор по изобретению»), который содержит конструкцию нуклеиновой кислоты по изобретению.

В другом аспекте изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей конструкцию нуклеиновой кислоты или экспрессирующий вектор по изобретению.

В другом аспекте изобретение относится к вирусной частице (далее в настоящем документе также обозначаемой как «вирусная частица по изобретению»), которая содержит нуклеиновую конструкцию или экспрессирующий вектор по изобретению. Предпочтительно, конструкция нуклеиновой кислоты составляет геномную последовательность вирусного вектора.

В другом аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, которая содержит продукт по изобретению, т.е. продукт, который содержит конструкцию нуклеиновой кислоты по изобретению, и фармацевтически приемлемый носитель. Как применяют в настоящем документе термин «продукт по изобретению» относится к любому из и неявно включает любое из: a) конструкции нуклеиновой кислоты по изобретению; b) экспрессирующего вектора по изобретению, c) клетки-хозяина по изобретению и d) вирусной частицы по изобретению.

В другом аспекте изобретение дополнительно относится к набору, содержащему конструкцию нуклеиновой кислоты, вектор, клетку-хозяина, вирусную частицу или фармацевтическую композицию по изобретению в одном или нескольких контейнерах.

В другом аспекте изобретение относится к продукту по изобретению для применения в медицине (в качестве лекарственного средства или медицинской композиции). Такое применение в медицине включает состояние, вызванное недостаточностью или нарушением функции медь-транспортирующей АТФазы 2. С другой стороны, изобретение относится к применению продукта по изобретению в препарате лекарственного средства для применения для лечения состояния, вызванного недостаточностью или нарушением функции медь-транспортирующей АТФазы 2; и к способу для лечения состояния, вызванного недостаточностью или нарушением функции медь-транспортирующей АТФазы 2 у индивидуума или пациента, который включает введение индивидууму или пациенту терапевтически эффективного количества продукта по изобретению. В более конкретном аспекте, продукт по изобретению применяют для лечения болезни Вильсона.

В другом аспекте изобретение дополнительно относится к фармацевтической композиции, содержащей продукт по изобретению, как описано выше, для предлагаемого использования в медицине и терапевтических способов, описанных в настоящем документе.

Еще в одном дополнительном аспекте, изобретение относится к способу получения вирусных частиц по изобретению, включающему стадии:

a) культивирования клетки-хозяина, содержащей конструкцию нуклеиновой кислоты или экспрессирующий вектор по изобретению в среде для культивирования; и

b) получения вирусных частиц в супернатанте клеточной культуры и/или внутри клеток.

В связанном аспекте, настоящее изобретение относится к применению конструкции нуклеиновой кислоты по изобретению или экспрессирующего вектора по изобретению для получения вирусных частиц.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1: Схематическое представление конструкции нуклеиновой кислоты вектора AAV2/8-AAT-wtATP7B, который несет ATP7B человека; вектора AAV2/8-AAT-ATP7B(d223-366), который несет укороченную форму ATP7B(d223-366) [ATP7B-T1]; и вектора AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486), который несет укороченный ATP7B(d57-486) [ATP7B-T2]. Элементы конструкций представляют собой: a) промотор гена альфа-1-антитрипсина (AAT); b) нуклеотидную последовательность, кодирующую соответственно ATP7B человека, ATP7B-T1, или ATP7B-T2; c) сигнал полиаденилирования (pA), и фланкирующий векторный геном d) инвертированные последовательности концевых повторов AAV2 (ITR).

Фигура 2: Уровни аланинтрансаминазы (ALT) в сыворотке у самцов мышей дикого типа [WT], самцов мышей, дефицитных по ATP7B [мыши с болезнью Вильсона, БВ], и самцов мышей с БВ, которых лечили векторами AAV2/8-AAT-wtATP7B [WD AAV-ATP7B], AAV2/8-AAT-ATP7B(d223-366) [WD AAV-T1]; или AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) [WD AAV-T2]. Дозу вектора в 3×10¹⁰ векторных геномов/на мышь вводили животным в возрасте шести недель. Уровни ALT измеряли через 4, 9, 14 и 24 недели после лечения [Недели] и выражали в МЕ/л (МЕ: международные единицы). ns: не значимо; *: p<0,05, **: p<0,01; ***: p<0,001 [непарный тест Манна-Уитни].

Фигура 3: Общее содержание меди в моче у самцов мышей дикого типа [WT], самцов мышей с болезнью Вильсона [БВ], и самцов мышей с БВ, которых лечили векторами AAV2/8-AAT-wtATP7B [WD AAV-ATP7B], AAV2/8-AAT-ATP7B(d223-366) [WD AAV-T1]; или AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) [WD AAV-T2]. Доза вектора: 3×10¹⁰ векторных геномов/на мышь. Содержание меди измеряли через 4, 9, 14 и 24 недели после лечения [Недели] в моче за 24 часа и выражали в нанограммах Cu (нг/24 часа).

Фигура 4: Активность церулоплазмина в сыворотке у самцов мышей дикого типа [WT], самцов мышей с болезнью Вильсона [БВ], и самцов мышей с БВ, которых лечили векторами AAV2/8-AAT-wtATP7B [WD AAV-ATP7B], AAV2/8-AAT-ATP7B(d223-366) [WD AAV-T1]; или AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) [WD AAV-T2]. Доза вектора: 3×10¹⁰ векторных геномов/на мышь. Активность церулоплазмина измеряли через 4 недели после лечения и выражали в виде оптической плотности, измеренной при длине волны 570 нм [Поглощение (570 нм)]. ns: не значимо; *: p<0,05, **: p<0,01; ***: p<0,001 [непарный тест Манна-Уитни].

Фигура 5. Содержание Cu в печени у самцов мышей дикого типа [WT], самцов мышей с болезнью Вильсона [БВ], и самцов мышей с БВ, которых лечили векторами AAV2/8-AAT-wtATP7B [WD AAV-ATP7B], AAV2/8-AAT-ATP7B(d223-366) [WD AAV-T1]; или AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) [WD AAV-T2]. Доза вектора: 3×10¹⁰ векторных геномов/на мышь. Содержание меди определяли после умерщвления животных через 24 недели после лечения при помощи атомно-абсорбционной спектроскопии; и выражали в мкг/г (мкг Cu/г сухой ткани печени). ns: не значимо; *: p<0,05, **: p<0,01; ***: p<0,001 [непарный тест Манна-Уитни].

Фигура 6: Гистологические снимки печени самцов мышей дикого типа [WT], самцов мышей с болезнью Вильсона [БВ], и самцов мышей с БВ, которых лечили векторами AAV2/8-AAT-wtATP7B [WD AAV-ATP7B], AAV2/8-AAT-ATP7B(d223-366) [WD AAV-T1]; или AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) [WD AAV-T2]. Доза вектора: 3×10¹⁰ векторных геномов/на мышь. Снимки были сделаны после умерщвления животных (в возрасте 30 недель). A: Снимки срезов печени, окрашенных гематоксилином и эозином. B: Снимки гистологических образцов, окрашенных способом с сульфидом серебра по Тимму для выявления отложений меди.

фигура 7: Анализ воспаления печени, пролиферации в желчных протоках и фиброза. Снимки печени самцов мышей дикого типа [WT], самцов мышей с болезнью Вильсона [БВ], и самцов мышей с БВ, которых лечили векторами AAV2/8-AAT-wtATP7B [WD AAV-ATP7B], AAV2/8-AAT-ATP7B(d223-366) [WD AAV-T1]; или AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) [WD AAV-T2]. Доза вектора: 3×10¹⁰ векторных геномов/на мышь. Анализ проводили после умерщвления животных (в возрасте 30 недель). CD45: Снимки срезов печени, иммунологически окрашенных при помощи антитела к CD45 для выявления воспалительных инфильтратов в печени. PANCK: Снимки срезов печени, иммунологически окрашенных при помощи антитела к PANCK для выявления пролиферации в желчных протоках. SR: Снимки срезов печени, окрашенных Сириусом красным для выявления фиброза.

Фигура 8: Уровни аланинтрансаминазы (ALT) в сыворотке у самок мышей дикого типа [WT], самок мышей с БВ [БВ], и самок мышей с БВ, которых лечили вектором AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) [WD AAV-T2]. Различным группам мыши самок мышей с БВ в возрасте 6 недель вводили различные дозы векторов (соответственно 1×10¹⁰, 3×10¹⁰, 1×10¹¹ вирусных геномов/на мышь). Уровни ALT измеряли через 4, 9, 14 и 24 недели после лечения [Недели] и выражали в МЕ/л. ns: не значимо; *: p<0,05, **: p<0,01; ***: p<0,001 [непарный тест Манна-Уитни].

Фигура 9: Уровни содержания Cu в моче у самок мышей дикого типа [WT], самок мышей с БВ [БВ], и самок мышей с БВ, которых лечили вектором AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) [WD AAV-T2]. Различным группам мыши самок мышей с БВ в возрасте 6 недель вводили различные дозы векторов (соответственно 1×10¹⁰, 3×10¹⁰, 1×10¹¹ вирусных геномов/на мышь). Уровни меди в моче измеряли через 4, 9, 14 и 24 недели после лечения [Недели] за 24 часа и выражали в нанограммах Cu (нг/24 часа). ns: не значимо; *: p<0,05, **: p<0,01; ***: p<0,001 [непарный тест Манна-Уитни].

Фигура 10: Активность церулоплазмина в сыворотке измеряли у самок мышей дикого типа [WT], самок мышей с БВ [БВ], и самок мышей с БВ, которых лечили вектором AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) [WD+AAV-T2] или вектором AAV2/8-AAT-wtATP7B [WD+AAV-ATP7B]. Для каждой экспериментальной группы, различным группам мыши самок мышей с БВ в возрасте 6 недель вводили различные дозы векторов (соответственно 1×10¹⁰, 3×10¹⁰, 1×10¹¹ вирусных геномов/на мышь). Активность церулоплазмина измеряли через 4 недели после лечения и выражали в виде оптической плотности, измеренной при длине волны 570 нм [Поглощение (570 нм)]. ns: не значимо; *: p<0,05, **: p<0,01; ***: p<0,001 [непарный тест Манна-Уитни].

Фигура 11: Содержание Cu в печени измеряли у самок мышей дикого типа [WT], самок мышей с БВ [БВ], и самок мышей с БВ, которых лечили вектором AAV2/8-AAT-wtATP7B [WD AAV ATP7B] или вектором AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) [WD AAV T2]. Для каждой экспериментальной группы, различным группам мыши самок мышей с БВ в возрасте 6 недель вводили различные дозы векторов (соответственно 1×10¹⁰, 3×10¹⁰, 1×10¹¹ вирусных геномов/на мышь). Концентрацию меди измеряли через 24 недели после лечения и выражали в виде мкг/г сухой ткани. ns: не значимо; *: p<0,05, **: p<0,01; ***: p<0,001 [непарный тест Манна-Уитни].

Фигура 12: Содержание Cu в печени у самцов мышей дикого типа [WT, n=15], самцов мышей с БВ [БВ; n=25], и самцов мышей с БВ, которых лечили вектором AAV2/8-AAT-wtATP7B [WD AAV ATP7B; n=7] или вектором AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) [WD AAV T2; n=7]. Для каждой экспериментальной группы, мышам с БВ вводили субоптимальную дозу вектора (1×10¹⁰ вирусных геномов/на мышь), когда животным было 6 недель. Концентрацию меди измеряли через 24 недели после лечения и выражали в виде мкг/г сухой ткани. ns: не значимо; *: p<0,05, **: p<0,01; ***: p<0,001 [непарный тест Манна-Уитни].

Фигура 13: Содержание Cu в печени у самцов мышей дикого типа [WT, n=15], самцов мышей с БВ [БВ; n=25], и самцов мышей с БВ, которых лечили вектором AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) [WD AAV T2; n=13] или вектором AAV2/8-AAT-coATP7B(d57-486) [WD AAV coT2; n=4]. Для каждой экспериментальной группы, мышам с БВ вводили субоптимальную дозу вектора (1×10¹⁰ вирусных геномов/на мышь), когда животным было 6 недель. Концентрацию меди измеряли через 24 недели после лечения и выражали в виде мкг/г сухой ткани. ns: не значимо; *: p<0,05, **: p<0,01; ***: p<0,001 [непарный тест Манна-Уитни].

Фигура 14: Активность церулоплазмина в сыворотке у самцов мышей дикого типа [WT, n=15], самцов мышей с БВ [БВ; n=25], и групп самцов мышей с БВ, которых лечили одним из векторов AAV2/8-AAT-wtATP7B [WD AAV ATP7B; n=10], AAV2/8-AAT-coATP7B [WD AAV coATP7B; n=8], AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) [WD AAV T2; n=13] и AAV2/8-AAT-coATP7B(d57-486) [WD AAV coT2; n=4]. Для каждой экспериментальной группы, шестинедельным мышам с БВ вводили субоптимальную дозу вектора (1×10¹⁰ вирусных геномов/на мышь). Оксидазную активность церулоплазмина измеряли через 4 недели после лечения и выражали в виде оптической плотности, измеренной при длине волны 570 нм [Поглощение (570 нм)]. ns: не значимо; *: p<0,05, **: p<0,01; ***: p<0,001 [непарный тест Манна-Уитни].

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Все термины, применяемые в настоящем документе заявки, если не указано иначе, следует понимать в их обычном значении, известном в данной области. Другие более конкретные определения для некоторых терминов, использованных в настоящей заявке, представлены ниже и предназначены для единообразного использования во всем описании и формуле, если иное не указано прямо, и определение не предполагает более широкий смысл.

Термины «последовательность нуклеиновой кислоты» и «нуклеотидная последовательность» можно использовать взаимозаменяемо по отношению к любой молекуле, состоящей из мономерных нуклеотидов или содержащей мономерные нуклеотиды. Нуклеиновая кислота может быть олигонуклеотидом или полинуклеотидом. Нуклеотидная последовательность может быть ДНК или РНК. Нуклеотидная последовательность может быть химически модифицирована или может быть искусственной. Нуклеотидные последовательности включают пептидные нуклеиновые кислоты (ПНК), морфолиновые олигонуклеотиды и замкнутые нуклеиновые кислоты (ЗНК), а также гликолевые нуклеиновые кислоты (ГНК) и треозную нуклеиновую кислоту (ТНК). Каждая из этих последовательностей отличается от природной ДНК или РНК за счет изменений остова молекулы. Также можно использовать тиофосфатные нуклеотиды. Другие дезоксинуклеотидные аналоги, которые можно использовать в нуклеотиде по изобретению, включают метилфосфонаты, фосфорамидаты, фосфородитиоаты, N3'P5'-фосфорамидаты и олигорибонуклеотидные тиофосфаты и их 2'-0-аллильные аналоги и 2'-0-метилрибонуклеотидные метилфосфонаты.

Применяемый в настоящем документе термин «конструкция нуклеиновой кислоты» относится к искусственно созданной молекуле нуклеиновой кислоты, полученной при использовании технологии рекомбинантных ДНК. Конструкция нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, или одно- или двухцепочечную, которая была модифицирована для включения сегментов последовательностей нуклеиновых кислот, которые были скомбинированы и помещены рядом таким образом, который в ином случае не существовал бы в природе. Конструкция нуклеиновой кислоты, как правило, представляет собой «вектор», т.е. молекулу нуклеиновой кислоты, которую применяют для доставки экзогенно созданной ДНК в клетку-хозяина.

Применяемый в настоящем документе термин «экспрессирующий вектор» или «вектор» относится к рекомбинантной нуклеотидной последовательности, которая способна осуществлять экспрессию гена (трансгена) в клетках-хозяевах или организмах-хозяевах, совместимых с такими последовательностями. Вместе с трансгеном экспрессирующие векторы, как правило, содержат, по меньшей мере, подходящие последовательности для регуляции транскрипции и, необязательно, 3'-сигналы терминации транскрипции. Могут также присутствовать дополнительные факторы, необходимые или полезные для осуществления транскрипции, такие как энхансерные элементы для экспрессии, способные отвечать на точный индуцирующий сигнал (эндогенные или химерные факторы транскрипции) или специфические для определенных клеток, органов или тканей.

Применяемый в настоящем документе термин «индивидуум» или «пациент» относится к млекопитающим. Виды млекопитающих, которым могут быть полезны описанные способы лечения, в качестве неограничивающих примеров включают людей, не являющиеся человеком приматов, таких как человекообразные обезьяны; шимпанзе; нечеловекообразных обезьян, и орангутанов, домашних животных, в том числе собак и кошек, а также домашний скот, такой как лошади, крупный рогатый скот, свиньи, овцы, и козы, или другие виды млекопитающих, в том числе без ограничений, мыши, крысы, морские свинки, кролики, хомяки, и т.п.

Применяемый в настоящем документе термин «упаковывающие клетки» относится к клетке или клеточной линии, которая может быть трансфецирована вектором-помощником или вирусом или конструкцией ДНК, и опосредованно обеспечивает все отсутствующие функции, которые необходимы для полной репликации и упаковки вирусного вектора. Как правило, упаковывающие клетки экспресируют конститутивным или индуцибельным образом одну или несколько из указанных отсуствующих вирусных функций.

конструкция нуклеиновой кислоты по изобретению

Нуклеотидная последовательность of эукариотическ промотор

Применяемый в настоящем документе, термин «эукариотический промотор» относится к области последовательности ДНК, которая инициирует транскрипцию конкретного гена, или одной или нескольких кодирующих последовательностей, в эукариотических клетках. Промотор может работать совместно с другими регуляторными областями или элементами для управления уровнем транскрипции гена или кодирующей последовательности/последовательностей. Эти регуляторные элементы в качестве неограничивающих примеров включают участки связывания фактора транскрипции, участки связывания белка-активатора и белка-репрессора, и любые другие последовательности нуклеотидов, известные специалисту в данной области, для прямого или опосредованного воздействия на регуляцию уровня транскрипции от промотора, включая, например, аттенюаторы, энхансеры, и сайленсеры. Промотор расположен рядом с участком начала транскрипции гена или кодирующей последовательности, с которой он функционально связан, на той же цепи и перед последовательностью ДНК (перед 5'-областью смысловой цепи). Промотор может быть приблизительно 100-1000 пар оснований в длину. Положения в промоторе обозначают относительно точки начала транскрипции промотор для конкретного гена (т.е., положения выше представляют собой отрицательные числа, которые отсчитываются назад от -1, например -100 представляет собой положение на 100 пар оснований выше).

Термин «основной промотор» или «минимальный промотор» относится к минимальной части последовательности промотора, необходимой для надлежащей инициации транскрипции. Он включает участок начала транскрипции (TSS) и элементы непосредственно выше; участок связывания для РНК-полимеразы (РНК-полимеразы II); и общие участки связывания для факторов транскрипции. Обычно промотор также включает проксимальную промоторную последовательность (выше основного промотора), которая содержит другие первичные регуляторные элементы (такие как энхансеры, сайленсеры, граничные элементы/инсуляторы); и дистальную промоторную последовательность (ниже основного промотора), которая может содержать дополнительные регуляторные элементы, обычно с более слабым влиянием на уровень транскрипции гена.

По изобретению последовательность эукариотического промотора функционально связана с нуклеотидной последовательностью, кодирующей укороченную медь-транспортирующую АТФазу 2. Применяемый в настоящем документе, термин «функционально связанный» относится к соединению полинуклеотидных (или полипептидных) элементов в функциональную связь. Нуклеиновая кислота является «функционально связанной», когда ее помещают в функциональную связь с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор или последовательность для регуляции транскрипции функционально связаны с кодирующей последовательностью, если они возжействуют на транскрипцию кодирующей последовательности. Функционально связанный означает, что связанные последовательности ДНК, как правило, являются смежными; где необходимо соединить две белок-кодирующие области, они являются смежными и в рамке считывания.

По изобретению, последовательность эукариотического промотора из конструкции нуклеиновой кислоты содержит, по меньшей мере, основной промотор и, необязательно, другие регуляторные области или элементы того же гена или различных генов (т.е. гибридные или химерные промоторы).

В одном из вариантов осуществления необязательно в комбинации с одним или несколькими признаками различных вариантов осуществления, описанными выше или ниже, эукариотический промотор представляет собой конститутивный промотор, тканеспецифический промотор, или индуцибельный промотор.

Как применяют в настоящем документе, «конститутивный» промотор представляет собой промотор, который является активным в большинстве эукариотических тканей при большинстве физиологических условий и условий развития.

«Тканеспецифический промотор» представляет собой промотор, который активен только в специфических типах тканей или клеток. То есть тканеспецифический промотор, в контексте настоящего изобретения, является промотором, который более активен в одной или нескольких конкретных тканях (например, двух, трех или четырех), чем в других тканях (т.е. промотор способен управлять более высокой экспрессией кодирующей последовательности, с которой он функционально связан, в ткани/тканях, для которых он более специфичен, чем в остальных). Как правило, ген, расположенный после «тканеспецифического» промотора является активным в большей степени в ткани/тканях, для которых специфичен промотор, чем в любой другой ткани/тканях. В этом случае, активность промотора присутствует в малой степени или отсутствует в любой ткани, отличной от той/тех, для которых он специфичен.

«Индуцибельный» промотор представляет собой промотор, который регулируется физиологическим путем или при развитии, например, с применением химического индуктора.

В данной области известно множество промоторов [Sambrook and Russell (Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Third Edition; 2001 Cold Spring Harbor Laboratory Press); и Green and Sambrook (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, cuarta edición, 2012 Cold Spring Harbor Laboratory Press)].

Подходящие тканеспецифические промоторы можно найти в базе данных тканеспецифических промоторов, TiProD (Nucleic Acids Research 2006; J4: D104-D107).

В одном из вариантов осуществления необязательно в комбинации с одним или несколькими признаками различных вариантов осуществления, описанными выше или ниже, эукариотический промотор представляет собой печень-специфический промотор. В контексте настоящего изобретения, «печень-специфический промотор» представляет собой промотор, который более активен в печени, чем в любой другой ткани организма. Как правило, активность печень-специфического промотора будет значительно больше в печени, чем в других тканях. Например, такой промотор может быть, по меньшей мере, в 2, по меньшей мере, в 3, по меньшей мере, в 4, по меньшей мере, в 5 или, по меньшей мере, в 10 раз более активным (например, при определении его способностью управлять экспрессией в данной ткани по сравнению с его способностью управлять экспрессией в других клетках или тканиях). Таким образом, печень-специфический промотор позволяет связанному с ним гену активно экспрессироваться в печени и предотвращает его экспрессию в других клетках или тканях.

В одном из вариантов осуществления необязательно в комбинации с одним или несколькими признаками различных вариантов осуществления, описанными выше или ниже, эукариотический промотор представляет собой нуклеотидную последовательность промотора гена α1-антитрипсина (AAT), или последовательность химерного промотора EalbPa1AT, которая содержит последовательность промотора гена α1-антитрипсина (AAT или Pa1AT) в сочетании с энхансерным элементом гена альбумина (Ealb). Обе промоторные последовательности обладают свойствами печень-специфических промоторов.

В конкретном варианте осуществления необязательно в комбинации с одним или несколькими признаками различных вариантов осуществления, описанными выше или ниже, последовательность эукариотического промотора представляет собой последовательность, ограниченную основаниями 156-460 из SEQ.ID.NO.1 (AAT); или SEQ.ID.NO.5 (EalbPa1AT).

Укороченная медь-транспортирующая АТФаза 2 (ATP7B)

Медь-транспортирующая АТФаза 2 (ATP7B) представляет собой АТФазу P-типа для транспорта катионов, чья функция заключается в выведении меди из клеток.

Ген, который кодирует фермент человека, расположен на хромосоме 13 (расположение на хромосоме 13q14,3; название гена ATP7B). Информация о полипептиде ATP7B человека (аминокислотные последовательности, структура, домены и других признаки) доступна, например, на Uniprot по номеру доступа: P35670 (http://www.uniprot.org/uniprot/P35670; Entry version 168 (03 Sep 2014), Sequence version 4 (16 Jun 2009)). Информация о гене ATP7B, кодирующем этот фермент, доступна на Entrez по номеру доступа Gene ID: 540 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ген/540; updated on 19-Sep-2014). Для ATP7B были описаны 4 изоформы, получаемые путем альтернативного сплайсинга; изоформа 1 (идентификатор P35670-1, 1465 аминокислот в длину) выбрана в качестве канонической последовательности.

В одном из вариантов осуществления необязательно в комбинации с одним или несколькими признаками различных вариантов осуществления, описанными выше или ниже, конструкция нуклеиновой кислоты по изобретению содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует укороченную форму ATP7B человека, предпочтительно ATP7B человека, чья аминокислотная последовательность представляет собой каноническую последовательность (SEQ.ID.NO.2), в настоящем документе также обозначаемую как wtATP7B.

В ATP7B присутствуют несколько консервативных мотивов, которые являются характерными для белкового семейства АТФаз P-типа. Эти мотивы необходимы для катализа АТФ и включают нуклеотид-связывающий домен (N-домен), домен фосфорилирования (P-домен) и домен-актуатор (A-домен). В этих мотивах присутствует высококонсервативная последовательность остатков; SEHPL в N-домене, DKTG в P-домене, и TGE в A-домене. Аминоконцевой хвост ATP7B человека содержит «шесть участков связывания металлов» (MBS), также нетипично называемых как «ассоциированные с тяжелыми металлами (HMA)» участки или домены, каждый содержащий коровую последовательность MxCxxC. Эти HMA связывают Cu(I) в соотношении атом Cu(I) на HMA. Эти аминоконцевые HMA ATP7B необходимы для нескольких аспектов его функционирования, включая перенос меди, включение меди в медь-содержащие ферменты, АТФазной активности, локализации и направленной миграции, и белок-белковых взаимодействий. Участки HMA идентифицируют, начиная с амино-конца, как домены HMA 1 (аминокислоты 59-125 в канонической последовательности), HMA 2 (аминокислоты 144-210), HMA 3 (258-327), HMA 4 (360-426), HMA 5 (489-555), и HMA 6 (565-631).

По изобретению, необязательно в комбинации с одним или несколькими признаками различных вариантов осуществления, описанными выше или ниже, конструкция нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует укороченный ATP7B, в котором N-концевые участки, ассоциированные с тяжелым металлом, HMA 1, HMA 2, HMA 3, и HMA 4 полностью или частично удалены.

В одном из вариантов осуществления необязательно в комбинации с одним или несколькими признаками различных вариантов осуществления, описанными выше или ниже, нуклеотидная последовательность, которая кодирует укороченный ATP7B, сохраняет N-концевую сигнальную последовательность ATP7B из 56 аминокислот.

В одном из вариантов осуществления необязательно в комбинации с одним или несколькими признаками различных вариантов осуществления, описанными выше или ниже, делеция в укороченном ATP7B включает аминокислоты с 57 до 486 из канонической последовательности.

В одном из вариантов осуществления необязательно в комбинации с одним или несколькими признаками различных вариантов осуществления, описанными выше или ниже, нуклеотидная последовательность кодирует укороченный ATP7B, чья аминокислотная последовательность представляет собой SEQ.ID.NO.7.

Из-за вырожденности кодонов, существует несколько нуклеотидных последовательностей, которые можно получать, кодируя полипептиды ATP7B с одинаковой аминокислотной последовательностью.

В одном из вариантов осуществления необязательно в комбинации с одним или несколькими признаками различных вариантов осуществления, описанными выше или ниже, нуклеотидная последовательность, кодирующая укороченную медь-транспортирующую АТФазу 2, представляет собой кодирующую последовательность CDS из SEQ.ID.NO.6, основания 473.3580.

В другом варианте осуществления необязательно в комбинации с одним или несколькими признаками различных вариантов осуществления, описанными выше или ниже, нуклеотидная последовательность, кодирующая укороченную медь-транспортирующую АТФазу 2, представляет собой SEQ.ID.NO.8, последовательность с оптимизированным сдвигом использования кодонов для клеток человека.

В одном из вариантов осуществления необязательно в комбинации с одним или несколькими признаками различных вариантов осуществления, описанными выше или ниже, нуклеотидная последовательность, кодирующая укороченную медь-транспортирующую АТФазу 2, представляет собой последовательность, где, по меньшей мере, 827, по меньшей мере, 879, по меньшей мере, 931, или, по меньшей мере, 983 из кодонов, кодирующих укороченную медь-транспортирующую АТФазу 2, идентичны кодонам кодирующей последовательности SEQ.ID.NO.8.

Последовательность сигнала полиаденилирования

Применяемый в настоящем документе, термин «сигнал полиаденилирования» или «поли(A) сигнал» относится к специфической последовательности распознавания в пределах 3'-нетранслируемой области (3'UTR) гена, которая транскрибируется в составе молекулы-предшественника мРНК и направляет терминацию транскрипции гена. Поли(A) сигнал действует как сигнал для эндонуклеолитического расщепления новообразованного предшественника мРНК с его 3'-конца, и для добавления к его 3'-концу фрагмента РНК, состоящего только из адениновых оснований (процесс полиаденилирования; поли(A) хвост). Поли(A) хвост является важным для экспорта из ядра, трансляции и стабильности мРНК. В контексте изобретения, сигнал полиаденилирования представляет собой последовательность распознавания, которая может управлять полиаденилированием генов млекопитающих и/или вирусных генов, в клетках млекопитающих.

Поли(A) сигналы, как правило, состоят из a) консенсусной последовательности AAUAAA, для которой было показано, что она необходима и для 3'-концевого расщепления, и для полиаденилирования предшественника мРНК (пре-мРНК) а также она способствует терминации трнскрипции ниже, и b) дополнительных элементов выше и ниже AAUAAA, которые контролируют эффективность использования AAUAAA в качестве поли(A) сигнала. Существует значительная изменчивость в этих мотивах в генах млекопитающих.

В одном из вариантов осуществления необязательно в комбинации с одним или несколькими признаками различных вариантов осуществления, описанными выше или ниже, последовательность сигнала полиаденилирования из конструкции нуклеиновой кислоты по изобретению представляет собой последовательность сигнала подиаденилирования из гена млекопитающего или вирусного гена. Подходящие сигналы полиаденилирования включают, среди прочих, ранний сигнал полиаденилирования SV40, поздний сигнал полиаденилирования SV40, сигнал полиаденилирования тимидинкиназы HSV, сигнал полиаденилирования гена протамина, сигнал полиаденилирования EIb аденовируса 5, сигнал полиаденилирования гормона роста, сигнал полиаденилирования PBGD, сконструированный сигнал полиаденилирования in silico (синтетический) и т.п.

В одном из вариантов осуществления необязательно в комбинации с одним или несколькими признаками различных вариантов осуществления, описанными выше или ниже, последовательность сигнала полиаденилирования из конструкции нуклеиновой кислоты представляет собой синтетическую поли(A) сигнальную последовательность, которая также способна направлять и осуществлять эндонуклеолитическое расщепление и полиаденилирование предшественника мРНК, полученного при транскрипции нуклеотидной последовательности, кодирующей укороченный ATP7B.

В одном из вариантов осуществления необязательно в комбинации с одним или несколькими признаками различных вариантов осуществления, описанными выше или ниже, последовательность сигнала полиаденилирования из конструкции нуклеиновой кислоты представляет собой синтетическую поли(A) сигнальную последовательность, ограниченную основаниями 4877.4932 из SEQ.ID.NO.1.

Другие нуклеотидные элементы

В одном из вариантов осуществления конструкция нуклеиновой кислоты по изобретению составляет рекомбинантный геном экспрессирующего вектора для генотерапии, экспрессирующего вектора по изобретению; и, более конкретно, вирусного вектора для генотерапии.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления необязательно в комбинации с одним или несколькими признаками различных вариантов осуществления, описанными выше или ниже, конструкция нуклеиновой кислоты по изобретению дополнительно содержит 5'ITR и 3'ITR вируса.

Применяемый в настоящем документе термин «инвертированный концевой повтор (ITR)» относится к нуклеотидной последовательности, расположенной на 5'-конце (5'ITR), и к нуклеотидной последовательности, расположенной на 3'-конце (3'ITR), вируса, которые содержат палиндромные последовательности и которые могут сворачиваться с образованием T-образных шпилечных структур, которые функционируют в качестве праймеров во время инициации репликации ДНК. Они также необходимы для интеграции вирусного генома в геном хозяина; для спасения из генома-хозяина; и для упаковки вирусной нуклеиновой кислоты в зрелые вирионы. ITR необходимы в цис-положении для репликации вирусного генома и его упаковки в вирусные частицы.

В одном из вариантов осуществления конструкция нуклеиновой кислоты содержит 5'ITR, сигнал упаковки ψ и 3'ITR вируса. «Сигнал упаковки ψ» представляет собой цис-действующую нуклеотидную последовательность вирусного генома, которая у некоторых вирусов (например, аденовирусов, лентивирусов) необходима для процесса упаковки вирусного генома в капсид вируса во время репликации.

В одном из вариантов осуществления необязательно в комбинации с одним или несколькими признаками различных вариантов осуществления, описанными выше или ниже, конструкция нуклеиновой кислоты содержит 5'ITR и 3'ITR вируса, выбранного из группы, состоящей из парвовирусов (в частности, аденоассоциированных вирусов), аденовирусов, альфавирусов, ретровирусов (в частности, гамма ретровирусов, и лентивирусов), герпесвирусов, и SV40; в предпочтительном варианте осуществления вирус представляет собой аденоассоциированный вирус (AAV), аденовирус (Ad), или лентивирус.

В одном из вариантов осуществления необязательно в комбинации с одним или несколькими признаками различных вариантов осуществления, описанными выше или ниже, конструкция нуклеиновой кислоты содержит 5'ITR и 3'ITR из AAV.

Геном AAV состоит из линейной одноцепочечной молекулы ДНК, которая содержит 4681 оснований (Berns и Bohenzky, (1987) Advances in Virus Research (Academic Press, Inc.) 32:243-307). Геном включает инвертированные концевые повторы (ITR) на каждом конце, которые функционируют в цис-положении как точки начала репликации ДНК и в качестве сигналов упаковки для вируса. ITR составляют приблизительно 145 п.н. в длину. Внутренняя не повторяющаяся часть генома включает две больших открытых рамки считывания, известных как гены AAV rep и cap, соответственно. Эти гены кодируют вирусные белки, участвующие в репликации и упаковке вириона. В частности, по меньшей мере, четыре вирусных белка синтезируются с гена AAV rep, Rep 78, Rep 68, Rep 52 и Rep 40, названные в соответствии с их наблюдаемой молекулярной массой. Ген AAV cap кодирует, по меньшей мере, три белка, VP1, VP2 и VP3. Для подробного описания генома AAV, см., например, Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129.

Конструирование рекомбинантных вирионов AAV, в основном, известно в данной области и описано например, в US 5173414 и US5139941; WO 92/01070, WO 93/03769, (Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B. J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539; Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129; и Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801.

Изобретение можно осуществлять с использованием ITR из любого серотипа AAV, включая AAV1, AAV2, AAV3 (в том числе, типы 3A и 3B), AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV птиц, бычий AAV, AAV собак, AAV лошадей, AAV овец, и любой другой серотип AAV, известный в настоящее время или открытый позднее.

В одном из вариантов осуществления необязательно в комбинации с одним или несколькими признаками различных вариантов осуществления, описанными выше или ниже, конструкция нуклеиновой кислоты содержит 5'ITR и 3'ITR из серотипа AAV, выбранного из группы, состоящей из AAV1, AAV2, и AAV4. В предпочтительном варианте осуществления конструкция нуклеиновой кислоты содержит последовательности ITR, ограниченные основаниями 1-141, и основаниями 4968-5107 из SEQ.ID.NO.1, которые представляют собой последовательности ITR из AAV2.

ITR представляют собой только вирусные элементы AAV, которые необходимы в цис-положении для репликации генома AAV и его упаковки в вирусные частицы.

В одном из вариантов осуществления необязательно в комбинации с одним или несколькими признаками различных вариантов осуществления, описанными выше или ниже, конструкция нуклеиновой кислоты содержит 5'ITR, сигнал упаковки ψ и 3'ITR аденовируса из любого серотипа в пределах любой классификации подгрупп (A-F). В конкретном варианте осуществления необязательно в комбинации с одним или несколькими признаками различных вариантов осуществления, описанными выше или ниже, эти последовательности 5'ITR, сигнала ψ и 3'ITR происходят из подгруппы C аденовируса, более предпочтительно от аденовируса серотипа 2 (Ad2) или серотипа 5 (Ad5).

С другой стороны, в других вариантах осуществления изобретение можно осуществлять с использованием синтетических 5'ITR и/или 3'ITR; и также с использованием 5'ITR и 3'ITR, которые получены от вирусов разных серотипов.

Все другие вирусные гены, необходимые для репликации вирусного вектора могут быть представлены в транс-ориентации в вирус-продуцирующих клетках (упаковывающих клетках), как описано ниже. Таким образом, их включение в конструкцию нуклеиновой кислоты генома вирусного вектора по изобретению является необязательным.

В одном из вариантов осуществления необязательно в комбинации с одним или несколькими признаками различных вариантов осуществления, описанными выше или ниже, экспрессирующий вектор представляет собой вектор на основе AAV.

В конкретном варианте осуществления конструкция нуклеиновой кислоты по изобретению представляет собой вектор на основе AAV, выбранный из группы комбинаций, состоящей из:

a) вектора, который содержит нуклеотидные последовательности 5'ITR и 3'ITR из AAV2, последовательность промотора AAT и нуклеотидную последовательность, кодирующую укороченный ATP7B человека(d57-486);

b) вектора, который содержит нуклеотидные последовательности 5'ITR и 3'ITR из AAV2, последовательность промотора AAT и нуклеотидную последовательность с оптимизированными кодонами из SEQ.ID.NO.8, кодирующую укороченный ATP7B человека(d57-486);

c) вектора, который содержит нуклеотидные последовательности 5'ITR и 3'ITR из AAV2, последовательность гибридного промотора EalbPa1AT и нуклеотидную последовательность, кодирующую укороченный ATP7B человека(d57-486); и

d) вектора, который содержит нуклеотидные последовательности 5'ITR и 3'ITR из AAV2, последовательность гибридного промотора EalbPa1AT и нуклеотидную последовательность с оптимизированными кодонами из SEQ.ID.NO.8, кодирующую укороченный ATP7B человека(d57-486).

Каждый из этих вариантов осуществления вектора на основе AAV также включает последовательность сигнала полиаденилирования, такую как синтетическая поли(A) сигнальная последовательность из SEQ.ID.NO.1 или любой другой подходящий поли(A) сигнал; вместе или раздельно с другими необязательными нуклеотидными элементами.

В другом варианте осуществления необязательно в комбинации с одним или несколькими признаками различных вариантов осуществления, описанными выше или ниже, экспрессирующий вектор представляет собой аденовирусный вектор. Этот аденовирусный вектор по изобретению может быть, в частности, аденовирусом первого, второго или третьего поколения [см. Adenovirus. Methods and Protocols. Chillón M. и Bosch A. (Eds); third Edition; 2014 Springer], или любой другой уже известной или описанной позже аденовирусной векторной системой.

В конкретном варианте осуществления необязательно в комбинации с одним или несколькими признаками различных вариантов осуществления, описанными выше или ниже, вирусный вектор по изобретению представляет собой «аденовирус третьего поколения», который также может быть обозначен как «выпотрошенный аденовирус», «аденовирус, зависимый от помощника (HD-Ad)», или «аденовирус с высокой емкостью (HC-Ad)». У аденовируса третьего поколения удалены все вирусные кодирующие области (выпотрошенный); он зависит от аденовируса-помощника для репликации (зависимый от помощника); и он может нести и лоставлять в клетку-хозяина вплоть до 36 Кб вставок чужеродного генетического материала (с высокой емкостью). Выпотрошенный аденовирус сохраняет инвернтированные концевые повторы ITR (5' и 3') и сигнал упаковки (ψ).

Конструкцию нуклеиновой кислоты и экспрессирующий вектор по изобретению, описанные в настоящем документе, можно получать общепринятыми способами, известными специалистам в данной области: Sambrook and Russell (Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Third Edition; 2001 Cold Spring Harbor Laboratory Press); и Green and Sambrook (Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Fourth Edition; 2012 Cold Spring Harbor Laboratory Press).

ВИРУСНАЯ ЧАСТИЦА ПО ИЗОБРЕТЕНИЮ ДЛЯ ГЕНОТЕРАПИИ

Термины «вирусная частица», и «вирион» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к инфекционной вирусной частице, как правило, с дефектной репликацией, содержащей вирусный геном (т.е. конструкцию нуклеиновой кислоты экпрессирующего вирусного вектора) и упакованной в капсид и, соответственно, в липидную оболочку, окружающую капсид.

В одном из вариантов осуществления необязательно в комбинации с одним или несколькими признаками различных вариантов осуществления, описанными выше или ниже, вирион по изобретению представляет собой "рекомбинантный вирион AAV» или "вирион rAAV", полученный путем упаковки конструкции нуклеиновой кислоты вектора на основе AAV по изобретению в белковую оболочку.

Белки вирусного капсида аденоассоциированного вируса (капсидные белки VP1, VP2, и VP3) получают из одного вирусного гена (гена cap). Различия между последовательностями капсидных белков из разных серотипов AAV являются результатом использования различных рецепторов клеточной поверхности для прониконовения в клетку. В комбинации с альтернативными внутриклеточными путями обработки, это приводит к различной тропности к ткани для каждого серотипа AAV.

В конкретном варианте осуществления рекомбинантный вирион AAV по изобретению можно получать путем упаковки конструкции нуклеиновой кислоты вектора на основе AAV/генома AAV, полученной из конкретного серотипа AAV, в вирусную частицу, образованную природными белками Cap, соответствующими AAV того же конкретного серотипа. Однако были разработаны несколько способов для модификации и улучшения структурных и функциональных свойств вирусных частиц природных AAV (Bünning H et al. J Gene Med 2008; 10: 717-733). Таким образом, нуклеотидную конструкцию вирусного вектора, фланкированную ITR данного серотипа AAV, можно упаковывать в другую вирусную частицу AAV по изобретению, например, в: a) вирусную частицу, состоящую из капсидных белков, которые получены из того же или другого серотипа AAV [например, ITR AAV2 и капсидные белки AAV5; ITR AAV2 и капсидные белки AAV8; и т.п.]; b) мозаичную вирусную частицу, состоящую из смеси капсидных белков из различных серотипов или мутантов AAV [например, ITR AAV2 с капсидными белками AAV1 и AAV5]; c) химерную вирусную частицу, состоящую из капсидных белков, которые были укорочены путем обмена доменами между различными серотипами или вариантами AAV [например, ITR AAV2 с капсидными белками AAV5 с доменами AAV3]; или d) нацеленную вирусную частицу, сконструированную для расположения селективных связывающих доменов, позволяющих строгое взаимодействие со специфическими рецепторами клетки-мишени [например, ITR AAV4 с капсидными белками AAV2, генетически укороченными путем вставки пептидного лиганда; или капсидными белками AAV2, модифицированными не генетическим путем за счет присоединения пептидного лиганда к поверхности капсида].

Специалисту будет понятно, что вирион AAV по изобретению может содержать капсидные белки из любого серотипа AAV. В одном из вариантов осуществления необязательно в комбинации с одним или несколькими признаками различных вариантов осуществления, описанными выше или ниже, вирусная частица содержит капсидные белки AAV. В конкретном варианте осуществления необязательно в комбинации с одним или несколькими признаками различных вариантов осуществления, описанными выше или ниже, вирусная частица на основе AAV содержит капсидные белки из серотипа, выбранного из группы, состоящей из AAV1, AAV5, AAV7, AAV8, и AAV9, которые наиболее подходят для доставки в клетки печени (Nathwani et al. Blood 2007; 109: 1414-1421; Kitajima et al. Atherosclerosis 2006; 186:65-73). В конкретном варианте осуществления необязательно в комбинации с одним или несколькими признаками различных вариантов осуществления, описанными выше или ниже, вирусная частица содержит конструкцию нуклеиновой кислоты по изобретению, где последовательности 5'ITR и 3'ITR из конструкции нуклеиновой кислоты принадлежат серотипу AAV2, а капсидные белки принадлежат серотипу AAV8.

В конкретном варианте осуществления необязательно в комбинации с одним или несколькими признаками различных вариантов осуществления, описанными выше или ниже, вирусная частица на основе AAV содержит капсидные белки из Anc80, предсказанного предшественника вирусных серотипов AAV 1, 2, 8, и 9, который ведет себя как высоко мощный генотерапевтический вектор для нацеливания на печень, мышцу и сетчатку (Zinn et al. Cell Reports 2015; 12:1-13). В более конкретном варианте осуществления, вирусная частица содержит капсидный белок VP3 Anc80L65 (номер доступа GeneBank: KT235804).

Вирусно-гликановые взаимодействия являются решающими определяющими факторами для проникновения в клетку. В конкретном варианте осуществления необязательно в комбинации с одним или несколькими признаками различных вариантов осуществления, описанными выше или ниже, вирусная частица на основе AAV содержит капсидные белки, содержащие одну или несколько аминокислотных замен, где замены вводят новый участок связывания с гликанами в капсидный белок AAV. В более конкретном варианте осуществления, замены аминокислот происходят в аминокислоте 266, аминокислотах 463-475 и аминокислотах 499-502 в AAV2 или в соответствующих аминокислотных положениях в AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV 8, AAV9, AAV10 или любом другом серотипе AAV, также включающем Anc80 и Anc80L65.

Новый введенный участок связывания с гликанами может быть участком связывания с гексозой [например, участок связывания с галактозой (Gal), маннозой (Man), глюкозой (Glu) или фукозой (fuc)]; участок связывания с сиаловой кислотой (Sia) [например, с остатком Sia, таким как N-ацетилнейраминовая кислота (NeuSAc) или N-гликолилнейраминовая кислота (NeuSGc)]; или участок связывания с дисахаридом, где дисахарид представляет собой сиаловую кислоту, связанную с галактозой, например, в форме Sia(alpha2,3)Gal или Sia(alpha2,6)Gal. Подробное руководство по введению нового участка связывания из серотипа AAV в капсидный белок из другого серотипа AAV дано в международной патентной публикации WO2014144229 и у Shen et al. (J. Biol. Chem. 2013; 288(40):28814-28823). В конкретном варианте осуществления необязательно в комбинации с одним или несколькими признаками различных вариантов осуществления, описанными выше или ниже, участок связывания с Gal из AAV9 введен в остов VP3 AAV2, что приводит к штамму AAV с двойным гликановым связыванием, который способен использовать и HS и Gal рецепторы для проникновения в клетку. Предпочтительно, указанный штамм AAV с двойным гликановым связыванием представляет собой AAV2G9. Shen et al. создал AAV2G9 путем замены аминокислотных остатков непосредственно включенных в участок распознавания и непосредственно фланкирующих участок распознавания Gal на субъединице капсидного белка VP3 AAV9 на соответствующие остатки кодирующей области субъединицы капсидного белка VP3 AAV2 (нумерация VP3 AAV2 - Q464V, A467P, D469N, I470M, R471A, D472V, S474G, Y500F, и S501A).

В другом варианте осуществления необязательно в комбинации с одним или несколькими признаками различных вариантов осуществления, описанными выше или ниже, вирион по изобретению представляет собой аденовирусный вирион, такой как вирион Ad5. Также как и в случае с вирионами AAV, капсидные белки вирионов Ad также можно конструировать для изменения их тропности и свойств нацеливания на клетки, также можно использовать альтернативные серотипы аденовирусов.

Выработка вирусных частиц

Выработку вирусных частиц, несущих конструкцию нуклеиновой кислоты экспрессионного вирусного вектора по изобретению можно проводить путем общепринятых способов и протоколов, которые выбраны с учетом структурных признаков, выбранных для данного варианта осуществления конструкции нуклеиновой кислоты и вирусной частицы вектора, которую необходимо получить.

В кратком изложении, вирусные частицы можно получать в конкретной вирус-продуцирующей клетке (упаковывающей клетке), которую трансфецируют конструкцией нуклеиновой кислоты вектора, которую нужно упаковать, в присутствии вектора-помощника или вируса-помощника или другой конструкции/конструкций ДНК.

Таким образом, в одном из аспектов изобретение относится к использованию конструкции нуклеиновой кислоты или экспрессирующего вектора по изобретению для выработки вирусных частиц.

В связанном аспекте, изобретение относится к процессу выработки вирусных частиц по изобретению, включающему стадии:

a) культивирования клетки-хозяина, содержащей конструкцию нуклеиновой кислоты или экспрессирующего вектора по изобретению, в среде для культивирования; и

b) получения вирусных частиц в супернатанте клеточной культуры и/или внутри клеток.

Предпочтительно, указанная клетка-хозяин представляет собой упаковывающую клетку, как описано ниже. Подходящие среды для культивирования известны специалисту в данной области. Ингредиенты, которые составляют такую среду, могут варьировать в зависимости от типа культивируемой клетки. В дополнение к питательной композиции, осмолярность и pH считаются важными параметрами сред для культивирования. Среда для выращивания клеток содержит ряд ингредиентов, хорошо известных специалисту в данной области, в том числе аминокислоты, витамины, органические и неорганические соли, источники углевода, липиды, микроэлементы (CuSO₄, FeSO₄, Fe(NO₃)₃, ZnSO₄), каждый ингредиент присутствует в количестве, которое поддерживает культивирование клетки in vitro (т.е., выживание и рост клеток). Ингредиенты также могут включать различные вспомогательные вещества, такие как буферные вещества (такие как бикарбонат натрия, Hepes, Tris), стабилизаторы окисления, стабилизаторы для противодействия механическому стрессу, ингибиторы протеаз, животные факторы роста, гидролизаты растений, антиагреганты, противовспениватели. Хараткетристики и композиции сред для выращивания клеток различаются в зависимости от конкретных требований для клеток. Примеры коммерчески доступных сред для выращивания клеток представляют собой MEM (минимальная поддерживающая среда), BME (минимальная среда Игла) DMEM (модифицированная Дульбекко среда Игла), Iscoves DMEM (среда Дульбекко, модифицированная по способу Исков), GMEM, RPMI 1640, Leibovitz L-15, CHO, McCoy's, Medium 199, HEK293, Ham (среда Хэм) F10 и производные, Ham F12, DMEM/F12, и т.д.

КЛЕТКА-ХОЗЯИН ПО ИЗОБРЕТЕНИЮ

В другом аспекте изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей конструкцию нуклеиновой кислоты или экспрессирующий вектор по изобретению.

Применяемый в настоящем документе термин «клетка-хозяин» относится к любой клеточной линии, которая чувствительна к заражению интересующим вирусом и поддается культивированию in vitro.

Клетку-хозяина по изобретению можно использовать для целей генотерапии ex vivo. В таких вариантах осуществления клетки трансфецируют конструкцией нуклеиновой кислоты или вирусного вектора по изобретению и затем переносят пациенту или индивидууму. Трансплантированные клетки могут иметь аутологичное, аллогеничное или гетерологичное происхождение. Для клинического применения, выделение клеток проводят, как правило, в условиях Надлежащей практики организации производства (GMP). Перед пересадкой, как правило, проверяют качество клеток и отсутствие микробных или других загрязнений, и можно проводить предтрансплантационную подготовку печени, такую как обработка радиацией и/или иммуносупрессорами. Кроме того, клетки-хозяева можно пересаживать вместе с факторами роста для стимуляции клеточной пролиферации и/или дифференцировки, такими как фактор роста гепатоцитов (HGF).

В конкретном варианте осуществления клетку-хозяина применяют для генотерапии ex vivo в печени. Предпочтительно, указанные клетки представляют собой эукариотические клетки, такие как клетки млекопитающих, которые в качестве неограничивающих примеров включают, людей, не являющиеся человеком приматов, таких как человекообразные обезьяны; шимпанзе; нечеловекообразных обезьян, и орангутанов, домашних животных, в том числе собак и кошек, а также домашний скот, такой как лошади, крупный рогатый скот, свиньи, овцы, и козы, или другие виды млекопитающих, в том числе без ограничений, мыши, крысы, морские свинки, кролики, хомяки, и т.п. Специалист в данной области может подобрать наиболее подходящие клетки в соответсвии с пациентом или индивидуумом, которому они буду трансплантированы.

Указанная клетка-хозяин может быть клеткой со свойствами самоподдержания и плюрипотентности, такой как стволовые клетки или индуцированные плюрипотентные стволовые клетки. Стволовые клетки предпочтительно являются мезенхимальными стволовыми клетками. Мезенхимальные стволовые клетки (MSC) способны к дифференцировке, по меньшей мере, в один тип из остеобласта, хондроцита, адипоцита, или миоцита, и могут быть выделены из любого типа ткани. В основном, MSC выделяют из костного мозга, жировой ткани, пупочного канатика, или периферической крови. Способы для получения хорошо известны специалисту в данной области. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (также известные как клетки iPS iPSC) представляют собой тип плюрипотентной стволовой клетки, который можно получать непосредственно из взрослых клеток. Yamanaka et al. индуцировали клетки iPS путем переноса генов Oct3/4, Sox2, Klf4 и c-Myc в фибробласты мыши и человека, и принуждения клеток к экспрессии генов (WO 2007/069666). Thomson et al. затем получили клетки iPS человека с использованием Nanog и Lin28 вместо Klf4 и c-Myc (WO 2008/118820).

Указанные клетки-хозяева могут также быть гепатоцитами. Способы пересадки гепатоцитов, включая выделение клеток и последующую трансплантацию человеку-реципиенту или мышам-реципиентам, описаны, например, у Filippi и Dhawan, Ann NY Acad Sci. 2014, 1315 50-55; Yoshida et al., Gastroenterology 1996, 111: 1654-1660; Irani et al. Molecular Therapy 2001, 3:3, 302-309; и Vogel et al. J Inherit Metab Dis 2014, 37:165-176. Способ для трансдукции вирусного вектора в гепатоциты ex vivo описан, например, у Merle et al., Scandinavian Journal of Gastroenterology 2006, 41:8, 974-982.

В другом конкретном варианте осуществления клетка-хозяин представляет собой упаковывающую клетку. Указанные клетки могут быть прикрепляющимися клетками или клетками в суспензии. Упаковывающая клетка и вектор-помощник или конструкции ДНК вместе обеспечивают в транс-положении все отсутствующие функции, которые необходимы для полной репликации и упаковки вирусного вектора.

Предпочтительно, указанные упаковывающие клетки представляют собой эукариотические клетки, такие как клетки млекопитающих, включая клетки обезьян, человека, собаки и грызуна. Примеры клеток человека представляют собой клетки PER.C6 (WO01/38362), MRC-5 (ATCC CCL-171), WI-38 (ATCC CCL-75), клетки HEK-293 (ATCC CRL-1573), клетки HeLa (ATCC CCL2), и клетки зародышевого легкого макаки резус (ATCC CL-160). Примеры клеток не являющегося человеком примата представляют собой клетки Vero (ATCC CCL81), клетки COS-1 (ATCC CRL-1650) или клетки COS-7 (ATCC CRL-1651). Примеры клеток собаки представляют собой клетки MDCK (ATCC CCL-34). Примеры клеток грызуна представляют собой клетки хомяка, такие как BHK21-F, клетки HKCC, или клетки CHO.

В качестве альтернативы источникам клеток из млекопитающих, клеточные линии для применения в изобретении можно получать из источников из птиц, таких как курица, утка, гусь, перепел или фазан. Примеры клеточных линий птиц включают эмбриональные стволовые клетки птиц (WO01/85938 и WO03/076601), иммортализованные клетки сетчатки утки (WO2005/042728), и клетки, полученные из эмбриональных стволовых клеток птиц, включая клетки курицы (WO2006/108846) или клетки утки, такие как клеточная линия EB66 (WO2008/129058 & WO2008/142124).

В другом варианте осуществления указанная клетка-хозяин представляет собой клетки насекомых, такие как клетки SF9 (ATCC CRL-1711), клетки Sf21 (IPLB-Sf21), клетки MG1 (BTI-TN-MG1) или клетки High Five™ (BTI-TN-5B1-4).

Таким образом, в конкретном варианте осуществления необязательно в комбинации с одним или несколькими признаками различных вариантов осуществления, описанными выше или ниже, клетка-хозяин содержит:

a) конструкцию нуклеиновой кислоты или экспрессирующий вектор по изобретению (т.е., рекомбинантный геном AAV), как правило, в виде плазмиды;

b) конструкцию нуклеиновой кислоты, как правило, плазмиду, кодирующую гены rep и/или cap AAV, которая не несет последовательности ITR; и/или

c) конструкцию нуклеиновой кислоты, как правило, плазмиду или вирус, содержащую вирусные гены-помощники.

Вирусные гены, необходимые для репликации AAV, в настоящем документе называются вирусные гены-помощники. Как правило, указанные гены, необходимые для репликации AAV, представляют собой аденовирусные гены-помощники, такие как РНК E1A, E1B, E2a, E4, или VA. Предпочтительно, аденовирусные гены-помощники относятся к серотипу Ad5 или Ad2.

Можно использовать общепринятые способы для получения вирусных частиц вектора на основе AAV, которые включают временную ко-трансфекцию клеток конструкцией нуклеиновой кислоты (например, плазмидой), несущей рекомбинантный вектор на основе AAV/геном AAV по изобретению; конструкцией нуклеиновой кислоты (например, плазмидой-помощником на основе AAV), которая кодирует гены rep и cap, но не несет последовательности ITR; и третьей конструкцией нуклеиновой кислоты (например, плазмидой), обеспечивающей аденовирусные функции, необходимые для репликации AAV.

Таким образом, в конкретном варианте осуществления необязательно в комбинации с одним или несколькими признаками различных вариантов осуществления, описанными выше или ниже, указанная клетка-хозяин характеризуется содержанием:

i) конструкции нуклеиновой кислоты или экспрессирующего вектора по изобретению (т.е., рекомбинантного генома AAV);

ii) конструкции нуклеиновой кислоты, кодирующей гены rep и cap AAV, которая не несет последовательности ITR; и

iii) конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей аденовирусные гены-помощники.

Альтернативно, гены rep, cap и аденовирусные гены-помощники можно комбинировать в одной плазмиде (Blouin Vet al. J Gene Med. 2004; 6(suppl): S223-S228; Grimm D. et al. Hum. Gene Ther. 2003; 7: 839-850). Таким образом, в другом конкретном варианте осуществления необязательно в комбинации с одним или несколькими признаками различных вариантов осуществления, описанными выше или ниже, указанная клетка-хозяин характеризуется содержанием:

i) конструкции нуклеиновой кислоты или экспрессирующего вектора по изобретению (т.е., рекомбинантного генома AAV);

ii) конструкции нуклеиновой кислоты, кодирующей гены rep и cap AAV, которая не несет последовательности ITR и дополнительно содержит аденовирусные гены-помощники.

В дополнительном конкретном варианте осуществления необязательно в комбинации с одним или несколькими признаками различных вариантов осуществления, описанными выше или ниже, клетка-хозяин содержит:

a) конструкцию нуклеиновой кислоты или экспрессирующий вектор по изобретению (т.е., рекомбинантный геном AAV);

b) плазмиду, кодирующую гены rep и cap AAV, которая не несет последовательности ITR; и

c) плазмиду, содержащую аденовирусные гены-помощники РНК E2a, E4, и VA,

где ко-трансфекцию проводят в клетках, предпочтительно клетках млекопитающих, которые экспрессируют аденовирусный ген E1 и транскомплементарны ему, такие как клетки HEK-293 (ATCC CRL-1573).

Широкомасштабное производство векторов на основе AAV по изобретению можно также проводить, например, путем заражения клеток насекомых комбинацией рекомбинантных бакуловирусов (Urabe et al. Hum. Gene Ther. 2002; 13: 1935-1943). Клетки SF9 совместно заражают тремя бакуловирусными векторами, соответственно экспрессирующими rep AAV, cap AAV и вектор AAV, который предполагается упаковать. Рекомбинантные бакуловирусные векторы будут обеспечивать функции вирусного гена-помощника, необходимого для репликации и/или упаковки вируса.

С использованием плазмиды-помощника, кодирующей ORF rep (открытую рамку считывания) одного серотипа AAV и ORF cap из другого серотипа AAV, становится возможным упаковать вектор, фланкированный ITR определенного серотипа AAV, в вирионы, собранные из капсидных структурных белков другого серотипа. Также при помощи этого способа возможна упаковка мозаичного, химерного или нацеленного векторов.

С другой стороны, получение векторов с высокой емкостью HC-Ad по изобретению можно проводить при помощи клеток млекопитающих, которые постоянно экспрессируют аденовирусный ген E1 и транскомплементарны ему, а также рекомбиназу Cre (например, клетки 293Cre). Эти клетки трансфецируют геномом вектора HC-Ad и заражают аденовирусным вирусом-помощником первого поколения (E1-удален), в котором в котором сигнал для упаковки фланкирован последовательностями loxP. [Parks RJ et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 13565-13570; для клеток 293Cre, см. Palmer и Engel. Mol. Ther. 2003; 8:846-852]. Были описаны несколько систем вирусов-помощников на основе Cre/loxP, которые можно использовать для упаковки векторов HC-Ad, такие как AdAdLC8cluc, или оптимизированный самоинактивирующийся вирус-помощник AdTetCre (EP2295591; Gonzalez-Aparicio et al. Gene Therapy 2011; 18: 1025-1033).

Дополнительное руководство по конструированию и получению вирусных векторов для генотерапии по изобретению можно найти в:

Viral Vectors for Gene Therapy, Methods and Protocols. Series: Methods in Molecular Biology, Vol. 737. Merten and Al-Rubeai (Eds.); 2011 Humana Press (Springer).

Gene Therapy. M. Giacca. 2010 Springer-Verlag.

Heilbronn R. and Weger S. Viral Vectors for Gene Transfer: Current Status of Gene Therapeutics. In: Drug Delivery, Handbook of Experimental Pharmacology 197; M. Schäfer-Korting (Ed.). 2010 Springer-Verlag; pp. 143-170.

Adeno-Associated Virus: Methods and Protocols. R.O. Snyder and P. Moulllier (Eds). 2011 Humana Press (Springer).

Bünning H. et al. Recent developments in adeno-associated virus technology. J. Gene Med. 2008; 10:717-733.

Adenovirus: Methods and Protocols. M. Chillón and A. Bosch (Eds.); Third Edition. 2014 Humana Press (Springer).

ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ ПРИМЕНЕНИЯ

В дополнительном аспекте, изобретение относится к продукту по изобретению, определенному в пределах раздела Сущность изобретения, для применения в качестве лекарственного средства.

В дополнительном аспекте, изобретение относится к продукту по изобретению, определенному в пределах раздела Сущность изобретения, для применения для лечения состояния, вызванного недостаточностью или нарушением функции медь-транспортирующей АТФазы 2, и любых других состояний и заболеваний, при которых повышение экспрессии и активности медь-транспортирующей АТФазы 2 может принести терапевтическую выгоду или улучшение, в частности, заболевания или состояния, ассоциированного со снижением лизосомального ATP7B-зависимого экзоцитоза и накоплением меди в лизосомах, такого как холеостатические нарушения, болезнь Альцгеймера и/или злокачественная опухоль (Polishchuck et al. Dev Cell. 2014, 29(6), 686-700; Gupta and Lutsenko, Future Med. Chem. 2009, 1, 1125-1142).

Индивидуум, подлежащий лечению, может быть млекопитающим, и в частности, пациентом-человеком.

В конкретном варианте осуществления необязательно в комбинации с одним или несколькими признаками различных вариантов осуществления, описанными выше или ниже, состояние, вызванное недостаточностью или нарушением функции медь-транспортирующей АТФазы 2, представляет собой болезнь Вильсона (БВ, номер доступа в онлайн-каталоге фенетических маркеров человека OMIN 277900; http://www.omim.org/entry/277900).

В связанном аспекте, изобретение относится к использованию продукта по изобретению, определенного в пределах раздела Сущность изобретения, в препарате лекарственного средства для применения для лечения состояния, вызванного недостаточностью или нарушением функции медь-транспортирующей АТФазы 2, и любых других состояний и заболеваний, при которых повышение экспрессии и активности медь-транспортирующей АТФазы 2 может принести терапевтическую выгоду или улучшение, предпочтительно для применения для лечения болезни Вильсона.

В дополнительном аспекте, изобретение относится к лечению состояния, вызванного недостаточностью или нарушением функции медь-транспортирующей АТФазы 2, и любых других состояний и заболеваний, при которых повышение экспрессии и активности медь-транспортирующей АТФазы 2 может принести терапевтическую выгоду или улучшение, предпочтительно для применения для лечения болезни Вильсона, у пациента, которое включает введение пациенту терапевтически эффективного количества конструкции нуклеиновой кислоты, экспрессирующего вектора, клетки-хозяина, вирусной частицы или фармацевтической композиции по изобретению.

Лечение продуктом по изобретению может облегчать, улучшать или уменьшать тяжесть одного или нескольких симптомов БВ. Например, лечение может увеличивать и/или восстанавливать синтез холоцерулоплазмина, оксидазную активность церулоплазмина и /или экскрецию меди в желчь (таким образом, снижая накопление меди в сыворотке, печени, головном мозге и моче); и как следствие может облегчать, улучшать или уменьшать тяжесть боли в животе, усталость, желтуху, частоту неконтролируемых движений, ригидность мышц, проблемы с речью, глотанием или физической координацией.

Продукт по изобретению, как правило, будет включен в фармацевтическую композицию или лекарственное средство, необязательно в комбинации с фармацевтическим носителем, разбавителем и/или адъювантом. Такая композиция или медицинский продукт содержит продукт по изобретению в эффективном количестве, достаточном для того чтобы обеспечить желаемый терапевтический эффект, и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.

Таким образом, в дополнительном аспекте, изобретение относится к фармацевтической композиции, которая содержит конструкцию нуклеиновой кислоты, экспрессирующий вектор, клетку-хозяина или вирусную частицу по изобретению, и фармацевтически приемлемый носитель.

В препарате фармацевтической композиции по изобретению можно использовать любой подходящий фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент (См. например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro (Editor) Mack Publishing Company, April 1997). Фармацевтические композиции, как правило, являются стерильными и стабильны в условиях производства и хранения. Фармацевтические композиции можно формулировать в виде растворов (например, физиологический раствор, раствор декстрозы, или забуференный раствор, или другие фармацевтически приемлемые стерильные жидкости), микроэмульсий, липосом, или других организованных структур, подходящих для содержания высокой концентрации продукта (например, микрочастицы или наночастицы). Носитель может быть растворителем или диспергирующей средой, содержащей, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, и жидкий полиэтиленгликоль, и т.п.), и их подходящие смеси. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, при помощи покрытия, такого как лецитин, путем сохранения необходимого размера частиц в случае дисперсии и путем использования поверхностно-активных веществ. Во многих случаях, будет предпочтительно включить в композицию средства для придания изотоничности, например, сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит, или хлорид натрия. Продолжительного всасывания инъекционных композиций можно достигать, включая в композицию средство, которое замедляет абсорбцию, например, соли моностеаратов и желатин. Продукт по изобретению можно вводить в состав с контролируемым высвобождением, например в композицию, которая включает полимер для замедленного высвобождения или другие носители, которые защищают продукт от быстрого высвобождения, в том числе имплантаты и микроинкапсулированные системы доставки. Можно, например, использовать биоразлагаемые и биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры, полимолочная кислота и сополимеры полимолочной/полигликолевой кислот (PLG). Предпочтительно, указанную фармацевтическую композицию формулируют в виде раствора, более предпочтительно необязательно в виде забуференного физиологического раствора.

В фармацевтические композиции по изобретению можно также включать дополнительные активные соединения. Руководство по совместному введению дополнительных терапевтических средств можно, например, найти в Справочнике фармацевтических препаратов и специализированных средств (CPS) Канадской ассоциации фармацевтов.

В одном из вариантов осуществления необязательно в комбинации с одним или несколькими признаками различных вариантов осуществления, описанными выше или ниже, фармацевтическая композиция по изобретению представляет собой парентеральную фармацевтическую композицию, в том числе композицию, подходящую для внутривенного, внутриартериального, подкожного, интраперитонеального или внутримышечного введения. Эти фармацевтические композиции приведены только в качестве примера и не ограничивают фармацевтические композиции, подходящие для других парентеральных и непарентеральное путей введения.

В контексте изобретения, "эффективное количество" означает терапевтически эффективное количество.

Применяемый в настоящем документе "терапевтически эффективное количество" относится к количеству, эффективном в дозировках и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического результата, такого как повышение активности, связанной с перемещением меди, таким образом, повышение медь в желчи и снижение меди в сыворотке, печени, головном мозге и моче. Терапевтически эффективное количество продукта по изобретению или фармацевтической композиции, которая его содержит, может меняться в соответствии с такими факторами, как состояние болезни, возраст, пол, и масса индивидуума, и способность продукта или фармацевтической композиции вызывать желаемый ответ у индивидуума. Режимы дозирования можно корректировать для того чтобы обеспечить оптимальный терапевтический ответ. Терапевтически эффективное количество также, как правило, представляет собой количество, при котором любой токсическое или вредное воздействие продукта или фармацевтической композиции перевешивается терапевтически положительным воздействием.

В одном из вариантов осуществления необязательно в комбинации с одним или несколькими признаками различных вариантов осуществления, описанными выше или ниже, фармацевтическую композицию, содержащую продукт по изобретению, вводят индивидууму или пациенту парентеральным путем.

В одном из вариантов осуществления необязательно в комбинации с одним или несколькими признаками различных вариантов осуществления, описанными выше или ниже, фармацевтическую композицию вводят внутривенным, внутриартериальным, подкожным, интраперитонеальным или внутримышечным путем.

В одном из вариантов осуществления необязательно в комбинации с одним или несколькими признаками различных вариантов осуществления, описанными выше или ниже, фармацевтическую композицию, содержащую продукт по изобретению, вводят интерстициальным путем, т.е. путем инъекции к интерстицию или в интерстиций ткани. Ткань-мишень может быть конкретной, например, ткань печени, или может быть сочетанием нескольких тканей, например, ткани мышц и печени. Примеры тканей-мишеней могут включать печень, скелетную мышцу, сердечную мышцу, жировые отложения, почку, легкое, сосудистый эндотелий, эпителиальные и/или гематопоэтические клетки. В предпочтительном варианте осуществления необязательно в комбинации с одним или несколькими признаками различных вариантов осуществления, описанными выше или ниже, композицию вводят путем внутрипеченочной инъекции, т.е. инъекции в межклеточное пространство печеночной ткани.

Количество продукта по изобретению, которое вводят индивидууму или пациенту может варьировать в зависимости от конкретных обстоятельств индивидуума или пациента, включая возраст, пол и массу индивидуума; характер и стадию заболевания, агрессивность заболевания; путь введение; и/или сопутствующее медикаментозное лечение, которое было прописано индивидууму или пациенту. Режимы дозирования можно корректировать для того чтобы обеспечить оптимальный терапевтический ответ.

Для любого конкретного индивидуума, конкретные режимы дозирования можно корректировать с течением времени в соответствии с потребностями индивидуума и профессиональной оценкой о назначении композиций или надзора за введением композиций. Диапазоны доз, представленные в настоящем документе. Приведены только для примера и не ограничивают диапазоны доз, которые могут выбирать врачи-терапевты.

В одном из вариантов осуществления вектор по изобретению на основе AAV можно вводить индивидууму или пациенту для лечения болезни Вильсона в количестве или дозе, находящимся в пределах диапазона от 5×10¹¹ до 1×10¹⁴ вг/кг (вг: вирусные геномы; кг: масса тела индивидуума или пациента). В более конкретном варианте осуществления, вектор на основе AAV вводят в количестве, находящемся в пределах диапазона 1×10¹² до 1×10¹³ вг/кг.

В другом варианте осуществления вектор HC-Ad по изобретению можно вводить индивидууму или пациенту для лечения болезни Вильсона в количестве или дозе, находящимся в пределах диапазона от 1×10⁹ до 1×10¹¹ ие/кг (ие: инфекционные единицы вектора).

В другом аспекте изобретение дополнительно относится к набору, содержащему конструкцию нуклеиновой кислоты, вектор, клетку-хозяина, вирусную частицу или фармацевтическую композицию по изобретению в одном или нескольких контейнерах. Набор по изобретению может включать инструкции или упаковочные материалы, которые описывают, как вводить пациенту конструкцию нуклеиновой кислоты, вектор, клетку-хозяина или вирусную частицу по изобретению, содержащиеся в наборе. Контейнеры из набора могут быть из любого подходящего материала, например, стекла, пластика, металла, и т.д., и любого подходящего размера, формы, или конфигурации. В определенных вариантах осуществления наборы могут включать одну или несколько ампул или шприцов, которые содержат конструкцию нуклеиновой кислоты, вектор, клетку-хозяина, вирусную частицу или фармацевтическую композицию по изобретению в подходящей жидкости или в форме раствора.

На всем протяжении описания и формулы изобретения слово "содержит" и его варианты, не предназначено для исключения других технических признаков, добавок, компонентов или этапов. Кроме того, слово «содержит» включает случай «состоит из». Дополнительные объекты, преимущества и признаки изобретения станут понятны специалистам в данной области при рассмотрении описания или могут быть изучены при практиковании изобретения. Следующие примеры приведены в качестве иллюстрации, и они не предназначены для ограничения настоящего изобретения. Кроме того, настоящее изобретение охватывает все возможные комбинации конкретных и предпочтительных вариантов осуществления, описываемых в настоящем документе.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Конструирование рекомбинантных экспрессирующих векторов

Были разработаны и произведены пять различных векторов на основе AAV, которые несут и экспрессируют ATP7B человека, или укороченную форму ATP7B человека, для проведения генотерапии болезни Вильсона (БВ): AAV2/8-AAT-wtATP7B, AAV2/8-AAT-coATP7B, AAV2/8-AAT-ATP7B(d223-366), AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) и AAV2/8-AAT-coATP7B(d57-486).

1.1 Вектор AAV2/8-AAT-wtATP7B [в настоящем документе также называется AAV-wtATP7B]

Геномная последовательность этого вектора идентифицирована как SEQ.ID.NO.1.

Сначала, плазмида pUC-ATP7B была собрана по запросу (GenScript) путем клонирования конструкции нуклеиновой кислоты в плазмиду pUC57. Конструкция нуклеиновой кислоты содержала последовательность кДНК, кодирующую ATP7B человека (трансген), вместе с синтетической последовательностью сигнала подиаденилирования (Levitt N. et al. Genes & Development 1989; 3(7):1019-1025) ниже трансгена.

Затем, в плазмиду pUC-ATP7B был введен минимальный промотор гена альфа1-антитрипсина (AAT), выше гена ATP7B. Минимальный промотор включает последовательность от нуклеотида -261 до нуклеотида +44 относительно сайта кэпирования промотора AAT (Kramer M.G. et al. Mol. Therapy 2003; 7(3): 375-385) и содержит тканеспецифический элемент (TSE), необходимый для функционирования в печени, и дистальную область (DRI), необходимую для активность полного промотора. Промотор AAT получали путем ПЦР-амплификации с использованием в качестве матрицы плазмиды pEnhAlbAAT-люцифераза (предоставленной M.G. Kramer) и следующих праймеров:

Праймер AAT-прямой

5' CTGGTCTAGAACGCGTCGCCACCCCCTCCACCTTGG 3' (SEQ.ID.NO.10); и

Праймер AAT-обратный

5' ATCATGATGCGGCCGCTTCACTGTCCCAGGTCAGTG 3' (SEQ.ID.NO.11).

Праймер AAT-Прямой имеет участок рестрикции для XbaI и MluI и праймер AAT-обратный имеет участок рестрикции для NotI.

Таким образом, для того чтобы получить плазмиду pUC-AAT-ATP7B, плазмиду pUC-ATP7B расщепляли XbaI и NotI и лигировали с промотором AAT, предварительно расщепленным этими же ферментами.

Экспрессирующую кассету затем субклонировали в плазмиду для переноса на основе AAV pAAV-MCS (Agilent technologies) путем расщепления рестрикционными ферментами PmlI и MluI, таким образом, получая плазмиду pAAV2-AAT-wtATP7B.

После конструирования плазмиды, производили вектор на основе AAV путем двойной трансфекции клеток 293 плазмидой pAAV2-AAT-ATP7B и плазмидой pDP8 (полученной от PlasmidFactory, Bielefeld, Germany; плазмида pDP8 экспрессирует капсидный белок AAV8, белок rep AAV2 и аденовирусные молекулы, необходимые для продукции и упаковки AAV).

Наконец, вектор очищали в градиенте йодиксанола и титровали путем количественной ПЦР.

1.2 Вектор AAV2/8-AAT-coATP7B [в настоящем документе также называется AAV-coATP7B]

Геномная последовательность этого вектора идентифицирована как SEQ.ID.NO.3.

Для получения вектора на основе AAV, экспрессирующего версию гена ATP7B с оптимизированными кодонами (coATP7B), сначала собирали по запросу плазмиду pUC-coATP7B (GenScript) путем клонирования конструкции нуклеиновой кислоты в плазмиду pUC57. Затем coATP7B вырезали из pUC-coATP7B путем расщепления рестрикционными ферментами NotI и KpnI и субклонировали в плазмиду pAAV2-AAT-wtATP7B, предварительно расщепленную этими же ферментами, NotI и KpnI, для получения плазмиды pAAV2-AAT-coATP7B.

После конструирования плазмиды, продукцию вирусного генома и упаковку вирусных частиц проводили, как было описано ранее для вектора AAV2/8-AAT-wtATP7B: двойная трансфекция ранее полученной плазмидой pAAV2-AAT-coATP7B с плазмидой pDP8, очистка (в градиенте йодиксанола) и титрование.

1.3 Вектор AAV2/8-AAT-ATP7B(d223-366) [в настоящем документе также называется AAV-T1]

Этот вектор несет в качестве последовательности трансгена последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ.ID.NO.12), кодирующей ATP7B(d223-366), укороченную форму ATP7B человека, в которой были удалены аминокислоты с 223 до 366. Удаленная последовательность содержит домен HMA 3 и семь аминокислот домена HMA 4.

Для получения вектора, плазмиду pUC57-wtATP7B расщепляли рестрикционными ферментами MfeI и Nae I, для получения плазмиды pUC57-ATP7B-T1. Этим способом размер кодирующей области был уменьшен на 432 нуклеотида, а размер белка на 144 аминокислоты.

После конструирования плазмиды pUC57-ATP7B-T1, продукцию вирусного генома и упаковку вирусных частиц проводили, как было описано ранее для вектора AAV2/8-AAT-wtATP7B: лигирование с промотором AAT, субклонирование в плазмиду pAAV-MCS, двойная трансфекция ранее полученной плазмидой pAAV2-AAT-T1 с плазмидой pDP8, очистка вируса (в градиенте йодиксанола) и титрование.

1.4 Вектор AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) [в настоящем документе также называется AAV-T2]

Геномная последовательность этого вектора идентифицирована как SEQ.ID.NO.6.

Этот вектор несет в качестве последовательности трансгена последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей ATP7B(d57-486) [также называется ATP7B-T2], укороченную форму ATP7B человека, в которой были удалены аминокислоты с 57 до 486. Этим способом были удалены первые четыре домена HMA, с одновременным сохранением сигнальной последовательности, которая содержит 56 аминокислот аминоконцевой области, уменьшая кодирующую область на 1,29 Кб и белок на 430 аминокислот.

Нуклеотидную последовательность ATP7B(d57-486) получали путем ПЦР-амплификации с использованием pUC57-wtATP7B в качестве матрицы и двух наборов праймеров;

первый набор праймеров, амплифицирующий аминоконцевую последовательность:

Праймер F1:

5'CTAGATGCGGCCGCCACCATGCCTG3' (SEQ.ID.NO.14), и

Праймер R1:

5'CTGAGAAGAAGGGCCCAGGCC3' (SEQ.ID.NO.15); и

второй набор праймеров, амплифицирующий карбоксиконцевую область:

Праймер F2:

5'GGCCCTTCTTCTCAGCCGCAGAAGTGCTTCTTACAG3' (SEQ.ID.NO.16), и

Праймер R2:

5'ACCAAAATCGATAAAACCGATTACAATCC 3' (SEQ.ID.NO.17).

5'-концевые последовательности праймеров R1 и F2 комплементарны. Проводили ПЦР для получения нуклеотидной последовательности, кодирующей ATP7B(d57-486), с использованием эквимолярных количеств очищенных фрагментов из двух ПЦР и праймеров F1 и R2. Продукт ПЦР затем расщепляли NotI и ClaI и клонировали в плазмиду pUC57-AAT-wtATP7B, предварительно расщепленную обоими ферментами, и получали плазмиду pUC57-ATP7B-T2.

После конструирования плазмиды pUC57-ATP7B-T2, продукцию вирусного генома и упаковку вирусных частиц проводили, как было описано ранее для вектора AAV2/8-AAT-wtATP7B: лигирование с промотором AAT, субклонирование в плазмиду pAAV-MCS, двойная трансфекция ранее полученной плазмидой pAAV2-AAT-T2 с плазмидой pDP8, очистка вируса (в градиенте йодиксанола) и титрование.

1.5 Вектор AAV2/8-AAT-coATP7B(d57-486) [в настоящем документе также называется AAV-AAT-coT2]

Этот вектор несет в качестве трансгена последовательность нуклеиновой кислоты с оптимизированными кодонами [SEQ.ID.NO.8; coATP7B(d57-486) или coATP7B-T2], которая также кодирует ATP7B(d57-486).

Нуклеотидную последовательность coATP7B(d57-486) получали путем ПЦР-амплификации с использованием pUC57-coATP7B wtATP7B в качестве матрицы и двух наборов праймеров;

первый набор праймеров, амплифицирующий аминоконцевую последовательность:

Праймер F3:

5' ACGCGTGCGGCCGCCACCATGCCAG 3' (SEQ.ID.NO.18), и

Праймер R3:

5' CTGGGAGCTAGGTCCCAGTCC 3' (SEQ.ID.NO.19); и

второй набор праймеров, амплифицирующий карбоксиконцевую область:

Праймер F4:

5' GGACCTAGCTCCCAGCCTCAGAAGTGTTTTCTGCAG 3' (SEQ.ID.NO.20), и

паймер R4:

5' TGTTCCTCGCGAATGATCAGGTTGTCCTC 3' (SEQ.ID.NO.21).

5'-концевые последовательности праймеров R3 и F4 комплементарны. Проводили ПЦР для получения нуклеотидной последовательности с оптимизированными кодонами, кодирующей ATP7B(d57-486), с использованием эквимолярных количеств очищенных фрагментов из двух ПЦР и праймеров F3 и R4. Продукт ПЦР затем расщепляли NotI и NruI и клонировали в плазмиду pUC57-AAT-wtATP7B, предварительно расщепленную обоими ферментами, и получали плазмиду pUC57-coATP7B-T2.

После конструирования плазмиды pUC57-coATP7B-T2, продукцию вирусного генома и упаковку вирусных частиц проводили, как было описано ранее для вектора AAV2/8-AAT-wtATP7B: лигирование с промотором AAT, субклонирование в плазмиду pAAV-MCS, двойная трансфекция ранее полученной плазмидой pAAV2-AAT-coT2 с плазмидой pDP8, очистка вируса (в градиенте йодиксанола) и титрование.

Пример 2. Модель болезни Вильсона на животных: ATP7B KO

Терапевтические свойства векторов AAV2/8-AAT-ATP7B-T1 и AAV2/8-AAT-ATP7B-T2 тестировали на мышах с нокаутом ATP7B (ATP7B KO, ATP7B^-/-или мыши с БВ), которые являются типичной моделью БВ на животных. Эта модель на животных была разработана Buiakova et al., путем введения кодона ранней терминации в мРНК ATP7B мыши за счет конструирования замены части экзона 2 ATP7B неомициновой кассетой, ориентированной в противоположной транскрипционной рамке (Buikova O.I. et al. Human Molecular Genetics 1999; 8(9): 1665-1671). Мыши с нокаутом ATP7B показывают отсутствие экспрессии ATP7B в печени и высокую экскрецию Cu в мочу, низкие уровни холоцерулоплазмина в сыворотке, высокие уровни трансаминаз, высокую концентрацию Cu в печени и патологическую гистологию печени. Эти мыши демонстрируют типичные биохимические характеристики болезни Вильсона у человека, за исключением неврологической аффектации (Lutsenko S. Biochemical Society Transactions 2008; 36(Pt 6): 1233-1238).

Пример 3. Определение терапевтического эффекта of вирусных векторов AAV2/8-AAT-ATP7B-T1 и AAV2/8-AAT-ATP7B-T2 у мышей с болезнью Вильсона

Шестинедельных (6w) самцов мышей ATP7B-/- делили на 4 группы по 5 мышей в каждой: первую из групп лечили внутривенно вектором AAV2/8-AAT-wtATP7B в дозе 3×10¹⁰ вг/на мышь (вг: вирусные геномы); вторую группу лечили такой же дозой вектора AAV2/8-AAT-ATP7B-T1; третью группу лечили такой же дозой вектора AAV2/8-AAT-ATP7B-T2; и четвертую группу оставили нелеченной. Дополнительную группу мышей дикого типа оставляли нелеченной в качестве контрольной группы (контроль). Животных умерщвляли через двадцать четыре недели после введения вектора (w30).

Через четыре недели после введения вектора и каждые пять недель после этого, вплоть до недели 30 у всех групп определяли уровни трансаминаз в сыворотке (ALT) и содержание Cu в моче. Активность церулоплазмина в сыворотке измеряли через 4 недели после лечения.

Уровни трансаминаз в сыворотке (ALT) определяли способом с DGKC (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) с использованием клинического анализатора Hitachi 747 (Hitachi, Tokyo, Japan).

Активность церулоплазмина в сыворотке определяли с использованием в качестве субстрата ο-дианизидин дигидрохлорида (4,4'-диамино-3,3'-диметокси-бифенила) (Sigma-Aldrich, San Louis, MO, United States), как описано у Schosinsky и коллег. (Clinical Chemistry 1974; 20(12): 1556-1563). Оптическую плотность измеряли при 540 нм на спектрофотометре.

Содержание меди в моче определяли при помощи атомно-абсорбционной спектроскопии (SIMAA 6000, from Perkin-Elmer GmbH, Bodenseewerk).

После умерщвления печень вырезали для гистологического анализа.

Содержание меди в печени определяли в сухой ткани печени при помощи атомно-абсорбционной спектроскопии (SIMAA 6000, от Perkin-Elmer GmbH, Bodenseewerk), и способом окрашивания серебром по Тимму (Danscher G. и Zimmer J. Histochemistry 1978; 55(1): 27-40).

Структуру печени оценивали на срезах, окрашенных гематоксилином и эозином.

Проводили иммуногистохимию с антителом к мышиному CD45 (BioLegend, San Diego, USA; каталожный номер 103102) для выявления воспалительной инфильтрации в печени.

Также проводили иммуногистохимию с антителом к мышиному PanCk (Invitrogen/Life Technologies, 18-0132, клон AE1/AE3) для выявления клеток желчевыводящих путей.

Для выявления фиброза использовали общепринятое окрашивание Сириусом красным в качестве способа для определения коллагена.

Как показано на фигуре 2, уровни трансаминаз нормализовались у мышей, получавших AAV2/8-AAT-wtATP7B или AAV2/8-AAT-ATP7B-T2, но не у животных, которых лечили AAV2/8-AAT-ATP7B-T1. Кроме того, концентрация Cu в моче была значимо ниже у животных, которые получили AAV2/8-AAT-wtATP7B, AAV2/8-AAT-ATP7B-T1, или AAV2/8-AAT-ATP7B-T2; однако AAV2/8-AAT-ATP7B-T1 был менее эффективен для снижения концентрации Cu в моче (фигура 3). Активность церулоплазмина восстановилась через четыре недели после лечения у животных, получающих AAV2/8-AAT-wtATP7B или AAV2/8-AAT-ATP7B-T2, но не у животных, которых лечили AAV2/8-AAT-ATP7B-T1 (фигура 4). Это результат был подкреплен анализом вестерн-блоттинга. Холоцерулоплазмин был выявлен у мышей, которых лечили AAV2/8-AAT-wtATP7B или AAV2/8-AAT-ATP7B-T2, но не у животных, которых лечили AAV2/8-AAT-ATP7B-T1, где, как и у необработанных мышей с БВ, можно было выявить только форму апоцерулоплазмина.

С другой стороны, введение AAV2/8-AAT-wtATP7B, AAV2/8-AAT-ATP7B-T1, или AAV2/8-AAT-ATP7B-T2 значимо снизило содержание Cu в печени; однако, AAV2/8-AAT-ATP7B-T1 был менее эффективен для снижения концентрации Cu в печени (фигура 5). Результаты подтвердились на снимке, полученном после окрашивания по Тимму (фигура 6B). Что касается гистологии печени, животные без лечения демонстрировали нарушенную архитектуру печени с огромными гепатоцитами, содержащими ненормальные ядра. Введение векторов AAV2/8-AAT-wtATP7B или AAV2/8-AAT-ATP7B-T2, но не AAV2/8-AAT-ATP7B-T1, привело к нормализации гистологии печени (фигура 6A). Кроме того, у животных с БВ присутствует сильный печеночный инфильтрат, в основном, состоящий из CD45-положительных клеток; инфильтрат исчез после лечения рекомбинантными вирусными векторами (фигура 7). Таким образом, введение вектора на основе AAV привело к заметному уменьшению воспалительного инфильтрата. Кроме того, были также значимо снижены пролиферация в желчных протоках и фиброз печениу мышей с БВ, которых лечили AAV2/8-AAT-wtATP7B, AAV2/8-AAT-ATP7B-T2, и AAV2/8-AAT-ATP7B-T1 (фигура 7).

Пример 4. Терапевтический эффект вирусного вектора AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) у самок мышей с болезнью Вильсона

Шестинедельных (6w) самок мышей ATP7B-/- делили на 4 группы по 5 мышей в каждой: животных из групп 1-3 обрабатывали внутривенно вирусным вектором AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486), каждая группа получала различную дозу (соответственно, 1×10¹⁰, 3×10¹⁰ и 1×10¹¹ вирусных геномов/на мышь); четвертую группу оставили нелеченной. Дополнительную группу мышей дикого типа оставляли нелеченной в качестве контрольной группы (WT).

Через четыре недели после введения вектора и каждые пять недель после этого, вплоть до 24 недель после лечения (когда мышам было 30 недель) у всех групп определяли уровни трансаминаз в сыворотке (ALT) и содержание Cu в моче, теми же способами, как описано в примере 3.

Как показано на фигуре 8, AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) нормализовал уровни трансаминаз у самок с БВ мыши при двух самых высоких дозах (3×10¹⁰ и 1×10¹¹вирусных геномов/на мышь); самая низкая доза 1×10¹⁰вирусных геномов/на мышь значимо снизила уровни трансаминаз, но не смогла прекратить повреждение печени. Однако, лечение тремя различными дозами значимо снизило экскрецию Cu с мочой, достигнув уровней, которые были получены у мышей WT (фигура 9).

Пример 5. Сравнение терапевтического эффекта вирусных векторов AAV2/8-AAT-wtATP7B и AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) у самок мышей с болезнью Вильсона.

Были созданы две экспериментальные группы. Для каждой экспериментальной группы шестинедельных (6w) самок мышей ATP7B-/- делили на 4 группы по 5 мышей в каждой: 3 из групп обрабатывали внутривенно тестируемым вирусным вектором, каждая группа получала различную дозу (соответственно, 1×10¹⁰, 3×10¹⁰ и 1×10¹¹ вирусных геномов/на мышь); четвертую группу оставили нелеченной. Дополнительную группу мышей дикого типа оставляли нелеченной в качестве контрольной группы (WT).

В первой экспериментальной группе (экспериментальная группа 1), мышам с БВ, получавшим лечение, вводили вектор AAV2/8-AAT-wtATP7B; во второй экспериментальной группе (экспериментальная группа 2) им вводили вектор AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486).

Активность церулоплазмина в сыворотке определяли через 4 недели после лечения, а содержание Cu в печени определяли через 24 недели после лечения, при помощи тех же способов, как описано в примере 3.

Активность церулоплазмина в сыворотке

Активность церулоплазмина в сыворотке была скорректирована только при введении самой высокой дозы вектора AAV2/8-AAT-wtATP7B (фигура 10A, экспериментальная группа 1); при введении двух самых низких доз не наблюдали никакого эффекта.

Напротив, вектор AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) значимо повысил уровни церулоплазмина в самой низкой дозе 1×10¹⁰вирусных геномов/на мышь; введение средней дозы вектора нормализовало уровни церулоплазмина, и самая высокая доза увеличила уровни церулоплазмина выше нормальных уровней (фигура 10B, экспериментальная группа 2).

Концентрация Cu в печени

Кроме того, концентрация Cu в печени была снижена, но не нормализовалась при введении двух самых высоких доз AAV2/8-AAT-wtATP7B; и при самой низкой дозе не наблюдали никакого эффекта (фигура 11A, экспериментальная группа 1). Напротив, было показано, что концентрация Cu снизилась после введения вектора AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) во всех исследуемых дозах, и при самой высокой дозе уровни были близки к нормальным (фигура 11B, экспериментальная группа 2).

Таким образом, было показано, что доза 1×10¹⁰вирусных геномов/на мышь вектора AAV2/8-AAT-wtATP7B является «субоптимальной дозой» для нормализации активности церулоплазмина в сыворотке и снижения накопления Cu в печени; в то время как вектор, несущий укороченную форму, неожиданно обеспечил статистически значимые терапевтические эффекты в указанной субоптимальной дозе.

Пример 6. Сравнение терапевтического эффекта вирусных векторов AAV2/8-AAT-wtATP7B и AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) у мышей с БВ

Шестинедельных (6w) самцов мышей ATP7B-/- делили на три группы мышей: 2 группы животных соответственно лечили субоптимальной внутривенной дозой (1×10¹⁰ вирусных геномов/на мышь) вектора AAV2/8-AAT-wtATP7B или вектор AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486); третью группу оставляли нелеченной. Дополнительную группу мышей дикого типа оставляли нелеченной в качестве контрольной группы (WT).

Содержание Cu в печени измеряли тем же способом, как описано в примере 3.

Как показано на фигуре 12, хотя оба вектора AAV2/8-AAT-wtATP7B и AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486), полученные в субоптимальной дозе, снизили накопление меди в печени мышей с БВ, AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) обеспечил снижение содержания меди в печени, которое было значимо больше, чем снижение обеспеченное AAV2/8-AAT-wtATP7B.

Пример 7. Сравнение терапевтического эффекта вирусных векторов AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) и AAV2/8-AAT-coATP7B(d57-486) у мышей с БВ.

Шестинедельных (6w) самцов мышей ATP7B-/- делили на три группы мышей: 2 группы животных соответственно лечили субоптимальной внутривенной дозой (1×10¹⁰ вирусных геномов/на мышь) вектора AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) и AAV2/8-AAT-coATP7B(d57-486), третью группу оставляли не леченной. Дополнительную группу мышей дикого типа оставляли не леченной в качестве контрольной группы (WT).

Содержание Cu в печени измеряли тем же способом, как описано в примере 3.

Как показано на фигуре 13, хотя оба вектора AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) и AAV2/8-AAT-coATP7B(d57-486), полученные в субоптимальной дозе, снизили накопление меди в печени мышей с БВ, AAV2/8-AAT-coATP7B(d57-486) обеспечил снижение содержания меди в печени, которое было значимо больше, чем снижение обеспеченное AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486).

Пример 8. Терапевтический эффект вирусного вектора с оптимизированными кодонами AAV2/8-AAT-coATP7B(d57-486) у мышей с БВ.

Шестинедельных (6w) самцов мышей ATP7B-/- делили на 5 групп мышей: 4 группы животных соответственно лечили субоптимальной внутривенной дозой (1×10¹⁰ вирусных геномов/на мышь) векторов AAV2/8-AAT-wtATP7B, AAV2/8-AAT-coATP7B, AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) или AAV2/8-AAT-coATP7B(d57-486); пятую групп оставляли нелеченной Дополнительную группу мышей дикого типа оставляли нелеченной в качестве контрольной группы (WT).

Активность церулоплазмина в сыворотке измеряли тем же способом, как описано в примере 3.

Как показано на фигуре 14, два вектора, несущих нуклеотидную последовательность укороченного ATP7B-T2, восстановили оксидазную активность церулоплазмина при введении мышам с БВ в субоптимальной дозе, в то время как векторы, несущие нуклеотидные последовательности, кодирующие полный ATP7B человека, не обеспечили никакого значимого улучшения активности церулоплазмина при введении при аналогичных условиях лечения.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> FUNDACION PARA LA INVESTIGACION MEDICA APLICADA

<120> Конструкции нуклеиновой кислоты и векторы для генотерапии для применения для лечения болезни Вильсона и других состояний

<130> 2014005EP00

<160> 21

<170> BiSSAP 1.3

<210> 1

<211> 5107

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Конструкция нуклеиновой кислоты экспрессирующего вектора AAV2-AAT-wtATP7B

<220>

<221> область повторов

<222> 1..141

<223> /примечание="5' ITR из серотипа 2 аденоассоциированного вируса"

<220>

<221> промотор

<222> 156..460

<223> /примечание="альфа 1 антитрипсин"

<220>

<221> CDS

<222> 473..4870

<223> /примечание="последовательность, кодирующая ATP7B (медь-транспортирующую АТФазу 2)"

/таблица трансляции=1

<220>

<221> полиA_сигнал

<222> 4877..4932

<220>

<221> область повторов

<222> 4968..5107

<223> /стандартное название="3' ITR из серотипа 2 аденоассоциированного вируса "

<400> 1

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120

actccatcac taggggttcc tgcggccgca cgcgtcgcca ccccctccac cttggacaca 180

ggacgctgtg gtttctgagc caggtacaat gactcctttc ggtaagtgca gtggaagctg 240

tacactgccc aggcaaagcg tccgggcagc gtaggcgggc gactcagatc ccagccagtg 300

gacttagccc ctgtttgctc ctccgataac tggggtgacc ttggttaata ttcaccagca 360

gcctcccccg ttgcccctct ggatccactg cttaaatacg gacgaggaca gggccctgtc 420

tcctcagctt caggcaccac cactgacctg ggacagtgaa gcggccgcca cc atg cct 478

Met Pro

1

gag cag gag aga cag atc aca gcc aga gaa ggg gcc agt cgg aaa atc 526

Glu Gln Glu Arg Gln Ile Thr Ala Arg Glu Gly Ala Ser Arg Lys Ile

5 10 15

tta tct aag ctt tct ttg cct acc cgt gcc tgg gaa cca gca atg aag 574

Leu Ser Lys Leu Ser Leu Pro Thr Arg Ala Trp Glu Pro Ala Met Lys

20 25 30

aag agt ttt gct ttt gac aat gtt ggc tat gaa ggt ggt ctg gat ggc 622

Lys Ser Phe Ala Phe Asp Asn Val Gly Tyr Glu Gly Gly Leu Asp Gly

35 40 45 50

ctg ggc cct tct tct cag gtg gcc acc agc aca gtc agg atc ttg ggc 670

Leu Gly Pro Ser Ser Gln Val Ala Thr Ser Thr Val Arg Ile Leu Gly

55 60 65

atg act tgc cag tca tgt gtg aag tcc att gag gac agg att tcc aat 718

Met Thr Cys Gln Ser Cys Val Lys Ser Ile Glu Asp Arg Ile Ser Asn

70 75 80

ttg aaa ggc atc atc agc atg aag gtt tcc ctg gaa caa ggc agt gcc 766

Leu Lys Gly Ile Ile Ser Met Lys Val Ser Leu Glu Gln Gly Ser Ala

85 90 95

act gtg aaa tat gtg cca tcg gtt gtg tgc ctg caa cag gtt tgc cat 814

Thr Val Lys Tyr Val Pro Ser Val Val Cys Leu Gln Gln Val Cys His

100 105 110

caa att ggg gac atg ggc ttc gag gcc agc att gca gaa gga aag gca 862

Gln Ile Gly Asp Met Gly Phe Glu Ala Ser Ile Ala Glu Gly Lys Ala

115 120 125 130

gcc tcc tgg ccc tca agg tcc ttg cct gcc cag gag gct gtg gtc aag 910

Ala Ser Trp Pro Ser Arg Ser Leu Pro Ala Gln Glu Ala Val Val Lys

135 140 145

ctc cgg gtg gag ggc atg acc tgc cag tcc tgt gtc agc tcc att gaa 958

Leu Arg Val Glu Gly Met Thr Cys Gln Ser Cys Val Ser Ser Ile Glu

150 155 160

ggc aag gtc cgg aaa ctg caa gga gta gtg aga gtc aaa gtc tca ctc 1006

Gly Lys Val Arg Lys Leu Gln Gly Val Val Arg Val Lys Val Ser Leu

165 170 175

agc aac caa gag gcc gtc atc act tat cag cct tat ctc att cag ccc 1054

Ser Asn Gln Glu Ala Val Ile Thr Tyr Gln Pro Tyr Leu Ile Gln Pro

180 185 190

gaa gac ctc agg gac cat gta aat gac atg gga ttt gaa gct gcc atc 1102

Glu Asp Leu Arg Asp His Val Asn Asp Met Gly Phe Glu Ala Ala Ile

195 200 205 210

aag agc aaa gtg gct ccc tta agc ctg gga cca att gat att gag cgg 1150

Lys Ser Lys Val Ala Pro Leu Ser Leu Gly Pro Ile Asp Ile Glu Arg

215 220 225

tta caa agc act aac cca aag aga cct tta tct tct gct aac cag aat 1198

Leu Gln Ser Thr Asn Pro Lys Arg Pro Leu Ser Ser Ala Asn Gln Asn

230 235 240

ttt aat aat tct gag acc ttg ggg cac caa gga agc cat gtg gtc acc 1246

Phe Asn Asn Ser Glu Thr Leu Gly His Gln Gly Ser His Val Val Thr

245 250 255

ctc caa ctg aga ata gat gga atg cat tgt aag tct tgc gtc ttg aat 1294

Leu Gln Leu Arg Ile Asp Gly Met His Cys Lys Ser Cys Val Leu Asn

260 265 270

att gaa gaa aat att ggc cag ctc cta ggg gtt caa agt att caa gtg 1342

Ile Glu Glu Asn Ile Gly Gln Leu Leu Gly Val Gln Ser Ile Gln Val

275 280 285 290

tcc ttg gag aac aaa act gcc caa gta aag tat gac cct tct tgt acc 1390

Ser Leu Glu Asn Lys Thr Ala Gln Val Lys Tyr Asp Pro Ser Cys Thr

295 300 305

agc cca gtg gct ctg cag agg gct atc gag gca ctt cca cct ggg aat 1438

Ser Pro Val Ala Leu Gln Arg Ala Ile Glu Ala Leu Pro Pro Gly Asn

310 315 320

ttt aaa gtt tct ctt cct gat gga gcc gaa ggg agt ggg aca gat cac 1486

Phe Lys Val Ser Leu Pro Asp Gly Ala Glu Gly Ser Gly Thr Asp His

325 330 335

agg tct tcc agt tct cat tcc cct ggc tcc cca ccg aga aac cag gtc 1534

Arg Ser Ser Ser Ser His Ser Pro Gly Ser Pro Pro Arg Asn Gln Val

340 345 350

cag ggc aca tgc agt acc act ctg att gcc att gcc ggc atg acc tgt 1582

Gln Gly Thr Cys Ser Thr Thr Leu Ile Ala Ile Ala Gly Met Thr Cys

355 360 365 370

gca tcc tgt gtc cat tcc att gaa ggc atg atc tcc caa ctg gaa ggg 1630

Ala Ser Cys Val His Ser Ile Glu Gly Met Ile Ser Gln Leu Glu Gly

375 380 385

gtg cag caa ata tcg gtg tct ttg gcc gaa ggg act gca aca gtt ctt 1678

Val Gln Gln Ile Ser Val Ser Leu Ala Glu Gly Thr Ala Thr Val Leu

390 395 400

tat aat ccc tct gta att agc cca gaa gaa ctc aga gct gct ata gaa 1726

Tyr Asn Pro Ser Val Ile Ser Pro Glu Glu Leu Arg Ala Ala Ile Glu

405 410 415

gac atg gga ttt gag gct tca gtc gtt tct gaa agc tgt tct act aac 1774

Asp Met Gly Phe Glu Ala Ser Val Val Ser Glu Ser Cys Ser Thr Asn

420 425 430

cct ctt gga aac cac agt gct ggg aat tcc atg gtg caa act aca gat 1822

Pro Leu Gly Asn His Ser Ala Gly Asn Ser Met Val Gln Thr Thr Asp

435 440 445 450

ggt aca cct aca tct gtg cag gaa gtg gct ccc cac act ggg agg ctc 1870

Gly Thr Pro Thr Ser Val Gln Glu Val Ala Pro His Thr Gly Arg Leu

455 460 465

cct gca aac cat gcc ccg gac atc ttg gca aag tcc cca caa tca acc 1918

Pro Ala Asn His Ala Pro Asp Ile Leu Ala Lys Ser Pro Gln Ser Thr

470 475 480

aga gca gtg gca ccg cag aag tgc ttc tta cag atc aaa ggc atg acc 1966

Arg Ala Val Ala Pro Gln Lys Cys Phe Leu Gln Ile Lys Gly Met Thr

485 490 495

tgt gca tcc tgt gtg tct aac ata gaa agg aat ctg cag aaa gaa gct 2014

Cys Ala Ser Cys Val Ser Asn Ile Glu Arg Asn Leu Gln Lys Glu Ala

500 505 510

ggt gtt ctc tcc gtg ttg gtt gcc ttg atg gca gga aag gca gag atc 2062

Gly Val Leu Ser Val Leu Val Ala Leu Met Ala Gly Lys Ala Glu Ile

515 520 525 530

aag tat gac cca gag gtc atc cag ccc ctc gag ata gct cag ttc atc 2110

Lys Tyr Asp Pro Glu Val Ile Gln Pro Leu Glu Ile Ala Gln Phe Ile

535 540 545

cag gac ctg ggt ttt gag gca gca gtc atg gag gac tac gca ggc tcc 2158

Gln Asp Leu Gly Phe Glu Ala Ala Val Met Glu Asp Tyr Ala Gly Ser

550 555 560

gat ggc aac att gag ctg aca atc aca ggg atg acc tgc gcg tcc tgt 2206

Asp Gly Asn Ile Glu Leu Thr Ile Thr Gly Met Thr Cys Ala Ser Cys

565 570 575

gtc cac aac ata gag tcc aaa ctc acg agg aca aat ggc atc act tat 2254

Val His Asn Ile Glu Ser Lys Leu Thr Arg Thr Asn Gly Ile Thr Tyr

580 585 590

gcc tcc gtt gcc ctt gcc acc agc aaa gcc ctt gtt aag ttt gac ccg 2302

Ala Ser Val Ala Leu Ala Thr Ser Lys Ala Leu Val Lys Phe Asp Pro

595 600 605 610

gaa att atc ggt cca cgg gat att atc aaa att att gag gaa att ggc 2350

Glu Ile Ile Gly Pro Arg Asp Ile Ile Lys Ile Ile Glu Glu Ile Gly

615 620 625

ttt cat gct tcc ctg gcc cag aga aac ccc aac gct cat cac ttg gac 2398

Phe His Ala Ser Leu Ala Gln Arg Asn Pro Asn Ala His His Leu Asp

630 635 640

cac aag atg gaa ata aag cag tgg aag aag tct ttc ctg tgc agc ctg 2446

His Lys Met Glu Ile Lys Gln Trp Lys Lys Ser Phe Leu Cys Ser Leu

645 650 655

gtg ttt ggc atc cct gtc atg gcc tta atg atc tat atg ctg ata ccc 2494

Val Phe Gly Ile Pro Val Met Ala Leu Met Ile Tyr Met Leu Ile Pro

660 665 670

agc aac gag ccc cac cag tcc atg gtc ctg gac cac aac atc att cca 2542

Ser Asn Glu Pro His Gln Ser Met Val Leu Asp His Asn Ile Ile Pro

675 680 685 690

gga ctg tcc att cta aat ctc atc ttc ttt atc ttg tgt acc ttt gtc 2590

Gly Leu Ser Ile Leu Asn Leu Ile Phe Phe Ile Leu Cys Thr Phe Val

695 700 705

cag ctc ctc ggt ggg tgg tac ttc tac gtt cag gcc tac aaa tct ctg 2638

Gln Leu Leu Gly Gly Trp Tyr Phe Tyr Val Gln Ala Tyr Lys Ser Leu

710 715 720

aga cac agg tca gcc aac atg gac gtg ctc atc gtc ctg gcc aca agc 2686

Arg His Arg Ser Ala Asn Met Asp Val Leu Ile Val Leu Ala Thr Ser

725 730 735

att gct tat gtt tat tct ctg gtc atc ctg gtg gtt gct gtg gct gag 2734

Ile Ala Tyr Val Tyr Ser Leu Val Ile Leu Val Val Ala Val Ala Glu

740 745 750

aag gcg gag agg agc cct gtg aca ttc ttc gac acg ccc ccc atg ctc 2782

Lys Ala Glu Arg Ser Pro Val Thr Phe Phe Asp Thr Pro Pro Met Leu

755 760 765 770

ttt gtg ttc att gcc ctg ggc cgg tgg ctg gaa cac ttg gca aag agc 2830

Phe Val Phe Ile Ala Leu Gly Arg Trp Leu Glu His Leu Ala Lys Ser

775 780 785

aaa acc tca gaa gcc ctg gct aaa ctc atg tct ctc caa gcc aca gaa 2878

Lys Thr Ser Glu Ala Leu Ala Lys Leu Met Ser Leu Gln Ala Thr Glu

790 795 800

gcc acc gtt gtg acc ctt ggt gag gac aat tta atc atc agg gag gag 2926

Ala Thr Val Val Thr Leu Gly Glu Asp Asn Leu Ile Ile Arg Glu Glu

805 810 815

caa gtc ccc atg gag ctg gtg cag cgg ggc gat atc gtc aag gtg gtc 2974

Gln Val Pro Met Glu Leu Val Gln Arg Gly Asp Ile Val Lys Val Val

820 825 830

cct ggg gga aag ttt cca gtg gat ggg aaa gtc ctg gaa ggc aat acc 3022

Pro Gly Gly Lys Phe Pro Val Asp Gly Lys Val Leu Glu Gly Asn Thr

835 840 845 850

atg gct gat gag tcc ctc atc aca gga gaa gcc atg cca gtc act aag 3070

Met Ala Asp Glu Ser Leu Ile Thr Gly Glu Ala Met Pro Val Thr Lys

855 860 865

aaa ccc gga agc act gta att gcg ggg tct ata aat gca cat ggc tct 3118

Lys Pro Gly Ser Thr Val Ile Ala Gly Ser Ile Asn Ala His Gly Ser

870 875 880

gtg ctc att aaa gct acc cac gtg ggc aat gac acc act ttg gct cag 3166

Val Leu Ile Lys Ala Thr His Val Gly Asn Asp Thr Thr Leu Ala Gln

885 890 895

att gtg aaa ctg gtg gaa gag gct cag atg tca aag gca ccc att cag 3214

Ile Val Lys Leu Val Glu Glu Ala Gln Met Ser Lys Ala Pro Ile Gln

900 905 910

cag ctg gct gac cgg ttt agt gga tat ttt gtc cca ttt atc atc atc 3262

Gln Leu Ala Asp Arg Phe Ser Gly Tyr Phe Val Pro Phe Ile Ile Ile

915 920 925 930

atg tca act ttg acg ttg gtg gta tgg att gta atc ggt ttt atc gat 3310

Met Ser Thr Leu Thr Leu Val Val Trp Ile Val Ile Gly Phe Ile Asp

935 940 945

ttt ggt gtt gtt cag aga tac ttt cct aac ccc aac aag cac atc tcc 3358

Phe Gly Val Val Gln Arg Tyr Phe Pro Asn Pro Asn Lys His Ile Ser

950 955 960

cag aca gag gtg atc atc cgg ttt gct ttc cag acg tcc atc acg gtg 3406

Gln Thr Glu Val Ile Ile Arg Phe Ala Phe Gln Thr Ser Ile Thr Val

965 970 975

ctg tgc att gcc tgc ccc tgc tcc ctg ggg ctg gcc acg ccc acg gct 3454

Leu Cys Ile Ala Cys Pro Cys Ser Leu Gly Leu Ala Thr Pro Thr Ala

980 985 990

gtc atg gtg ggc acc ggg gtg gcc gcg cag aac ggc atc ctc atc aag 3502

Val Met Val Gly Thr Gly Val Ala Ala Gln Asn Gly Ile Leu Ile Lys

995 1000 1005 1010

gga ggc aag ccc ctg gag atg gcg cac aag ata aag act gtg atg ttt 3550

Gly Gly Lys Pro Leu Glu Met Ala His Lys Ile Lys Thr Val Met Phe

1015 1020 1025

gac aag act ggc acc att acc cat ggc gtc ccc agg gtc atg cgg gtg 3598

Asp Lys Thr Gly Thr Ile Thr His Gly Val Pro Arg Val Met Arg Val

1030 1035 1040

ctc ctg ctg ggg gat gtg gcc aca ctg ccc ctc agg aag gtt ctg gct 3646

Leu Leu Leu Gly Asp Val Ala Thr Leu Pro Leu Arg Lys Val Leu Ala

1045 1050 1055

gtg gtg ggg act gcg gag gcc agc agt gaa cac ccc ttg ggc gtg gca 3694

Val Val Gly Thr Ala Glu Ala Ser Ser Glu His Pro Leu Gly Val Ala

1060 1065 1070

gtc acc aaa tac tgt aaa gag gaa ctt gga aca gag acc ttg gga tac 3742

Val Thr Lys Tyr Cys Lys Glu Glu Leu Gly Thr Glu Thr Leu Gly Tyr

1075 1080 1085 1090

tgc acg gac ttc cag gca gtg cca ggc tgt gga att ggg tgc aaa gtc 3790

Cys Thr Asp Phe Gln Ala Val Pro Gly Cys Gly Ile Gly Cys Lys Val

1095 1100 1105

agc aac gtg gaa ggc atc ctg gcc cac agt gag cgc cct ttg agt gca 3838

Ser Asn Val Glu Gly Ile Leu Ala His Ser Glu Arg Pro Leu Ser Ala

1110 1115 1120

ccg gcc agt cac ctg aat gag gct ggc agc ctt ccc gca gaa aaa gat 3886

Pro Ala Ser His Leu Asn Glu Ala Gly Ser Leu Pro Ala Glu Lys Asp

1125 1130 1135

gca gtc ccc cag acc ttc tct gtg ctg att gga aac cgt gag tgg ctg 3934

Ala Val Pro Gln Thr Phe Ser Val Leu Ile Gly Asn Arg Glu Trp Leu

1140 1145 1150

agg cgc aac ggt tta acc att tct agc gat gtc agt gac gct atg aca 3982

Arg Arg Asn Gly Leu Thr Ile Ser Ser Asp Val Ser Asp Ala Met Thr

1155 1160 1165 1170

gac cac gag atg aaa gga cag aca gcc atc ctg gtg gct att gac ggt 4030

Asp His Glu Met Lys Gly Gln Thr Ala Ile Leu Val Ala Ile Asp Gly

1175 1180 1185

gtg ctc tgt ggg atg atc gca atc gca gac gct gtc aag cag gag gct 4078

Val Leu Cys Gly Met Ile Ala Ile Ala Asp Ala Val Lys Gln Glu Ala

1190 1195 1200

gcc ctg gct gtg cac acg ctg cag agc atg ggt gtg gac gtg gtt ctg 4126

Ala Leu Ala Val His Thr Leu Gln Ser Met Gly Val Asp Val Val Leu

1205 1210 1215

atc acg ggg gac aac cgg aag aca gcc aga gct att gcc acc cag gtt 4174

Ile Thr Gly Asp Asn Arg Lys Thr Ala Arg Ala Ile Ala Thr Gln Val

1220 1225 1230

ggc atc aac aaa gtc ttt gca gag gtg ctg cct tcg cac aag gtg gcc 4222

Gly Ile Asn Lys Val Phe Ala Glu Val Leu Pro Ser His Lys Val Ala

1235 1240 1245 1250

aag gtc cag gag ctc cag aat aaa ggg aag aaa gtc gcc atg gtg ggg 4270

Lys Val Gln Glu Leu Gln Asn Lys Gly Lys Lys Val Ala Met Val Gly

1255 1260 1265

gat ggg gtc aat gac tcc ccg gcc ttg gcc cag gca gac atg ggt gtg 4318

Asp Gly Val Asn Asp Ser Pro Ala Leu Ala Gln Ala Asp Met Gly Val

1270 1275 1280

gcc att ggc acc ggc acg gat gtg gcc atc gag gca gcc gac gtc gtc 4366

Ala Ile Gly Thr Gly Thr Asp Val Ala Ile Glu Ala Ala Asp Val Val

1285 1290 1295

ctt atc aga aat gat ttg ctg gat gtg gtg gct agc att cac ctt tcc 4414

Leu Ile Arg Asn Asp Leu Leu Asp Val Val Ala Ser Ile His Leu Ser

1300 1305 1310

aag agg act gtc cga agg ata cgc atc aac ctg gtc ctg gca ctg att 4462

Lys Arg Thr Val Arg Arg Ile Arg Ile Asn Leu Val Leu Ala Leu Ile

1315 1320 1325 1330

tat aac ctg gtt ggg ata ccc att gca gca ggt gtc ttc atg ccc atc 4510

Tyr Asn Leu Val Gly Ile Pro Ile Ala Ala Gly Val Phe Met Pro Ile

1335 1340 1345

ggc att gtg ctg cag ccc tgg atg ggc tca gcg gcc atg gca gcc tcc 4558

Gly Ile Val Leu Gln Pro Trp Met Gly Ser Ala Ala Met Ala Ala Ser

1350 1355 1360

tct gtg tct gtg gtg ctc tca tcc ctg cag ctc aag tgc tat aag aag 4606

Ser Val Ser Val Val Leu Ser Ser Leu Gln Leu Lys Cys Tyr Lys Lys

1365 1370 1375

cct gac ctg gag agg tat gag gca cag gcg cat ggc cac atg aag ccc 4654

Pro Asp Leu Glu Arg Tyr Glu Ala Gln Ala His Gly His Met Lys Pro

1380 1385 1390

ctg acg gca tcc cag gtc agt gtg cac ata ggc atg gat gac agg tgg 4702

Leu Thr Ala Ser Gln Val Ser Val His Ile Gly Met Asp Asp Arg Trp

1395 1400 1405 1410

cgg gac tcc ccc agg gcc aca cca tgg gac cag gtc agc tat gtc agc 4750

Arg Asp Ser Pro Arg Ala Thr Pro Trp Asp Gln Val Ser Tyr Val Ser

1415 1420 1425

cag gtg tcg ctg tcc tcc ctg acg tcc gac aag cca tct cgg cac agc 4798

Gln Val Ser Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Lys Pro Ser Arg His Ser

1430 1435 1440

gct gca gca gac gat gat ggg gac aag tgg tct ctg ctc ctg aat ggc 4846

Ala Ala Ala Asp Asp Asp Gly Asp Lys Trp Ser Leu Leu Leu Asn Gly

1445 1450 1455

agg gat gag gag cag tac atc tga ggtaccaata aagacctctt attttcattc 4900

Arg Asp Glu Glu Gln Tyr Ile

1460 1465

atcaggtgtg gttggttttt ttgtgtgggg gcggatccat cggatcccgt gcggaccgag 4960

cggccgcagg aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc 5020

actgaggccg ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct ttgcccgggc ggcctcagtg 5080

agcgagcgag cgcgcagctg cctgcag 5107

<210> 2

<211> 1465

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> [CDS]:473..4870 из SEQ ID NO 1

<400> 2

Met Pro Glu Gln Glu Arg Gln Ile Thr Ala Arg Glu Gly Ala Ser Arg

1 5 10 15

Lys Ile Leu Ser Lys Leu Ser Leu Pro Thr Arg Ala Trp Glu Pro Ala

20 25 30

Met Lys Lys Ser Phe Ala Phe Asp Asn Val Gly Tyr Glu Gly Gly Leu

35 40 45

Asp Gly Leu Gly Pro Ser Ser Gln Val Ala Thr Ser Thr Val Arg Ile

50 55 60

Leu Gly Met Thr Cys Gln Ser Cys Val Lys Ser Ile Glu Asp Arg Ile

65 70 75 80

Ser Asn Leu Lys Gly Ile Ile Ser Met Lys Val Ser Leu Glu Gln Gly

85 90 95

Ser Ala Thr Val Lys Tyr Val Pro Ser Val Val Cys Leu Gln Gln Val

100 105 110

Cys His Gln Ile Gly Asp Met Gly Phe Glu Ala Ser Ile Ala Glu Gly

115 120 125

Lys Ala Ala Ser Trp Pro Ser Arg Ser Leu Pro Ala Gln Glu Ala Val

130 135 140

Val Lys Leu Arg Val Glu Gly Met Thr Cys Gln Ser Cys Val Ser Ser

145 150 155 160

Ile Glu Gly Lys Val Arg Lys Leu Gln Gly Val Val Arg Val Lys Val

165 170 175

Ser Leu Ser Asn Gln Glu Ala Val Ile Thr Tyr Gln Pro Tyr Leu Ile

180 185 190

Gln Pro Glu Asp Leu Arg Asp His Val Asn Asp Met Gly Phe Glu Ala

195 200 205

Ala Ile Lys Ser Lys Val Ala Pro Leu Ser Leu Gly Pro Ile Asp Ile

210 215 220

Glu Arg Leu Gln Ser Thr Asn Pro Lys Arg Pro Leu Ser Ser Ala Asn

225 230 235 240

Gln Asn Phe Asn Asn Ser Glu Thr Leu Gly His Gln Gly Ser His Val

245 250 255

Val Thr Leu Gln Leu Arg Ile Asp Gly Met His Cys Lys Ser Cys Val

260 265 270

Leu Asn Ile Glu Glu Asn Ile Gly Gln Leu Leu Gly Val Gln Ser Ile

275 280 285

Gln Val Ser Leu Glu Asn Lys Thr Ala Gln Val Lys Tyr Asp Pro Ser

290 295 300

Cys Thr Ser Pro Val Ala Leu Gln Arg Ala Ile Glu Ala Leu Pro Pro

305 310 315 320

Gly Asn Phe Lys Val Ser Leu Pro Asp Gly Ala Glu Gly Ser Gly Thr

325 330 335

Asp His Arg Ser Ser Ser Ser His Ser Pro Gly Ser Pro Pro Arg Asn

340 345 350

Gln Val Gln Gly Thr Cys Ser Thr Thr Leu Ile Ala Ile Ala Gly Met

355 360 365

Thr Cys Ala Ser Cys Val His Ser Ile Glu Gly Met Ile Ser Gln Leu

370 375 380

Glu Gly Val Gln Gln Ile Ser Val Ser Leu Ala Glu Gly Thr Ala Thr

385 390 395 400

Val Leu Tyr Asn Pro Ser Val Ile Ser Pro Glu Glu Leu Arg Ala Ala

405 410 415

Ile Glu Asp Met Gly Phe Glu Ala Ser Val Val Ser Glu Ser Cys Ser

420 425 430

Thr Asn Pro Leu Gly Asn His Ser Ala Gly Asn Ser Met Val Gln Thr

435 440 445

Thr Asp Gly Thr Pro Thr Ser Val Gln Glu Val Ala Pro His Thr Gly

450 455 460

Arg Leu Pro Ala Asn His Ala Pro Asp Ile Leu Ala Lys Ser Pro Gln

465 470 475 480

Ser Thr Arg Ala Val Ala Pro Gln Lys Cys Phe Leu Gln Ile Lys Gly

485 490 495

Met Thr Cys Ala Ser Cys Val Ser Asn Ile Glu Arg Asn Leu Gln Lys

500 505 510

Glu Ala Gly Val Leu Ser Val Leu Val Ala Leu Met Ala Gly Lys Ala

515 520 525

Glu Ile Lys Tyr Asp Pro Glu Val Ile Gln Pro Leu Glu Ile Ala Gln

530 535 540

Phe Ile Gln Asp Leu Gly Phe Glu Ala Ala Val Met Glu Asp Tyr Ala

545 550 555 560

Gly Ser Asp Gly Asn Ile Glu Leu Thr Ile Thr Gly Met Thr Cys Ala

565 570 575

Ser Cys Val His Asn Ile Glu Ser Lys Leu Thr Arg Thr Asn Gly Ile

580 585 590

Thr Tyr Ala Ser Val Ala Leu Ala Thr Ser Lys Ala Leu Val Lys Phe

595 600 605

Asp Pro Glu Ile Ile Gly Pro Arg Asp Ile Ile Lys Ile Ile Glu Glu

610 615 620

Ile Gly Phe His Ala Ser Leu Ala Gln Arg Asn Pro Asn Ala His His

625 630 635 640

Leu Asp His Lys Met Glu Ile Lys Gln Trp Lys Lys Ser Phe Leu Cys

645 650 655

Ser Leu Val Phe Gly Ile Pro Val Met Ala Leu Met Ile Tyr Met Leu

660 665 670

Ile Pro Ser Asn Glu Pro His Gln Ser Met Val Leu Asp His Asn Ile

675 680 685

Ile Pro Gly Leu Ser Ile Leu Asn Leu Ile Phe Phe Ile Leu Cys Thr

690 695 700

Phe Val Gln Leu Leu Gly Gly Trp Tyr Phe Tyr Val Gln Ala Tyr Lys

705 710 715 720

Ser Leu Arg His Arg Ser Ala Asn Met Asp Val Leu Ile Val Leu Ala

725 730 735

Thr Ser Ile Ala Tyr Val Tyr Ser Leu Val Ile Leu Val Val Ala Val

740 745 750

Ala Glu Lys Ala Glu Arg Ser Pro Val Thr Phe Phe Asp Thr Pro Pro

755 760 765

Met Leu Phe Val Phe Ile Ala Leu Gly Arg Trp Leu Glu His Leu Ala

770 775 780

Lys Ser Lys Thr Ser Glu Ala Leu Ala Lys Leu Met Ser Leu Gln Ala

785 790 795 800

Thr Glu Ala Thr Val Val Thr Leu Gly Glu Asp Asn Leu Ile Ile Arg

805 810 815

Glu Glu Gln Val Pro Met Glu Leu Val Gln Arg Gly Asp Ile Val Lys

820 825 830

Val Val Pro Gly Gly Lys Phe Pro Val Asp Gly Lys Val Leu Glu Gly

835 840 845

Asn Thr Met Ala Asp Glu Ser Leu Ile Thr Gly Glu Ala Met Pro Val

850 855 860

Thr Lys Lys Pro Gly Ser Thr Val Ile Ala Gly Ser Ile Asn Ala His

865 870 875 880

Gly Ser Val Leu Ile Lys Ala Thr His Val Gly Asn Asp Thr Thr Leu

885 890 895

Ala Gln Ile Val Lys Leu Val Glu Glu Ala Gln Met Ser Lys Ala Pro

900 905 910

Ile Gln Gln Leu Ala Asp Arg Phe Ser Gly Tyr Phe Val Pro Phe Ile

915 920 925

Ile Ile Met Ser Thr Leu Thr Leu Val Val Trp Ile Val Ile Gly Phe

930 935 940

Ile Asp Phe Gly Val Val Gln Arg Tyr Phe Pro Asn Pro Asn Lys His

945 950 955 960

Ile Ser Gln Thr Glu Val Ile Ile Arg Phe Ala Phe Gln Thr Ser Ile

965 970 975

Thr Val Leu Cys Ile Ala Cys Pro Cys Ser Leu Gly Leu Ala Thr Pro

980 985 990

Thr Ala Val Met Val Gly Thr Gly Val Ala Ala Gln Asn Gly Ile Leu

995 1000 1005

Ile Lys Gly Gly Lys Pro Leu Glu Met Ala His Lys Ile Lys Thr Val

1010 1015 1020

Met Phe Asp Lys Thr Gly Thr Ile Thr His Gly Val Pro Arg Val Met

1025 1030 1035 1040

Arg Val Leu Leu Leu Gly Asp Val Ala Thr Leu Pro Leu Arg Lys Val

1045 1050 1055

Leu Ala Val Val Gly Thr Ala Glu Ala Ser Ser Glu His Pro Leu Gly

1060 1065 1070

Val Ala Val Thr Lys Tyr Cys Lys Glu Glu Leu Gly Thr Glu Thr Leu

1075 1080 1085

Gly Tyr Cys Thr Asp Phe Gln Ala Val Pro Gly Cys Gly Ile Gly Cys

1090 1095 1100

Lys Val Ser Asn Val Glu Gly Ile Leu Ala His Ser Glu Arg Pro Leu

1105 1110 1115 1120

Ser Ala Pro Ala Ser His Leu Asn Glu Ala Gly Ser Leu Pro Ala Glu

1125 1130 1135

Lys Asp Ala Val Pro Gln Thr Phe Ser Val Leu Ile Gly Asn Arg Glu

1140 1145 1150

Trp Leu Arg Arg Asn Gly Leu Thr Ile Ser Ser Asp Val Ser Asp Ala

1155 1160 1165

Met Thr Asp His Glu Met Lys Gly Gln Thr Ala Ile Leu Val Ala Ile

1170 1175 1180

Asp Gly Val Leu Cys Gly Met Ile Ala Ile Ala Asp Ala Val Lys Gln

1185 1190 1195 1200

Glu Ala Ala Leu Ala Val His Thr Leu Gln Ser Met Gly Val Asp Val

1205 1210 1215

Val Leu Ile Thr Gly Asp Asn Arg Lys Thr Ala Arg Ala Ile Ala Thr

1220 1225 1230

Gln Val Gly Ile Asn Lys Val Phe Ala Glu Val Leu Pro Ser His Lys

1235 1240 1245

Val Ala Lys Val Gln Glu Leu Gln Asn Lys Gly Lys Lys Val Ala Met

1250 1255 1260

Val Gly Asp Gly Val Asn Asp Ser Pro Ala Leu Ala Gln Ala Asp Met

1265 1270 1275 1280

Gly Val Ala Ile Gly Thr Gly Thr Asp Val Ala Ile Glu Ala Ala Asp

1285 1290 1295

Val Val Leu Ile Arg Asn Asp Leu Leu Asp Val Val Ala Ser Ile His

1300 1305 1310

Leu Ser Lys Arg Thr Val Arg Arg Ile Arg Ile Asn Leu Val Leu Ala

1315 1320 1325

Leu Ile Tyr Asn Leu Val Gly Ile Pro Ile Ala Ala Gly Val Phe Met

1330 1335 1340

Pro Ile Gly Ile Val Leu Gln Pro Trp Met Gly Ser Ala Ala Met Ala

1345 1350 1355 1360

Ala Ser Ser Val Ser Val Val Leu Ser Ser Leu Gln Leu Lys Cys Tyr

1365 1370 1375

Lys Lys Pro Asp Leu Glu Arg Tyr Glu Ala Gln Ala His Gly His Met

1380 1385 1390

Lys Pro Leu Thr Ala Ser Gln Val Ser Val His Ile Gly Met Asp Asp

1395 1400 1405

Arg Trp Arg Asp Ser Pro Arg Ala Thr Pro Trp Asp Gln Val Ser Tyr

1410 1415 1420

Val Ser Gln Val Ser Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Lys Pro Ser Arg

1425 1430 1435 1440

His Ser Ala Ala Ala Asp Asp Asp Gly Asp Lys Trp Ser Leu Leu Leu

1445 1450 1455

Asn Gly Arg Asp Glu Glu Gln Tyr Ile

1460 1465

<210> 3

<211> 5107

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Конструкция нуклеиновой кислоты экспрессирующего вектора AAV2-AAT-coATP7B

<220>

<221> область повторов

<222> 1..141

<223> /примечание="5' ITR из серотипа 2 аденоассоциированного вируса "

<220>

<221> промотор

<222> 156..460

<223> /примечание="альфа 1 антитрипсин"

<220>

<221> CDS

<222> 473..4870

<223> /примечание="последовательность с оптимизированными кодонами, кодирующая ATP7B"

/таблица трансляции=1

<220>

<221> поли A_сигнал

<222> 4877..4932

<220>

<221> область повторов

<222> 4968..5107

<223> /примечание="3' ITR из серотипа 2 аденоассоциированного вируса"

<400> 3

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120

actccatcac taggggttcc tgcggccgca cgcgtcgcca ccccctccac cttggacaca 180

ggacgctgtg gtttctgagc caggtacaat gactcctttc ggtaagtgca gtggaagctg 240

tacactgccc aggcaaagcg tccgggcagc gtaggcgggc gactcagatc ccagccagtg 300

gacttagccc ctgtttgctc ctccgataac tggggtgacc ttggttaata ttcaccagca 360

gcctcccccg ttgcccctct ggatccactg cttaaatacg gacgaggaca gggccctgtc 420

tcctcagctt caggcaccac cactgacctg ggacagtgaa gcggccgcca cc atg cca 478

Met Pro

1

gaa cag gaa cgc cag atc aca gca aga gag gga gca agt cgg aaa atc 526

Glu Gln Glu Arg Gln Ile Thr Ala Arg Glu Gly Ala Ser Arg Lys Ile

5 10 15

ctg agc aaa ctg agc ctg cca acc aga gca tgg gaa ccc gca atg aag 574

Leu Ser Lys Leu Ser Leu Pro Thr Arg Ala Trp Glu Pro Ala Met Lys

20 25 30

aaa agc ttc gcc ttt gac aac gtg gga tac gag gga ggg ctg gat gga 622

Lys Ser Phe Ala Phe Asp Asn Val Gly Tyr Glu Gly Gly Leu Asp Gly

35 40 45 50

ctg gga cct agc tcc cag gtg gcc acc tct aca gtc cga atc ctg ggc 670

Leu Gly Pro Ser Ser Gln Val Ala Thr Ser Thr Val Arg Ile Leu Gly

55 60 65

atg act tgc cag agt tgc gtg aaa tca att gaa gac cgg atc agt aat 718

Met Thr Cys Gln Ser Cys Val Lys Ser Ile Glu Asp Arg Ile Ser Asn

70 75 80

ctg aag gga atc att agc atg aaa gtg tcc ctg gag cag ggc tca gcc 766

Leu Lys Gly Ile Ile Ser Met Lys Val Ser Leu Glu Gln Gly Ser Ala

85 90 95

acc gtg aag tat gtc cct agc gtg gtc tgc ctg cag cag gtg tgc cac 814

Thr Val Lys Tyr Val Pro Ser Val Val Cys Leu Gln Gln Val Cys His

100 105 110

cag atc ggc gat atg ggg ttc gag gcc tcc att gct gaa ggg aaa gcc 862

Gln Ile Gly Asp Met Gly Phe Glu Ala Ser Ile Ala Glu Gly Lys Ala

115 120 125 130

gct tct tgg cct agc cgg tcc ctg cca gca cag gaa gca gtg gtc aag 910

Ala Ser Trp Pro Ser Arg Ser Leu Pro Ala Gln Glu Ala Val Val Lys

135 140 145

ctg aga gtg gag gga atg aca tgc cag agc tgc gtg agc agt atc gaa 958

Leu Arg Val Glu Gly Met Thr Cys Gln Ser Cys Val Ser Ser Ile Glu

150 155 160

gga aag gtc cga aaa ctg cag ggc gtg gtc cgg gtg aag gtc tct ctg 1006

Gly Lys Val Arg Lys Leu Gln Gly Val Val Arg Val Lys Val Ser Leu

165 170 175

agt aac cag gag gcc gtg att acc tac cag ccc tat ctg atc cag cct 1054

Ser Asn Gln Glu Ala Val Ile Thr Tyr Gln Pro Tyr Leu Ile Gln Pro

180 185 190

gaa gac ctg agg gat cac gtg aat gac atg ggc ttc gag gca gcc atc 1102

Glu Asp Leu Arg Asp His Val Asn Asp Met Gly Phe Glu Ala Ala Ile

195 200 205 210

aag tcc aaa gtg gcc cca ctg tct ctg ggg ccc att gat atc gaa aga 1150

Lys Ser Lys Val Ala Pro Leu Ser Leu Gly Pro Ile Asp Ile Glu Arg

215 220 225

ctg cag tcc acc aac cca aag agg ccc ctg tca agc gcc aac cag aac 1198

Leu Gln Ser Thr Asn Pro Lys Arg Pro Leu Ser Ser Ala Asn Gln Asn

230 235 240

ttc aac aat agt gag acc ctg gga cac cag ggc tca cat gtg gtc aca 1246

Phe Asn Asn Ser Glu Thr Leu Gly His Gln Gly Ser His Val Val Thr

245 250 255

ctg cag ctg agg att gac ggc atg cac tgc aag tct tgc gtg ctg aac 1294

Leu Gln Leu Arg Ile Asp Gly Met His Cys Lys Ser Cys Val Leu Asn

260 265 270

att gag gaa aat atc ggc cag ctg ctg ggg gtg cag tct atc cag gtc 1342

Ile Glu Glu Asn Ile Gly Gln Leu Leu Gly Val Gln Ser Ile Gln Val

275 280 285 290

agt ctg gag aac aag act gct cag gtg aaa tac gat cct tca tgc acc 1390

Ser Leu Glu Asn Lys Thr Ala Gln Val Lys Tyr Asp Pro Ser Cys Thr

295 300 305

agc cca gtg gca ctg cag cgc gct atc gaa gca ctg ccc cct gga aat 1438

Ser Pro Val Ala Leu Gln Arg Ala Ile Glu Ala Leu Pro Pro Gly Asn

310 315 320

ttc aag gtg agc ctg cct gac gga gca gag gga tcc gga acc gat cac 1486

Phe Lys Val Ser Leu Pro Asp Gly Ala Glu Gly Ser Gly Thr Asp His

325 330 335

agg tcc tct agt tca cat tcc cca ggg tct cca cca cga aac cag gtg 1534

Arg Ser Ser Ser Ser His Ser Pro Gly Ser Pro Pro Arg Asn Gln Val

340 345 350

cag gga aca tgt tcc acc aca ctg att gca atc gcc ggc atg act tgc 1582

Gln Gly Thr Cys Ser Thr Thr Leu Ile Ala Ile Ala Gly Met Thr Cys

355 360 365 370

gcc tca tgc gtg cac agc att gaa ggg atg atc tct cag ctg gag gga 1630

Ala Ser Cys Val His Ser Ile Glu Gly Met Ile Ser Gln Leu Glu Gly

375 380 385

gtg cag cag atc tca gtc agc ctg gcc gag ggc act gct acc gtg ctg 1678

Val Gln Gln Ile Ser Val Ser Leu Ala Glu Gly Thr Ala Thr Val Leu

390 395 400

tac aat ccc agt gtc atc tca cct gag gaa ctg cgg gct gca att gag 1726

Tyr Asn Pro Ser Val Ile Ser Pro Glu Glu Leu Arg Ala Ala Ile Glu

405 410 415

gac atg ggg ttc gaa gct tcc gtg gtc tcc gaa tct tgc agt acc aac 1774

Asp Met Gly Phe Glu Ala Ser Val Val Ser Glu Ser Cys Ser Thr Asn

420 425 430

ccc ctg ggg aat cat tcc gcc gga aac tct atg gtg cag act acc gac 1822

Pro Leu Gly Asn His Ser Ala Gly Asn Ser Met Val Gln Thr Thr Asp

435 440 445 450

ggg aca cct act tct gtg cag gag gtc gca cca cac aca gga cgc ctg 1870

Gly Thr Pro Thr Ser Val Gln Glu Val Ala Pro His Thr Gly Arg Leu

455 460 465

cca gcc aat cat gct ccc gat atc ctg gcc aaa agc ccc cag tcc act 1918

Pro Ala Asn His Ala Pro Asp Ile Leu Ala Lys Ser Pro Gln Ser Thr

470 475 480

cga gct gtg gca cct cag aag tgt ttt ctg cag atc aaa ggc atg acc 1966

Arg Ala Val Ala Pro Gln Lys Cys Phe Leu Gln Ile Lys Gly Met Thr

485 490 495

tgc gcc tct tgc gtg agc aac att gag cgg aat ctg cag aag gaa gct 2014

Cys Ala Ser Cys Val Ser Asn Ile Glu Arg Asn Leu Gln Lys Glu Ala

500 505 510

ggg gtg ctg agc gtg ctg gtc gca ctg atg gcc gga aag gct gag atc 2062

Gly Val Leu Ser Val Leu Val Ala Leu Met Ala Gly Lys Ala Glu Ile

515 520 525 530

aag tac gac cct gaa gtg atc cag cca ctg gag att gcc cag ttc atc 2110

Lys Tyr Asp Pro Glu Val Ile Gln Pro Leu Glu Ile Ala Gln Phe Ile

535 540 545

cag gat ctg ggc ttt gag gcc gct gtg atg gaa gac tat gct ggg agc 2158

Gln Asp Leu Gly Phe Glu Ala Ala Val Met Glu Asp Tyr Ala Gly Ser

550 555 560

gat gga aac att gaa ctg acc atc acc gga atg act tgt gcc tct tgc 2206

Asp Gly Asn Ile Glu Leu Thr Ile Thr Gly Met Thr Cys Ala Ser Cys

565 570 575

gtg cac aac atc gag agt aaa ctg act aga acc aat ggg att acc tac 2254

Val His Asn Ile Glu Ser Lys Leu Thr Arg Thr Asn Gly Ile Thr Tyr

580 585 590

gcc agt gtg gcc ctg gct aca tca aag gct ctg gtg aaa ttc gac ccc 2302

Ala Ser Val Ala Leu Ala Thr Ser Lys Ala Leu Val Lys Phe Asp Pro

595 600 605 610

gag atc att gga cct agg gat atc att aag atc att gag gaa atc ggc 2350

Glu Ile Ile Gly Pro Arg Asp Ile Ile Lys Ile Ile Glu Glu Ile Gly

615 620 625

ttt cac gca agc ctg gcc cag cgc aac cca aat gcc cac cat ctg gac 2398

Phe His Ala Ser Leu Ala Gln Arg Asn Pro Asn Ala His His Leu Asp

630 635 640

cat aag atg gag atc aag cag tgg aag aaa agt ttc ctg tgc tca ctg 2446

His Lys Met Glu Ile Lys Gln Trp Lys Lys Ser Phe Leu Cys Ser Leu

645 650 655

gtg ttt gga atc ccc gtc atg gcc ctg atg atc tac atg ctg atc cct 2494

Val Phe Gly Ile Pro Val Met Ala Leu Met Ile Tyr Met Leu Ile Pro

660 665 670

agc aac gag cca cac cag tcc atg gtg ctg gat cat aac atc att cct 2542

Ser Asn Glu Pro His Gln Ser Met Val Leu Asp His Asn Ile Ile Pro

675 680 685 690

ggc ctg tcc atc ctg aat ctg att ttc ttt atc ctg tgc aca ttc gtg 2590

Gly Leu Ser Ile Leu Asn Leu Ile Phe Phe Ile Leu Cys Thr Phe Val

695 700 705

cag ctg ctg gga ggc tgg tac ttt tat gtg cag gca tat aaa tca ctg 2638

Gln Leu Leu Gly Gly Trp Tyr Phe Tyr Val Gln Ala Tyr Lys Ser Leu

710 715 720

cga cac cgg agc gcc aat atg gac gtg ctg att gtc ctg gca acc tct 2686

Arg His Arg Ser Ala Asn Met Asp Val Leu Ile Val Leu Ala Thr Ser

725 730 735

atc gcc tac gtg tat agt ctg gtc atc ctg gtg gtc gca gtg gca gag 2734

Ile Ala Tyr Val Tyr Ser Leu Val Ile Leu Val Val Ala Val Ala Glu

740 745 750

aag gca gaa cgg agc cca gtg act ttc ttt gat acc cct cca atg ctg 2782

Lys Ala Glu Arg Ser Pro Val Thr Phe Phe Asp Thr Pro Pro Met Leu

755 760 765 770

ttc gtg ttt atc gct ctg ggc aga tgg ctg gaa cat ctg gca aag tca 2830

Phe Val Phe Ile Ala Leu Gly Arg Trp Leu Glu His Leu Ala Lys Ser

775 780 785

aaa acc agc gag gct ctg gca aag ctg atg agc ctg cag gct acc gaa 2878

Lys Thr Ser Glu Ala Leu Ala Lys Leu Met Ser Leu Gln Ala Thr Glu

790 795 800

gca aca gtg gtc act ctg gga gag gac aac ctg atc att cgc gag gaa 2926

Ala Thr Val Val Thr Leu Gly Glu Asp Asn Leu Ile Ile Arg Glu Glu

805 810 815

cag gtg cct atg gaa ctg gtc cag cga ggc gat atc gtg aag gtg gtc 2974

Gln Val Pro Met Glu Leu Val Gln Arg Gly Asp Ile Val Lys Val Val

820 825 830

cca ggg gga aaa ttc ccc gtg gac ggc aag gtc ctg gag ggg aat act 3022

Pro Gly Gly Lys Phe Pro Val Asp Gly Lys Val Leu Glu Gly Asn Thr

835 840 845 850

atg gcc gat gaa tcc ctg atc acc ggc gag gct atg cct gtg aca aag 3070

Met Ala Asp Glu Ser Leu Ile Thr Gly Glu Ala Met Pro Val Thr Lys

855 860 865

aaa cca gga tca act gtc att gct ggc agc atc aac gca cac ggg tcc 3118

Lys Pro Gly Ser Thr Val Ile Ala Gly Ser Ile Asn Ala His Gly Ser

870 875 880

gtg ctg atc aag gcc aca cat gtc ggg aat gac aca act ctg gct cag 3166

Val Leu Ile Lys Ala Thr His Val Gly Asn Asp Thr Thr Leu Ala Gln

885 890 895

att gtg aaa ctg gtc gag gaa gcc cag atg tcc aag gct cct atc cag 3214

Ile Val Lys Leu Val Glu Glu Ala Gln Met Ser Lys Ala Pro Ile Gln

900 905 910

cag ctg gcc gat cgg ttc tcc ggc tac ttc gtg ccc ttc atc att atc 3262

Gln Leu Ala Asp Arg Phe Ser Gly Tyr Phe Val Pro Phe Ile Ile Ile

915 920 925 930

atg tct aca ctg act ctg gtg gtc tgg att gtg atc gga ttc att gac 3310

Met Ser Thr Leu Thr Leu Val Val Trp Ile Val Ile Gly Phe Ile Asp

935 940 945

ttt ggc gtg gtc cag aga tat ttt ccc aac cct aat aag cac atc agc 3358

Phe Gly Val Val Gln Arg Tyr Phe Pro Asn Pro Asn Lys His Ile Ser

950 955 960

cag acc gaa gtg atc atc agg ttc gca ttt cag acc agt att aca gtg 3406

Gln Thr Glu Val Ile Ile Arg Phe Ala Phe Gln Thr Ser Ile Thr Val

965 970 975

ctg tgc atc gcc tgc cca tgt tca ctg ggg ctg gct acc ccc aca gca 3454

Leu Cys Ile Ala Cys Pro Cys Ser Leu Gly Leu Ala Thr Pro Thr Ala

980 985 990

gtg atg gtc gga aca gga gtg gca gca cag aac gga att ctg atc aag 3502

Val Met Val Gly Thr Gly Val Ala Ala Gln Asn Gly Ile Leu Ile Lys

995 1000 1005 1010

ggc ggg aaa ccc ctg gag atg gcc cac aag atc aaa act gtg atg ttt 3550

Gly Gly Lys Pro Leu Glu Met Ala His Lys Ile Lys Thr Val Met Phe

1015 1020 1025

gac aaa act ggg acc att aca cat gga gtg ccc cgc gtc atg cga gtg 3598

Asp Lys Thr Gly Thr Ile Thr His Gly Val Pro Arg Val Met Arg Val

1030 1035 1040

ctg ctg ctg ggc gat gtg gca acc ctg cct ctg aga aag gtc ctg gca 3646

Leu Leu Leu Gly Asp Val Ala Thr Leu Pro Leu Arg Lys Val Leu Ala

1045 1050 1055

gtg gtc gga aca gca gag gct agc tcc gaa cac cca ctg ggg gtg gcc 3694

Val Val Gly Thr Ala Glu Ala Ser Ser Glu His Pro Leu Gly Val Ala

1060 1065 1070

gtc aca aag tac tgc aaa gag gaa ctg ggc act gag acc ctg ggg tat 3742

Val Thr Lys Tyr Cys Lys Glu Glu Leu Gly Thr Glu Thr Leu Gly Tyr

1075 1080 1085 1090

tgt act gac ttc cag gca gtg ccc gga tgc gga atc gga tgt aaa gtc 3790

Cys Thr Asp Phe Gln Ala Val Pro Gly Cys Gly Ile Gly Cys Lys Val

1095 1100 1105

tct aac gtg gaa ggg att ctg gct cac agt gag cgg ccc ctg agc gca 3838

Ser Asn Val Glu Gly Ile Leu Ala His Ser Glu Arg Pro Leu Ser Ala

1110 1115 1120

cct gca tcc cat ctg aat gaa gca gga agc ctg cca gca gag aag gac 3886

Pro Ala Ser His Leu Asn Glu Ala Gly Ser Leu Pro Ala Glu Lys Asp

1125 1130 1135

gct gtg cct cag acc ttt tcc gtc ctg atc ggc aac aga gaa tgg ctg 3934

Ala Val Pro Gln Thr Phe Ser Val Leu Ile Gly Asn Arg Glu Trp Leu

1140 1145 1150

cgg aga aat ggg ctg aca att tct agt gac gtg tcc gat gcc atg aca 3982

Arg Arg Asn Gly Leu Thr Ile Ser Ser Asp Val Ser Asp Ala Met Thr

1155 1160 1165 1170

gat cac gag atg aaa ggc cag act gca att ctg gtg gcc atc gac gga 4030

Asp His Glu Met Lys Gly Gln Thr Ala Ile Leu Val Ala Ile Asp Gly

1175 1180 1185

gtc ctg tgc ggc atg att gct atc gca gat gcc gtg aag cag gag gct 4078

Val Leu Cys Gly Met Ile Ala Ile Ala Asp Ala Val Lys Gln Glu Ala

1190 1195 1200

gca ctg gcc gtc cat acc ctg cag tct atg ggc gtg gac gtg gtc ctg 4126

Ala Leu Ala Val His Thr Leu Gln Ser Met Gly Val Asp Val Val Leu

1205 1210 1215

atc acc ggg gat aac cgg aaa aca gct aga gca att gcc act caa gtg 4174

Ile Thr Gly Asp Asn Arg Lys Thr Ala Arg Ala Ile Ala Thr Gln Val

1220 1225 1230

ggc atc aat aag gtg ttc gct gaa gtc ctg cct agc cac aag gtc gca 4222

Gly Ile Asn Lys Val Phe Ala Glu Val Leu Pro Ser His Lys Val Ala

1235 1240 1245 1250

aaa gtg cag gag ctg cag aac aag ggc aag aaa gtc gcc atg gtg gga 4270

Lys Val Gln Glu Leu Gln Asn Lys Gly Lys Lys Val Ala Met Val Gly

1255 1260 1265

gac ggc gtg aat gat agc cca gct ctg gca cag gca gac atg gga gtc 4318

Asp Gly Val Asn Asp Ser Pro Ala Leu Ala Gln Ala Asp Met Gly Val

1270 1275 1280

gct att ggg aca gga act gac gtg gca atc gag gcc gct gat gtg gtc 4366

Ala Ile Gly Thr Gly Thr Asp Val Ala Ile Glu Ala Ala Asp Val Val

1285 1290 1295

ctg att agg aat gac ctg ctg gat gtg gtc gct tct att cat ctg agt 4414

Leu Ile Arg Asn Asp Leu Leu Asp Val Val Ala Ser Ile His Leu Ser

1300 1305 1310

aag agg aca gtg agg cgc att cgc atc aac ctg gtg ctg gcc ctg atc 4462

Lys Arg Thr Val Arg Arg Ile Arg Ile Asn Leu Val Leu Ala Leu Ile

1315 1320 1325 1330

tac aat ctg gtg gga att cca atc gca gcc ggc gtg ttt atg cca att 4510

Tyr Asn Leu Val Gly Ile Pro Ile Ala Ala Gly Val Phe Met Pro Ile

1335 1340 1345

ggg atc gtc ctg cag ccc tgg atg ggc tca gct gca atg gcc gct tca 4558

Gly Ile Val Leu Gln Pro Trp Met Gly Ser Ala Ala Met Ala Ala Ser

1350 1355 1360

agc gtg agc gtg gtc ctg tcc tct ctg cag ctg aaa tgc tac aag aaa 4606

Ser Val Ser Val Val Leu Ser Ser Leu Gln Leu Lys Cys Tyr Lys Lys

1365 1370 1375

cca gac ctg gag cgg tac gaa gct cag gca cac gga cat atg aag ccc 4654

Pro Asp Leu Glu Arg Tyr Glu Ala Gln Ala His Gly His Met Lys Pro

1380 1385 1390

ctg acc gct tcc cag gtg tct gtc cac atc ggc atg gac gat aga tgg 4702

Leu Thr Ala Ser Gln Val Ser Val His Ile Gly Met Asp Asp Arg Trp

1395 1400 1405 1410

agg gac agc cca agg gcc act cca tgg gat cag gtc agt tac gtg agc 4750

Arg Asp Ser Pro Arg Ala Thr Pro Trp Asp Gln Val Ser Tyr Val Ser

1415 1420 1425

cag gtc agc ctg agt tca ctg acc agc gac aag ccc tcc cgc cat tct 4798

Gln Val Ser Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Lys Pro Ser Arg His Ser

1430 1435 1440

gca gcc gct gat gac gac ggg gac aag tgg agc ctg ctg ctg aac gga 4846

Ala Ala Ala Asp Asp Asp Gly Asp Lys Trp Ser Leu Leu Leu Asn Gly

1445 1450 1455

agg gac gaa gaa cag tat atc taa ggtaccaata aagacctctt attttcattc 4900

Arg Asp Glu Glu Gln Tyr Ile

1460 1465

atcaggtgtg gttggttttt ttgtgtgggg gcggatccat cggatcccgt gcggaccgag 4960

cggccgcagg aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc 5020

actgaggccg ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct ttgcccgggc ggcctcagtg 5080

agcgagcgag cgcgcagctg cctgcag 5107

<210> 4

<211> 1465

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> [CDS]:473..4870 из SEQ ID NO 3

<400> 4

Met Pro Glu Gln Glu Arg Gln Ile Thr Ala Arg Glu Gly Ala Ser Arg

1 5 10 15

Lys Ile Leu Ser Lys Leu Ser Leu Pro Thr Arg Ala Trp Glu Pro Ala

20 25 30

Met Lys Lys Ser Phe Ala Phe Asp Asn Val Gly Tyr Glu Gly Gly Leu

35 40 45

Asp Gly Leu Gly Pro Ser Ser Gln Val Ala Thr Ser Thr Val Arg Ile

50 55 60

Leu Gly Met Thr Cys Gln Ser Cys Val Lys Ser Ile Glu Asp Arg Ile

65 70 75 80

Ser Asn Leu Lys Gly Ile Ile Ser Met Lys Val Ser Leu Glu Gln Gly

85 90 95

Ser Ala Thr Val Lys Tyr Val Pro Ser Val Val Cys Leu Gln Gln Val

100 105 110

Cys His Gln Ile Gly Asp Met Gly Phe Glu Ala Ser Ile Ala Glu Gly

115 120 125

Lys Ala Ala Ser Trp Pro Ser Arg Ser Leu Pro Ala Gln Glu Ala Val

130 135 140

Val Lys Leu Arg Val Glu Gly Met Thr Cys Gln Ser Cys Val Ser Ser

145 150 155 160

Ile Glu Gly Lys Val Arg Lys Leu Gln Gly Val Val Arg Val Lys Val

165 170 175

Ser Leu Ser Asn Gln Glu Ala Val Ile Thr Tyr Gln Pro Tyr Leu Ile

180 185 190

Gln Pro Glu Asp Leu Arg Asp His Val Asn Asp Met Gly Phe Glu Ala

195 200 205

Ala Ile Lys Ser Lys Val Ala Pro Leu Ser Leu Gly Pro Ile Asp Ile

210 215 220

Glu Arg Leu Gln Ser Thr Asn Pro Lys Arg Pro Leu Ser Ser Ala Asn

225 230 235 240

Gln Asn Phe Asn Asn Ser Glu Thr Leu Gly His Gln Gly Ser His Val

245 250 255

Val Thr Leu Gln Leu Arg Ile Asp Gly Met His Cys Lys Ser Cys Val

260 265 270

Leu Asn Ile Glu Glu Asn Ile Gly Gln Leu Leu Gly Val Gln Ser Ile

275 280 285

Gln Val Ser Leu Glu Asn Lys Thr Ala Gln Val Lys Tyr Asp Pro Ser

290 295 300

Cys Thr Ser Pro Val Ala Leu Gln Arg Ala Ile Glu Ala Leu Pro Pro

305 310 315 320

Gly Asn Phe Lys Val Ser Leu Pro Asp Gly Ala Glu Gly Ser Gly Thr

325 330 335

Asp His Arg Ser Ser Ser Ser His Ser Pro Gly Ser Pro Pro Arg Asn

340 345 350

Gln Val Gln Gly Thr Cys Ser Thr Thr Leu Ile Ala Ile Ala Gly Met

355 360 365

Thr Cys Ala Ser Cys Val His Ser Ile Glu Gly Met Ile Ser Gln Leu

370 375 380

Glu Gly Val Gln Gln Ile Ser Val Ser Leu Ala Glu Gly Thr Ala Thr

385 390 395 400

Val Leu Tyr Asn Pro Ser Val Ile Ser Pro Glu Glu Leu Arg Ala Ala

405 410 415

Ile Glu Asp Met Gly Phe Glu Ala Ser Val Val Ser Glu Ser Cys Ser

420 425 430

Thr Asn Pro Leu Gly Asn His Ser Ala Gly Asn Ser Met Val Gln Thr

435 440 445

Thr Asp Gly Thr Pro Thr Ser Val Gln Glu Val Ala Pro His Thr Gly

450 455 460

Arg Leu Pro Ala Asn His Ala Pro Asp Ile Leu Ala Lys Ser Pro Gln

465 470 475 480

Ser Thr Arg Ala Val Ala Pro Gln Lys Cys Phe Leu Gln Ile Lys Gly

485 490 495

Met Thr Cys Ala Ser Cys Val Ser Asn Ile Glu Arg Asn Leu Gln Lys

500 505 510

Glu Ala Gly Val Leu Ser Val Leu Val Ala Leu Met Ala Gly Lys Ala

515 520 525

Glu Ile Lys Tyr Asp Pro Glu Val Ile Gln Pro Leu Glu Ile Ala Gln

530 535 540

Phe Ile Gln Asp Leu Gly Phe Glu Ala Ala Val Met Glu Asp Tyr Ala

545 550 555 560

Gly Ser Asp Gly Asn Ile Glu Leu Thr Ile Thr Gly Met Thr Cys Ala

565 570 575

Ser Cys Val His Asn Ile Glu Ser Lys Leu Thr Arg Thr Asn Gly Ile

580 585 590

Thr Tyr Ala Ser Val Ala Leu Ala Thr Ser Lys Ala Leu Val Lys Phe

595 600 605

Asp Pro Glu Ile Ile Gly Pro Arg Asp Ile Ile Lys Ile Ile Glu Glu

610 615 620

Ile Gly Phe His Ala Ser Leu Ala Gln Arg Asn Pro Asn Ala His His

625 630 635 640

Leu Asp His Lys Met Glu Ile Lys Gln Trp Lys Lys Ser Phe Leu Cys

645 650 655

Ser Leu Val Phe Gly Ile Pro Val Met Ala Leu Met Ile Tyr Met Leu

660 665 670

Ile Pro Ser Asn Glu Pro His Gln Ser Met Val Leu Asp His Asn Ile

675 680 685

Ile Pro Gly Leu Ser Ile Leu Asn Leu Ile Phe Phe Ile Leu Cys Thr

690 695 700

Phe Val Gln Leu Leu Gly Gly Trp Tyr Phe Tyr Val Gln Ala Tyr Lys

705 710 715 720

Ser Leu Arg His Arg Ser Ala Asn Met Asp Val Leu Ile Val Leu Ala

725 730 735

Thr Ser Ile Ala Tyr Val Tyr Ser Leu Val Ile Leu Val Val Ala Val

740 745 750

Ala Glu Lys Ala Glu Arg Ser Pro Val Thr Phe Phe Asp Thr Pro Pro

755 760 765

Met Leu Phe Val Phe Ile Ala Leu Gly Arg Trp Leu Glu His Leu Ala

770 775 780

Lys Ser Lys Thr Ser Glu Ala Leu Ala Lys Leu Met Ser Leu Gln Ala

785 790 795 800

Thr Glu Ala Thr Val Val Thr Leu Gly Glu Asp Asn Leu Ile Ile Arg

805 810 815

Glu Glu Gln Val Pro Met Glu Leu Val Gln Arg Gly Asp Ile Val Lys

820 825 830

Val Val Pro Gly Gly Lys Phe Pro Val Asp Gly Lys Val Leu Glu Gly

835 840 845

Asn Thr Met Ala Asp Glu Ser Leu Ile Thr Gly Glu Ala Met Pro Val

850 855 860

Thr Lys Lys Pro Gly Ser Thr Val Ile Ala Gly Ser Ile Asn Ala His

865 870 875 880

Gly Ser Val Leu Ile Lys Ala Thr His Val Gly Asn Asp Thr Thr Leu

885 890 895

Ala Gln Ile Val Lys Leu Val Glu Glu Ala Gln Met Ser Lys Ala Pro

900 905 910

Ile Gln Gln Leu Ala Asp Arg Phe Ser Gly Tyr Phe Val Pro Phe Ile

915 920 925

Ile Ile Met Ser Thr Leu Thr Leu Val Val Trp Ile Val Ile Gly Phe

930 935 940

Ile Asp Phe Gly Val Val Gln Arg Tyr Phe Pro Asn Pro Asn Lys His

945 950 955 960

Ile Ser Gln Thr Glu Val Ile Ile Arg Phe Ala Phe Gln Thr Ser Ile

965 970 975

Thr Val Leu Cys Ile Ala Cys Pro Cys Ser Leu Gly Leu Ala Thr Pro

980 985 990

Thr Ala Val Met Val Gly Thr Gly Val Ala Ala Gln Asn Gly Ile Leu

995 1000 1005

Ile Lys Gly Gly Lys Pro Leu Glu Met Ala His Lys Ile Lys Thr Val

1010 1015 1020

Met Phe Asp Lys Thr Gly Thr Ile Thr His Gly Val Pro Arg Val Met

1025 1030 1035 1040

Arg Val Leu Leu Leu Gly Asp Val Ala Thr Leu Pro Leu Arg Lys Val

1045 1050 1055

Leu Ala Val Val Gly Thr Ala Glu Ala Ser Ser Glu His Pro Leu Gly

1060 1065 1070

Val Ala Val Thr Lys Tyr Cys Lys Glu Glu Leu Gly Thr Glu Thr Leu

1075 1080 1085

Gly Tyr Cys Thr Asp Phe Gln Ala Val Pro Gly Cys Gly Ile Gly Cys

1090 1095 1100

Lys Val Ser Asn Val Glu Gly Ile Leu Ala His Ser Glu Arg Pro Leu

1105 1110 1115 1120

Ser Ala Pro Ala Ser His Leu Asn Glu Ala Gly Ser Leu Pro Ala Glu

1125 1130 1135

Lys Asp Ala Val Pro Gln Thr Phe Ser Val Leu Ile Gly Asn Arg Glu

1140 1145 1150

Trp Leu Arg Arg Asn Gly Leu Thr Ile Ser Ser Asp Val Ser Asp Ala

1155 1160 1165

Met Thr Asp His Glu Met Lys Gly Gln Thr Ala Ile Leu Val Ala Ile

1170 1175 1180

Asp Gly Val Leu Cys Gly Met Ile Ala Ile Ala Asp Ala Val Lys Gln

1185 1190 1195 1200

Glu Ala Ala Leu Ala Val His Thr Leu Gln Ser Met Gly Val Asp Val

1205 1210 1215

Val Leu Ile Thr Gly Asp Asn Arg Lys Thr Ala Arg Ala Ile Ala Thr

1220 1225 1230

Gln Val Gly Ile Asn Lys Val Phe Ala Glu Val Leu Pro Ser His Lys

1235 1240 1245

Val Ala Lys Val Gln Glu Leu Gln Asn Lys Gly Lys Lys Val Ala Met

1250 1255 1260

Val Gly Asp Gly Val Asn Asp Ser Pro Ala Leu Ala Gln Ala Asp Met

1265 1270 1275 1280

Gly Val Ala Ile Gly Thr Gly Thr Asp Val Ala Ile Glu Ala Ala Asp

1285 1290 1295

Val Val Leu Ile Arg Asn Asp Leu Leu Asp Val Val Ala Ser Ile His

1300 1305 1310

Leu Ser Lys Arg Thr Val Arg Arg Ile Arg Ile Asn Leu Val Leu Ala

1315 1320 1325

Leu Ile Tyr Asn Leu Val Gly Ile Pro Ile Ala Ala Gly Val Phe Met

1330 1335 1340

Pro Ile Gly Ile Val Leu Gln Pro Trp Met Gly Ser Ala Ala Met Ala

1345 1350 1355 1360

Ala Ser Ser Val Ser Val Val Leu Ser Ser Leu Gln Leu Lys Cys Tyr

1365 1370 1375

Lys Lys Pro Asp Leu Glu Arg Tyr Glu Ala Gln Ala His Gly His Met

1380 1385 1390

Lys Pro Leu Thr Ala Ser Gln Val Ser Val His Ile Gly Met Asp Asp

1395 1400 1405

Arg Trp Arg Asp Ser Pro Arg Ala Thr Pro Trp Asp Gln Val Ser Tyr

1410 1415 1420

Val Ser Gln Val Ser Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Lys Pro Ser Arg

1425 1430 1435 1440

His Ser Ala Ala Ala Asp Asp Asp Gly Asp Lys Trp Ser Leu Leu Leu

1445 1450 1455

Asn Gly Arg Asp Glu Glu Gln Tyr Ile

1460 1465

<210> 5

<211> 695

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибридный промотор EalbPa1AT

<220>

<221> энхансер

<222> 1..382

<223> /примечание="энхансер гена альбумина"

<220>

<221> промотор

<222> 391..695

<223> /примечание="промотор альфа 1 антитрипсина"

<400> 5

ctcgaggttc ctagattaca ttacacattc tgcaagcata gcacagagca atgttctact 60

ttaattactt tcattttctt gtatcctcac agcctagaaa ataacctgcg ttacagcatc 120

cactcagtat cccttgagca tgaggtgaca ctacttaaca tagggacgag atggtacttt 180

gtgtctcctg ctctgtcagc agggcacagt acttgctgat accagggaat gtttgttctt 240

aaataccatc attccggacg tgtttgcctt ggccagtttt ccatgtacat gcagaaagaa 300

gtttggactg atcaatacag tcctctgcct ttaaagcaat aggaaaaggc caacttgtct 360

acgtttagta tgtggctgta gatctgtacc cgccaccccc tccaccttgg acacaggacg 420

ctgtggtttc tgagccaggt acaatgactc ctttcggtaa gtgcagtgga agctgtacac 480

tgcccaggca aagcgtccgg gcagcgtagg cgggcgactc agatcccagc cagtggactt 540

agcccctgtt tgctcctccg ataactgggg tgaccttggt taatattcac cagcagcctc 600

ccccgttgcc cctctggatc cactgcttaa atacggacga ggacagggcc ctgtctcctc 660

agcttcaggc accaccactg acctgggaca gtgaa 695

<210> 6

<211> 3817

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> конструкция нуклеиновой кислоты экспрессирующего вектора AAV2-AAT-ATP7B(d57-486)

<220>

<221> область повторов

<222> 1..141

<223> /примечание="5' ITR из серотипа 2 аденоассоциированного вируса"

<220>

<221> промотор

<222> 156..460

<223> /примечание="альфа 1 антитрипсин"

<220>

<221> CDS

<222> 473..3580

<223> /примечание="Укороченный ATP7B (медь-транспортирующая АТФаза 2)"

/примечание="последовательность, кодирующая укороченный ATP7B (медь-транспортирующую АТФазу 2), с делецией аминокислот 57..486"

/таблица трансляции=1

<220>

<221> полиA_сигнал

<222> 3587..3642

<220>

<221область повторов

<222> 3678..3817

<223> /примечание="3' ITR из серотипа 2 аденоассоциированного вируса "

<400> 6