СПОСОБ ПОЛИАЛКОКСИЛИРОВАНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ, КОТОРЫЙ ПОЗВОЛЯЕТ ИЗВЛЕКАТЬ И ПОВТОРНО ИСПОЛЬЗОВАТЬ ИЗБЫТОК ПОЛИАЛКОКСИЛИРУЮЩЕГО РЕАГЕНТА Российский патент 2022 года по МПК A61K47/60 C12N15/10 C12N15/113 C12N15/115 C12N15/117 C12Q1/6876 C07H21/00 

Настоящее изобретение относится к способу получения модифицированной молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеиновокислотную часть и не-нуклеиновокислотную часть, путем взаимодействия первого взаимодействующего вещества и второго взаимодействующего вещества, где первое взаимодействующее вещество включает не-нуклеиновокислотную часть и карбоксильную группу, и где второе взаимодействующее вещество представляет собой амино-модифицированную молекулу нуклеиновой кислоты, включающую нуклеиновокислотную часть и амино-модификацию, включающую амино группу, присоединенную к нуклеиновокислотной части, к модифицированной молекуле нуклеиновой кислоты, полученной таким способом, к модифицированной молекуле нуклеиновой кислоты, полученной таким способом, для применения в терапии, к модифицированной молекуле нуклеиновой кислоты, полученной таким способом, для применения в диагностике, и к применению модифицированной молекулы нуклеиновой кислоты, полученной таким способом, в методе анализа образца in vitro.

Конъюгация лекарственных средств, таких как нуклеиновые кислоты, пептиды, белки и наночастицы, с другими молекулами, такими как полиалкокси соединения, широко используют для повышения биодоступности, стабильности, безопасности и эффективности для применения в терапевтических целях. В области олигонуклеотидных терапевтических средств, аптамеры и шпигельмеры (также называемые зеркально отраженными аптамерами) обычно являются полиалкоксилированными. Полиэтиленгликоль (сокр. ПЭГ) представляет собой широко используемое полиалкокси соединение, которое одобрено Управлением по контролю продуктов питания и лекарственных средств как часть лекарственных средств, вводимых внутривенно, перорально и чрескожно.

Обычно полиалкоксилированную нуклеиновую кислоту получают способом, который сначала собирает нуклеиновую кислоту, содержащую реакционноспособную группу, на твердой фазе (Hoffmann et. al, Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry 2011, 4:4,46,1-4,46,30). После отщепления от твердой фазы и снятия защиты синтезированную нуклеиновую кислоту очищают такими методами, как высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой (сокр. ОФ-ВЭЖХ) или ионообменная высокоэффективная жидкостная хроматография (сокр. ИО-ВЭЖХ) или ультрафильтрация (сокр. УФ). Реакционноспособная группа нуклеиновой кислоты затем может вступать во взаимодействие с полиалкокси соединением, содержащим подходящую совместимую реакционноспособную группу, с образованием конъюгата полиалкокси соединения и нуклеиновой кислоты. После конъюгации неочищенный продукт, состоящий из полиалкоксилированных нуклеиновокислотных молекул и не-полиалкоксилированных нуклеиновокислотных молекул, очищают методами, которые могут представлять собой комбинацию ВЭЖХ, в частности, ОФ- или ИО-ВЭЖХ, и ультрафильтрации.

Выход реакции полиалкоксилирования зависит от природы и чистоты нуклеиновой кислоты, подлежащей полиалкоксилированию, типа реакции полиалкоксилирования и от условий самой реакции. Наиболее часто используемые типы реакций, используемые для полиалкоксилирования нуклеиновых кислот представляют собой:

a) аминолиз активного сложного эфира полиалкоксикарбоновой кислоты амино-модифицированным олигонуклеотидом в присутствии основания;

b) присоединение тиол-модифицированного олигонуклеотида к полиалкокси соединению, содержащему малеимидную группу; и

c) 1,3-диполярное циклоприсоединение азид-модифицированного олигонуклеотида с полиалкокси соединением, содержащим алкиновую группу, или алкин-модифицированного олигонуклеотида с полиалкокси соединением, содержащим азидную группу.

Наиболее широко используемой реакцией полиалкоксилирования является аминолиз активного эфира полиалкоксикарбоновой кислоты амино-модифицированным олигонуклеотидом в присутствии основания. Реакция быстрая и легко масштабируемая. Малеимид-тиольное присоединение не требует какого-либо основания и является быстрой и селективной реакцией, но тиол должен быть освобожден от дисульфидного предшественника на отдельной стадии реакции с использованием восстановителя, такого как DTT. Избыток DTT должен быть полностью удален перед реакцией конъюгации, так как он также подвергнется присоединению к малеимиду и, следовательно, снизит выход. Удаление DTT должно быть быстрым, поскольку высвобожденный тиол будет подвергаться окислению. Это усложняет использование для крупномасштабного производства. 1,3-Диполярное циклоприсоединение, также называемое ʺклик-реакциейʺ, требует либо присутствия меди в качестве катализатора, либо стерически затрудненных алкиновых соединений. Для ʺклик-реакцииʺ без присутствия металла либо азид, либо стерически затрудненный алкин необходимо вводить в олигонуклеотид после синтеза, поскольку оба они чувствительны к нуклеофильным основаниям, таким как метиламин/аммиак, используемым для отщепления и снятия защиты олигонуклеотидов.

Принимая во внимание ограничения малеимид-тиольного присоединения и ʺклик-реакцииʺ, образование полиалкоксилированных олигонуклеотидов в большом масштабе лучше всего осуществлять путем аминолиза активного сложного эфира полиалкоксикарбоновой кислоты амино-модифицированным олигонуклеотидом. Как правило, полиалкоксикарбоновые кислоты являются активированными в виде N-гидроксисукцинимидных сложных эфиров, которые получают в отдельной реакции, очищают и хранят до применения. Вследствие их реакционноспособной природы вышеуказанные сложные эфиры склонны к гидролизу до соответствующей свободной полиалкоксикарбоновой кислоты и N-гидроксисукцинимида. Это неизбежно требует мер предосторожности при обработке, хранении или транспортировке таких веществ.

Задача, лежащая в основе настоящего изобретения, заключается в обеспечении способа получения модифицированной молекулы нуклеиновой кислоты и, более конкретно, полиалкоксилированной молекулы нуклеиновой кислоты, такой как ПЭГилированная молекула нуклеиновой кислоты.

Эту и другие задачи решают при помощи объекта изобретения, представленного в прилагаемых независимых пунктах формулы изобретения. Предпочтительные варианты осуществления могут быть очевидны из прилагаемых зависимых пунктов формулы изобретения.

Задача, лежащая в основе настоящего изобретения, более конкретно решается в первом аспекте, который также является первым вариантом осуществления первого аспекта, при помощи способа получения модифицированной молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеиновокислотную часть и не-нуклеиновокислотную часть, путем взаимодействия первого взаимодействующего вещества и второго взаимодействующего вещества, где первое взаимодействующее вещество включает не-нуклеиновокислотную часть и карбоксильную группу, и где второе взаимодействующее вещество представляет собой амино-модифицированную молекулу нуклеиновой кислоты, включающую нуклеиновокислотную часть и амино-модификацию, включающую амино группу, которая присоединена к нуклеиновокислотной части, где способ включает следующие стадии:

a) активирование первого взаимодействующего вещества, предпочтительно карбоксильной группы первого взаимодействующего вещества, реагентом конденсации в смешиваемом с водой органическом растворителе, и

b) взаимодействие активированного первого взаимодействующего вещества, предпочтительно активированной карбоксильной группы первого взаимодействующего вещества, со стадии a) и второго взаимодействующего вещества, предпочтительно амино группы амино-модификации амино-модифицированной молекулы нуклеиновой кислоты, которая растворена в воде или смеси смешиваемого с водой органического растворителя и воды,

в результате чего образуется модифицированная молекула нуклеиновой кислоты.

Во втором варианте осуществления первого аспекта, который также является вариантом осуществления первого варианта осуществления первого аспекта, амино-модифицированную молекулу нуклеиновой кислоты растворяют в смеси воды и смешиваемого с водой органического растворителя в присутствии четвертичной аммониевой соли.

В третьем варианте осуществления первого аспекта, который также является вариантом осуществления первого и второго варианта осуществления первого аспекта, активированное первое взаимодействующее вещество стадии a) добавляют к амино-модифицированной молекуле нуклеиновой кислоты, растворенной в воде или в смеси смешиваемого с водой органического растворителя и воды.

В четвертом варианте осуществления первого аспекта, который также является вариантом осуществления первого, второго и третьего варианта осуществления первого аспекта, первое взаимодействующее вещество и/или не-нуклеиновокислотная часть выбраны из группы, включающей полиалкокси соединение, пептид, белок, гликопротеин, нуклеиновую кислоту, углеводный фрагмент и химическую группу, отличную от пептида, белка, гликопротеина, нуклеиновой кислоты и/или углеводного фрагмента, предпочтительно первое взаимодействующее вещество и/или не-нуклеиновокислотная часть представляет собой полиалкокси соединение.

В пятом варианте осуществления первого аспекта, который также является вариантом осуществления первого, второго, третьего и четвертого варианта осуществления первого аспекта, амино-модифицированная молекула нуклеиновой кислоты является подходящей для использования в аналитическом методе, в диагностике и/или терапии.

В шестом варианте осуществления первого аспекта, который также является вариантом осуществления первого, второго, третьего, четвертого и пятого варианта осуществления первого аспекта, амино-модифицированная молекула нуклеиновой кислоты выбрана из группы, включающей амино-модифицированные аптамеры, амино-модифицированные шпигельмеры, амино-модифицированные иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты, амино-модифицированные миРНК, амино-модифицированные микроРНК молекулы и амино-модифицированные антисмысловые нуклеиновокислотные молекулы, предпочтительно аптамеры представляют собой аптамеры, состоящие из L- и/или D-нуклеотидов,

и/или где нуклеиновокислотная часть выбрана из группы, включающей аптамеры, шпигельмеры, иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты, молекулы миРНК, микроРНК и антисмысловые нуклеиновокислотные молекулы, предпочтительно аптамеры представляют собой аптамеры, состоящие из L- и/или D-нуклеотидов.

В седьмом варианте осуществления первого аспекта, который также является вариантом осуществления первого, второго, третьего, четвертого, пятого и шестого варианта осуществления первого аспекта, на стадии b) используют избыток молекул активированного первого взаимодействующего вещества по сравнению с молекулами амино-модифицированных нуклеиновых кислот.

В восьмом варианте осуществления первого аспекта, который также является вариантом осуществления седьмого варианта осуществления первого аспекта, избыток выражают как молярное отношение молекул активированного первого взаимодействующего вещества и амино-модифицированных молекул нуклеиновых кислот, где молярное отношение составляет от около 1,1 до около 10, предпочтительно от около 1,5 до около 3,5.

В девятом варианте осуществления первого аспекта, который также является вариантом осуществления первого, второго, третьего, четвертого, пятого, шестого, седьмого и восьмого варианта осуществления первого аспекта, для активирования первого взаимодействующего вещества в соответствии со стадией a) первое взаимодействующее вещество растворяют в смешиваемом с водой органическом растворителе и добавляют конденсирующий агент и основание, предпочтительно сначала конденсирующий агент и затем основание, где предпочтительно конденсирующий агент растворяют в смешиваемом с водой органическом растворителе.

В десятом варианте осуществления первого аспекта, который также является вариантом осуществления девятого варианта осуществления первого аспекта, основание представляет собой ненуклеофильное основание.

В одиннадцатом варианте осуществления первого аспекта, который также является вариантом осуществления девятого и десятого варианта осуществления первого аспекта, через 0,25 мин - 60 мин, предпочтительно 0,5 мин - 20 мин, и более предпочтительно 1,0 мин - 5,0 мин после добавления основания полученный таким образом раствор добавляют к раствору, содержащему амино-модифицированную молекулу нуклеиновой кислоты, предпочтительно через 1,0 мин - 5,0 мин после добавления основания раствор, включающий конденсирующий агент и основание, добавляют к раствору, содержащему амино-модифицированную молекулу нуклеиновой кислоты.

В двенадцатом варианте осуществления первого аспекта, который также является вариантом осуществления девятого, десятого и одиннадцатого варианта осуществления первого аспекта, конденсирующий агент выбран из группы, включающей

a) соли фосфония, такие как BOP, PyBOP, PyBrop, AOP, PyAOP, BrOP и PyClOP,

b) соли урония, такие как HCTU, TCTU, TBTU, HBTU, HATU, TOTU и COMU, и

c) карбодиимиды,

где предпочтительно конденсирующий растворитель представляет собой PyBOP, TBTU, COMU, HBTU, более предпочтительно HBTU.

В 13^ом варианте осуществления первого аспекта, который также является вариантом осуществления двенадцатого варианта осуществления первого аспекта, карбодиимид выбран из группы, включающей DCC (N,N'-дициклогексилкарбодиимид), EDC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид) и DIC (N,N'-диизопропилкарбодиимид).

В 14^ом варианте осуществления первого аспекта, который также является вариантом осуществления первого, второго, третьего, четвертого, пятого, шестого, седьмого, восьмого, девятого, десятого, одиннадцатого, двенадцатого и 13^го варианта осуществления первого аспекта, смешиваемый с водой органический растворитель выбран из группы, включающей метанол, этанол, н-пропанол, изопропанол, н-бутанол, втор-бутанол, трет-бутанол, диметилсульфоксид, диэтилсульфоксид, метилэтилсульфоксид, формамид, метилформамид, диметилформамид, этилформамид, этилметилформамид, диэтилформамид, 2-пирролидон, N-метилпирролидон, N-этилпирролидон, ацетонитрил, ацетон, этилметилкетон, метилпропилкетон, диэтилкетон, метилизопропилкетон, метилформиат, этилформиат, пропилформиат, изопропилформиат, метилацетат, этилацетат, метилпропаноат, тетрагидрофуран и диоксан, предпочтительно диметилформамид, ацетонитрил и диметилсульфоксид.

В 15^ом варианте осуществления первого аспекта, который также является вариантом осуществления первого, второго, третьего, четвертого, пятого, шестого, седьмого, восьмого, девятого, десятого, одиннадцатого, двенадцатого, 13^го и 14^го варианта осуществления первого аспекта, основание выбрано из группы, включающей диизопропилэтиламин (DIPEA), триметиламин и DBU, предпочтительно диизопропилэтиламин (DIPEA).

В 16^ом варианте осуществления первого аспекта, который также является вариантом осуществления девятого, десятого, одиннадцатого, двенадцатого, 13^го, 14^го и 15^го варианта осуществления первого аспекта, a или молярное отношение основания к первому взаимодействующему веществу равно или больше чем 1.

В 17^ом варианте осуществления первого аспекта, который также является вариантом осуществления девятого, десятого, одиннадцатого, двенадцатого, 13^го, 14^го, 15^го и 16^го варианта осуществления первого аспекта, раствор амино-модифицированной молекулы нуклеиновой кислоты содержит основание, предпочтительно ненуклеофильное основание, при этом предпочтительно молярное отношение ненуклеофильного основания к числу фосфодиэфиров в амино-модифицированной молекуле нуклеиновой кислоты больше чем 3.

В 18^ом варианте осуществления первого аспекта, который также является вариантом осуществления первого, второго, третьего, четвертого, пятого, шестого, седьмого, восьмого, девятого, десятого, одиннадцатого, двенадцатого, 13^го, 14^го, 15^го, 16^го и 17^го варианта осуществления первого аспекта, стадию а) осуществляют при температуре 5°C-60°C, предпочтительно при температуре 10°C-40°C, более предпочтительно при температуре 15°C-30°C, наиболее предпочтительно при температуре окружающей среды.

В 19^ом варианте осуществления первого аспекта, который также является вариантом осуществления первого, второго, третьего, четвертого, пятого, шестого, седьмого, восьмого, девятого, десятого, одиннадцатого, двенадцатого, 13^го, 14^го, 15^го, 16^го, 17^го и 18^го варианта осуществления первого аспекта, стадию b) осуществляют при температуре 5°C-60°C, предпочтительно при температуре 10°C-40°C, более предпочтительно при температуре 15°C-30°C, наиболее предпочтительно при температуре окружающей среды.

В 20^ом варианте осуществления первого аспекта, который также является вариантом осуществления первого, второго, третьего, четвертого, пятого, шестого, седьмого, восьмого, девятого, десятого, одиннадцатого, двенадцатого, 13^го, 14^го, 15^го, 16^го, 17^го, 18^го и 19^го варианта осуществления первого аспекта, реакция активированной карбоксильной группы первого взаимодействующего вещества с амино группой амино-модифицированной молекулы нуклеиновой кислоты завершается через 5 минут - шесть часов, предпочтительно через 15 минут - 45 минут, более предпочтительно через 15-30 минут.

В 21^ом варианте осуществления первого аспекта, который также является вариантом осуществления первого, второго, третьего, четвертого, пятого, шестого, седьмого, восьмого, девятого, десятого, одиннадцатого, двенадцатого, 13^го, 14^го, 15^го, 16^го, 17^го, 18^го, 19^го и 20^го варианта осуществления первого аспекта, стадию b) осуществляют в диапазоне pH 7,5-10, предпочтительно в диапазоне pH 7,5-9,и более предпочтительно в диапазоне pH 7,5-8,5.

В 22^ом варианте осуществления первого аспекта, который также является вариантом осуществления первого, второго, третьего, четвертого, пятого, шестого, седьмого, восьмого, девятого, десятого, одиннадцатого, двенадцатого, 13^го, 14^го, 15^го, 16^го, 17^го, 18^го, 19^го, 20^го и 21^го варианта осуществления первого аспекта, на стадии b) активированное первое взаимодействующее вещество добавляют к раствору амино-модифицированных молекул нуклеиновых кислот до тех пор, пока от 80% до 100% амино-модифицированных молекул не прореагируют с первым взаимодействующим веществом, предпочтительно пока от 90% до 100% амино-модифицированных молекул нуклеиновых кислот не прореагируют с первым взаимодействующим веществом.

В 23^ем варианте осуществления первого аспекта, который также является вариантом осуществления первого, второго, третьего, четвертого, пятого, шестого, седьмого, восьмого, девятого, десятого, одиннадцатого, двенадцатого, 13^го, 14^го, 15^го, 16^го, 17^го, 18^го, 19^го, 20^го, 21^го и 22^го варианта осуществления первого аспекта, после завершения стадии b) любое непрореагировавшее первое взаимодействующее вещество отделяют от реакционной смеси при помощи ультрафильтрации и/или хроматографии, предпочтительно при помощи ионообменной хроматографии.

в 24^ом варианте осуществления первого аспекта, который также является вариантом осуществления 23^го варианта осуществления первого аспекта, отделенное первое взаимодействующее вещество подвергают рециклу и используют на стадии a).

В 25^ом варианте осуществления первого аспекта, который также является вариантом осуществления четвертого, пятого, шестого, седьмого, восьмого, девятого, десятого, одиннадцатого, двенадцатого, 13^го, 14^го, 15^го, 16^го, 17^го, 18^го, 19^го, 20^го, 21^го, 22^го, 23^го и 24^го варианта осуществления первого аспекта, полиалкокси соединение представляет собой полиалкокси соединение с прямой или разветвленной цепью.

В 26^ом варианте осуществления первого аспекта, который также является вариантом осуществления четвертого, пятого, шестого, седьмого, восьмого, девятого, десятого, одиннадцатого, двенадцатого, 13^го, 14^го, 15^го, 16^го, 17^го, 18^го, 19^го, 20^го, 21^го, 22^го, 23^го, 24^го и 25^го варианта осуществления первого аспекта, полиалкокси соединение выбрано из группы, включающей полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, полибутиленгликоль, полиглицерин.

В 27^ом варианте осуществления первого аспекта, который также является вариантом осуществления четвертого, пятого, шестого, седьмого, восьмого, девятого, десятого, одиннадцатого, двенадцатого, 13^го, 14^го, 15^го, 16^го, 17^го, 18^го, 19^го, 20^го, 21^го, 22^го, 23^го, 24^го, 25^го и 26^го варианта осуществления первого аспекта, полиалкокси соединение представляет собой полиэтиленгликоль.

В 28^ом варианте осуществления первого аспекта, который также является вариантом осуществления четвертого, пятого, шестого, седьмого, восьмого, девятого, десятого, одиннадцатого, двенадцатого, 13^го, 14^го, 15^го, 16^го, 17^го, 18^го, 19^го, 20^го, 21^го, 22^го, 23^го, 24^го, 25^го, 26^го и 27^го варианта осуществления первого аспекта, полиалкокси соединение имеет молекулярную массу от 5000 до 100000 Да, предпочтительно от 20000 до 80000 Да, более предпочтительно 40000 Да.

Задача, лежащая в основе настоящего изобретения, решена во втором аспекте при помощи модифицированной молекулы нуклеиновой кислоты, полученной способом в соответствии с первым аспектом, включая любой вариант его осуществления.

Задача, лежащая в основе настоящего изобретения, решена в третьем аспекте при помощи модифицированной молекулы нуклеиновой кислоты, полученной способом в соответствии с первым аспектом, включая любой вариант его осуществления, для применения в терапии.

Задача, лежащая в основе настоящего изобретения, решена в четвертом аспекте при помощи модифицированной молекулы нуклеиновой кислоты, полученной способом в соответствии с первым аспектом, включая любой вариант его осуществления, для применения в диагностике.

Задача, лежащая в основе настоящего изобретения, решена в пятом аспекте путем использования модифицированной молекулы нуклеиновой кислоты, полученной способом в соответствии с первым аспектом, включая любой вариант его осуществления, в методе анализа образца in vitro.

Настоящее изобретение основано на неожиданной идентификации улучшенного протокола для полиалкоксилирования амино-модифицированных олигонуклеотидов, который обеспечивает возможность более эффективного получения полиалкоксилированных нуклеиновых кислот, известных из существующего уровня техники (Hoffmann et. al, Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry 2011, 4:4.46.1-4.46.30). Настоящее изобретение обеспечивает, в частности, способ получения полиалкоксилированных нуклеиновых кислот, который включает взаимодействие амино-модифицированной нуклеиновой кислоты с полиалкоксикарбоновой кислотой, активированной реагентом для конденсации непосредственно перед реакцией конъюгации. Кроме того, неожиданно было обнаружено, что полиалкоксикарбоновая кислота, используемая в избытке для доведения реакции до завершения, может быть извлечена во время последующей обработки, например, посредством УФ и/или ВЭЖХ очистки неочищенного продукта полиалкоксилирования. После сушки рециклированную полиалкоксикарбоновую кислоту использовали повторно для еще одной реакции полиалкоксилирования.

Способ по настоящему изобретению обладает рядом преимуществ по сравнению со способами предшествующего уровня техники. Более конкретно, способ по настоящему изобретению является менее трудоемким и более благоприятным для окружающей среды способом производства, позволяющим направлять в повторный цикл первое взаимодействующее вещество, содержащее карбоксильную группу, которое используют в избытке. Кроме того, получение первого взаимодействующего вещества, содержащего карбоксильную группу, требует меньших технологических стадий и, следовательно, является менее трудоемким, чем получение и выделение активированного карбоксильного взаимодействующего вещества, которое было описано в предшествующем уровне техники. Помимо этого, первое взаимодействующее вещество, содержащее карбоксильную группу, является более стабильным, чем активированная карбоксильная группа, описанная в предшествующем уровне техники, и не требует специальных условий хранения в холоде, что добавляет преимущества способу по настоящему изобретению.

В свете вышеизложенного и в соответствии с настоящим изобретением, саму полиалкоксикарбоновую кислоту можно использовать в качестве исходного вещества для реакции с амино-модифицированной молекулой нуклеиновой кислоты, такой как амино-модифицированный олигонуклеотид, для образования модифицированной молекулы нуклеиновой кислоты и модифицированного олигонуклеотида, соответственно, причем модификация предпочтительно представляет собой полиалкокси группу и более предпочтительно ПЭГ группу.

В одном варианте осуществления способа по настоящему изобретению активированное первое взаимодействующее вещество, полученное на стадии a) способа по настоящему изобретению, подвергают взаимодействию с амино-модифицированной молекулой нуклеиновой кислоты, при этом реакция осуществляется в растворе; элементы такого раствора включают указанное активированное первое взаимодействующее вещество и указанную амино-модифицированную молекулу нуклеиновой кислоты и растворитель, при этом растворитель выбран из группы, включающей воду и смесь смешиваемого с водой органического растворителя и воды. Предпочтительно активированное первое взаимодействующее вещество и/или амино модифицированную молекулу нуклеиновой кислоты растворяют или диспергируют в таком растворителе или части такого растворителя. Как предпочтительно используется в настоящей заявке, часть растворителя представляет собой одну фазу растворителя или одну из фаз, образованных растворителем.

В одном варианте осуществления способа по настоящему изобретению активированное первое взаимодействующее вещество добавляют к амино-модифицированной нуклеиновой кислоте, при этом, предпочтительно амино-модифицированная нуклеиновая кислота присутствует в растворе. В альтернативном варианте осуществления амино-модифицированную нуклеиновую кислоту, которая предпочтительно присутствует в растворе, добавляют к первому активированному взаимодействующему веществу, предпочтительно первому активированному взаимодействующему веществу стадии a).

В одном варианте осуществления способа по настоящему изобретению нуклеиновокислотная часть включает молекулу нуклеиновой кислоты.

В одном варианте осуществления способа по настоящему изобретению не-нуклеиновокислотная часть содержит карбоксильную группу.

В одном варианте осуществления способа по настоящему изобретению амино-модифицированная молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеиновокислотную часть и амино-модификацию, которая присоединена к нуклеиновокислотной части.

В одном варианте осуществления способа по настоящему изобретению амино-модифицированную молекулу нуклеиновой кислоты растворяют в воде или смеси смешиваемого с водой органического растворителя и воды перед взаимодействием амино-модифицированной молекулы нуклеиновой кислоты с первым взаимодействующим веществом. Соответственно, раствор, в котором амино-модифицированная молекула нуклеиновой кислоты присутствует до и после реакции с первым взаимодействующим веществом, различается, также в том, что касается раствора и растворителей, образующих такой раствор.

В одном варианте осуществления и как предпочтительно используется в настоящей заявке, углеводный фрагмент представляет собой фрагмент, включающий углевод или полимер из углеводов. Углеводный фрагмент включает, но не ограничивается этим, углевод, полимер из углеводов, гликопротеин, нуклеотид и нуклеиновую кислоту.

В одном варианте осуществления способа по настоящему изобретению амино-модифицированная иммуностимулирующая нуклеиновая кислота представляет собой амино-модифицированную иммуностимулирующую нуклеиновую кислоту.

В одном варианте осуществления способа по настоящему изобретению иммуностимулирующая нуклеиновая кислота представляет собой иммуностимулирующую нуклеиновую кислоту.

В одном варианте осуществления способа по настоящему изобретению аптамер представляет собой связывающуюся с мишенью нуклеиновую кислоту, которая предпочтительно связывается с мишенью через связывание, отличное от спаривания оснований по Уотсону-Крику или спаривания оснований по Хугстену. Предпочтительно, аптамер состоит из D-нуклеотидов. В альтернативном варианте осуществления, аптамер представляет собой смешанный аптамер, который включает как D-нуклеотиды, так и по меньшей мере один L-нуклеотид, причем предпочтительно, чтобы количество L-нуклеотидов в аптамере было меньше, чем количество D-нуклеотидов.

В одном варианте осуществления способа по настоящему изобретению, шпигельмер представляет собой связывающуюся с мишенью нуклеиновую кислоту из L-нуклеотидов, которая предпочтительно связывается с мишенью через связывание, отличное от спаривания оснований по Уотсону-Крику или спаривания оснований по Хугстену. Предпочтительно, шпигельмер состоит из L-нуклеотидов. В альтернативном варианте осуществления, шпигельмер представляет собой смешанный шпигельмер, который содержит как L-нуклеотиды, так и по меньшей мере один D-нуклеотид, причем предпочтительно, чтобы количество D-нуклеотидов в шпигельмере было меньше, чем количество L-нуклеотидов.

И аптамеры и шпигельмеры могут быть модифицированы. Такая модификация может быть связана с одним нуклеотидом нуклеотидной последовательности таких аптамеров и шпигельмеров и хорошо известна в данной области. Примеры такой модификации описаны, среди прочего, в Venkatesan et al. (Venkatesan, N., Kim, S.J., et al., Curr. Med. Chem. 10, 1973 (2003)) и Kusser (Kusser, W., J. Biotechnol. 74, 27 (2000)). Такая модификация может представлять собой атом H, атом F или группу OCH₃ или NH₂-группу в положении 2' отдельного нуклеотида, из которых состоит аптамер. Также, аптамер в соответствии с настоящим изобретением может включать по меньшей мере один закрытый нуклеотид (LNA) или незакрытый нуклеотид (UNA).

В одном варианте осуществления и как предпочтительно используется в настоящей заявке, температура окружающей среды означает 20°C-22°C.

В одном варианте осуществления способа по настоящему изобретению амино-модифицированная молекула нуклеиновой кислоты включает амино группу; предпочтительно, амино группа может взаимодействовать с карбоксильной группой, предпочтительно активированной карбоксильной группой.

В одном варианте осуществления способа по настоящему изобретению активированное первое взаимодействующее вещество представляет собой первое взаимодействующее вещество, которое было подвергнуто активации посредством реагента конденсации; предпочтительно, активированное первое взаимодействующее вещество представляет собой первое взаимодействующее вещество, включающее активированную карбоксильную группу, при этом активированная карбоксильная группа образуется из карбоксильной группы первого взаимодействующего вещества, подвергнутого активации посредством реагента конденсации.

Четвертичную аммониевую соль, используемую в варианте осуществления способа по настоящему изобретению, используют для повышения растворимости амино-модифицированной молекулы нуклеиновой кислоты в смеси воды и смешиваемого с водой органического растворителя. Она выбрана из группы, включающей тетраалкиламмоний хлорид, тетраалкиламмоний бромид, тетраалкиламмоний тетрафторборат, тетраалкилгексафторфосфат, тетраалкилгидросульфат, тетраалкилгидрофосфат, где алкил представляет собой алкильную цепь, состоящую из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17 или 18 C-атомов, где предпочтительно четвертичное аммониевое соединение представляет собой тетрабутиламмоний бромид.

В одном варианте осуществления способа по настоящему изобретению жирные кислоты включают насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты с одной или несколькими двойными связями. Как насыщенные, так и ненасыщенные жирные кислоты могут иметь длину цепи от 8 до 30 атомов углерода, то есть длину 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 атомов углерода.

В одном варианте осуществления способа по настоящему изобретению стероиды включают кортикостероиды, такие как холестерин, желчные кислоты, такие как холевая кислота и литохолевая кислота, стероидные гормоны, такие как кортизол или прогестерон, стероидные гликозиды, такие как дигоксигенин, и метаболиты вышеуказанных стероидов.

В одном варианте осуществления способа по настоящему изобретению основание, и предпочтительно ненуклеофильное основание, выбрано из группы, включающей триалкиламины, такие как диизопропилэтиламин (DIPEA), триметиламин, триизопропиламин, пералкилированные стерически затрудненные полиаминофосфазеновые основания, такие как t-Bu-P4, 1,8-диазабициклоундец-7-ен (DBU), 2,6-ди-трет-бутилпиридин, 1,8-бис(диметиламино)нафталин, литий тетраметилпиперидин, трет-бутоксид калия, 1,1,3,3-тетраметилгуанидин, 2,2,6,6-тетраметилпиперидин. В предпочтительном варианте осуществления основание представляет собой диизопропилэтиламин (DIPEA).

Способ полиалкоксилирования по настоящему изобретению можно применить к нуклеиновым кислотам, содержащим группы природных сахаров, например, 2'-дезоксирибонуклеиновым кислотам (далее в заявке ʺДНКʺ) и рибонуклеиновым кислотам (далее в заявке ʺРНКʺ), и нуклеиновым кислотам, содержащим модифицированные сахарные группы, модифицированные фосфатные группы или модифицированные нуклеиновые основания. Способ в соответствии с изобретением не ограничивается природным стереоизомером РНК и ДНК. Кроме того, полиалкоксилированные нуклеиновые кислоты, включающие зеркальное отображение ДНК (L-ДНК) или РНК (L-РНК), а также сахар-, фосфат- или нуклеотид-модифицированные L-ДНК или L-РНК, а также D/L-гибридные олигонуклеотиды и их модификации, можно получить способом в соответствии с настоящим изобретением. Модификации сахарной части включают изменение размера кольца (например, фураноза, гексоза), замещение, введение или удаление отдельных кольцевых атомов (например, карбасахара, азасахар), замещение, введение или удаление групп или атомов боковых цепей (например, 2'-F, 2'OMe), замещение кольца ациклическими или полициклическими производными (например, незакрытая нуклеиновая кислота, аминокислота, нуклеиновая кислота, закрытая нуклеиновая кислота, трициклическая нуклеиновая кислота), ориентацию или положение нуклеоснования (α-аномерная ориентация, гекситоловая нуклеиновая кислота). Олигонуклеотид также может состоять из одного или нескольких природных или неприродных фрагментов с удаленными азотистыми основаниями (например, тетрагидрофуран, этиленгликоль). Модифицированные фосфатные группы включают фосфоротиоаты, фосфородитиоаты, алкилфосфонаты, алкилфосфаты, фосфорамидаты и фосфортиоамидаты. Модификации нуклеиновых оснований могут встречаться в природе, такие как инозин, ксантин, 5,6-дигидроурацил или 5-метилцитозин, или быть искусственными модификациями, такими как C5-алкинилпиримидины, N-алкилированные пурины и пиримидины, C6- и/или C5-производные пиримидинов и пуринов и другие. Нуклеиновая кислота может также включать или состоять из одной или нескольких из вышеуказанных модификаций.

Способы для сборки нуклеиновых кислот хорошо известны в данной области. В вариантах осуществления нуклеиновые кислоты будут собраны фосфорамидитным методом, использующим ступенчатое связывание защищенных структурных элементов с образующейся нуклеиновой кислотой на твердой подложке (Beaucage et. al., Tetrahedron 1992, 48(12), 2223-2311). В предпочтительном варианте осуществления направление синтеза представляет собой направление от 3' к 5', но также применим обратный синтез в направлении от 5' к 3' (Srivastava et. al. Nucleic Acids Symposium Series 2008, 52, 103-104). Как только желаемая последовательность нуклеиновых кислот собрана и все необходимые модификации для последующей обработки введены, нуклеиновую кислоту отщепляют от твердой подложки и снимают защиту. Затем нуклеиновые кислоты могут быть очищены любым из способов, известных в данной области.

Обычно стадия отщепления и снятия защиты включает использование аммиака и/или алкиламина или солей аммония. Например, РНК отщепляют при помощи NH₃/MeNH₂, а затем NEt₃⋅HF или Bu₄NF. В случае последующего полиалкоксилирования, эти амины и соли аммония должны быть удалены, так как они приводят к нежелательным побочным реакциям, снижающим эффективность связывания в процессе полиалкоксилирования. Удаление групп амина осуществляют путем солевого обмена, который может быть осуществлен путем добавления больших количеств натриевых солей, с последующим осаждением или ультрафильтрацией или во время ИО-ВЭЖХ с использованием градиентов соли натрия для элюирования. После ИО-ВЭЖХ очистки также необходимо удаление избытка соли перед полиалкоксилированием. При необходимости можно применять множество различных методов. В предпочтительных вариантах осуществления перед полиалкоксилированием используют солевой обмен с последующей ультрафильтрацией. Положение амино-модификации во втором взаимодействующем веществе, и предпочтительно в амино-модифицированной молекуле нуклеиновой кислоты, такой как, например, олигонуклеотид, может быть на 3'-конце и/или 5'-конце и/или в любом положении между 3' концевым нуклеотидом и 5' концевым нуклеотидом второго взаимодействующего вещества, и предпочтительно амино-модифицированной молекулы нуклеиновой кислоты, такой как, например, олигонуклеотид. Амино модифицированные нуклеиновые кислоты, используемые в примерах для иллюстрации настоящего изобретения, синтезировали и очищали в соответствии с примерами 1-3.

Полиалкокси соединения, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают поли(этиленоксиды), поли(пропиленоксиды) и смешанные соединения поли(этиленоксид)/поли(пропиленоксид). Полиалкокси соединения предпочтительно имеют формулу: P_rO-(CH₂CH₂O-)_x-(CH₂CHRO-)_y-(CH₂CH₂O-)_zQ, где x, y и z каждый независимо имеет значение ноль или представляет собой положительное целое число, при условии, что по меньшей мере один из x, y и z не равен нолю; R представляет собой H или алкил, такой как C1, C2, C3 или C4 алкильная, предпочтительно метильная, группа, P_r представляет собой кэпирующую группу или метящую группу, и Q представляет собой группу, позволяющую связываться с олигонуклеотидом. Когда x, y или z не равны нулю, обычно они имеют значение до 1000. В некоторых вариантах осуществления x имеет значение от 3 до 1000, например от 100 до 500, и оба y и z равны нолю. В других вариантах осуществления x и y каждый независимо имеет значение от 3 до 1000, например от 100 до 500, и z имеет значение ноль. Еще в других вариантах осуществления x и z каждый независимо имеет значение от 3 до 500, например от 100 до 300, и y имеет значение от 3 до 1000, например от 100 до 500. Предпочтительно полиалкокси соединение кэпируют, например C1, C2, C3 или C4 алкильной, предпочтительно метильной, группой. Метящие группы, которые могут быть представлены как P_r, включают флуоресцеин и биотин или также любую другую реакционноспособную группу, такую как, например, тиол, малеимид, азид или алкин. Используемые полиалкокси соединения обычно идентифицируют по их приблизительной средней молекулярной массе и сокращенному химическому названию. (например, ПЭГ=поли(этиленгликоль); ППГ=поли(пропиленгликоль)). Полиалкокси соединение может быть линейным или разветвленным, и обычно имеет среднюю молекулярную массу от около 0,2 кД до около 60 кД, предпочтительно от около 2 кД до около 40 кД. Когда полиалкокси соединение является разветвленным, группа Q, позволяющая связываться с олигонуклеотидом, может содержать две или более полиалкокси групп. Например, Q может представлять собой лизин или эквивалентную группу, содержащую две полиалкокси группы, и реакционноспособную группу. В предпочтительном варианте осуществления способа по настоящему изобретению группа Q, позволяющая связываться с олигонуклеотидом, включает карбоновокислотный фрагмент. Предпочтительно, полиалкокси соединение представляет собой ПЭГ.

Образование амидной связи между карбоновой кислотой и амином, как предпочтительно реализовано в способе по настоящему изобретению между первым взаимодействующим веществом, включающим карбоксильную группу, и вторым взаимодействующим веществом, то есть амино-модифицированной молекулой нуклеиновой кислоты, включающей амино группу, представляет собой реакцию конденсации, которую можно осуществить при 160-180°C (Jursic, B. S.; Zdravkovski, Z. Synth. Commun. 1993, 23, 2761-2770). Однако высокая температура несовместима с олигонуклеотидами. Поэтому карбоновые кислоты активируют, например, в виде сложных эфиров. Сложные эфиры электроноакцепторных спиртов, таких как пара-нитрофенол (pNP), пентафторфенол, N-гидроксисукцинимид (NHS), гидроксибензотриазол (HOBt) и другие, проявляют повышенную электрофильность в карбонильном центре, что делает их доступными для реакции с широким спектром нуклеофилов. В соответствии с этим, этот тип спиртов является предпочтительным в вариантах осуществления способа по настоящему изобретению. Они взаимодействуют с аминами в мягких условиях с получением желаемого амида. Для конъюгации полиалкоксикарбоновых кислот с биомолекулами, такими как ДНК, РНК или белки, чаще всего используют N-гидроксисукцинимидные сложные эфиры (NHS-сложные эфиры).

Предпочтительно реакцию амино-модифицированных олигонуклеотидов с ПЭГ-NHS-сложными эфирами осуществляют в водных органических растворителях или растворах, включающих воду и смешиваемый с водой органический растворитель. Предпочтительные органические растворители являются апротонными полярными и включают, например, DMF, DMSO, NMP или ацетонитрил. Концентрация органического растворителя в растворах, включающих смешиваемый с водой органический растворитель, может варьироваться от около 10% до около 75%. Нуклеиновая кислота, такая как, например, олигонуклеотид, обычно используется или присутствует в слабощелочном водном растворе, который в равной степени относится ко второму реагенту в целом. Для достижения слабощелочных рН буферов, таких как бикарбонат натрия или борат натрия, можно также использовать ненуклеофильные третичные аминовые основания, такие как NEt₃ или DIPEA. Предпочтительно, pH раствора олигонуклеотида доводят до 8,5-9,5. При использовании ненуклеофильных аминов для забуферивания, это может быть достигнуто путем добавления основания в 2-5-кратном избытке по отношению к общему количеству фосфодиэфирных мостиков, обеспечиваемых присутствующим олигонуклеотидом. ПЭГ-NHS-сложный эфир используют в качестве раствора в смешиваемом с водой органическом растворителе, и он остается в растворе при добавлении к водному раствору олигонуклеотида. Молярные соотношения ПЭГ-NHS-сложного эфира и олигонуклеотида могут варьироваться от 1:1 до 5:1 на реакционноспособную аминогруппу, обеспечиваемую олигонуклеотидом, в зависимости от масштаба и реакционной способности. Добавление ПЭГ-NHS-сложного эфира предпочтительно продолжают до завершения реакции. После реакции возможно осуществление всех аналитических методов, доступных специалистам в данной области. В вариантах осуществления настоящего изобретения используют ОФ-ВЭЖХ для отслеживания реакции ПЭГилирования. Для достижения наилучшей конверсии температура может варьироваться от температуры окружающей среды до 45°C.

Вышеуказанные сложные эфиры полиалкоксикарбоновой кислоты и NHS или, более конкретно, ПЭГ-NHS сложные эфиры предпочтительно предварительно получают в отдельной реакции, а затем их очищают и хранят до их использования в способе по настоящему изобретению. NHS-сложные эфиры, например, получают путем взаимодействия карбоновой кислоты с NHS в присутствии конденсирующего агента, такого как карбодиимид, например, DCC, EDC или DIC. В химии пептидов существует огромное множество конденсирующих агентов для образования амидной связи между карбоновыми кислотами и аминами. Группа конденсирующих агентов содержит соли фосфония, такие как BOP, PyBOP, PyBrop, AOP, PyAOP, BrOP и PyClOP, соли урония, такие как HCTU, TCTU, TBTU, HBTU, HATU, TOTU и COMU и многие другие (C. A. G. N. Montalbetti, V. Falque Tetrahedron, 2005, 61, 10827-10852, Ayman El-Faham and Fernando Albericio, Chem. Rev., 2011, 111, (11), 6557-6602), которые все можно использовать в вариантах осуществления настоящего изобретения. Конденсирующий агент представляет собой реагент, который взаимодействует с карбоновой кислотой с образованием сложного эфира, который обладает высокой реакционной способностью по отношению к амину или другому нуклеофилу, обеспечивая, таким образом, возможность желаемой реакции конденсации в мягких условиях. Образование амидной связи в растворе и твердофазный пептидный синтез осуществляют в органических растворителях с низким содержанием воды, таких как DMF, NMP, DMSO, ACN или CH₂Cl₂. Однако олигонуклеотиды не растворимы в безводных органических растворителях.

Авторы настоящего изобретения также к удивлению обнаружили, что обычные реагенты для конденсации, указанные выше, можно использовать очень эффективно для активации ПЭГкарбоновой кислоты (ПЭГ-COOH) в контексте получения ПЭГилированных олигонуклеотидов, если активацию ПЭГ-COOH реагентом конденсации осуществляют в смешиваемом с водой органическом растворителе в течение периода времени от 0,5 мин до 60 мин, предпочтительно от 1 до 20 мин, после чего следует присоединение активированного ПЭГ к амино-модифицированному олигонуклеотиду в воде (см. Примеры 4-10). Фиг. 3 показывает типичную хроматограмму неочищенного 5'-аминомодифицированного L-РНК Шпигельмера NOX-E36 (5'-NH₂-NOX-E36, Таблица 1, номер 1) до ПЭГилирования при анализе методом A) ИО-ВЭЖХ и C) ОФ-ВЭЖХ. Типичная хроматограмма неочищенного 5'-NH₂-NOX-E36 после ПЭГилирования при помощи 40 кДа ПЭГ-COOH и конденсирующего реагента HBTU показана на Фиг. 3B и 3D, соответственно (пример 9). В представленных примерах ОФ-ВЭЖХ анализ показывает полную конверсию, если процент УФ-площади пика более медленно элюирующего продукта равен или несколько больше процента содержания полноразмерного продукта 5'-амино-модифицированного олигонуклеотида, обнаруженного методом ИО-ВЭЖХ. Например, неочищенный 5'-NH₂-NOX-E36, используемый в Примерах 4-10, показывает чистоту 47% полноразмерного продукта по данным ИО-ВЭЖХ. Неочищенный продукт содержит до 15% амино-модифицированных видов, которые не имеют желаемую нуклеотидную последовательность, таких как недостаточные и дополнительные последовательности, который также могут быть ПЭГилированы. Следовательно, в этом случае до 60% УФ-площади пика продукта по данным ОФ-ВЭЖХ можно отнести к полной конверсии (пример 5).

Сопоставимые результаты были достигнуты при использовании PyBOP, TBTU или COMU (примеры 4-7). Также было показано, что карбоновые кислоты малых молекул эффективно связаны с амино-модифицированными олигонуклеотидами. Как показано в примере 11, биотин активировали и связывали с 5'-NH2-NOX-A12 (таблица 1, номер 2) с очень высокой эффективностью. ИО-ВЭЖХ анализ неочищенного 5'-NH2-NOX-A12 до биотинилирования с использованием HBTU для предварительной активации показан на Фиг. 4А. ЖХ-МС и ИО-ВЭЖХ анализ полученного неочищенного 5'-биотин-NOX-A12 показан на Фиг. 4В и 4С и подтверждает правильную молекулярную массу и сдвиг времени удерживания, ожидаемый для биотинилированного продукта.

Кроме того, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что избыток ПЭГ-СООН, такой как 40 кДа ПЭГ-СООН, используемый для доведения реакции ПЭГилирования до завершения, может быть извлечен из неочищенной реакционной смеси либо ультрафильтрацией (пример 12), либо в процессе очистки ионообменной хроматографией (пример 15) неочищенного ПЭГилированного олигонуклеотида. После удаления малых молекул, содержащихся в реакционной смеси, таких как реагент для конденсации, органические растворители или соли, при помощи УФ и последующей сушки (пример 16), выделенный ПЭГ-СООН может быть повторно использован для ПЭГилирования амино-модифицированного олигонуклеотида (примеры 18, 19 и 22). ИО-ВЭЖХ анализ неочищенного 5'-NH2-NOX-A12 до ПЭГилирования показан на Фиг. 5А. Типичная ИО-хроматограмма неочищенного NOX-A12 после ПЭГилирования ʺсвежимʺ ПЭГ-COOH показана на Фиг. 5B. Типичная ИО-хроматограмма полученного очищенного ПЭГилированного продукта NOX-A12 показана на Фиг. 5C. Рециркулированный 40 кДа ПЭГ-COOH показал аналогичную высокую эффективность конъюгации по сравнению со ʺсвежимʺ ПЭГ-COOH (примеры 18, 19 и 17, соответственно). Выход и качество ПЭГилированного продукта были одинаково высокими для ʺсвежегоʺ и повторно используемого ПЭГ 40 кДа. На Фиг. 5C и 5E показан типичный ИО-ВЭЖХ анализ очищенного ПЭГилированного NOX-A12 после ПЭГилирования ʺсвежимʺ и ʺрециркулированнымʺ 40 кДа ПЭГ-COOH, соответственно.

Настоящее изобретение оказывается более эффективным, поскольку оно использует полиалкоксикарбоновые кислоты вместо NHS-сложных эфиров полиалкоксикарбоновых кислот для полиалкоксилирования молекул амино-модифицированных нуклеиновых кислот, таких как олигонуклеотиды. Способ является превосходным, поскольку он не требует какого-либо промежуточного получения и выделения какого-либо активированного NHS-эфира из полиалкоксикарбоновой кислоты, тем самым уменьшая количество общих стадий реакции. Кроме того, полиалкоксикарбоновая кислота более стабильна, и ее легче хранить, чем чувствительные к влаге сложные эфиры NHS полиалкоксикарбоновой кислоты. Кроме того, способ по изобретению обеспечивает экономичное повторное использование реагентов, которые обычно используются в избытке для доведения реакции до завершения.

В соответствии с этим, и в варианте осуществления способа по изобретению после завершения стадии b) в ее различных вариантах осуществления любое непрореагировавшее первое взаимодействующее вещество отделяют от реакционной смеси, предпочтительно методом ультрафильтрации и/или хроматографии, предпочтительно ионообменной хроматографии. В зависимости от природы избытка первого взаимодействующего вещества, непрореагировавшее вещество, то есть непрореагировавшее первое взаимодействующее вещество, может быть отделено от молекулы нуклеиновой кислоты и, более конкретно, от модифицированной молекулы нуклеиновой кислоты ультрафильтрацией (УФ) или хроматографией, предпочтительно от целевой модифицированной молекулы нуклеиновой кислоты. УФ является методом выбора, когда существует достаточно большая разница в гидродинамическом объеме, связанном с молекулярной массой, между первым взаимодействующим веществом и немодифицированной и модифицированной молекулой нуклеиновой кислоты. Альтернативно, ионообменную (ИО-ВЭЖХ) или обращенно-фазовую (ОФ-ВЭЖХ) хроматографию можно использовать в случае разницы в заряде или липофильности между первым взаимодействующим веществом и немодифицированной и модифицированной молекулой нуклеиновой кислоты. В случае незаряженных (нейтральных) первых взаимодействующих веществ, таких как полиалкокси соединения, стероиды, углеводы и жирные кислоты, ИО-ВЭЖХ является методом выбора, поскольку смола обладает более слабым сродством к первому взаимодействующему веществу, чем к нуклеиновой кислоте. В случае амфифильных пептидов, белков или гликопротеинов, можно использовать ИО-ВЭЖХ или ОФ-ВЭЖХ.

В рамках настоящего изобретения нуклеиновая кислота представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты. Настолько, насколько это возможно термины нуклеиновая кислота и молекула нуклеиновой кислоты используются в настоящей заявке синонимичным образом, если не указано иное. Кроме того, такая нуклеиновая кислота(кислоты) предпочтительно также указана в настоящей заявке как молекула(молекулы) нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением, нуклеиновая кислота(кислоты) в соответствии с настоящим изобретением, нуклеиновая кислота (кислоты) по изобретению или молекула(молекулы) нуклеиновой кислоты по изобретению. Кроме того, в рамках настоящего изобретения нуклеиновая кислота представляет собой олигонуклеотид. В свете этого, следует признать, что раскрытие настоящей заявки в той степени, в которой оно относится к олигонуклеотиду, в равной степени относится к любой нуклеиновой кислоте, и наоборот, если явно не указано иное. Кроме того, любое обсуждение, представленное в настоящей заявке, касающееся использования олигонуклеотида в способе по изобретению, в равной степени относится к первому взаимодействующему веществу и его применению в способе по изобретению.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к модифицированной молекуле нуклеиновой кислоты, полученной способом по настоящему изобретению.

Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к модифицированной молекуле нуклеиновой кислоты, полученной способом по изобретению, для применения в терапии. Такое применение в терапии включает введение модифицированной молекулы нуклеиновой кислоты нуждающемуся в этом субъекту. Таким субъектом предпочтительно является человек, который страдает от заболевания или подвержен риску заболевания. При таком применении модифицированная молекула нуклеиновой кислоты способна лечить такое заболевание или предотвращать такое заболевание.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к модифицированной молекуле нуклеиновой кислоты, полученной способом по изобретению, для использования в диагностике. Такая диагностика может быть диагностикой in vivo или диагностикой in vitro. В случае диагностики in vivo, модифицированную молекулу нуклеиновой кислоты вводят субъекту, который должен быть диагностирован. Таким субъектом предпочтительно является человек, который страдает от заболевания, подвержен риску заболевания, или когда имеются подозрения, что у него имеется или развивается такое заболевание. При таком использовании модифицированная молекула нуклеиновой кислоты способна связываться с биомаркером, ассоциированным с заболеванием.

Наконец, настоящее изобретение относится, еще в одном аспекте, к применению модифицированной молекулы нуклеиновой кислоты, полученной способом по изобретению, в методе анализа образца in vitro. Такой анализ образца предназначен для детекции присутствия или отсутствия аналита. Используемая для такого применения, молекула нуклеиновой кислоты способна связываться с аналитом.

Специалистами в данной области должно быть признано, что аналитические и диагностические применения модифицированной молекулы нуклеиновой кислоты, полученной способом по изобретению, может охватывать способы гибридизации нуклеиновых кислот in vitro или in vivo или связывания нуклеиновой кислоты с молекулой-мишенью in vitro или in vivo в случае аптамеров и детекцию гибридизованной или связанной нуклеиновой кислоты с помощью радиоактивности, поглощения света или излучения.

Синтетические применения включают использование нуклеиновых кислот в асимметричном катализе, кодированные нуклеиновыми кислотами библиотеки и аффинную хроматографию.

Специалистам в данной области должно быть понятно, что нуклеиновая кислота в соответствии с изобретением предпочтительно состоит из нуклеотидов, которые ковалентно связаны друг с другом, предпочтительно посредством фосфодиэфирных связующих звеньев или связей. Другими звеньями или связями, присутствующими в молекуле нуклеиновой кислоты как предмете настоящего изобретения, являются фосфотиоатные звенья и связи, соответственно, и фосфоамидатные звенья и связи, соответственно.

Должно быть понятно, что термины конденсирующий агент и агент конденсации используются в настоящей заявке как синонимы.

Должно быть понятно, что термины ʺпо изобретениюʺ и ʺпо настоящему изобретениюʺ используются в настоящей заявке как синонимы.

Должно быть понятно, что любые проценты, указанные в настоящей заявке, указаны как объем/объем (об/об).

Настоящее изобретение дополнительно иллюстрируется таблицей, чертежами и примерами, из которых могут быть очевидны дополнительные признаки, варианты осуществления и преимущества, где

Фиг. 1 схематически представляет способ в соответствии с настоящим изобретением;

Фиг. 2 показывает реагенты, способствующие введению реакционноспособных амино-групп в нуклеиновые кислоты;

Фиг. 3 A показывает ИО-ВЭЖХ анализ типичного неочищенного продукта синтеза 5'NH₂-NOX-E36 до ПЭГилирования;

Фиг. 3 B показывает ИО-ВЭЖХ анализ типичного неочищенного продукта синтеза 5'NH₂-NOX-E36 после ПЭГилирования;

Фиг. 3 C показывает ОФ-ВЭЖХ анализ типичного неочищенного продукта синтеза 5'NH₂-NOX-E36 до ПЭГилирования;

Фиг. 3 D показывает ОФ-ВЭЖХ анализ типичного неочищенного продукта синтеза 5'NH₂-NOX-E36 после ПЭГилирования;

Фиг. 4 A показывает ИО-ВЭЖХ анализ типичного неочищенного продукта синтеза 5'NH₂-NOX-A12 до конъюгации;

Фиг. 4 B показывает ЖХМС анализ типичного неочищенного продукта синтеза 5'NH₂-NOX-A12 после конъюгации с биотином;

Фиг. 4 C показывает ИО-ВЭЖХ анализ типичного неочищенного продукта синтеза 5'NH₂-NOX-A12 после конъюгации с биотином;

Фиг. 5 A показывает ИО-ВЭЖХ анализ типичного неочищенного продукта синтеза 5'NH₂-NOX-A12 до ПЭГилирования;

Фиг. 5 B показывает ИО-ВЭЖХ анализ типичного неочищенного продукта 5'NH₂-NOX-A12 после ПЭГилирования ʺсвежимʺ ПЭГ;

Фиг. 5 C показывает ИО-анализ типичного очищенного продукта 5'NH₂-NOX-A12 после ПЭГилирования ʺсвежимʺ ПЭГ;

Фиг. 5 D показывает ИО-ВЭЖХ анализ типичного неочищенного продукта 5'NH₂-NOX-A12 после ПЭГилирования ʺрециклированнымʺ ПЭГ; и

Фиг. 5 E показывает ИО-анализ типичного очищенного продукта 5'NH₂-NOX-A12 после ПЭГилирования ʺрециклированнымʺ ПЭГ.

Таблица 1
Последовательности нуклеиновых кислот, используемых для демонстрации способа в соответствии с настоящим изобретением No Последовательность Длина Тип Модификация Название 1 5′-rG-rC-rA-rC-rG-rU-rC-rC-rC-rU-rC-rA-rC-rC-rG-rG-rU-rG-rC-rA-rA-rG-rU-rG-rA-rA-rG-rC-rC-rG-rU-rG-rG-rC-rU-rC-rU-rG-rC-rG-3′ 40 нуклеотидов L-РНК 5' 40 кДа ПЭГ через аминогексил-линкер NOX-E36 2 5′-rG-rC-rG-rU-rG-rG-rU-rG-rU-rG-rA-rU-rC-rU-rA-rG-rA-rU-rG-rU-rA-LrU-LrU-LrG-LrG-LrC-LrU-LrG-LrA-LrU-LrC-rC-LrU-rA-rG-rU-rC-LrA-rG-rG-rU-rA-LrC-rG-rC-3' 45 нуклеотидов L-РНК 5' 40 кДа ПЭГ через аминогексил-линкер NOX-A12

Пример 1: Синтез РНК

РНК шпигельмеры получали твердофазным синтезом с использованием синтезатора ÄktaPilot100 (GE Healthcare, Freiburg) в колонке с фиксированным объемом 48 мл с использованием 2'-TBDMS РНК фосфорамидитной химии (Damha and Ogilvie, Methods in Molecular Biology, 1993, 81-114, The Humana Press Inc., Totowa, New Jersey.). L-rA(N-Bz)-, L-rC(Ac)-, L-rG(N-ibu)- и L-rU-фосфорамидиты закупали у ChemGenes (Wilmington, MA, USA). 5'-амино-модификатор amC6 закупали у ChemGenes (Wilmington, MA, USA). Синтез амино-модифицированного шпигельмера начинали на L-riboG или L-rib°C модифицированных CPG с размером пор 600 Å (Prime Synthesis, Aston, PA, USA). Можно использовать альтернативные 3'амино(TFA)-модифицированные CPG с размером пор 1000 Å (ChemGenes, Wilmington, MA, USA). Для связывания (12 мин на цикл) использовали 0,6 M этилтиотетразола (Azide Chemical Co., Ltd, Anzhen, Wuxi, CN) в ацетонитриле и 1,5-4 эквивалентов раствора 0,2 M соответствующего фосфорамидита в ацетонитриле. Использовали цикл кэпирования-окисления. Стандартные растворители и реагенты для синтеза олигонуклеотидов закупали у Biosolve (Valkenswaard, NL), Proligo (Hamburg, D), VWR (Karlsruhe, D) или Sigma Aldrich (Taufkirchen, D). Были синтезированы шпигельмеры 5'-MMT-ON. Отщепление и снятие защиты осуществляли в соответствии с Wincott et al. (Wincott, Nucleic Acids Research 1995, 23(14), 2677-2684) с незначительными изменениями. Более подробно, после завершения автоматического синтеза CPG-связанный олигонуклеотид (700 мкмоль) быстро сушили и переносили в стеклянную бутыль. Добавляли 200 мл водного раствора MeNH₂ (40%) и суспензию осторожно взбалтывали при комнатной температуре. Через 90 мин суспензию фильтровали и остаточный CPG промывали несколько раз водным раствором EtOH (50%). Объединенные фильтраты концентрировали и в завершение лиофилизировали досуха. Для удаления 2'-TBDMS групп сухой неочищенный продукт растворяли в 120 мл DMSO, затем 60 мл NEt₃ и 80 мл NEt₃⋅3HF. Эту смесь осторожно взбалтывали при 65°C в течение 2 часов. После отщепления 2'-TBDMS групп реакцию гасили путем добавления 1 л ледяной воды. Удаление MMT-группы осуществляли путем добавления уксусной кислоты (25 мл). Затем шпигельмер обессоливали методом тангенциальной поточной фильтрации с использованием 2кДа регенерированной целлюлозной мембраны (Sartorius, Göttingen, D). Для солевого обмена добавляли 3 л раствора 0,25 M NaCl и раствор обессоливали методом тангенциальной поточной фильтрации. В завершение, продукт собирали и сушили лиофилизацией.

Пример 2: Синтез 5'NH₂-NOX-E36 (1 пре-ПЭГ)

Применяя процедуру, описанную в примере 1, 10,2 г L-rG CPG (600 Å, 70 мкмоль/г, 711 мкмоль) использовали для сборки 5'NH₂-NOX-E36 (1 пре-ПЭГ) с 2 экв. амидита на цикл нуклеотидного связывания. Выход после УФ: 150732 OD, Чистота: 47%, Масса: 12997 Да (найдено), 12996 Да (рассчитано).

Пример 3: Синтез 5'NH₂-NOX-A12 (2 пре-ПЭГ)

Применяя процедуру, описанную в примере 1, 1,7 г L-rC CPG (600 Å, 72 мкмоль/г, 123 мкмоль) использовали для сборки 5'NH₂-NOX-A12 (2 пре-ПЭГ) с 2,5 экв. амидита на цикл нуклеотидного связывания. Выход после УФ: 23985 OD, Чистота: 52%, Масса: 14656 Да (найдено), 14656 Да (рассчитано).

Пример 4: ПЭГилирование 5'NH₂-NOX-E36 с использованием PyBOP для активации и DMF в качестве сорастворителя

К раствору 1000 OD (40 мг, 1,54 мкмоль) 5'NH₂-NOX-E36 (1 пре-ПЭГ) в 1 мл воды добавляли раствор 193 мг (600 мкмоль) Bu₄NBr в 750 мл DMF с последующим добавлением 69 мкл (52 мг, 405 мкмоль) DIPEA. В другом реакционном сосуде 92 мг (2,31 мкмоль) 40 кДа ПЭГ-COOH (JenKem Technology, Allen, TX, USA) растворяли в 2,5 мл DMF. К раствору ПЭГ добавляли 1,8 мг (3,5 мкмоль) PyBOP в 60 мкл DMF с последующим добавлением 6,0 мкл (4,6 мг, 35 мкмоль) DIPEA. Раствор ПЭГ затем тщательно перемешивали вихревым способом и добавляли к раствору олигонуклеотида через 2 минуты. Реакционную смесь осторожно взбалтывали в течение 30 минут. Мониторинг реакции методом ОФ-ВЭЖХ показал конверсию 52%.

Пример 5: ПЭГилирование 5'NH₂-NOX-E36 с использованием PyBOP для активации и DMSO в качестве сорастворителя

К раствору 1000 OD (40 мг, 1,54 мкмоль) 5'NH₂-NOX-E36 (1 пре-ПЭГ) в 1 мл воды добавляли раствор 193 мг (600мкмоль) Bu₄NBr в 2 мл DMSO с последующим добавлением 69 мкл (52 мг, 405 мкмоль) DIPEA. В другом реакционном сосуде 92 мг (2,31 мкмоль) 40 кДа ПЭГ-COOH (JenKem Technology, Allen, TX, USA) растворяли в 0,5 мл ACN. К раствору ПЭГ добавляли 1,8 мг (3,5 мкмоль) PyBOP в 60 мкл ACN с последующим добавлением 6,0 мкл (4,6 мг, 35 мкмоль) DIPEA. Раствор ПЭГ затем тщательно перемешивали вихревым способом и добавляли к раствору олигонуклеотида через 2 минуты. Реакционную смесь осторожно взбалтывали в течение 30 минут. Мониторинг реакции методом ОФ-ВЭЖХ показал конверсию 60%.

Пример 6: ПЭГилирование 5'NH₂-NOX-E36 с использованием TBTU для активации

К раствору 1000 OD (40 мг, 1,54) 5'NH₂-NOX-E36 (1 пре-ПЭГ) в 1 мл воды добавляли раствор 193 мг (600 мкмоль) Bu₄NBr в 2 мл DMSO с последующим добавлением 69 мкл (52 мг, 405 мкмоль) DIPEA. В другом реакционном сосуде 92 мг (2,31 мкмоль) 40 кДа ПЭГ-COOH (JenKem Technology, Allen, TX, USA) растворяли в 0,5 мл ACN. К раствору ПЭГ добавляли 1,1 мг (3,5 мкмоль) TBTU в 60 мкл ACN с последующим добавлением 6,0 мкл (4,6 мг, 35 мкмоль) DIPEA. Раствор ПЭГ затем тщательно перемешивали вихревым способом и добавляли к раствору олигонуклеотида через 2 минуты. Реакционную смесь осторожно взбалтывали в течение 30 минут. Мониторинг реакции методом ОФ-ВЭЖХ показал конверсию 59%.

Пример 7: ПЭГилирование 5'NH₂-NOX-E36 с использованием COMU для активации

К раствору 1000 OD (40 мг, 1,54 мкмоль) 5'NH₂-NOX-E36 (1 пре-ПЭГ) в 1 мл воды добавляли раствор 193 мг (600 мкмоль) Bu₄NBr в 2 мл DMSO с последующим добавлением 69 мкл (52 мг, 405 мкмоль) DIPEA. В другом реакционном сосуде 92 мг (2,31 мкмоль) 40 кДа ПЭГ-COOH (JenKem Technology, Allen, TX, USA) растворяли в 0,5 мл ACN. К раствору ПЭГ добавляли 1,5 мг (3,5 мкмоль) COMU в 60 мкл ACN с последующим добавлением 6,0 мкл (4,6 мг, 35 мкмоль) DIPEA. Раствор ПЭГ затем тщательно перемешивали вихревым способом в течение 2 минут и добавляли к раствору олигонуклеотида. Реакционную смесь осторожно взбалтывали в течение 30 минут. Мониторинг реакции методом ОФ-ВЭЖХ показал конверсию 45%.

Пример 8: ПЭГилирование 5'NH₂-NOX-E36 в присутствии Bu₄NBr с использованием HBTU для активации

К раствору 1000 OD (40 мг, 1,54 мкмоль) 5'NH₂-NOX-E36 (1 пре-ПЭГ) в 1 мл воды добавляли раствор 193 мг (600 мкмоль) Bu₄NBr в 2 мл DMSO с последующим добавлением 69 мкл (52 мг, 405 мкмоль) DIPEA. В другом реакционном сосуде 92 мг (2,31 мкмоль) 40 кДа ПЭГ-COOH (JenKem Technology, Allen, TX, USA) растворяли в 0,5 мл ACN. К раствору ПЭГ добавляли 1,3 мг (3,5 мкмоль) HBTU в 7,5 мкл ACN с последующим добавлением 6,0 мкл (4. 6 мг, 35мкмоль) DIPEA. Раствор ПЭГ затем тщательно перемешивали вихревым способом в течение 5 минут и добавляли к раствору олигонуклеотида. Реакционную смесь осторожно взбалтывали в течение 30 минут. Мониторинг реакции методом ОФ-ВЭЖХ показал конверсию 42%.

Пример 9: ПЭГилирование 5'NH₂-NOX-E36 без Bu₄NBr с использованием HBTU для активации

К раствору 6000 OD (240 мг, 9,23 мкмоль) 5'NH₂-NOX-E36 (1 пре-ПЭГ) в 6 мл воды добавляли 12 мл DMSO с последующим добавлением 414 мкл (307 мг, 2,38 ммоль) DIPEA. В другом реакционном сосуде 554 мг (13,8 мкмоль) 40 кДа ПЭГ-COOH (JenKem Technology, Allen, TX, USA) растворяли в 2,5 мл ACN. К раствору ПЭГ добавляли 7,85 мг (20,7 мкмоль) HBTU в 100 мкл ACN с последующим добавлением 36,0 мкл (26,8 мг, 207 мкмоль) DIPEA. Раствор ПЭГ затем тщательно перемешивали вихревым способом в течение 5 минут и добавляли к раствору олигонуклеотида. Реакционную смесь осторожно взбалтывали в течение 30 минут. Мониторинг реакции методом ОФ-ВЭЖХ показал конверсию 45,5%.

Пример 10: ПЭГилирование 5'NH₂-NOX-A12 без Bu₄NBr с использованием HBTU для активации

К раствору 15966 OD (638 мг, 19,6 мкмоль, 50% FLP) 5'NH₂-NOX-A12 (2 пре-ПЭГ) в 16 мл воды добавляли 32 мл DMSO с последующим добавлением 1,12 мл DIPEA. В другом реакционном сосуде 1,97 г (49,3 мкмоль) 40 кДа ПЭГ-COOH (JenKem Technology, Allen, TX, USA) растворяли в 8 мл ACN. К раствору ПЭГ добавляли 19,9 мг (52,5 мкмоль) HBTU в 200 мкл ACN с последующим добавлением 83 мкл DIPEA. Раствор ПЭГ затем тщательно перемешивали вихревым способом в течение 5 минут и добавляли к раствору олигонуклеотида. Реакционную смесь осторожно взбалтывали в течение 30 минут. Мониторинг реакции методом ОФ-ВЭЖХ показал конверсию 58%.

Пример 11: Биотинилирование 5'NH₂-NOX-A12 с использованием HBTU для активации

К раствору 200 OD (8 мг, 0,237 мкмоль, 50% FLP) 5'NH₂-NOX-A12 (2 пре-ПЭГ) в 200 мкл воды добавляли 400 мкл DMSO с последующим добавлением 12,5 мл DIPEA. В другом реакционном сосуде 0,167 мг (0,683мкмоль) биотина растворяли в 90 мкл DMSO. К раствору биотина добавляли 0,259 мг (0,683 мкмоль) HBTU в 10 мкл ACN с последующим добавлением 1,8 мкл DIPEA. Раствор биотина затем тщательно перемешивали вихревым способом в течение 1 минуты и добавляли к раствору олигонуклеотида. Реакционную смесь осторожно взбалтывали в течение 30 минут. Мониторинг реакции методом ОФ-ВЭЖХ показал конверсию 55%. Неочищенный продукт осаждали путем добавления 20 мкл раствора 3 M ацетата натрия и 10мл EtOH и хранили при -20°C в течение 2 часов. Осадок собирали центрифугированием (4000g) и декантацией. Осадок после центрифугирования растворяли в воде и обессоливали при помощи эксклюзионной хроматографии с получением 159 OD (6,4 мг, 0,192 мкмоль) биотинилированного NOX-A12 с чистотой 45% по данным ИО-ВЭЖХ, МС: 14883 Да (рассчитано), 14883 Да (найдено).

Пример 12: УФ-Рециклирование избытка 40 кДа ПЭГ-COOH после ПЭГилирования 5'NH₂-NOX-A12

Аликвоту 7983 OD неочищенного продукта ПЭГилирования NOX-A12, полученного в соответствии с примером 10, подвергали тангенциальной поточной ультрафильтрации (УФ) с использованием регенерированной целлюлозной мембраны с отсечением по молекулярной массе (MWCO) 30 кДа (Sartorius, Göttingen, D). Давление насоса устанавливали на 1 бар и 10 л воды использовали в качестве подаваемого раствора. Концентрат собирали и лиофилизировали с получением 0,87 г (7264 OD) бесцветного твердого вещества. Фильтрат затем концентрировали и обессоливали методом тангенциальной поточной фильтрации с использованием регенерированной целлюлозной мембраны с отсечением 2кДа (Sartorius, Göttingen, D). Давление насоса устанавливали на 1 бар и воду использовали в качестве подаваемого раствора. Способ продолжали до тех пор, пока фильтрат не показал проводимость меньше чем 20 мкСм/см. Концентрат собирали и лиофилизировали с получением 0,51 г 40 кДа ПЭГ-COOH в виде бесцветного твердого вещества.

Пример 13: Ультрафильтрация неочищенной смеси ПЭГилирования NOX-A12

Еще одну аликвоту 7983 OD неочищенного продукта NOX-A12 ПЭГилирования, полученного в соответствии с примером 10, подвергали тангенциальной поточной ультрафильтрация (УФ) с использованием регенерированной целлюлозной мембраны с отсечением по молекулярной массе 2 кДа (Sartorius, Göttingen, D). Давление насоса устанавливали на 1 бар и 10 л воды использовали в качестве подаваемого раствора. Концентрат собирали и лиофилизировали с получением 1,38 г (7829 OD) бесцветного твердого вещества.

Пример 14: ИО-ВЭЖХ очистка и последующая УФ ПЭГилированного NOX-A12

Неочищенный NOX-A12 продукт 0,87г (7264 OD), полученный в примере 12, затем очищали ИО-ВЭЖХ хроматографией. Водный раствор 6000 OD образца загружали в 12 мл ИО-ВЭЖХ колонку TOSOH Super Q5PW (500 OD/мл смолы, 50°C) и элюировали при 50°C с использованием градиента следующей буферной системы (буфер A: 25 мМ Na₂HPO₄, pH 7,5, 10% ACN; буфер B: 25 мМ Na₂HPO₄, 1 M NaBr, pH 7,5, 10% ACN; градиент: 5% B до 35%B в 25 кол.об.). Все содержащие продукт фракции (>75% FLP по данным ИО-ВЭЖХ) объединяли (842 OD), обессоливали методом УФ с использованием регенерированной целлюлозной мембраны с отсечением по молекулярной массе 5 кДа (Millipore, Bedford, MA) и в завершение лиофилизировали. Выход: 801 OD, 76% FLP.

Пример 15: ИО-ВЭЖХ-Рециклирование избытка 40 кДа ПЭГ-COOH после ПЭГилирования 5'NH₂-NOX-A12

Неочищенный продукт NOX-A12 (1,38г, 7829 OD), полученный в примере 13, затем очищали ИО-ВЭЖХ хроматографией. Водный раствор 6000 OD образца загружали в 12 мл ИО-ВЭЖХ колонку TOSOH Super Q5PW (500 OD/мл смолы, 50°C) и элюировали при 50°C с использованием градиента следующей буферной системы (буфер A: 25 мМ Na₂HPO₄, pH 7,5, 10% ACN; буфер B: 25 мМ Na₂HPO₄, 1 M NaBr, pH 7,5, 10% ACN; градиент: 5% B до 35%B в 25 кол.об.). В процессе загрузки и промывки после загрузки с использованием 2 кол.об. проточную фракцию собирали, обессоливали с использованием регенерированной целлюлозной мембраны с отсечением по молекулярной массе 2 кДа (Sartorius, Göttingen, D) и лиофилизировали с получением 410 мг бесцветного твердого вещества 40 кДа ПЭГ-COOH. Все содержащие продукт фракции (>75% FLP по данным ИО-ВЭЖХ) объединяли (1004 OD), обессоливали методом УФ с использованием регенерированной целлюлозной мембраны с отсечением по молекулярной массе 5кДа (Millipore, Bedford, MA) и в завершение лиофилизировали. Выход: 1042 OD, 76% FLP.

Пример 16: Сушка рециклированного 40 кДа ПЭГ-COOH для последующего использования в ПЭГилировании 5'NH₂-NOX-A12

40 кДа ПЭГ-COOH, выделенный ИО-ВЭЖХ хроматографией или тангенциальной проточной фильтрацией, как описано в примерах 12 и 15, растворяли в ацетонитриле (20 мл/г) и хранили над осушающими слоями из молекулярных сит в течение ночи для удаления какой-либо остаточной воды. Молекулярные сита удаляли и раствор ПЭГ концентрировали при пониженном давлении.

Пример 17: ПЭГилирование 5'NH₂-NOX-A12 с использованием ʺсвежегоʺ 40 кДа ПЭГ-COOH и HBTU для активации

К раствору 100 OD (4 мг, 0,14 мкмоль, 50% FLP) 5'NH₂-NOX-A12 (2 пре-ПЭГ) в 100 мкл воды добавляли 200 мкл DMSO с последующим добавлением 7,5 мл DIPEA. В другом реакционном сосуде 13,7 мг (0,34 мкмоль) ʺсвежегоʺ 40 кДа ПЭГ-COOH (JenKem Technology, Allen, TX, USA) растворяли в 60 мкл ACN. К раствору ПЭГ-COOH добавляли 0,13 мг (0,34 мкмоль) HBTU в 10 мкл ACN с последующим добавлением 0,6 мкл DIPEA. Раствор ПЭГ тщательно перемешивали вихревым способом в течение 5 минут и добавляли к раствору олигонуклеотида. Реакционную смесь осторожно взбалтывали в течение 30 минут. Мониторинг реакции методом ОФ-ВЭЖХ показал конверсию 43%.

Пример 18: ПЭГилирование 5'NH₂-NOX-A12 с использованием ʺУФ-выделенногоʺ 40 кДа ПЭГ-COOH и HBTU для активации

К раствору 100 OD (4 мг, 0,14 мкмоль, 50% FLP) 5'NH₂-NOX-A12 (2 пре-ПЭГ) в 100 мкл воды добавляли 200 мкл DMSO с последующим добавлением 7,5 мл DIPEA. В другом реакционном сосуде 13,7 мг (0,34 мкмоль) ʺУФ-выделенногоʺ и высушенного (полученного, как описано в примере 12 и 16) 40 кДа ПЭГ-COOH растворяли в 60 мкл ACN. К раствору ПЭГ добавляли 0,13 мг (0,340 мкмоль) HBTU в 10 мкл ACN с последующим добавлением 0,6 мкл DIPEA. ПЭГ-COOH раствор тщательно перемешивали вихревым способом в течение 5 минут и добавляли к раствору олигонуклеотида. Реакционную смесь осторожно взбалтывали в течение 30 минут. Мониторинг реакции методом ОФ-ВЭЖХ показал конверсию 48%.

Пример 19: ПЭГилирование 5'NH₂-NOX-A12 с использованием ʺИО-ВЭЖХ-выделенногоʺ 40 кДа ПЭГ-COOH и HBTU для активации

К раствору 100 OD (4 мг, 0,14 мкмоль, 50% FLP) 5'NH₂-NOX-A12 (2 пре-ПЭГ) в 100 мкл воды добавляли 200 мкл DMSO с последующим добавлением 7,5 мл DIPEA. В другом реакционном сосуде 13,7 мг (0,34 мкмоль) ʺИО-ВЭЖХ-выделенногоʺ и высушенного (полученного, как описано в примерах 15 и 16) 40 кДа ПЭГ-COOH растворяли в 60 мкл ACN. К раствору ПЭГ добавляли 0,13 мг (0,34 мкмоль) HBTU в 10 мкл ACN с последующим добавлением 0,6 мкл DIPEA. ПЭГ-COOH раствор тщательно перемешивали вихревым способом в течение 5 минут и добавляли к раствору олигонуклеотида. Реакционную смесь осторожно взбалтывали в течение 30 минут. Мониторинг реакции методом ОФ-ВЭЖХ показал конверсию 47%.

Пример 20: Твердофазный синтез 5'NH₂-NOX-A12

Применяя процедуру, описанную в примере 1, 1,70 г L-rC CPG (600 Å, 72 мкмоль/г, 122 мкмоль) использовали для сборки 5'NH₂-NOX-A12 (2 пре-ПЭГ) с 2,5 экв. амидита на цикл нуклеотидного связывания. Выход после снятия защиты и УФ: 23378 OD, Чистота: 49%, Масса: 14656 Да (найдено), 14656 Да (рассчитано).

Пример 21: ПЭГилирование 5'NH₂-NOX-A12 ʺсвежимʺ 40 кДа ПЭГ-COOH и последующая обработка для получения NOX-A12

К раствору 6000 OD (240 мг, 7,86 мкмоль, 48% FLP) 5'NH₂-NOX-A12 (2 пре-ПЭГ, синтезированный в соответствии с примером 20, в 6 мл воды добавляли 12 мл DMSO с последующим добавлением 0,42 мл DIPEA. В другом реакционном сосуде 628 мг (15,7 мкмоль) 40 кДа ПЭГ-COOH (JenKem Technology, Allen, TX, USA) растворяли в 2,55 мл ACN. К раствору ПЭГ добавляли 5,96 мг (15,7мкмоль) HBTU в 50 мкл ACN с последующим добавлением 40 мкл DIPEA. Раствор ПЭГ тщательно перемешивали вихревым способом в течение 5 минут и добавляли к раствору олигонуклеотида. Реакционную смесь осторожно взбалтывали в течение 30 минут. Мониторинг реакции методом ОФ-ВЭЖХ показал конверсию 39%. Дополнительную аликвоту 0,5 экв. ПЭГ-COOH получали путем растворения 157 мг (1,97 мкмоль) 40 кДа ПЭГ-COOH (JenKem Technology, Allen, TX, USA) в 0,7 мл ACN. К раствору ПЭГ добавляли 1,49 мг (1,97 мкмоль) HBTU в 12,5 мкл ACN с последующим добавлением 10 мкл DIPEA. Раствор ПЭГ тщательно перемешивали вихревым способом в течение 5 минут и добавляли к раствору олигонуклеотида. Реакционную смесь осторожно взбалтывали в течение 30 минут. Возобновленный мониторинг реакции методом ОФ-ВЭЖХ показал конверсию 52%. Еще одно добавление 0,5 экв. активированного ПЭГ-COOH привело к конверсии 58% через дополнительные 30 минут. Реакцию останавливали путем разбавления в 500 мл вода и подвергали тангенциальной поточной фильтрации с использованием регенерированной целлюлозной мембраны с отсечением по молекулярной массе 30 кДа (Sartorius, Göttingen, D). Давление насоса устанавливали на 1 бар и 20 л воды использовали в качестве подаваемого раствора. Концентрат собирали с получением 5581 OD. Неочищенный NOX-A12 продукт затем очищали ИО-ВЭЖХ хроматографией. Продукт загружали в 12 мл ИО-ВЭЖХ колонку TOSOH Super Q5PW (500 OD/мл смолы, 50°C) и элюировали при 50°C с использованием градиента следующей буферной системы (буфер A: 25 мМ Tris, pH 7,5, 10% ACN; буфер B: 25 мМ Tris, 2 M NaCl, pH 7,5, 10% ACN; градиент: 5% B до 35%B в 25 кол.об.). Все содержащие продукт фракции (>75% FLP по данным ИО-ВЭЖХ) объединяли, обессоливали методом УФ с использованием регенерированной целлюлозной мембраны с отсечением по молекулярной массе 2 кДа(Millipore, Bedford, MA) и в завершение лиофилизировали. Выход: 1474 OD, 75% FLP.

Пример 22: ПЭГилирование 5'NH₂-NOX-A12 с использованием ʺИО-ВЭЖХ-выделенногоʺ 40 кДа ПЭГ-COOH и последующей обработкой для получения NOX-A12

К раствору 6000 OD (240 мг, 7,86 мкмоль, 48%FLP) 5'NH₂-NOX-A12 (2 пре-ПЭГ, синтезированный в соответствии с примером 20) в 6 мл воды добавляли 12 мл DMSO с последующим добавлением 0,42 мл DIPEA. В другом реакционном сосуде 628 мг (15,7мкмоль) ʺИО-ВЭЖХ выделенногоʺ и высушенного 40 кДа ПЭГ-COOH (полученного, как описано в примерах 15 и 16) растворяли в 2,55 мл ACN. К раствору ПЭГ добавляли 5,96 мг (15,7мкмоль) HBTU в 50 мкл ACN с последующим добавлением 40 мкл DIPEA. Раствор ПЭГ тщательно перемешивали вихревым способом в течение 5 минут, затем его добавляли к раствору олигонуклеотида. Реакционную смесь осторожно взбалтывали в течение 30 минут. Мониторинг реакции методом ОФ-ВЭЖХ показал конверсию 29%. Дополнительную аликвоту 0,5 экв. ПЭГ-COOH получали путем растворения 157мг (1,97мкмоль) ʺИО-выделенногоʺ и высушенного 40 кДа ПЭГ-COOH в 0,7 мл ACN. К раствору ПЭГ добавляли 1,49 мг (1,97мкмоль) HBTU в 12,5 мкл ACN с последующим добавлением 10 мкл DIPEA. Раствор ПЭГ тщательно перемешивали вихревым способом в течение 5 минут и добавляли к раствору олигонуклеотида. Реакционную смесь осторожно взбалтывали в течение 30 минут. Возобновленный мониторинг реакции методом ОФ-ВЭЖХ показал конверсию 37%. Второе и третье добавление 0,5 экв. активированного ʺИО-выделенногоʺ и высушенного ПЭГ-COOH привело к конверсии 45% и 52% через дополнительные 30 минут. Реакцию останавливали путем разбавления в 500 мл воды и подвергали тангенциальной поточной фильтрации с использованием регенерированной целлюлозной мембраны с отсечением по молекулярной массе 30кДа (Sartorius, Göttingen, D). Давление насоса устанавливали на 1 бар и 20 л воды использовали в качестве подаваемого раствора. Концентрат собирали и лиофилизировали с получением 5711 OD. Неочищенный NOX-A12 продукт затем очищали ИО-ВЭЖХ хроматографией. Продукт загружали в 12 мл ИО-ВЭЖХ колонку TOSOH Super Q5PW (500 OD/мл смолы, 50°C) и элюировали при 50°C с использованием градиента следующей буферной системы (буфер A: 25 мМ Tris, pH 7,5, 10% ACN; буфер B: 25 мМ Tris, 2 M NaCl, pH 7,5, 10% ACN; градиент: 5% B до 35%B в 25 кол.об.). Все содержащие продукт фракции (>75% FLP по данным ИО-ВЭЖХ) объединяли, обессоливали методом УФ с использованием регенерированной целлюлозной мембраны с отсечением по молекулярной массе 2 кДа(Millipore, Bedford, MA) и в завершение лиофилизировали. Выход: 1242 OD, 70% FLP.

Характерные признаки настоящего изобретения, раскрытые описании, формуле изобретения и/или чертежах, могут как отдельно, так и в любой их комбинации представлять собой материал для реализации изобретения в его различных формах.

Изобретение относится к способу получения модифицированного олигонуклеотида, включающего олигонуклеотидную часть и полиалкокси часть, применяемого в терапевтических целях. Способ включает: a) активирование карбоксильной группы первого взаимодействующего вещества, включающего полиалкокси часть и карбоксильную группу, реагентом конденсации в смешиваемом с водой органическом растворителе; и b) взаимодействие активированной карбоксильной группы первого взаимодействующего вещества с аминогруппой второго взаимодействующего вещества с получением модифицированного олигонуклеотида. Второе взаимодействующее вещество представляет собой аминомодифицированный олигонуклеотид, включающий олигонуклеотидную часть и аминомодификацию, содержащую аминогруппу, которое предварительно растворяют в воде или смеси смешиваемого с водой органического растворителя и воды. Способ позволяет получить модифицированный олигонуклеотид, включающий олигонуклеотидную часть и полиалкокси часть, с более высоким выходом. 32 з.п. ф-лы, 14 ил., 1 табл., 22 пр.

1. Способ получения модифицированного олигонуклеотида, включающего олигонуклеотидную часть и полиалкокси часть, путем взаимодействия первого взаимодействующего вещества и второго взаимодействующего вещества, где первое взаимодействующее вещество включает полиалкокси часть и карбоксильную группу, и где второе взаимодействующее вещество представляет собой аминомодифицированный олигонуклеотид, включающий олигонуклеотидную часть и аминомодификацию, включающую аминогруппу, которая присоединена к олигонуклеотидной части, где способ включает следующие стадии:

a) активирование карбоксильной группы первого взаимодействующего вещества реагентом конденсации в смешиваемом с водой органическом растворителе, и

b) взаимодействие активированной карбоксильной группы первого взаимодействующего вещества с аминогруппой аминомодификации аминомодифицированного олигонуклеотида, который был растворен в воде или смеси смешиваемого с водой органического растворителя и воды, в результате чего образуется модифицированная молекула олигонуклеотида.

2. Способ по п. 1, где аминомодифицированный олигонуклеотид растворяют в смеси воды и смешиваемого с водой органического растворителя в присутствии четвертичной аммониевой соли.

3. Способ по любому из пп. 1, 2, где активированное первое взаимодействующее вещество со стадии a) добавляют к аминомодифицированному олигонуклеотиду, растворенному в воде или в смеси смешиваемого с водой органического растворителя и воды.

4. Способ по любому из пп. 1-3, где аминомодифицированный олигонуклеотид выбран из группы, состоящей из аминомодифицированных аптамеров и аминомодифицированных шпигельмеров.

5. Способ по любому из пп. 1-4, где на стадии b) используют избыток молекул активированного первого взаимодействующего вещества относительно аминомодифицированного олигонуклеотида.

6. Способ по п. 5, где избыток выражают как молярное отношение молекул активированного первого взаимодействующего вещества и аминомодифицированного олигонуклеотида, где молярное отношение составляет от около 1,1 до около 10.

7. Способ по п. 6, где молярное отношение составляет от около 1,5 до около 3,5.

8. Способ по любому из пп. 1-7, где для активирования первого взаимодействующего вещества в соответствии со стадией a) первое взаимодействующее вещество растворяют в смешиваемом с водой органическом растворителе и добавляют конденсирующий агент и основание.

9. Способ по п. 8, где добавляют сначала конденсирующий агент и затем основание.

10. Способ по любому из пп. 8 или 9, где конденсирующий агент растворяют в смешиваемом с водой органическом растворителе.

11. Способ по любому из пп. 8-10, где основание представляет собой ненуклеофильное основание.

12. Способ по любому из пп. 8-11, где через 0,25-60 мин после добавления основания полученный таким образом раствор добавляют к раствору, содержащему аминомодифицированный олигонуклеотид.

13. Способ по любому из пп. 8-12, где конденсирующий агент выбран из группы, включающей

a) соли фосфония, такие как BOP, PyBOP, PyBrop, AOP, PyAOP, BrOP и PyClOP,

b) соли урония, такие как HCTU, TCTU, TBTU, HBTU, HATU, TOTU и COMU, и

c) карбодиимиды.

14. Способ по п. 13, где конденсирующий растворитель представляет собой PyBOP, TBTU, COMU, HBTU.

15. Способ по п. 13, где карбодиимид выбран из группы, включающей DCC (N,N'-дициклогексилкарбодиимид), EDC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид) и DIC (N,N'-диизопропилкарбодиимид).

16. Способ по любому из пп. 1-15, где смешиваемый с водой органический растворитель выбран из группы, включающей метанол, этанол, н-пропанол, изопропанол, н-бутанол, втор-бутанол, трет-бутанол, диметилсульфоксид, диэтилсульфоксид, метилэтилсульфоксид, формамид, метилформамид, диметилформамид, этилформамид, этилметилформамид, диэтилформамид, 2-пирролидон, N-метилпирролидон, N-этилпирролидон, ацетонитрил, ацетон, этилметилкетон, метилпропилкетон, диэтилкетон, метилизопропилкетон, метилформиат, этилформиат, пропилформиат, изопропилформиат, метилацетат, этилацетат, метилпропаноат, тетрагидрофуран и диоксан, предпочтительно диметилформамид, ацетонитрил и диметилсульфоксид.

17. Способ по любому из пп. 8-16, где основание выбрано из группы, включающей диизопропилэтиламин (DIPEA), триметиламин и DBU, предпочтительно диизопропилэтиламин (DIPEA).

18. Способ по любому из пп. 8-17, где молярное отношение основания к первому взаимодействующему веществу равно или больше чем 1.

19. Способ по любому из пп. 8-18, где раствор аминомодифицированной молекулы нуклеиновой кислоты содержит основание.

20. Способ по п. 19, где основанием является ненуклеофильное основание.

21. Способ по любому из пп. 19 или 20, где молярное отношение ненуклеофильного основания к числу фосфодиэфиров в аминомодифицированной молекуле нуклеиновой кислоты больше чем 3.

22. Способ по любому из пп. 1-21, где стадию а) осуществляют при температуре 5-60°C.

23. Способ по любому из пп. 1-22, где стадию b) осуществляют при температуре 5-60°C.

24. Способ по любому из пп. 1-23, где реакция активированной карбоксильной группы первого взаимодействующего вещества с аминогруппой аминомодифицированного олигонуклеотида завершается через 5 мин - 6 ч.

25. Способ по любому из пп. 1-24, где стадию b) осуществляют в диапазоне pH 7,5-10.

26. Способ по любому из пп. 1-25, где на стадии b) активированное первое взаимодействующее вещество добавляют к раствору аминомодифицированного олигонуклеотида до тех пор, пока от 80 до 100% аминомодифицированных молекул не прореагируют с первым взаимодействующим веществом.

27. Способ по любому из пп. 1-26, где после завершения стадии b) любое непрореагировавшее первое взаимодействующее вещество выделяют из реакции при помощи ультрафильтрации и/или хроматографии.

28. Способ по п. 27, где после завершения стадии b) любое непрореагировавшее первое взаимодействующее вещество выделяют из реакции при помощи ионообменной хроматографии.

29. Способ по любому из пп. 27 или 28, где выделенное первое взаимодействующее вещество направляют в повторный цикл и используют на стадии a).

30. Способ по любому из пп. 1-29, где полиалкокси соединение представляет собой полиалкокси соединение с прямой или разветвленной цепью.

31. Способ по любому из пп. 1-30, где полиалкокси соединение выбрано из группы, включающей полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, полибутиленгликоль, полиглицерин.

32. Способ по любому из пп. 1-31, где полиалкокси соединение представляет собой полиэтиленгликоль.

33. Способ по любому из пп. 1-32, где полиалкокси соединение имеет молекулярную массу от 5000 до 100000 Да.