КОНЪЮГАТ АНТИТЕЛА ПРОТИВ CEA И АНАЛОГА ЭКСАТЕКАНА И ЕГО ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2025 года по МПК C07K16/30 A61K47/68 A61P35/00 

Настоящая заявка испрашивает приоритет по китайской патентной заявке (заявка № CN 201911294912.3), поданной 16 декабря 2019 года.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к конъюгату антитела против CEA и аналога эксатекана, способу его получения, фармацевтическим композициям, содержащим его, и его применению для получения лекарственного препарата для лечения заболевания или состояния, опосредованного CEA, в особенности его применению для получения противоракового лекарственного средства.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Изложенное в данном документе представляет собой лишь общую информацию, относящуюся к настоящему изобретению, и необязательно может представлять собой известный уровень техники.

Раково-эмбриональный антиген (CEA, также известный как CEACAM-5 или CD66e) представляющий собой гликопротеин с молекулярной массой около 180 кДа, является одним из самых ранних обнаруженных опухолеассоциированных антигенов. CEA является членом суперсемейства иммуноглобулинов и содержит 7 доменов, присоединенных к клеточной мембране через гликозилфосфатидилинозитоловый (GPI) якорь (Thompson J.A., J Clin Lab Anal. 5:344-366, 1991). Первоначально CEA был обнаружен и описан Gold P и Freedman SO в экстрактах ткани рака толстой кишки (Gold and Freedman 1965; Gold and Freedman, 1965), и впоследствии сообщалось, что CEA был обнаружен в сыворотке пациентов с раком толстой кишки и другими опухолями с использованием чувствительных методов радиоиммуноанализа, в то время как содержание CEA в сыворотке здорового человека или пациентов с другими заболеваниями чрезвычайно низкое (Thomson, Krupey и др., 1969). Экспрессия CEA повышается в раковых клетках, и повышенный CEA способствует межклеточной адгезии и дальнейшему метастазированию клеток (Marshall J., Semin Oncol., 30(Suppl. 8):30-6, 2003). CEA обычно экспрессируется в эпителиальных тканях, включая клетки желудочно-кишечного, дыхательного и мочеполового трактов, а также в клетках толстой кишки, шейки матки, потовых желез и предстательной железы (Nap и др., Tumour biol., 9(2-3): 145-53, 1988; Nap и др., Cancer Res., 52(8):2329-23339, 1992).

Конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC) связывает моноклональное антитело или фрагмент антитела с биологически активным цитотоксином через стабильное химическое линкерное соединение, полностью используя специфичность связывания антитела с поверхностными антигенами нормальных клеток и опухолевых клеток и высокую эффективность цитотоксического вещества, а также устраняя недостаток первого, связанного с тем, что оно имеет плохой терапевтический эффект, недостаток последнего, связанного с тем, что оно имеет серьезные токсические побочные эффекты, и тому подобное. Это означает, что конъюгат антитело-лекарственное средство может более точно связываться с опухолевыми клетками и оказывать сниженное влияние на нормальные клетки по сравнению с обычными химиотерапевтическими препаратами, используемыми ранее.

В настоящее время некоторые антитела, таргетированные на CEA, и лекарственные средства ADC описаны в патентах, таких как WO2015069430. Тем не менее, все еще существует необходимость в разработке более эффективного и безопасного конъюгата антитело против CEA-лекарственное средство для лучшего применения при лечении опухолей, ассоциированных с CEA.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к конъюгату антитело против CEA-лекарственное средство и его фармацевтическому применению, где конъюгат антитело против CEA-лекарственное средство содержит антитело против CEA или его антигенсвязывающий фрагмент, конъюгированный с лекарственным средством на основе токсина, необязательно посредством линкера, где антитело против CEA или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи антитела, где:

i) HCDR1 (определяющая комплементарность область 1 тяжелой цепи) и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи идентичны HCDR1 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 7, и HCDR2 вариабельной области тяжелой цепи идентична HCDR2 вариабельной области тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 7, или отличается от нее одной аминокислотой; LCDR1 (определяющая комплементарность область 1 легкой цепи), LCDR2 и LCDR3 вариабельной области легкой цепи идентичны LCDR1, LCDR2 и LCDR3 вариабельной области легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 8;

ii) HCDR1 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи идентичны HCDR1 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 9, и HCDR2 вариабельной области тяжелой цепи идентична HCDR2 вариабельной области тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 9, или отличается от нее одной аминокислотой; LCDR1, LCDR2 и LCDR3 вариабельной области легкой цепи идентичны LCDR1, LCDR2 и LCDR3 вариабельной области легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 10;

iii) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи идентичны HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 11; LCDR1, LCDR2 и LCDR3 вариабельной области легкой цепи идентичны LCDR1, LCDR2 и LCDR3 вариабельной области легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 12; или

iv) HCDR1 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи идентичны HCDR1 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 13, и HCDR2 вариабельной области тяжелой цепи идентична HCDR2 вариабельной области тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 13, или отличается от нее одной аминокислотой; LCDR1 и LCDR3 вариабельной области легкой цепи идентичны LCDR1 и LCDR3 вариабельной области легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 14, и LCDR2 вариабельной области легкой цепи идентична LCDR2 вариабельной области легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 14, или отличается от нее одной аминокислотой.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело против CEA или его антигенсвязывающий фрагмент в конъюгате антитело-лекарственное средство содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где:

v) вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, представленные в SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17, соответственно, и вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, представленные в SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20, соответственно; или вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, представленные в SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 17, соответственно, и вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, представленные в SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20, соответственно;

vi) вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, представленные в SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 23, соответственно, и вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, представленные в SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26, соответственно; или вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, представленные в SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 47 и SEQ ID NO: 23, соответственно, и вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, представленные в SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26, соответственно;

vii) вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, представленные в SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 29, соответственно, и вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, представленные в SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO: 32, соответственно; или

viii) вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1 и HCDR3, представленные в SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 34, соответственно, и HCDR2, представленные в SEQ ID NO: 16 или SEQ ID NO: 38; вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1 и LCDR3, представленные в SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 37, и LCDR2, представленные в SEQ ID NO: 36 или SEQ ID NO: 64.

В некоторых вариантах осуществления антитело против CEA или его антигенсвязывающий фрагмент в конъюгате антитело-лекарственное средство содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где:

в некоторых вариантах осуществления антитело против CEA или его антигенсвязывающий фрагмент в конъюгате антитело-лекарственное средство содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где:

вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, представленные в SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 34, соответственно, и вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, представленные в SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 и SEQ ID NO: 37, соответственно; или

вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, представленные в SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 34, соответственно, и вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, представленные в SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 и SEQ ID NO: 37, соответственно; или

вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, представленные в SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 34, соответственно, и вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, представленные в SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 64 и SEQ ID NO: 37, соответственно;

или

вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, представленные в SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 34, соответственно, и вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, представленные в SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 64 и SEQ ID NO: 37, соответственно.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело против CEA в конъюгате антитело-лекарственное средство представляет собой мышиное антитело, химерное антитело или гуманизированное антитело.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело против CEA или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из вышеуказанных вариантов в конъюгате антитело-лекарственное средство содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где:

(a) вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 7; и/или вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 8; или

(b) вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 9; и/или вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 10; или

(c) вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 11, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 11; и/или вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 12, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 12; или

(d) вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 13; и/или вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 14.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело против CEA или его антигенсвязывающий фрагмент в конъюгате антитело-лекарственное средство содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где:

(e) вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 39, 40, 41 или 42, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с любой одной аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 39, 40, 41 или 42; и/или вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 43, 44, 45 или 46, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с любой одной аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 43, 44, 45 или 46;

предпочтительно, вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 42, и вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 44; или

(f) вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 48, 49, 50, 51 или 52, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с любой одной аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 48, 49, 50, 51 или 52; и/или вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 53, 54 или 55, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с любой одной аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 53, 54 или 55;

предпочтительно, вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 52, и вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 53; или

(g) вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 56, 57 или 58, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с любой одной аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 56, 57 или 58; и/или вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 59, 60, 61, 62 или 63, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с любой одной аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 59, 60, 61, 62 или 63;

предпочтительно, вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 58, и вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 62; или

(h) вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 65, 66, 67 или 68, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с любой аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 65, 66, 67 или 68; и/или вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75 или 76, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с любой аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75 или 76;

предпочтительно, вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 68, и вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 76.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело против CEA по любому из вышеуказанных вариантов осуществления в конъюгате антитело-лекарственное средство, антитело представляет собой гуманизированное антитело, содержащее каркасную область, полученную из человеческого антитела или его варианта каркасной области, и вариант каркасной области имеет обратные мутации до 10 аминокислот в каркасной области легкой цепи и/или каркасной области тяжелой цепи антитела человека;

предпочтительно, вариант каркасной области выбран из любого из следующих (i) - (l):

(i) каркасная область вариабельной области легкой цепи, содержащая LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие последовательности, представленные в SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20, соответственно, содержащая одну или более аминокислотных обратных мутаций, выбранных из группы, состоящей из 46P, 47W, 49Y, 70S и 71Y, и/или каркасная область вариабельной области тяжелой цепи, содержащая HCDR1, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15, HCDR2, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16 или SEQ ID NO: 38, и HCDR3, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17, содержащая одну или более аминокислотных обратных мутаций, выбранных из группы, состоящей из 38K и 46K;

(j) каркасная область вариабельной области легкой цепи, содержащая LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие последовательности, представленные в SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26, соответственно, содержащая одну или более аминокислотных обратных мутаций, выбранных из группы, состоящей из 2V, 42G, 44V и 71Y, и/или каркасная область вариабельной области тяжелой цепи, содержащая HCDR1, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21, HCDR2, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 47, и HCDR3, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 23, содержащая одну или более аминокислотных обратных мутаций, выбранных из группы, состоящей из 48I, 66K, 67A, 69L, 71V, 73K, 82F и 82A R;

(k) каркасная область вариабельной области легкой цепи, содержащая LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие последовательности, представленные в SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO: 32, соответственно, содержащая одну или более аминокислотных обратных мутаций, выбранных из группы, состоящей из 3V, 43P и 58V, и/или каркасная область вариабельной области тяжелой цепи, содержащая HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие последовательности, представленные в SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 29, содержащая одну или более аминокислотных обратных мутаций, выбранных из группы, состоящей из 38K, 66K и 71V; и

(l) каркасная область вариабельной области легкой цепи, содержащая LCDR1, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 35, LCDR2, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 36 или SEQ ID NO: 64, и LCDR3, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 37, содержащая одну или более аминокислотных обратных мутаций, выбранных из группы, состоящей из 4V, 36Y, 43P, 47V, 49E, 70D и 87I; и/или каркасная область вариабельной области тяжелой цепи, содержащая HCDR1, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 33, HCDR2, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16 или SEQ ID NO: 38, и HCDR3, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 34, содержащая одну или более аминокислотных обратных мутаций, выбранных из группы, состоящей из 2I, 38K и 46K;

(m) каркасная область вариабельной области легкой цепи, содержащая LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие последовательности, представленные в SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26, соответственно, содержащая одну или более аминокислотных обратных мутаций, выбранных из группы, состоящей из 2V, 42G, 44V и 71Y, и/или каркасная область вариабельной области тяжелой цепи, содержащая HCDR1, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21, HCDR2, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 47, и HCDR3, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 23, содержащая одну или более аминокислотных обратных мутаций, выбранных из группы, состоящей из 66K, 67A, 69L, 71V, 73K, 82F и 82A R;

где сайты обратных мутаций пронумерованы по схеме нумерации Кабата.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело против CEA по любому из вышеуказанных вариантов осуществления в конъюгате антитело-лекарственное средство, антитело представляет собой гуманизированное антитело, содержащее каркасную область, полученную из человеческого антитела или его варианта каркасной области, и вариант каркасной области имеет обратные мутации до 10 аминокислот в каркасной области легкой цепи и/или каркасной области тяжелой цепи антитела человека;

предпочтительно, вариант каркасной области выбран из любого из следующих (i) - (l):

(i) каркасная область вариабельной области легкой цепи, содержащая LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие последовательности, представленные в SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20, соответственно, содержащая одну или более обратных аминокислотных мутаций, выбранных из группы, состоящей из 46P, 47W, 49Y, 70S и 71Y, и/или

каркасная область вариабельной области тяжелой цепи, содержащая HCDR1, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15, HCDR2, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16 или SEQ ID NO: 38, и HCDR3, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17, содержащая одну или более обратных аминокислотных мутаций, выбранных из группы, состоящей из 38K и 46K;

(j) каркасная область вариабельной области легкой цепи, содержащая LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие последовательности, представленные в SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26, соответственно, содержащая одну или более обратных аминокислотных мутаций, выбранных из группы, состоящей из 2V, 42G, 44V и 71Y, и/или

каркасная область вариабельной области тяжелой цепи, содержащая HCDR1, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21, HCDR2, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 47, и HCDR3, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 23, содержащая одну или более обратных аминокислотных мутаций, выбранных из группы, состоящей из 48I, 66K, 67A, 69L, 71V, 73K, 82F и 82A R;

(k) каркасная область вариабельной области легкой цепи, содержащая LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие последовательности, представленные в SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO: 32, соответственно, содержащая одну или более обратных аминокислотных мутаций, выбранных из группы, состоящей из 3V, 43P и 58V, и/или

каркасная область вариабельной области тяжелой цепи, содержащая HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие последовательности, представленные в SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 29, соответственно, содержащая одну или более обратных аминокислотных мутаций, выбранных из группы, состоящей из 38K, 66K и 71V; и

(l) каркасная область вариабельной области легкой цепи, содержащая LCDR1, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 35, LCDR2, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 36 или SEQ ID NO: 64, и LCDR3, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 37, содержащая одну или более обратных аминокислотных мутаций, выбранных из группы, состоящей из 4V, 36Y, 43P, 47V, 49E, 70D и 87I; и/или

каркасная область вариабельной области тяжелой цепи, содержащая HCDR1, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 33, HCDR2, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16 или SEQ ID NO: 38, и HCDR3, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 34, содержащая одну или более обратных аминокислотных мутаций, выбранных из группы, состоящей из 2I, 38K и 46K;

где сайты обратных мутаций пронумерованы по схеме нумерации Кабата.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело против CEA или его антигенсвязывающий фрагмент согласно любому из вышеуказанных вариантов осуществления в конъюгате антитело-лекарственное средство, антитело содержит константную область тяжелой цепи и константную область легкой цепи антитела; предпочтительно, константная область тяжелой цепи выбрана из группы, состоящей из константных областей человеческого IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, и константная область легкой цепи выбрана из группы, состоящей из константных областей человеческого антитела κ- и λ-цепи; более предпочтительно, антитело содержит константную область тяжелой цепи, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 77, и константную область легкой цепи, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 78 или SEQ ID NO: 79;

наиболее предпочтительно, антитело против CEA, используемое в настоящем изобретении, содержит:

(m) тяжелую цепь, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 80, или последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с ней, и/или легкую цепь, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 81, или последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с ней;

(n) тяжелую цепь, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 82, или последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с ней, и/или легкую цепь, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 83, или последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с ней;

(o) тяжелую цепь, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 84, или последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с ней, и/или легкую цепь, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 85, или последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с ней; или

(p) тяжелую цепь, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 86, или последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с ней, и/или легкую цепь, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 87, или последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с ней.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающий фрагмент по любому из вышеуказанных вариантов осуществления выбран из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab')₂, одноцепочечного антитела (scFv), димеризованной V-области (вариабельная область) (диатело) и стабилизированной дисульфидными связями V-области (dsFv).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из вышеуказанных вариантов осуществления изобретения представляет собой конъюгат антитело-лекарственное средство общей формулы (Pc-L-Y-D):

,

где:

Y выбран из группы, состоящей из -O-(CR^aR^b)_m-CR¹R²-C(O)-, -O-CR¹R²-(CR^aR^b)_m-, -O-CR¹R²-, -NH-(CR^aR^b)_m, -CR¹R²-C(O)- и -S-(CR^aR^b)_m-CR¹R²-C(O)-;

R^a и R^b являются идентичными или различными и каждый независимо выбран из группы, состоящей из водорода, дейтерия, галогена, алкила, галогеналкила, дейтерированного алкила, алкокси, гидрокси, амино, циано, нитро, гидроксиалкила, циклоалкила и гетероциклила; или R^a и R^b вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют циклоалкил и гетероциклил;

R¹ выбран из группы, состоящей из галогена, галогеналкила, дейтерированного алкила, циклоалкила, циклоалкилалкила, алкоксиалкила, гетероциклила, арила и гетероарила; R² выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, галогеналкила, дейтерированного алкила, циклоалкила, циклоалкилалкила, алкоксиалкила, гетероциклила, арила и гетероарила; или R¹ и R² вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют циклоалкил или гетероциклил;

или R^a и R² вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют циклоалкил или гетероциклил;

m представляет собой целое число от 0 до 4;

n представляет собой десятичное или целое число от 1 до 10;

L представляет собой линкерный фрагмент;

Pc представляет собой антитело против CEA или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано выше.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в конъюгате антитело-лекарственное средство по любому из вышеуказанных вариантов осуществления изобретения n представляет собой целое число или десятичное число от 0 до 10, n может представлять собой среднее значение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10, предпочтительно от 1 до 8, более предпочтительно от 2 до 8 и наиболее предпочтительно от 4 до 6, и n представляет собой среднее значение десятичного или целого числа.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в конъюгате антитело-лекарственное средство по любому из вышеуказанных вариантов осуществления изобретения n представляет собой среднее десятичное или целое число от 3 до 5.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в конъюгате антитело-лекарственное средство по любому из вышеуказанных вариантов осуществления изобретения n представляет собой среднее десятичное или целое число от 6 до 7.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из вышеуказанных вариантов осуществления изобретения является таким, как показано в общей формуле (Pc-L-Y-D), где:

Y представляет собой -O-(CR^aR^b)_m-CR¹R²-C(O)-;

R^a и R^b являются идентичными или различными и каждый независимо выбран из группы, состоящей из водорода, дейтерия, галогена и алкила;

R¹ представляет собой галогеналкил или C₃-₆ циклоалкил;

R² выбран из группы, состоящей из водорода, галогеналкила и C₃-₆ циклоалкила;

или R¹ и R² вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют C₃-₆ циклоалкил;

m представляет собой 0 или 1.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в конъюгате антитело-лекарственное средство по любому из вышеуказанных вариантов осуществления Y выбран из группы, состоящей из:

и;

где O-конец Y соединен с линкерным фрагментом L.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в конъюгате антитело-лекарственное средство по любому из вышеуказанных вариантов осуществления изобретения Y представляет собой:

;

где O-конец Y соединен с линкерным фрагментом L.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из вышеуказанных вариантов осуществления выбран из группы:

где:

L представляет собой линкерный фрагмент;

Pc представляет собой антитело против CEA или его антигенсвязывающий фрагмент;

n представляет собой десятичное или целое число от 1 до 10.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из вышеуказанных вариантов осуществления выбран из группы, состоящей из:

где:

L представляет собой линкерный фрагмент;

Pc представляет собой антитело против CEA или его антигенсвязывающий фрагмент;

n представляет собой десятичное или целое число от 1 до 10.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в конъюгате антитело-лекарственное средство по любому из вышеуказанных вариантов осуществления изобретения линкерный фрагмент -L- представляет собой -L¹-L²-L³-L⁴-, где

L¹ выбран из группы, состоящей из -(сукцинимидил-3-ил-N)-W-C(O)-, -CH₂-C(O)-NR³-W-C(O)- и -C(O)-W-C(O)-, где W выбран из группы, состоящей из C₁-₈ алкила, C₁-₈ алкил-циклоалкила и линейного гетероалкила, содержащего от 1 до 8 атомов, и гетероалкил содержит от 1 до 3 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, O и S, где C₁-₈ алкил, циклоалкил или линейный гетероалкил каждый независимо необязательно дополнительно замещен одним или более заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, гидрокси, циано, амино, алкила, хлоралкила, дейтерированного алкила, алкокси и циклоалкила;

L² выбран из группы, состоящей из -NR⁴(CH₂CH₂O)p¹CH₂CH₂C(O)-, -NR⁴(CH₂CH₂O)p¹CH₂C(O)-, -S(CH₂)p¹C(O)- и химической связи, где p¹ представляет собой целое число от 1 до 20;

L³ представляет собой пептидный остаток, состоящий из от 2 до 7 аминокислот, где аминокислоты выбраны из группы, состоящей из аминокислотных остатков, образованных из аминокислот из фенилаланина, глицина, валина, лизина, цитруллина, серина, глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты, и необязательно дополнительно замещены одним или более заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, гидрокси, циано, амино, алкила, хлоралкила, дейтерированного алкила, алкокси и циклоалкила;

L⁴ выбран из группы, состоящей из -NR⁵(CR⁶R⁷)_t-, -C(O)NR⁵-, -C(O)NR⁵(CH₂)_t- и химической связи, где t представляет собой целое число от 1 до 6;

R³, R⁴ и R⁵ являются идентичными или различными и каждый независимо выбран из группы, состоящей из водорода, алкила, галогеналкила, дейтерированного алкила и гидроксиалкила;

R⁶ и R⁷ являются идентичными или различными и каждый независимо выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, алкила, галогеналкила, дейтерированного алкила и гидроксиалкила.

В некоторых вариантах осуществления изобретения L¹ выбран из группы, состоящей из -(сукцинимидил-3-ил-N)-W-C(O)-, -CH₂-C(O)-NR³-W-C(O)- и -C(O)-W-C(O)-, где W выбран из группы, состоящей из C₁-₈ алкила, C₁-₈ алкил-C_3-6 циклоалкила и линейного гетероалкила, имеющего от 1 до 8 атомов цепи, причем гетероалкил содержит от 1 до 3 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, O и S, где указанный C₁-₈ алкил, C₁-₈ алкил-C_3-6 циклоалкил или линейный гетероалкил, имеющий от 1 до 8 атомов цепи, независимо необязательно дополнительно замещен одним или более заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, гидрокси, циано, амино, алкила, хлоралкила, дейтерированного алкила, алкокси и циклоалкила.

В некоторых вариантах осуществления изобретения L² выбран из группы, состоящей из -NR⁴(CH₂CH₂O)p¹CH₂C(O)-, -NR⁴(CH₂CH₂O)p¹CH₂C(O)-, -S(CH₂)p¹C(O)- и химической связи, где p¹ представляет собой целое число от 1 до 20.

В некоторых вариантах осуществления изобретения L³ представляет собой пептидный остаток, состоящий из от 2 до 7 аминокислот, где аминокислоты выбраны из группы, состоящей из аминокислотных остатков, образованных из аминокислот из фенилаланина, глицина, валина, лизина, цитруллина, серина, глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты, и необязательно дополнительно замещены одним или более заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, гидрокси, циано, амино, алкила, хлоралкила, дейтерированного алкила, алкокси и циклоалкила.

В некоторых вариантах осуществления изобретения L⁴ выбран из группы, состоящей из -NR⁵(CR⁶R⁷)_t-, -C(O)NR⁵-, -C(O)NR⁵(CH₂)_t- и химической связи, где t представляет собой целое число от 1 до 6.

В некоторых вариантах осуществления изобретения R³, R⁴ и R⁵ являются идентичными или различными и каждый независимо выбран из группы, состоящей из водорода, алкила, галогеналкила, дейтерированного алкила и гидроксиалкила.

В некоторых вариантах осуществления изобретения R⁶ и R⁷ являются идентичными или различными и каждый независимо выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, алкила, галогеналкила, дейтерированного алкила и гидроксиалкила.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в конъюгате антитело-лекарственное средство по любому из вышеуказанных вариантов осуществления изобретения линкерный фрагмент -L- представляет собой -L¹-L²-L³-L⁴-, где

L¹ представляет собой, и s¹ представляет собой целое число от 2 до 8;

L² представляет собой химическую связь;

L³ представляет собой остаток тетрапептида; предпочтительно L³ представляет собой остаток тетрапептида глицин-глицин-фенилаланин-глицина (GGFG, SEQ ID NO: 92);

L⁴ представляет собой -NR⁵(CR⁶R⁷)_t-, где R⁵, R⁶ и R⁷ являются идентичными или различными и каждый независимо представляет собой водород или алкил, и t представляет собой 1 или 2;

где L¹-конец присоединен к Pc, а L⁴-конец присоединен к Y.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из вышеуказанных вариантов осуществления изобретения является таким, как показано в общей формуле (Pc-L-Y-D) или в общей формуле Pc-L-D, где -L- представляет собой:

.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из вышеуказанных вариантов осуществления изобретения является таким, как показано в общей формуле (Pc-L-Y-D) или общей формуле Pc-L-D, где -L-Y- необязательно выбран из группы, состоящей из:

,

и

.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из вышеуказанных вариантов осуществления изобретения представляет собой конъюгат антитело-лекарственное средство общей формулы (Pc-L_aY-D):

,

где:

W, L², L³, R⁵, R⁶ и R⁷ являются такими, как определено в линкерном фрагменте L;

Pc, n, R¹, R² и m являются такими, как определено в общей формуле (Pc-L-Y-D).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из вышеуказанных вариантов осуществления изобретения представляет собой конъюгат антитело-лекарственное средство общей формулы (Pc-L_bY-D):

,

где:

s¹ представляет собой целое число от 2 до 8;

Pc, R¹, R², R⁵-R⁷, m и n являются такими, как определено в общей формуле (Pc-L_a-Y-D).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из вышеуказанных вариантов осуществления выбран из группы, состоящей из:

,

и

,

где Pc и n являются такими, как определено в общей формуле (Pc-L-Y-D).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения конъюгат антитело-лекарственное средство выбран из группы, состоящей из:

Hu63-13-2-A

,

Hu47-14-2-A

или

Hu67-14-2-A

,

Hu103-32-2-A

,

где n является таким, как определено в общей формуле (Pc-L-Y-D);

антитела описаны следующим образом:

Hu63-13 содержит тяжелую цепь, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 80, и легкую цепь, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 81;

Hu47-14 содержит тяжелую цепь, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 82, и легкую цепь, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 83;

Hu67-14 содержит тяжелую цепь, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 84, и легкую цепь, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 85;

Hu103-32 содержит тяжелую цепь, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 86, и легкую цепь, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 87.

Необязательно, n может являться ненулевым целым числом или десятичной дробью от 0 до 10, предпочтительно целым или десятичным числом от 1 до 10; более предпочтительно, целым или десятичным числом от 2 до 8; и наиболее предпочтительно, целым или десятичным числом от 3 до 8; необязательно, n может являться десятичным или целым числом от 3 до 5; необязательно, n является десятичным или целым числом от 6 до 7.

В настоящем изобретении дополнительно предложен способ получения конъюгата антитело-лекарственное средство общей формулы (Pc-L_a-Y-D), где способ включает следующую стадию:

подвергания реакции сочетания восстановленного Pc и соединения общей формулы (L_a-Y-D) с получением соединения общей формулы (Pc-La-Y-D);

Pc представляет собой антитело против CEA или его антигенсвязывающий фрагмент;

W, L², L³, R¹, R², R⁵-R⁷, m и n являются такими, как определено в общей формуле (Pc-L_a-Y-D).

В настоящем изобретении дополнительно предложен способ получения конъюгата антитело-лекарственное средство общей формулы (Pc-L'-D), где способ включает следующую стадию:

подвергания реакции сочетания восстановленного Pc и соединения общей формулы (La'-D) с получением соединения, где:

Pc представляет собой антитело против CEA или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано выше;

n является таким, как определено в общей формуле (Pc-L-Y-D).

В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из вышеуказанных вариантов осуществления изобретения и один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов, разбавителей или носителей.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению конъюгата антитело-лекарственное средство по любому из вышеуказанных вариантов осуществления или фармацевтической композиции, содержащей его, в качестве лекарственного препарата.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению конъюгата антитело-лекарственное средство по любому из вышеуказанных вариантов осуществления изобретения или фармацевтической композиции, содержащей его, для получения лекарственного препарата для лечения заболевания или состояния, опосредованного CEA. Опосредованное CEA заболевание или состояние представляет собой рак с высокой экспрессией CEA. Или, CEA-опосредованное заболевание или состояние представляет собой рак с умеренной экспрессией CEA.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению конъюгата антетело-лекарственное средство по любому из вышеуказанных вариантов осуществления или фармацевтической композиции, содержащей его для получения лекарственного препарата для лечения или предотвращения опухоли, где опухоль и рак предпочтительно представляет собой плоскоклеточную карциному головы и шеи, рак головы и шеи, рак головного мозга, нейроглиому, мультиформную глиобластому, нейробластому, карциному центральной нервной системы, нейроэндокринную опухоль, рак горла, рак носоглотки, рак пищевода, рак щитовидной железы, злокачественную мезотелиому плевры, рак легкого, рак молочной железы, рак печени, гепатобилиарный рак, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак желудочно-кишечного тракта, рак кишечника, рак толстой кишки, колоректальный рак, рак почки, светлоклеточный рак почки, рак яичников, рак эндометрия, рак шейки матки, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак яичка, рак кожи, меланому, лейкоз, лимфому, рак кости, хондросаркому, миелому, множественную миелому, миелодиспластический синдром, опухоль Крукенберга, миелопролиферативную опухоль, плоскоклеточную карцинома, саркому Юинга, системный амилоидоз легкой цепи или карциному из клеток Меркеля; более предпочтительно лимфома выбрана из группы, состоящей из: ходжкинской лимфомы, неходжкинской лимфомы, диффузной В-крупноклеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы, первичной медиастинальной В-крупноклеточной лимфомы, мантийноклеточной лимфомы, малой лимфоцитарной лимфомы, В-крупноклеточной лимфомы, богатой Т-клетками/гистиоцитами и лимфоплазмоцитарной лимфомы, рак легкого выбран из немелкоклеточного рака легкого или мелкоклеточного рака легкого, и лейкоз выбран из группы, состоящей из: хронического миелоидного лейкоза, острого миелоидного лейкоза, лимфоцитарного лейкоза, лимфобластного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза, хронического лимфоцитарного лейкоза и миелоидно-клеточного лейкоза.

В другом аспекте настоящее изобретение также относится к способу лечения и/или предотвращения опухоли, где способ включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективной дозы конъюгата антитело-лекарственное средство по любому из вышеуказанных вариантов осуществления изобретения или фармацевтической композиции, содержащей его; где опухоль предпочтительно представляет собой рак, связанный с высокой экспрессией CEA.

В другом аспекте настоящее изобретение дополнительно относится к способу лечения или предотвращения рака, включающему введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективной дозы конъюгата антитело-лекарственное средство по любому из вышеуказанных вариантов осуществления изобретения или фармацевтической композиции, содержащей его, где опухоль и рак предпочтительно представляет собой плоскоклеточную карциному головы и шеи, рак головы и шеи, рак головного мозга, нейроглиому, мультиформную глиобластому, нейробластому, карциному центральной нервной системы, нейроэндокринную опухоль, рак горла, рак носоглотки, рак пищевода, рак щитовидной железы, злокачественную мезотелиому плевры, рак легкого, рак молочной железы, рак печени, гепатобилиарный рак, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак желудочно-кишечного тракта, рак кишечника, рак толстой кишки, колоректальный рак, рак почки, светлоклеточный рак почки, рак яичников, рак эндометрия, рак шейки матки, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак яичка, рак кожи, меланому, лейкоз, лимфому, рак кости, хондросаркому, миелому, множественную миелому, миелодиспластический синдром, опухоль Крукенберга, миелопролиферативную опухоль, плоскоклеточную карцинома, саркому Юинга, системный амилоидоз легкой цепи или карциному из клеток Меркеля; более предпочтительно лимфома выбрана из группы, состоящей из ходжкинской лимфомы, неходжкинской лимфомы, диффузной В-крупноклеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы, первичной медиастинальной В-крупноклеточной лимфомы, мантийноклеточной лимфомы, малой лимфоцитарной лимфомы, В-крупноклеточной лимфомы, богатой Т-клетками/гистиоцитами и лимфоплазмоцитарной лимфомы, рак легкого выбран из немелкоклеточного рака легкого или мелкоклеточного рака легкого, и лейкоз выбран из группы, состоящей из: хронического миелоидного лейкоза, острого миелолейкоза, лимфоцитарного лейкоза, лимфоцитарного лейкоза, лимфобластного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза, хронического лимфоцитарного лейкоза и миелоидно-клеточного лейкоза.

Активное соединение (например, конъюгат лиганд-лекарственное средство по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемая соль) может быть составлено в форме, подходящей для введения любым подходящим способом, предпочтительно в форме стандартной дозы или в форме однократной дозы, которую субъект может вводить самостоятельно. Стандартная доза по настоящему изобретению может быть таблетке, капсуле, облатке, флаконе, порошке, грануле, пастилке, суппозитории, регенерирующем порошке или жидком препарате.

Доза введения активного соединения или композиции, применяемой в способе лечения по настоящему изобретению, обычно варьируется в зависимости от тяжести заболевания, веса субъекта и эффективности активного соединения. Однако, как правило, подходящая стандартная доза может составлять от 0,1 до 1000 мг.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать, в дополнение к активному соединению, один или более эксципиентов, выбранных из группы, состоящей из: наполнителя, разбавителя, связующего вещества, увлажняющего агента, разрыхлителя, эксципиента и тому подобного. В зависимости от способа введения композиция может содержать от 0,1 до 99 мас.% активного соединения.

Антитело против CEA и конъюгат антитело-лекарственное средство, предложенные в настоящем изобретении, обладают хорошей аффинностью к антигенам клеточной поверхности, хорошей эффективностью эндоцитоза и высокой эффективностью ингибирования опухоли, а также более широкими окнами применения лекарственного средства и пригодны для клинического применения лекарственного средства.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На фиг. 1 показаны результаты анализа FACS (метод анализа сортировки клеток с активированной флуоресценцией) связывания гуманизированных антител против CEA человека на клеточном уровне.

На фиг. 2 показан нецелевой эффект и цитотоксичность молекул ADC; данные показывают, что все молекулы ADC имеют сильный нецелевой эффект и цитотоксичность, и при совместном культивировании MKN45 и HCT116 молекулы ADC могут ингибировать пролиферацию обоих типов клеток, в то время как при культивировании HCT116 в отдельности молекулы ADC, связанные с 2-A, по существу не являются токсичными для клеток.

На фиг. 3 показан эффект молекул ADC на объем опухоли в модели опухоли ксенотрансплантата LS174T; данные показывают, что все молекулы ADC обладают эффектами ингибирования увеличения объема опухоли по сравнению с контрольной группой (PBS (фосфатно-солевой буфер)), и ингибирующие эффекты на опухоли в группах, получавших 3 мг/кг, лучше, чем в группах, получавших 1 мг/кг; среди групп, получавших 3 мг/кг, Hu63-13-2-A обладает лучшим ингибирующим эффектом на опухоли, за которым следует Hu47-14-2-A, а затем Hu67-14-2-A, и Lmab-CL2A-SN38 обладает наихудшим ингибирующим эффектом на опухоли.

На фиг. 4 показан эффект молекул ADC на массу опухоли в модели опухоли ксенотрансплантата LS174T; данные показывают, что все молекулы ADC имеют эффекты ингибирования увеличения массы опухолей как при низких, так и при высоких дозах по сравнению с контрольной группой (PBS); среди групп, получавших 3 мг/кг, Hu63-13-2-A оказывает наилучшее ингибирующее действие на опухоли, за которым следует Hu47-14-2-A, а затем Hu67-14-2-A, и Lmab-CL2A-SN38 оказывает наихудшее ингибирующее действие на опухоли.

На фиг. 5 показан эффект молекул ADC на объем опухоли в модели опухоли ксенотрансплантата MKN45; данные показывают, что все молекулы ADC обладают эффектами ингибирования увеличения объема опухоли по сравнению с контрольной группой (PBS), и ингибирующие эффекты на опухоли в группах, получавших 3 мг/кг, лучше, чем в группах, получавших 1 мг/кг; среди групп, получавших, 3 мг/кг Hu67-14-2-A обладает лучшим ингибирующим эффектом на опухоли, за которым следует Hu103-32-2-A, а затем Hu63-13-2-A, и Lmab-CL2A-SN38 обладает наихудшим ингибирующим эффектом на опухоли.

На фиг. 6 показан эффект молекул ADC на массу опухоли в модели опухоли ксенотрансплантата MKN45; данные показывают, что все молекулы ADC имеют эффекты ингибирования увеличения массы опухолей как при низких, так и при высоких дозах по сравнению с контрольной группой (PBS); среди групп, получавших 3 мг/кг, Hu67-14-2-A оказывает наилучшее ингибирующее действие на опухоли, за которым следует Hu103-32-2-A, а затем Hu63-13-2-A, и Lmab-CL2A-SN38 оказывает наихудшее ингибирующее действие на опухоли.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Терминология

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют такое же значение, которое обычно подразумевается специалистом в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Хотя любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем документе, также могут быть использованы для осуществления или тестирования настоящего изобретения, предпочтительные способы и материалы описаны в настоящем документе. В описании и формуле изобретения по настоящему изобретению используются следующие термины в соответствии с приведенными ниже определениями.

Когда в настоящем описании используется торговое наименование, предполагается, что оно включает состав коммерческого продукта под торговым наименованием, а также непатентованное лекарственное средство и активный лекарственный компонент коммерческого продукта под торговым наименованием.

Если не указано иное, термины, используемые в описании и формуле изобретения, имеют приведенные ниже значения.

Термин "лекарственное средство" относится к химическому веществу, которое может изменять или устанавливать физиологию и патологическое состояние организма и может использоваться для предотвращения, диагностики и лечения заболеваний. Лекарственное средство включает цитотоксическое лекарственное средство. Нет четкой границы между лекарственным средством и токсичным веществом. Токсичное вещество относится к химическому веществу, которое оказывает токсический эффект на организмы и может причинить вред здоровью человека даже в небольших дозах. Любое лекарственное средство в больших дозах может вызывать токсические реакции.

Цитотоксическое лекарственное средство относится к веществу, которое ингибирует или предотвращает функции клеток и/или вызывает гибель клеток или разрушение клеток. Цитотоксическое лекарственное средство может уничтожать опухолевые клетки в целом при достаточно высокой концентрации; однако из-за отсутствия специфичности, цитотоксическое лекарственное средство может вызывать апоптоз нормальных клеток при уничтожении опухолевых клеток, что приводит к серьезным побочным эффектам. Цитотоксическое лекарственное средство включает токсины, такие как низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, радиоизотопы (например, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² и радиоактивные изотопы Lu), лекарственные средства на основе токсина, химиотерапевтические лекарственные средства, антибиотики и нуклеолитические ферменты.

Термин "линкерное звено", "линкер" или "линкерный фрагмент" относится к химическому структурному фрагменту или связи, которая связана с лигандом на одном конце и связана с лекарственным средством на другом конце, а также может быть связана с другими линкерами, а затем связана с лекарственным средством.

Линкер может содержать один или более линкерных компонентов. Иллюстративные линкерные компоненты включают 6-малеимидокапроил ("MC"), малеимидопропионил ("MP"), валин-цитруллин ("val-cit" или "vc"), аланин-фенилаланин ("ala-phe"), п-аминобензилоксикарбонил ("PAB"), N-сукцинимидил 4-(2-пиридилтио)пентаноат ("SPP"), N-сукцинимидил 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1 карбоксилат ("SMCC", также упоминаемый в настоящем документе как "MCC") и N-сукцинимидил(4-иод-ацетил)аминобензоат ("SIAB"). Линкер может включать удлиняющие звенья, спейсерные звенья и аминокислотные звенья и может быть синтезирован с использованием способов, известных в данной области техники, таких как описанные в US2005-0238649A1. Линкер может представлять собой "расщепляемый линкер", благоприятствующий высвобождению лекарственных средств в клетках. Например, могут быть использованы кислотолабильные линкеры (например, гидразоны), чувствительные к протеазе (например, чувствительные к пептидазе) линкеры, фотолабильные линкеры, диметильные линкеры или дисульфидсодержащие линкеры (Chari et al., Cancer Research 52: 127-131(1992); патент США № 5208020).

Сокращения

Линкерные компоненты включают, но не ограничиваются ими:

MC представляет собой 6-малеимидокапроил, со структурой:

,

Val-Cit или "vc" представляет собой валин-цитруллин (примерный дипептид в расщепляемом протеазой линкере),

цитруллин представляет собой 2-амино-5-уреидопентановую кислоту,

PAB представляет собой п-аминобензилоксикарбонил (пример "саморасщепляющихся" линкерных компонентов),

Me-Val-Cit представляет собой N-метил-валин-цитруллин (где линкерная пептидная связь была модифицирована для предотвращения ее расщепления катепсином B),

MC(PEG)6-OH представляет собой малеимидокапроил-полиэтиленгликоль (присоединяемый к цистеину антитела),

SPP представляет собой N-сукцинимидил 4-(2-пиридилтио)валерат,

SPDP представляет собой N-сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио)пропионат,

SMCC представляет собой сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат,

IT представляет собой иминотиолан.

Термин «конъюгат антитело-лекарственное средство» означает, что антитело связано с биологически активным лекарственным средством стабильным линкерным фрагментом. В настоящем описании "конъюгат антитело-лекарственное средство" или конъюгат антитела с лекарственным средством (ADC) означает, что моноклональное антитело или фрагмент антитела связаны с биологически активным токсичным лекарственным средством посредством линкерного фрагмента. Антитело может быть конъюгировано с лекарственным средством непосредственно или через линкер. Среднее количество блоков лекарственного средства, конъюгированных с каждым антителом (среднее значение нагрузки лекарственным средством или нагрузка лекарственным средством, которое может быть представлено как n), может варьироваться, например, от около 0 до около 20 блоков лекарственного средства; в некоторых вариантах осуществления изобретения от 1 до около 10 блоков лекарственного средства и в некоторых вариантах осуществления изобретения от 1 до около 8 блоков лекарственного средства.

Термин «среднее значение нагрузки лекарственным средством» или «нагрузка лекарственным средством» относится к среднему количеству цитотоксического лекарственного средства, нагруженному на лиганд в молекулах конъюгата антитело-лекарственное средство, и также может быть выражен в терминах соотношения лекарственного средства к антителу. Нагрузка лекарственным средством может составлять от 0 до 12, предпочтительно от 1 до 10 цитотоксических лекарственных средств на лиганд (Pc). В вариантах осуществления настоящего изобретения нагрузка лекарственным средством представлена в n, которое также может называться значением DAR (соотношение лекарственное средство-антитело), и приведенные в качестве примера значения могут быть средними значениями 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10. Среднее количество лекарственного средства на молекулу ADC после реакций сочетания может быть охарактеризовано обычными методами, такими как спектроскопия в УФ (ультрафиолетовый спектр)/видимом спектре, масс-спектрометрия, анализы ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) и HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография).

Трехбуквенные и однобуквенные коды для аминокислот, используемые в настоящем описании, раскрыты в J. biol. chem, 243, p3558 (1968).

Термин "антитело" относится к иммуноглобулину, который имеет структуру тетрапептидной цепи, образованную путем соединения между двумя тяжелыми цепями и двумя легкими цепями межцепочечными дисульфидными связями. По отличиям в аминокислотном составе и порядку расположения константных областей тяжелой цепи иммуноглобулины можно разделить на пять классов, иначе называемых изотипами иммуноглобулинов, а именно IgM, IgD, IgG, IgA и IgE, при этом их соответствующими тяжелыми цепями являются μ-цепь, δ-цепь, γ-цепь, α-цепь и ε-цепь соответственно. Ig одного класса может быть разделен на различные подклассы в зависимости от различий в аминокислотном составе шарнирных областей и количества и положения дисульфидных связей тяжелых цепей; например, IgG может быть разделен на IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Легкие цепи классифицируются на κ- или λ-цепи по различиям в константных областях. Каждый из пяти классов Ig может иметь κ-цепь или λ-цепь.

В тяжелых и легких цепях полноразмерных антител последовательности около 110 аминокислот вблизи N-конца значительно варьируются и, таким образом, называются вариабельными областями (Fv-области); остальные аминокислотные последовательности вблизи С-конца являются относительно стабильными и, таким образом, называются константными областями. Вариабельная область включает 3 гипервариабельные области (HVR) и 4 каркасные области (FR) с относительно консервативными последовательностями. Три гипервариабельные области определяют специфичность антитела и также известны как определяющие комплементарность области (CDR). Каждая вариабельная область легкой цепи (LCVR) или вариабельная область тяжелой цепи (HCVR) состоит из 3 CDR и 4 FR, расположенных от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Три области CDR легкой цепи обозначаются как LCDR1, LCDR2 и LCDR3, три области CDR тяжелой цепи обозначаются как HCDR1, HCDR2 и HCDR3.

Термины "полностью гуманизированное антитело", "полностью человеческое антитело" или "абсолютно человеческое антитело", также известное как "полностью гуманизированное моноклональное антитело", имеют как гуманизированную вариабельную область, так и константную область, для устранения иммуногенности и токсических побочных эффектов. Развитие моноклональных антител имеет четыре стадии, а именно мышиные моноклональные антитела, химерные моноклональные антитела, гуманизированные моноклональные антитела и полностью гуманизированные моноклональные антитела. Основные подходящие технологии для получения полностью человеческих антител включают: технологию гибридомы человека, технологию EBV-трансформированных (вирус Эпштейна-Барр) В-лимфоцитов, технологию фагового дисплея, технологию получения антител трансгенной мыши, технологию получения единичного В-клеточного антитела и тому подобное.

Термин "антигенсвязывающий фрагмент" относится к одному или более фрагментам антитела, которые сохраняют способность связываться с антигеном. Показано, что фрагмент полноразмерного антитела может быть использован для выполнения антигенсвязывающей функции антитела. Связывающий фрагмент, включенный в "антигенсвязывающий фрагмент", выбран из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab')₂, одноцепочечного антитела (scFv), димеризованной V-области (диатела), стабилизированной дисульфидными связями V-области (dsFv) и антигенсвязывающих фрагментов пептидов, содержащих CDR; примеры включают (i) Fab-фрагменты, одновалентные фрагменты, состоящие из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) F(ab')₂-фрагменты, двухвалентные фрагменты, содержащие два Fab-фрагмента, соединенных дисульфидными мостиками в шарнирных областях; (iii) Fd-фрагменты, состоящие из доменов VH и CH1; (iv) Fv-фрагменты, состоящие из доменов VH и VL одного плеча антитела; (v) одиночные домены или dAb-фрагменты (Ward et al., 1989) Nature 341:544-546), состоящие из доменов VH; и (vi) выделенные определяющие комплементарность области (CDR) или (vii) комбинациях двух или более выделенных CDR, которые необязательно могут быть связаны синтетическими линкерами. Кроме того, хотя два домена фрагмента Fv, VL и VH, кодируются отдельными генами, они могут быть связаны синтетическим линкером путем рекомбинации, что позволяет ему продуцировать одну белковую цепь, в которой области VL и VH спариваются с образованием одновалентной молекулы (называемой одноцепочечной Fv (scFv); см., например, Bird и др. (1988) Science 242: 423-426; и Huston и др. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также предназначены для включения в термин «антигенсвязывающий фрагмент» антитела. Такие фрагменты антител получают с использованием общепринятых методик, известных специалистам в данной области техники, и подвергают скринингу на пригодность таким же образом, как интактные антитела. Антигенсвязывающие части могут быть получены с использованием технологии рекомбинантной ДНК или путем ферментативного или химического расщепления интактных иммуноглобулинов. Антитела могут быть различных изотипов, например, IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 подтипа), IgA1, IgA2, IgD, IgE или IgM антитела.

В целом, Fab представляет собой фрагмент антитела, имеющий молекулярную массу около 50000 и обладающий антигенсвязывающей активностью, среди фрагментов, полученных путем обработки молекулы антитела IgG протеазой папаином (например, расщеплением аминокислотного остатка в положении 224 H-цепи), в котором часть на N-концевой стороне H-цепи объединена с L-цепью дисульфидной связью.

В целом, F(ab')₂ представляет собой фрагмент антитела, полученный путем расщепления части ниже дисульфидной связи в шарнирной области IgG ферментом пепсином. Он имеет молекулярную массу около 100000, обладает антигенсвязывающей активностью и содержит две области Fab, связанные в шарнирном положении.

В целом, Fab' представляет собой фрагмент антитела, имеющий молекулярную массу около 50000 и обладающий антигенсвязывающей активностью, полученный путем расщепления дисульфидной связи в шарнирной области F(ab')₂, описанного выше.

Кроме того, Fab' может быть получен путем вставки ДНК, кодирующей фрагмент Fab', в прокариотический или эукариотический вектор экспрессии и введения вектора в прокариот или эукариот для экспрессии Fab'.

Термин "одноцепочечное антитело", "одноцепочечное Fv" или "scFv" означает молекулу, содержащую вариабельный домен тяжелой цепи антитела (или VH) и вариабельный домен легкой цепи антитела (или VL), связанные линкером. Такие молекулы scFv имеют общую структуру: NH₂-VL-линкер-VH-COOH или NH₂-VH-линкер-VL-COOH. Подходящие линкеры в предшествующем уровне техники состоят из повторяющихся аминокислотных последовательностей GGGGS или их вариантов, например, от 1 до 4 повторяющихся вариантов (Holliger и др. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448). Другие линкеры, которые можно использовать в настоящем изобретении, описаны в Alfthan и др. (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi и др. (2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106, Hu и др. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov и др. (1999) J. Mol. Biol. 293:41-56 и Roovers и др. (2001), Cancer Immunol.

Термин "CDR" относится к одной из 6 гипервариабельных областей в пределах вариабельного домена антитела, которые в основном способствуют связыванию антигена. В целом, существует три CDR (HCDR1, HCDR2 и HCDR3) в каждой вариабельной области тяжелой цепи и три CDR (LCDR1, LCDR2 и LCDR3) в каждой вариабельной области легкой цепи. Границы аминокислотных последовательностей CDR могут быть определены с использованием любой из множества хорошо известных схем. Одно из наиболее распространенных определений для 6 CDR представлено в Kabat E.A. и др., (1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242. В данном контексте определение CDR Кабата (Kabat) относится только к CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена легкой цепи и к CDR2 и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи. Также включены схема нумерации Чотии (Chothia), схема нумерации "ABM", схема нумерации "contact" (см. Martin, ACR. Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains[J]. 2001), схема нумерации ImMunoGenTics (IMGT) (Lefranc M.P., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77(2003)) и тому подобное.

Термин "каркас антитела" относится к части вариабельного домена VL или VH, которая служит каркасом для антигенсвязывающих петель (CDR) вариабельного домена. Это, по существу, представляет собой вариабельный домен без CDR.

Термин "эпитоп" или "антигенная детерминанта" относится к сайту на антигене, с которым связывается иммуноглобулин или антитело. Эпитопы, как правило, содержат по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 смежных или несмежных аминокислот в уникальной пространственной конформации, см., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G.E.Morris, Ed. (1996).

Термины "специфическое связывание", "селективное связывание", "селективное связывание с" и "специфическое связывание с" относятся к связыванию антитела с эпитопом на заданном антигене. Как правило, антитело связывается с аффинностью (KD) менее чем около 10^-7 M, например, менее чем около10^-8 M, 10^-9 M или 10^-10 M или менее.

Термин "KD" относится к константе равновесия диссоциации для взаимодействия антитело-антиген. В целом, антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент) по настоящему изобретению связывается с CEA (или его эпитопом) с константой равновесия диссоциации (KD) менее чем около 10^-7 M, например, менее чем около 10^-8 M или 10^-9 M; например, значение KD определяют с использованием метода FACS для аффинности антитела по настоящему изобретению к антигену клеточной поверхности.

Термин "конкурировать" при использовании в случае, когда антигенсвязывающие белки (например, нейтрализующие антигенсвязывающие белки или нейтрализующие антитела) конкурируют за один и тот же эпитоп, относится к конкуренции между антигенсвязывающими белками, анализируемой с помощью последующего анализа, в котором антигенсвязывающий белок, подлежащий анализу (например, антитело или его иммунологически функциональный фрагмент), предотвращает или ингибирует (например, снижает) специфическое связывание эталонного антигенсвязывающего белка (например, лиганда или эталонного антитела) с общим антигеном (например, антигеном CEA или его фрагментом). Многочисленные типы конкурентных анализов связывания доступны для определения того, конкурирует ли антигенсвязывающий белок с другим, например, твердофазный прямой или непрямой радиоиммуноанализ (RIA), твердофазный прямой или непрямой иммуноферментный анализ (EIA) и сэндвич-конкурентный анализ (см., например, Stahli и др., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253), твердофазный прямой биотин-авидин ИФА (см., например, Kirkland и др., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619), твердофазный прямой меченый анализ и твердофазный прямой меченый сэндвич-анализ (см., например, Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press), твердофазный прямой меченый RIA с меткой I-125 (см., например, Morel и др., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15), твердофазный прямой биотин-авидин EIA (см., например, Cheung, и др., 1990, Virology 176:546-552) и прямой меченый RIA (Moldenhauer и др., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82). В целом, анализ относится к применению очищенного антигена, связывающегося с твердой поверхностью или клеткой, несущей любой из немеченого анализируемого антигенсвязывающего белка и меченого эталонного антигенсвязывающего белка. Конкурентное ингибирование измеряют путем измерения количества метки, связанной с твердой поверхностью или клеткой в присутствии анализируемого антигенсвязывающего белка. Как правило, анализируемый антигенсвязывающий белок присутствует в избыточном количестве. Антигенсвязывающие белки, идентифицированные с помощью конкурентного анализа (конкурентные антигенсвязывающие белки), включают: антигенсвязывающий белок, связывающийся с тем же эпитопом, что и эталонный антигенсвязывающий белок, и антигенсвязывающий белок, связывающийся с соседним эпитопом, достаточно близким к связывающему эпитопу эталонного антигенсвязывающего белка, и два эпитопа пространственно мешают друг другу для предотвращения связывания. Другая подробная информация о способе анализа конкурентного связывания представлена в примерах в настоящем документе. Как правило, когда конкурентный антигенсвязывающий белок присутствует в избыточном количестве, специфическое связывание эталонного антигенсвязывающего белка с общим антигеном будет ингибироваться (например, снижаться) по меньшей мере на 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% или 75% или более. В некоторых случаях связывание ингибируется по меньшей мере на 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97% или 97% или более.

Термин "молекула нуклеиновой кислоты" относится к молекуле ДНК или молекуле РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно представляет собой двухцепочечную ДНК. Нуклеиновая кислота является "функционально связанной", когда она помещена в функциональную связь с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию кодирующей последовательности.

"Идентичность" аминокислотной последовательности относится к проценту аминокислотных остатков, разделяемых первой последовательностью и второй последовательностью, где при выравнивании аминокислотных последовательностей при необходимости вводятся гэпы для достижения максимального процента идентичности последовательности, и любая консервативная замена не рассматривается как часть идентичности последовательности. С целью определения процента идентичности аминокислотных последовательностей, выравнивания могут быть достигнуто различными способами, которые входят в область техники, например, с использованием общедоступного компьютерного программного обеспечения, такого как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области техники могут определить параметры, подходящие для измерения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания всей длины выровненных последовательностей.

Термин "вектор экспрессии" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она была связана. В одном варианте осуществления изобретения вектор представляет собой "плазмиду", которая относится к круговой двухцепочечной петле ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. В другом варианте осуществления вектор представляет собой вирусный вектор, где дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Векторы, раскрытые в настоящем документе, способны автономно реплицироваться в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальное происхождение репликации, и эписомальные векторы млекопитающих), или способны интегрироваться в геном клетки-хозяина после введения в клетку-хозяина и, таким образом, реплицироваться с геномом хозяина (например, неэписомальные векторы млекопитающих).

Способы получения и очистки антител и антигенсвязывающих фрагментов хорошо известны в данной области техники, например, описанные в главах 5-8 и 15 публикации Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press. Антигенсвязывающие фрагменты также могут быть получены с использованием общепринятых способов. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, генетически сконструированы таким образом, чтобы содержать одну или более дополнительных области FR человека в области CDR нечеловеческого происхождения. Последовательности зародышевой линии FR человека можно получить на веб-сайте http://imgt.cines.fr ImMunoGeneTics (IMGT) или в журнале иммуноглобулинов, Lefranc, G., the Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, 2001ISBN012441351, путем сравнения с базой данных генов вариабельной области зародышевой линии человеческих антител IMGT программным обеспечением MOE.

Термин "клетка-хозяин" относится к клетке, в которую был введен вектор экспрессии. Клетки-хозяева могут включать бактериальные, микробные, растительные или животные клетки. Бактерии, чувствительные к трансформации, включают членов семейства Enterobacteriaceae, таких как штаммы Escherichia coli или Salmonella; членов семейства Bacillaceae, таких как Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus; и Haemophilus influenzae. Подходящие микроорганизмы включают Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris. Подходящие линии клеток-хозяев животных включают CHO (линия клеток яичника китайского хомячка) и клетки NS0.

Сконструированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент в настоящем изобретении могут быть получены и очищены обычными методами. Например, последовательности кДНК, кодирующие тяжелую и легкую цепи, можно клонировать и рекомбинировать в вектор экспрессии. Векторы экспрессии рекомбинантного иммуноглобулина могут быть стабильно трансфицированы в клетки-хозяева. В качестве более рекомендуемых в предшествующем уровне техники системы экспрессии млекопитающих приведут к гликозилированию антитела, в частности, в N-концевом сайте Fc-области. Положительные клоны размножаются в среде в биореакторе для получения антител. Культура с секретируемым антителом может быть очищена с использованием обычных методик, например, с использованием колонки A или G Sepharose FF. Неспецифически связанные фракции вымывали. Связанное антитело элюировали методом градиента рН, а фрагменты антител детектируют с помощью SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) и собирали. Антитело могут быть отфильтрованы и концентрированы обычными методами. Растворимые смеси и полимеры также могут быть удалены обычными методами, такими как молекулярные сита и ионный обмен. Полученный продукт должен быть немедленно заморожен, например, при -70°C, или лиофилизирован.

Термин "пептид" относится к фрагменту соединения между аминокислотой и белком. Он образуется путем соединения 2 или более аминокислотных молекул пептидными связями и является структурным и функциональным фрагментом белка.

Термин "сахар" относится к биомакромолекулам, состоящим из C, H и O элементов. Они могут быть классифированы на моносахариды, дисахариды, полисахариды и т.п.

Термин "алкил" относится к насыщенной алифатической углеводородной группе, которая представляет собой линейную или разветвленную группу, содержащую от 1 до 20 атомов углерода, предпочтительно алкилу, содержащему от 1 до 12 атомов углерода, более предпочтительно алкилу, содержащему от 1 до 10 атомов углерода, и наиболее предпочтительно алкилу, содержащему от 1 до 6 атомов углерода (содержащему 1, 2, 3, 4, 5 или 6 атомов углерода). Неограничивающие примеры включают метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, трет-бутил, втор-бутил, н-пентил, 1,1-диметилпропил, 1,2-диметилпропил, 2,2-диметилпропил, 1-этилпропил, 2-метилбутил, 3-метилбутил, н-гексил, 1-этил-2-метилпропил, 1,1,2-триметилпропил, 1,1-диметилбутил, 1,2-диметилбутил, 2,2-диметилбутил, 1,3-диметилбутил, 2-этилбутил, 2-метилпентил, 3-метилпентил, 4-метилпентил, 2,3-диметилбутил, н-гептил, 2-метилгексил, 3-метилгексил, 4-метилгексил, 5-метилгексил, 2,3-диметилпентил, 2,4-диметилпентил, 2,2-диметилпентил, 3,3-диметилпентил, 2-этилпентил, 3-этилпентил, н-октил, 2,3-диметилгексил, 2,4-диметилгексил, 2,5-диметилгексил, 2,2-диметилгексил, 3,3-диметилгексил, 4,4-диметилгексил, 2-этилгексил, 3-этилгексил, 4-этилгексил, 2-метил-2-этилпентил, 2-метил-3-этилпентил, н-нонил, 2-метил-2-этилгексил, 2-метил-3-этилгексил, 2,2-диэтилпентил, н-децил, 3,3-диэтилгексил, 2,2-диэтилгексил, и их различные изомеры с боковыми цепями и т.д. Более предпочтительным является низший алкил, имеющий от 1 до 6 атомов углерода, и неограничивающие примеры включают метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, трет-бутил, втор-бутил, н-пентил, 1,1-диметилпропил, 1,2-диметилпропил, 2,2-диметилпропил, 1-этилпропил, 2-метилбутил, 3-метилбутил, н-гексил, 1-этил-2-метилпропил, 1,1,2-триметилпропил, 1,1-диметилбутил, 1,2-диметилбутил, 2,2-диметилбутил, 1,3-диметилбутил, 2-этилбутил, 2-метилпентил, 3-метилпентил, 4-метилпентил, 2,3-диметилбутил и т.д. Алкил может быть замещенным или незамещенным. При замещении заместитель может быть замещен в любом доступном месте соединения, где заместитель предпочтительно представляет собой одну или более из следующих групп, независимо выбранных из группы, состоящей из алкила, алкенила, алкинила, алкокси, алкилтио, алкиламино, галогена, меркапто, гидрокси, нитро, циано, циклоалкила, гетероциклоалкила, арила, гетероарила, циклоалкокси, гетероциклоалкокси, циклоалкилтио, гетероциклоалкилтио и оксо.

Термин "гетероалкил" относится к алкилу, содержащему один или более гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, O и S, где алкил является таким, как определено выше.

Термин "алкилен" относится к насыщенной линейной или разветвленной алифатической углеводородной группе, имеющей 2 остатка, полученных из исходного алкана путем удаления двух атомов водорода из одного и того же атома углерода или двух разных атомов углерода. Эта линейная или разветвленная группа, содержит от 1 до 20 атомов углерода, предпочтительно алкилен, содержащий от 1 до 12 атомов углерода, более предпочтительно алкилен, содержащий от 1 до 6 атомов углерода (содержащий 1, 2, 3, 4, 5 или 6 атомов углерода). Неограничивающие примеры алкилена включают, но не ограничиваются ими, метилен(-CH₂-), 1,1-этилиден(-CH(CH₃)-), 1,2-этилиден(-CH₂CH₂)-, 1,1-пропилиден(-CH(CH₂CH₃)-), 1,2-пропилиден(-CH₂CH(CH₃)-), 1,3-пропилиден(-CH₂CH₂CH₂-), 1,4-бутилиден(-CH₂CH₂CH₂CH₂-), 1,5-бутилиден(-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-) и тому подобное. Алкилен может быть замещенным или незамещенным. При замещении заместитель может быть замещен в любом доступном месте соединения одним или более заместителями, предпочтительно независимо необязательно выбранными из группы, состоящей из алкила, алкенила, алкинила, алкокси, алкилтио, алкиламино, галогена, меркапто, гидрокси, нитро, циано, циклоалкила, гетероциклила, арила, гетероарила, циклоалкокси, гетероциклоалкокси, циклоалкилтио, гетероциклоалкилтио и оксо.

Термин "алкокси" относится к группе -O-(алкил) и -O-(незамещенный циклоалкил), где алкил или циклоалкил является таким, как определено выше. Неограничивающие примеры алкокси включают метокси, этокси, пропокси, бутокси, циклопропокси, циклобутокси, циклопентилокси и циклогексилокси. Алкокси может быть необязательно замещенным или незамещенным, и когда он замещен, заместитель предпочтительно представляет собой одну или более из следующих групп, независимо выбранных из группы, состоящей из: алкила, алкенила, алкинила, алкокси, алкилтио, алкиламино, галогена, меркапто, гидрокси, нитро, циано, циклоалкила, гетероциклоалкила, арила, гетероарила, циклоалкокси, гетероциклоалкокси, циклоалкилтио и гетероциклоалкилтио.

Термин "галогеналкил" относится к алкильной группе, в которой водород замещен одним или более галогенами, где алкил является таким, как определено выше.

Термин "дейтерированный алкил" относится к алкильной группе, в которой водород замещен одним или более атомами дейтерия, где алкил является таким, как определено выше.

Термин "гидроксиалкил" относится к алкильной группе, в которой водород замещен одним или более гидрокси группами, где алкил является таким, как определено выше.

Термин "гидрокси" относится к группе -ОН.

Термин "галоген" относится к фтору, хлору, брому или иоду.

Термин "амино" относится к -NH₂.

Термин "нитро" относится к -NO₂.

Термин "циано" относится к -CN.

Настоящее изобретение также содержит различные дейтерированные формы соединений формулы (I). Каждый доступный атом водорода, соединенный с атомом углерода, может быть независимо замещен атомом дейтерия. Специалисты в данной области техники могут синтезировать соединения формулы (I) в дейтерированной форме со ссылкой на соответствующую литературу. Коммерчески доступные дейтерированные исходные материалы могут быть использованы для получения дейтерированных форм соединений формулы (I), или они могут быть синтезированы с использованием обычных методов с дейтерированными реагентами, включая, но не ограничиваясь ими, дейтерированный боран, тридейтерированный боран в тетрагидрофуране, дейтерированный гидрид лития-алюминия, дейтерированный йодэтан, дейтерированный йодметан и тому подобное.

Термин "необязательный" или "необязательно" означает, что событие или обстоятельство, описанное впоследствии, может, но не обязательно, иметь место, и что описание включает случаи, когда событие или обстоятельство происходит или не происходит. Например, "гетероциклильная группа, необязательно замещенная алкилом" означает, что алкил может присутствовать, но не обязательно, и что описание включает случаи, когда гетероциклильная группа является или не является замещенной алкилом.

"Замещенный" означает, что один или более, предпочтительно до 5 и более предпочтительно 1, 2 или 3 атома водорода в группе независимо замещены заместителем. Заместитель находится только в своем возможном химическом положении, и специалисты в данной области техники смогут определить (экспериментально или теоретически) возможную или невозможную замену без особых усилий. Например, он может быть нестабильным, когда амино или гидрокси, имеющая свободный водород, связана с атомом углерода, имеющим ненасыщенную (например, олефиновую) связь.

Термин "фармацевтическая композиция" относится к смеси, содержащей одно или более соединений, описанных в настоящем документе, или их физиологически/фармацевтически приемлемую соль, или пролекарство и другие химические компоненты, например, физиологически/фармацевтически приемлемые носители и эксципиенты. Назначение фармацевтической композиции состоит в том, чтобы способствовать введению в организм, который облегчает абсорбцию активного ингредиента, тем самым осуществляя биологическую активность.

Термин "фармацевтически приемлемая соль" относится к соли конъюгатов антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению или к соли активного соединения, описанного в настоящем изобретении. Такие соли являются безопасными и эффективными при использовании у субъектов и обладают требуемой биологической активностью. Конъюгат лиганд-лекарственное средство по настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну аминогруппу и, таким образом, может образовывать соль с кислотой. Неограничивающие примеры фармацевтически приемлемых солей включают: гидрохлорид, гидробромид, гидроиодат, сульфат, бисульфат, цитрат, ацетат, сукцинат, аскорбат, оксалат, нитрат, сорбат, гидрофосфат, дигидрофосфат, салицилат, гидроцитрат, тартрат, малеат, фумарат, формиат, бензоат, мезилат, этансульфонат, бензолсульфонат и п-толуолсульфонат.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения цитотоксическое лекарственное средство конъюгировано с меркаптогруппой антитела посредством линкерного фрагмента.

Нагрузка конъюгата лиганд-цитотоксическое лекарственное средство может контролироваться следующими неограничивающими способами, включая:

(1) контроль молярного соотношения линкерного реагента к моноклональному антителу,

(2) контроль времени и температуры реакции, и

(3) выбор различных реагентов.

Для получения обычных фармацевтических композиций делается ссылка на Китайскую фармакопею.

Термин "фармацевтически приемлемый носитель" для лекарственного средства по настоящему изобретению относится к системе, которая может изменять способ попадания лекарственного средства в организм субъекта и распределение лекарственного средства у субъекта, контролировать скорость высвобождения лекарственного средства и доставлять лекарственное средство в орган-мишень. Высвобождение носителя лекарственного средства и система-мишень могут уменьшить деградацию и потерю лекарственного средства, уменьшить побочные эффекты и улучшить биодоступность. Например, полимерные поверхностно-активные вещества, которые могут быть использованы в качестве носителей, могут самостоятельно собираться благодаря своим уникальным амфифильным структурам с образованием различных форм агрегатов, таких как мицеллы, микроэмульсии, гели, жидкие кристаллы и везикулы, в качестве предпочтительных примеров. Агрегаты имеют способность инкапсулировать молекулы лекарственного средства и имеют хорошую проницаемость для мембран, и поэтому могут быть использованы как превосходные носители лекарственого средства.

Термин "эксципиент" представляет собой добавку, помимо активного соединения, к фармацевтической композиции. Он также может называться адъювантом. Например, связующие вещества, наполнители, разрыхлители, смазывающие вещества в таблетках; основная часть в полутвердой мази и кремовых препаратах; консерванты, антиоксиданты, корригенты, ароматизаторы, сорастворители, эмульгаторы, солюбилизаторы, агенты, регулирующие тоничность, красители и тому подобное в жидких составах могут быть названы эксципиентами.

Термин "разбавитель", также называемый наполнителем, используется в первую очередь для увеличения массы и объема таблетки. Добавление разбавителя не только обеспечивает определенный объем, но и уменьшает отклонение дозы основных ингредиентов, а также улучшает способность лекарственного средства к прессованию и тому подобное. Когда лекарственное средство в форме таблетки содержит маслянистые компоненты, в обязательном порядке добавляют абсорбент для абсорбции маслянистых компонентов таким образом, чтобы поддерживать "сухое" состояние и, таким образом, облегчать получение таблетки. Примеры включают крахмал, лактозу, неорганические соли кальция, микрокристаллическую целлюлозу и тому подобное.

Фармацевтическая композиция может иметь форму стерильного водного раствора для инъекций. Доступные и приемлемые носители или растворители включают воду, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Стерильный препарат для инъекций может представлять собой стерильную микроэмульсию масло-в-воде для инъекций, в которой активный ингредиент растворен в масляной фазе. Например, активный ингредиент растворяют в смеси соевого масла и лецитина. Затем масляный раствор добавляют к смеси воды и глицерина и обрабатывают с образованием микроэмульсии. Инъекция или микроэмульсия может быть введена местно в кровоток субъекта в больших количествах. В качестве альтернативы, может быть желательным введение раствора и микроэмульсии таким образом, чтобы поддерживать постоянную циркулирующую концентрацию соединения по настоящему изобретению. Для поддержания такой постоянной концентрации может использоваться устройство для непрерывной внутривенной доставки. Примером такого устройства является насос для внутривенных инъекций Deltec CADD-PLUS. TM. 5400.

Фармацевтическая композиция может быть в форме стерильной водной или масляной суспензии для инъекции для внутримышечного и подкожного введения. Суспензия может быть получена в соответствии с предшествующим уровнем техники с использованием тех подходящих диспергаторов или увлажняющих агентов и суспендирующих агентов, упомянутых выше. Стерильный состав для инъекции также может представлять собой стерильную инъекцию или суспензию, полученную в парентерально приемлемом нетоксичном разбавителе или растворителе, например, растворе, полученном в 1,3-бутандиоле. Кроме того, стерильное нелетучее масло может обычно использоваться в качестве растворителя или суспендирующей среды. Для этой цели может быть использована любая смесь нелетучего масла, включая синтетические моноглицериды или диглицериды. Кроме того, при получении инъекций также могут быть использованы жирные кислоты, такие как олеиновая кислота.

Настоящее изобретение относится к расщепляемому связывающему плечу со специфической структурой, активному веществу со специфической структурой и конъюгату антитело-лекарственное средство, состоящему из связывающего плеча, активного вещества и антитела. Такой ADC представляет собой комплекс, образованный путем связывания токсичного вещества с антителом через спейсер. Конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC) разлагается in vivo с высвобождением активных молекул, тем самым играя противоопухолевую роль.

2. Способ синтеза

Для целей синтеза приняты следующие технические схемы синтеза:

Способ получения соединения общей формулы (Pc-L_a-Y-D) включает следующие стадии:

подвергание реакции сочетания восстановленного Pc и общей формулы (L_a-Y-D) с получением соединения общей формулы (Pc-L_a-Y-D), где восстановитель предпочтительно представляет собой TCEP (трис(2-карбоксиэтил)фосфин); в частности, дисульфидные связи в антителе предпочтительно являются восстановленными;

где:

Pc, W, L², L³, R¹, R², R⁵-R⁷, m и n являются такими, как определено в общей формуле (Pc-L_a-Y-D).

Один или более вариантов осуществления настоящего изобретения подробно описаны в описании выше. Хотя любые способы и материалы, подобные или идентичные описанным здесь, могут быть использованы для осуществления или тестирования настоящего изобретения, предпочтительные способы и материалы описаны ниже. Другие признаки, объекты и преимущества изобретения будут очевидны из описания и формулы изобретения. В описании и формуле изобретения формы единственного числа включают множественное число, если иное четко не указано в контексте. Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют общие значения, понятные специалисту в данной области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение. Все патенты и публикации, цитируемые в описании, включены посредством ссылки. Следующие примеры приведены для того, чтобы более полно проиллюстрировать предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения. Эти примеры не следует никоим образом истолковывать как ограничивающие объем настоящего изобретения, который определен формулой изобретения.

Пример 1: Получение рекомбинантного белка CEA и стабильно трансфицированной клетки

I. Последовательности рекомбинантного антигена CEA и белка CEA, экспрессируемые на поверхности клетки

Аминокислотные последовательности человеческого CEA с Fc и His метками клонировали в векторы экспрессии клеток млекопитающих, и рекомбинантный белок получали после экспрессии и очистки в клетках 293E, а затем использовали в экспериментах последующих примеров. Между тем, ген CEA человека без метки, ген CEACAM1 человека и ген CEA обезьяны трансфицировали в клетки CHO с образованием клеточного штамма CHO, экспрессирующего белок CEA на клеточных поверхностях, для последующего скрининга и идентификации антител. Аминокислотные последовательности родственных белков являются следующими:

1. Аминокислотная последовательность CEA-His человека (hCEA-His):

(SEQ ID NO: 1)

2. Аминокислотная последовательность CEA-Fc человека (hCEA-Fc):

KLTIESTPFNVAEGKEVLLLVHNLPQHLFGYSWYKGERVDGNRQIIGYVIGTQQATPGPAYSGREIIYPNASLLIQNIIQNDTGFYTLHVIKSDLVNEEATGQFRVYPELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPETQDATYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDTASYKCETQNPVSARRSDSVILNVLYGPDAPTISPLNTSYRSGENLNLSCHAASNPPAQYSWFVNGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYTCQAHNSDTGLNRTTVTTITVYAEPPKPFITSNNSNPVEDEDAVALTCEPEIQNTTYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNDNRTLTLLSVTRNDVGPYECGIQNELSVDHSDPVILNVLYGPDDPTISPSYTYYRPGVNLSLSCHAASNPPAQYSWLIDGNIQQHTQELFISNITEKNSGLYTCQANNSASGHSRTTVKTITVSAELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPEAQNTTYLWWVNGQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDARAYVCGIQNSVSANRSDPVTLDVLYGPDTPIISPPDSSYLSGANLNLSCHSASNPSPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

(SEQ ID NO:2)

3. Аминокислотная последовательность CEA-His яванского макака (cynoCEA-His):

(SEQ ID NO:3)

4. Аминокислотная последовательность CEA человека, экспрессируемая на поверхности клеток CHO (hCEA-CHO):

MESPSAPPHRWCIPWQRLLLTASLLTFWNPPTTAKLTIESTPFNVAEGKEVLLLVHNLPQHLFGYSWYKGERVDGNRQIIGYVIGTQQATPGPAYSGREIIYPNASLLIQNIIQNDTGFYTLHVIKSDLVNEEATGQFRVYPELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPETQDATYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDTASYKCETQNPVSARRSDSVILNVLYGPDAPTISPLNTSYRSGENLNLSCHAASNPPAQYSWFVNGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYTCQAHNSDTGLNRTTVTTITVYAEPPKPFITSNNSNPVEDEDAVALTCEPEIQNTTYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNDNRTLTLLSVTRNDVGPYECGIQNELSVDHSDPVILNVLYGPDDPTISPSYTYYRPGVNLSLSCHAASNPPAQYSWLIDGNIQQHTQELFISNITEKNSGLYTCQANNSASGHSRTTVKTITVSAELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPEAQNTTYLWWVNGQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDARAYVCGIQNSVSANRSDPVTLDVLYGPDTPIISPPDSSYLSGANLNLSCHSASNPSPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAGATVGIMIGVLVGVALI

(SEQ ID NO:4)

5. Аминокислотная последовательность CEA обезьяны, экспрессируемая на поверхности клеток CHO (cynoCEA-CHO):

MEFGLSWLFLVAILKGVQCQLTIESRPFNVAEGKEVLLLAHNVSQNLFGYIWYKGERVDASRRIGSCVIRTQQITPGPAHSGRETIDFNASLLIQNVTQSDTGSYTIQVIKEDLVNEEATGQFRVYPELPKPYITSNNSNPIEDKDAVALTCEPETQDTTYLWWVNNQSLPVSPRLELSSDNRTLTVFNIPRNDTTSYKCETQNPVSVRRSDPVTLNVLYGPDAPTISPLNTPYRAGEYLNLTCHAASNPTAQYFWFVNGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYMCQAHNSATGLNRTTVTAITVYAELPKPYITSNNSNPIEDKDAVTLTCEPETQDTTYLWWVNNQRLSVSSRLELSNDNRTLTVFNIPRNDTTFYECETQNPVSVRRSDPVTLNVLYGPDAPTISPLNTPYRAGENLNLSCHAASNPAAQYFWFVNGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYMCQAHNSATGLNRTTVTAITVYVELPKPYISSNNSNPIEDKDAVTLTCEPVAENTTYLWWVNNQSLSVSPRLQLSNGNRILTLLSVTRNDTGPYECGIQNSESAKRSDPVTLNVTYGPDTPIISPPDLSYRSGANLNLSCHSDSNPSPQYSWLINGTLRQHTQVLFISKITSNNNGAYACFVSNLATGRNNSIVKNISVSSGDSAPGSSGLSARATVGIIIGMLVGVALM

(SEQ ID NO: 5)

6. Аминокислотная последовательность CEACAM1 человека, экспрессируемая на поверхности клеток CHO (CEACAM1-CHO):

MGHLSAPLHRVRVPWQGLLLTASLLTFWNPPTTAQLTTESMPFNVAEGKEVLLLVHNLPQQLFGYSWYKGERVDGNRQIVGYAIGTQQATPGPANSGRETIYPNASLLIQNVTQNDTGFYTLQVIKSDLVNEEATGQFHVYPELPKPSISSNNSNPVEDKDAVAFTCEPETQDTTYLWWINNQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLLSVTRNDTGPYECEIQNPVSANRSDPVTLNVTYGPDTPTISPSDTYYRPGANLSLSCYAASNPPAQYSWLINGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYTCHANNSVTGCNRTTVKTIIVTELSPVVAKPQIKASKTTVTGDKDSVNLTCSTNDTGISIRWFFKNQSLPSSERMKLSQGNTTLSINPVKREDAGTYWCEVFNPISKNQSDPIMLNVNYNALPQENGLSPGAIAGIVIGVVALVALIAVALACFLHFGKTGRASDQRDLTEHKPSVSNHTQDHSNDPPNKMNEVTYSTLNFEAQQPTQPTSASPSLTATEIIYSEVKKQ

(SEQ ID NO: 6)

II. Очистка родственных белков

1. Очистка белка с помощью His-метки

Образец супернатанта для экспрессии клеток центрифугировали на высокой скорости для удаления примесей. Колонку с никелем уравновешивали буфером PBS (pH 7,4) и промывали 2-5 объемами колонки, и образец супернатанта наносили на колонку Ni Sepharose excel со скоростью потока. Колонку промывали буфером PBS до тех пор, пока показания A₂₈₀ не упали до исходного уровня. Затем колонку для хроматографии промывали PBS + 10 мМ имидазола для удаления неспецифически связанных примесных белков и собирали вытекшую жидкость. Наконец, целевой белок элюировали раствором PBS, содержащим 300 мМ имидазола, и получали пик элюирования. Собранный элюат концентрировали, и буфер образца заменяли на раствор PBS с помощью обессоливающей колонки с получением смеси для использования в последующих экспериментах.

2. Очистка белка, содержащего Fc, химерное антитело и гибридомное антитело

Образец супернатанта экспрессии клеток центрифугировали на высокой скорости для удаления примесей, рекомбинантный белок, содержащий Fc, и супернатант экспрессии химерных антител очищали с использованием колонки с белком A, и супернатант экспрессии гибридомы очищали с использованием колонки с белком G. Супернатант наносили на колонку со скоростью потока. Колонку промывали буфером PBS до тех пор, пока показания A₂₈₀ не упали до исходного уровня. Целевой белок элюировали 100 мМ уксусной кислотой при рН 3,0 и нейтрализовали 1 М Трис-HCl при рН 8,0. Элюированный образец концентрировали, и буфер образца заменяли на PBS с получением смеси, которую аликвотировали для последующего использования.

Пример 2: Получение мышиного моноклонального антитела против CEA человека

1. Иммунизация и слияние

Мышей иммунизировали белком hCEA-His и белком cyno-CEA-His или перекрестно иммунизировали клетками hCEA-CHO и клетками cynoCEA-CHO. Количество иммунизации белком составляло 50 мкг для первой иммунизации и 25 мкг для последующих иммунизаций, клеточная иммунизация составляла 10⁷ клеток на иммунизацию, и иммунизация проводилась один раз в две недели. После 3 иммунизаций брали кровь для определения активности антител в сыворотке. Мыши, у которых титр антител в сыворотке крови был высоким и достигал плато, отбирали для слияния спленоцитов. Лимфоциты селезенки и клетки миеломы, клетки Sp2/0 (ATCC (Американская коллекция типовых культур)® CRL-8287™), сливали процедурой слияния, опосредованной PEG, для получения гибирдомных клеток. Слитые гибридомные клетки ресуспендировали в MC полутвердой полной среде (среда RPMI-1640, содержащая 20% FBS, 1×HAT (гипоксантин-аминоптерин тимидин), 1×OPI (оксалоацетат-пируват-инсулин) и 2% метилцеллюлозы) при плотности 0,5-1×10⁶ клеток/мл, и суспензию аликвотировали в 35 мм чашки для культивирования клеток и инкубировали при 37°С с 5% CO₂ в течение 7-9 дней. На 7-9 день после слияния, в соответствии с размером клеточного клона, одиночные клеточные клоны собирали в 96-луночный планшет для культивирования клеток, к которому добавляли 200 мкл/лунку полной среды HT (среда RPMI-1640, содержащая 20% FBS, 1×HT (гипоксантин-тимидин) и 1×OPI), культивировали при 37°C с 5% CO₂ в течение 3 дней, а затем детектировали.

2. Скрининг гибридомных клеток

Первичный скрининг антител проводили на основе твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) антигенов клеточной поверхности. Клетки наносили на планшет ELISA (Corning, кат. № 3599) и культивировали в течение ночи в инкубаторе при 37°C. Когда клетки полностью прилипли к стенке и почти заполнили всю лунку, супернатант удаляли. Клетки промывали один раз PBS, а затем фиксировали буфером для фиксации клеток (Beyotime, кат. № P0098) при комнатной температуре в течение 45 мин. Фиксирующий буфер удаляли, и планшет промывали 3 раза с помощью устройства для промывки планшета и блокировали 5% сухим обезжиренным молоком при 37°C в течение более 3 часов. Блокирующий буфер удаляли, и планшет промывали 3 раза с помощью устройства для промывки для планшета. Планшет с заблокированными клетками хранили при -20°C или использовали напрямую. При использовании планшета добавляли супернатант культуры клеток гибридомы, разбавленной в градиенте, и планшет инкубировали при 37°C в течение 1 ч и промывали 3 раза с использованием устройства для промывки планшетов. Добавляли 100 мкл 100000-кратного разведенного козьего вторичного антитела против IgG мыши H&L (HRP) (Abcam, кат. № ab205719), и планшет инкубировали при 37°C в течение 1 часа и промывали 3 раза с помощью устройства для промывки планшетов. Добавляли 100 мкл TMB (KPL, кат . № 5120-0077), и планшет помещали при 37°C для цветопроявления в течение 10 мин. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 1 М серной кислоты, и считывали оптическую плотность при 450 нм с помощью микропланшетного ридера. Когда тестируемое антитело связывалось с CEA на поверхности клетки, не будучи конкурентно связанным растворимым CEA (sCEA), антитело инкубировали с sCEA в течение 30 минут, а затем добавляли в планшет для клеток.

Отобранные положительные клоны размножали, замораживали для сохранения семян и субклонировали два-три раза до тех пор, пока не получали одноклеточные клоны. Отобранные клоны гибридомы дополнительно получали и очищали с помощью бессывороточной клеточной культуры. Связывание полученного гибридомного антитела с белком CEA на поверхности клетки детектировали с помощью проточного цитометра (способ показан в тестовом примере 1 настоящего изобретения), и отбирали штаммы клеток гибридомы с хорошей связывающей активностью. Результаты детектирования активности связывания штаммов клеток моноклональной гибридомы mAb47, mAb63, mAb67 и mAb103 приведены в таблице 1:

Таблица 1. Результаты эксперимента по связыванию мышиных антител с белками CEA клеточной поверхности Антитела EC₅₀ (полумаксимальная эффективная концентрация) (нМ) MKN45 cynoCEA-CHO CEACAM1-CHO mAb47 2,10 1,66 Нет связывания mAb63 3,62 2,88 Нет связывания mAb67 1,90 6,00 Нет связывания mAb103 3,94 0,71 Нет связывания

3. Секвенирование гибридомных антител

Штаммы клеток моноклональной гибридомы mAb47, mAb63, mAb67 и mAb103 были выбраны, и последовательности моноклональных антител были клонированы. Процесс клонирования был следующим: собирали клетки гибридомы, растущие в логарифмической фазе, и экстрагировали РНК с использованием тризоля (Invitrogen, кат. №15596-018) и обратно транскрибировали в кДНК. После PCR-амплификации (полимеразная цепная реакция) с использованием кДНК в качестве матрицы кДНК секвенировали компанией, занимающейся секвенированием, и аминокислотные последовательности антител, соответствующие полученным последовательностям ДНК, показаны в таблице 2 ниже:

Таблица 2. Последовательности вариабельных областей мышиных антител против CEA Антитела Последовательность вариабельной области тяжелой цепи VH Последовательность вариабельной области легкой цепи VL mAb47 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTTYGMSWVKQAPGKGLKWMGWINTYSGVPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARRGNYGRWDFDVWGTGTTVTVSS
(SEQ ID NO: 7) EIVLTQSPALMAASPGEKVTITCSVSSTISSSNLHWYQQKSETSPKPWIYGTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSIYPLTFGAGTKLELK
(SEQ ID NO: 8) mAb63 EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDFYMNWVRQSHGKSLEWIGDIFPKNGNTDYNRKFKDKATLTVDKSSNTVYMEFRSLTLEDSAIYFCARSGYGNYVFDYWGQGTIFTVSS
(SEQ ID NO: 9) DVQMTQTPSALSASLGDRVTISCRTSQDINIYLNWYQQKPDGTVKLLIYYRSGLLSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYFCQQGNTLPPTFGGGTKLEIK
(SEQ ID NO: 10) mAb67 EVQLQQSGPELVKPGASVKIYCKASGYTFTDYHMNWVKQSHGKSLEWIGDINPDIGGTSYNQNFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCSRWDFDSFANWGQGTLVTVSA
(SEQ ID NO: 11) DIVMTQSPASLAMSLGKRATISCRASESVSIIGTNLIHWYQQKPGQPPKLLIYHASNLETGVPARFSGSGSGADFTLTIDPVEGDDVALYYCLQSRKIPYTFGGGTKMEIK
(SEQ ID NO: 12) mAb103 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTTYGVIWVKQAPGKGLKWMGWINTYSGVPTYADDFKGRFAFSLETSASTAFLQINNLKNEDTATYFCARKKTLTTVTPWFAYWGQGTLVTVSA
(SEQ ID NO: 13) DLVVTQSSSASFSLGASAKLTCTLSSQHSTYTIEWYQQQPLKPPKYVMELKKDGSHSTGDGIPDRFSGSSSGADRYLTISNIQPEDEAIYICGVGNTIKEQFVYVFGGGTKVTVL
(SEQ ID NO: 14)

Таблица 3. Последовательности CDR антител против CEA Антитела Последовательность CDR тяжелой цепи Последовательность CDR легкой цепи mAb47 HCDR1 TYGMS
(SEQ ID NO: 15) LCDR1 SVSSTISSSNLH
(SEQ ID NO: 18) HCDR2 WINTYSGVPTYADDFKG
(SEQ ID NO: 16) LCDR2 GTSNLAS
(SEQ ID NO: 19) HCDR3 RGNYGRWDFDV
(SEQ ID NO: 17) LCDR3 QQWSIYPLT
(SEQ ID NO: 20) mAb63 HCDR1 DFYMN
(SEQ ID NO: 21) LCDR1 RTSQDINIYLN
(SEQ ID NO:24) HCDR2 DIFPKNGNTDYNRKFKD
(SEQ ID NO:22) LCDR2 YRSGLLS
(SEQ ID NO:25) HCDR3 SGYGNYVFDY
(SEQ ID NO:23) LCDR3 QQGNTLPPT
(SEQ ID NO:26) mAb67 HCDR1 DYHMN
(SEQ ID NO:27) LCDR1 RASESVSIIGTNLIH
(SEQ ID NO: 30) HCDR2 DINPDIGGTSYNQNFKG
(SEQ ID NO: 28) LCDR2 HASNLET
(SEQ ID NO: 31) HCDR3 WDFDSFAN
(SEQ ID NO: 29) LCDR3 LQSRKIPYT
(SEQ ID NO: 32) mAb103 HCDR1 TYGVI
(SEQ ID NO: 33) LCDR1 TLSSQHSTYTIE
(SEQ ID NO:35) HCDR2 WINTYSGVPTYADDFKG
(SEQ ID NO: 16) LCDR2 LKKDGSHSTGD
(SEQ ID NO:36) HCDR3 KKTLTTVTPWFAY
(SEQ ID NO: 34) LCDR3 GVGNTIKEQFVYV
(SEQ ID NO:37)

Примечание: последовательности CDR антител в таблице были определены по системе нумерации Кабата.

4. Получение химерного антитела IgG1 человека

Последовательности генов, кодирующих вариабельную область, были получены путем амплификации и секвенирования молекул-кандидатов mAb47, mAb63, mAb67 и mAb103, полученных путем скрининга гибридом, праймер с хвостовой частью был сконструирован с использованием последовательностей, полученных путем секвенирования, фрагменты гена VH/VK были сконструированы для каждого антитела с помощью PCR с использованием секвенированного гена в качестве матрицы и гомологично рекомбинированы с вектором экспрессии pHr (с сигнальным пептидом и геном константной области hIgG1/hkappa/hlambda (CH1-Fc/CL)) для конструирования полноразмерной плазмиды VH-CH1-Fc-pHr/VL-CL-pHr рекомбинантного химерного антитела Ch47, Ch63, Ch67 и Ch103.

Пример 3: Гуманизация моноклональных антител мыши против CEA человека

Сравнивая базу данных генов зародышевой линии вариабельной области тяжелой и легкой цепи антитела человека IMGT и программное обеспечение MOE, в качестве матриц выбирали гены зародышевой области вариабельной области тяжелой и легкой цепи с высокой гомологией, а CDR мышиного антитела прививали в соответствующие гуманизированные матрицы с образованием последовательностей вариабельной области в последовательности FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Аминокислотные остатки CDR антител в следующих примерах были определены и аннотированы системой нумерации Кабата.

1. Гуманизация мышиного антитела mAb47

Гены зародышевой линии вариабельной области тяжелой и легкой цепи с высокой гомологией были выбраны в качестве матриц; например, для мышиного антитела mAb47 IGKV6-21*01 и IGKJ2*01 были выбраны в качестве гуманизированных матриц легкой цепи, а IGHV7-4-1*02 и IGHJ6 *01 были выбраны в качестве гуманизированных матриц тяжелой цепи. CDR мышиного антитела mAb47 прививали в соответствующие гуманизированные матрицы для гуманизации, а конструкция гуманизированных обратных мутаций для мышиного антитела mAb47 показана в таблице 4 ниже:

Таблица 4. Конструкция гуманизации для мышиного антитела mAb47 Вариабельная область легкой цепи гуманизированного антитела mAb47 Вариабельная область тяжелой цепи гуманизированного антитела mAb47 h47VL1 Привитая (IGKV6-21*01+IGKJ2*01) h47VH1 Привитая (IGHV7-4-1*02+IGHJ6*01) h47VL2 Привитая (IGKV6-21*01+IGKJ2*01)+L46P, K49Y, F71Y h47VH2 Привитая (IGHV7-4-1*02+IGHJ6*01)+E46K h47VL3 Привитая (IGKV6-21*01+IGKJ2*01)+L46P, L47W, K49Y, F71Y h47VH3 Привитая (IGHV7-4-1*02+IGHJ6*01)+R38K, E46K h47VL4 Привитая (IGKV6-21*01+IGKJ2*01)+L46P, L47W, K49Y, D70S, F71Y h47VH4 Привитая (IGHV7-4-1*02+IGHJ6*01)+R38K, E46K

Примечание: положения аминокислот в таблице были пронумерованы с использованием схемы нумерации Кабата; например, L46P означает, что L в положении 46 мутирован обратной мутацией в P в соответствии с системой нумерации Кабата; привитая означает, что CDR мышиных антител привиты в последовательности зародышевой области FR человека.

Кроме того, мутацию D61S дополнительно ввели в вариабельную область тяжелой цепи h47VH3 (т.е., ввели аминокислотную мутацию в антитело HCDR2, так что последовательность антитела HCDR2 была изменена с (SEQ ID NO: 16) на (SEQ ID NO: 38)) для получения вариабельной области тяжелой цепи h47VH4 с сохранением хорошей активности антитела.

Конкретные последовательности гуманизированного мышиного антитела mAb47 показаны в таблице 5:

Примечание: области CDR (определенные по системе нумерации Кабата) подчеркнуты в таблице, а сайты мутаций выделены жирным курсивом.

2. Гуманизация мышиного антитела mAb63

Гены зародышевой линии вариабельной области тяжелой и легкой цепи с высокой гомологией были выбраны в качестве матриц; например, для мышиного антитела mAb63, IGKV1-39*01 и IGKJ4*01 были выбраны в качестве гуманизированных матриц легкой цепи, а IGHV1-46*01 и IGHJ1*01 были выбраны в качестве гуманизированных матриц тяжелой цепи. CDR мышиного антитела mAb63 прививали в соответствующие гуманизированные матрицы для гуманизации, а конструкция гуманизированных обратных мутаций для мышиного антитела mAb63 показана в таблице 6 ниже:

Таблица 6. Конструкция гуманизированного мышиного антитела mAb63 Вариабельная область легкой цепи гуманизированного антитела mAb63 Вариабельная область тяжелой цепи гуманизированного антитела mAb63 h63VL1 Привитая (IGKV1-39*01+IGKJ4*01) h63VH1 Привитая (IGHV1-46*01+IGHJ1*01) h63VL2 Привитая (IGKV1-39*01+IGKJ4*01)+I2V, F71Y h63VH2 Привитая (IGHV1-46*01+IGHJ1*01)+M69L, R71V, T73K h63VL3 Привитая (IGKV1-39*01+IGKJ4*01)+I2V, K42G, P44V, F71Y h63VH3 Привитая (IGHV1-46*01+IGHJ1*01)+M48I, V67A, M69L, R71V, T73K, L82F h63VH4 Привитая (IGHV1-46*01+IGHJ1*01)+M48I, R66K, V67A, M69L, R71V, T73K, L82F, S 82A R

Примечание: положения аминокислот в таблице были пронумерованы с использованием схемы нумерации Кабата; например, S82AR означает, что S в положении 82A мутирован обратной мутацией в R в соответствии с системой нумерации Кабата; привитая означает, что CDR мышиных антител привиты в последовательности зародышевой области FR человека.

Кроме того, мутацию N54S дополнительно ввели в вариабельную область тяжелой цепи h63VH1 (т.е., ввели аминокислотную мутацию в антитело HCDR2, так что последовательность антитела HCDR2 была изменена с (SEQ ID NO: 22) на (SEQ ID NO: 47)) для получения вариабельной области тяжелой цепи h63VH5 с сохранением хорошей активности антитела.

Конкретные последовательности гуманизированного и мутированного мышиного антитела mAb63 показаны в таблице 7:

Примечание: области CDR (определенные по системе нумерации Кабата) подчеркнуты в таблице, а сайты мутаций выделены жирным курсивом.

3. Гуманизация мышиного антитела mAb67

Гены зародышевой линии вариабельной области тяжелой и легкой цепи с высокой гомологией были выбраны в качестве матриц; например, для мышиного антитела mAb67, IGKV4-1*01 и IGKJ4*01, IGKV3-15*01 и IGKJ4*01 или IGKV1-39*01 и IGKJ4*01 были выбраны в качестве гуманизированных матриц легкой цепи, а IGHV1-3*01 и IGHJ1*01 или IGHV5-51*01 и IGHJ1*01 были выбраны в качестве гуманизированных матриц тяжелой цепи. CDR мышиного антитела mAb67 прививали в соответствующие гуманизированные матрицы для гуманизации, а конструкция гуманизированных обратных мутаций для мышиного антитела mAb67 показана в таблице 8 ниже:

Таблица 8. Гуманизированный дизайн мышиного антитела mAb67 Вариабельная область легкой цепи гуманизированного антитела mAb67 Вариабельная область тяжелой цепи гуманизированного антитела mAb67 h67VL1 Привитая (IGKV4-1*01+IGKJ4*01) h67VH1 Привитая IGHV1-3*01+IGHJ1*01) h67VL2 Привитая (IGKV3-15*01+IGKJ4*01) h67VH2 Привитая (IGHV5-51*01+IGHJ1*01) h67VL3 Привитая (IGKV3-15*01+ IGKJ4*01)+A43P, I58V h67VH3 Привитая (IGHV5-51*01+IGHJ1*01)+R38K, Q66K, A71V h67VL4 Привитая (IGKV1-39*01+IGKJ4*01) h67VL5 Привитая (IGKV1-39*01+ IGKJ4*01)+Q3V, A43P

Примечание: положения аминокислот в таблице были пронумерованы с использованием схемы нумерации Кабата; например, A43P означает, что A в положении 43 мутирован обратной мутацией в P в соответствии с системой нумерации Кабата; привитая означает, что CDR мышиных антител привиты в последовательности зародышевой области FR человека.

Конкретные последовательности гуманизированного мышиного антитела mAb67 показаны в таблице 9:

Примечание: области CDR (определенные по системе нумерации Кабата) подчеркнуты в таблице, а сайты мутаций выделены жирным курсивом.

4. Гуманизация мышиного антитела mAb103

Гены зародышевой линии вариабельной области тяжелой и легкой цепи с высокой гомологией были выбраны в качестве матриц; например, для мышиного антитела mAb103 IGLV4-69*01 и IGLJ2*01 были выбраны в качестве гуманизированных матриц легкой цепи, а IGHV7-4-1*02 и IGHJ6*01 были выбраны в качестве гуманизированных матриц тяжелой цепи. CDR мышиного антитела mAb103 прививали в соответствующие гуманизированные матрицы для гуманизации, а конструкция гуманизированных обратных мутаций для мышиного антитела mAb103 показана в таблице 10 ниже:

Таблица 10: Гуманизированная конструкция мышиного антитела mAb103 Вариабельная область легкой цепи гуманизированного антитела mAb103 Вариабельная область тяжелой цепи гуманизированного антитела mAb67 h103VL1 Привитая (IGLV4-69*01+ IGLJ2*01) + K49E h103VH1 Привитая (IGHV7-4-1*02+ IGHJ1*01) h103VL2 Привитая (IGLV4-69*01+ IGLJ2*01) +H36Y, K49E h103VH2 Привитая (IGHV7-4-1*02+ IGHJ1*01)+R38K, E46K h103VL3 Привитая (IGLV4-69*01+ IGLJ2*01) +H36Y, L47V, K49E h103VH3 Привитая (IGHV7-4-1*02+ IGHJ1*01)+V2I, R38K, E46K h103VL4 Привитая (IGLV4-69*01+ IGLJ2*01) +L4V, H36Y, L47V, K49E h103VL5 Привитая (IGLV4-69*01+ IGLJ2*01) +H36Y, G43P, L47V, K49E, Y87I h103VL6 Привитая (IGLV4-69*01+ IGLJ2*01) +L4V, H36Y, G43P, L47V, K49E, Y87I h103VL7 Привитая (IGLV4-69*01+ IGLJ2*01) +L4V, H36Y, G43P, L47V, K49E, E70D, Y87I

Примечание: положения аминокислот в таблице были пронумерованы с использованием схемы нумерации Кабата; например, K49E означает, что K в положении 49 мутирован обратной мутацией в E в соответствии с системой нумерации Кабата; привитая означает, что CDR мышиных антител привиты в последовательности зародышевой области FR человека.

Кроме того, мутация D61S была дополнительно введена в тяжелую цепь h103VH1 (т.е. введение аминокислотной мутации в антитело HCDR2 таким образом, что последовательность антитела HCDR2 была изменена с (SEQ ID NO: 16) на (SEQ ID NO: 38)); и мутация D56E была введена в легкую цепь h103VL3 (т.е. введение аминокислотной мутации в антитело LCDR2 таким образом, что последовательность антитела LCDR2 была изменена с LKKDGSHSTGD (SEQ ID NO: 36) на LKKDGSHSTGE (SEQ ID NO: 64)), при этом хорошая активность антитела сохранилась.

Конкретные последовательности гуманизированного мышиного антитела mAb6103 показаны в таблице 11:

Примечание: области CDR (определенные по системе нумерации Кабата) подчеркнуты в таблице, а сайты мутаций выделены жирным курсивом.

5. Получение гуманизированных антител

Были сконструированы векторы экспрессии легкой цепи и тяжелой цепи антитела, соответственно; комбинацию перекрестного спаривания выполняли на легкой цепи и тяжелой цепи гуманизированного антитела, супернатант культуры собирали и очищали после трансфекции клеток 293E с получением гуманизированного полноразмерного антитела. Константная область тяжелой цепи гуманизированного антитела может быть выбрана из группы, состоящей из константных областей IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 и их вариантов; в качестве примера, константная область тяжелой цепи IgG1 человека (представленную в SEQ ID NO: 77) была присоединена к вышеуказанной гуманизированной вариабельной области тяжелой цепи с образованием полноразмерной тяжелой цепи антитела. Константная область легкой цепи гуманизированного антитела может быть выбрана из группы, состоящей из константных областей человеческих κ- и λ-цепей или их вариантов; иллюстративно, константная область человеческой легкой цепи κ-цепи (представленную в SEQ ID NO: 78) или константная область человеческой легкой цепи λ-цепи (как указано в SEQ ID NO: 79) была присоединена к вышеуказанной гуманизированной вариабельной области легкой цепи с образованием полноразмерной легкой цепи антитела.

Последовательности константных областей типовых антител являются следующими:

Константная область тяжелой цепи IgG1 человека:

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 77

Константная область легкой цепи человека κ-цепь:

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 78

Константная область λ цепи легкой цепи человека:

GQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

SEQ ID NO:79

В качестве примера, вышеуказанную вариабельную область тяжелой цепи гуманизированного антитела, полученного из mAb47, как показано в Таблице 5, соединяют с аминоконцом константной области тяжелой цепи IgG1 человека, имеющей последовательность, представленную в SEQ ID NO: 77, с образованием полноразмерной тяжелой цепи антитела, а вариабельную область легкой цепи гуманизированного антитела, показанную в Таблице 5, соединяют с аминоконцом константной области легкой κ-цепи человека, имеющей последовательность, представленную в SEQ ID NO: 78, с образованием полноразмерной легкой цепи антитела, в результате чего получают диапазон гуманизированных антител mAb47, показанный в Таблице 12 ниже:

Таблица 12. Гуманизированные антитела mAb47 VH
VL h47VH1 h47VH2 h47VH3 h47VH4 h47VL1 Hu47-1 Hu47-5 Hu47-9 Hu47-13 h47VL2 Hu47-2 Hu47-6 Hu47-10 Hu47-14 h47VL3 Hu47-3 Hu47-7 Hu47-11 Hu47-15 h47VL4 Hu47-4 Hu47-8 Hu47-12 Hu47-16

Примечание: в таблице, например, "Hu47-14" указывает, что вариабельная область легкой цепи гуманизированного антитела под номером Hu47-14 представляет собой h47VL2, а вариабельная область тяжелой цепи представляет собой h47VH4; и последовательность константной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO: 77, а последовательность константной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO: 78.

В качестве примера, вышеуказанную вариабельную область тяжелой цепи гуманизированного антитела, полученного из mAb63, как показано в Таблице 7, соединяют с аминоконцом константной области тяжелой цепи IgG1 человека, имеющей последовательность, представленную в SEQ ID NO: 77, с образованием полноразмерной тяжелой цепи антитела, а вариабельную область легкой цепи гуманизированного антитела, показанную в Таблице 7, соединяют с аминоконцом константной области легкой κ-цепи человека, имеющей последовательность, представленную в SEQ ID NO: 78, с образованием полноразмерной легкой цепи антитела, в результате чего получают диапазон гуманизированных антител mAb63, показанный в Таблице 13 ниже:

Таблица 13. Гуманизированные антитела mAb63 VH
VL h63VH1 h63VH2 h63VH3 h63VH4 h63VH5 h63VL1 Hu63-1 Hu63-4 Hu63-7 Hu63-10 Hu63-13 h63VL2 Hu63-2 Hu63-5 Hu63-8 Hu63-11 Hu63-14 h63VL3 Hu63-3 Hu63-6 Hu63-9 Hu63-12 Hu63-15

Примечание: в таблице, например, "Hu63-13" указывает, что вариабельная область легкой цепи гуманизированного антитела под номером Hu63-13 представляет собой h63VL1, а вариабельная область тяжелой цепи представляет собой h63VH5; и последовательность константной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO: 77, а последовательность константной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO: 78.

В качестве примера, вышеуказанную вариабельную область тяжелой цепи гуманизированного антитела, полученного из mAb67, как показано в Таблице 9, соединяют с аминоконцом константной области тяжелой цепи IgG1 человека, имеющей последовательность, представленную в SEQ ID NO: 77, с образованием полноразмерной тяжелой цепи антитела, а вариабельную область легкой цепи гуманизированного антитела, показанную в Таблице 9, соединяют с аминоконцом константной области легкой κ-цепи человека, имеющей последовательность, представленную в SEQ ID NO: 78, с образованием полноразмерной легкой цепи антитела, в результате чего получают диапазон гуманизированных антител mAb67, показанный в Таблице 14 ниже:

Таблица 14. Гуманизированные антитела mAb67 VH
VL h67VH1 h67VH2 h67VH3 h67VL1 Hu67-1 Hu67-6 Hu67-11 h67VL2 Hu67-2 Hu67-7 Hu67-12 h67VL3 Hu67-3 Hu67-8 Hu67-13 h67VL4 Hu67-4 Hu67-9 Hu67-14 h67VL5 Hu67-5 Hu67-10 Hu67-15

Примечание: в таблице, например, "Hu67-14" указывает, что вариабельная область легкой цепи гуманизированного антитела под номером Hu67-14 представляет собой h67VL4, а вариабельная область тяжелой цепи представляет собой h67VH3; и последовательность константной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO: 77, а последовательность константной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO: 78.

В качестве примера, вышеуказанную вариабельную область тяжелой цепи гуманизированного антитела, полученного из mAb103, как показано в Таблице 11, соединяют с аминоконцом константной области тяжелой цепи IgG1 человека, имеющей последовательность, представленную в SEQ ID NO: 77, с образованием полноразмерной тяжелой цепи антитела, а вариабельную область легкой цепи гуманизированного антитела, показанную в Таблице 11, соединяют с аминоконцом константной области легкой κ-цепи человека, имеющей последовательность, представленную в SEQ ID NO: 79, с образованием полноразмерной легкой цепи антитела, в результате чего получают диапазон гуманизированных антител mAb103, показанный в Таблице 15 ниже:

Таблица 15. Гуманизированные антитела mAb103 VH
VL h103VH1 h103VH2 h103VH3 h103VH4 h103VL1 Hu103-1 Hu103-9 Hu103-17 Hu103-25 h103VL2 Hu103-2 Hu103-10 Hu103-18 Hu103-26 h103VL3 Hu103-3 Hu103-11 Hu103-19 Hu103-27 h103VL4 Hu103-4 Hu103-12 Hu103-20 Hu103-28 h103VL5 Hu103-5 Hu103-13 Hu103-21 Hu103-29 h103VL6 Hu103-6 Hu103-14 Hu103-22 Hu103-30 h103VL7 Hu103-7 Hu103-15 Hu103-23 Hu103-31 h103VL8 Hu103-8 Hu103-16 Hu103-24 Hu103-32

Примечание: в таблице, например, "Hu103-32" указывает, что вариабельная область легкой цепи гуманизированного антитела под номером Hu103-32 представляет собой h103VL8, а вариабельная область тяжелой цепи представляет собой h103VH4; и последовательность константной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO: 77, а последовательность константной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO: 79.

В качестве примера, полноразмерные последовательности легкой/тяжелой цепи гуманизированных антител показаны в Таблице 16 ниже:

Таблица 16. Последовательности легкой и тяжелой цепи гуманизированных антител № антитела Последовательность тяжелой цепи Последовательность легкой цепи Hu63-13
SEQ ID NO:80
SEQ ID NO:81 Hu47-14
SEQ ID NO: 82
SEQ ID NO:83 Hu67-14
SEQ ID NO: 84
SEQ ID NO: 85 Hu103-32
SEQ ID NO:86
SEQ ID NO:87

Примечание: в таблице курсивом выделены последовательности константных областей, а вертикальными буквами - последовательности вариабельных областей.

В настоящее время 2 известные молекулы ADC, нацеленные на CEA представляют собой SAR-408701 и лабетузумаб говитекан (также называемый Lmab-CL2A-SN38), в которых последовательности легкой и тяжелой цепей антител являются следующими:

Последовательность тяжелой цепи антитела в SAR-408701 (Sanofi):

EVQLQESGPGLVKPGGSLSLSCAASGFVFSSYDMSWVRQTPERGLEWVAYISSGGGITYAPSTVKGRFTVSRDNAKNTLYLQMNSLTSEDTAVYYCAAHYFGSSGPFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:88

Последовательность легкой цепи антитела в SAR-408701 (сокращенно Sanofi)

DIQMTQSPASLSASVGDRVTITCRASENIFSYLAWYQQKPGKSPKLLVYNTRTLAEGVPSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:89

Последовательность тяжелой цепи антитела лабетузумаба в Lmab-CL2A-SN38 (сокращенно Lmab)

EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCSASGFDFTTYWMSWVRQAPGKGLEWIGEIHPDSSTINYAPSLKDRFTISRDNAKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCASLYFGFPWFAYWGQGTPVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:90

Последовательность легкой цепи лабетузумаба в Lmab-CL2A-SN38 (Lmab)

DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGTSVAWYQQKPGKAPKLLIYWTSTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYSLYRSFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:91

Вышеуказанные антитела клонировали, экспрессировали и очищали с использованием обычных способов клонирования генов и рекомбинантной экспрессии.

Пример 4: Получение соединений

Экспериментальные процедуры без условий, указанные в примерах настоящего изобретения, как правило, проводят в соответствии с общепринятыми условиями или в соответствии с условиями, рекомендованными производителем исходных материалов или коммерческих продуктов. Реагенты без указания конкретного происхождения являются коммерчески доступными обычными реагентами.

Структуру соединений идентифицировали с помощью ядерного магнитного резонанса (NMR) или масс-спектрометрии (MS). Спектры NMR измеряли с использованием прибора ядерного магнитного резонанса Bruker AVANCE-400, с дейтерированным диметилсульфоксидом (DMSO-d6 (диметилсульфоксид)), дейтерированным хлороформом (CDCl₃) и дейтерированным метанолом (CD₃OD) в качестве растворителей и тетраметилсиланом (ТМС) в качестве внутреннего стандарта. Химические сдвиги приведены в единицах измерения10^-6 (млн^-1).

MS-анализ проводили с использованием масс-спектрометра FINNIGAN LCQAd (ESI) (производитель: Thermo, модель: Finnigan LCQ advantage MAX).

Анализ UPLC (сверхэффективная жидкостная хроматография) проводили с использованием системы жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии Waters Acquity UPLC SQD.

Анализ UPLC проводили с использованием жидкостного хроматографа Agilent 1200DAD высокого давления (хроматографическая колонка Sunfire C18 150×4,6 мм) и жидкостного хроматографа Waters 2695-2996 высокого давления (хроматографическая колонка Gimini C18 150×4,6 мм).

Анализ UV-HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография с использованием УФ детектора) проводили с использованием ультрафиолетового спектрофотометра Thermo nanodrop2000.

Степень ингибирования пролиферации и значения IC₅₀ (концентрация полумаксимального ингибирования) измеряли с помощью микропланшетного ридера PHERA starFS (BMG, Германия).

Силикагелевые пластины Huanghai HSGF254 или Qingdao GF254 со спецификациями от 0,15 мм до 0,2 мм применяли для тонкослойной хроматографии (TLC) и от 0,4 мм до 0,5 мм для разделения и очистки TLC.

Силикагель Yantai Yellow Sea 200-300 меш обычно используется в качестве носителя в колоночной хроматографии.

Известные исходные материалы по настоящему изобретению могут быть синтезированы с использованием или в соответствии со способами, известными в данной области техники, или могут быть приобретены у ABCR GmbH & Co.KG, Acros Organnics, Aldrich Chemical Company, Accela ChemBio Inc, Chembee Chemicals и т.д.

В примерах все реакции проводили в атмосфере аргона или в атмосфере азота, если не указано иное.

Атмосфера аргона или атмосфера азота означает, что реакционная колба соединена с баллоном, содержащим около 1 л аргона или азота.

Атмосфера водорода означает, что реакционная колба соединена с баллоном, содержащим около 1 л водорода.

Гидрогенизатор Parr 3916EKX, гидрогенизатор Qinglan QL-500 или гидрогенизатор HC2-SS использовали в реакциях гидрирования под давлением.

Реакция гидрирования обычно включает 3 цикла вакуумирования и продувки водородом.

Для микроволновой реакции использовали микроволновый реактор CEM Discover-S 908860.

В примерах раствор в реакции относится к водному раствору, если не указано иное.

В примерах температура реакции представляет собой комнатную температуру, если не указано иное.

Комнатная температура является оптимальной температурой реакции, которая находится в диапазоне от 20 до 30°C.

Получение буфера PBS при рН 6,5 в примерах:8,5 г KH₂PO₄, 8,56 г K₂HPO₄, 3H₂O, 5,85г NaCl и 1,5 г EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) добавляли в колбу, и объем доводили до 2 л. Все добавления растворяли ультразвуком, и раствор хорошо перемешивали путем встряхивания с получением требуемого буфера.

Система элюента для колоночной хроматографии и система проявляющего растворителя для тонкослойной хроматографии, используемая для очистки соединения, включают: A: дихлорметанольную и изопропанольную систему, B: дихлорметанольную и метанольную систему и C: петролейнэфирную и этилацетатную систему. Объемное соотношение растворителей корректировали в соответствии с полярностью соединения или добавляли небольшое количество триэтиламина и кислотного или основного реагента.

Некоторые из соединений по настоящему изобретению характеризуются анализом Q-TOF LC/MS (жидкостная хроматография с масс-спектрометрией). Q-TOF LC/MS применял квадрупольный времяпролетный масс-спектрометр Agilent 6530 с точной массой и сверхвысокоэффективным жидкостным хроматографом Agilent 1290-Infinity (хроматографическая колонка Agilent Poroshell 300SB-C8 5 мкм, 2,1×75 мм).

Лекарственная часть Y-D конъюгатов антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению раскрыта в PCT/CN2019/107873, и синтез и тесты соответствующих соединений включены в настоящий документ посредством ссылки. Неограничивающие примеры синтеза включены посредством ссылки следующим образом:

1. Синтез лекарственных средств на основе токсина по настоящему изобретению

(S)-2-циклопропил-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-2-гидроксиацетамид 2-A

(R)-2-циклопропил-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-2-гидроксиацетамид 2-B

.

К 1b (4 мг, 7,53 мкмоль) добавляли 2 мл этанола и 0,4 мл N,N-диметилформамида. Систему трижды продували аргоном, и смесь охлаждали до 0-5°C на ледяной водяной бане с последующим добавлением по каплям 0,3 мл N-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали, пока она не стала прозрачной. К реакционной смеси последовательно добавляли 2-циклопропил-2-гидроксиуксусную кислоту 2а (2,3 мг, 19,8 мкмоль, полученную, как описано в патентной заявке "WO2013106717"), 1-гидроксибензотриазол (3 мг, 22,4 мкмоль) и 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид гидрохлорид (4,3 мг, 22,4 мкмоль). После добавления реакционную смесь перемешивали при 0-5°C в течение 1 часа. Ледяную водяную баню удаляли, и реакционную смесь нагревали до 30°С, перемешивали в течение 2 ч и концентрировали при пониженном давлении. Полученное неочищенное соединение 1 очищали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (условия разделения: хроматографическая колонка: XBridge Prep C18 OBD 5 мкм 19×250 мм; подвижная фаза: A - вода (10 ммоль NH₄OAc), B - ацетонитрил, градиентное элюирование, скорость потока: 18 мл/мин), и соответствующие фракции собирали и концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке продукта (3-A: 1,5 мг, 3-B: 1,5 мг).

MS m/z (ESI (ионизация электроспреем): 534,0 [M+1].

Соединение 1-B с единственной конфигурацией (меньшее время удерживания)

Анализ UPLC: время удерживания: 1,06 мин; чистота: 88 % (хроматографическая колонка: ACQUITY UPLC BEHC18 1,7 мкм 2,1×50 мм; подвижная фаза: A - вода (5 ммоль NH4OAc), B - ацетонитрил).

¹H NMR (400 МГц, DMSO-d₆): δ 8,37 (d, 1H), 7,76 (d, 1H), 7,30 (s, 1H), 6,51 (s, 1H), 5,58-5,56 (m, 1H), 5,48 (d, 1H), 5,41 (s, 2H), 5,32-5,29 (m, 2H), 3,60 (t, 1H), 3,19-3,13 (m, 1H), 2,38 (s, 3H), 2,20-2,14 (m, 1H), 1,98 (q, 2H), 1,87-1,83 (m, 1H), 1,50-1,40 (m, 1H), 1,34-1,28 (m, 1H), 0,86 (t, 3H), 0,50-0,39 (m, 4H).

Соединение 1-A с единственной конфигурацией (большее время удерживания)

Анализ UPLC: время удерживания: 1,10 мин; чистота: 86 % (хроматографическая колонка: ACQUITY UPLC BEHC18 1,7 мкм 2,1×50 мм; подвижная фаза: A - вода (5 ммоль NH₄OAc), B - ацетонитрил).

¹H NMR (400 МГц, DMSO-d₆): δ 8,35 (d, 1H), 7,78 (d, 1H), 7,31 (s, 1H), 6,52 (s, 1H), 5,58-5,53 (m, 1H), 5,42 (s, 2H), 5,37 (d, 1H), 5,32 (t, 1H), 3,62 (t, 1H), 3,20-3,15 (m, 2H), 2,40 (s, 3H), 2,25-2,16 (m, 1H), 1,98 (q, 2H), 1,87-1,82 (m, 1H), 1,50-1,40 (m, 1H), 1,21-1,14 (m, 1H), 0,87 (t, 3H), 0,47-0,35 (m, 4H).

2. Синтез линкерных лекарственных средств на основе токсина по настоящему изобретению

N-((2R,10S)-10-бензил-2-циклопропил-1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1,6,9,12,15-пентаоксо-3-окса-5,8,11,14-тетраазагексадекан-16-ил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамид 2-A

N-((2S,10S)-10-бензил-2-циклопропил-1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1,6,9,12,15-пентаоксо-3-окса-5,8,11,14-тетраазагексадекан-16-ил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамид 2-B

Fmoc - флуоренилметилхлороформиат

Стадия 1

Бензил-2-циклопропил-2-гидроксиацетат 2a

1a (1,3 г, 11,2 ммоль; полученный, как описано в патентной заявке "WO 2013/106717") растворяли в 50 мл ацетонитрила и последовательно добавляли карбонат калия (6,18 г, 44,8 ммоль), бензилбромид (1,33 мл, 11,2 ммоль) и тетрабутиламмонийиодид (413 мг, 1,1 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 48 часов и фильтровали через целит, и осадок на фильтре промывали этилацетатом (10 мл). Фильтраты объединяли и концентрировали при пониженном давлении, и полученный остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле с системой проявляющего растворителя C с получением указанного в заголовке продукта 2a (2 г, выход 86,9 %).

Стадия 2

Бензил 10-циклопропил-1-(9H-флуорен-9-ил)-3,6-диоксо-2,9-диокса-4,7-диазаундекан-11-оат 2b

2a (120,9 мг, 0,586 ммоль) и 2g (180 мг, 0,489 ммоль, полученные согласно описанию в патентной заявке "CN105829346A") добавляли в реакционную колбу и добавляли 4 мл тетрагидрофурана. Систему трижды продували аргоном и охлаждали реакционную смесь до 0-5°C на ледяной водяной бане с последующим добавлением трет-бутоксида калия (109 мг, 0,98 ммоль). Ледяную баню удаляли, и реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 40 минут с последующим добавлением 10 мл ледяной воды и экстракцией этилацетатом (20 мл×2) и хлороформом (10 мл×5). Органические фазы объединяли и концентрировали. Полученный остаток растворяли в 4 мл диоксана и добавляли 2 мл воды, бикарбонат натрия (49,2 мг, 0,586 ммоль) и 9-флуоренилметилхлорформиата (126 мг, 0,49 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Добавляли 20 мл воды с последующей экстракцией этилацетатом (10 мл×3). Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (20 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле с системой C проявляющего растворителя с получением указанного в заголовке продукта 2b (48 мг, выход 19 %).

MS m/z (ESI): 515,0 [M+1].

Стадия 3

10-циклопропил-1-(9H-флуорен-9-ил)-3,6-диоксо-2,9-диокса-4,7-диазаундекан-11-оевая кислота 2c

2b (20 мг, 0,038 ммоль) растворяли в 4,5 мл смеси растворителей тетрагидрофурана и этилацетата (V:V (объем:объем) = 2:1) и добавляли палладий на угле (12 мг, нагрузка 10%, сухое вещество). Систему трижды продували водородом, и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционную смесь фильтровали через целит, а осадок на фильтре промывали этилацетатом. Фильтрат концентрировали с получением неочищенного указанного в заголовке продукта 2c (13 мг), который непосредственно использовали на следующей стадии без очистки.

MS m/z (ESI): 424,9 [M+1].

Стадия 4

(9H-флуорен-9-ил)метил(2-(((1-циклопропил-2-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-2-оксоэтокси)метил)амино)-2-оксоэтил)карбамат 2d

1b (10 мг, 18,8 ммоль) добавляли в реакционную колбу и добавляли 1 мл N,N-диметилформамида. Систему трижды продували аргоном и смесь охлаждали до 0-5°C на ледяной водяной бане с последующим добавлением капли неочищенного триэтиламина 5c (13 мг, 30,6 мкмоль) и 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорида (16,9 мг, 61,2 мкмоль). Реакционную смесь перемешивали на ледяной бане в течение 40 мин. Добавляли 10 мл воды с последующей экстракцией этилацетатом (10 мл×3). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия (10 мл×2), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали с помощью тонкослойной хроматографии с системой В проявляющего растворителя с получением указанного в заголовке продукта 2d (19 мг, выход 73,6 %).

MS m/z (ESI): 842,1 [M+1].

Стадия 5

2-((2-аминоацетамидо)метокси)-2-циклопропил-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)ацетамид 2e

2d (19 мг, 22,6 мкмоль) растворяли в 2 мл дихлорметана и добавляли 1 мл диэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч и концентрировали при пониженном давлении. Добавляли 1 мл толуола с последующим концентрированием при пониженном давлении; процедуры повторяли дважды. Остаток суспендировали с 3 мл н-гексана и оставлял. Затем супернатант удаляли и оставляли твердое вещество. Твердый остаток концентрировали при пониженном давлении и сушили с помощью масляного насоса для получения неочищенного указанного в заголовке продукта 2e (17 мг), который непосредственно использовали на следующей стадии без очистки.

MS m/z (ESI): 638,0 [М+18].

Стадия 6

N-((2R,10S)-10-бензил-2-циклопропил-1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1,6,9,12,15-пентаоксо-3-окса-5,8,11,14-тетраазагексадекан-16-ил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамид 2-A

N-((2S,10S)-10-бензил-2-циклопропил-1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1,6,9,12,15-пентаоксо-3-окса-5,8,11,14-тетраазагексадекан-16-ил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамид 2-B

Неочищенный 2e (13,9 мг, 22,4 мкмоль) растворяли в 0,6 мл N,N-диметилформамида. Систему трижды продували аргоном, и раствор охлаждали до 0-5°C на ледяной водяной бане. Добавляли раствор 2f (21,2 мг, 44,8 мкмоль, полученный согласно описанию в патентной заявке "EP2907824") в 0,3 мл N,N-диметилформамида с последующим добавлением 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорида (18,5 мг, 67,3 мкмоль). Реакционную смесь перемешивали на ледяной бане в течение 10 мин. Затем ледяную баню удаляли и реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 часа с получением соединения 2. Реакционную смесь очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией (условия разделения: колонка для хроматографии: XBridge Prep C18 OBD 5 мкм 19×250 мм; подвижная фаза: А - вода (10 ммоль NH₄OAc): В-ацетонитрил, градиентное элюирование, скорость потока: 18 мл/мин). Соответствующие фракции собирали и концентрировали при пониженном давлении с получением указанных в заголовке продуктов (2-A: 2,4 мг, 2-B: 1,7 мг).

MS m/z (ESI): 1074,4 [M+1].

Соединение 2-А с единственной конфигурацией (меньшее временя удерживания):

Анализ UPLC: время удерживания: 1,14 мин; чистота: 85 % (хроматографическая колонка: ACQUITY UPLC BEHC18 1,7 мкм 2,1×50 мм; подвижная фаза: A - вода (5 ммоль NH₄OAc), B - ацетонитрил).

¹H NMR (400 МГц, DMSO-d₆): δ 8,60 (t, 1H), 8,51-8,49 (d, 1H), 8,32-8,24 (m, 1H), 8,13-8,02 (m, 2H), 8,02-7,96 (m, 1H), 7,82-7,75 (m, 1H), 7,31 (s, 1H), 7,26-7,15 (m, 4H), 6,99 (s, 1H), 6,55-6,48 (m, 1H), 5,65-5,54 (m, 1H), 5,41 (s, 2H), 5,35-5,15 (m, 3H), 4,74-4,62 (m, 1H), 4,54-4,40 (m, 2H), 3,76-3,64 (m, 4H), 3,62-3,48 (m, 2H), 3,20-3,07 (m, 2H), 3,04-2,94 (m, 1H), 2,80-2,62 (m, 12H), 2,45-2,30 (m, 3H), 2,25-2,15 (m, 2H), 2,15-2,04 (m, 2H), 1,93-1,78 (m, 2H), 1,52-1,39 (m, 3H), 1,34-1,12 (m, 5H), 0,87 (t, 3H), 0,64-0,38 (m, 4H).

Соединение 2-B с единственной конфигурацией (большее временя удерживания):

Анализ UPLC: время удерживания: 1,16 мин; чистота: 89 % (хроматографическая колонка: ACQUITY UPLC BEHC18 1,7 мкм 2,1×50 мм; подвижная фаза: A - вода (5 ммоль NH₄OAc), B - ацетонитрил).

¹H NMR (400 МГц, DMSO-d₆): δ 8,68-8,60 (m, 1H), 8,58-8,50 (m, 1H), 8,32-8,24 (m, 1H), 8,13-8,02 (m, 2H), 8,02-7,94 (m, 1H), 7,82-7,75 (m, 1H), 7,31 (s, 1H), 7,26-7,13 (m, 3H), 6,99 (s, 1H), 6,55-6,48 (m, 1H), 5,60-5,50 (m, 1H), 5,41 (s, 2H), 5,35-5,15 (m, 2H), 4,78-4,68 (m, 1H), 4,60-4,40 (m, 2H), 3,76-3,58 (m, 4H), 3,58-3,48 (m, 1H), 3,20-3,10 (m, 2H), 3,08-2,97 (m, 2H), 2,80-2,72 (m, 2H), 2,45-2,30 (m, 3H), 2,25-2,13 (m, 2H), 2,13-2,04 (m, 2H), 2,03-1,94 (m, 2H), 1,91-1,78 (m, 2H), 1,52-1,39 (m, 3H), 1,34-1,12 (m, 4H), 0,91-0,79 (m, 3H), 0,53-0,34 (m, 4H).

Пример 5: Получение конъюгатов антитело-лекарственное средство (ADC)

Анализ нагрузки лекарственным средством холостого раствора ADC

Цель и принцип эксперимента

Исходный раствор ADC представляет собой сшитый препарат антитела, и его механизм лечения заболеваний заключается в транспортировке молекул токсина в клетки в зависимости от эффективности нацеливания антитела таким образом, чтобы уничтожить клетки. Нагрузка лекарственного средства играет решающую роль в эффективности лекарственного средства. Нагрузку лекарственного средства исходного раствора ADC определяли УФ-методом.

Экспериментальные процедуры

Кюветы, содержащие буферный раствор сукцината натрия, помещали в эталонную ячейку и ячейку образца, и вычитали абсорбцию холостого растворителя. Затем в ячейку с образцом помещали кювету, содержащую тестовый раствор, и определяли значения абсорбции при 280 нм и 370 нм.

Расчет для результатов: нагрузочную способность исходного раствора ADC определяли с помощью ультрафиолетовой спектрофотометрии (прибор: ультрафиолетовый спектрофотометр Thermo nanodrop2000), исходя из принципа, что суммарная абсорбция исходного раствора ADC при определенной длине волны представляет собой сумму значений абсорбций лекарственного средства и моноклонального антитела при этой длине волны, а именно:

(1)A_280нм= ε_mab-280bCmab+ε_{лекарственного средства-280}bC_{лекарственного средства}

ε_{лекарственного средства-280}: средний молярный коэффициент затухания лекарственного средства при 280 нм составляет 5100;

C_{лекарственного средства}: концентрация лекарственнного средства;

ε_mab-280: средний молярный коэффициент затухания исходного раствора моноклонального антитела при 280 нм составляет 214600;

C_mab: концентрация исходного раствора моноклонального антитела;

b: оптическая длина пути составляет 1 см.

Аналогично, уравнение для общей абсорбции образца при 370 нм может быть представлено как:

(2) A_370нм= ε_mab-370bC_mab+εлекарственного средства-_370bC_{лекарственного средства}

ε_{лекарственного средства-370}: средний молярный коэффициент затухания лекарственного средства при 370 нм составил 19000;

C_{лекарственного средства}: концентрация лекарственнного средства;

ε_mab-370:коэффициент затухания холостого раствора моноклонального антитела при 370 нм составляет 0;

C_mab: концентрация исходного раствора моноклонального антитела;

b: оптическая длина пути составляет 1 см.

Нагрузка лекарственного средства может быть рассчитана с использованием как уравнения (1), так и (2), а также коэффициентов затухания моноклонального антитела и лекарственного средства при обеих длинах волн и их концентрациях.

Нагрузка лекарственного средства =C_{лекарственного средства}/C_mab.

1. Получение конъюгатов антитело-лекарственное средство (ADC) по настоящему изобретению

Соединение на основе токсина 1-B представляет собой ингибитор ДНК-топоизомеразы I, а комплекс, образованный соединением на основе токсина, топоизомеразы I и ДНК, может вызывать одноцепочечные разрывы в ДНК, предотвращая репликацию ДНК и эффективно ингибируя пролиферацию клеток в клетках.

ADC получали следующим образом: гуманизированное антитело (выбранное из группы, состоящей из Hu63-13, Hu47-14, Hu67-14 и Hu103-32) помещали в 0,05 М водный буфер PBS (с антителом в концентрации 10 мг/мл) при рН 6,5 и добавляли 10 мМ водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP) (Innochem, CAS: 51805-45-9, кат. № B45573) в молярном количестве, которое в 5,3 раза превышало количество антитела; смеси давали прореагировать во встряхивающем инкубаторе при постоянной температуре 37°С в течение 3 часов. Вышеуказанную реакционную смесь охлаждали до 25°C на ледяной бане.

Соединение токсина 2-A растворяли в диметилсульфоксиде в молярном количестве, которое в 15 раз превышало количество антитела, и полученный раствор добавляли в вышеуказанную реакционную смесь, которую затем оставляли реагировать на шейкере при комнатной температуре в течение 3 часов перед прекращением реакции. Реакционную смесь обессоливали и очищали через колонку с гелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М буфер PBS при рН 6,5, содержащий 0,01 М EDTA) с получением молекулы конъюгата целевого антитела с соотношением лекарственное средство к антителу (DAR, значение n) 6-8.

Специалисты в данной области техники могут получать конъюгаты с различными значениями DAR путем корректировки условий реакции и реагентов. Например, молекулы ADC с молярным соотношением лекарственного средства к антителу (DAR, значение n) 3-5 получали путем корректировки молярного соотношения антитела к TCEP к соединению токсина путем добавления 10 мМ водного раствора трис(2-карбоксиэтил)фосфина в молярном количестве, в 2,5 раза превышающем количество антитела, и добавления соединения на основе токсина 2-A в молярном количестве, в 10 раз превышающем количество антитела.

Конкретные полученные ADC являются следующими:

Образцы ADC Антитело, содержащее Значение DAR (n) Hu47-14-2-A Hu47-14 6,6 Hu63-13-2-A Hu63-13 6,29 Hu67-14-2-A Hu67-14 6,41 Hu103-32-2-A Hu103-32 6,94 Hu63-13-2-A Hu63-13 3,97 Hu67-14-2-A Hu67-14 4,28 Hu103-32-2-A Hu103-32 4,8

Hu63-13-2-A

,

Hu47-14-2-A

,

Hu67-14-2-A

или

Hu103-32-2-A

.

Настоящее изобретение также предлагает ADC с другими значениями DAR, как требуется в тестовых примерах, см. следующие тестовые примеры для получения подробной информации.

2. Получение контрольного ADC Lmab-CL2A-SN38 (ADC-4)

Для оценки различий между сконструированным ADC в настоящем изобретении и молекулой контроля ADC Lmab-CL2A-SN38 синтезировали токсин CL2A-SN38 со ссылкой на структуру, описанную в документе ВОЗ «Информация о лекарственном препарате », том 30, № 1, 2016 г., и способ, описанный в Mol pharm. 2015 Jun 1;12(6): 1836-47, и конъюгировали с Lmab с образованием молекул ADC Lmab-CL2A-SN38 с различными значениями DAR путем регулирования условий реакции, как описано в получении ADC выше. Полученные молекулы ADC хранили при -20°C для последующего использования.

Тестовые примеры:

Тестовый пример 1: Анализ связывания FACS

Чтобы обнаружить связывание антитела с белком CEA на поверхности клетки, активность связывания антитела определяли с помощью FACS с использованием клеток, экспрессирующих CEA на поверхности клетки. Клетки собирали и центрифугировали при 400 g при 4°C в течение 5 мин. Добавляли предварительно охлажденный PBS, содержащий FBS в конечной концентрации 10%, и смесь центрифугировали при 400 g при 4°C в течение 5 минут; процедуры повторяли дважды. Клетки высевали в 96-луночный планшет с концентрацией 10⁵ клеток/лунку, и в каждую лунку добавляли 100 мкл разбавленного градиентом раствора антитела. Планшет инкубировали при 4°C в течение 60 минут и центрифугировали, и удаляли супернатант. 250 мкл предварительно охлажденного PBS, содержащего FBS в конечной концентрации 10%, добавляли в каждую лунку для ресуспендирования клеток, и суспензию центрифугировали при 400 g при 4°C в течение 5 мин с последующим удалением супернатанта; процедуры повторяли дважды. Добавляли 50 мкл разбавленного вторичного антитела 1:200 Alexa Fluor@488 козьего антитела против IgG человека (H+L) (Lifetechologies, кат. №A11013). Планшет инкубировали в темноте при 4°C в течение 45 мин и центрифугировали, и удаляли супернатант. 250 мкл предварительно охлажденного PBS, содержащего FBS в конечной концентрации 10%, добавляли в каждую лунку для ресуспендирования клеток, и суспензию центрифугировали при 400 g при 4°C в течение 5 мин; процедуры повторяли дважды. В каждую лунку добавляли 100 мкл предварительно охлажденного PBS для ресуспендирования клеток. Планшет анализировали с помощью проточного цитометра (BD, FACSverse) для значений сигнала флуоресценции. Более высокие значения указывают на более высокую активность связывания антитела с белком на поверхности клетки. Кривые связывания были построены с использованием программного обеспечения для анализа PRISM на основе результатов анализа, а значения EC₅₀ для активности связывания антитела с белками клеточной поверхности CEA человека (клетки рака желудка человека MKN45, Nanjing Kebai Biotechnology Co., Ltd., кат. № # CBP60488), cynoCEA-CHO и CEACAM1-CHO были получены путем подгонки. Связывающая активность гуманизированных антител показана в таблицах 17 и 18 ниже:

Таблица 17. Связывающая активность гуманизированных антител к белкам CEA клеточной поверхности разных видов Антитела EC₅₀ (нМ) MKN45 cynoCEA-CHO CEACAM1-CHO Hu63-13 2,93 1,71 Нет связывания Hu47-14 4,19 2,70 Нет связывания Hu67-14 1,58 2,89 Нет связывания Hu103-32 1,79 1,24 Нет связывания Sanofi 2,64 17,27 Нет связывания Lmab 2,45 Нет связывания Нет связывания

Результаты активности связывания других гуманизированных антител с белками CEA клеточной поверхности (MKN45 и CynoCEA-CHO) показаны в таблице 18 ниже:

Таблица 18. Связывающая активность гуманизированных антител к белкам CEA клеточной поверхности разных видов Антитела EC₅₀ (нМ) Антитела EC₅₀ (нМ) MKN45 cynoCEA-CHO MKN45 cynoCEA-CHO Hu103-1 2,37 2,49 Hu47-6 2,50 0,30 Hu103-2 2,18 1,26 Hu47-10 2,27 0,27 Hu103-3 1,91 1,18 Hu63-1 4,23 1,24 Hu103-4 2,62 1,32 Hu63-2 3,73 2,64 Hu103-5 2,38 1,47 Hu63-3 3,56 2,01 Hu103-6 1,27 1,56 Hu63-4 5,18 1,95 Hu103-7 2,20 1,62 Hu63-5 3,70 2,14 Hu103-9 2,95 1,61 Hu63-6 3,71 2,88 Hu103-10 2,23 1,00 Hu63-8 3,24 2,43 Hu103-11 2,71 0,92 Hu63-9 4,87 2,47 Hu103-12 2,38 1,08 Hu63-10 4,95 1,88 Hu103-13 2,53 1,01 Hu63-11 4,35 2,29 Hu103-14 2,41 1,37 Hu63-12 4,04 2,23 Hu103-15 2,13 1,36 Hu67-1 2,46 4,57 Hu103-17 2,92 1,52 Hu67-4 3,25 3,06 Hu103-18 2,75 0,89 Hu67-5 2,86 3,50 Hu103-19 2,42 0,96 Hu67-7 3,88 7,20 Hu103-20 2,19 0,98 Hu67-9 3,75 3,72 Hu103-21 1,34 1,17 Hu67-10 3,19 5,37 Hu103-22 3,64 1,02 Hu67-11 2,26 4,66 Hu103-23 2,90 0,93 Hu67-12 3,20 5,31

Экспериментальные результаты показывают, что отобранные гуманизированные антитела по настоящему изобретению сохраняют такую же связывающую активность, как и мышиные антитела, и все они могут быть связаны с белками CEA человека на поверхности клетки; и что отобранные гуманизированные антитела по настоящему изобретению могут быть связаны с белками CEA обезьяны на поверхности клетки, и связывающая активность гуманизированных антител с белками CEA обезьяны была лучше, чем у антитела положительного контроля.

Тестовый пример 2: Эксперимент по конкуренции с растворимым CEA (sCEA)

Чтобы проверить, были ли антитела также предпочтительно связаны с CEA на поверхности клеточной мембраны в присутствии sCEA, разбавленное градиентом антитело и определенную растворимость sCEA (5 мкг/мл) предварительно инкубировали в течение 30 минут, а затем клетки MKN45 собирали и высевали в 96-луночный планшет. В каждую лунку добавляли разбавленное в градиенте антитело и предварительно инкубированный смешанный раствор антитела и sCEA. Планшет инкубировали при 4°C в течение 60 минут и центрифугировали, и удаляли супернатант. Клетки дважды промывали предварительно охлажденным PBS, содержащим FBS в конечной концентрации 10%. Добавляли 50 мкл разбавленного вторичного антитела 1:200 Alexa Fluor@488 козьего антитела против IgG человека (H+L) (Lifetechologies, кат. № A11013). Планшет инкубировали при 4°C в течение 45 мин и центрифугировали, и удаляли супернатант. Клетки дважды промывали 250 мкл предварительно охлажденного PBS, с FBS в конечной концентрации 10%. В каждую лунку добавляли 100 мкл предварительно охлажденного PBS для ресуспендирования клеток. Суспензию анализировали с помощью проточного цитометра (BD, FACSverse) для значений сигнала флуоресценции. Если соотношение значения сигнала, полученного в отсутствие sCEA, к значению, полученному в присутствии sCEA, составляет менее 2 для каждой концентрации антитела, это указывает на то, что кривая связывания антитела не сильно изменяется в присутствии sCEA, и что антитело по-прежнему предпочтительно связывается с CEA на поверхности клеточной мембраны. Экспериментальные результаты показаны в таблицах 19 и 20, где соотношения значения сигнала флуоресценции, полученного в отсутствие sCEA, к таковому, полученному в присутствии sCEA, для различных концентраций антител Hu63-13, Hu47-14, Hu67-14, Hu103-32 и положительного контроля Lmab показаны в таблице 19 ниже, а максимальные соотношения значения сигнала флуоресценции, полученного в отсутствие sCEA, к таковому, полученному в присутствии sCEA, показаны в таблице 20 ниже:

Таблица 19. Соотношения значения сигнала флуоресценции, полученного в отсутствие sCEA, к таковому, полученному в присутствии sCEA для гуманизированных антител Соотношение значений сигнала флуоресценции Концентрация антитела [μg/ml] Hu63-13 Hu47-14 Hu67-14 Hu103-32 Lmab 40 0,92 1,09 0,94 0,91 1,10 1,6 1,36 1,18 1,73 1,67 2,78 0,32 1,59 1,23 1,78 1,24 5,18 0,064 1,59 1,24 1,25 1,44 4,15 0,0128 1,43 1,09 1,50 1,28 2,72 0,00256 1,24 1,15 1,58 1,09 1,74 0,000512 1,02 1,07 1,08 0,86 1,20

Таблица 20. Максимальные соотношения значения сигнала флуоресценции, полученного в отсутствие sCEA, к таковому, полученному в присутствии sCEA для антител Антитела Максимальное соотношение сигналов флуоресценции Антитела Максимальное соотношение сигналов флуоресценции Hu47-2 1,04 Hu103-1 1,30 Hu47-3 1,10 Hu103-2 1,17 Hu47-4 1,13 Hu103-3 1,14 Hu47-6 1,26 Hu103-4 1,17 Hu47-7 1,11 Hu103-5 1,15 Hu47-8 1,04 Hu103-6 1,15 Hu47-10 1,13 Hu103-7 1,07 Hu47-12 1,08 Hu103-9 1,57 Hu63-1 1,31 Hu103-10 1,19 Hu63-3 1,14 Hu103-11 1,16 Hu67-1 1,35 Hu103-12 1,24 Hu67-2 1,21 Hu103-13 1,16 Hu67-4 1,25 Hu103-14 1,10 Hu67-5 1,09 Hu103-15 1,23 Hu67-6 1,22 Hu103-17 1,12 Hu67-7 1,03 Hu103-18 1,22 Hu67-9 1,10 Hu103-19 1,36 Hu67-10 1,34 Hu103-20 1,22 Hu67-11 1,18 Hu103-21 1,27 Hu67-12 1,31 Hu103-22 1,33 Hu67-15 1,05 Hu103-23 1,31 mAb63 1,43 mAb103 1,02 mAb47 1,08 Sanofi 2,65

Экспериментальные результаты показывают, что соотношения значения сигнала флуоресценции, полученного в отсутствие sCEA, к таковому, полученному в присутствии sCEA для различных концентраций гуманизированных антител Hu63-13, Hu47-14, Hu67-14 и Hu103-32, все меньше 2; например, максимальное соотношение для Hu63-13 составляет 1,59, а максимальное соотношение для положительного контроля Lmab составляет 5,18. Отобранные антитела в настоящем изобретении превосходят контрольное антитело. Максимальные соотношения значения сигнала флуоресценции, полученного в отсутствие sCEA, к таковому, полученному в присутствии sCEA для отобранных гуманизированных антител в настоящем изобретении, составляют менее 2 и менее, чем у антитела положительного контроля, что указывает на то, что отобранные гуманизированные антитела в настоящем изобретении по-прежнему предпочтительно связываются с CEA на поверхности клеточной мембраны в присутствии sCEA и превосходят антитело положительного контроля.

Тестовый пример 3: Определение аффинности антител к растворимому CEA с использованием Biacore

Аффинность тестируемого гуманизированного антитела к человеческому и обезьяньему растворимому CEA определяли с помощью прибора Biacore (GE, T200). В соответствии со способом, описанным в инструкции к набору для захвата антител человека (GE, кат. № BR-1008-39), антитело для захвата антител человека ковалентно конъюгировали с биосенсорным чипом CM5 (GE, кат. № BR-1005-30) инструмента Biacore для захвата определенного количества тестируемого антитела с аффинностью, затем через поверхность чипа пропускали серию градиентов концентрации растворимых антигенов CEA и детектировали сигналы реакции в режиме реального времени с использованием Biacore, получая кривую ассоциации и диссоциации. После завершения каждого цикла диссоциации биочип промывали и восстанавливали с помощью раствора для восстановления, полученного в наборе для захвата антител человека. Данные, полученные в ходе эксперимента, были дополнены моделью Ленгмюра (1:1) с использованием программного обеспечения BIAevaluation версии 4.1 для получения значений аффинности. Поскольку желательно, чтобы активность связывания отобранных антител в настоящем описании с CEA на поверхности клеточной мембраны была выше, чем с растворимым CEA, желательно более низкая аффинность антител к растворимому CEA. Результаты количественного определения аффинности гуманизированных антител к растворимому CEA приведены в таблице 21 ниже:

Таблица 21. Аффинность гуманизированных антител к человеческому растворимому CEA Человеческий растворимый CEA Антитела ka (константа скорости ассоциации) (1/мс) kd (константа скорости диссоциации) (1/с) KD (равновесная константа диссоциации) (M) Hu63-13 2.99E+04 4.31E-03 1.44E-07 Hu47-14 1,31E+05 1,88E-01 1,43E-06 Hu67-14 3,76E+04 8,59E-03 2,28E-07 Hu103-32 3,33E+04 1,03E-03 3,11E-08 Sanofi 5,95E+04 3,08E-03 5,17E-08 Lmab 5,58E+04 3,31E-04 5,93E-09

Результаты теста показывают, что гуманизированные антитела Hu63-13, Hu47-14 и Hu67-14 имеют более низкое сродство к растворимому белку CEA, значительно ниже, чем контрольные антитела Sanofi и Lmab. Это указывает на то, что Hu63-13, Hu47-14 и Hu67-14 не нейтрализуются легко растворимым CEA в крови in vivo, и большое количество антител может связываться с клетками, экспрессирующими CEA на поверхности клеточной мембраны.

Тестовый пример 4: Эндоцитарная активность антитела против CEA в клетках MKN45, высоко экспрессирующих CEA

После того, как конъюгат антитела против CEA в настоящем изобретении эндоцитируется клетками, конъюгат может высвобождать токсин для уничтожения клеток. Следовательно, эндоцитарная активность антитела против CEA в клетках, экспрессирующих CEA, может стимулировать ADC к проявлению активности. Для оценки эндоцитарной активности гуманизированных антител в клетках MKN45, клетки MKN45 высевали в 96-луночный планшет (Corning, кат. № 3795) и культивировали в течение ночи; гуманизированные антитела против CEA Hu63-13, Hu47-14, Hu67-14 и Hu103-32 предварительно инкубировали на следующий день с реагентом для мечения iFL Green Human IgG (Invitrogen, кат. № Z25611) в течение 15 минут, в течение которых реагент iFL связывался с Fc гуманизированных антител; затем комплексы антител и iFL добавляли в планшет для клеточной культуры, и раствор клеточной культуры удаляли через 6 ч и 24 ч; клетки дважды промывали PBS, расщепляли и собирали, и интенсивность флуоресцентных сигналов в клетках обнаруживали с помощью FACS. iFL, связанный с Fc антител, вводили в клетки после эндоцитоза, а флуоресцентные сигналы могли обнаруживаться только в кислотной среде после того, как iFL был эндоцитирован клетками; поэтому более сильные сигналы указывали на более высокую эндоцитотическую активность антител. Эндоцитарная активность гуманизированных антител показана на фиг. 1: все гуманизированные антитела могут быть эндоцитированы клетками MKN45, и большее количество антител было эндоцитировано с течением времени.

Тестовый пример 5: Цитотоксичность ADC по отношению к раковым клеткам с различными уровнями экспрессии CEA

После конъюгации гуманизированных антител против CEA с токсином 2-A оценивали цитотоксичность каждого ADC к линиям раковых клеток с различными уровнями экспрессии CEA. Высоко экспрессирующие СЕА клетки MKN45, умеренно экспрессирующие СЕА клетки LS174T и неэкспрессирующие СЕА клетки HCT116 высевали в 96-луночные планшеты; разбавленные градиентом образцы ADC добавляли к клеткам на следующий день, и клетки культивировали при 37°С в течение 5 дней. В каждую лунку добавляли 50 мкл реагента Cell Titer-Glo (Promega, кат. № G9242), и после инкубации в течение 10 мин в темноте сигналы люминесценции обнаруживали с помощью детектора для визуализации клеток (BioTek, Cytation5). Кривую ингибирования наносили на график с результатами детектирования с использованием программного обеспечения для анализа PRISM и подгоняли для получения значения IC₅₀ ингибирующей активности ADC против пролиферации клеток. Цитотоксичность каждого ADC показана следующим образом:

Таблица 22. Цитотоксичность ADC к клеткам с различными уровнями экспрессии CEA Образцы ADC IC₅₀ (нМ) Соотношение IC₅₀ DAR MKN45 (с высокой экспрессией CEA) LS174T (с умеренной экспрессией CEA) HCT116 (без экспрессии CEA) HCT116/LS174T HCT116/MKN45 Hu47-14-2-A 6,6 6,58 10,3 106,3 10,32 16,16 Hu63-13-2-A 6,29 3,933 13,08 87,64 6,70 22,28 Hu67-14-2-A 6,41 3,331 9,236 71,83 7,78 21,56 Hu103-32-2-A 6,94 2,998 2,374 78,1 32,90 26,05 Lmab-CL2A-SN38 7 0,665 0,3456 0,4276 1,24 0,64 Hu63-13-2-A 3,97 34,02 19,76 165,1 8,36 4,85 Hu67-14-2-A 4,28 9,388 15,58 71,95 4,62 7,66 Hu103-32-2-A 4,8 2,863 3,076 83,58 27,17 29,19 Lmab-CL2A-SN38 4,15 1,595 0,6618 1,059 1,60 0,66

Молекулы ADC, конъюгированные с токсином 2-A, демонстрируют зависимую от уровня экспрессии CEA цитотоксичность: чем выше уровень экспрессии CEA, тем более токсичен ADC для клеток. Между тем, ADC с высокими значениями DAR и низкими значениями DAR обладают более сильной цитотоксичностью в отношении клеток, экспрессирующих CEA, и более слабой цитотоксичностью в отношении клеток, не экспрессирующих CEA. Молекула контроля ADC Lmab-CL2A-SN38 обладает сходной цитотоксичностью со всеми тремя клеточными линиями, демонстрируя неспецифическую цитотоксичность. Соотношение IC₅₀ может косвенно отражать безопасность молекулы ADC. Большее соотношение указывает на то, что молекула ADC менее токсична для клеток, которые не экспрессируют CEA, и может быть более безопасной in vivo.

Тестовый пример 6: нецелевой эффект и цитотоксичность ADC

После эндоцитоза ADC в клетку, токсин высвобождается из ADC для получения токсического эффекта на клетку. После гибели и лизиса клетки токсин высвобождается из клетки и может далее попадать в близлежащие клетки, чтобы оказывать на них токсическое воздействие.

Чтобы оценить нецелевой эффект и цитотоксичность ADC, CEA-высокоэкспрессирующую клеточную линию MKN45 и CEA-неэкспрессирующую клеточную линию HCT116 культивировали в 6-луночном планшете для культивирования клеток в течение 24 часов, а затем добавляли образец ADC в конечной концентрации 4 нМ. Клетки культивировали в клеточном инкубаторе при 37°С в течение еще 5 дней. Клетки расщепляли панкреатином и собирали, и добавляли моноклональное антитело CEA FITC (ThermoFisher, кат. № MA1-80578) в конечной концентрации 10 мкг/мл. Клетки инкубировали на льду в темноте в течение 1 часа, дважды промывали PBS и подсчитывали с использованием проточного цитометра. Клетки, которые продуцировали флуоресцентные сигналы, были клетками MKN45, экспрессирующими CEA, а клетки, которые не продуцировали сигнал, были клетками HCT116, не экспрессирующими CEA.

Результаты нецелевого эффекта и цитотоксичности образцов ADC показаны на фиг. 2: все молекулы ADC обладают сильными нецелевыми эффектами и цитотоксичностью. При совместном культивировании MKN45 и HCT116 молекулы ADC могут ингибировать пролиферацию обоих типов клеток, в то время как при культивировании HCT116 отдельно молекулы ADC, соединенные с 2-A, в основном не являются токсичными для клеток. Молекула контроля ADC Lmab-CL2A-SN38 очень токсична для обоих типов клеток, совместно культивируемых и культивируемых отдельно.

Значения DAR молекул ADC, использованных в экспериментах, следующие: Hu63-13-2-A DAR 6,29; Hu47-14-2-A DAR 6,6; Hu67-14-2-A DAR 6,41; Lmab-CL2A-SN38 DAR 7,0.

Тестовый пример 7: Ингибирующая активность in vivo молекул ADC против опухолей

Эффективность молекул ADC in vivo оценивали с использованием моделей опухолей ксенотрансплантатов LS174T и MKN45. Голые мыши BALB/c (класс SPF (не содержащие специфических патогенов), Shanghai Slac Laboratory Animal Co., Ltd., номер сертификата: 201833814, номер лицензии: SCXK (Jiangsu) 2016-0010) помещали в 12/12-часовой цикл свет/темнота при температуре 23±1°С с влажностью 40-50%, с пищей (стандартный стерилизованный корм для мышей) и водой неограничено. Мышей акклиматизировали в течение 10 дней в лабораторной среде перед началом эксперимента, а затем подкожно инокулировали на правом боку клетками LS174T (5×10⁵ клеток/мышь) или клетками MKN45 (4×10⁶ клеток/мышь). Опухолям давали вырасти до размера около 150 мм³, а затем мышей рандомизировали в группы по 8. После группировки мышам в экспериментальных группах внутрибрюшинно вводили образцы ADC в дозе 1 мг/кг или 3 мг/кг, а мышам в пустой контрольной группе внутрибрюшинно вводили PBS только один раз. Размеры опухолей на мышах наблюдали, измеряли и фиксировали. Объем опухоли (V) рассчитывали как: V=1/2×L_{длинная}×L_{короткая}²; относительный объем опухоли (RTV) =V_T/V₀; частота ингибирования опухоли (%)= (C_RTV-T_RTV)/C_RTV (%); где V₀ и V_T - объемы опухоли в начале и конце эксперимента, соответственно; и C_RTV и T_RTV - относительные объемы опухоли контрольной группы и экспериментальных групп, соответственно, в конце эксперимента.

С точки зрения эффективности in vivo, по сравнению с PBS в контрольной группе, все молекулы ADC имеют эффекты ингибирования увеличения объема и массы опухолей в некоторой степени дозозависимым образом: ингибирующие эффекты на опухоли в группах 3 мг/кг лучше, чем в группах 1 мг/кг. В модели опухоли ксенотрансплантата LS174T результаты показаны на фиг. 3 (изменения объема опухоли) и фиг. 4 (масса опухоли в последний день): среди групп, получавших 3 мг/кг, Hu63-13-2-A обладает лучшим ингибирующим действием на опухоли, за которым следует Hu47-14-2-A, а затем Hu67-14-2-A, и Lmab-CL2A-SN38 обладает наихудшим ингибирующим действием на опухоли. В модели опухоли ксенотрансплантата MKN45 результаты показаны на фиг. 5 (изменения объема опухоли) и фиг. 6 (масса опухоли в последний день): среди групп, получавших 3 мг/кг, Hu67-14-2-A обладает лучшим ингибирующим действием на опухоли, за которым следует Hu103-32-2-A, а затем Hu63-13-2-A, и Lmab-CL2A-SN38 обладает наихудшим ингибирующим действием на опухоли.

Частота ингибирования опухоли молекулами ADC in vivo показана в таблицах 23 и 24 ниже: степень ингибирования опухоли ADC демонстрирует значительный эффект от дозы; в частности, в модели опухоли ксенотрансплантата LS174T среди групп с низкой дозой (1 мг/кг), Hu63-13-2-A имеет самую высокую степень ингибирования опухоли (55,95%), за которой следует Hu67-14-2-A (43,71%), и Hu47-14-2-A имеет самую низкую степень ингибирования опухоли (23,04%); среди групп с высокой дозой (3 мг/л), Hu63-13-2-A имеет самую высокую степень ингибирования опухоли (77,13%), за которой следует Hu47-14-2-A (66,87%), а затем Hu67-14-2-A (47,66%), и Lmab-CL2A-SN38 имеет самую низкую степень ингибирования опухоли (33,44%); в модели опухоли ксенотрансплантана MKN45 среди групп с низкой дозой (1 мг/кг), Hu67-14-2-A имеет самую высокую степень ингибирования опухоли в (15,88%), за которой следует Hu103-32-2-A (11,39%), и Hu63-2-A имеет самую низкую степень ингибирования (9,89%); среди групп с высокой дозой (3 мг/л), Hu67-14-2-A имеет самую высокую степень ингибирования опухоли (79,51%), за которой следует Hu103-32-2-A (74,66%), а затем Hu63-13-2-A (60,26%), и Lmab-CL2A-SN38 имеет самую низкую степень ингибирования опухоли (13,51%).

Таблица 23. Степени ингибирования опухоли in vivo ADC Группа DAR Доза Степень ингибирования опухоли (%) Значение P (по сравнению с контрольной группой) Группа холостого контроля NA (не применимо) NA NA NA Hu63-13-2-A 6,3 1 мг/кг 55,95%* 0,0159 Hu63-13-2-A 6,3 3 мг/кг 77,13%** 0,0013 Hu47-14-2-A 6,6 1 мг/кг 23,04% 0,4590 Hu47-14-2-A 6,6 3 мг/кг 66,87%** 0,0052 Hu67-14-2-A 6,13 1 мг/кг 43,71% 0,0561 Hu67-14-2-A 6,13 3 мг/кг 47,66% 0,0794 Lmab-CL2A-SN38 7,0 3 мг/кг 33,44% 0,1791

Примечание: * обозначает P<0,05, ** обозначает P<0,01, а NA обозначает не применимо.

Таблица 24. Степени ингибирования опухоли in vivo ADC в модели опухоли ксенотрансплантата MKN45 Группа DAR Доза Степень ингибирования опухоли (%) Значение P (по сравнению с контрольной группой) Группа холостого контроля NA NA NA NA Hu63-13-2-A 6,3 1 мг/кг 9,89% 0,6492 Hu63-13-2-A 6,3 3 мг/кг 60,26%* 0,0124 Hu67-14-2-A 6,13 1 мг/кг 15,88% 0,5336 Hu67-14-2-A 6,13 3 мг/кг 79,51%** 0,0087 Hu103-32-2-A 6,94 1 мг/кг 11,39% 0,5219 Hu103-32-2-A 6,94 3 мг/кг 74,66%** 0,0033 Lmab-CL2A-SN38 7,0 3 мг/кг 13,51% 0,4980

Примечание: * обозначает P<0,05, ** обозначает P<0,01, а NA обозначает не применимо.

Тестовый пример 8: Фармакокинетическое исследование молекул ADC in vivo

Фармакокинетическое исследование in vivo проводили на крысах линии SD (Спрег-Доули). Крысы SD (Shanghai Sippr-BK Laboratory Animal Co. Ltd.) были рандомизированы в группы по 3 особи, и лекарственные средства вводили путем внутривенной инъекции в дозе 3 мг/кг. 0,3 мл образцов цельной крови брали из групп введения в следующие моменты времени: до введения и 5 мин, 8 ч, 1 день, 2 дня, 4 дня, 7 дней, 10 дней, 14 дней, 21 день и 28 дней после введения, и антикоагулянт не добавляли. Собранный образец цельной крови оставляли при 4°C в течение 30 минут и центрифугировали при 1000 g в течение 15 минут, а супернатант собирали, помещали в пробирку EP (Эппендорф) и хранили при -80°C. Концентрацию в сыворотке крови определяли с помощью ELISA, а фармакокинетические параметры для исследуемых лекарственных средств рассчитывали с помощью программного обеспечения Winnolin. Результаты приведены ниже:

Таблица 25. Фармакокинетические параметры молекул ADCin vivo Образцы Hu63-13-2-A
(DAR 6,8) Hu47-14-2-A
(DAR 6,72) Hu67-14-2-A
(DAR 6,7) Hu103-32-2-A
(DAR 6,91) Интактный ADC Антитела Интактный ADC Антитела Интактный ADC Антитела Интактный ADC Антитела Параметры Среднее значение Среднее значение Среднее значение Среднее значение Среднее значение Среднее значение Среднее значение Среднее значение t1/2 (часы) 169,7 192,7 158,5 188,8 170,8 180,6 135,19 157,87 t1/2 (дни) 7,1 8,0 6,6 7,9 7,1 7,5 5,63 6,58 Cmax (максимальная концентрация) (мкг/мл) 62,9 67,6 51,5 55,2 50,8 49,6 64,94 66,35 AUC 0-t (площадь под кривой зависимости концентрации от времени, рассчитанная от нуля до последней измеренной концентрации) (мкг/мл*ч) 4280 4949 3283 3444 4037 4038 3609 3235 AUC 0-_∞ (площадь под кривой зависимости концентрации от времени, от нуля до бесконечности) (мкг/мл*ч) 4600 5451 3456 3741 4309 4356 3699 3357 Vz (объем распределения при конечной фазе) (мл/кг) 159,8 153,0 198,3 218,8 171,9 179,9 160,09 206,29 CL (общий клиренс) (мл/сут/кг) 15,7 13,2 20,9 19,3 16,8 16,6 19,70 21,75 MRT0-_∞ (среднее время пребывания от нуля до бесконечности) (ч) 212,1 239,0 184,7 216,6 226,6 237,7 144,63 160,14

Все молекулы ADC обладают хорошими фармакокинетическими свойствами, а периоды полураспада антител немного дольше, чем у молекул ADC. Период полувыведения Hu63-13-2-A in vivo составляет 7,1 суток, а период полувыведения антитела составляет 8 суток; период полувыведения Hu47-14-2-A in vivo составляет 6,6 суток, а период полувыведения антитела составляет 7,9 суток; период полувыведения Hu67-14-2-A in vivo составляет 7,1 суток, а период полувыведения антитела составляет 7,5 суток; период полувыведения Hu103-32-2-A in vivo составляет 5,63 суток, а период полувыведения антитела составляет 6,58 суток.

Тестовый пример 9: Исследование стабильности in vitro молекул ADC в плазме

Чтобы оценить стабильность молекул ADC в плазме in vitro, молекулы ADC добавляли к плазме человека и обезьяны в концентрации 100 мкг/мл, и смеси оставляли при 37°C в течение 21 дня. Образцы смеси отбирали один раз в неделю и анализировали с помощью LC/MS/MS (Shimadzu, LC-30AD система сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии; Applied Biosystems, API4000 тройной квадрупольный тандемный масс-спектрометр) на содержание свободного токсина в плазме. Результаты детектирования приведены ниже:

Таблица 26. Процентное содержание токсинов в плазме Процентное содержание токсинов в плазме (%) Hu63-13-2-A
(DAR 7,24) Hu47-14-2-A
(DAR 6,85) Hu67-14-2-A
(DAR 6,7) Hu103-32-2-A
(DAR 6,05) Дни BSA (бычий сывороточный альбумин) Человек Обезьяна BSA Человек Обезьяна BSA Человек Обезьяна BSA Человек Обезьяна 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,93 0,38 14 0 0,21 0 0 0,28 0 0 0,18 0,21 0 0,78 0,92 21 0 0,32 0,4 0 0,34 0,29 0 0,4 0,24 0 1,13 0,96

Результат обнаружения 0 указывает на то, что содержание свободного токсина в плазме ниже нижнего предела обнаружения и не может быть обнаружено. Все молекулы ADC обладают хорошей стабильностью в плазме человека и обезьяны. Содержание свободного токсина в плазме человека и обезьяны для Hu63-13-2-A составило 0,32% и 0,4% соответственно после инкубации при 37°С в течение 21 дня; содержание свободного токсина в плазме человека и обезьяны для Hu47-14-2-A составило 0,34% и 0,29% соответственно; содержание свободного токсина в плазме человека и обезьяны для Hu67-14-2-A составило 0,4% и 0,24% соответственно; содержание свободного токсина в плазме человека и обезьяны для Hu103-32-2-A составило 1,13% и 0,96% соответственно.

Тестовый пример 10: Тест на ингибирование in vitro пролиферации опухолевых клеток соединениями

I. Назначение

Этот эксперимент предназначен для проверки ингибирующей активности фармацевтических соединений по настоящему изобретению в отношении пролиферации in vitro клеток U87MG (Банк клеток, Китайская академия наук, кат. № TCHu138) и опухолевых клеток SK-BR-3 (клетки рака молочной железы человека, ATCC, кат. № HTB-30). Клетки обрабатывали in vitro соединением в различных концентрациях. Через 6 дней культивирования пролиферацию клеток тестировали с использованием реагентов CTG (CellTiter-Glo® Люминесцентный анализ жизнеспособности клеток, Promega, кат. № G7573) и оценивали активность соединения in vitro в соответствии со значением IC₅₀.

II. Способ

Испытание на ингибирование in vitro пролиферации клеток U87MG был взят в качестве примера, чтобы проиллюстрировать способ по настоящему изобретению для тестирования ингибирующей активности соединений по настоящему изобретению против in vitro пролиферации опухолевых клеток. Способ также применим, но не ограничивается этим, к испытаниям на ингибирующую активность в отношении in vitro пролиферации других опухолевых клеток.

1. Клеточная культура: Клетки U87MG и SK-BR-3 культивировали в среде EMEM (минимальная эссенциальная среда Игла) (GE, кат. № SH30024.01), содержащей 10% FBS, и среде McCoy's 5A (среда МакКоя 5A) (Gibco, кат. № 16600-108), содержащей 10% FBS, соответственно.

2. Получение клеток: клетки U87MG и SK-BR-3, в фазе логарифмического роста, промывали один раз PBS (фосфатный буфер, Shanghai BasalMedia Technologies Co., Ltd.), а затем расщепляли трипсином 2-3 мл (0,25% трипсин-EDTA (1×), Gibico, Life Technologies) в течение 2-3 минут. После полного расщепления клеток добавляли 10-15 мл среды для культивирования клеток для элюирования расщепленных клеток. Смеси центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 мин, и супернатанты отбрасывали. Затем клетки ресуспендировали в 10-20 мл среды для культивирования клеток для получения одноклеточных суспензий.

3. Культивирование клеток: одноклеточные суспензии U87MG и SK-BR-3 хорошо перемешивали и доводили с помощью среды для культивирования клеток до плотности клеток 2,75×10³ клеток/мл и 8,25×10³ клеток/мл, соответственно. Все доведенные клеточные суспензии хорошо перемешивали и добавляли в 96-луночные планшеты для культивирования клеток при 180 мкл/лунку. Во внешние лунки 96-луночного планшета добавляли только 200 мкл среды. Планшет инкубировали в инкубаторе в течение 24 часов (37°C, 5% CO₂).

4. Получение соединения: соединение растворяли в DMSO (диметилсульфоксид, Shanghai Titan Scientific Co., Ltd.) для получения исходного раствора при начальной концентрации 10 мМ.

Низкомолекулярные соединения получали при начальной концентрации 500 нМ следующим образом.

Различные тестовые образцы в дозировке 100 мкМ (30 мкл) добавляли в первый вертикальный ряд 96-луночного планшета с U-образным дном, и 20 мкл DMSO добавляли в каждую лунку второго вертикального ряда по одиннадцатый ряд. Образцы в первом ряду (10 мкл) добавляли к 20 мкл DMSO во втором вертикальном ряду, и смеси хорошо перемешивали. В третью колонку добавляли 10 мкл смесей и так далее до десятого вертикального ряда. Лекарственные средства в планшете (5 мкл на лунку) переносили в среду EMEM (95 мкл) и смеси хорошо перемешивали для последующего использования.

ADC получали при начальной концентрации 10 нМ или 500 нМ следующим образом.

Различные тестовые образцы в концентрации 100 нМ или 5 мкМ (100 мкл) добавляли в первый вертикальный ряд 96-луночного планшета и 100 мкл PBS добавляли в каждую лунку второго вертикального ряда по одиннадцатый вертикальный ряд. Образцы в первом вертикальном ряду (50 мкл) добавляли к 100 мкл PBS во втором вертикальном ряду и смеси хорошо перемешивали. Смеси (50 мкл) добавляли в третий вертикальный ряд и так далее, 3-кратным разведением, до десятого вертикального ряда.

5. Тестовые образцы, полученные в различных концентрациях (20 мкл), добавляли в планшет для культур, с двумя дублирующими лунками, установленными для каждого образца. Планшет инкубировали в инкубаторе в течение 6 дней (37°C, 5% CO₂).

6. Цветопроявление: извлекали 96-луночный планшет для культивирования клеток и добавляли 90 мкл раствора CTG в каждую лунку с последующей 10-минутной инкубацией при комнатной температуре.

7. Считывание планшета: 96-луночный планшет для культивирования клеток извлекали и тестировали на хемилюминесцентном ридере для микропланшетов (BMG labtech, PHERAstar FS).

III. Анализ данных

Данные обрабатывали и анализировали с помощью Microsoft Excel и Graphpad Prism 5. Результаты эксперимента приведены в таблице ниже.

Таблица 27. Значения IC₅₀ низкомолекулярных фрагментов согласно настоящему изобретению в ингибировании in vitro пролиферации клеток SK-BR-3 и клеток U87 № соединения IC₅₀ (нМ) SK-BR-3 U87 Более короткое время удерживания 1-B 0,33 0,86 Более длительное время удерживания 1-A 8,11 2,31

Заключение: Низкомолекулярные фрагменты по настоящему изобретению обладают значительной ингибирующей активностью в отношении пролиферации клеток SK-BR-3 и клеток U87, а хиральные центры оказывают определенное влияние на ингибирующую активность соединений.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ЦЗЯНСУ ХЭНЖУЙ МЕДСИН КО., ЛТД.

ШАНХАЙ ХЭНЖУЙ ФАРМАСЬЮТИКАЛ КО., ЛТД.

<120> КОНЪЮГАТ АНТИТЕЛА ПРОТИВ CEA И АНАЛОГА ЭКСАТЕКАНА И ЕГО ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ

<130> 702139CPCT

<160> 92

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 657

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ПЕПТИД

<223> Белковая последовательность CEA-His человека(hCEA-His)

<400> 1

Lys Leu Thr Ile Glu Ser Thr Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly Lys Glu

1 5 10 15

Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln His Leu Phe Gly Tyr Ser

20 25 30

Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg Gln Ile Ile Gly Tyr

35 40 45

Val Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Tyr Ser Gly Arg

50 55 60

Glu Ile Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Ile Ile Gln

65 70 75 80

Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu His Val Ile Lys Ser Asp Leu Val

85 90 95

Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe Arg Val Tyr Pro Glu Leu Pro Lys

100 105 110

Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu Asp Lys Asp Ala

115 120 125

Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Ala Thr Tyr Leu Trp

130 135 140

Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln Leu Ser

145 150 155 160

Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg Asn Asp Thr

165 170 175

Ala Ser Tyr Lys Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Ala Arg Arg Ser

180 185 190

Asp Ser Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro Thr Ile

195 200 205

Ser Pro Leu Asn Thr Ser Tyr Arg Ser Gly Glu Asn Leu Asn Leu Ser

210 215 220

Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Phe Val Asn

225 230 235 240

Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro Asn Ile Thr

245 250 255

Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Thr Cys Gln Ala His Asn Ser Asp Thr

260 265 270

Gly Leu Asn Arg Thr Thr Val Thr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Glu Pro

275 280 285

Pro Lys Pro Phe Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu Asp Glu

290 295 300

Asp Ala Val Ala Leu Thr Cys Glu Pro Glu Ile Gln Asn Thr Thr Tyr

305 310 315 320

Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln

325 330 335

Leu Ser Asn Asp Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr Arg Asn

340 345 350

Asp Val Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn Glu Leu Ser Val Asp

355 360 365

His Ser Asp Pro Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Asp Pro

370 375 380

Thr Ile Ser Pro Ser Tyr Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Val Asn Leu Ser

385 390 395 400

Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Leu

405 410 415

Ile Asp Gly Asn Ile Gln Gln His Thr Gln Glu Leu Phe Ile Ser Asn

420 425 430

Ile Thr Glu Lys Asn Ser Gly Leu Tyr Thr Cys Gln Ala Asn Asn Ser

435 440 445

Ala Ser Gly His Ser Arg Thr Thr Val Lys Thr Ile Thr Val Ser Ala

450 455 460

Glu Leu Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu

465 470 475 480

Asp Lys Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Ala Gln Asn Thr

485 490 495

Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg

500 505 510

Leu Gln Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr

515 520 525

Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Cys Gly Ile Gln Asn Ser Val Ser

530 535 540

Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asp Val Leu Tyr Gly Pro Asp

545 550 555 560

Thr Pro Ile Ile Ser Pro Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly Ala Asn

565 570 575

Leu Asn Leu Ser Cys His Ser Ala Ser Asn Pro Ser Pro Gln Tyr Ser

580 585 590

Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu Phe Ile

595 600 605

Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe Val Ser

610 615 620

Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile Thr Val

625 630 635 640

Ser Ala Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu Ser Ala His His His His His

645 650 655

His

<210> 2

<211> 883

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ПЕПТИД

<223> Белковая последовательность CEA-Fc человека (hCEA-Fc)

<400> 2

Lys Leu Thr Ile Glu Ser Thr Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly Lys Glu

1 5 10 15

Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln His Leu Phe Gly Tyr Ser

20 25 30

Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg Gln Ile Ile Gly Tyr

35 40 45

Val Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Tyr Ser Gly Arg

50 55 60

Glu Ile Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Ile Ile Gln

65 70 75 80

Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu His Val Ile Lys Ser Asp Leu Val

85 90 95

Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe Arg Val Tyr Pro Glu Leu Pro Lys

100 105 110

Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu Asp Lys Asp Ala

115 120 125

Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Ala Thr Tyr Leu Trp

130 135 140

Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln Leu Ser

145 150 155 160

Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg Asn Asp Thr

165 170 175

Ala Ser Tyr Lys Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Ala Arg Arg Ser

180 185 190

Asp Ser Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro Thr Ile

195 200 205

Ser Pro Leu Asn Thr Ser Tyr Arg Ser Gly Glu Asn Leu Asn Leu Ser

210 215 220

Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Phe Val Asn

225 230 235 240

Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro Asn Ile Thr

245 250 255

Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Thr Cys Gln Ala His Asn Ser Asp Thr

260 265 270

Gly Leu Asn Arg Thr Thr Val Thr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Glu Pro

275 280 285

Pro Lys Pro Phe Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu Asp Glu

290 295 300

Asp Ala Val Ala Leu Thr Cys Glu Pro Glu Ile Gln Asn Thr Thr Tyr

305 310 315 320

Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln

325 330 335

Leu Ser Asn Asp Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr Arg Asn

340 345 350

Asp Val Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn Glu Leu Ser Val Asp

355 360 365

His Ser Asp Pro Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Asp Pro

370 375 380

Thr Ile Ser Pro Ser Tyr Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Val Asn Leu Ser

385 390 395 400

Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Leu

405 410 415

Ile Asp Gly Asn Ile Gln Gln His Thr Gln Glu Leu Phe Ile Ser Asn

420 425 430

Ile Thr Glu Lys Asn Ser Gly Leu Tyr Thr Cys Gln Ala Asn Asn Ser

435 440 445

Ala Ser Gly His Ser Arg Thr Thr Val Lys Thr Ile Thr Val Ser Ala

450 455 460

Glu Leu Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu

465 470 475 480

Asp Lys Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Ala Gln Asn Thr

485 490 495

Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg

500 505 510

Leu Gln Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr

515 520 525

Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Cys Gly Ile Gln Asn Ser Val Ser

530 535 540

Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asp Val Leu Tyr Gly Pro Asp

545 550 555 560

Thr Pro Ile Ile Ser Pro Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly Ala Asn

565 570 575

Leu Asn Leu Ser Cys His Ser Ala Ser Asn Pro Ser Pro Gln Tyr Ser

580 585 590

Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu Phe Ile

595 600 605

Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe Val Ser

610 615 620

Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile Thr Val

625 630 635 640

Ser Ala Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu Ser Ala Glu Pro Lys Ser Ser

645 650 655

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

660 665 670

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

675 680 685

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

690 695 700

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

705 710 715 720

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

725 730 735

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

740 745 750

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

755 760 765

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

770 775 780

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

785 790 795 800

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

805 810 815

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

820 825 830

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

835 840 845

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

850 855 860

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

865 870 875 880

Pro Gly Lys

<210> 3

<211> 660

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ПЕПТИД

<223> Белковая последовательность CEA-His яванского макака

(cynoCEA-His)

<400> 3

Gln Leu Thr Ile Glu Ser Arg Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly Lys Glu

1 5 10 15

Val Leu Leu Leu Ala His Asn Val Ser Gln Asn Leu Phe Gly Tyr Ile

20 25 30

Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Ala Ser Arg Arg Ile Gly Ser Cys

35 40 45

Val Ile Arg Thr Gln Gln Ile Thr Pro Gly Pro Ala His Ser Gly Arg

50 55 60

Glu Thr Ile Asp Phe Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Val Thr Gln

65 70 75 80

Ser Asp Thr Gly Ser Tyr Thr Ile Gln Val Ile Lys Glu Asp Leu Val

85 90 95

Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe Arg Val Tyr Pro Glu Leu Pro Lys

100 105 110

Pro Tyr Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Ile Glu Asp Lys Asp Ala

115 120 125

Val Ala Leu Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Thr Thr Tyr Leu Trp

130 135 140

Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Glu Leu Ser

145 150 155 160

Ser Asp Asn Arg Thr Leu Thr Val Phe Asn Ile Pro Arg Asn Asp Thr

165 170 175

Thr Ser Tyr Lys Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Val Arg Arg Ser

180 185 190

Asp Pro Val Thr Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro Thr Ile

195 200 205

Ser Pro Leu Asn Thr Pro Tyr Arg Ala Gly Glu Tyr Leu Asn Leu Thr

210 215 220

Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Thr Ala Gln Tyr Phe Trp Phe Val Asn

225 230 235 240

Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro Asn Ile Thr

245 250 255

Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Met Cys Gln Ala His Asn Ser Ala Thr

260 265 270

Gly Leu Asn Arg Thr Thr Val Thr Ala Ile Thr Val Tyr Ala Glu Leu

275 280 285

Pro Lys Pro Tyr Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Ile Glu Asp Lys

290 295 300

Asp Ala Val Thr Leu Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Thr Thr Tyr

305 310 315 320

Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Arg Leu Ser Val Ser Ser Arg Leu Glu

325 330 335

Leu Ser Asn Asp Asn Arg Thr Leu Thr Val Phe Asn Ile Pro Arg Asn

340 345 350

Asp Thr Thr Phe Tyr Glu Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Val Arg

355 360 365

Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro

370 375 380

Thr Ile Ser Pro Leu Asn Thr Pro Tyr Arg Ala Gly Glu Asn Leu Asn

385 390 395 400

Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Ala Ala Gln Tyr Phe Trp Phe

405 410 415

Val Asn Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro Asn

420 425 430

Ile Thr Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Met Cys Gln Ala His Asn Ser

435 440 445

Ala Thr Gly Leu Asn Arg Thr Thr Val Thr Ala Ile Thr Val Tyr Val

450 455 460

Glu Leu Pro Lys Pro Tyr Ile Ser Ser Asn Asn Ser Asn Pro Ile Glu

465 470 475 480

Asp Lys Asp Ala Val Thr Leu Thr Cys Glu Pro Val Ala Glu Asn Thr

485 490 495

Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Ser Val Ser Pro Arg

500 505 510

Leu Gln Leu Ser Asn Gly Asn Arg Ile Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr

515 520 525

Arg Asn Asp Thr Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn Ser Glu Ser

530 535 540

Ala Lys Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asn Val Thr Tyr Gly Pro Asp

545 550 555 560

Thr Pro Ile Ile Ser Pro Pro Asp Leu Ser Tyr Arg Ser Gly Ala Asn

565 570 575

Leu Asn Leu Ser Cys His Ser Asp Ser Asn Pro Ser Pro Gln Tyr Ser

580 585 590

Trp Leu Ile Asn Gly Thr Leu Arg Gln His Thr Gln Val Leu Phe Ile

595 600 605

Ser Lys Ile Thr Ser Asn Asn Asn Gly Ala Tyr Ala Cys Phe Val Ser

610 615 620

Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Asn Ile Ser Val

625 630 635 640

Ser Ser Gly Asp Ser Ala Pro Gly Ser Ser Gly Leu Ser Ala His His

645 650 655

His His His His

660

<210> 4

<211> 702

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ПЕПТИД

<223> Белковая последовательность СЕА человека, экспрессируемая

на поверхности клеток СНО (hCEA-CHO)

<400> 4

Met Glu Ser Pro Ser Ala Pro Pro His Arg Trp Cys Ile Pro Trp Gln

1 5 10 15

Arg Leu Leu Leu Thr Ala Ser Leu Leu Thr Phe Trp Asn Pro Pro Thr

20 25 30

Thr Ala Lys Leu Thr Ile Glu Ser Thr Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly

35 40 45

Lys Glu Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln His Leu Phe Gly

50 55 60

Tyr Ser Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg Gln Ile Ile

65 70 75 80

Gly Tyr Val Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Tyr Ser

85 90 95

Gly Arg Glu Ile Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Ile

100 105 110

Ile Gln Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu His Val Ile Lys Ser Asp

115 120 125

Leu Val Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe Arg Val Tyr Pro Glu Leu

130 135 140

Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu Asp Lys

145 150 155 160

Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Ala Thr Tyr

165 170 175

Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln

180 185 190

Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg Asn

195 200 205

Asp Thr Ala Ser Tyr Lys Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Ala Arg

210 215 220

Arg Ser Asp Ser Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro

225 230 235 240

Thr Ile Ser Pro Leu Asn Thr Ser Tyr Arg Ser Gly Glu Asn Leu Asn

245 250 255

Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Phe

260 265 270

Val Asn Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro Asn

275 280 285

Ile Thr Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Thr Cys Gln Ala His Asn Ser

290 295 300

Asp Thr Gly Leu Asn Arg Thr Thr Val Thr Thr Ile Thr Val Tyr Ala

305 310 315 320

Glu Pro Pro Lys Pro Phe Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu

325 330 335

Asp Glu Asp Ala Val Ala Leu Thr Cys Glu Pro Glu Ile Gln Asn Thr

340 345 350

Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg

355 360 365

Leu Gln Leu Ser Asn Asp Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr

370 375 380

Arg Asn Asp Val Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn Glu Leu Ser

385 390 395 400

Val Asp His Ser Asp Pro Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp

405 410 415

Asp Pro Thr Ile Ser Pro Ser Tyr Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Val Asn

420 425 430

Leu Ser Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser

435 440 445

Trp Leu Ile Asp Gly Asn Ile Gln Gln His Thr Gln Glu Leu Phe Ile

450 455 460

Ser Asn Ile Thr Glu Lys Asn Ser Gly Leu Tyr Thr Cys Gln Ala Asn

465 470 475 480

Asn Ser Ala Ser Gly His Ser Arg Thr Thr Val Lys Thr Ile Thr Val

485 490 495

Ser Ala Glu Leu Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro

500 505 510

Val Glu Asp Lys Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Ala Gln

515 520 525

Asn Thr Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val Ser

530 535 540

Pro Arg Leu Gln Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn

545 550 555 560

Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Cys Gly Ile Gln Asn Ser

565 570 575

Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asp Val Leu Tyr Gly

580 585 590

Pro Asp Thr Pro Ile Ile Ser Pro Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly

595 600 605

Ala Asn Leu Asn Leu Ser Cys His Ser Ala Ser Asn Pro Ser Pro Gln

610 615 620

Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu

625 630 635 640

Phe Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe

645 650 655

Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile

660 665 670

Thr Val Ser Ala Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu Ser Ala Gly Ala Thr

675 680 685

Val Gly Ile Met Ile Gly Val Leu Val Gly Val Ala Leu Ile

690 695 700

<210> 5

<211> 690

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ПЕПТИД

<223> Белковая последовательность СЕА яванского макака,

экспрессируемая на поверхности клеток СНО (cynoCEA-CHO)

<400> 5

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Gln Leu Thr Ile Glu Ser Arg Pro Phe Asn Val Ala Glu

20 25 30

Gly Lys Glu Val Leu Leu Leu Ala His Asn Val Ser Gln Asn Leu Phe

35 40 45

Gly Tyr Ile Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Ala Ser Arg Arg Ile

50 55 60

Gly Ser Cys Val Ile Arg Thr Gln Gln Ile Thr Pro Gly Pro Ala His

65 70 75 80

Ser Gly Arg Glu Thr Ile Asp Phe Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn

85 90 95

Val Thr Gln Ser Asp Thr Gly Ser Tyr Thr Ile Gln Val Ile Lys Glu

100 105 110

Asp Leu Val Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe Arg Val Tyr Pro Glu

115 120 125

Leu Pro Lys Pro Tyr Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Ile Glu Asp

130 135 140

Lys Asp Ala Val Ala Leu Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Thr Thr

145 150 155 160

Tyr Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu

165 170 175

Glu Leu Ser Ser Asp Asn Arg Thr Leu Thr Val Phe Asn Ile Pro Arg

180 185 190

Asn Asp Thr Thr Ser Tyr Lys Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Val

195 200 205

Arg Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala

210 215 220

Pro Thr Ile Ser Pro Leu Asn Thr Pro Tyr Arg Ala Gly Glu Tyr Leu

225 230 235 240

Asn Leu Thr Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Thr Ala Gln Tyr Phe Trp

245 250 255

Phe Val Asn Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro

260 265 270

Asn Ile Thr Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Met Cys Gln Ala His Asn

275 280 285

Ser Ala Thr Gly Leu Asn Arg Thr Thr Val Thr Ala Ile Thr Val Tyr

290 295 300

Ala Glu Leu Pro Lys Pro Tyr Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Ile

305 310 315 320

Glu Asp Lys Asp Ala Val Thr Leu Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp

325 330 335

Thr Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Arg Leu Ser Val Ser Ser

340 345 350

Arg Leu Glu Leu Ser Asn Asp Asn Arg Thr Leu Thr Val Phe Asn Ile

355 360 365

Pro Arg Asn Asp Thr Thr Phe Tyr Glu Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val

370 375 380

Ser Val Arg Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro

385 390 395 400

Asp Ala Pro Thr Ile Ser Pro Leu Asn Thr Pro Tyr Arg Ala Gly Glu

405 410 415

Asn Leu Asn Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Ala Ala Gln Tyr

420 425 430

Phe Trp Phe Val Asn Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe

435 440 445

Ile Pro Asn Ile Thr Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Met Cys Gln Ala

450 455 460

His Asn Ser Ala Thr Gly Leu Asn Arg Thr Thr Val Thr Ala Ile Thr

465 470 475 480

Val Tyr Val Glu Leu Pro Lys Pro Tyr Ile Ser Ser Asn Asn Ser Asn

485 490 495

Pro Ile Glu Asp Lys Asp Ala Val Thr Leu Thr Cys Glu Pro Val Ala

500 505 510

Glu Asn Thr Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Ser Val

515 520 525

Ser Pro Arg Leu Gln Leu Ser Asn Gly Asn Arg Ile Leu Thr Leu Leu

530 535 540

Ser Val Thr Arg Asn Asp Thr Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn

545 550 555 560

Ser Glu Ser Ala Lys Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asn Val Thr Tyr

565 570 575

Gly Pro Asp Thr Pro Ile Ile Ser Pro Pro Asp Leu Ser Tyr Arg Ser

580 585 590

Gly Ala Asn Leu Asn Leu Ser Cys His Ser Asp Ser Asn Pro Ser Pro

595 600 605

Gln Tyr Ser Trp Leu Ile Asn Gly Thr Leu Arg Gln His Thr Gln Val

610 615 620

Leu Phe Ile Ser Lys Ile Thr Ser Asn Asn Asn Gly Ala Tyr Ala Cys

625 630 635 640

Phe Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Asn

645 650 655

Ile Ser Val Ser Ser Gly Asp Ser Ala Pro Gly Ser Ser Gly Leu Ser

660 665 670

Ala Arg Ala Thr Val Gly Ile Ile Ile Gly Met Leu Val Gly Val Ala

675 680 685

Leu Met

690

<210> 6

<211> 526

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ПЕПТИД

<223> Белковая последовательность CEACAM1 человека,

экспрессируемая на поверхности клеток CHO (CEACAM1-CHO)

<400> 6

Met Gly His Leu Ser Ala Pro Leu His Arg Val Arg Val Pro Trp Gln

1 5 10 15

Gly Leu Leu Leu Thr Ala Ser Leu Leu Thr Phe Trp Asn Pro Pro Thr

20 25 30

Thr Ala Gln Leu Thr Thr Glu Ser Met Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly

35 40 45

Lys Glu Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln Gln Leu Phe Gly

50 55 60

Tyr Ser Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg Gln Ile Val

65 70 75 80

Gly Tyr Ala Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Asn Ser

85 90 95

Gly Arg Glu Thr Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Val

100 105 110

Thr Gln Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu Gln Val Ile Lys Ser Asp

115 120 125

Leu Val Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe His Val Tyr Pro Glu Leu

130 135 140

Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu Asp Lys

145 150 155 160

Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Thr Thr Tyr

165 170 175

Leu Trp Trp Ile Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln

180 185 190

Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr Arg Asn

195 200 205

Asp Thr Gly Pro Tyr Glu Cys Glu Ile Gln Asn Pro Val Ser Ala Asn

210 215 220

Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asn Val Thr Tyr Gly Pro Asp Thr Pro

225 230 235 240

Thr Ile Ser Pro Ser Asp Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Ala Asn Leu Ser

245 250 255

Leu Ser Cys Tyr Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Leu

260 265 270

Ile Asn Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro Asn

275 280 285

Ile Thr Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Thr Cys His Ala Asn Asn Ser

290 295 300

Val Thr Gly Cys Asn Arg Thr Thr Val Lys Thr Ile Ile Val Thr Glu

305 310 315 320

Leu Ser Pro Val Val Ala Lys Pro Gln Ile Lys Ala Ser Lys Thr Thr

325 330 335

Val Thr Gly Asp Lys Asp Ser Val Asn Leu Thr Cys Ser Thr Asn Asp

340 345 350

Thr Gly Ile Ser Ile Arg Trp Phe Phe Lys Asn Gln Ser Leu Pro Ser

355 360 365

Ser Glu Arg Met Lys Leu Ser Gln Gly Asn Thr Thr Leu Ser Ile Asn

370 375 380

Pro Val Lys Arg Glu Asp Ala Gly Thr Tyr Trp Cys Glu Val Phe Asn

385 390 395 400

Pro Ile Ser Lys Asn Gln Ser Asp Pro Ile Met Leu Asn Val Asn Tyr

405 410 415

Asn Ala Leu Pro Gln Glu Asn Gly Leu Ser Pro Gly Ala Ile Ala Gly

420 425 430

Ile Val Ile Gly Val Val Ala Leu Val Ala Leu Ile Ala Val Ala Leu

435 440 445

Ala Cys Phe Leu His Phe Gly Lys Thr Gly Arg Ala Ser Asp Gln Arg

450 455 460

Asp Leu Thr Glu His Lys Pro Ser Val Ser Asn His Thr Gln Asp His

465 470 475 480

Ser Asn Asp Pro Pro Asn Lys Met Asn Glu Val Thr Tyr Ser Thr Leu

485 490 495

Asn Phe Glu Ala Gln Gln Pro Thr Gln Pro Thr Ser Ala Ser Pro Ser

500 505 510

Leu Thr Ala Thr Glu Ile Ile Tyr Ser Glu Val Lys Lys Gln

515 520 525

<210> 7

<211> 120

<212> ПРТ

<213> Мышь домовая

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области тяжелой цепи

mAb47

<400> 7

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Gly Asn Tyr Gly Arg Trp Asp Phe Asp Val Trp Gly Thr

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 108

<212> ПРТ

<213> Мышь домовая

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области легкой цепи

mAb47

<400> 8

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ala Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser Thr Ile Ser Ser Ser

20 25 30

Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Glu Thr Ser Pro Lys Pro Trp

35 40 45

Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Tyr Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 9

<211> 119

<212> ПРТ

<213> Мышь домовая

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области тяжелой цепи

mAb63

<400> 9

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Phe Pro Lys Asn Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Arg Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Phe Arg Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Asn Tyr Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Ile Phe Thr Val Ser Ser

115

<210> 10

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Мышь домовая

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области легкой цепи

mAb63

<400> 10

Asp Val Gln Met Thr Gln Thr Pro Ser Ala Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Asn Ile Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Arg Ser Gly Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 11

<211> 117

<212> ПРТ

<213> Мышь домовая

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области тяжелой цепи

mAb67

<400> 11

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Tyr Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

His Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Asn Pro Asp Ile Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Asp Phe Asp Ser Phe Ala Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 12

<211> 111

<212> ПРТ

<213> Мышь домовая

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области легкой цепи

mAb67

<400> 12

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly

1 5 10 15

Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile Ile

20 25 30

Gly Thr Asn Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp

65 70 75 80

Pro Val Glu Gly Asp Asp Val Ala Leu Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg

85 90 95

Lys Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Met Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 13

<211> 122

<212> ПРТ

<213> Мышь домовая

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области тяжелой цепи

mAb103

<400> 13

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Gly Val Ile Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Phe

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Lys Lys Thr Leu Thr Thr Val Thr Pro Trp Phe Ala Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210> 14

<211> 115

<212> ПРТ

<213> Мышь домовая

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области легкой цепи

mAb103

<400> 14

Asp Leu Val Val Thr Gln Ser Ser Ser Ala Ser Phe Ser Leu Gly Ala

1 5 10 15

Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr Tyr Thr

20 25 30

Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Leu Lys Pro Pro Lys Tyr Val Met

35 40 45

Glu Leu Lys Lys Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Asn Ile Gln Pro Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asn

85 90 95

Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val

100 105 110

Thr Val Leu

115

<210> 15

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Мышь домовая

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность тяжелой цепи HCDR1 mAb47

<400> 15

Thr Tyr Gly Met Ser

1 5

<210> 16

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Мышь домовая

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность тяжелой цепи HCDR2 mAb47/mAb103

<400> 16

Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 17

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Мышь домовая

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность тяжелой цепи HCDR3 mAb47

<400> 17

Arg Gly Asn Tyr Gly Arg Trp Asp Phe Asp Val

1 5 10

<210> 18

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Мышь домовая

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность легкой цепи LCDR1 mAb47

<400> 18

Ser Val Ser Ser Thr Ile Ser Ser Ser Asn Leu His

1 5 10

<210> 19

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Мышь домовая

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность легкой цепи LCDR2 mAb47

<400> 19

Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 20

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Мышь домовая

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность легкой цепи LCDR3 mAb47

<400> 20

Gln Gln Trp Ser Ile Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 21

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Мышь домовая

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность тяжелой цепи HCDR1 mAb63

<400> 21

Asp Phe Tyr Met Asn

1 5

<210> 22

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Мышь домовая

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность тяжелой цепи HCDR2 mAb63

<400> 22

Asp Ile Phe Pro Lys Asn Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Arg Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 23

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Мышь домовая

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность тяжелой цепи HCDR3 mAb63

<400> 23

Ser Gly Tyr Gly Asn Tyr Val Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 24

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Мышь домовая

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность легкой цепи LCDR1 mAb63

<400> 24

Arg Thr Ser Gln Asp Ile Asn Ile Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 25

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Мышь домовая

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность легкой цепи LCDR2 mAb63

<400> 25

Tyr Arg Ser Gly Leu Leu Ser

1 5

<210> 26

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Мышь домовая

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность легкой цепи LCDR3 mAb63

<400> 26

Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Pro Thr

1 5

<210> 27

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Мышь домовая

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность тяжелой цепи HCDR1 mAb67

<400> 27

Asp Tyr His Met Asn

1 5

<210> 28

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Мышь домовая

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность тяжелой цепи HCDR2 mAb67

<400> 28

Asp Ile Asn Pro Asp Ile Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 29

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Мышь домовая

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность тяжелой цепи HCDR3 mAb67

<400> 29

Trp Asp Phe Asp Ser Phe Ala Asn

1 5

<210> 30

<211> 15

<212> ПРТ

<213> Мышь домовая

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность легкой цепи LCDR1 mAb67

<400> 30

Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile Ile Gly Thr Asn Leu Ile His

1 5 10 15

<210> 31

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Мышь домовая

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность легкой цепи LCDR2 mAb67

<400> 31

His Ala Ser Asn Leu Glu Thr

1 5

<210> 32

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Мышь домовая

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность легкой цепи LCDR3 mAb67

<400> 32

Leu Gln Ser Arg Lys Ile Pro Tyr Thr

1 5

<210> 33

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Мышь домовая

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность тяжелой цепи HCDR1 mAb103

<400> 33

Thr Tyr Gly Val Ile

1 5

<210> 34

<211> 13

<212> ПРТ

<213> Мышь домовая

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность тяжелой цепи HCDR3 mAb103

<400> 34

Lys Lys Thr Leu Thr Thr Val Thr Pro Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 35

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Мышь домовая

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность легкой цепи LCDR1 mAb103

<400> 35

Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu

1 5 10

<210> 36

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Мышь домовая

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность легкой цепи LCDR2 mAb103

<400> 36

Leu Lys Lys Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp

1 5 10

<210> 37

<211> 13

<212> ПРТ

<213> Мышь домовая

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность легкой цепи LCDR3 mAb103

<400> 37

Gly Val Gly Asn Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val

1 5 10

<210> 38

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Мутантная последовательность тяжелой цепи HCDR2 (D61S)

mAb47/mAb103

<400> 38

Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Ser Asp Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 39

<211> 120

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области тяжелой цепи

h47VH1 гуманизированного антитела mAb47

<400> 39

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Gly Asn Tyr Gly Arg Trp Asp Phe Asp Val Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 40

<211> 120

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области тяжелой цепи

h47VH2 гуманизированного антитела mAb47

<400> 40

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Gly Asn Tyr Gly Arg Trp Asp Phe Asp Val Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 41

<211> 120

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области тяжелой цепи

h47VH3 гуманизированного антитела mAb47

<400> 41

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Gly Asn Tyr Gly Arg Trp Asp Phe Asp Val Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 42

<211> 120

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области тяжелой цепи

h47VH4 гуманизированного антитела mAb47

<400> 42

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Ser Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Gly Asn Tyr Gly Arg Trp Asp Phe Asp Val Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 43

<211> 108

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области легкой цепи

h47VL1 гуманизированного антитела mAb47

<400> 43

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser Thr Ile Ser Ser Ser

20 25 30

Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Lys Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Tyr Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 44

<211> 108

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области легкой цепи

h47VL2 гуманизированного антитела mAb47

<400> 44

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser Thr Ile Ser Ser Ser

20 25 30

Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Pro Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Tyr Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 45

<211> 108

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области легкой цепи

h47VL3 гуманизированного антитела mAb47

<400> 45

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser Thr Ile Ser Ser Ser

20 25 30

Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Pro Trp

35 40 45

Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Tyr Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 46

<211> 108

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области легкой цепи

h47VL4 гуманизированного антитела mAb47

<400> 46

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser Thr Ile Ser Ser Ser

20 25 30

Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Pro Trp

35 40 45

Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Tyr Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 47

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Мутантная последовательность тяжелой цепи HCDR2 (N54S)

mAb63

<400> 47

Asp Ile Phe Pro Lys Ser Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Arg Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 48

<211> 119

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области тяжелой цепи

h63VH1 гуманизированного антитела mAb63

<400> 48

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asp Ile Phe Pro Lys Asn Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Arg Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Asn Tyr Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 49

<211> 119

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области тяжелой цепи

h63VH2 гуманизированного антитела mAb63

<400> 49

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asp Ile Phe Pro Lys Asn Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Arg Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Asn Tyr Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 50

<211> 119

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области тяжелой цепи

h63VH3 гуманизированного антитела mAb63

<400> 50

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Phe Pro Lys Asn Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Arg Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Phe Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Asn Tyr Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 51

<211> 119

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области тяжелой цепи

h63VH4 гуманизированного антитела mAb63

<400> 51

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Phe Pro Lys Asn Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Arg Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Phe Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Asn Tyr Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 52

<211> 119

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области тяжелой цепи

h63VH5 гуманизированного антитела mAb63

<400> 52

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asp Ile Phe Pro Lys Ser Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Arg Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Asn Tyr Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 53

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области легкой цепи

h63VL1 гуманизированного антитела mAb63

<400> 53

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Asn Ile Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Arg Ser Gly Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 54

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области легкой цепи

h63VL2 гуманизированного антитела mAb63

<400> 54

Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Asn Ile Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Arg Ser Gly Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 55

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области легкой

цепи h63VL3 гуманизированного антитела mAb63

<400> 55

Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Asn Ile Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Ala Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Arg Ser Gly Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 56

<211> 117

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области тяжелой цепи

h67VH1 гуманизированного антитела mAb67

<400> 56

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

His Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asp Ile Asn Pro Asp Ile Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Asp Phe Asp Ser Phe Ala Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 57

<211> 117

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области тяжелой цепи

h67VH2 гуманизированного антитела mAb67

<400> 57

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

His Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asp Ile Asn Pro Asp Ile Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Asp Phe Asp Ser Phe Ala Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 58

<211> 117

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области тяжелой цепи

h67VH3 гуманизированного антитела mAb67

<400> 58

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

His Met Asn Trp Val Lys Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asp Ile Asn Pro Asp Ile Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Asp Phe Asp Ser Phe Ala Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 59

<211> 111

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области легкой цепи

h67VL1 гуманизированного антитела mAb67

<400> 59

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile Ile

20 25 30

Gly Thr Asn Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg

85 90 95

Lys Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 60

<211> 111

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области легкой цепи

h67VL2 гуманизированного антитела mAb67

<400> 60

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile Ile

20 25 30

Gly Thr Asn Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg

85 90 95

Lys Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 61

<211> 111

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области легкой цепи

h67VL3 гуманизированного антитела mAb67

<400> 61

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile Ile

20 25 30

Gly Thr Asn Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg

85 90 95

Lys Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 62

<211> 111

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области легкой цепи

h67VL4 гуманизированного антитела mAb67

<400> 62

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile Ile

20 25 30

Gly Thr Asn Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg

85 90 95

Lys Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 63

<211> 111

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области легкой цепи

h67VL5 гуманизированного антитела mAb67

<400> 63

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile Ile

20 25 30

Gly Thr Asn Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg

85 90 95

Lys Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 64

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Мутантная последовательность легкой цепи LCDR2 (D56E)

mAb103

<400> 64

Leu Lys Lys Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Glu

1 5 10

<210> 65

<211> 122

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области тяжелой цепи

h103VH1 гуманизированного антитела mAb103

<400> 65

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Gly Val Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Lys Lys Thr Leu Thr Thr Val Thr Pro Trp Phe Ala Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 66

<211> 122

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области тяжелой цепи

h103VH2 гуманизированного антитела mAb103

<400> 66

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Gly Val Ile Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Lys Lys Thr Leu Thr Thr Val Thr Pro Trp Phe Ala Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 67

<211> 122

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области тяжелой цепи

h103VH3 гуманизированного антитела mAb103

<400> 67

Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Gly Val Ile Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Lys Lys Thr Leu Thr Thr Val Thr Pro Trp Phe Ala Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 68

<211> 122

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области тяжелой цепи

h103VH4 гуманизированного антитела mAb103

<400> 68

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Gly Val Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Ser Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Lys Lys Thr Leu Thr Thr Val Thr Pro Trp Phe Ala Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 69

<211> 115

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области легкой цепи

h103VL1 гуманизированного антитела mAb103

<400> 69

Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr Tyr Thr

20 25 30

Ile Glu Trp His Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met

35 40 45

Glu Leu Lys Lys Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asn

85 90 95

Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

100 105 110

Thr Val Leu

115

<210> 70

<211> 115

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области легкой цепи

h103VL2 гуманизированного антитела mAb103

<400> 70

Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr Tyr Thr

20 25 30

Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met

35 40 45

Glu Leu Lys Lys Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asn

85 90 95

Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

100 105 110

Thr Val Leu

115

<210> 71

<211> 115

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области легкой цепи

h103VL3 гуманизированного антитела mAb103

<400> 71

Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr Tyr Thr

20 25 30

Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg Tyr Val Met

35 40 45

Glu Leu Lys Lys Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asn

85 90 95

Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

100 105 110

Thr Val Leu

115

<210> 72

<211> 115

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области легкой цепи

h103VL4 гуманизированного антитела mAb103

<400> 72

Glu Leu Val Val Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr Tyr Thr

20 25 30

Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg Tyr Val Met

35 40 45

Glu Leu Lys Lys Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asn

85 90 95

Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

100 105 110

Thr Val Leu

115

<210> 73

<211> 115

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области легкой цепи

h103VL5 гуманизированного антитела mAb103

<400> 73

Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr Tyr Thr

20 25 30

Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Pro Pro Arg Tyr Val Met

35 40 45

Glu Leu Lys Lys Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asn

85 90 95

Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

100 105 110

Thr Val Leu

115

<210> 74

<211> 115

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области легкой цепи

h103VL6 гуманизированного антитела mAb103

<400> 74

Glu Leu Val Val Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr Tyr Thr

20 25 30

Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Pro Pro Arg Tyr Val Met

35 40 45

Glu Leu Lys Lys Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asn

85 90 95

Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

100 105 110

Thr Val Leu

115

<210> 75

<211> 115

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области легкой цепи

h103VL7 гуманизированного антитела mAb103

<400> 75

Glu Leu Val Val Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr Tyr Thr

20 25 30

Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Pro Pro Arg Tyr Val Met

35 40 45

Glu Leu Lys Lys Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asn

85 90 95

Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

100 105 110

Thr Val Leu

115

<210> 76

<211> 115

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность вариабельной области легкой цепи

h103VL8 гуманизированного антитела mAb103

<400> 76

Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr Tyr Thr

20 25 30

Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg Tyr Val Met

35 40 45

Glu Leu Lys Lys Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Glu Gly Ile Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asn

85 90 95

Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

100 105 110

Thr Val Leu

115

<210> 77

<211> 330

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Константная область тяжелой цепи IgG1 человека

<400> 77

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 78

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность κ-цепи константной области легкой

цепи человека

<400> 78

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 79

<211> 106

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность λ-цепи константной области легкой

цепи человека

<400> 79

Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

20 25 30

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro

35 40 45

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

50 55 60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

65 70 75 80

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

85 90 95

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100 105

<210> 80

<211> 449

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> цепь

<223> Последовательность тяжелой цепи Hu63-13

<400> 80

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asp Ile Phe Pro Lys Ser Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Arg Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Asn Tyr Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 81

<211> 214

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> цепь

<223> Последовательность легкой цепи Hu63-13

<400> 81

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Asn Ile Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Arg Ser Gly Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 82

<211> 450

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> цепь

<223> Последовательность тяжелой цепи Hu47-14

<400> 82

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Ser Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Gly Asn Tyr Gly Arg Trp Asp Phe Asp Val Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 83

<211> 215

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> цепь

<223> Последовательность легкой цепи Hu47-14

<400> 83

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser Thr Ile Ser Ser Ser

20 25 30

Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Pro Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Tyr Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 84

<211> 447

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> цепь

<223> Последовательность тяжелой цепи Hu67-14

<400> 84

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

His Met Asn Trp Val Lys Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asp Ile Asn Pro Asp Ile Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Asp Phe Asp Ser Phe Ala Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 85

<211> 218

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> цепь

<223> Последовательность легкой цепи Hu67-14

<400> 85

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile Ile

20 25 30

Gly Thr Asn Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg

85 90 95

Lys Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 86

<211> 452

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> цепь

<223> Последовательность тяжелой цепи Hu103-32

<400> 86

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Gly Val Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Ser Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Lys Lys Thr Leu Thr Thr Val Thr Pro Trp Phe Ala Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly Lys

450

<210> 87

<211> 221

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> цепь

<223> Последовательность легкой цепи Hu103-32

<400> 87

Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr Tyr Thr

20 25 30

Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg Tyr Val Met

35 40 45

Glu Leu Lys Lys Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Glu Gly Ile Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asn

85 90 95

Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

100 105 110

Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro

115 120 125

Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu

130 135 140

Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp

145 150 155 160

Gly Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln

165 170 175

Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu

180 185 190

Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly

195 200 205

Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215 220

<210> 88

<211> 450

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> цепь

<223> Последовательность тяжелой цепи антитела Sanofi

<400> 88

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Val Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Arg Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ile Thr Tyr Ala Pro Ser Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala His Tyr Phe Gly Ser Ser Gly Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 89

<211> 214

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> цепь

<223> Последовательность легкой цепи антитела Sanofi

<400> 89

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Phe Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Val

35 40 45

Tyr Asn Thr Arg Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 90

<211> 449

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> цепь

<223> Последовательность тяжелой цепи антитела Lmab

<400> 90

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 91

<211> 213

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> цепь

<223> Последовательность легкой цепи антитела Lmab

<400> 91

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Leu Tyr Arg Ser

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 92

<211> 4

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Тетрапептидный линкер

<400> 92

Gly Gly Phe Gly

1 4

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен конъюгат антитело-лекарственное средство для лечения рака или опухоли. Конъюгат содержит антитело против CEA (раково-эмбриональный антиген) или его антигенсвязывающий фрагмент, конъюгированные с лекарственным средством на основе токсина посредством линкера. Лекарственное средство может представлять собой аналог эксатекана. Изобретение также относится к фармацевтическому применению указанного конъюгата для получения противоракового лекарственного средства. Изобретение может найти дальнейшее применение в терапии рака. 5 н. и 26 з.п. ф-лы, 6 ил., 27 табл., 15 пр.

1. Конъюгат антитело-лекарственное средство для лечения рака или опухоли, содержащий антитело против CEA (раково-эмбриональный антиген) или его антигенсвязывающий фрагмент, конъюгированные с лекарственным средством на основе токсина посредством линкера, где антитело против CEA или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи антитела, где

вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, представленные в SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 23 соответственно, и вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, представленные в SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26 соответственно; или вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, представленные в SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 47 и SEQ ID NO: 23 соответственно, и вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, представленные в SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26 соответственно.

2. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 1, где антитело против CEA представляет собой мышиное антитело, химерное антитело или гуманизированное антитело.

3. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 1 или 2, где антитело против CEA или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где

вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 9; и вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 10.

4. Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 1-3, где антитело против CEA или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где

вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 48, 49, 50, 51 или 52, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с любой из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 48, 49, 50, 51 или 52; и вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 53, 54 или 55, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с любой из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 53, 54 или 55.

5. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 1, где антитело против CEA или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 52, и вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 53.

6. Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 1-5, где антитело против CEA представляет собой гуманизированное антитело, содержащее каркасную область, полученную из человеческого антитела или его варианта каркасной области, и вариант каркасной области имеет обратные мутации до 10 аминокислот в каркасной области легкой цепи и каркасной области тяжелой цепи человеческого антитела.

7. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 6, где каркасная область вариабельной области легкой цепи содержит одну или более аминокислотных обратных мутаций, выбранных из группы, состоящей из 2V, 42G, 44V и 71Y, и каркасная область вариабельной области тяжелой цепи содержит одну или более аминокислотных обратных мутаций, выбранных из группы, состоящей из 48I, 66K, 67A, 69L, 71V, 73K, 82F и 82A R;

где сайты обратных мутаций пронумерованы по схеме нумерации Кабата.

8. Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 1-7, где антитело против CEA или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи и константную область легкой цепи антитела; константная область тяжелой цепи выбрана из группы, состоящей из константных областей IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 человека и их обычных вариантов, и константная область легкой цепи выбрана из группы, состоящей из константных областей κ и λ цепи человеческого антитела и их обычных вариантов.

9. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 8, где антитело против CEA содержит константную область тяжелой цепи, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 77, и константную область легкой цепи, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 78 или SEQ ID NO: 79.

10. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 1, где антитело против CEA содержит тяжелую цепь, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 80, или последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с ней, и легкую цепь, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 81, или последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с ней.

11. Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 1-10, который представляет собой конъюгат антитело-лекарственное средство общей формулы (Pc-L-Y-D)

,

где Y выбран из группы, состоящей из -O-(CR^aR^b)_m-CR¹R²-C(O)-, -O-CR¹R²-(CR^aR^b)_m-, -O-CR¹R²-, -NH-(CR^aR^b)_m-CR¹R²-C(O)- и -S-(CR^aR^b)_m-CR¹R²-C(O)-;

R^a и R^b являются идентичными или различными и каждый независимо выбран из группы, состоящей из водорода, дейтерия, галогена, алкила, галогеналкила, дейтерированного алкила, алкокси, гидрокси, амино, циано, нитро, гидроксиалкила, циклоалкила и гетероциклила; или R^a и R^b вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют циклоалкил и гетероциклил;

R¹ выбран из группы, состоящей из галогена, галогеналкила, дейтерированного алкила, циклоалкила, циклоалкилалкила, алкоксиалкила, гетероциклила, арила и гетероарила; R² выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, галогеналкила, дейтерированного алкила, циклоалкила, циклоалкилалкила, алкоксиалкила, гетероциклила, арила и гетероарила; или R¹ и R² вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют циклоалкил или гетероциклил;

или R^a и R² вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют циклоалкил или гетероциклил;

m представляет собой целое число от 0 до 4;

n представляет собой десятичное или целое число от 1 до 10;

L представляет собой линкерный фрагмент;

Pc представляет собой антитело против CEA или его антигенсвязывающий фрагмент, как определено в любом из пп. 1-7.

12. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 11, где n представляет собой целое или десятичное число от 2 до 8.

13. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 11, где n представляет собой целое или десятичное число от 4 до 6.

14. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 11, где

Y представляет собой -O-(CR^aR^b)_m-CR¹R²-C(O)-;

R^a и R^b являются идентичными или различными и каждый независимо выбран из группы, состоящей из водорода, дейтерия, галогена и алкила;

R¹ представляет собой галогеналкил или C_3–6 циклоалкил;

R² выбран из группы, состоящей из водорода, галогеналкила и C_3–6 циклоалкила;

или R¹ и R² вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют C_3–6 циклоалкил;

m представляет собой 0 или 1.

15. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 14, где Y выбран из группы, состоящей из:

, , , , , и;

где O-конец Y соединен с линкерным фрагментом L.

16. Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 11-15, где конъюгат антитело-лекарственное средство представляет собой конъюгат антитело-лекарственное средство общей формулы (Pc-L-D)

,

где L представляет собой линкерный фрагмент;

Pc представляет собой антитело против CEA или его антигенсвязывающий фрагмент;

n представляет собой десятичное или целое число от 1 до 10.

17. Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 11-16, где линкерный фрагмент -L- представляет собой -L¹-L²-L³-L⁴-, где

L¹ выбран из группы, состоящей из -(сукцинимидил-3-ил-N)-W-C(O)-, -CH₂-C(O)-NR³-W-C(O)- и -C(O)-W-C(O)-, где W выбран из группы, состоящей из C_1–8 алкила, C_1–8 алкил-циклоалкила и линейного гетероалкила, содержащего от 1 до 8 атомов, и гетероалкил содержит от 1 до 3 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, O и S, где C_1–8 алкил, C_1–8 алкил-циклоалкил и линейный гетероалкил, содержащий от 1 до 8 атомов, каждый независимо необязательно дополнительно замещен одним или более заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, гидрокси, циано, амино, алкила, хлоралкила, дейтерированного алкила, алкокси и циклоалкила;

L² выбран из группы, состоящей из -NR⁴(CH₂CH₂O)p¹CH₂CH₂C(O)-, -NR⁴(CH₂CH₂O)p¹CH₂C(O)-, -S(CH₂)p¹C(O)- и химической связи, где p¹ представляет собой целое число от 1 до 20;

L³ представляет собой пептидный остаток, состоящий из от 2 до 7 аминокислот, где аминокислоты выбраны из группы, состоящей из аминокислотных остатков, образованных из аминокислот из фенилаланина, глицина, валина, лизина, цитруллина, серина, глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты, и необязательно дополнительно замещены одним или более заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, гидрокси, циано, амино, алкила, хлоралкила, дейтерированного алкила, алкокси и циклоалкила;

L⁴ выбран из группы, состоящей из -NR⁵(CR⁶R⁷)_t-, -C(O)NR⁵-, -C(O)NR⁵(CH₂)_t- и химической связи, где t представляет собой целое число от 1 до 6;

R³, R⁴ и R⁵ являются идентичными или различными и каждый независимо выбран из группы, состоящей из водорода, алкила, галогеналкила, дейтерированного алкила и гидроксиалкила;

R⁶ и R⁷ являются идентичными или различными и каждый независимо выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, алкила, галогеналкила, дейтерированного алкила и гидроксиалкила.

18. Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 11-17, где линкерный фрагмент -L- представляет собой -L¹-L²-L³-L⁴-, где

L¹ представляет собой

и s¹ представляет собой целое число от 2 до 8;

L² представляет собой химическую связь;

L³ представляет собой остаток тетрапептида;

L⁴ представляет собой -NR⁵(CR⁶R⁷)_t-, где R⁵, R⁶ и R⁷ являются идентичными или различными и каждый независимо представляет собой водород или алкил, и t представляет собой 1 или 2;

где L¹-конец присоединен к Pc, а L⁴-конец присоединен к Y.

19. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 18, где L³ представляет собой остаток тетрапептида глицин-глицин-фенилаланин-глицина (GGFG, SEQ ID NO: 92).

20. Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 11-19, где -L- представляет собой

.

21. Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 11-20, который представляет собой конъюгат антитело-лекарственное средство общей формулы (Pc-L_a-Y-D)

,

где W, L², L³, R⁵, R⁶ и R⁷ являются такими, как определено в п. 17;

Pc, n, R¹, R² и m являются такими, как определено в п. 11.

22. Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 11-21, который представляет собой конъюгат антитело-лекарственное средство общей формулы (Pc-L_b-Y-D)

,

где s¹ представляет собой целое число от 2 до 8;

Pc, R¹, R², R⁵-R⁷, m и n являются такими, как определено в п. 21.

23. Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 11-22, который выбран из группы, состоящей из:

,

и

,

где Pc и n являются такими, как определено в п. 11.

24. Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 11-23, который представляет собой следующий:

,

где n представляет собой такой, как определено в п. 11;

Hu63-13 содержит тяжелую цепь, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 80, и легкую цепь, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 81.

25. Способ получения конъюгата антитело-лекарственное средство общей формулы (Pc-L_a-Y-D), включающий следующую стадию:

подвергание реакции сочетания восстановленного Pc и соединения общей формулы (L_a-Y-D) с получением соединения общей формулы (Pc-L_a-Y-D);

где Pc представляет собой антитело против CEA или его антигенсвязывающий фрагмент, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи антитела, где вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, представленные в SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 23 соответственно, и вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, представленные в SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26 соответственно; или вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, представленные в SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 47 и SEQ ID NO: 23 соответственно, и вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, представленные в SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26 соответственно;

где W выбран из группы, состоящей из C_1–8 алкила, C_1–8 алкил-циклоалкила и линейного гетероалкила, содержащего от 1 до 8 атомов, и гетероалкил содержит от 1 до 3 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, O и S, где C_1–8 алкил, C_1–8 алкил-циклоалкил и линейный гетероалкил, содержащий от 1 до 8 атомов, каждый независимо необязательно дополнительно замещен одним или более заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, гидрокси, циано, амино, алкила, хлоралкила, дейтерированного алкила, алкокси и циклоалкила;

L² выбран из группы, состоящей из -NR⁴(CH₂CH₂O)p¹CH₂CH₂C(O)-, -NR⁴(CH₂CH₂O)p¹CH₂C(O)-, -S(CH₂)p¹C(O)- и химической связи, где p¹ представляет собой целое число от 1 до 20;

L³ представляет собой пептидный остаток, состоящий из от 2 до 7 аминокислот, где аминокислоты выбраны из группы, состоящей из аминокислотных остатков, образованных из аминокислот из фенилаланина, глицина, валина, лизина, цитруллина, серина, глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты, и необязательно дополнительно замещены одним или более заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, гидрокси, циано, амино, алкила, хлоралкила, дейтерированного алкила, алкокси и циклоалкила;

R¹ выбран из группы, состоящей из галогена, галогеналкила, дейтерированного алкила, циклоалкила, циклоалкилалкила, алкоксиалкила, гетероциклила, арила и гетероарила; R² выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, галогеналкила, дейтерированного алкила, циклоалкила, циклоалкилалкила, алкоксиалкила, гетероциклила, арила и гетероарила; или R¹ и R² вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют циклоалкил или гетероциклил;

R⁴ и R⁵ являются идентичными или различными и каждый независимо выбран из группы, состоящей из водорода, алкила, галогеналкила, дейтерированного алкила и гидроксиалкила;

R⁶ и R⁷ являются идентичными или различными и каждый независимо выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, алкила, галогеналкила, дейтерированного алкила и гидроксиалкила.

26. Фармацевтическая композиция для лечения рака или опухоли, содержащая конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 1-24 и один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов, разбавителей или носителей.

27. Применение конъюгата антитело-лекарственное средство по любому из пп. 1-24 или фармацевтической композиции по п. 26 для получения лекарственного препарата для лечения заболевания или состояния, опосредованного CEA.

28. Применение по п. 27, где заболевание или состояние, опосредованное CEA, представляет собой рак с высокой экспрессией CEA.

29. Применение конъюгата антитело-лекарственное средство по любому из пп. 1-24 или фармацевтической композиции по п. 26 для получения лекарственного препарата для лечения и/или предотвращения опухоли и рака.

30. Применение по п. 29, где опухоль и рак представляют собой плоскоклеточную карциному головы и шеи, рак головы и шеи, рак головного мозга, нейроглиому, мультиформную глиобластому, нейробластому, карциному центральной нервной системы, нейроэндокринную опухоль, рак горла, рак носоглотки, рак пищевода, рак щитовидной железы, злокачественную мезотелиому плевры, рак легкого, рак молочной железы, рак печени, гепатобилиарный рак, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак желудочно-кишечного тракта, рак кишечника, рак толстой кишки, колоректальный рак, рак почки, светлоклеточный рак почки, рак яичников, рак эндометрия, рак шейки матки, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак яичка, рак кожи, меланому, лейкоз, лимфому, рак кости, хондросаркому, миелому, множественную миелому, миелодиспластический синдром, опухоль Крукенберга, миелопролиферативную опухоль, плоскоклеточную карциному, саркому Юинга, системный амилоидоз легкой цепи или карциному из клеток Меркеля.

31. Применение по п. 30, где лимфома выбрана из группы, состоящей из: ходжкинской лимфомы, неходжкинской лимфомы, диффузной В-крупноклеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы, первичной медиастинальной В-крупноклеточной лимфомы, мантийноклеточной лимфомы, малой лимфоцитарной лимфомы, В-крупноклеточной лимфомы, богатой Т-клетками/гистиоцитами, и лимфоплазмоцитарной лимфомы, рак легкого выбран из группы, состоящей из немелкоклеточного рака легкого и мелкоклеточного рака легкого, и лейкоз выбран из группы, состоящей из: хронического миелоидного лейкоза, острого миелоидного лейкоза, лимфоцитарного лейкоза, лимфобластного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза, хронического лимфоцитарного лейкоза и миелоидно-клеточного лейкоза.