КОНЬЮГАТ АНТИТЕЛА К КЛАУДИНУ И ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА И ЕГО ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2024 года по МПК C07K16/28 A61K47/68 A61K39/395 A61K31/4745 A61P35/00 

Настоящая заявка испрашивает приоритет по китайской патентной заявке (заявка № CN201911273041.7), поданной 12 декабря 2019 года, и китайской патентной заявке (заявка № CN202011060513.3), поданной 30 сентября 2020 года.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к конъюгату антитела к клаудину и лекарственного средства и, в частности, к конъюгату антитела к клаудину 18.2 и аналога экзатекана, способу его получения, фармацевтической композиции, содержащей конъюгат антитела и лекарственного средства, и их применению для получения лекарственного препарата для лечения заболевания или состояния, опосредованного клаудином 18.2, в частности, применению для получения противоракового лекарственного препарата.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Изложенное в данном документе представляет собой лишь общую информацию, относящуюся к настоящему изобретению, и совсем не обязательно может представлять собой известный уровень техники.

Клаудин-18 (CLDN18), белок, кодируемый геном клаудина 18 у человека, принадлежит к семейству белков с плотным клеточным соединением и может контролировать прохождение молекул между слоями клеток. Белок клаудин содержит четыре трансмембранные области и две внеклеточные петли в своей структуре, с его N-концом и С-концом в цитоплазме. Существует два сплайс-варианта клаудина-18, клаудин 18.1 и клаудин 18.2, которые отличаются по последовательности на восемь аминокислот в первых внеклеточных петлях. Клаудин 18.1 и клаудин 18.2 отличаются по распределению экспрессии. Клаудин 18.1 селективно экспрессируется в нормальных клетках легких, в то время как экспрессия клаудина 18.2 сильно ограничена в нормальных клетках, но он часто эктопически активируется и сверхэкспрессируется при различных опухолях (например, раке желудка, раке легкого и раке поджелудочной железы). Клаудин 18.2 считается потенциальной терапевтической мишенью при раке желудка и других видах рака, и обнаружение такой мишени также обеспечивает новый вариант для лечения рака желудка.

Конъюгат антитела и лекарственного средства (ADC) связывает моноклональное антитело или фрагмент антитела с биологически активным цитотоксином с помощью стабильного химического линкерного соединения, полностью используя специфичность связывания антитела с поверхностными антигенами нормальных клеток и опухолевых клеток и высокую эффективность цитотоксического вещества, а также устраняя недостаток первого, связанный с тем, что оно имеет низкий терапевтический эффект, и недостаток последнего, связанный с тем, что оно имеет серьезные токсические побочные эффекты, и тому подобное. Это означает, что конъюгат антитела и лекарственного средства может более точно связываться с опухолевыми клетками и оказывает сниженный эффект на нормальные клетки по сравнению с обычными химиотерапевтическими препаратами, известными в прошлом.

В настоящее время некоторые антитела, нацеленные на клаудин 18.2, и лекарственные средства ADC описаны в патентах, таких как WO2020200196A1, WO2016166122 и WO2016165762. Тем не менее, все еще существует необходимость в разработке более эффективных и безопасных конъюгатов антитела к клаудину 18.2 и лекарственного средства для лучшего применения в лечении опухолей, связанных с клаудином 18.2.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к ADC антител к клаудину 18.2 и их применению и обеспечивает лекарственное средство ADC, в котором антитело к клаудину 18.2 или антигенсвязывающий фрагмент конъюгированы с аналогом экзатекана, цитотоксическим веществом.

Соответственно, настоящее изобретение предназначено для обеспечения конъюгата лиганда и лекарственного средства общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли:

где:

Y выбран из группы, состоящей из -O-(CR^aR^b)_m-CR¹R²-C(O)-, -O-CR¹R²-(CR^aR^b)_m-, -O-CR¹R²-, -NH-(CR^aR^b)_m-CR¹R²-C(O)- и -S-(CR^aR^b)_m-CR¹R²-C(O)-;

R^a и R^b являются идентичными или различными и каждый независимо выбран из группы, состоящей из водорода, дейтерия, галогена, алкила, галогеналкила, дейтерированного алкила, алкокси, гидрокси, амино, циано, нитро, гидроксиалкила, циклоалкила и гетероциклила; или R^a и R^b вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют циклоалкил или гетероциклил;

R¹ выбран из группы, состоящей из галогена, галогеналкила, дейтерированного алкила, циклоалкила, циклоалкилалкила, алкоксиалкила, гетероциклила, арила и гетероарила; R² выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, галогеналкила, дейтерированного алкила, циклоалкила, циклоалкилалкила, алкоксиалкила, гетероциклила, арила и гетероарила; или R¹ и R² вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют циклоалкил или гетероциклил;

или R^a и R² вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют циклоалкил или гетероциклил;

m представляет собой целое число от 0 до 4;

n представляет собой десятичное или целое число от 1 до 10;

L представляет собой линкерное звено;

Pc представляет собой антитело к клаудину 18.2 или его антигенсвязывающий фрагмент.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в конъюгате лиганда и лекарственного средства общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления антитело к клаудину 18.2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где:

i) вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR (определяющая комплементарность область тяжелой цепи) 1, HCDR2 и HCDR3, имеющие последовательности, идентичные последовательностям HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи, указанной в SEQ ID NO: 3, и вариабельная область легкой цепи содержит LCDR (определяющая комплементарность область легкой цепи) 1, LCDR2 и LCDR3, имеющие последовательности, идентичные последовательностям LCDR1, LCDR2 и LCDR3 вариабельной области легкой цепи, указанной в SEQ ID NO: 4; или

ii) вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие последовательности, идентичные последовательностям HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи, указанной в SEQ ID NO: 5, и вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие последовательности, идентичные последовательностям LCDR1, LCDR2 и LCDR3 вариабельной области легкой цепи, указанной в SEQ ID NO: 6.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в конъюгате лиганда и лекарственного средства общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления антитело к клаудину 18.2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где:

iii) вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11, соответственно, и вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14, соответственно; или

iv) вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17, соответственно, и вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20, соответственно.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в конъюгате лиганда и лекарственного средства общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления антитело к клаудину 18.2 представляет собой мышиное антитело, химерное антитело или гуманизированное антитело.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в конъюгате лиганда и лекарственного средства общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления антитело к клаудину 18.2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где:

(1) вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 3 или имеющую по меньшей мере 90% идентичность с ней, и вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 4 или имеющую по меньшей мере 90% идентичность с ней;

(2) вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 24 или имеющую по меньшей мере 90% идентичность с ней, и вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 21 или имеющую по меньшей мере 90% идентичность с ней;

(3) вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 5 или имеющую по меньшей мере 90% идентичность с ней, и вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 6 или имеющую по меньшей мере 90% идентичность с ней; или

(4) вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 31 или имеющую по меньшей мере 90% идентичность с ней, и вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 28 или имеющую по меньшей мере 90% идентичность с ней.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в конъюгате лиганда и лекарственного средства общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления изобретения антитело к клаудину 18.2 представляет собой гуманизированное антитело, содержащее каркасную область, полученную из человеческого антитела, или вариант его каркасной области, причем указанный вариант каркасной области имеет обратные мутации вплоть до 10 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) аминокислот в каркасной области легкой цепи и/или каркасной области тяжелой цепи человеческого антитела;

предпочтительно вариант каркасной области содержит мутации, выбранные из (a) или (b):

(a) одна или более обратных мутаций аминокислот необязательно выбраны из группы, состоящей из 22S, 85I и 87H, содержащихся в вариабельной области легкой цепи; и/или одна или более обратных мутаций аминокислот необязательно выбраны из группы, состоящей из 48I, 82T и 69M, содержащихся в вариабельной области тяжелой цепи; или

(b) одна или более обратных мутаций аминокислот необязательно выбраны из группы, состоящей из 4L и 22S, содержащихся в вариабельной области легкой цепи; и/или одна или более обратных мутаций аминокислот необязательно выбраны из группы, состоящей из 38K, 40R, 48I, 66K, 67A, 69L, 71L и 73K, содержащихся в вариабельной области тяжелой цепи;

предпочтительно вариант каркасной области содержит мутации, выбранные из группы, состоящей из:

(a-1) обратных мутаций аминокислот 22S, 85I и 87H, содержащихся в вариабельной области легкой цепи, и обратных мутаций аминокислот 48I и 82T, содержащихся в вариабельной области тяжелой цепи; или

(b-1) обратной мутации аминокислоты, выбранной из 4L, содержащейся в вариабельной области легкой цепи.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в конъюгате лиганда и лекарственного средства общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления антитело к клаудину 18.2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, показанные ниже:

(vii) вариабельная область тяжелой цепи, имеющая последовательность, указанную в SEQ ID NO: 3, и вариабельная область легкой цепи, имеющая последовательность, указанную в SEQ ID NO: 4;

(viii) вариабельная область тяжелой цепи, имеющая последовательность, указанную в SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 или SEQ ID NO: 27, и вариабельная область легкой цепи, имеющая последовательность, указанную в SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 23;

(ix) вариабельная область тяжелой цепи, имеющая последовательность, указанную в SEQ ID NO: 5, и вариабельная область легкой цепи, имеющая последовательность, указазнную в SEQ ID NO: 6; или

(x) вариабельная область тяжелой цепи, имеющая последовательность, указанную в SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 или SEQ ID NO: 34, и вариабельная область легкой цепи, имеющая последовательность, указанную в SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30;

предпочтительно антитело к клаудину 18.2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, показанные ниже:

(xi) вариабельная область тяжелой цепи, имеющая последовательность, указанную в SEQ ID NO: 31, и вариабельная область легкой цепи, имеющая последовательность, указанную в SEQ ID NO: 29; или

(xii) вариабельная область тяжелой цепи, имеющая последовательность, указанную в SEQ ID NO: 26, и вариабельная область легкой цепи, имеющая последовательность, указанную в SEQ ID NO: 23.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в конъюгате лиганда и лекарственного средства общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления изобретения антитело к клаудину 18.2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи и константную область легкой цепи антитела; предпочтительно константная область тяжелой цепи выбрана из группы, состоящей из константных областей IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 человека и их обычных вариантов, и константная область легкой цепи выбрана из группы, состоящей из константных областей κ и λ цепи человеческого антитела и их обычных вариантов; более предпочтительно антитело содержит константную область тяжелой цепи, имеющую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 7, и константную область легкой цепи, имеющую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 8; наиболее предпочтительно антитело содержит: тяжелую цепь, имеющую по меньшей мере 90% идентичность с тяжелой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 35 или SEQ ID NO: 42, и легкую цепь, имеющую по меньшей мере 90% идентичность с легкой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 36 или SEQ ID NO: 39; или

тяжелую цепь, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с тяжелой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 37 или SEQ ID NO: 49, и легкую цепь, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с легкой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 38 или SEQ ID NO: 46.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в конъюгате лиганда и лекарственного средства общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления антитело к клаудину 18.2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(c) тяжелую цепь, имеющую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 35, и легкую цепь, имеющую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 36;

(d) тяжелую цепь, имеющую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44 или SEQ ID NO: 45, и легкую цепь, имеющую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 или SEQ ID NO: 41;

(е) тяжелую цепь, имеющую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 37, и легкую цепь, имеющую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 38; или

(f) тяжелую цепь, имеющую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 или SEQ ID NO: 52, и легкую цепь, имеющую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 или SEQ ID NO: 48.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в конъюгате лиганда и лекарственного средства общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления антитело к клаудину 18.2 выбрано из группы, состоящей из:

h1901-11, содержащего тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 44, и легкую цепь, имеющую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 41; и

h1902-5, содержащего тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 49, и легкую цепь, имеющую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 47.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab')2, одноцепочечного антитела (scFv), димеризованной V-области (диатела) и дисульфид-стабилизированной V-области (dsFv).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в конъюгате лиганда и лекарственного средства общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления изобретения n может представлять собой целое или десятичное число от 1 до 10, и n может быть средним 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. n представляет собой десятичное или целое число от 2 до 8, предпочтительно десятичное или целое число от 3 до 8, более предпочтительно десятичное или целое число от 5 до 9 или предпочтительно десятичное или целое число от 2 до 7. В некоторых вариантах осуществления изобретения n представляет собой десятичное или целое число от 3,5 до 4,5.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в конъюгате лиганда и лекарственного средства общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления изобретения

Y представляет собой -O-(CR^aR^b)_m-CR¹R²-C(O)-;

R^a и R^b являются идентичными или различными и каждый независимо выбран из группы, состоящей из водорода, дейтерия, галогена и алкила;

R¹ представляет собой галогеналкил или C₃-₆ циклоалкил;

R² выбран из группы, состоящей из водорода, галогеналкила и C₃-₆ циклоалкила;

или R¹ и R² вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют C₃-₆ циклоалкил;

m представляет собой 0 или 1.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в конъюгате лиганда и лекарственного средства общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления Y выбран из группы, состоящей из:

и ;

где О-конец Y присоединен к линкерному звену L.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложен конъюгат лиганда и лекарственного средства общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, где линкерное звено -L- представляет собой -L¹-L²-L³-L⁴-.

В некоторых вариантах осуществления изобретения L¹ выбран из группы, состоящей из -(сукцинимидил-3-ил-N)-W-C(O)-, -CH₂-C(O)-NR³-W-C(O)- и -C(O)-W-C(O)-, где W выбран из группы, состоящей из C₁-₈ алкила, C₁-₈ алкил-C_3-6 циклоалкила и линейного гетероалкила, имеющего от 1 до 8 атомов цепи, причем указанный гетероалкил содержит от 1 до 3 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, O и S, где указанный C₁-₈ алкил, C₁-₈ алкил-C_3-6 циклоалкил или линейный гетероалкил, имеющий от 1 до 8 атомов цепи, независимо необязательно дополнительно замещен одним или более заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, гидрокси, циано, амино, алкила, хлоралкила, дейтерированного алкила, алкокси и циклоалкила.

В некоторых вариантах осуществления изобретения L² выбран из группы, состоящей из -NR⁴(CH₂CH₂O)p¹CH₂CH₂C(O)-, -NR⁴(CH₂CH₂O)p¹CH₂C(O)-, -S(CH₂)p¹C(O)- и химической связи, где p¹ представляет собой целое число от 1 до 20.

В некоторых вариантах осуществления изобретения L³ представляет собой пептидный остаток, состоящий из 2-7 аминокислот, где аминокислоты выбраны из группы, состоящей из аминокислотных остатков, образованных из аминокислот из фенилаланина, глицина, валина, лизина, цитруллина, серина, глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты, и необязательно дополнительно замещены одним или более заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, гидрокси, циано, амино, алкила, хлоралкила, дейтерированного алкила, алкокси и циклоалкила.

В некоторых вариантах осуществления изобретения L⁴ выбран из группы, состоящей из -NR⁵(CR⁶R⁷)_t-, -C(O)NR⁵-, -C(O)NR⁵(CH₂)_t- и химической связи, где t представляет собой целое число от 1 до 6.

В некоторых вариантах осуществления изобретения R³, R⁴ и R⁵ являются идентичными или различными и каждый независимо выбран из группы, состоящей из водорода, алкила, галогеналкила, дейтерированного алкила и гидроксиалкила.

В некоторых вариантах осуществления изобретения R⁶ и R⁷ являются идентичными или различными и каждый независимо выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, алкила, галогеналкила, дейтерированного алкила и гидроксиалкила.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в конъюгате лиганда и лекарственного средства общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли или сольвате согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления изобретения линкерное звено -L- представляет собой -L¹-L²-L³-L⁴-, где

L¹ выбран из группы, состоящей из -(сукцинимидил-3-ил-N)-W-C(O)-, -CH₂-C(O)-NR³-W-C(O)- и -C(O)-W-C(O)-, где W выбран из группы, состоящей из C₁-₈ алкила, C₁-₈ алкил-циклоалкила и линейного гетероалкила, имеющего от 1 до 8 атомов цепи, причем указанный гетероалкил содержит от 1 до 3 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, O и S, где указанный C₁-₈ алкил, циклоалкил или линейный гетероалкил каждый независимо необязательно дополнительно замещен одним или более заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, гидрокси, циано, амино, алкила, хлоралкила, дейтерированного алкила, алкокси и циклоалкила;

L² выбран из группы, состоящей из -NR⁴(CH₂CH₂O)p¹CH₂CH₂C(O)-, -NR⁴(CH₂CH₂O)p¹CH₂C(O)-, -S(CH₂)p¹C(O)- и химической связи, где p¹ представляет собой целое число от 1 до 20;

L³ представляет собой пептидный остаток, состоящий из 2-7 аминокислот, где аминокислоты выбраны из группы, состоящей из аминокислотных остатков, образованных из аминокислот из фенилаланина, глицина, валина, лизина, цитруллина, серина, глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты, и необязательно дополнительно замещены одним или более заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, гидрокси, циано, амино, алкила, хлоралкила, дейтерированного алкила, алкокси и циклоалкила;

L⁴ выбран из группы, состоящей из -NR⁵(CR⁶R⁷)_t-, -C(O)NR⁵-, -C(O)NR⁵(CH₂)_t- и химической связи, где t представляет собой целое число от 1 до 6;

R³, R⁴ и R⁵ являются идентичными или различными и каждый независимо выбран из группы, состоящей из водорода, алкила, галогеналкила, дейтерированного алкила и гидроксиалкила;

R⁶ и R⁷ являются идентичными или различными и каждый независимо выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, алкила, галогеналкила, дейтерированного алкила и гидроксиалкила.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в конъюгате лиганда и лекарственного средства общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления изобретения линкерное звено -L- представляет собой -L¹-L²-L³-L⁴-, где

L¹ представляет собой , и s¹ представляет собой целое число от 2 до 8;

L² представляет собой химическую связь;

L³ представляет собой тетрапептидный остаток, предпочтительно тетрапептидный остаток GGFG (SEQ ID NO: 55);

L⁴ представляет собой -NR⁵(CR⁶R⁷)t-, где R⁵, R⁶ и R⁷ являются идентичными или различными и каждый независимо представляет собой водород или алкил, и t представляет собой 1 или 2;

причем L¹-конец присоединен к Pc, а L⁴-конец присоединен к Y.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в конъюгате лиганда и лекарственного средства общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления изобретения -L- представляет собой:

.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в конъюгате лиганда и лекарственного средства общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления -L-Y- необязательно выбран из группы, состоящей из:

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения конъюгат лиганда и лекарственного средства общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемая соль согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления изобретения представляет собой конъюгат лиганда и лекарственного средства общей формулы (Pc-L_a-Y-D) или его фармацевтически приемлемую соль,

где:

W, L², L³, R⁵, R⁶ и R⁷ являются такими, как определено в вышеупомянутом линкерном звене -L-;

Pc, n, R¹, R² и m являются такими, как определено в общей формуле (Pc-L-Y-D).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения конъюгат лиганда и лекарственного средства общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемая соль согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления изобретения представляет собой конъюгат лиганда и лекарственного средства общей формулы (Pc-L_b-Y-D) или его фармацевтически приемлемую соль,

где:

s¹ представляет собой целое число от 2 до 8;

Pc, R¹, R², R⁵-R⁷, m и n являются такими, как определено в общей формуле (Pc-L_a-Y-D).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в конъюгате лиганда и лекарственного средства общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления конъюгат лиганда и лекарственного средства выбран из группы, состоящей из:

где Pc и n являются такими, как определено в общей формуле (Pc-L-Y-D).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложен конъюгат лиганда и лекарственного средства общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемая соль, где конъюгат лиганда и лекарственного средства выбран из группы, состоящей из:

и

,

где n является таким, как определено в общей формуле (Pc-L-Y-D), и антитела h1902-5 и h1901-11 являются такими, как определено ранее.

В настоящем изобретении дополнительно предложен способ получения конъюгата лиганда и лекарственного средства общей формулы (Pc-L_a-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли, включающий следующие стадии:

подвергание реакции сочетания Pc' и соединения общей формулы (L_a-Y-D) с получением соединения общей формулы (Pc-L_a-Y-D);

где:

Pc представляет собой антитело к клаудину 18.2 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный выше, и Pc' получен путем восстановления Pc;

W, L², L³, R¹, R², R⁵-R⁷, m и n являются такими, как определено в общей формуле (Pc-L_a-Y-D).

В настоящем изобретении дополнительно предложен способ получения конъюгата антитела и лекарственного средства общей формулы (Pc-L'-D), включающий следующую стадию:

подвергание реакции сочетания восстановленного Pc и общей формулы (L'-D) с получением соединения, где:

Pc представляет собой антитело к клаудину 18.2 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный выше;

n является таким, как определено в общей формуле (Pc-L-Y-D).

В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей конъюгат лиганда и лекарственного средства или его фармацевтически приемлемую соль согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления изобретения и один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов, разбавителей или носителей.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению конъюгата лиганда и лекарственного средства или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления или фармацевтической композиции, содержащей их, в качестве лекарственного препарата. В некоторых вариантах осуществления изобретения лекарственный препарат предназначен для лечения заболевания или состояния, опосредованного клаудином 18.2; указанное заболевание или состояние, опосредованное клаудином 18.2, предпочтительно представляет собой рак с высокой экспрессией клаудина 18.2. В некоторых вариантах осуществления изобретения лекарственный препарат предназначен для лечения рака. В некоторых вариантах осуществления изобретения рак предпочтительно представляет собой плоскоклеточную карциному головы и шеи, рак головы и шеи, рак головного мозга, нейроглиому, мультиформную глиобластому, нейробластому, карциному центральной нервной системы, нейроэндокринную опухоль, рак горла, рак носоглотки, рак пищевода, рак щитовидной железы, злокачественную мезотелиому плевры, рак легкого, рак молочной железы, рак печени, гепатобилиарный рак, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак желудочно-кишечного тракта, рак кишечника, рак толстой кишки, колоректальный рак, рак почки, светлоклеточную почечно-клеточную карциному, рак яичников, рак эндометрия, рак шейки матки, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак яичка, рак кожи, меланому, лейкоз, лимфому, рак кости, хондросаркому, миелому, множественную миелому, миелодиспластический синдром, опухоль Крукенберга, миелопролиферативную опухоль, плоскоклеточную карцинома, саркому Юинга, системный амилоидоз легкой цепи или карциному из клеток Меркеля; более предпочтительно лимфома выбрана из группы, состоящей из ходжкинской лимфомы, неходжкинской лимфомы, диффузной В-крупноклеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы, первичной медиастинальной В-крупноклеточной лимфомы, мантийноклеточной лимфомы, малой лимфоцитарной лимфомы, В-крупноклеточной лимфомы, богатой Т-клетками/гистиоцитами, и лимфоплазмоцитарной лимфомы, рак легкого выбран из группы, состоящей из немелкоклеточного рака легкого и мелкоклеточного рака легкого, и лейкоз выбран из группы, состоящей из хронического миелоидного лейкоза, острого миелоидного лейкоза, лимфоцитарного лейкоза, лимфобластного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза, хронического лимфоцитарного лейкоза и миелоидно-клеточного лейкоза.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению конъюгата лиганда и лекарственного средства или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления изобретения или фармацевтической композиции, содержащей их, для получения лекарственного препарата для лечения заболевания или состояния, опосредованного клаудином 18.2, где заболевание или состояние, опосредованное клаудином 18.2, представляет собой рак с высокой экспрессией клаудина 18.2. В некоторых вариантах осуществления изобретения заболевание предпочтительно представляет собой плоскоклеточную карциному головы и шеи, рак головы и шеи, рак головного мозга, нейроглиому, мультиформную глиобластому, нейробластому, карциному центральной нервной системы, нейроэндокринную опухоль, рак горла, рак носоглотки, рак пищевода, рак щитовидной железы, злокачественную мезотелиому плевры, рак легкого, рак молочной железы, рак печени, гепатобилиарный рак, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак желудочно-кишечного тракта, рак кишечника, рак толстой кишки, колоректальный рак, рак почки, светлоклеточную почечно-клеточную карциному, рак яичников, рак эндометрия, рак шейки матки, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак яичка, рак кожи, меланому, лейкоз, лимфому, рак кости, хондросаркому, миелому, множественную миелому, миелодиспластический синдром, опухоль Крукенберга, миелопролиферативную опухоль, плоскоклеточную карциному, саркому Юинга, системный амилоидоз легкой цепи или карциному из клеток Меркеля; более предпочтительно лимфома выбрана из группы, состоящей из ходжкинской лимфомы, неходжкинской лимфомы, диффузной В-крупноклеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы, первичной медиастинальной В-крупноклеточной лимфомы, мантийноклеточной лимфомы, малой лимфоцитарной лимфомы, В-крупноклеточной лимфомы, богатой Т-клетками/гистиоцитами, и лимфоплазмоцитарной лимфомы, рак легкого выбран из группы, состоящей из немелкоклеточного рака легкого и мелкоклеточного рака легкого, и лейкоз выбран из группы, состоящей из хронического миелоидного лейкоза, острого миелоидного лейкоза, лимфоцитарного лейкоза, лимфобластного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза, хронического лимфоцитарного лейкоза и миелоидно-клеточного лейкоза.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению конъюгата лиганда и лекарственного средства или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления изобретения или фармацевтической композиции, содержащей их, для получения лекарственного препарата для лечения или предотвращения опухоли, где опухоль и рак предпочтительно представляет собой плоскоклеточную карциному головы и шеи, рак головы и шеи, рак головного мозга, нейроглиому, мультиформную глиобластому, нейробластому, карциному центральной нервной системы, нейроэндокринную опухоль, рак горла, рак носоглотки, рак пищевода, рак щитовидной железы, злокачественную мезотелиому плевры, рак легкого, рак молочной железы, рак печени, гепатобилиарный рак, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак желудочно-кишечного тракта, рак кишечника, рак толстой кишки, колоректальный рак, рак почки, светлоклеточную почечно-клеточную карциному, рак яичников, рак эндометрия, рак шейки матки, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак яичка, рак кожи, меланому, лейкоз, лимфому, рак кости, хондросаркому, миелому, множественную миелому, миелодиспластический синдром, опухоль Крукенберга, миелопролиферативную опухоль, плоскоклеточную карциному, саркому Юинга, системный амилоидоз легкой цепи или карциному из клеток Меркеля; более предпочтительно лимфома выбрана из группы, состоящей из ходжкинской лимфомы, неходжкинской лимфомы, диффузной В-крупноклеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы, первичной медиастинальной В-крупноклеточной лимфомы, мантийноклеточной лимфомы, малой лимфоцитарной лимфомы, В-крупноклеточной лимфомы, богатой Т-клетками/гистиоцитами, и лимфоплазмоцитарной лимфомы, рак легкого выбран из группы, состоящей из немелкоклеточного рака легкого и мелкоклеточного рака легкого, и лейкоз выбран из группы, состоящей из хронического миелоидного лейкоза, острого миелоидного лейкоза, лимфоцитарного лейкоза, лимфобластного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза, хронического лимфоцитарного лейкоза и миелоидно-клеточного лейкоза.

В другом аспекте настоящее изобретение также относится к способу лечения и/или предотвращения опухоли, включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически или профилактически эффективной дозы конъюгата лиганда и лекарственного средства или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления изобретения или фармацевтической композиции, содержащей их, где опухоль предпочтительно представляет собой рак, связанный с высокой экспрессией клаудина 18.2.

В другом аспекте настоящее изобретение также относится к способу лечения или предотвращения рака, включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически или профилактически эффективной дозы конъюгата лиганда и лекарственного средства или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления изобретения или фармацевтической композиции, содержащей их, где опухоль и рак предпочтительно представляет собой плоскоклеточную карциному головы и шеи, рак головы и шеи, рак головного мозга, нейроглиому, мультиформную глиобластому, нейробластому, карциному центральной нервной системы, нейроэндокринную опухоль, рак горла, рак носоглотки, рак пищевода, рак щитовидной железы, злокачественную мезотелиому плевры, рак легкого, рак молочной железы, рак печени, гепатобилиарный рак, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак желудочно-кишечного тракта, рак кишечника, рак толстой кишки, колоректальный рак, рак почки, светлоклеточную почечно-клеточную карциному, рак яичников, рак эндометрия, рак шейки матки, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак яичка, рак кожи, меланому, лейкоз, лимфому, рак кости, хондросаркому, миелому, множественную миелому, миелодиспластический синдром, опухоль Крукенберга, миелопролиферативную опухоль, плоскоклеточную карцинома, саркому Юинга, системный амилоидоз легкой цепи или карциному из клеток Меркеля; более предпочтительно лимфома выбрана из группы, состоящей из ходжкинской лимфомы, неходжкинской лимфомы, диффузной В-крупноклеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы, первичной медиастинальной В-крупноклеточной лимфомы, мантийноклеточной лимфомы, малой лимфоцитарной лимфомы, В-крупноклеточной лимфомы, богатой Т-клетками/гистиоцитами, и лимфоплазмоцитарной лимфомы, рак легкого выбран из группы, состоящей из немелкоклеточного рака легкого и мелкоклеточного рака легкого, и лейкоз выбран из группы, состоящей из хронического миелоидного лейкоза, острого миелоидного лейкоза, лимфоцитарного лейкоза, лимфобластного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза, хронического лимфоцитарного лейкоза и миелоидно-клеточного лейкоза.

Активное соединение (например, конъюгат лиганда и лекарственного средства или его фармацевтически приемлемая соль в соответствии с настоящим изобретением) может быть составлено в форме, подходящей для введения любым подходящим способом, предпочтительно в форме стандартной дозы или в форме однократной дозы, которую субъект может вводить самостоятельно. Стандартная доза по настоящему изобретению может быть в таблетке, капсуле, крахмальной капсуле, флаконе, порошке, грануле, пастилке, суппозитории, регенерирующем порошке или жидком составе.

Доза введения активного соединения или композиции, используемая в способе лечения по настоящему изобретению, обычно варьируется в зависимости от тяжести заболевания, массы субъекта и эффективности активного соединения. Однако, как правило, подходящая стандартная доза может составлять от 0,1 до 1000 мг.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать, в дополнение к активному соединению, один или более эксципиентов, выбранных из группы, состоящей из наполнителя, разбавителя, связующего вещества, смачивающего агента, разрыхлителя, эксципиента и тому подобного. В зависимости от способа введения композиция может содержать от 0,1 до 99 мас.% активного соединения.

Антитело к клаудину 18.2 и конъюгат антитела и лекарственного средства, предложенные в настоящем изобретении, обладают хорошей аффинностью к антигенам клеточной поверхности, хорошей эффективностью эндоцитоза и высокой эффективностью ингибирования опухоли, а также более широкими окнами применения лекарственного средства, и пригодны для клинического применения лекарственного средства.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг. 1 показаны результаты анализа FACS (метод анализа сортировки клеток с активированной флуоресценцией) связывания гуманизированных антител с клаудином 18.2 человека на клеточном уровне.

На Фиг. 2 показан эндоцитоз гуманизированных антител клетками NUGC4.

На Фиг. 3A-3C показаны анализы антител в отношении эффектов ADCC (антителозависимая клеточная цитотоксичность) в клетках NUGC4 с различными уровнями экспрессии клаудина 18.2. На Фиг. 3A показаны анализы антител в отношении эффектов ADCC в клетках NUGC4 дикого типа (с низкой экспрессией клаудина 18.2); на Фиг. 3B показаны анализы антител в отношении эффектов ADCC в клетках NUGC4 с умеренной экспрессией клаудина 18.2; на Фиг. 3C показаны анализы антител в отношении эффектов ADCC в клетках NUGC4 с высокой экспрессией клаудина 18.2.

На Фиг. 4 показаны результаты ингибирования опухолей с помощью ADC-1 по настоящему изобретению.

На Фиг. 5 показаны результаты ингибирования опухолей с помощью ADC-2 по настоящему изобретению.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Терминология

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют такое же значение, которое обычно подразумевается специалистом в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Хотя любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем документе, также могут быть использованы для осуществления или испытания настоящего изобретения, предпочтительные способы и материалы описаны в настоящем документе. В описании и формуле изобретения по настоящему изобретению следующие термины используются в соответствии с приведенными ниже определениями.

Когда в настоящем описании используется торговое наименование, оно предназначено для включения состава продукта под торговым наименованием и непатентованного лекарственного средства и активных лекарственных компонентов продукта под торговым наименованием.

Если не указано иное, термины, используемые в описании и формуле изобретения, имеют следующие значения.

Термин "лекарственное средство" относится к химическому веществу, которое может изменять или устанавливать физиологию и патологическое состояние организма и может использоваться для предотвращения, диагностики и лечения заболеваний. Лекарственное средство включает цитотоксическое лекарственное средство. Нет четкой границы между лекарственным средством и токсичным веществом. Токсичное вещество относится к химическому веществу, которое оказывает токсический эффект на организмы и может причинить вред здоровью человека даже в небольших дозах. Любое лекарственное средство в больших дозах может вызывать токсические реакции. Цитотоксическое лекарственное средство относится к веществу, которое ингибирует или предотвращает функции клеток и/или вызывает гибель клеток или разрушение клеток. Цитотоксическое лекарственное средство может уничтожать опухолевые клетки в целом при достаточно высокой концентрации; однако из-за отсутствия специфичности цитотоксическое лекарственное средство может вызывать апоптоз нормальных клеток при уничтожении опухолевых клеток, что приводит к серьезным побочным эффектам. Цитотоксическое лекарственное средство включает токсины, такие как низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, радиоизотопы (например, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² и радиоактивные изотопы Lu), токсичные лекарственные средства, химиотерапевтические лекарственные средства, антибиотики и нуклеолитические ферменты.

Термин "линкерное звено", "линкер" или "линкерный фрагмент" относится к химическому структурному фрагменту или связи, которая связана на одном конце с лигандом (например, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом), а на другом конце с лекарственным средством или связана с другими линкерами до того, как быть связанной с лекарственным средством.

Линкер может содержать один или более линкерных компонентов. Иллюстративные линкерные компоненты включают 6-малеимидокапроил ("MC"), малеимидопропионил ("MP"), валин-цитруллин ("val-cit" или "vc"), аланин-фенилаланин ("ala-phe"), п-аминобензилоксикарбонил ("PAB"), N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентаноат ("SPP"), N-сукцинимидил 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1 карбоксилат ("SMCC", также упоминаемый в настоящем документе как "MCC") и N-сукцинимидил(4-иод-ацетил)аминобензоат ("SIAB"). Линкер может содержать растягивающие звенья, спейсерные звенья и аминокислотные звенья и может быть синтезирован с использованием способов, известных в данной области техники, таких как описанные в US2005-0238649A1. Линкер может представлять собой "расщепляемый линкер", благоприятствующий высвобождению лекарственных средств в клетках. Например, могут быть использованы кислотолабильные линкеры (например, гидразоны), чувствительные к протеазе (например, чувствительные к пептидазе) линкеры, фотолабильные линкеры, диметильные линкеры или дисульфидсодержащие линкеры (Chari et al., Cancer Research 52: 127-131(1992); патент США № 5208020).

Сокращения

Линкерные компоненты включают, но не ограничиваются ими:

MC представляет собой 6-малеимидокапроил со структурой:

,

Val-Cit или "vc" представляет собой валин-цитруллин (типовой дипептид в расщепляемом протеазой линкере),

цитруллин представляет собой 2-амино-5-уреидопентановую кислоту,

PAB представляет собой п-аминобензилоксикарбонил (пример "саморасщепляющихся" линкерных компонентов),

Me-Val-Cit представляет собой N-метил-валин-цитруллин (где линкерная пептидная связь была модифицирована для предотвращения ее расщепления катепсином B),

MC(PEG)6-OH представляет собой малеимидокапроил-полиэтиленгликоль (присоединяемый к цистеину антитела),

SPP представляет собой N-сукцинимидил 4-(2-пиридилтио)валерат,

SPDP представляет собой N-сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио)пропионат,

SMCC представляет собой сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат,

IT представляет собой иминотиолан.

Термин "конъюгат лиганда и лекарственного средства" означает, что лиганд связан с биологически активным лекарственным средством посредством линкерного звена. В настоящем описании "конъюгат лиганда и лекарственного средства" предпочтительно представляет собой конъюгат антитела и лекарственного средства (ADC), что означает, что моноклональное антитело или фрагмент антитела связаны с биологически активным токсичным лекарственным средством посредством линкерного звена. Антитело может быть конъюгировано с лекарственным средством непосредственно или через линкер. Среднее количество блоков лекарственного средства, конъюгированных с каждым антителом (среднее значение нагрузки лекарственным средством или нагрузка лекарственным средством, которая может быть выражена в единицах n), может варьироваться, например, от около 0 до около 20 блоков лекарственного средства; в некоторых вариантах осуществления изобретения от 1 до около 10 блоков лекарственного средства и в некоторых вариантах осуществления изобретения от 1 до около 8 блоков лекарственного средства.

Термин "среднее значение нагрузки лекарственным средством" или "нагрузка лекарственным средством" относится к среднему количеству цитотоксического лекарственного средства, нагруженному на лиганд в молекулах конъюгата лиганда и лекарственного средства, и также может быть выражено в терминах соотношения лекарственного средства к антителу. Нагрузка лекарственным средством может составлять от 0 до 12, предпочтительно от 1 до 10 цитотоксических лекарственных средств на лиганд (Pc). В вариантах осуществления настоящего изобретения нагрузка лекарственным средством выражается в единицах n, которые также могут называться значением DAR (соотношение лекарственное средство-антитело) и могут быть ненулевым целым или десятичным числом от 0 до 12, предпочтительно целым или десятичным числом от 1 до 10, более предпочтительно целым или десятичным числом от 2 до 8 и наиболее предпочтительно целым или десятичным числом от 3 до 8. Примерами являются среднее 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. Среднее количество лекарственных средств на молекулу ADC после реакций сочетания может быть охарактеризовано обычными методами, такими как спектроскопия в УФ и видимой области, масс-спектрометрия, анализы ELISA (иммуноферментный анализ) и ВЭЖХ.

Трехбуквенные и однобуквенные коды для аминокислот, используемые в настоящем описании, раскрыты в J. biol. chem, 243, p3558 (1968).

Молекулы клаудина 18 (CLD18) (учетный номер доступа Genbank: сплайс-вариант 1 (CLD18A1): NP_057453, NM016369, и сплайс-вариант 2 (CLD18A2 или клаудин 18.2): NM_001002026, NP_001002026) являются внутренними трансмембранными белками, находящимися в плотных клеточных соединениях эпителия и эндотелия. В плотных клеточных соединениях окклюдины и клаудины являются преобладающими компонентами трансмембранного белка. Из-за сильного свойства межклеточной адгезии клаудинов они создают первичный барьер, который предотвращает и контролирует параклеточный транспорт растворенных веществ и ограничивает боковую диффузию мембранных липидов и белков для поддержания клеточной полярности. В структуре тканей эпителия участвуют белки, превращающиеся в плотные клеточные соединения. Сообщается, что эти белки едва ли могут приблизиться к антителам в хорошо сконструированном эпителии, но становятся открытыми для воздействия в опухолевых клетках.

Термин "антитело" относится к иммуноглобулину, который имеет структуру тетрапептидной цепи, образованную путем соединения между двумя тяжелыми цепями и двумя легкими цепями межцепочечными дисульфидными связями. По отличиям в аминокислотном составе и порядку расположения константных областей тяжелой цепи иммуноглобулины можно разделить на пять классов, иначе называемых изотипами иммуноглобулинов, а именно IgM, IgD, IgG, IgA и IgE, при этом их соответствующими тяжелыми цепями являются μ-цепь, δ-цепь, γ-цепь, α-цепь и ε-цепь соответственно. Ig одного класса может быть разделен на различные подклассы в зависимости от различий в аминокислотном составе шарнирных областей и количества и положения дисульфидных связей тяжелых цепей; например, IgG может быть разделен на IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Легкие цепи классифицируются на κ- или λ-цепи по различиям в константных областях. Каждый из пяти классов Ig может иметь κ-цепь или λ-цепь.

В тяжелых и легких цепях полноразмерных антител последовательности около 110 аминокислот вблизи N-конца значительно варьируются и, таким образом, называются вариабельными областями (Fv-области); остальные аминокислотные последовательности вблизи С-конца являются относительно стабильными и, таким образом, называются константными областями. Вариабельные области включают 3 гипервариабельные области (HVR) и 4 каркасные области (FR) с относительно консервативными последовательностями. Три гипервариабельные области определяют специфичность антитела и, таким образом, также известны как определяющие комплементарность области (CDR). Каждая вариабельная область легкой цепи (LCVR) или вариабельная область тяжелой цепи (HCVR) состоит из 3 CDR и 4 FR, расположенных от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Три CDR легкой цепи обозначаются как LCDR1, LCDR2 и LCDR3, три CDR тяжелой цепи обозначаются как HCDR1, HCDR2 и HCDR3.

Термин "полностью гуманизированное антитело", "полностью человеческое антитело" или "совершенно человеческое антитело", также известное как "полностью гуманизированное моноклональное антитело", имеет как гуманизированную вариабельную область, так и константную область. Развитие моноклональных антител имеет четыре стадии, а именно мышиные моноклональные антитела, химерные моноклональные антитела, гуманизированные моноклональные антитела и полностью гуманизированные моноклональные антитела. Основные подходящие технологии для получения полностью человеческих антител включают: технологию гибридомы человека, технологию EBV (вирус Эпштейна-Барр)-трансформированных В-лимфоцитов, технологию фагового дисплея, технологию получения антител трансгенной мыши, технологию получения единичного В-клеточного антитела и тому подобное.

Термин "антигенсвязывающий фрагмент" относится к одному или более фрагментам антитела, которые сохраняют способность связываться с антигеном. Показано, что фрагмент полноразмерного антитела может быть использован для выполнения антигенсвязывающей функции антитела. Связывающий фрагмент, включенный в "антигенсвязывающий фрагмент", выбран из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab')2, одноцепочечного антитела (scFv), димеризованной V-области (диатела), дисульфид-стабилизированной V-области (dsFv) и антигенсвязывающих фрагментов пептидов, содержащих CDR; примеры включают (i) Fab-фрагменты, моновалентные фрагменты, состоящие из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) F(ab')2-фрагменты, двухвалентные фрагменты, содержащие два Fab-фрагмента, соединенных дисульфидными мостиками в шарнирных областях; (iii) Fd-фрагменты, состоящие из доменов VH и CH1; (iv) Fv-фрагменты, состоящие из доменов VH и VL одного плеча антитела; (v) одиночные домены или dAb-фрагменты (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), состоящие из доменов VH; и (vi) изолированные определяющие комплементарность области (CDR) или (vii) комбинациях двух или более изолированных CDR, которые необязательно могут быть связаны синтетическими линкерами. Кроме того, хотя два домена Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются отдельными генами, они могут быть связаны синтетическим линкером путем рекомбинации, что позволяет ему продуцировать одну белковую цепь, в которой области VL и VH спариваются с образованием моновалентной молекулы (называемой одноцепочечной Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также предназначены для включения в термин "антигенсвязывающий фрагмент" антитела. Такие фрагменты антител получают с использованием общепринятых методик, известных специалистам в данной области техники, и подвергают скринингу на пригодность таким же образом, как и интактные антитела. Антигенсвязывающие части могут быть получены с использованием технологии рекомбинантной ДНК или путем ферментативного или химического расщепления интактных иммуноглобулинов. Антитела могут быть различных изотипов, например, IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 подтипа), IgA1, IgA2, IgD, IgE или IgM антитела.

В целом, Fab представляет собой фрагмент антитела, имеющий молекулярную массу около 50000 и обладающий антигенсвязывающей активностью, среди фрагментов, полученных путем обработки молекулы антитела IgG протеазой папаином (например, расщеплением аминокислотного остатка в положении 224 H-цепи), в котором часть на N-концевой стороне H-цепи объединена с L-цепью дисульфидной связью.

В целом, F(ab')2 представляет собой фрагмент антитела, полученный путем расщепления части ниже дисульфидной связи в шарнирной области IgG ферментом пепсином. Он имеет молекулярную массу около 100000, обладает антигенсвязывающей активностью и содержит две области Fab, связанные в шарнирном положении.

В целом, Fab' представляет собой фрагмент антитела, имеющий молекулярную массу около 50000 и обладающий антигенсвязывающей активностью, полученный путем расщепления дисульфидной связи в шарнирной области F(ab')2, описанного выше.

Кроме того, Fab' может быть получен путем вставки ДНК, кодирующей фрагмент Fab', в прокариотический или эукариотический вектор экспрессии и введения вектора в прокариот или эукариот для экспрессии Fab'.

Термин "одноцепочечное антитело", "одноцепочечный Fv" или "scFv" означает молекулу, содержащую вариабельный домен тяжелой цепи антитела (или VH) и вариабельный домен легкой цепи антитела (или VL), связанные линкером. Такие молекулы scFv имеют общую структуру: NH₂-VL-линкер-VH-COOH или NH₂-VH-линкер-VL-COOH. Подходящие линкеры в предшествующем уровне техники состоят из повторяющихся аминокислотных последовательностей GGGGS или их вариантов, например, от 1 до 4 повторяющихся вариантов (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448). Другие линкеры, которые можно использовать в настоящем изобретении, описаны в Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov et al. (1999) J. Mol. Biol. 293:41-56 и Roovers et al. (2001), Cancer Immunol.

Термин "CDR" относится к одной из 6 гипервариабельных областей в пределах вариабельного домена антитела, которые в основном способствуют связыванию антигена. В целом, существует три CDR (HCDR1, HCDR2 и HCDR3) в каждой вариабельной области тяжелой цепи и три CDR (LCDR1, LCDR2 и LCDR3) в каждой вариабельной области легкой цепи. Границы аминокислотных последовательностей CDR могут быть определены с использованием любой из множества хорошо известных схем. Одно из наиболее распространенных определений для 6 CDR представлено в Kabat E.A. et al., (1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242. В данном контексте определение CDR по Кабату (Kabat) относится только к CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена легкой цепи и к CDR2 и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи. Также включены схема нумерации Чотиа ("Chothia"), схема нумерации "ABM", схема нумерации "contact" (см. Martin, ACR. Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains[J]. 2001), схема нумерации ImMunoGenTics (IMGT) (Lefranc M.P., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77(2003)) и др.

Термин "каркас антитела" относится к части вариабельного домена VL или VH, которая служит каркасом для антигенсвязывающих петель (CDR) вариабельного домена. Это, по существу, представляет собой вариабельный домен без CDR.

Термин "эпитоп" или "антигенная детерминанта" относится к сайту на антигене, с которым связывается иммуноглобулин или антитело. Эпитопы обычно содержат по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 смежных или несмежных аминокислот в уникальной пространственной конформации. См., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular B iology, volume 66, G.E.Morris, Ed. (1996).

Термины "специфическое связывание", "селективное связывание", "селективное связывание с" и "специфическое связывание с" относятся к связыванию антитела с эпитопом на заданном антигене. Как правило, антитело связывается с аффинностью (KD) менее чем около10^-7 M, например, менее чем около 10^-8 M, 10^-9 M или 10^-10 M или менее.

Термин "KD" относится к константе равновесия диссоциации для взаимодействия антитело-антиген. В целом, антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент) по настоящему изобретению связывается с клаудином 18.2 (или его эпитопом) с константой равновесия диссоциации (KD) менее чем около 10^-7 M, например, менее чем около 10^-8 M или 10^-9 M; например, значение KD определяют с использованием метода FACS для аффинности антитела по настоящему изобретению к антигенам клеточной поверхности.

Термин "молекула нуклеиновой кислоты" относится к молекуле ДНК или молекуле РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно представляет собой двухцепочечную ДНК. Нуклеиновая кислота является "функционально связанной", когда она помещена в функциональную связь с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию кодирующей последовательности.

"Идентичность" аминокислотной последовательности относится к проценту аминокислотных остатков, разделяемых первой последовательностью и второй последовательностью, причем при выравнивании аминокислотных последовательностей при необходимости вводятся гэпы для достижения максимального процента идентичности последовательности, и любая консервативная замена не рассматривается как часть идентичности последовательности. С целью определения процента идентичности аминокислотных последовательностей, выравнивание может быть достигнуто различными способами, которые входят в область техники, например, с использованием общедоступного компьютерного программного обеспечения, такого как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN-2 или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области техники могут определить параметры, подходящие для измерения выравнивания, включая любой алгоритм, необходимый для достижения максимального выравнивания всей длины выровненных последовательностей.

Термин "вектор экспрессии" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. В одном варианте осуществления изобретения вектор представляет собой "плазмиду", которая относится к круговой двухцепочечной петле ДНК, в которую могут быть лигированы другие сегменты ДНК. В другом варианте осуществления изобретения вектор представляет собой вирусный вектор, в котором другие сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Векторы, раскрытые в настоящем документе, способны автономно реплицироваться в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальное происхождение репликации, и эписомальные векторы млекопитающих), или способны интегрироваться в геном клетки-хозяина после введения в клетку-хозяина и, таким образом, реплицироваться с геномом хозяина (например, неэписомальные векторы млекопитающих).

Способы получения и очистки антител и антигенсвязывающих фрагментов хорошо известны в данной области техники, например, те, которые описаны в главах 5-8 и 15 публикации Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press. Антигенсвязывающие фрагменты также могут быть получены с использованием общепринятых способов. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, генетически сконструированы таким образом, чтобы содержать одну или более дополнительных FR человека в CDR нечеловеческого происхождения. Последовательности зародышевой линии FR человека можно получить на веб-сайте ImMunoGeneTics(IMGT) http://imgt.cines.fr или в журнале иммуноглобулинов, Lefranc, G., the Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, 2001ISBN012441351, путем выравнивания с базой данных генов вариабельной области зародышевой линии человеческих антител IMGT и программным обеспечением MOE.

Термин "клетка-хозяин" относится к клетке, в которую введен вектор экспрессии. Клетки-хозяева могут включать бактериальные, микробные, растительные или животные клетки. Бактерии, чувствительные к трансформации, включают членов семейства Enterobacteriaceae, таких как штаммы Escherichia coli или Salmonella; членов семейства Bacillaceae, таких как Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus; и Haemophilus influenzae. Подходящие микроорганизмы включают Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris. Подходящие линии клеток-хозяев животных включают CHO (линию клеток яичника китайского хомячка) и клетки NS0.

Сконструированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент в настоящем изобретении можно получить и очистить обычными методами. Например, последовательности кДНК, кодирующие тяжелую и легкую цепи, можно клонировать и рекомбинировать в вектор экспрессии. Векторы экспрессии рекомбинантного иммуноглобулина могут быть стабильно трансфицированы в клетки-хозяева. В качестве более рекомендуемых в предшествующем уровне техники системы экспрессии млекопитающих приведут к гликозилированию антитела, в частности, в N-концевом сайте Fc-области. Положительные клоны размножаются в среде в биореакторе для получения антитела. Культура с секретируемым антителом может быть очищена с использованием обычных методик, например, с использованием колонки A или G Sepharose FF. Неспецифически связанные фракции смывают. Связанное антитело элюируют методом градиента рН, а фрагменты антител детектируют с помощью ДСН-ПААГ-электрофореза (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) и собирают. Антитело можно фильтровать и концентрировать обычными методами. Растворимые смеси и полимеры также можно удалить обычными методами, такими как молекулярные сита и ионный обмен. Полученный продукт должен быть немедленно заморожен, например, при минус 70°C, или лиофилизирован.

Термин "пептид" относится к фрагменту соединения между аминокислотой и белком. Он образуется путем соединения 2 или более аминокислотных молекул пептидными связями и является структурным и функциональным фрагментом белка.

Термин "сахар" относится к биомакромолекулам, состоящим из C, H и O элементов. Их можно разделить на моносахариды, дисахариды, полисахариды и т.д.

Термин "алкил" относится к насыщенной алифатической углеводородной группе, которая представляет собой линейную или разветвленную группу, содержащую от 1 до 20 атомов углерода, предпочтительно алкильную группу, содержащую от 1 до 12 атомов углерода, более предпочтительно алкильную группу, содержащую от 1 до 10 атомов углерода, и наиболее предпочтительно алкильную группу, содержащую от 1 до 6 атомов углерода (содержащую 1, 2, 3, 4, 5 или 6 атомов углерода). Неограничивающие примеры включают метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, трет-бутил, втор-бутил, н-пентил, 1,1-диметилпропил, 1,2-диметилпропил, 2,2-диметилпропил, 1-этилпропил, 2-метилбутил, 3-метилбутил, н-гексил, 1-этил-2-метилпропил, 1,1,2-триметилпропил, 1,1-диметилбутил, 1,2-диметилбутил, 2,2-диметилбутил, 1,3-диметилбутил, 2-этилбутил, 2-метилпентил, 3-метилпентил, 4-метилпентил, 2,3-диметилбутил, н-гептил, 2-метилгексил, 3-метилгексил, 4-метилгексил, 5-метилгексил, 2,3-диметилпентил, 2,4-диметилпентил, 2,2-диметилпентил, 3,3-диметилпентил, 2-этилпентил, 3-этилпентил, н-октил, 2,3-диметилгексил, 2,4-диметилгексил, 2,5-диметилгексил, 2,2-диметилгексил, 3,3-диметилгексил, 4,4-диметилгексил, 2-этилгексил, 3-этилгексил, 4-этилгексил, 2-метил-2-этилпентил, 2-метил-3-этилпентил, н-нонил, 2-метил-2-этилгексил, 2-метил-3-этилгексил, 2,2-диэтилпентил, н-децил, 3,3-диэтилгексил, 2,2-диэтилгексил, их различные изомеры с боковыми цепями и т.д. Более предпочтительным является низший алкил, имеющий от 1 до 6 атомов углерода, и неограничивающие примеры включают метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, трет-бутил, втор-бутил, н-пентил, 1,1-диметилпропил, 1,2-диметилпропил, 2,2-диметилпропил, 1-этилпропил, 2-метилбутил, 3-метилбутил, н-гексил, 1-этил-2-метилпропил, 1,1,2-триметилпропил, 1,1-диметилбутил, 1,2-диметилбутил, 2,2-диметилбутил, 1,3-диметилбутил, 2-этилбутил, 2-метилпентил, 3-метилпентил, 4-метилпентил, 2,3-диметилбутил и т.д. Алкил может быть замещенным или незамещенным. При замещении заместитель может быть замещен в любом доступном месте соединения, где заместитель предпочтительно представляет собой одну или более из следующих групп, независимо выбранных из группы, состоящей из алкила, алкенила, алкинила, алкокси, алкилтио, алкиламино, галогена, меркапто, гидрокси, нитро, циано, циклоалкила, гетероциклоалкила, арила, гетероарила, циклоалкокси, гетероциклоалкокси, циклоалкилтио, гетероциклоалкилтио и оксо.

Термин "гетероалкил" относится к алкильной группе, содержащей один или более гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, O и S, где алкил является таким, как определено выше.

Термин "алкилен" относится к насыщенной линейной или разветвленной алифатической углеводородной группе, имеющей 2 остатка, полученные из исходного алкана путем удаления двух атомов водорода из одного и того же атома углерода или двух разных атомов углерода. Это линейная или разветвленная группа, содержащая от 1 до 20 атомов углерода, предпочтительно алкилен, содержащий от 1 до 12 атомов углерода, более предпочтительно алкилен, содержащий от 1 до 6 атомов углерода (содержащий 1, 2, 3, 4, 5 или 6 атомов углерода). Неограничивающие примеры алкиленовых групп включают, но не ограничиваются ими, метилен (-CH₂-), 1,1-этилиден (-CH(CH₃)-), 1,2-этилиден (-CH₂CH₂)-, 1,1-пропилиден (-CH(CH₂CH₃)-), 1,2-пропилиден (-CH₂CH(CH₃)-), 1,3-пропилиден (-CH₂CH₂CH₂-), 1,4-бутилиден (-CH₂CH₂CH₂CH₂-), 1,5-бутилиден (-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-) и т.д. Алкилен может быть замещенным или незамещенным. При замещении заместитель может быть замещен в любом доступном месте соединения одним или более заместителями, предпочтительно независимо необязательно выбранными из группы, состоящей из алкила, алкенила, алкинила, алкокси, алкилтио, алкиламино, галогена, меркапто, гидрокси, нитро, циано, циклоалкила, гетероциклила, арила, гетероарила, циклоалкокси, гетероциклоалкокси, циклоалкилтио, гетероциклоалкилтио и оксо.

Термин "алкокси" относится к группе -O-(алкил) и -O-(незамещенный циклоалкил), где алкил или циклоалкил является таким, как определено выше. Неограничивающие примеры алкокси включают метокси, этокси, пропокси, бутокси, циклопропилокси, циклобутокси, циклопентилокси и циклогексилокси. Алкокси может быть необязательно замещенным или незамещенным, и когда он замещен, заместитель предпочтительно представляет собой одну или более из следующих групп, независимо выбранных из группы, состоящей из: алкила, алкенила, алкинила, алкокси, алкилтио, алкиламино, галогена, меркапто, гидрокси, нитро, циано, циклоалкила, гетероциклоалкила, арила, гетероарила, циклоалкокси, гетероциклоалкокси, циклоалкилтио и гетероциклоалкилтио.

Термин "циклоалкил" относится к насыщенному или частично ненасыщенному моноциклическому или полициклическому углеводородному заместителю. Циклоалкильное кольцо содержит от 3 до 20 атомов углерода, предпочтительно от 3 до 12 атомов углерода, более предпочтительно от 3 до 10 атомов углерода и наиболее предпочтительно от 3 до 8 атомов углерода (содержащих 3, 4, 5, 6, 7 или 8 атомов углерода). Неограничивающие примеры моноциклического циклоалкила включают циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклопентенил, циклогексил, циклогексенил, циклогексадиенил, циклогептил, циклогептатриенил, циклооктил и т. д. Полициклический циклоалкил включает спироциклоалкил, конденсированный циклоалкил и мостиковый циклоалкил.

Термин "гетероциклил" относится к насыщенному или частично ненасыщенному моноциклическому или полициклическому углеводородному заместителю, содержащему от 3 до 20 кольцевых атомов, где один или более кольцевых атомов представляют собой гетероатомы, выбранные из группы, состоящей из азота, кислорода и S(O)_m (где m представляет собой целое число 0, 1 или 2), за исключением циклической части -O-O-, -O-S- или -S-S-, а остальные кольцевые атомы представляют собой атомы углерода. Он предпочтительно содержит от 3 до 12 кольцевых атомов, из которых от 1 до 4 представляют собой гетероатомы (1, 2, 3 или 4 гетероатома); более предпочтительно циклоалкильное кольцо содержит от 3 до 10 кольцевых атомов (3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 кольцевых атомов). Неограничивающие примеры моноциклического гетероциклила включают пирролидинил, пиперидинил, пиперазинил, морфолинил, тиоморфолинил, гомопиперазинил и т.д. Полициклический гетероциклил включает спирогетероциклил, конденсированный гетероциклил и мостиковый гетероциклил.

Термин "спирогетероциклил" относится к 5-20-членной полициклической гетероциклильной группе, в которой моноциклические кольца имеют общий один атом (называемый спироатомом), где один или более кольцевых атомов представляют собой гетероатомы, выбранные из группы, состоящей из азота, кислорода и S(O)_m (где m представляет собой целое число от 0 до 2), а остальные кольцевые атомы представляют собой атомы углерода. Эти кольца могут содержать одну или более двойных связей, но ни одно из них не имеет полностью сопряженной π-электронной системы. Предпочтительно спирогетероциклил является 6-14-членным и более предпочтительно 7-10-членным. В соответствии с количеством спироатомов, являющихся общими между кольцами, спирогетероциклил может представлять собой моноспирогетероциклил, биспирогетероциклил или полиспирогетероциклил, предпочтительно моноспирогетероциклил и биспирогетероциклил и более предпочтительно 4-членный/4-членный, 4-членный/5-членный, 4-членный/6-членный, 5-членный/5-членный или 5-членный/6-членный моноспирогетероциклил. Неограничивающие примеры спирогетероциклила включают:

и
.

Термин "конденсированный гетероциклил" относится к 5-20-членному полициклическому гетероциклилу, в котором каждое кольцо имеет общую пару соседних атомов с другими кольцами в системе, при этом одно или более колец могут содержать одну или более двойных связей, но ни одно из них не имеет полностью сопряженной π-электронной системы, при этом один или более кольцевых атомов представляют собой гетероатомы, выбранные из группы, состоящей из азота, кислорода или S(O)_m (где m представляет собой целое число 0, 1 или 2), а остальные кольцевые атомы представляют собой атомы углерода. Предпочтительно конденсированный гетероциклил представляет собой 6-14-членное и более предпочтительно 7-10-членное (7-, 8-, 9- или 10-членное кольцо). В соответствии с количеством образованных колец, конденсированный гетероциклил может быть бициклическим, трициклическим, тетрациклическим или полициклическим, предпочтительно бициклическим или трициклическим и более предпочтительно 5-членным/5-членным или 5-членным/6-членным бициклическим конденсированным гетероциклилом. Неограничивающие примеры конденсированного гетероциклила включают:

и .

Термин "мостиковый гетероциклил" относится к 5-14-членному полициклическому гетероциклилу, в котором любые два кольца имеют общих два атома углерода, которые непосредственно не присоединены друг к другу, причем эти кольца могут содержать одну или более двойных связей, но ни одно из них не имеет полностью сопряженной π-электронной системы, причем один или более кольцевых атомов представляют собой гетероатомы, выбранные из группы, состоящей из азота, кислорода и S(O)_m (где m представляет собой целое число 0, 1 или 2), а остальные кольцевые атомы представляют собой атомы углерода. Предпочтительно конденсированный гетероциклил представляет собой 6-14-членное и более предпочтительно 7-10-членное (7-, 8-, 9- или 10-членное кольцо). В соответствии с количеством образованных колец, мостиковый гетероциклил может быть бициклическим, трициклическим, тетрациклическим или полициклическим, предпочтительно бициклическим, трициклическим или тетрациклическим и более предпочтительно бициклическим или трициклическим. Неограничивающие примеры мостикового гетероциклила включают:

и
.

Гетероциклильное кольцо может быть конденсировано с арильным, гетероарильным или циклоалкильным кольцом, причем кольцо, присоединенное к исходной структуре, представляет собой гетероциклил; неограничивающие примеры включают, но не ограничиваются ими:

, и т.д.

Гетероциклил может быть необязательно замещенным или незамещенным, и когда он замещен, заместитель предпочтительно представляет собой одну или более из следующих групп, независимо выбранных из группы, состоящей из: алкила, алкенила, алкинила, алкокси, алкилтио, алкиламино, галогена, меркапто, гидрокси, нитро, циано, циклоалкила, гетероциклоалкила, арила, гетероарила, циклоалкокси, гетероциклоалкокси, циклоалкилтио, гетероциклоалкилтио и оксо.

Термин "арил" относится к 6-14-членной, предпочтительно 6-10-членной (6-, 7-, 8-, 9- или 10-членной), углеродной моноциклической или конденсированной полициклической (т.е., кольца, имеющие общую пару соседних атомов углерода) группе, имеющей сопряженную π-электронную систему, такую как фенил и нафтил, предпочтительно фенил. Арильное кольцо может быть конденсировано с гетероарильным, гетероциклильным или циклоалкильным кольцом, причем кольцо, присоединенное к исходной структуре, представляет собой арильное кольцо; неограничивающие примеры включают, но не ограничиваются ими:

и .

Арил может быть замещенным или незамещенным, и когда он замещен, заместитель предпочтительно представляет собой одну или более из следующих групп, независимо выбранных из группы, состоящей из: алкила, алкенила, алкинила, алкокси, алкилтио, алкиламино, галогена, меркапто, гидрокси, нитро, циано, циклоалкила, гетероциклоалкила, арила, гетероарила, циклоалкокси, гетероциклоалкокси, циклоалкилтио и гетероциклоалкилтио.

Термин "гетероарил" относится к гетероароматической системе, содержащей от 1 до 4 гетероатомов (1, 2, 3 или 4 гетероатома) и от 5 до 14 кольцевых атомов, где гетероатомы выбраны из группы, состоящей из кислорода, серы и азота. Гетероарил предпочтительно представляет собой 5-10-членный (5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-членный гетероарил), более предпочтительно 5- или 6-членный, такой как фуранил, тиенил, пиридинил, пирролил, N-алкилпирролил, пиримидинил, пиразинил, имидазолил и тетразолил. Гетероарильное кольцо может быть конденсировано с арильным, гетероциклильным или циклоалкильным кольцом, причем кольцо, присоединенное к исходной структуре, представляет собой гетероарил; неограничивающие примеры включают, но не ограничиваются ими:

и .

Гетероарил может быть необязательно замещенным или незамещенным, и когда он замещен, заместитель предпочтительно представляет собой одну или более из следующих групп, независимо выбранных из группы, состоящей из: алкила, алкенила, алкинила, алкокси, алкилтио, алкиламино, галогена, меркапто, гидрокси, нитро, циано, циклоалкила, гетероциклоалкила, арила, гетероарила, циклоалкокси, гетероциклоалкокси, циклоалкилтио и гетероциклоалкилтио.

Термин "аминозащитная группа" относится к группе, которая может быть легко удалена и предназначена для защиты аминогруппы от изменения, когда реакция проводится в другом месте молекулы. Неограничивающие примеры включают 9-флуоренилметоксикарбонил, трет-бутоксикарбонил, ацетил, бензил, аллил, п-метоксибензили т.д. Эти группы могут быть необязательно замещены от 1 до 3 заместителей (1, 2 или 3 заместителями), выбранных из группы, состоящей из галогена, алкокси и нитро. Аминозащитная группа предпочтительно представляет собой 9-флуоренилметоксикарбонил.

Термин "галогеналкил" относится к алкильной группе, в которой атомы водорода замещены одним или более галогенами, где алкильная группа является такой, как определено выше.

Термин "дейтерированный алкил" относится к алкильной группе, в которой атомы водорода замещены одним или более атомами дейтерия, где алкильная группа является такой, как определено выше.

Термин "гидроксиалкил" относится к алкильной группе, где водород алкильной группы замещен одной или более гидроксигруппами, где алкил является таким, как определено выше.

Термин "гидрокси" относится к группе -ОН.

Термин "галоген" относится к фтору, хлору, брому или иоду.

Термин "амино" относится к -NH₂.

Термин "нитро" относится к -NO₂.

Термин "циано" относится к -CN.

Термин "ациламино" относится к -C(O)N(алкил) или (циклоалкил), где алкил и циклоалкил являются такими, как определено выше.

Термин "необязательный" или "необязательно" означает, что событие или обстоятельство, описанное впоследствии, может, но не обязательно, иметь место, и что описание включает случаи, когда событие или обстоятельство происходит или не происходит. Например, "гетероциклильная группа, необязательно замещенная алкилом" означает, что алкил может присутствовать, но не обязательно, и что описание включает случаи, когда гетероциклильная группа является или не является замещенной алкилом.

"Замещенный" означает, что один или более, предпочтительно до 5 и более предпочтительно 1, 2 или 3 атома водорода в группе независимо замещены заместителем. Заместитель находится только в своем возможном химическом положении, и специалисты в данной области техники смогут определить (экспериментально или теоретически) возможную или невозможную замену без особых усилий. Например, она может быть нестабильной, когда амино или гидроксигруппа, имеющая свободный водород, связана с атомом углерода, имеющим ненасыщенную (например, олефиновую) связь.

Термин "фармацевтическая композиция" относится к смеси, содержащей одно или более соединений, описанных в настоящем документе, или их физиологически/фармацевтически приемлемую соль или пролекарство и другие химические компоненты, и другие компоненты, например, физиологически/фармацевтически приемлемые носители и эксципиенты. Назначение фармацевтической композиции состоит в том, чтобы способствовать введению в организм, которое облегчает абсорбцию активного ингредиента, тем самым осуществляя биологическую активность.

Термин "фармацевтически приемлемая соль" относится к соли конъюгата лиганда и лекарственного средства по настоящему изобретению или к соли активного соединения по настоящему изобретению. Такие соли являются безопасными и эффективными при использовании у субъектов и обладают требуемой биологической активностью. Конъюгат лиганда-антитела и лекарственного средства по настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну аминогруппу и, таким образом, может образовывать соль с кислотой. Неограничивающие примеры фармацевтически приемлемых солей включают: гидрохлорид, гидробромид, гидроиодат, сульфат, бисульфат, цитрат, ацетат, сукцинат, аскорбат, оксалат, нитрат, сорбат, гидрофосфат, дигидрофосфат, салицилат, гидроцитрат, тартрат, малеат, фумарат, формиат, бензоат, мезилат, этансульфонат, бензолсульфонат и п-толуолсульфонат.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения цитотоксическое лекарственное средство конъюгировано с меркаптогруппой антитела посредством линкерного звена.

Нагрузка конъюгата лиганда и цитотоксического лекарственного средства может контролироваться следующими неограничивающими способами, включая:

(1) контроль молярного соотношения линкерного реагента к моноклональному антителу,

(2) контроль времени и температуры реакции и

(3) выбор различных реагентов.

Для получения обычных фармацевтических композиций делается ссылка на Китайскую фармакопею.

Термин "фармацевтически приемлемый носитель" для лекарственного средства по настоящему изобретению относится к системе, которая может изменять способ попадания лекарственного средства в организм субъекта и распределение лекарственного средства у субъекта, контролировать скорость высвобождения лекарственного средства и доставлять лекарственное средство в орган-мишень. Высвобождение носителя лекарственного средства и система-мишень могут уменьшить деградацию и потерю лекарственного средства, уменьшить побочные эффекты и улучшить биодоступность. Например, полимерные поверхностно-активные вещества, которые могут быть использованы в качестве носителей, могут самостоятельно собираться благодаря своим уникальным амфифильным структурам с образованием различных форм агрегатов, таких как мицеллы, микроэмульсии, гели, жидкие кристаллы и везикулы, в качестве предпочтительных примеров. Агрегаты имеют способность инкапсулировать молекулы лекарственного средства и имеют хорошую проницаемость для мембран, и поэтому могут быть использованы как превосходные носители лекарственого средства.

Термин "эксципиент" представляет собой добавку, помимо активного соединения, к фармацевтической композиции. Он также может называться адъювантом. Например, связующие вещества, наполнители, разрыхлители, смазывающие вещества в таблетках; основная часть в полутвердой мази и кремовых препаратах; консерванты, антиоксиданты, корригенты, ароматизаторы, сорастворители, эмульгаторы, солюбилизаторы, агенты, регулирующие тоничность, красители и тому подобное в жидких составах могут быть названы эксципиентами.

Термин "разбавитель", также называемый наполнителем, используется в первую очередь для увеличения массы и объема таблетки. Добавление разбавителя не только обеспечивает определенный объем, но и уменьшает отклонение дозы основных ингредиентов, а также улучшает способность лекарственного средства к прессованию и тому подобное. Когда лекарственное средство в форме таблетки содержит маслянистые компоненты, в обязательном порядке добавляют абсорбент для абсорбции маслянистых компонентов таким образом, чтобы поддерживать "сухое" состояние и, таким образом, облегчать получение таблетки. Примеры включают крахмал, лактозу, неорганические соли кальция, микрокристаллическую целлюлозу и тому подобное.

Фармацевтическая композиция может иметь форму стерильного водного раствора для инъекций. Доступные и приемлемые носители или растворители включают воду, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Стерильный препарат для инъекций может представлять собой стерильную микроэмульсию масло-в-воде для инъекций, в которой активный ингредиент растворен в масляной фазе. Например, активный ингредиент растворяют в смеси соевого масла и лецитина. Затем масляный раствор добавляют к смеси воды и глицерина и обрабатывают с образованием микроэмульсии. Инъекция или микроэмульсия может быть введена местно в кровоток субъекта в больших количествах. В качестве альтернативы, может быть желательным введение раствора и микроэмульсии таким образом, чтобы поддерживать постоянную циркулирующую концентрацию соединения по настоящему изобретению. Для поддержания такой постоянной концентрации может использоваться устройство для непрерывной внутривенной доставки. Примером такого устройства является насос для внутривенных инъекций Deltec CADD-PLUS. TM. 5400.

Фармацевтическая композиция может быть в форме стерильной водной или масляной суспензии для инъекции для внутримышечного и подкожного введения. Суспензия может быть получена в соответствии с предшествующим уровнем техники с использованием тех подходящих диспергаторов или увлажняющих агентов и суспендирующих агентов, упомянутых выше. Стерильный состав для инъекции также может представлять собой стерильную инъекцию или суспензию, приготовленную в парентерально приемлемом нетоксичном разбавителе или растворителе, например, растворе, приготовленном в 1,3-бутандиоле. Кроме того, стерильное нелетучее масло может обычно использоваться в качестве растворителя или суспендирующей среды. Для этой цели может быть использована любая смесь нелетучего масла, включая синтетические моно- или диглицериды. Кроме того, при приготовлении инъекций также могут быть использованы жирные кислоты, такие как олеиновая кислота.

2. Способ синтеза

Для целей синтеза приняты следующие технические схемы синтеза:

Способ получения соединения общей формулы (Pc-L_a-Y-D) включает следующие стадии:

подвергание реакции сочетания восстановленного Pc и общей формулы (L_a-Y-D) с получением соединения общей формулы (Pc-L_a-Y-D), где восстановитель предпочтительно представляет собой TCEP (трис(2-карбоксиэтил)фосфин); в частности, дисульфидные связи в антителе предпочтительно являются восстановленными;

Pc, W, L², L³, R¹, R², R⁵-R⁷, m и n являются такими, как определено в общей формуле (Pc-L_a-Y-D).

Один или более вариантов осуществления настоящего изобретения подробно описаны в описании выше. Хотя любые способы и материалы, подобные или идентичные описанным здесь, могут быть использованы для осуществления или тестирования настоящего изобретения, предпочтительные способы и материалы описаны ниже. Другие признаки, объекты и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из описания и формулы изобретения. В описании и формуле изобретения формы единственного числа включают формы множественного числа, если иное четко не указано в контексте. Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют общие значения, понятные специалисту в данной области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение. Все патенты и публикации, цитируемые в описании, включены посредством ссылки. Следующие примеры приведены для того, чтобы более полно проиллюстрировать предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения. Эти примеры не следует никоим образом истолковывать как ограничивающие объем настоящего изобретения, который определен формулой изобретения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. Получение антител

Пример 1-1. Конструирование штамма клеток с высокой экспрессией клаудина 18.2

Лентивирусные экспрессионные векторные плазмиды pCDH-hClaudin18.2, лентивирусная система упаковочных векторов pVSV-G и pCMV-dR8.91 трансфицировали в вирусные упаковывающие клетки 293T с использованием трансфекционного реагента Lipofectamine 3000. Супернатант среды, содержащий вирусы, собирали, фильтровали и центрифугировали на сверхвысокой скорости. Штамм клеток NUGC4 перстневидно-клеточной карциномы желудка человека разрешали к инфицированию концентрированным вирусом, скринингу с использованием пуромицина в течение двух-трех недель и подвергали одноклеточной сортировке FACS.

Уровни экспрессии клаудина 18.2 определяли в соответствии с оценками ИГХ (имуногистохимия) опухоли. Клетки с уровнями экспрессии клаудина 18.2, аналогичными уровням экспрессии опухоли с оценкой ИГХ опухоли 3 балла, считали клетками с высокой экспрессией, а клетки с уровнями экспрессии клаудина 18.2, аналогичными уровням экспрессии опухоли с оценкой ИГХ опухоли 2 балла, считали клетками с умеренной экспрессией. По уровню экспрессии клаудина 18.2 на поверхности клеток NUGC4, определенному с помощью FACS, были отобраны штаммы моноклональных клеток NUGC4/hClaudin18.2 с высокой экспрессией клаудина 18.2. Уровень экспрессии клаудина 18.2 на поверхности клеток NUGC4 дикого типа также определяли с помощью FACS и отбирали штаммы клональных клеток NUGC4 с умеренной экспрессией клаудина 18.2. Клетки NUGC4 дикого типа представляли собой клетки с низкой экспрессией клаудина 18.2.

Выбранные штаммы моноклональных клеток размножали и сохраняли путем замораживания для последующих экспериментов.

Последовательность клаудина 18.2 в Genbank: NP_001002026: (SEQ ID NO: 1)

MAVTACQGLGFVVSLIGIAGIIAATCMDQWSTQDLYNNPVTAVFNYQGLWRSCVRESSGFTECRGYFTLLGLPAMLQAVRALMIVGIVLGAIGLLVSIFALKCIRIGSMEDSAKANMTLTSGIMFIVSGLCAIAGVSVFANMLVTNFWMSTANMYTGMGGMVQTVQTRYTFGAALFVGWVAGGLTLIGGVMMCIACRGLAPEETNYKAVSYHASGHSVAYKPGGFKASTGFGSNTKNKKIYDGGARTEDEVQSYPSKHDYV;

Последовательность ДНК клаудина 18.2: (SEQ ID NO: 2)

1 AGAATTGCGC TGTCCACTTG TCGTGTGGCT CTGTGTCGAC ACTGTGCGCC ACCATGGCCG

61 TGACTGCCTG TCAGGGCTTG GGGTTCGTGG TTTCACTGAT TGGGATTGCG GGCATCATTG

121 CTGCCACCTG CATGGACCAG TGGAGCACCC AAGACTTGTA CAACAACCCC GTAACAGCTG

181 TTTTCAACTA CCAGGGGCTG TGGCGCTCCT GTGTCCGAGA GAGCTCTGGC TTCACCGAGT

241 GCCGGGGCTA CTTCACCCTG CTGGGGCTGC CAGCCATGCT GCAGGCAGTG CGAGCCCTGA

301 TGATCGTAGG CATCGTCCTG GGTGCCATTG GCCTCCTGGT ATCCATCTTT GCCCTGAAAT

361 GCATCCGCAT TGGCAGCATG GAGGACTCTG CCAAAGCCAA CATGACACTG ACCTCCGGGA

421 TCATGTTCAT TGTCTCAGGT CTTTGTGCAA TTGCTGGAGT GTCTGTGTTT GCCAACATGC

481 TGGTGACTAA CTTCTGGATG TCCACAGCTA ACATGTACAC CGGCATGGGT GGGATGGTGC

541 AGACTGTTCA GACCAGGTAC ACATTTGGTG CGGCTCTGTT CGTGGGCTGG GTCGCTGGAG

601 GCCTCACACT AATTGGGGGT GTGATGATGT GCATCGCCTG CCGGGGCCTG GCACCAGAAG

661 AAACCAACTA CAAAGCCGTT TCTTATCATG CCTCAGGCCA CAGTGTTGCC TACAAGCCTG

721 GAGGCTTCAA GGCCAGCACT GGCTTTGGGT CCAACACCAA AAACAAGAAG ATATACGATG

781 GAGGTGCCCG CACAGAGGAC GAGGTACAAT CTTATCCTTC CAAGCACGAC TATGTGTAAT

841 GCTCTAAGAC CTCTCAGCAC GGGCGGAAGA AACTCCCGGA GAGCTCACCC AAAAAACAAG

901 GAGATCCCAT CTAGATTTCT TCTTGCTTTT GACTCACAGC TGGAAGTTAG AAAAGCCTCG

961 ATTTCATCTT TGGAGAGGCC AAATGGTCTT AGCCTCAGTC TCTGTCTCTA AATATTCCAC

1021 CATAAAACAG CTGAGTTATT TATGAATTAG AGGCTATAGC TCACATTTTC AATCCTCTAT

1081 TTCTTTTTTT AAATATAACT TTCTACTCTG ATGAGAGAAT GTGGTTTTAA TCTCTCTCTC

1141 ACATTTTGAT GATTTAGACA GACTCCCCCT CTTCCTCCTA GTCAATAAAC CCATTGATGA

1201 TCTATTTCCC AGCTTATCCC CAAGAAAACT TTTGAAAGGA AAGAGTAGAC CCAAAGATGT

1261 TATTTTCTGC TGTTTGAATT TTGTCTCCCC ACCCCCAACT TGGCTAGTAA TAAACACTTA

1321 CTGAAGAAGA AGCAATAAGA GAAAGATATT TGTAATCTCT CCAGCCCATG ATCTCGGTTT

1381 TCTTACACTG TGATCTTAAA AGTTACCAAA CCAAAGTCAT TTTCAGTTTG AGGCAACCAA

1441 ACCTTTCTAC TGCTGTTGAC ATCTTCTTAT TACAGCAACA CCATTCTAGG AGTTTCCTGA

1501 GCTCTCCACT GGAGTCCTCT TTCTGTCGCG GGTCAGAAAT TGTCCCTAGA TGAATGAGAA

1561 AATTATTTTT TTTAATTTAA GTCCTAAATA TAGTTAAAAT AAATAATGTT TTAGTAAAAT

1621 GATACACTAT CTCTGTGAAA TAGCCTCACC CCTACATGTG GATAGAAGGA AATGAAAAAA

1681 TAATTGCTTT GACATTGTCT ATATGGTACT TTGTAAAGTC ATGCTTAAGT ACAAATTCCA

1741 TGAAAAGCTC ACTGATCCTA ATTCTTTCCC TTTGAGGTCT CTATGGCTCT GATTGTACAT

1801 GATAGTAAGT GTAAGCCATG TAAAAAGTAA ATAATGTCTG GGCACAGTGG CTCACGCCTG

1861 TAATCCTAGC ACTTTGGGAG GCTGAGGAGG AAGGATCACT TGAGCCCAGA AGTTCGAGAC

1921 TAGCCTGGGC AACATGGAGA AGCCCTGTCT CTACAAAATA CAGAGAGAAA AAATCAGCCA

1981 GTCATGGTGG CCTACACCTG TAGTCCCAGC ATTCCGGGAG GCTGAGGTGG GAGGATCACT

2041 TGAGCCCAGG GAGGTTGGGG CTGCAGTGAG CCATGATCAC ACCACTGCAC TCCAGCCAGG

2101 TGACATAGCG AGATCCTGTC TAAAAAAATA AAAAATAAAT AATGGAACAC AGCAAGTCCT

2161 AGGAAGTAGG TTAAAACTAA TTCTTTAAAA AAAAAAAAAA GTTGAGCCTG AATTAAATGT

2221 AATGTTTCCA AGTGACAGGT ATCCACATTT GCATGGTTAC AAGCCACTGC CAGTTAGCAG

2281 TAGCACTTTC CTGGCACTGT GGTCGGTTTT GTTTTGTTTT GCTTTGTTTA GAGACGGGGT

2341 CTCACTTTCC AGGCTGGCCT CAAACTCCTG CACTCAAGCA ATTCTTCTAC CCTGGCCTCC

2401 CAAGTAGCTG GAATTACAGG TGTGCGCCAT CACAACTAGC TGGTGGTCAG TTTTGTTACT

2461 CTGAGAGCTG TTCACTTCTC TGAATTCACC TAGAGTGGTT GGACCATCAG ATGTTTGGGC

2521 AAAACTGAAA GCTCTTTGCA ACCACACACC TTCCCTGAGC TTACATCACT GCCCTTTTGA

2581 GCAGAAAGTC TAAATTCCTT CCAAGACAGT AGAATTCCAT CCCAGTACCA AAGCCAGATA

2641 GGCCCCCTAG GAAACTGAGG TAAGAGCAGT CTCTAAAAAC TACCCACAGC AGCATTGGTG

2701 CAGGGGAACT TGGCCATTAG GTTATTATTT GAGAGGAAAG TCCTCACATC AATAGTACAT

2761 ATGAAAGTGA CCTCCAAGGG GATTGGTGAA TACTCATAAG GATCTTCAGG CTGAACAGAC

2821 TATGTCTGGG GAAAGAACGG ATTATGCCCC ATTAAATAAC AAGTTGTGTT CAAGAGTCAG

2881 AGCAGTGAGC TCAGAGGCCC TTCTCACTGA GACAGCAACA TTTAAACCAA ACCAGAGGAA

2941 GTATTTGTGG AACTCACTGC CTCAGTTTGG GTAAAGGATG AGCAGACAAG TCAACTAAAG

3001 AAAAAAGAAA AGCAAGGAGG AGGGTTGAGC AATCTAGAGC ATGGAGTTTG TTAAGTGCTC

3061 TCTGGATTTG AGTTGAAGAG CATCCATTTG AGTTGAAGGC CACAGGGCAC AATGAGCTCT

3121 CCCTTCTACC ACCAGAAAGT CCCTGGTCAG GTCTCAGGTA GTGCGGTGTG GCTCAGCTGG

3181 GTTTTTAATT AGCGCATTCT CTATCCAACA TTTAATTGTT TGAAAGCCTC CATATAGTTA

3241 GATTGTGCTT TGTAATTTTG TTGTTGTTGC TCTATCTTAT TGTATATGCA TTGAGTATTA

3301 ACCTGAATGT TTTGTTACTT AAATATTAAA AACACTGTTA TCCTACAGTT.

Примеры 1-2. Получение моноклонального антитела к клаудину 18.2 человека

1. Иммунизация

Моноклональные антитела к клаудину 18.2 человека получали путем иммунизации мышей. Лабораторные белые мыши SJL, самки, в возрасте 6-8 недель (Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd., номер лицензии на животноводческое производство: SCXK(Beijing)2012-0001). Среда содержания: класс SPF (свободные от специфической патогенной микрофлоры). Приобретенных мышей содержали в лабораторной среде в течение 1 недели, в 12/12-часовом цикле освещения/темноты, при температуре 20-25°С, с влажностью 40-60 %. Акклиматизированных мышей иммунизировали согласно следующей схеме. Антигены для иммунизации представляли собой клетки huClaudin18.2-HEK293 (штамм клеток HEK-293, стабильно трансфицированный плазмидой клаудина 18.2 человека).

Схема иммунизации: Перед первой клеточной иммунизацией каждой мыши внутрибрюшинно (IP) вводили 0,1 мл адъюванта TiterMax® Gold (Sigma Cat No. T2684), и через полчаса вводили 0,1 мл разбавленной физиологическим раствором клеточной жидкости в концентрации 1×10⁸/мл. Клетки равномерно пипетировали, а затем проводили инокуляцию в дни 0, 14, 28, 42 и 56. Кровь собирали в дни 21, 35, 49 и 63, а титр антител в сыворотке крови мышей определяли с помощью ELISA. После 4-5 иммунизации мышей, у которых титр антител в сыворотке крови был высоким и достигал плато, отбирали для слияния спленоцитов. Мышей иммунизировали бустерной дозой 1×10⁷ клеток путем внутрибрюшинной инъекции (IP) за 3 дня до слияния спленоцитов.

2. Слияние спленоцитов

Лимфоциты селезенки и клетки миеломы, клетки Sp2/0 (ATCC® CRL-8287™), сливали, следуя оптимизированной процедуре слияния, опосредованной ПЭГ (полиэтиленгликоль), для получения гибирдомных клеток. Полученные гибридомные клетки ресуспендировали в полной среде (среда IMDM, содержащая 20% FBS (фетальная бычья сыворотка), 1× HAT (гипоксантин-аминоптеринтимидин) и 1× OPI) при плотности 0,5-1×10⁶/мл и высевали в 96-луночный планшет при 100 мкл/лунку. Планшет инкубировали при 37°C с 5% CO₂ в течение 3-4 дней, дополняли полной средой HAT при 100 мкл/лунку и инкубировали в течение еще 3-4 дней с образованием точечных клонов. Супернатант удаляли и добавляли полную среду HT (среда IMDM, содержащая 20% FBS, 1× HT (гипоксантин-тимидин) и 1× OPI) при 200 мкл/лунку. Планшет инкубировали при 37°C с 5% CO₂ в течение 3 дней с последующим анализом ELISA.

3. Скрининг гибридомных клеток

Супернатанты культуры гибридомы анализировали с использованием комбинированного метода ELISA в соответствии с плотностью, при которой росли гибридомные клетки. Клетки, которые имели хорошую способность связывания с клетками huClaudin18.2-HEK293, но не были связаны с HEK293, отбирали, размножали и замораживали. Субклонирование проводили 2-3 раза с получением одноклеточных клонов.

Для каждого субклонирования клеток также проводили анализ связывания клеток. Гибридомные клоны получали с помощью вышеуказанного процесса скрининга, и антитела дополнительно получали с использованием способа культивирования клеток без сыворотки. Антитела очищали в соответствии с примером очистки для применения в тестовых примерах.

Примеры 1-3. Гуманизация мышиных антител

Отбирали штаммы моноклональных гибридомных клеток mAb1901 и mAb1902 с высокой активностью in vitro. Содержащиеся в них последовательности моноклональных антител клонировали с последующей гуманизацией, рекомбинантной экспрессией и оценкой активности.

Клонирование последовательностей из гибридом происходит следующим образом. Гибридомные клетки, растущие в логарифмической фазе, собирали, и РНК экстрагировали с использованием Тризола (Invitrogen, 15596-018) (следуя процедурам в инструкциях набора) и обратно транскрибировали (PrimeScript™ Reverse Transcriptase, Takara, cat # 2680A). Полученную обратной транскрипцией кДНК амплифицировали с помощью ПЦР (полимеразная цепная реакция) с использованием набора mouse Ig-Primer Set (Novagen, TB326 Rev.B 0503), а затем отправляли на секвенирование в компанию, занимающуюся секвенированием. Аминокислотные последовательности, соответствующие полученным последовательностям ДНК гибридомных клеток, указаны в SEQ ID NO: 3-6:

Вариабельная область мышиной тяжелой цепи mAb1901 (SEQ ID NO: 3)

EVQLMESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYGIHWVRQAPEMGLEWIAYISRGSSTIYYADTVKGRFTMSRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARGGYDTRNAMDYWGQGTSVTVSS;

Вариабельная область мышинной легкой цепи mAb1901 (SEQ ID NO: 4)

DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRASGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAIYHCQNDLYYPLTFGAGTKLELK;

Вариабельная область мышинной тяжелой цепи mAb1902 (SEQ ID NO: 5)

EVQLQESGAELVKPGASVKLSCKASGYIFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGMIHPNSGSTNYNEKFKGKATLTLDKSSSTAYMQLSSLPSEDSAVYYCARLKTGNSFDYWGQGTTLTVSS;

Вариабельная область мышинной легкой цепи mAb1902 (SEQ ID NO: 6)

DIVLTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAIYYCQNAYTYPFTFGSGTKLEIK.

Вышеуказанные вариабельные области мышинной тяжелой цепи и легкой цепи были соединены с константной областью тяжелой цепи антитела IgG1 человека и константной областью легкой цепи κ человека, описанной ниже, соответственно, с образованием химерных антител ch1901 и ch1902.

Константные области были выбраны из группы, состоящей из следующих последовательностей:

Константная область тяжелой цепи антитела IgG1 человека: (SEQ ID NO: 7)

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK;

Константная область легкой цепи κ человека: (SEQ ID NO: 8)

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.

Гуманизацию мышиных моноклональных антител проводили, как описано во многих публикациях в данной области техники. Вкратце, константные домены человека использовали вместо родительских (мышиные антитела) константных доменов, и последовательности антител зародышевой линии человека отбирали на основе гомологии мышиных и человеческих антител для трансплантации CDR. Настоящее изобретение выбирает молекулы-кандидаты с хорошей активностью для гуманизации, и результаты являются следующими.

1. CDR мышиных антител

Аминокислотные остатки CDR VH/VL в таблице 1 идентифицировали с использованием системы нумерации по Кабату и аннотировали.

Последовательности CDR мышинных антител описаны в таблице 1:

Таблица 1. Последовательности CDR мышиных антител Антитело mAb1901 HCDR1 DYGIH (SEQ ID NO: 9) HCDR2 YISRGSSTIYYADTVKG (SEQ ID NO: 10) HCDR3 GGYDTRNAMDY (SEQ ID NO: 11) LCDR1 KSSQSLLNSGNQKNYLA (SEQ ID NO: 12) LCDR2 GASTRAS (SEQ ID NO: 13) LCDR3 QNDLYYPLT (SEQ ID NO: 14) Антитело mAb1902 HCDR1 SYWMH (SEQ ID NO: 15) HCDR2 MIHPNSGSTNYNEKFKGR (SEQ ID NO: 16) HCDR3 LKTGNSFDY (SEQ ID NO: 17) LCDR1 KSSQSLLNSGNQKNYLT (SEQ ID NO: 18) LCDR2 WASTRES (SEQ ID NO: 19) LCDR3 QNAYTYPFT (SEQ ID NO: 20)

2. Выбор последовательностей области FR зародышевой линии человека

На основании типичной структуры полученного мышиного антитела VH/VLCDR последовательности вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи сравнивали с базой данных антител Germine для получения матрицы зародышевой линии человека с высокой гомологией. Каркасную область легкой цепи зародышевой линии человека получали из гена легкой цепи κ человека.

2.1. Гуманизация mAb1901 и дизайн обратной мутации

Подходящую зародышевую линию человеческого антитела отбирали для проведения гуманизации на мышином антителе mAb1901. CDR мышиного антитела mAb1901 прививали в выбранную матрицу гуманизации для замены гуманизированных вариабельных областей с последующей рекомбинацией с константной областью IgG с образованием полного антитела. Между тем, в область FR в V области гуманизированного антитела вводили обратные мутации. Иллюстративные обратные мутации и их комбинации являются следующими:

Таблица 2. Гуманизированные антитела mAb1901 и обратные мутации* Вариабельные области легкой цепи гуманизированных антител mAb1901 Вариабельные области тяжелой цепи гуманизированных антител mAb1901 VL1 Нет VH1 Нет VL2 N22S VH2 N82T VL3 N22S, V85I, Y87H VH3 V48I, N82T VH4 I69M, N82T

* Все положения аминокислот в таблице пронумерованы в соответствии со схемой нумерации по Кабату; в N82T вариабельной области тяжелой цепи 82 относится к положению 82A в соответствии со схемой по Кабату.

Таблица 3. Последовательности вариабельной области легкой цепи и тяжелой цепи гуманизированных антител mAb1901 Название вариабельной области (SEQ ID NO:) Последовательность VL1
(SEQ ID NO: 21) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDLYYPLTFGQGTKLEIK VL2
(SEQ ID NO:22) DIVMTQSPDSLAVSLGERATISCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDLYYPLTFGQGTKLEIK VL3
(SEQ ID NO:23) DIVMTQSPDSLAVSLGERATISCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAIYHCQNDLYYPLTFGQGTKLEIK VH1
(SEQ ID NO:24) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGIHWVRQAPGKGLEWVAYISRGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGYDTRNAMDYWGQGTTVTVSS VH2
(SEQ ID NO:25) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGIHWVRQAPGKGLEWVAYISRGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMTSLRAEDTAVYYCARGGYDTRNAMDYWGQGTTVTVSS VH3
(SEQ ID NO:26) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGIHWVRQAPGKGLEWIAYISRGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMTSLRAEDTAVYYCARGGYDTRNAMDYWGQGTTVTVSS VH4
(SEQ ID NO:27) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGIHWVRQAPGKGLEWVAYISRGSSTIYYADTVKGRFTMSRDNAKNSLYLQMTSLRAEDTAVYYCARGGYDTRNAMDYWGQGTTVTVSS

Соответствующую вариабельную область тяжелой цепи в приведенной выше таблице соединяли с константной областью тяжелой цепи IgG1 человека, указанной в SEQ ID NO: 7, с образованием тяжелой цепи полноразмерного антитела, а вариабельную область легкой цепи соединяли с константной областью легкой цепи κ человека, указанной в SEQ ID NO: 8, с образованием легкой цепи полноразмерного антитела. В других вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи также могут быть соединены с другими константными областями тяжелой цепи и константными областями легкой цепи, соответственно, с образованием полноразмерного антитела.

2.2. Гуманизация mAb1902 и дизайн обратной мутации

Подходящую зародышевую линию человеческого антитела отбирали для проведения гуманизации на мышином антителе mAb1902. CDR мышиного антитела mAb1902 прививали в выбранную матрицу гуманизации для замены гуманизированных вариабельных областей с последующей рекомбинацией с константной областью IgG с образованием полного антитела. Между тем, в область FR в V области гуманизированного антитела вводили обратные мутации. Иллюстративные обратные мутации и их комбинации являются следующими:

Таблица 4. Гуманизированные антитела mAb1902 и дизайн обратной мутации для них* Вариабельная область легкой цепи гуманизированных антител mAb1902 Вариабельная область тяжелой цепи гуманизированных антител mAb1902 VL11 Нет VH11 Нет VL12 M4L VH12 I69L, R71L, T73K VL13 M4L, N22S VH13 M48I, R66K, V67A, I69L, R71L, T73K VH14 R38K, A40R, M48I, R66K, V67A, I69L, R71L, T73K

* Все положения аминокислот в таблице пронумерованы в соответствии со схемой нумерации по Кабату.

Таблица 5. Последовательности вариабельной области легкой цепи и тяжелой цепи гуманизированного антитела mAb1902 Название вариабельной области (SEQ ID NO:) Последовательность VL11
(SEQ ID NO: 28) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNAYTYPFTFGQGTKLEIK VL12
(SEQ ID NO: 29) DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNAYTYPFTFGQGTKLEIK VL13
(SEQ ID NO: 30) DIVLTQSPDSLAVSLGERATISCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNAYTYPFTFGQGTKLEIK VH11
(SEQ ID NO: 31) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQRLEWMGMIHPNSGSTNYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKTGNSFDYWGQGTTVTVSS VH12
(SEQ ID NO: 32) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQRLEWMGMIHPNSGSTNYNEKFKGRVTLTLDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKTGNSFDYWGQGTTVTVSS VH13
(SEQ ID NO: 33) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQRLEWIGMIHPNSGSTNYNEKFKGKATLTLDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKTGNSFDYWGQGTTVTVSS VH14
(SEQ ID NO: 34) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQRLEWIGMIHPNSGSTNYNEKFKGKATLTLDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKTGNSFDYWGQGTTVTVSS

Соответствующую вариабельную область тяжелой цепи в приведенной выше таблице соединяли с константной областью тяжелой цепи IgG1 человека, указанной в SEQ ID NO: 7, с образованием тяжелой цепи полноразмерного антитела, и вариабельную область легкой цепи соединяли с константной областью легкой цепи κ человека, указанной в SEQ ID NO: 8, с образованием легкой цепи полноразмерного антитела.

Химерное антитело ch1901

Тяжелая цепь ch1901: (SEQ ID NO: 35)

EVQLMESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYGIHWVRQAPEMGLEWIAYISRGSSTIYYADTVKGRFTMSRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARGGYDTRNAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK;

Легкая цепь ch1901: (SEQ ID NO: 36)

DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRASGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAIYHCQNDLYYPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC;

Химерное антитело ch1902

Тяжелая цепь ch1902 (SEQ ID NO: 37)

EVQLQESGAELVKPGASVKLSCKASGYIFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGMIHPNSGSTNYNEKFKGKATLTLDKSSSTAYMQLSSLPSEDSAVYYCARLKTGNSFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK;

Легкая цепь ch1902 (SEQ ID NO: 38)

DIVLTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAIYYCQNAYTYPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.

В таблице 6 показаны гуманизированные антитела mAb1901:

Таблица 6. Гуманизированные антитела mAb1901 Легкие и тяжелые цепи H1 H2 H3 H4 L1 h1901-1 h1901-2 h1901-3 h1901-4 L2 h1901-5 h1901-6 h1901-7 h1901-8 L3 h1901-9 h1901-10 h1901-11 h1901-12

Примечание: В таблице гуманизированное антитело h1901-1 имеет тяжелую цепь H1 и легкую цепь L1. Это относится и к другим гуманизированным антителам. Последовательности легкой цепи и тяжелой цепи полноразмерного антитела гуманизированных антител mAb1901 показаны в таблице 7 ниже:

Таблица 7. Последовательности легкой цепи и тяжелой цепи гуманизированных антител mAb1901 Название вариабельной области (SEQ ID NO:) Последовательность L1
(SEQ ID NO: 39) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDLYYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC L2
(SEQ ID NO: 40) DIVMTQSPDSLAVSLGERATISCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDLYYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC L3
(SEQ ID NO: 41) DIVMTQSPDSLAVSLGERATISCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAIYHCQNDLYYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC H1
(SEQ ID NO: 42) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGIHWVRQAPGKGLEWVAYISRGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGYDTRNAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK H2
(SEQ ID NO: 43) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGIHWVRQAPGKGLEWVAYISRGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMTSLRAEDTAVYYCARGGYDTRNAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK H3
(SEQ ID NO: 44) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGIHWVRQAPGKGLEWIAYISRGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMTSLRAEDTAVYYCARGGYDTRNAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK H4
(SEQ ID NO: 45) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGIHWVRQAPGKGLEWVAYISRGSSTIYYADTVKGRFTMSRDNAKNSLYLQMTSLRAEDTAVYYCARGGYDTRNAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

В таблице 8 показаны гуманизированные антитела mAb1902:

Таблица 8. Гуманизированные антитела mAb1902 Легкие и тяжелые цепи H11 H12 H13 H14 L11 h1902-1 h1902-2 h1902-3 h1902-4 L12 h1902-5 h1902-6 h1902-7 h1902-8 L13 h1902-9 h1902-10 h1902-11 h1902-12

Примечание: В таблице гуманизированное антитело h1902-1 имеет тяжелую цепь H11 и легкую цепь L11. Это относится и к другим гуманизированным антителам.

Последовательности легкой цепи и тяжелой цепи гуманизированных антител mAb1902 показаны в таблице 9 ниже:

Таблица 9. Последовательности легкой цепи и тяжелой цепи гуманизированных антител mAb1901 Название вариабельной области (SEQ ID NO:) Последовательность L11
(SEQ ID NO: 46) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNAYTYPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC L12
(SEQ ID NO: 47) DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNAYTYPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC L13
(SEQ ID NO: 48) DIVLTQSPDSLAVSLGERATISCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNAYTYPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC H11
(SEQ ID NO: 49) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQRLEWMGMIHPNSGSTNYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKTGNSFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK H12
(SEQ ID NO: 50) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQRLEWMGMIHPNSGSTNYNEKFKGRVTLTLDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKTGNSFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK H13
(SEQ ID NO: 51) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQRLEWIGMIHPNSGSTNYNEKFKGKATLTLDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKTGNSFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK H14
(SEQ ID NO: 52) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQRLEWIGMIHPNSGSTNYNEKFKGKATLTLDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKTGNSFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Антитело положительного контроля согласно настоящему изобретению представляет собой IMAB-362 (из WO2016166122)

Тяжелая цепь IMAB-362 (SEQ ID NO: 53):

1 QVQLQQPGAE LVRPGASVKL SCKASGYTFT SYWINWVKQR PGQGLEWIGN

51 IYPSDSYTNY NQKFKDKATL TVDKSSSTAY MQLSSPTSED SAVYYCTRSW

101 RGNSFDYWGQ GTTLTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY

151 FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI

201 CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD

251 TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST

301 YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY

351 TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD

401 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK;

Легкая цепь IMAB-362 (SEQ ID NO: 54):

1 DIVMTQSPSS LTVTAGEKVT MSCKSSQSLL NSGNQKNYLT WYQQKPGQPP

51 KLLIYWASTR ESGVPDRFTG SGSGTDFTLT ISSVQAEDLA VYYCQNDYSY

101 PFTFGSGTKL EIKRTVAAPS VFIFPPSDEQ LKSGTASVVC LLNNFYPREA

151 KVQWKVDNAL QSGNSQESVT EQDSKDSTYS LSSTLTLSKA DYEKHKVYAC

201 EVTHQGLSSP VTKSFNRGEC.

Вышеуказанные антитела клонировали, экспрессировали и очищали с использованием обычных способов клонирования генов и рекомбинантной экспрессии.

2. Получение соединений

Экспериментальные процедуры без условий, указанные в примерах настоящего изобретения, как правило, осуществляют в соответствии с общепринятыми условиями или в соответствии с условиями, рекомендованными производителем исходных материалов или коммерческих продуктов. Реагенты без указания конкретного происхождения являются коммерчески доступными обычными реагентами.

Структуры соединений идентифицировали с помощью ядерного магнитного резонанса (ЯМР) или масс-спектрометрии (МС). Спектры ЯМР измеряли с использованием прибора ядерного магнитного резонанса Bruker AVANCE-400, с дейтерированным диметилсульфоксидом (ДМСО-d6), дейтерированным хлороформом (CDCl₃) и дейтерированным метанолом (CD₃OD) в качестве растворителей и тетраметилсиланом (ТМС) в качестве внутреннего стандарта. Химические сдвиги приведены в единицах измерения10^-6 (ppm).

МС-анализ проводили с использованием масс-спектрометра FINNIGAN LCQAd (ESI) (производитель: Thermo, модель: Finnigan LCQ advantage MAX).

Анализ СВЭЖХ (сверхэффективная жидкостная хроматография) проводили с использованием системы жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии Waters Acquity UPLC SQD.

Анализ ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) проводили с использованием жидкостного хроматографа высокого давления Agilent 1200DAD (хроматографическая колонка Sunfire C18 150×4,6 мм) и жидкостного хроматографа высокого давления Waters 2695-2996 (хроматографическая колонка Gimini C18 150×4,6 мм).

Анализ УФ-ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография с использованием УФ) проводили с использованием ультрафиолетового спектрофотометра Thermo nanodrop2000.

Степень ингибирования пролиферации и значения IC₅₀ измеряли с помощью считывающего устройства для микропланшетов PHERA starFS (BMG, Германия).

Силикагелевые пластины Huanghai HSGF254 или Qingdao GF254 со спецификациями от 0,15 мм до 0,2 мм применяли для тонкослойной хроматографии (ТСХ) и от 0,4 мм до 0,5 мм для разделения и очистки ТСХ.

Силикагель Yantai Yellow Sea 200-300 меш обычно используется в качестве носителя в колоночной хроматографии.

Известные исходные материалы по настоящему изобретению могут быть синтезированы с использованием или в соответствии со способами, известными в данной области техники, или могут быть приобретены у ABCR GmbH & Co.KG, Acros Organnics, Aldrich Chemical Company, Accela ChemBio Inc, Chembee Chemicals и т.д.

В примерах все реакции проводили в атмосфере аргона или в атмосфере азота, если не указано иное.

Атмосфера аргона или атмосфера азота означает, что реакционная колба соединена с баллоном, содержащим около 1 л аргона или азота.

Атмосфера водорода означает, что реакционная колба соединена с баллоном, содержащим около 1 л водорода.

Гидрогенизатор Parr 3916EKX, гидрогенизатор Qinglan QL-500 или гидрогенизатор HC2-SS использовали в реакциях гидрирования под давлением.

Реакция гидрирования обычно включает 3 цикла вакуумирования и продувки водородом.

В реакциях, проводимых под воздействием микроволнового излучения, использовали микроволновый реактор CEM Discover-S типа 908860.

В примерах раствор в реакции относится к водному раствору, если не указано иное.

В примерах температура реакции представляет собой комнатную температуру, если не указано иное.

Комнатная температура является оптимальной температурой реакции, которая находится в диапазоне от 20 до 30°C.

Приготовление буфера PBS (фосфатно-солевой буферный раствор) при рН 6,5 в примерах:8,5 г KH₂PO₄, 8,56 г K₂HPO₄×3H₂O, 5,85г NaCl и 1,5 г ЭДТА добавляли в колбу, и объем доводили до 2 л. Все добавления растворяли ультразвуком, и раствор хорошо перемешивали путем встряхивания с получением требуемого буфера.

Система элюента для колоночной хроматографии и система проявляющего растворителя для тонкослойной хроматографии, используемая для очистки соединения, включает: A: дихлорметанольную и изопропанольную систему, B: дихлорметанольную и метанольную систему и C: петролейный эфир и этилацетатную систему. Объемное соотношение растворителей корректировали в соответствии с полярностью соединения или добавляли небольшое количество триэтиламина и кислотного или основного реагента.

Некоторые из соединений по настоящему изобретению охарактеризовывали с помощью анализа Q-TOF ЖХ/MС. В Q-TOF ЖХ/MС применяли квадрупольный времяпролетный масс-спектрометр с точной массой Agilent 6530 и сверхвысокоэффективный жидкостный хроматограф Agilent 1290-Infinity (хроматографическая колонка Agilent Poroshell 300SB-C8 5 мкм, 2,1×75 мм).

См. PCT/CN2019/107873 для части лекарственного средства Y-D конъюгатов антитела и лекарственного средства по настоящему изобретению, и синтез и испытания соответствующих соединений включены в настоящий документ посредством ссылки. Неограничивающие примеры синтеза включены посредством ссылки следующим образом:

Пример 1

N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-1-гидроксициклопропан-1-карбоксамид 1

К экзатекан мезилату 1b (2,0 мг, 3,76 мкмоль, полученному, как описано в патентной заявке "EP0737686A1") добавляли 1 мл N,N-диметилформамида. Смесь охлаждали до 0-5°C на ледяной водяной бане и добавляли каплю триэтиламина. Реакционную смесь перемешивали, пока она не стала прозрачной. К реакционной смеси последовательно добавляли 1-гидроксициклопропилкарбоновую кислоту 1а (1,4 мг, 3,7 мкмоль, полученную известным способом "Tetrahedron Letters, 25(12), 1269-72; 1984") и 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорид (3,8 мг, 13,7 мкмоль). После добавления реакционную смесь перемешивали при 0-5°C в течение 2 часов, гасили 5 мл воды и экстрагировали этилацетатом (8 мл × 3). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия (5 мл × 2), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и полученный остаток очищали с помощью тонкослойной хроматографии с помощью системы проявляющего растворителя B с получением указанного в заголовке продукта 1 (1,6 мг, выход 82,1 %).

МС m/z (ESI): 520,2 [M+1]

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃): δ 7,90-7,84 (m, 1H), 7,80-7,68 (m, 1H), 5,80-5,70 (m, 1H), 5,62-5,54 (m, 2H), 5,44-5,32 (m, 2H), 5,28-5,10 (m, 2H), 3,40-3,15 (m, 3H), 2,44 (s, 3H), 2,23(t, 1H), 2,06-1,75 (m, 2H), 1,68-1,56 (m, 1H), 1,22-1,18 (m, 2H), 1,04-0,98 (m, 2H), 0,89 (t, 3H).

Пример 2

(S)-2-циклопропил-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-2-гидроксиацетамид 2-A

(R)-2-циклопропил-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-2-гидроксиацетамид 2-B

К 1b (4 мг, 7,53 мкмоль) добавляли 2 мл этанола и 0,4 мл N,N-диметилформамида. Систему трижды продували аргоном, и смесь охлаждали до 0-5°C на ледяной водяной бане с последующим добавлением по каплям 0,3 мл N-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали, пока она не стала прозрачной. К реакционной смеси последовательно добавляли 2-циклопропил-2-гидроксиуксусную кислоту 2а (2,3 мг, 19,8 мкмоль, полученную, как описано в патентной заявке "WO2013106717"), 1-гидроксибензотриазол (3 мг, 22,4 мкмоль) и 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид гидрохлорид (4,3 мг, 22,4 мкмоль). После добавления реакционную смесь перемешивали при 0-5°C в течение 1 часа. Ледяную водяную баню удаляли, и реакционную смесь нагревали до 30°С, перемешивали в течение 2 часов и концентрировали при пониженном давлении. Полученное неочищенное соединение 2 очищали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (условия разделения: хроматографическая колонка: XBridge Prep C18 OBD 5 мкм 19×250 мм; подвижная фаза: A - вода (10 ммоль NH₄OAc), B - ацетонитрил, градиентное элюирование, скорость потока: 18 мл/мин), и соответствующие фракции собирали и концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке продукта (2-A: 1,5 мг, 2-B: 1,5 мг).

МС m/z (ESI): 534,0 [M+1].

Соединение с единственной конфигурацией 2-B (меньшее время удерживания)

Анализ СВЭЖХ: время удерживания: 1,06 мин; чистота: 88 % (хроматографическая колонка: ACQUITY UPLC BEHC18 1,7 мкм 2,1 × 50 мм; подвижная фаза: A - вода (5 ммоль NH₄OAc), B - ацетонитрил).

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 8,37 (d, 1H), 7,76 (d, 1H), 7,30 (s, 1H), 6,51 (s, 1H), 5,58-5,56 (m, 1H), 5,48 (d, 1H), 5,41 (s, 2H), 5,32-5,29 (m, 2H), 3,60 (t, 1H), 3,19-3,13 (m, 1H), 2,38 (s, 3H), 2,20-2,14 (m, 1H), 1,98 (q, 2H), 1,87-1,83 (m, 1H), 1,50-1,40 (m, 1H), 1,34-1,28 (m, 1H), 0,86 (t, 3H), 0,50-0,39 (m, 4H).

Соединение с единственной конфигурацией 2-A (большее время удерживания)

Анализ СВЭЖХ: время удерживания: 1,10 мин; чистота: 86 % (хроматографическая колонка: ACQUITY UPLC BEHC18 1,7 мкм 2,1 × 50 мм; подвижная фаза: A - вода (5 ммоль NH₄OAc), B - ацетонитрил).

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 8,35 (d, 1H), 7,78 (d, 1H), 7,31 (s, 1H), 6,52 (s, 1H), 5,58-5,53 (m, 1H), 5,42 (s, 2H), 5,37 (d, 1H), 5,32 (t, 1H), 3,62 (t, 1H), 3,20-3,15 (m, 2H), 2,40 (s, 3H), 2,25-2,16 (m, 1H), 1,98 (q, 2H), 1,87-1,82 (m, 1H), 1,50-1,40 (m, 1H), 1,21-1,14 (m, 1H), 0,87 (t, 3H), 0,47-0,35 (m, 4H).

Пример 3

(S)-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-3,3,3-трифтор-2-гидроксипропионамид 3-A

(R)-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-3,3,3-фтор-2-гидроксипропионамид 3-B

К 1b (5,0 мг, 9,41 мкмоль) добавляли 2 мл этанола и 0,4 мл N,N-диметилформамида, и смесь охлаждали до 0-5°C на ледяной водяной бане с последующим добавлением по каплям 0,3 мл N-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали, пока она не стала прозрачной. К реакционной смеси последовательно добавляли 3,3,3-трифтор-2-гидроксипропионовую кислоту 3a (4,1 мг, 28,4 мкмоль, поставляемый Alfa), 1-гидроксибензотриазол (3,8 мг, 28,1 мкмоль) и 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид гидрохлорид (5,4 мг, 28,2 мкмоль). После добавления реакционную смесь перемешивали при 0-5°C в течение 10 минут. Ледяную водяную баню удаляли, и реакционную смесь нагревали до 30°C, перемешивали в течение 8 часов и концентрировали при пониженном давлении. Полученное неочищенное соединение 3 очищали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (условия разделения: хроматографическая колонка: XBridge Prep C18 OBD 5 мкм 19 × 250 мм; подвижная фаза: A - вода (10 ммоль NH₄OAc), B - ацетонитрил, градиентное элюирование, скорость потока: 18 мл/мин), и соответствующие фракции собирали и концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке продукта (3-A: 1,5 мг, 3-B: 1,5 мг).

МС m/z (ESI): 561,9 [M+1].

Соединение с единственной конфигурацией (меньшее время удерживания)

Анализ СВЭЖХ: время удерживания: 1,11 мин; чистота: 88 % (хроматографическая колонка: ACQUITY UPLC BEHC18 1,7 мкм 2,1 × 50 мм; подвижная фаза: A - вода (5 ммоль NH₄OAc), B - ацетонитрил).

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 8,94 (d, 1H), 7,80 (d, 1H), 7,32 (s, 1H), 7,20 (d, 1H), 6,53 (s, 1H), 5,61-5,55 (m, 1H), 5,45-5,23 (m, 3H), 5,15-5,06 (m, 1H), 4,66-4,57 (m, 1H), 3,18-3,12 (m, 1H), 2,40 (s, 3H), 2,26-2,20 (m, 1H), 2,16-2,08 (m, 1H), 2,02-1,94 (m, 1H), 1,89-1,82 (m, 1H), 1,50-1,40 (m, 1H), 0,87 (t, 3H).

Соединение с единственной конфигурацией (большее время удерживания)

Анализ СВЭЖХ: время удерживания: 1,19 мин; чистота: 90 % (хроматографическая колонка: ACQUITY UPLC BEHC18 1,7 мкм 2,1 × 50 мм; подвижная фаза: A - вода (5 ммоль NH₄OAc), B - ацетонитрил).

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 8,97 (d, 1H), 7,80 (d, 1H), 7,31 (s, 1H), 7,16 (d, 1H), 6,53 (s, 1H), 5,63-5,55 (m, 1H), 5,45-5,20 (m, 3H), 5,16-5,07 (m, 1H), 4,66-4,57 (m, 1H), 3,18-3,12 (m, 1H), 2,40 (s, 3H), 2,22-2,14 (m, 1H), 2,04-1,95 (m, 2H), 1,89-1,82 (m, 1H), 1,50-1,40 (m, 1H), 0,87 (t, 3H).

Пример 4

N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-1-гидроксициклопентан-1-карбоксамид 4

К 1b (3,0 мг, 5,64 мкмоль) добавляли 1 мл N,N-диметилформамида. Смесь охлаждали до 0-5°C на ледяной водяной бане и добавляли каплю триэтиламина. Реакционную смесь перемешивали, пока она не стала прозрачной. К реакционной смеси последовательно добавляли 1-гидрокси-циклопентанкарбоновую кислоту 4a (2,2 мг, 16,9 мкмоль, полученную, как описано в патентной заявке "WO2013106717") и 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорид (4,7 мг, 16,9 мкмоль). После добавления реакционную смесь перемешивали при 0-5°C в течение 1 часа, гасили 5 мл воды и экстрагировали этилацетатом (10 мл × 3). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия (5 мл × 2), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и полученный остаток очищали с помощью тонкослойной хроматографии с помощью системы проявляющего растворителя B с получением указанного в заголовке продукта 4 (2,5 мг, выход 80,9 %).

МС m/z (ESI): 548,0 [M+1].

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃): δ 7,73-7,62 (m, 2H), 5,75-5,62 (m, 1H), 5,46-5,32 (m, 2H), 5,26-5,10 (m, 1H), 3,30-3,10 (m, 1H), 2,43 (s, 3H), 2,28-2,20 (m, 2H), 2,08-1,84 (m, 8H), 1,69-1,58 (m, 2H), 1,04-1,00 (m, 2H), 0,89 (t, 3H).

Пример 5

N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-1-(гидроксиметил)циклопропан-1-карбоксамид 5

К 1b (2,0 мг, 3,76 мкмоль) добавляли 1 мл N,N-диметилформамида. Смесь охлаждали до 0-5°C на ледяной водяной бане и добавляли каплю триэтиламина. Реакционную смесь перемешивали, пока она не стала прозрачной. К реакционной смеси последовательно добавляли 1-(гидроксиметил)-циклопентанкарбоновую кислоту 5a (0,87 мг, 7,5 мкмоль, полученную, как описано в патентной заявке "WO201396771") и 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорид (2 мг, 7,24 мкмоль). После добавления реакционную смесь перемешивали при 0-5°C в течение 2 часов, гасили 5 мл воды и экстрагировали этилацетатом (8 мл × 3). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия (5 мл × 2), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и полученный остаток очищали с помощью тонкослойной хроматографии с помощью системы проявляющего растворителя B с получением указанного в заголовке продукта 5 (1,0 мг, выход 50 %).

МС m/z (ESI): 533,9 [M+1].

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃): δ 8,07 (s, 1H), 7,23-7,18 (m, 2H), 6,71-6,64 (m, 1H), 6,55-6,51 (m, 1H), 5,36-5,27 (m, 2H), 4,67-4,61 (m, 2H), 3,53-3,48 (m, 1H), 3,30-3,22 (m, 2H), 3,18-3,13 (m, 1H), 2,71-2,61 (m, 2H), 2,35-2,28 (m, 1H), 2,04-1,91 (m, 4H), 1,53-1,40 (m, 3H), 0,91-0,75 (m, 4H).

Пример 6

N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-1-(гидроксиметил)циклобутан-1-карбоксамид 6

К 1b (3,0 мг, 5,64 мкмоль) добавляли 1 мл N,N-диметилформамида. Смесь охлаждали до 0-5°C на ледяной водяной бане и добавляли каплю триэтиламина. Реакционную смесь перемешивали, пока она не стала прозрачной. К реакционной смеси последовательно добавляли 1-(гидроксиметил)циклобутан-1-карбоновую кислоту 6a (2,2 мг, 16,9 мкмоль, полученную, как описано в "Journal of the American Chemical Society, 2014, vol.136, #22, p.8138-8142") и 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорид (4,7 мг, 16,9 мкмоль). После добавления реакционную смесь перемешивали при 0-5°C в течение 1 часа, гасили 5 мл воды и экстрагировали этилацетатом (10 мл × 3). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия (5 мл × 2), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и полученный остаток очищали с помощью тонкослойной хроматографии с помощью системы проявляющего растворителя B с получением указанного в заголовке продукта 6 (2,1 мг, выход 67,9 %).

МС m/z (ESI): 548,0 [M+1].

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 7,85-7,62 (m, 1H), 6,88 (br, 1H), 5,87-5,48 (m, 2H), 5,47-5,33 (m, 1H), 5,31-5,06 (m, 1H), 4,25-3,91 (m, 2H), 3,25 (br, 1H), 2,60-2,32 (m, 3H), 2,23 (t, 1H), 2,15-1,95 (m, 3H), 1,70-1,56 (m, 2H), 1,41-1,17 (m, 9H), 1,03 (s, 1H), 0,95-0,80 (m, 2H).

Пример 7

N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-1-гидроксициклобутан-1-карбоксамид 7

К 1b (3,0 мг, 5,64 мкмоль) добавляли 2 мл этанола и 0,4 мл N,N-диметилформамида, и смесь охлаждали до 0-5°C на ледяной водяной бане с последующим добавлением по каплям 0,3 мл N-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали, пока она не стала прозрачной. К реакционной смеси последовательно добавляли 1-гидроксициклобутанкарбоновую кислоту 7а (2,0 мг, 17,22 мкмоль, поставляемый PharmaBlock), 1-гидроксибензотриазол (2,3 мг, 17,0 мкмоль) и 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид гидрохлорид (3,2 мг, 16,7 мкмоль). После добавления реакционную смесь перемешивали при 0-5°C в течение 10 минут. Ледяную водяную баню удаляли, и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов и концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали с помощью тонкослойной хроматографии с системой проявляющего растворителя В с получением указанного в заголовке продукта 7 (2,5 мг, выход 83,1 %).

МС m/z (ESI): 534,0 [M+1].

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 8,28 (d, 1H), 7,75 (d, 1H), 7,29 (s, 1H), 6,51 (s, 1H), 6,12 (s, 1H), 5,59-5,51 (m, 1H), 5,41 (s, 2H), 5,20-5,01 (m, 2H), 3,27-3,17 (m, 1H), 3,15-3,05 (m, 1H), 2,71-2,63 (m, 1H), 2,37 (s, 3H), 2,12-2,05 (m, 1H), 2,03-1,94 (m, 2H), 1,92-1,78 (m, 4H), 1,50-1,42 (m, 1H), 0,90-0,83 (m, 4H).

Пример 8

1-(((S)-7-бензил-20-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3,6,9,12,15-пентаоксо-2,5,8,11,14-пентаазаикозил)окси)-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)циклопропан-1-карбоксамид 8

Стадия 1

Бензил 1-((2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)ацетамидо)метокси)циклопропан-1-карбоксилат 8c

Бензил 1-гидроксициклопропан-1-карбоксилат 8a (104 мг, 0,54 ммоль; полученный, как описано в патентной заявке "US2005/20645") и 2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)ацетамидо)метилацетат 8b (100 мг, 0,27 ммоль; полученный, как описано в патентной заявке "CN105829346A") добавляли в реакционную колбу и добавляли 5 мл тетрагидрофурана. Систему трижды продували аргоном и охлаждали смесь до 0-5°C на ледяной водяной бане с последующим добавлением трет-бутоксида калия (61 мг, 0,54 ммоль). Ледяную баню удаляли, и реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 10 минут с последующим добавлением 20 мл ледяной воды и экстракцией этилацетатом (5 мл × 2) и хлороформом (5 мл × 5). Органические фазы объединяли и концентрировали. Полученный остаток растворяли в 3 мл 1,4-диоксана с последующим добавлением 0,6 мл воды, бикарбоната натрия (27 мг, 0,32 ммоль) и 9-фторенилметилхлорформиата (70 мг, 0,27 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Добавляли 20 мл воды с последующей экстракцией этилацетатом (8 мл × 3). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия (20 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и полученный остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле с помощью системы проявляющего растворителя B с получением указанного в заголовке продукта 8c (100 мг, выход 73,6 %).

МС m/z (ESI): 501,0 [M+1].

Стадия 2

1-((2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)ацетамидо)метокси)циклопропан-1-карбоновая кислота 8d

8c (50 мг, 0,10 ммоль) растворяли в 3 мл смеси растворителей тетрагидрофурана и этилацетата (V:V = 2:1) и добавляли палладий на угле (25 мг, 10% нагрузка). Систему трижды продували водородом, и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционную смесь фильтровали через целит, а осадок на фильтре промывали тетрагидрофураном. Фильтрат концентрировали с получением указанного в заголовке продукта 8d (41 мг, выход 100 %).

МС m/z (ESI): 411,0 [M+1].

Стадия 3

(9H-флуорен-9-ил)метил(2-(((1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)аминокарбонил)циклопропокси)метил)амино)-2-оксоэтил)карбамат 8e

1b (7 мг, 0,013 ммоль) добавляли в реакционную колбу и добавляли 1 мл N,N-диметилформамида. Систему трижды продували аргоном и охлаждали смесь до 0-5°C на ледяной водяной бане с последующим добавлением капли триэтиламина, раствора 8d (7 мг, 0,017 ммоль) в 0,5 мл N,N-диметилформамида и 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорида (7 мг, 0,026 ммоль). Реакционную смесь перемешивали на ледяной бане в течение 35 мин. Добавляли 10 мл воды с последующей экстракцией этилацетатом (5 мл × 3). Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (10 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и полученный остаток очищали с помощью тонкослойной хроматографии с помощью системы проявляющего растворителя B с получением указанного в заголовке продукта 8e (8,5 мг, выход 78,0 %).

МС m/z (ESI): 828,0 [M+1].

Стадия 4

1-((2-аминоацетиламино)метокси)-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)циклопропан-1-карбоксамид 8f

8e (4 мг, 4,84 мкмоль) растворяли в 0,2 мл дихлорметана и добавляли 0,1 мл диэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов и концентрировали при пониженном давлении. Добавляли 2 мл толуола с последующим концентрированием при пониженном давлении; процедуры повторяли дважды. Остаток суспендировали с 3 мл н-гексана и удаляли верхний слой н-гексана; процедуры повторяли трижды. Суспензию концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке неочищенного продукта 8f (2,9 мг), который непосредственно использовали на следующей стадии без очистки.

МС m/z (ESI): 606,0 [M+1].

Стадия 5

1-(((S)-7-бензил-20-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3,6,9,12,15-пентаоксо-2,5,8,11,14-пентаазаикозил)окси)-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)циклопропан-1-карбоксамид 8

Неочищенный 8f (2,9 мг, 4,84 мкмоль) растворяли в 0,5 мл N,N-диметилформамида. Систему трижды продували аргоном, и раствор охлаждали до 0-5°C на ледяной водяной бане. Добавляли раствор (S)-2(-2-(-2-(6-(2,5-диоксо-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)ацетиламино)ацетиламино)-3-фенилпропионовой кислоты 8g (2,7 мг, 5,80 мкмоль, полученный, как описано в патентной заявке "EP2907824") в 0,3 мл N,N-диметилформамида с последующим добавлением 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорида (2,7 мг, 9,67 мкмоль). Реакционную смесь перемешивали на ледяной бане в течение 30 минут. Затем ледяную баню удаляли, и реакционную смесь нагревали до комнатной температуры, перемешивали в течение 15 минут и очищали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (условия разделения: хроматографическая колонка: XBridge Prep C18 OBD 5 мкм 19 × 250 мм; подвижная фаза: A - вода (10 ммоль NH₄OAc), B - ацетонитрил, градиентное элюирование, скорость потока: 18 мл/мин). Соответствующие фракции собирали и концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке продукта 8 (2 мг, выход 39,0 %).

МС m/z (ESI): 1060,0 [M+1].

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 9,01 (d, 1H), 8,77 (t, 1H), 8,21 (t, 1H), 8,08-7,92 (m, 2H), 7,73 (d, 1H), 7,28 (s, 1H), 7,24-7,07 (m, 4H), 6,98 (s, 1H), 6,50 (s, 1H), 5,61 (q, 1H), 5,40 (s, 2H), 5,32 (t, 1H), 5,12 (q, 2H), 4,62 (t, 1H), 4,52 (t, 1H), 4,40-4,32 (m, 1H), 3,73-3,47 (m, 8H), 3,16-3,04 (m, 2H), 2,89 (dd, 1H), 2,69-2,55 (m, 2H), 2,37-2,23 (m, 4H), 2,12-1,93 (m, 4H), 1,90-1,74 (m, 2H), 1,52-1,38 (m, 4H), 1,33-1,11 (m, 5H), 0,91-0,81 (m, 4H).

Пример 9

N-((2R,10S)-10-бензил-2-циклопропил-1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1,6,9,12,15-пентаоксо-3-окса-5,8,11,14-тетраазагексадекан-16-ил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамид 9-A

N-((2S,10S)-10-бензил-2-циклопропил-1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1,6,9,12,15-пентаоксо-3-окса-5,8,11,14-тетраазагексадекан-16-ил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамид 9-B

Стадия 1

Бензил 2-циклопропил-2-гидроксиацетат 9a

2a (1,3 г, 11,2 ммоль; полученный, как описано в патентной заявке "WO2013/106717") растворяли в 50 мл ацетонитрила и последовательно добавляли карбонат калия (6,18 г, 44,8 ммоль), бензилбромид (1,33 мл, 11,2 ммоль) и тетрабутиламмония иодид (413 мг, 1,1 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 48 часов и фильтровали через целит, и осадок на фильтре промывали этилацетатом (10 мл). Фильтраты объединяли и концентрировали при пониженном давлении, и полученный остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле с системой проявляющего растворителя C с получением указанного в заголовке продукта 9a (2 г, выход 86,9 %).

Стадия 2

Бензил 10-циклопропил-1-(9H-флуорен-9-ил)-3,6-диоксо-2,9-диокса-4,7-диазаундекан-11-оат 9b

9a (120,9 мг, 0,586 ммоль) и 8b (180 мг, 0,489 ммоль) добавляли в реакционную колбу и добавляли 4 мл тетрагидрофурана. Систему трижды продували аргоном и охлаждали реакционную смесь до 0-5°C на ледяной водяной бане с последующим добавлением трет-бутоксида калия (109 мг, 0,98 ммоль). Ледяную баню удаляли, и реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 40 минут с последующим добавлением 10 мл ледяной воды и экстракцией этилацетатом (20 мл × 2) и хлороформом (10 мл × 5). Органические фазы объединяли и концентрировали. Полученный остаток растворяли в 4 мл диоксана и добавляли 2 мл воды, бикарбонат натрия (49,2 мг, 0,586 ммоль) и 9-флуоренилметилхлорформиат (126 мг, 0,49 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Добавляли 20 мл воды с последующей экстракцией этилацетатом (10 мл × 3). Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (20 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле с системой проявляющего растворителя C с получением указанного в заголовке продукта 9b (48 мг, выход 19 %).

МС m/z (ESI): 515,0 [M+1].

Стадия 3

10-циклопропил-1-(9H-флуорен-9-ил)-3,6-диоксо-2,9-диокса-4,7-диазаундекан-11-овая кислота 9c

9b (20 мг, 0,038 ммоль) растворяли в 4,5 мл смеси растворителей тетрагидрофурана и этилацетата (V:V = 2:1) и добавляли палладий на угле (12 мг, 10% нагрузка, сухое вещество). Систему трижды продували водородом, и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционную смесь фильтровали через целит, а осадок на фильтре промывали этилацетатом. Фильтрат концентрировали с получением неочищенного указанного в заголовке продукта 9c (13 мг), который непосредственно использовали на следующей стадии без очистки.

МС m/z (ESI): 424,9 [M+1].

Стадия 4

(9H-флуорен-9-ил)метил(2-(((1-циклопропил-2-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-2-оксоэтокси)метил)амино)-2-оксоэтил)карбамат 9d

1b (10 мг, 18,8 мкмоль) добавляли в реакционную колбу и добавляли 1 мл N,N-диметилформамида. Систему трижды продували аргоном и смесь охлаждали до 0-5°C на ледяной водяной бане с последующим добавлением капли триэтиламина, неочищенного 9c (13 мг, 30,6 мкмоль) и 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорида (16,9 мг, 61,2 мкмоль). Реакционную смесь перемешивали на ледяной бане в течение 40 минут. Добавляли 10 мл воды с последующей экстракцией этилацетатом (10 мл × 3). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия (10 мл × 2), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали с помощью тонкослойной хроматографии с системой проявляющего растворителя В с получением указанного в заголовке продукта 9d (19 мг, выход 73,6 %).

МС m/z (ESI): 842,1 [M+1].

Стадия 5

2-((2-аминоацетамидо)метокси)-2-циклопропил-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)ацетамид 9e

9d (19 мг, 22,6 мкмоль) растворяли в 2 мл дихлорметана и добавляли 1 мл диэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов и концентрировали при пониженном давлении. Добавляли 1 мл толуола с последующим концентрированием при пониженном давлении; процедуры повторяли дважды. Остаток суспендировали с 3 мл н-гексана и оставляли стоять. Затем супернатант удаляли и твердое вещество сохраняли. Твердый остаток концентрировали при пониженном давлении и сушили с помощью масляного насоса с получением неочищенного указанного в заголовке продукта 9e (17 мг), который непосредственно использовали на следующей стадии без очистки.

МС m/z (ESI): 638,0 [М+18].

Стадия 6

N-((2R,10S)-10-бензил-2-циклопропил-1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1,6,9,12,15-пентаоксо-3-окса-5,8,11,14-тетраазагексадекан-16-ил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамид 9-A

N-((2S,10S)-10-бензил-2-циклопропил-1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1,6,9,12,15-пентаоксо-3-окса-5,8,11,14-тетраазагексадекан-16-ил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамид 9-B

Неочищенный 9e (13,9 мг, 22,4 мкмоль) растворяли в 0,6 мл N,N-диметилформамида. Систему трижды продували аргоном, и раствор охлаждали до 0-5°C на ледяной водяной бане. Добавляли раствор 8g (21,2 мг, 44,8 мкмоль) в 0,3 мл N,N-диметилформамида с последующим добавлением 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорида (18,5 мг, 67,3 мкмоль). Реакционную смесь перемешивали на ледяной бане в течение 10 минут. Затем ледяную баню удаляли и реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 часа с получением соединения 9. Реакционную смесь очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией (условия разделения: хроматографическая колонка: XBridge Prep C18 OBD 5 мкм 19×250 мм; подвижная фаза: А - вода (10 ммоль NH₄OAc): В - ацетонитрил, градиентное элюирование, скорость потока: 18 мл/мин). Соответствующие фракции собирали и концентрировали при пониженном давлении с получением указанных в заголовке продуктов (9-A: 2,4 мг, 9-B: 1,7 мг).

МС m/z (ESI): 1074,4 [M+1].

Соединение с единственной конфигурацией 9-А (меньшее время удерживания):

Анализ СВЭЖХ: время удерживания: 1,14 мин; чистота: 85 % (хроматографическая колонка: ACQUITY UPLC BEHC18 1,7 мкм 2,1 × 50 мм; подвижная фаза: A - вода (5 ммоль NH₄OAc), B - ацетонитрил).

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 8,60 (t, 1H), 8,51-8,49 (d, 1H), 8,32-8,24 (m, 1H), 8,13-8,02 (m, 2H), 8,02-7,96 (m, 1H), 7,82-7,75 (m, 1H), 7,31 (s, 1H), 7,26-7,15 (m, 4H), 6,99 (s, 1H), 6,55-6,48 (m, 1H), 5,65-5,54 (m, 1H), 5,41 (s, 2H), 5,35-5,15 (m, 3H), 4,74-4,62 (m, 1H), 4,54-4,40 (m, 2H), 3,76-3,64 (m, 4H), 3,62-3,48 (m, 2H), 3,20-3,07 (m, 2H), 3,04-2,94 (m, 1H), 2,80-2,62 (m, 1H), 2,45-2,30 (m, 3H), 2,25-2,15 (m, 2H), 2,04-2,15 (m, 2H), 1,93-1,78 (m, 2H), 1,52-1,39 (m, 3H), 1,34-1,12 (m, 5H), 0,87 (t, 3H), 0,64-0,38 (m, 4H).

Соединение с единственной конфигурацией 9-B (большее время удерживания):

Анализ СВЭЖХ: время удерживания: 1,16 мин; чистота: 89 % (хроматографическая колонка: ACQUITY UPLC BEHC18 1,7 мкм 2,1 × 50 мм; подвижная фаза: A - вода (5 ммоль NH₄OAc), B - ацетонитрил).

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 8,68-8,60 (m, 1H), 8,58-8,50 (m, 1H), 8,32-8,24 (m, 1H), 8,13-8,02 (m, 2H), 8,02-7,94 (m, 1H), 7,82-7,75 (m, 1H), 7,31 (s, 1H), 7,26-7,13 (m, 3H), 6,99 (s, 1H), 6,55-6,48 (m, 1H), 5,60-5,50 (m, 1H), 5,41 (s, 2H), 5,35-5,15 (m, 2H), 4,78-4,68 (m, 1H), 4,60-4,40 (m, 2H), 3,76-3,58 (m, 4H), 3,58-3,48 (m, 1H), 3,20-3,10 (m, 2H), 3,08-2,97 (m, 2H), 2,80-2,72 (m, 2H), 2,45-2,30 (m, 3H), 2,25-2,13 (m, 2H), 2,13-2,04 (m 2H), 2,03-1,94 (m, 2H), 1,91-1,78 (m, 2H), 1,52-1,39 (m, 3H), 1,34-1,12 (m, 4H), 0,91-0,79 (m, 3H), 0,53-0,34 (m, 4H).

III. Получение конъюгатов ADC антитела к клаудину 18.2

Анализ нагрузки лекарственным средством исходного раствора ADC

A. Способ УФ-ВЭЖХ

Значение n DAR рассчитывали с помощью УФ-ВЭЖХ для некоторых примеров ADC согласно настоящему изобретению, в частности, следующим образом:

1. Метод определения:

Кюветы, содержащие буферный раствор сукцината натрия, помещали в эталонную ячейку и ячейку образца, и абсорбцию исходного растворителя вычитали. Затем в ячейку образца помещали кювету, содержащую тестовый раствор, и определяли значения абсорбции при 280 нм и 370 нм.

2. Расчет для результатов: нагрузочную способность исходного раствора ADC определяли с помощью ультрафиолетовой спектрофотометрии (прибор: ультрафиолетовый спектрофотометр Thermo nanodrop2000), исходя из принципа, что суммарная абсорбция исходного раствора ADC при определенной длине волны представляет собой сумму значений абсорбций лекарственного средства и моноклонального антитела при этой длине волны, а именно:

(1) A_{280 нм=} ε_mab-280bC_mab + ε_{декарственное средство-280}bC_{лекарственное средство}

ε_{лекарственное средство-280}: средний молярный коэффициент затухания лекарственного средства при 280 нм составляет 5100;

C_{лекарственное средство}: концентрация лекарственнного средства;

ε_mab-280: средний молярный коэффициент затухания исходного раствора моноклонального антитела при 280 нм составляет 214600;

C_mab: концентрация исходного раствора моноклонального антитела;

b: оптическая длина пути составляет 1 см.

Аналогично, уравнение для общей абсорбции образца при 370 нм может быть представлено как:

(2) A_{370 нм=} ε_mab-370bC_mab + ε_{лекарственное средство-370}bC_{лекарственное средство}

ε_{лекарственное средство-370}: средний молярный коэффициент затухания лекарственного средства при 370 нм составляет 19000;

C_{лекарственное средство}: концентрация лекарственнного средства;

ε_mab-370: коэффициент затухания исходного раствора моноклонального антитела при 370 нм составляет 0;

C_mab: концентрация исходного раствора моноклонального антитела;

b: оптическая длина пути составляет 1 см.

Нагрузка лекарственным средством может быть рассчитана с использованием как уравнения (1), так и уравнения (2), а также коэффициентов затухания моноклонального антитела и лекарственного средства при обеих длинах волн и их концентрациях.

Нагрузка лекарственным средством = C_{лекарственное средство}/C_mab.

B. Метод ОФ-ВЭЖХ (обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография)

Значение DAR рассчитывали с помощью ОФ-ВЭЖХ (обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография) для некоторых примеров ADC по настоящему изобретению, в частности, следующим образом:

1. Метод определения:

Голое антитело (неконъюгированное антитело) и тестируемый образец ADC (в концентрации 1 мг/мл) восстанавливали 4 мкл ДДТ (sigma) на водяной бане при 37°C в течение 1 часа, а затем переносили во вставку. Анализ проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе Agilent 1200 с Agilent PLRP-S 1000A 8 мкм 4,6 × 250 мм, выбранной в качестве хроматографической колонки, температурой колонки 80°C, детектором DAD (детектор с диодной матрицей) при длине волны 280 нм, скоростью потока 1 мл/мин и объемом введения 40 мкл. Сравнение проводили между спектрами образца и голого антитела для идентификации локализаций легкой цепи и тяжелой цепи, а затем проводили интеграцию на спектре тестового образца для вычисления значения n DAR.

2. Получение растворов

1) 0,25 М раствор DTT (дитиотреитол):

Пример получения: 5,78 мг DTT взвешивали в 150 мкл очищенной воды и полностью растворяли с получением 0,25 М раствора DTT, который затем хранили при минус 20°C.

2) Подвижная фаза А (0,1% ТФУ (трифторуксусная кислота) в воде):

Пример получения: 1000 мл очищенной воды отмеряли с помощью градуированного цилиндра и добавляли 1 мл ТФУ (sigma). Раствор хорошо перемешивали перед использованием и хранили при 2-8°C в течение 14 дней.

3) Подвижная фаза B (0,1% ТФУ в ацетонитриле):

Пример получения: 1000 мл ацетонитрила отмеряли с помощью градуированного цилиндра и добавляли 1 мл ТФУ. Раствор хорошо перемешивали перед использованием и хранили при 2-8°C в течение 14 дней.

3. Анализ данных

Сравнение проводили между спектрами образца и голого антитела для идентификации локализаций легкой цепи и тяжелой цепи, а затем проводили интеграцию на спектре тестового образца для вычисления значения DAR (n).

Формула расчета выглядит так:

Наименование Количество связанных лекарственных средств LC 0 LC+1 2 HC 0 HC+1 2 HC+2 4 HC+3 6

Общая площадь пика LC = площадь пика LC + площадь пика LC+1

Общая площадь пика HC = площадь пика HC + площадь пика HC+1 + площадь пика HC+2 + площадь пика HC+3

LC DAR = Σ(количество связанных лекарственных средств × процентная площадь пика)/общая площадь пика LC

HC DAR = Σ(количество связанных лекарственных средств × процентная площадь пика)/общая площадь пика HC

DAR = LC DAR + HC DAR.

Примеры получения конъюгатов антитела к клаудину 18.2 и лекарственного средства

Примеры 3-1 и 3-2: ADC-1 и ADC-2

К буферу PBS, содержащему антитело h1902-5 (0,05 M водный буфер PBS при рН 6,5; 10,0 мг/мл, 320,0 мл, 21,62 мкмоль), добавляли при 37°C водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP) (10 мМ, 11,03 мл, 110,3 мкмоль). Реакционную смесь встряхивали на водяной бане-шейкере при 37°С в течение 3 часов перед прекращением реакции. Реакционную смесь охлаждали до 25°C на водяной бане.

Соединение 9-A (350 мг, 303 мкмоль) растворяли в 13,2 мл ацетонитрила и 6,6 мл ДМСО (диметилсульфоксид), и полученный раствор добавляли к указанной выше реакционной смеси, которую охлаждали до 25°С, а затем встряхивали на водяной бане-шейкере при 25°С в течение 3 часов перед прекращением реакции.

Полученную реакционную смесь очищали с помощью мембраны для ультрафильтрации последовательно с 5 л буфера PBS (50 мМ, pH = 6,5, 4% ацетонитрил, 2% ДМСО) и 5 л буфера янтарной кислоты (10 мМ, pH = 5,3) для удаления малых молекул. Добавляли сахарозу в концентрации 60 мг/мл и твин-20 в концентрации 0,2 мг/мл с получением конечного продукта примера ADC-1 конъюгата антитела и лекарственного средства общей формулы h1902-5-9-A (10 мМ буфера янтарной кислоты при рН 5,3; 10 мг/мл, 2,626 г). Выход: 81,81 %.

Среднее значение, рассчитанное методом УФ-ВЭЖХ: n = 6,8.

Используя способы, описанные выше, продукт примера ADC-2 конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы h1901-11-9-A может быть получен с использованием соединения 9-A и антитела h1901-11 вместо h1902-5, причем значение n DAR равно 7,1.

Пример 3-3. ADC-3

К водному буферу PBS антитела h1901-11 (0,05 M водный буфер PBS при рН 6,5; 10,0 мг/мл, 1 мл, 67,5 нмоль) добавляли при 37°C подготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP) (10 мМ, 10,1 мкл, 101 нмоль). Реакционную смесь встряхивали на водяной бане-шейкере при 37°С в течение 3 часов перед прекращением реакции. Реакционную смесь охлаждали до 25°C на водяной бане.

Соединение 9-A (0,58 мг, 540 нмоль) растворяли в 34 мкл ДМСО, и полученный раствор добавляли к указанной выше реакционной смеси, которую затем встряхивали на водяной бане-шейкере при 25°С в течение 3 часов перед прекращением реакции. Реакционную смесь обессоливали и очищали через колонку с гелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М буфер PBS при рН 6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением продукта примера ADC-3 конъюгата антитела и лекарственного средства h1901-11-9-A в буфере PBS (0,72 мг/мл, 11,2 мл), который затем хранили при 4°C. Среднее значение, рассчитанное методом ОФ-ВЭЖХ: n = 2,51.

Пример 3-4. ADC-4

К водному буферу PBS антитела h1901-11 (0,05 M водный буфер PBS при рН 6,5; 10,0 мг/мл, 1 мл, 67,5 нмоль) добавляли при 37°C подготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP) (10 мМ, 16,9 мкл, 169 нмоль). Реакционную смесь встряхивали на водяной бане-шейкере при 37°С в течение 3 часов перед прекращением реакции. Реакционную смесь охлаждали до 25°C на водяной бане.

Соединение 9-A (0,73 мг, 680 нмоль) растворяли в 43 мкл ДМСО, и полученный раствор добавляли к указанной выше реакционной смеси, которую затем встряхивали на водяной бане-шейкере при 25°С в течение 3 часов перед прекращением реакции. Реакционную смесь обессоливали и очищали через колонку с гелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М буфер PBS при рН 6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением продукта примера ADC-4 конъюгата антитела и лекарственного средства h1901-11-9-A в буфере PBS (0,62 мг/мл, 12,5 мл), который затем хранили при 4°C. Среднее значение, рассчитанное методом ОФ-ВЭЖХ: n = 4,06.

Пример 3-5. ADC-5

К водному буферу PBS антитела h1901-11 (0,05 M водный буфер PBS при рН 6,5; 10,0 мг/мл, 1 мл, 67,5 нмоль) добавляли при 37°C подготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP) (10 мМ, 35,8 мкл, 358 нмоль). Реакционную смесь встряхивали на водяной бане-шейкере при 37°С в течение 3 часов перед прекращением реакции. Реакционную смесь охлаждали до 25°C на водяной бане.

Соединение 9-A (1,09 мг, 1015 нмоль) растворяли в 64 мкл ДМСО, и полученный раствор добавляли к указанной выше реакционной смеси, которую затем встряхивали на водяной бане-шейкере при 25°С в течение 3 часов перед прекращением реакции. Реакционную смесь обессоливали и очищали через колонку с гелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М буфер PBS при рН 6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением продукта примера ADC-5 конъюгата антитела и лекарственного средства h1901-11-9-A в буфере PBS (0,54 мг/мл, 12,5 мл), который затем хранили при 4°C. Среднее значение, рассчитанное методом ОФ-ВЭЖХ: n = 6,8.

Пример 3-6. ADC-6

К водному буферу PBS антитела h1902-5 (0,05 M водный буфер PBS при рН 6,5; 10,0 мг/мл, 1,08 мл, 72,9 нмоль) добавляли при 37°C подготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP) (10 мМ, 10,9 мкл, 109 нмоль). Реакционную смесь встряхивали на водяной бане-шейкере при 37°С в течение 3 часов перед прекращением реакции. Реакционную смесь охлаждали до 25°C на водяной бане.

Соединение 9-A (0,63 мг, 587 нмоль) растворяли в 40 мкл ДМСО, и полученный раствор добавляли к указанной выше реакционной смеси, которую затем встряхивали на водяной бане-шейкере при 25°С в течение 3 часов перед прекращением реакции. Реакционную смесь обессоливали и очищали через колонку с гелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М буфер PBS при рН 6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением продукта примера ADC-6 h1902-5-9-A в буфере PBS (0,7 мг/мл, 13,0 мл), который затем хранили при 4°C. Среднее значение, рассчитанное методом ОФ-ВЭЖХ: n = 2,69.

Пример 3-7. ADC-7

К водному буферу PBS антитела h1902-5 (0,05 M водный буфер PBS при рН 6,5; 10,0 мг/мл, 1,08 мл, 72,9 нмоль) добавляли при 37°C подготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP) (10 мМ, 18,3 мкл, 183 нмоль). Реакционную смесь встряхивали на водяной бане-шейкере при 37°С в течение 3 часов перед прекращением реакции. Реакционную смесь охлаждали до 25°C на водяной бане.

Соединение 9-A (0,79 мг, 736 нмоль) растворяли в 50 мкл ДМСО, и полученный раствор добавляли к указанной выше реакционной смеси, которую затем встряхивали на водяной бане-шейкере при 25°С в течение 3 часов перед прекращением реакции. Реакционную смесь обессоливали и очищали через колонку с гелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М буфер PBS при рН 6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением продукта примера ADC-7 h1902-5-9-A в буфере PBS (0,6 мг/мл, 14,0 мл), который затем хранили при 4°C. Среднее значение, рассчитанное методом ОФ-ВЭЖХ: n = 4,25.

Пример 3-8. ADC-8

К водному буферу PBS антитела h1902-5 (0,05 M водный буфер PBS при рН 6,5; 10,0 мг/мл, 1,08 мл, 72,9 нмоль) добавляли при 37°C подготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP) (10 мМ, 38,7 мкл, 387 нмоль). Реакционную смесь встряхивали на водяной бане-шейкере при 37°С в течение 3 часов перед прекращением реакции. Реакционную смесь охлаждали до 25°C на водяной бане.

Соединение 9-A (1,18 мг, 1099 нмоль) растворяли в 70 мкл ДМСО, и полученный раствор добавляли к указанной выше реакционной смеси, которую затем встряхивали на водяной бане-шейкере при 25°С в течение 3 часов перед прекращением реакции. Реакционную смесь обессоливали и очищали через колонку с гелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М буфер PBS при рН 6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением продукта примера ADC-8 h1902-5-9-A в буфере PBS (0,56 мг/мл, 14,2 мл), который затем хранили при 4°C. Среднее значение, рассчитанное методом ОФ-ВЭЖХ: n = 7,01.

Пример 3-9. ADC-9

К буферу гистидин-ацетат-трис/ЭДТА (10 мМ буфер гистидин-ацетат-трис при рН 7,2, 2,5 мМ буфер ЭДТА; 20,6 г/л, 6,49 л, 0,91 ммоль), содержащему антитело h1902-5, добавляли при 12°C подготовленный гистидиновый буфер TCEP (10 мМ буфер гистидин; 1,717 мМ, 1,16 л, 1,99 ммоль). Реакционную смесь перемешивали на водяной бане при 12°C в течение 2 часов, после чего реакцию останавливали с получением раствора промежуточного соединения I.

Соединение 9-A (4,72 г, 4,39 ммоль) растворяли в 0,38 л ДМСО с получением раствора соединения 9-A в ДМСО. К вышеуказанному раствору промежуточного соединения I добавляли 0,38 л ДМСО, а затем добавляли вышеуказанный раствор соединения 9-A в ДМСО. Реакционную смесь перемешивали на водяной бане при 12°C в течение 1 часа, после чего реакцию останавливали.

Реакционную смесь очищали с помощью катионной хроматографической колонки Capto S Impact, которую промывали 9 объемами колонки с 0,05 М ацетатным буфером, содержащим 10% (об./об.) ДМСО (pH = 5,0), и 6 объемами колонки с 0,05 М ацетатным буфером (pH = 5,0), с последующим элюированием 0,05 М уксусной кислотой и 0,30 М буфером хлорида натрия (pH = 5,5) для удаления свободных токсинов и остаточного растворителя из реакционной смеси. Катионный элюат подвергали 7-кратной объемной равнообъемной ультрафильтрации (в качестве мембраны для ультрафильтрации использовали полицеллюлозную мембрану 30 KD) при 22°C с получением продукта примера ADC-9 h1902-5-9-A. Среднее значение, рассчитанное с помощью ОФ-ВЭЖХ: n = 4,1.

Нагрузка лекарственным средством, полученная в этом примере, является неограничивающим примером, и специалист в данной области техники может получить конъюгаты с различными значениями DAR (от 1 до 10, предпочтительно от 1 до 8 и более предпочтительно от 2 до 8 и от 2 до 7) путем регулировки условий реакции и реагентов.

Биологическая оценка

Тестовый пример 1. Анализ связывания с помощью ELISA на клеточном уровне

Для тестирования связывающих свойств антител к клаудину 18.2 использовали клеточный анализ ELISA. Стабильно трансфицированные клетки NUGC4, экспрессирующие клаудин 18.2, культивировали в 96-луночном клеточном планшете. При росте на уровне 90% плотности клетки иммобилизовали 4% параформальдегидом в течение 1 часа. Планшет промывали 3 раза буфером PBST (pH 7,4 PBS, содержащим 0,05% твин-20) и добавляли блокирующий буфер на основе разбавленного PBS 5% обезжиренного молока (порошкообразное обезжиренное молоко от Brightdairy) при 200 мкл/лунку. Планшет инкубировали в инкубаторе при 37°C в течение 2,5 часов или оставляли стоять при 4°C в течение ночи (16-18 ч) для блокирования. После блокирования блокирующий буфер удаляли. Планшет трижды промывали буфером PBST, а затем добавляли тестируемое антитело, которое разбавляли разбавителем образца (pH 7,4 PBS, содержащим 1% молоко) до различных концентраций, при 50 мкл/лунку. Планшет инкубировали в инкубаторе при 37°C в течение 2 часов. После инкубации планшет промывали 5 раз PBST и добавляли меченное HRP (хреносодержащая пероксидаза) вторичное антитело козы к человеку, (Jackson Immuno Research, 109-035-003), которое разбавляли разбавителем образца, при 100 мкл/лунку. Планшет инкубировали при 37°C в течение 1 часа. Планшет промывали 6 раз PBST, а затем добавляли хромогенный TMB (тетраметилбензидиновый) субстрат (KPL, 52-00-03) при 50 мкл/лунку. Планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 10-15 минут, и реакцию останавливали добавлением 1 M H₂SO₄ при 50 мкл/лунку. Абсорбцию при 450 нм считывали с помощью считывающего устройства для микропланшетов MD Versa Max TM и рассчитывали значение EC₅₀ (полумаксимальная эффективная концентрация) связывания антитела к клаудину 18.2 с клаудином 18.2.

Таблица 10. Связывающая активность гибридомных антител Антитело IMAB362 ch1901 ch1902 Eмакс 1,175 1,399 1,272 EC₅₀ (нМ) 0,108 0,098 0,074

Таблица 11. Связывающая активность гуманизированных антител mAb1901 Антитело IMAB362 h1901-2 h1901-3 h1901-4 h1901-6 Eмакс 1,115 1,039 1,1055 0,986 0,937 EC₅₀ (нМ) 0,086 0,076 0,22 0,201 0,091 Антитело h1901-7 h1901-8 h1901-11 h1901-12 Eмакс 0,921 1,047 1,44 1,22 EC₅₀ (нМ) 0,166 0,091 0,076 0,116

Таблица 12. Связывающая активность гуманизированных антител mAb1902 Антитело IMAB362 h1902-1 h1902-2 h1902-3 h1902-4 h1902-5 Eмакс 0,88 0,87 0,88 0,84 0,82 0,90 EC₅₀ (нМ) 0,187 0,113 0,107 0,175 0,087 0,098 Антитело h1902-6 h1902-7 h1902-8 h1902-9 h1902-10 Eмакс 0,78 0,75 0,89 0,75 0,89 EC₅₀ (нМ) 0,141 0,121 0,132 0,137 0,133

Тестовый пример 2. Анализ связывания на клеточном уровне антител

Стабильно трансфицированные клетки NUGC4, экспрессирующие клаудин-18.2, суспендировали в буфере FACS (2% фетальная бычья сыворотка (Gibco, 10099141), pH 7,4 PBS (Sigma, P4417-100TAB)) с получением суспензии 1×10⁶ клеток/мл, которую затем добавляли к 96-луночному круглодонному планшету (Corning, 3795) при 100 мкл/лунку. После центрифугирования и удаления супернатанта, тестируемое антитело к клаудину 18.2, которое разбавляли буфером FACS до различных концентраций, добавляли при 50 мкл/лунку. Планшет инкубировали в темноте в холодильнике при 4°C в течение 1 часа. Планшет трижды промывали буфером FACS путем центрифугирования при 300 g и добавляли антитела козы к IgG человека Alexa Fluor 488 (H+L) (Invitrogen, A-11013) в рабочей концентрации. Планшет инкубировали в темноте в холодильнике при 4°C в течение 40 минут. Планшет трижды промывали буфером FACS путем центрифугирования при 300 g и тестировали на проточном цитометре BD FACS CantoII на геометрическую среднюю интенсивность флуоресценции. Рассчитывали значение EC₅₀ связывания антитела к клаудину 18.2 со стабильно трансфицированными клетками NUGC4, экспрессирующими клаудин 18.2. Результаты показаны на Фиг. 1.

Тестовый пример 3. Анализ эндоцитоза антител

Тестируемое антитело к клаудину 18.2, предварительно меченное DyLight 488 NHS Ester (thermofisher, 46403), добавляли к 1×10⁶/мл стабильно трансфицированных клеток NUGC4, экспрессирующих клаудин 18.2, в конечной концентрации 5 мкг/мл. Смесь инкубировали в темноте на льду в течение 1 часа и трижды промывали предварительно охлажденным буфером FACS (pH 7,4 PBS, 2% фетальная бычья сыворотка) путем центрифугирования. После удаления супернатанта остаток добавляли к предварительно нагретой полной среде с последующей инкубацией в клеточном инкубаторе при 37°C с 5% CO₂. Клетки извлекали через 0, 0,5, 1, 2 и 4 часа и хранили в темноте на льду. После того, как все образцы собирали, их центрифугировали при 300 g при низкой температуре и супернатанты удаляли. Добавляли элюирующий буфер (pH 1,7 0,05 М глицин, 0,1 М хлорид натрия), а затем смеси инкубировали при комнатной температуре в течение 7 минут, промывали один раз буфером FACS путем центрифугирования при 300 g и тестировали на проточном цитометре BD FACS CantoII на геометрическую среднюю интенсивность флуоресценции. Рассчитывали эффективность эндоцитоза антитела к клаудину 18.2 стабильно трансфицированными клетками NUGC4, экспрессирующими клаудин 18.2. Результаты (см. фиг. 2) показывают, что гуманизированные антитела обладают хорошей эффективностью эндоцитоза.

Тестовый пример 4. Анализ аффинности антител на основе проточной цитометрии

В день эксперимента клетки HEK293/hClaudin18.2 собирали в 96-луночный планшет с U-образным дном по 1-2×10⁵ клеток на лунку. Добавляли человеческое антитело к клаудину 18.2, которое было 2× разбавлено последовательно (12 точек концентрации) от начальной концентрации 5 мкг/мл, и планшет инкубировали при 4°C в течение 1 часа. IMAB362 использовали в качестве положительного контроля, и также устанавливали отрицательный контроль без антитела. Антитело удаляли центрифугированием и добавляли FITC (флуоресцеин изотиоцианат)-меченное антитело к Fc IgG человека (200×) при 100 мкл/лунку. Планшет инкубировали в темноте при 4°C в течение 30 минут и дважды промывали PBS + 2% FBS перед анализом методом проточной цитометрии. BD FACS CantoII запускали и предварительно нагревали, а затем запускали программное обеспечение BD FACSDiva, чтобы начать новый эксперимент. Тестировали образец отрицательного контроля HEK293/hClaudin18.2, и напряжения FSC и SSC корректировали до соответствующих значений и сохраняли. Контрольную пробу B и стандартну. кривая 1 тестировали в соответствии с инструкциями для набора Quantum™ FITC-5 MESF Kit, и напряжение FITC корректировали до соответствующего значения и сохраняли. Образцы в 96-луночном планшете с U-образным дном тестировали при сохраненном напряжении и записывали данные. Экспериментальные данные анализировали с использованием программного обеспечения Flowjo для получения геометрического (Geo) среднего, и стандартную кривую MESF (молекулы эквивалентного растворимого флуорохрома)-геометрическое среднее подгоняли в соответствии с инструкциями для набора Quantum™ FITC-5 MESF Kit. Молярную концентрацию человеческого антитела к клаудину 18.2, связанного с клетками HEK293/hClaudin18.2, и концентрацию свободного антитела рассчитывали в соответствии со значением флуоресценции концентрации FITC-антитела к Fc IgG человека, а Bmax и константу диссоциации KD антитела рассчитывали с помощью графиков Скэтчарда. Результаты представлены в таблице 13.

Таблица 13. Аффинность гуманизированных антител на клеточном уровне Антитело IMAB362 h1901-11 h1902-5 KD (нM) 10,2 6,8 1,64

Тестовый пример 5. Оценка эффекта ADCC антител

Различные клетки NUGC4 (с высокой, умеренной и низкой экспрессией клаудина 18.2) расщепляли, центрифугировали при 1000 об/мин, ресуспендировали и подсчитывали. Клетки ресуспендировали при плотности 3×10⁵ клеток/мл в RPMI 1640 без фенолового красного (Gibco, 11835-030) с добавлением 10% FBS (новозеландская эмбриональная бычья сыворотка со сверхнизким IgG, Gibco, 1921005PJ). 25 мкл клеток добавляли в каждую лунку в 96-луночном планшете (Corning, 3903) (7500 клеток/лунку). Антитело разбавляли в среде без фенолового красного с получением 3× разбавления антитела, которое затем добавляли к планшету с клетками при 25 мкл/лунку. Планшет инкубировали в инкубаторе при 37°C с 5% CO₂ в течение 0,5 часа.

Эффекторные клетки (клетки FcrR3A-V158-NFAT-RE-Jurkat) собирали, центрифугировали при 1000 об/мин, ресуспендировали и подсчитывали. Клетки ресуспендировали при плотности 3×10⁶ клеток/мл в RPMI 1640 без фенолового красного с добавлением 10% FBS (новозеландская фетальная бычья сыворотка со сверхнизким IgG), и в каждую лунку планшета добавляли 25 мкл клеток (7,5×10⁴ клеток/лунку). Планшет инкубировали в инкубаторе при 37°C с 5% CO₂ в течение 6 часов.

75 мкл Bright-Glo (Promega, E2610) добавляли в каждую лунку планшета, и определяли химическую люминесценцию с помощью считывающего устройства для микропланшетов (PerkinElmer, VITOR3).

Результаты (см. таблицу 14 и фиг. 3A-3C) показывают, что оба антитела h1901-11 и h1902-5 демонстрируют высокую активность ADCC в клетках NUGC4 с низкой (фиг. 3A), умеренной (фиг. 3B) и высокой (фиг. 3C) экспрессией клаудина 18.2.

Таблица 14. Эффект ADCC антител в клетках NUGC4 с различными уровнями экспрессии клаудина 18.2
Единица IC₅₀ (концентрация полумаксимального ингибирования, нг/мл) Уровень экспрессии клаудина 18.2 h1901-11 h1902-5 IMAB362 Низкая экспрессия 22,42 35,46 183,4 Умеренная экспрессия 15,35 30,00 210,4 Высокая экспрессия 26,17 32,16 132,6

Тестовый пример 6. Ингибирование in vitro пролиферации опухолевых клеток с помощью соединений

A. Цель

Этот эксперимент предназначен для тестирования ингибирующей активности фармацевтических соединений по настоящему изобретению в отношении пролиферации in vitro клеток U87MG (клетки глиомы, Cell Bank, Chinese Academy of Sciences, номер по каталогу TCHu138) и опухолевых клеток SK-BR-3 (клетки рака молочной железы человека, ATCC, номер по каталогу HTB-30). Клетки обрабатывали in vitro соединением в различных концентрациях. Через 6 дней культивирования пролиферацию клеток тестировали с использованием реагентов CTG (CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay, Promega, номер по каталогу G7573) и оценивали активность соединения in vitro в соответствии со значением IC₅₀.

B. Способ

Способ тестирования ингибирования пролиферации in vitro клеток U87MG описан ниже в качестве примера способа анализа ингибирующей активности соединений по настоящему изобретению в отношении пролиферации in vitro опухолевых клеток. Способ также применим, но не ограничивается этим, к тестированиям на ингибирующую активность в отношении пролиферации in vitro других опухолевых клеток.

1. Культура клеток: Клетки U87MG и SK-BR-3 культивировали в среде EMEM (GE, номер по каталогу SH30024.01), содержащей 10% FBS, и среде McCoy's 5A (Gibco, номер по каталогу 16600-108), содержащей 10% FBS, соответственно.

2. Получение клеток. Клетки U87MG и SK-BR-3, растущие в логарифмической фазе, промывали один раз PBS (фосфатным буфером, Shanghai BasalMedia Technologies Co., Ltd.), а затем расщепляли 2-3 мл трипсина (0,25% трипсин-ЭДТА (1×), Gibico, Life Technologies) в течение 2-3 минут. После полного расщепления клеток добавляли 10-15 мл среды для культивирования клеток для элюирования расщепленных клеток. Смеси центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 мин, и супернатанты отбрасывали. Затем клетки ресуспендировали в 10-20 мл среды для культивирования клеток с получением одноклеточных суспензий.

3. Выращивание клеток. Одноклеточные суспензии U87MG и SK-BR-3 хорошо перемешивали и доводили с помощью среды для культивирования клеток до плотности клеток 2,75×10³ клеток/ мл и 8,25×10³ клеток/мл, соответственно. Все отрегулированные клеточные суспензии хорошо перемешивали и добавляли в 96-луночные планшеты для культивирования клеток при 180 мкл/лунку. В каждую из периферийных лунок 96-луночных планшетов добавляли только 200 мкл среды. Планшет инкубировали в инкубаторе в течение 24 часов (37°C, 5% CO₂).

4. Получение соединений. Соединение растворяли в ДМСО (диметилсульфоксид, Shanghai Titan Scientific Co., Ltd.) для получения исходного раствора при начальной концентрации 10 мМ.

Низкомолекулярные соединения получали при начальной концентрации 500 нМ следующим образом.

Различные тестовые образцы в концентрации 100 мкМ (30 мкл) добавляли в первый вертикальный ряд 96-луночного планшета с U-образным дном, и 20 мкл ДМСО добавляли в каждую лунку второго вертикального ряда и по одиннадцатый вертикальный ряд. Образцы в первом вертикальном ряду (10 мкл) добавляли к 20 мкл ДМСО во втором вертикальном ряду, и смеси хорошо перемешивали. Смеси (10 мкл) добавляли в третий вертикальный ряд и так далее до десятого вертикального ряда. Лекарственные средства в планшете (5 мкл на лунку) переносили в среду EMEM (95 мкл) и смеси хорошо перемешивали для последующего использования.

ADC получали при начальной концентрации 10 нМ или 500 нМ следующим образом.

Различные тестовые образцы в концентрации 100 нМ или 5 мкМ (100 мкл) добавляли в первый вертикальный ряд 96-луночного планшета и 100 мкл PBS добавляли в каждую лунку второго вертикального ряда и по одиннадцатый вертикальный ряд. Образцы в первом вертикальном ряду (50 мкл) добавляли к 100 мкл PBS во втором вертикальном ряду и смеси хорошо перемешивали. Смеси (50 мкл) добавляли в третий вертикальный ряд и так далее, 3-кратным разведением, до десятого вертикального ряда.

5. Добавление образца. Тестовые образцы, приготовленные в различных концентрациях (20 мкл), добавляли в планшет для культур, с двумя дублирующими лунками, установленными для каждого образца. Планшет инкубировали в инкубаторе в течение 6 дней (37°C, 5% CO₂).

6. Развитие цвета. Извлекали 96-луночный планшет для культивирования клеток и добавляли 90 мкл раствора CTG в каждую лунку с последующей 10-минутной инкубацией при комнатной температуре.

7. Считывание планшета. 96-луночный планшет для культивирования клеток извлекали и тестировали на хемилюминесценцию в считывающем устройстве для микропланшетов (BMG labtech, PHERAstar FS).

C. Анализ данных

Данные обрабатывали и анализировали с помощью Microsoft Excel и Graphpad Prism 5. Результаты, полученные согласно этому примеру, показаны в таблице ниже.

Таблица 15. Значения IC₅₀ низкомолекулярных фрагментов согласно настоящему изобретению в ингибировании пролиферации in vitro клеток SK-BR-3 и клеток U87 Пример соединения IC₅₀ (нM) SK-BR-3 U87 Пример 1 0,12 0,23 Пример 2
2-B с меньшим временем удерживания 0,33 0,86 Пример 2
2-B с большим временем удерживания 8,11 2,31 Пример 3
Меньшее время удерживания 0,36 0,83 Пример 3
Большее время удерживания 1,67 2,98 Пример 4 1,9 / Пример 5 / 4,81 Пример 6 / 1,83 Пример 7 / 1,95

Заключение: Низкомолекулярные фрагменты по настоящему изобретению обладают значительной ингибирующей активностью в отношении пролиферации клеток SK-BR-3 и клеток U87, а хиральные центры оказывают определенное влияние на ингибирующую активность соединений.

Тестовый пример 7: Анализы жизнеспособности клеток для молекул ADC

Анализы жизнеспособности клеток на основе люминесценции CellTiter-Glo использовали для тестирования молекул ADC на эффекты уничтожения in vitro в отношении штамма клеток рака желудка человека в этом эксперименте. В день 1 клетки NUGC4 с низкой, умеренной и высокой экспрессией клаудина 18.2 собирали, доводили до плотности 2,5×10⁴/мл и добавляли в 96-луночный белый прозрачный планшет при 90 мкл/лунку, с приблизительно 2500 клетками на лунку. Клетки культивировали в течение ночи в инкубаторе при 37°C с 5% CO₂. На день 2 образцы 4× разбавляли серийно от начальной концентрации 5 мкМ в 96-луночном планшете с U-образным дном для получения 9 точек концентрации, и разбавленные образцы добавляли в планшет с клетками при 10 мкл/лунку. Клетки культивировали при 37°С в 5% CO₂ в течение 6 дней. На день 8 планшет для культивирования клеток извлекали и добавляли реагент Cell Titer-Glo при 50 мкл/лунку. Планшет оставляли при комнатной температуре на 2-3 мин и считывали на планшет-ридере PHERAstar FS значения флуоресценции. Анализ данных выполняли с использованием программного обеспечения GraphPad Prism. См. таблицу 16.

Таблица 16. Эффекты уничтожения in vitro молекул ADC по настоящему изобретению в отношении клеток ADC Клетки NUGC4 с низкой экспрессией клаудина 18.2 Клетки NUGC4 с умеренной экспрессией клаудина 18.2 Клетки NUGC4 с высокой экспрессией клаудина 18.2 EC₅₀ (нМ) Eмакс (%) EC₅₀ (нМ) Eмакс (%) EC₅₀ (нМ) Eмакс (%) ADC-1 126,8 66,7 23,6 82,1 1,3 91,5 ADC-2 109,0 69,8 16,8 82,3 1,9 91,1 ADC-3 более 500 49,0 94 78,7 ADC-4 299 61,03 12 84,97 ADC-5 142 69,91 3,5 95,89 ADC-6 более 500 45,22 11 78,00 ADC-7 284 61,09 3,9 88,51 ADC-8 154 66,74 1,3 97,15

Биологическая оценка активности in vivo

Тестовый пример 8. Оценка эффективности in vivo молекул ADC

Бестимусным мышам Balb/c подкожно инокулировали в правый бок клетки рака желудка человека, клетки NUGC4 (с умеренной экспрессией клаудина 18.2) (5×10⁶ клеток в 50% матригеле/мышь) и разделяли на 0 день на всего 5 групп по 8. Средний объем опухоли составлял около 84,41 мм³.

Каждой мыши внутрибрюшинно вводили ADC в концентрации 0,1 мл/10 г массы тела в дни 0, 4 и 11, выполняя в общей сложности 3 инъекции.

Каждой мыши внутрибрюшинно вводили ADC в концентрации 0,1 мл/10 г массы тела со дня группировки с интервалами в 5 дней, в общей сложности 4 инъекции.

Объемы опухоли и массу тела измеряли два раза в неделю, а результаты записывали.

Использовали статистическое программное обеспечение Excel 2003. Средние значения рассчитывали как среднее (avg); значения СО (стандартное отклонение) рассчитывали как STDEV (квадратный корень дисперсии выборки); значения SEM (стандартная ошибка среднего) рассчитывали как STDEV/SQRT (квадратный корень); и разность значения P между группами рассчитывали как TTEST.

Объем опухоли (V) рассчитывали как: V = 1/2×L_{длинная}×L_{короткая}²

Относительный объем (RTV) = VT/V0

Степень ингибирования опухоли (%) = (CRTV - TRTV)/CRTV (%),

где V0 и VT представляют собой объемы опухоли в начале эксперимента (день первого введения определяется как день 0) и во время измерения, соответственно; CRTV и TRTV представляют собой относительные объемы опухоли группы холостого контроля и экспериментальных групп, соответственно, в конце эксперимента. Результаты показаны в таблице 17 и Фиг. 4 и 5.

Таблица 17. Результаты ингибирования опухолей с помощью ADC Группа Средний объем опухоли (мм³) Средний объем опухоли (мм³) Относительный объем опухоли % Степень ингибирования опухоли D32 D0 SEM D32 SEM D0 SEM Группа холостого контроля 83,33 0,82 2067,0 102,24 24,83 1,27 - ADC-2 10 мг/кг (mpk) 83,93 1,65 263,13 44,17 3,11 0,51 87,47 %** ADC-2 3 мг/кг 84,35 1,83 328,95 45,04 3,86 0,48 84,45 %** ADC-1 10 мг/кг 83,60 1,61 123,80 20,99 1,48 0,25 94,04 %** ADC-1 3 мг/кг 86,84 1,91 356,41 55,18 4,06 0,58 83,65 %**

vs холостой: ** p < 0,01.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd.

Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd.

<120> КОНЬЮГАТ АНТИТЕЛА К КЛАУДИНУ И ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА И ЕГО

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ

<130> 702137CPCT

<140> PCT/CN2020/135680

<141> 2020-12-11

<150> CN201911273041.7

<151> 2019-12-12

<150> CN202011060513.3

<151> 2020-09-30

<160> 55

<170> Patent-In 3.5

<210> 1

<211> 261

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile

1 5 10 15

Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr

20 25 30

Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly

35 40 45

Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg

50 55 60

Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg

65 70 75 80

Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val

85 90 95

Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser

115 120 125

Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val

130 135 140

Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly

145 150 155 160

Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe

165 170 175

Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met

180 185 190

Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala

195 200 205

Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly

210 215 220

Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile

225 230 235 240

Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser

245 250 255

Lys His Asp Tyr Val

260

<210> 2

<211> 3350

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 2

agaattgcgc tgtccacttg tcgtgtggct ctgtgtcgac actgtgcgcc accatggccg 60

tgactgcctg tcagggcttg gggttcgtgg tttcactgat tgggattgcg ggcatcattg 120

ctgccacctg catggaccag tggagcaccc aagacttgta caacaacccc gtaacagctg 180

ttttcaacta ccaggggctg tggcgctcct gtgtccgaga gagctctggc ttcaccgagt 240

gccggggcta cttcaccctg ctggggctgc cagccatgct gcaggcagtg cgagccctga 300

tgatcgtagg catcgtcctg ggtgccattg gcctcctggt atccatcttt gccctgaaat 360

gcatccgcat tggcagcatg gaggactctg ccaaagccaa catgacactg acctccggga 420

tcatgttcat tgtctcaggt ctttgtgcaa ttgctggagt gtctgtgttt gccaacatgc 480

tggtgactaa cttctggatg tccacagcta acatgtacac cggcatgggt gggatggtgc 540

agactgttca gaccaggtac acatttggtg cggctctgtt cgtgggctgg gtcgctggag 600

gcctcacact aattgggggt gtgatgatgt gcatcgcctg ccggggcctg gcaccagaag 660

aaaccaacta caaagccgtt tcttatcatg cctcaggcca cagtgttgcc tacaagcctg 720

gaggcttcaa ggccagcact ggctttgggt ccaacaccaa aaacaagaag atatacgatg 780

gaggtgcccg cacagaggac gaggtacaat cttatccttc caagcacgac tatgtgtaat 840

gctctaagac ctctcagcac gggcggaaga aactcccgga gagctcaccc aaaaaacaag 900

gagatcccat ctagatttct tcttgctttt gactcacagc tggaagttag aaaagcctcg 960

atttcatctt tggagaggcc aaatggtctt agcctcagtc tctgtctcta aatattccac 1020

cataaaacag ctgagttatt tatgaattag aggctatagc tcacattttc aatcctctat 1080

ttcttttttt aaatataact ttctactctg atgagagaat gtggttttaa tctctctctc 1140

acattttgat gatttagaca gactccccct cttcctccta gtcaataaac ccattgatga 1200

tctatttccc agcttatccc caagaaaact tttgaaagga aagagtagac ccaaagatgt 1260

tattttctgc tgtttgaatt ttgtctcccc acccccaact tggctagtaa taaacactta 1320

ctgaagaaga agcaataaga gaaagatatt tgtaatctct ccagcccatg atctcggttt 1380

tcttacactg tgatcttaaa agttaccaaa ccaaagtcat tttcagtttg aggcaaccaa 1440

acctttctac tgctgttgac atcttcttat tacagcaaca ccattctagg agtttcctga 1500

gctctccact ggagtcctct ttctgtcgcg ggtcagaaat tgtccctaga tgaatgagaa 1560

aattattttt tttaatttaa gtcctaaata tagttaaaat aaataatgtt ttagtaaaat 1620

gatacactat ctctgtgaaa tagcctcacc cctacatgtg gatagaagga aatgaaaaaa 1680

taattgcttt gacattgtct atatggtact ttgtaaagtc atgcttaagt acaaattcca 1740

tgaaaagctc actgatccta attctttccc tttgaggtct ctatggctct gattgtacat 1800

gatagtaagt gtaagccatg taaaaagtaa ataatgtctg ggcacagtgg ctcacgcctg 1860

taatcctagc actttgggag gctgaggagg aaggatcact tgagcccaga agttcgagac 1920

tagcctgggc aacatggaga agccctgtct ctacaaaata cagagagaaa aaatcagcca 1980

gtcatggtgg cctacacctg tagtcccagc attccgggag gctgaggtgg gaggatcact 2040

tgagcccagg gaggttgggg ctgcagtgag ccatgatcac accactgcac tccagccagg 2100

tgacatagcg agatcctgtc taaaaaaata aaaaataaat aatggaacac agcaagtcct 2160

aggaagtagg ttaaaactaa ttctttaaaa aaaaaaaaaa gttgagcctg aattaaatgt 2220

aatgtttcca agtgacaggt atccacattt gcatggttac aagccactgc cagttagcag 2280

tagcactttc ctggcactgt ggtcggtttt gttttgtttt gctttgttta gagacggggt 2340

ctcactttcc aggctggcct caaactcctg cactcaagca attcttctac cctggcctcc 2400

caagtagctg gaattacagg tgtgcgccat cacaactagc tggtggtcag ttttgttact 2460

ctgagagctg ttcacttctc tgaattcacc tagagtggtt ggaccatcag atgtttgggc 2520

aaaactgaaa gctctttgca accacacacc ttccctgagc ttacatcact gcccttttga 2580

gcagaaagtc taaattcctt ccaagacagt agaattccat cccagtacca aagccagata 2640

ggccccctag gaaactgagg taagagcagt ctctaaaaac tacccacagc agcattggtg 2700

caggggaact tggccattag gttattattt gagaggaaag tcctcacatc aatagtacat 2760

atgaaagtga cctccaaggg gattggtgaa tactcataag gatcttcagg ctgaacagac 2820

tatgtctggg gaaagaacgg attatgcccc attaaataac aagttgtgtt caagagtcag 2880

agcagtgagc tcagaggccc ttctcactga gacagcaaca tttaaaccaa accagaggaa 2940

gtatttgtgg aactcactgc ctcagtttgg gtaaaggatg agcagacaag tcaactaaag 3000

aaaaaagaaa agcaaggagg agggttgagc aatctagagc atggagtttg ttaagtgctc 3060

tctggatttg agttgaagag catccatttg agttgaaggc cacagggcac aatgagctct 3120

cccttctacc accagaaagt ccctggtcag gtctcaggta gtgcggtgtg gctcagctgg 3180

gtttttaatt agcgcattct ctatccaaca tttaattgtt tgaaagcctc catatagtta 3240

gattgtgctt tgtaattttg ttgttgttgc tctatcttat tgtatatgca ttgagtatta 3300

acctgaatgt tttgttactt aaatattaaa aacactgtta tcctacagtt 3350

<210> 3

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи мышиного антитела mAb1901

<400> 3

Glu Val Gln Leu Met Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Met Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Arg Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Thr Arg Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 4

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепи мышиного антитела mAb1901

<400> 4

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Ile Tyr His Cys Gln Asn

85 90 95

Asp Leu Tyr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu

100 105 110

Lys

<210> 5

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи мышиного антитела mAb1902

<400> 5

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Met Ile His Pro Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Leu Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Pro Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Lys Thr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 6

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепи мышиного антитела mAb1902

<400> 6

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Ala Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 7

<211> 330

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Константная область тяжелой цепи человеческого антитела IgG1

<400> 7

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 8

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Константная область легкой каппа-цепи человеческого антитела

<400> 8

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 9

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> mAb1901 HCDR1

<400> 9

Asp Tyr Gly Ile His

1 5

<210> 10

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> mAb1901 HCDR2

<400> 10

Tyr Ile Ser Arg Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 11

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> mAb1901 HCDR3

<400> 11

Gly Gly Tyr Asp Thr Arg Asn Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 12

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> mAb1901 LCDR1

<400> 12

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 13

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> mAb1901 LCDR2

<400> 13

Gly Ala Ser Thr Arg Ala Ser

1 5

<210> 14

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> mAb1901 LCDR3

<400> 14

Gln Asn Asp Leu Tyr Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 15

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> mAb1902 HCDR1

<400> 15

Ser Tyr Trp Met His

1 5

<210> 16

<211> 18

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> mAb1902 HCDR2

<400> 16

Met Ile His Pro Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly Arg

<210> 17

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> mAb1902 HCDR3

<400> 17

Leu Lys Thr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr

1 5

<210> 18

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> mAb1902 LCDR1

<400> 18

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Thr

<210> 19

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> mAb1902 LCDR2

<400> 19

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 20

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> mAb1902 LCDR3

<400> 20

Gln Asn Ala Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr

1 5

<210> 21

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL1

<400> 21

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asp Leu Tyr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 22

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL2

<400> 22

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asp Leu Tyr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 23

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL3

<400> 23

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Ile Tyr His Cys Gln Asn

85 90 95

Asp Leu Tyr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 24

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH1

<400> 24

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Arg Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Thr Arg Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 25

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH2

<400> 25

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Arg Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Thr Arg Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 26

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH3

<400> 26

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Arg Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Thr Arg Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 27

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH4

<400> 27

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Arg Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Thr Arg Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 28

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL11

<400> 28

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Ala Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 29

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL12

<400> 29

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Ala Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 30

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL13

<400> 30

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Ala Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 31

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH11

<400> 31

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Met Ile His Pro Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Lys Thr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 32

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH12

<400> 32

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Met Ile His Pro Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Leu Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Lys Thr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 33

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH13

<400> 33

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Met Ile His Pro Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Leu Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Lys Thr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 34

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH14

<400> 34

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Met Ile His Pro Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Leu Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Lys Thr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 35

<211> 450

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> тяжелая цепь ch1901

<400> 35

Glu Val Gln Leu Met Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Met Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Arg Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Thr Arg Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 36

<211> 220

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> легкая цепь ch1901

<400> 36

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Ile Tyr His Cys Gln Asn

85 90 95

Asp Leu Tyr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 37

<211> 448

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> тяжелая цепь ch1902

<400> 37

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Met Ile His Pro Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Leu Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Pro Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Lys Thr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 38

<211> 220

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> легкая цепь ch1902

<400> 38

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Ala Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 39

<211> 220

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L1

<400> 39

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asp Leu Tyr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 40

<211> 220

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L2

<400> 40

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asp Leu Tyr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 41

<211> 220

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L3

<400> 41

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Ile Tyr His Cys Gln Asn

85 90 95

Asp Leu Tyr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 42

<211> 450

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> H1

<400> 42

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Arg Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Thr Arg Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 43

<211> 450

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> H2

<400> 43

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Arg Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Thr Arg Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 44

<211> 450

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> H3

<400> 44

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Arg Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Thr Arg Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 45

<211> 450

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> H4

<400> 45

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Arg Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Thr Arg Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 46

<211> 220

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L11

<400> 46

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Ala Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 47

<211> 220

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L12

<400> 47

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Ala Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 48

<211> 220

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L13

<400> 48

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Ala Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 49

<211> 448

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> H11

<400> 49

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Met Ile His Pro Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Lys Thr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 50

<211> 448

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> H12

<400> 50

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Met Ile His Pro Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Leu Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Lys Thr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 51

<211> 448

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> H13

<400> 51

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Met Ile His Pro Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Leu Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Lys Thr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 52

<211> 448

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> H14

<400> 52

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Met Ile His Pro Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Leu Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Lys Thr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 53

<211> 448

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> тяжелая цепь IMAB-362

<400> 53

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Ser Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 54

<211> 220

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> легкая цепь IMAB-362

<400> 54

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 55

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Тетрапептидный линкер

<400> 55

Gly Gly Phe Gly

1 4

<---

Группа изобретений относится к области биотехнологии и может быть применима в медицине. Изобретение раскрывает конъюгат антитела к клаудину с по меньшей мере одним фрагментом экзатекана (см. соединение общей формулы (Pc-L-Y-D)), где Pc представляет собой антитело к клаудину 18.2 или его антигенсвязывающий фрагмент, а L, Y и n являются такими, как определено в настоящем описании. Изобретение может быть использовано в получении лекарственного средства для лечения рака, клетки которого характеризуются высокой экспрессией клаудина 18.2. 5 н. и 26 з.п. ф-лы, 16 пр., 17 табл., 5 ил.

1. Конъюгат лиганда и лекарственного средства общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемая соль для лечения рака с высокой экспрессией клаудина 18.2:

где Y выбран из группы, состоящей из -O-(CR^aR^b)_m-CR¹R²-C(O)-, -OCR¹R²-(CR^aR^b)_m-, -O-CR¹R²-, -NH-(CR^aR^b)_m-CR¹R²-C(O)- и -S-(CR^aR^b)_m-CR¹R²-C(O)-;

R^a и R^b являются идентичными или различными и каждый независимо выбран из группы, состоящей из водорода, дейтерия, галогена, алкила, галогеналкила, дейтерированного алкила, алкокси, гидрокси, амино, циано, нитро, гидроксиалкила, циклоалкила и гетероциклила; или R^a и R^b вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют циклоалкил или гетероциклил;

R¹ выбран из группы, состоящей из галогена, галогеналкила, дейтерированного алкила, циклоалкила, циклоалкилалкила, алкоксиалкила, гетероциклила, арила и гетероарила; R² выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, галогеналкила, дейтерированного алкила, циклоалкила, циклоалкилалкила, алкоксиалкила, гетероциклила, арила и гетероарила; или R¹ и R² вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют циклоалкил или гетероциклил;

или R^a и R² вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют циклоалкил или гетероциклил;

m представляет собой целое число от 0 до 4;

n представляет собой десятичное или целое число от 2 до 8;

где линкерное звено -L- представляет собой -L¹-L²-L³-L⁴-, где

L¹ выбран из группы, состоящей из -(сукцинимидил-3-ил-N)-W-С(O)-, -СН₂-С(O)-NR³-W-C(O)- и -C(O)-W-C(O)-, где W выбран из группы, состоящей из C_1-8 алкила, C_1-8 алкил-С_3-6 циклоалкила и линейного гетероалкила, имеющего от 1 до 8 атомов цепи, причем указанный гетероалкил содержит от 1 до 3 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, О и S, где указанный C_1-8 алкил, C_1-8 алкил-С_3-6 циклоалкил или линейный гетероалкил, имеющий от 1 до 8 атомов цепи, независимо необязательно дополнительно замещен одним или более заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, гидрокси, циано, амино, алкила, хлоралкила, дейтерированного алкила, алкокси и циклоалкила;

L² выбран из группы, состоящей из -NR⁴(CH₂CH₂O)p¹CH₂CH₂C(O)-, -NR⁴(CH₂CH₂O)p¹CH₂C(O)-, -S(CH₂)p¹C(O)- и химической связи, где р¹ представляет собой целое число от 1 до 20;

L³ представляет собой пептидный остаток, состоящий из 2-7 аминокислот, где аминокислоты выбраны из группы, состоящей из аминокислотных остатков, образованных из аминокислот из фенилаланина, глицина, валина, лизина, цитруллина, серина, глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты, и необязательно дополнительно замещены одним или более заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, гидрокси, циано, амино, алкила, хлоралкила, дейтерированного алкила, алкокси и циклоалкила;

L⁴ выбран группы, состоящей из -NR⁵(CR⁶R⁷)_t-, -C(O)NR⁵-, -C(O)NR⁵(CH₂)_t- и химической связи, где t представляет собой целое число от 1 до 6;

R³, R⁴ и R⁵ являются идентичными или различными и каждый независимо выбран из группы, состоящей из водорода, алкила, галогеналкила, дейтерированного алкила и гидроксиалкила;

R⁶ и R⁷ являются идентичными или различными и каждый независимо выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, алкила, галогеналкила, дейтерированного алкила и гидроксиалкила;

Рс представляет собой антитело к клаудину 18.2 или его антигенсвязывающий фрагмент, причем антитело к клаудину 18.2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где:

iii) вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11, соответственно, и вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14, соответственно; или

iv) вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17, соответственно, и вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20, соответственно.

2. Конъюгат или его фармацевтически приемлемая соль по п. 1, где антитело к клаудину 18.2 представляет собой мышиное антитело, химерное антитело или гуманизированное антитело.

3. Конъюгат или его фармацевтически приемлемая соль по п. 1 или 2, где антитело к клаудину 18.2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где:

(1) вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 3 или имеющую по меньшей мере 90% идентичность с ней, и вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 4 или имеющую по меньшей мере 90% идентичность с ней;

(2) вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 24 или имеющую по меньшей мере 90% идентичность с ней, и вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 21 или имеющую по меньшей мере 90% идентичность с ней;

(3) вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 5 или имеющую по меньшей мере 90% идентичность с ней, и вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 6 или имеющую по меньшей мере 90% идентичность с ней; или

(4) вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 31 или имеющую по меньшей мере 90% идентичность с ней, и вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 28 или имеющую по меньшей мере 90% идентичность с ней.

4. Конъюгат или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-3, где антитело к клаудину 18.2 представляет собой гуманизированное антитело, содержащее каркасную область, полученную из человеческого антитела, или вариант его каркасной области, причем указанный вариант каркасной области имеет обратные мутации вплоть до 10 аминокислот в каркасной области легкой цепи и/или каркасной области тяжелой цепи человеческого антитела.

5. Конъюгат или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-4, где вариант каркасной области содержит мутации, выбранные из (а) или (b):

(a) одна или более обратных мутаций аминокислот необязательно выбраны из группы, состоящей из 22S, 85I и 87Н, содержащихся в вариабельной области легкой цепи; и/или одна или более обратных мутаций аминокислот необязательно выбраны из группы, состоящей из 48I, 82Т и 69М, содержащихся в вариабельной области тяжелой цепи; или

(b) одна или более обратных мутаций аминокислот необязательно выбраны из группы, состоящей из 4L и 22S, содержащихся в вариабельной области легкой цепи; и/или одна или более обратных мутаций аминокислот необязательно выбраны из группы, состоящей из 38K, 40R, 48I, 66K, 67А, 69L, 71L и 73K, содержащихся в вариабельной области тяжелой цепи.

6. Конъюгат или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-5, где вариант каркасной области содержит мутации, выбранные из группы, состоящей из:

(а-1) обратных мутаций аминокислот 22S, 85I и 87Н, содержащихся в вариабельной области легкой цепи, и обратных мутаций аминокислот 48I и 82Т, содержащихся в вариабельной области тяжелой цепи; или

(b-1) обратной мутаций аминокислоты 4L, содержащейся в вариабельной области легкой цепи.

7. Конъюгат или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-6, где антитело к клаудину 18.2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, показанные ниже:

(vii) вариабельная область тяжелой цепи, имеющая последовательность, указанную в SEQ ID NO: 3, и вариабельная область легкой цепи, имеющая последовательность, указанную в SEQ ID NO: 4;

(viii) вариабельная область тяжелой цепи, имеющая последовательность, указанную в SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 или SEQ ID NO: 27, и вариабельная область легкой цепи, имеющая последовательность, указанную в SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 23;

(ix) вариабельная область тяжелой цепи, имеющая последовательность, указанную в SEQ ID NO: 5, и вариабельная область легкой цепи, имеющая последовательность, указанную в SEQ ID NO: 6; или

(x) вариабельная область тяжелой цепи, имеющая последовательность, указанную в SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 или SEQ ID NO: 34, и вариабельная область легкой цепи, имеющая последовательность, указанную в SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30.

8. Конъюгат или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-7, где антитело к клаудину 18.2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, показанные ниже:

(xi) вариабельная область тяжелой цепи, имеющая последовательность, указанную в SEQ ID NO: 31, и вариабельная область легкой цепи, имеющая последовательность, указанную в SEQ ID NO: 29; или

(xii) вариабельная область тяжелой цепи, имеющая последовательность, указанную в SEQ ID NO: 26, и вариабельная область легкой цепи, имеющая последовательность, указанную в SEQ ID NO: 23.

9. Конъюгат или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-8, где антитело к клаудину 18.2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи и константную область легкой цепи антитела.

10. Конъюгат или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-9, где константная область тяжелой цепи выбрана из группы, состоящей из константных областей IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 человека и их обычных вариантов, и константная область легкой цепи выбрана из группы, состоящей из константных областей κ и λ цепи человеческого антитела и их обычных вариантов.

11. Конъюгат или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-10, где антитело к клаудину 18.2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи, имеющую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 7, константную область легкой цепи, имеющую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 8.

12. Конъюгат или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-11, где антитело к клаудину 18.2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: тяжелую цепь, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с тяжелой цепью, указанной в SEQ ID NO: 35 или SEQ ID NO: 42, и легкую цепь, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с легкой цепью, указанной в SEQ ID NO: 36 или SEQ ID NO: 39; или

тяжелую цепь, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с тяжелой цепью, указанной в SEQ ID NO: 37 или SEQ ID NO: 49, и легкую цепь, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с легкой цепью, указанной в SEQ ID NO: 38 или SEQ ID NO: 46.

13. Конъюгат или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-12, где антитело к клаудину 18.2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(c) тяжелую цепь, имеющую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 35, и легкую цепь, имеющую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 36;

(d) тяжелую цепь, имеющую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44 или SEQ ID NO: 45, и легкую цепь, имеющую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 или SEQ ID NO: 41;

(e) тяжелую цепь, имеющую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 37, и легкую цепь, имеющую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 38; или

(f) тяжелую цепь, имеющую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 или SEQ ID NO: 52, и легкую цепь, имеющую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 или SEQ ID NO: 48.

14. Конъюгат или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-13, где антитело к клаудину 18.2 выбрано из группы, состоящей из:

h1901-11, содержащего тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 44, и легкую цепь, указанную в SEQ ID NO: 41; и

h1902-5, содержащего тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 49, и легкую цепь, указанную в SEQ ID NO: 47.

15. Конъюгат или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-14, где n представляет собой десятичное или целое число от 3,5 до 4,5.

16. Конъюгат или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-15, где:

Y представляет собой -O-(CR^aR^b)_m-CR¹R²-С(O)-;

R^a и R^b являются идентичными или различными и каждый независимо выбран из группы, состоящей из водорода, дейтерия, галогена и алкила;

R¹ представляет собой галогеналкил или С_3-6 циклоалкил;

R² выбран из группы, состоящей из водорода, галогеналкила и С_3-6 циклоалкила; или R¹ и R² вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют С_3-6 циклоалкил;

m представляет собой 0 или 1.

17. Конъюгат или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-16, где Y выбран из группы, состоящей из:

где О-конец Y присоединен к линкерному звену L.

18. Конъюгат или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-17, где линкерное звено -L- представляет собой -L¹-L²-L³-L⁴-, где L¹ представляет собой и s¹ представляет собой целое число от 2 до 8;

L² представляет собой химическую связь;

L³ представляет собой тетрапептидный остаток;

L⁴ представляет собой -NR⁵(CR⁶R⁷)_t-, где R⁵, R⁶ и R⁷ являются идентичными или различными и каждый независимо представляет собой водород или алкил и t представляет собой 1 или 2;

где L¹-конец присоединен к Рс и L⁴-конец присоединен к Y.

19. Конъюгат или его фармацевтически приемлемая соль по п. 18, где L³ представляет собой тетрапептидный остаток GGFG.

20. Конъюгат или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-19, где -L- представляет собой:

21. Конъюгат или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-20, где -L-Y- необязательно выбран из группы, состоящей из:

22. Конъюгат или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-21, представляющий собой конъюгат общей формулы (Pc-L_a-Y-D) или его фармацевтически приемлемую соль:

где W, L², L³, R⁵, R⁶ и R⁷ являются такими, как определено в п. 1;

Рс, n, R¹, R² и m являются такими, как определено в п. 1.

23. Конъюгат или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-22, представляющий собой конъюгат общей формулы (Pc-L_b-Y-D) или его фармацевтически приемлемую соль:

где s¹ представляет собой целое число от 2 до 8;

Рс, R¹, R², R⁵-R⁷, m и n являются такими, как определено в п. 22.

24. Конъюгат или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-23, где конъюгат выбран из группы, состоящей из:

где Рс и n являются такими, как определено в п. 1.

25. Конъюгат или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-24, где конъюгат выбран из группы, состоящей из:

где n является таким, как определено в п. 1, и антитела h1902-5 и h1901-11 являются такими, как определено в п. 14.

26. Способ получения конъюгата общей формулы (Pc-L_a-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли, включающий следующие стадии:

подвергание реакции сочетания Рс' и соединения общей формулы (L_a-Y-D) с получением соединения общей формулы (Pc-L_a-Y-D);

где Рс представляет собой антитело к клаудину 18.2 или его антигенсвязывающий фрагмент и Рс' получен путем восстановления Рс; при этом восстанавливающий агент представляет собой ТСЕР; в частности, дисульфидные связи в антителе являются восстановленными;

W, L², L³, R¹, R², R⁵-R⁷, m и n являются такими, как определено в п. 22.

27. Фармацевтическая композиция для лечения рака с высокой экспрессией клаудина 18.2, содержащая конъюгат или его фармацевтически приемлемую соль по любому из пп. 1-25 и один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов, разбавителей или носителей.

28. Применение конъюгата или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп. 1-25 или фармацевтической композиции по п. 27 для получения лекарственного препарата для лечения рака с высокой экспрессией клаудина 18.2.

29. Применение конъюгата или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп. 1-25 или фармацевтической композиции по п. 27 для получения лекарственного препарата для лечения или предотвращения опухоли и рака.

30. Применение по п. 29, где опухоль и рак выбраны из группы, состоящей из: плоскоклеточная карцинома головы и шеи, рак головы и шеи, рак головного мозга, нейроглиома, мультиформная глиобластома, нейробластома, карцинома центральной нервной системы, нейроэндокринная опухоль, рак горла, рак носоглотки, рак пищевода, рак щитовидной железы, злокачественная мезотелиома плевры, рак легкого, рак молочной железы, рак печени, гепатобилиарный рак, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак желудочно-кишечного тракта, рак кишечника, рак толстой кишки, колоректальный рак, рак почки, светлоклеточная почечно-клеточная карцинома, рак яичников, рак эндометрия, рак шейки матки, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак яичка, рак кожи, меланома, лейкоз, лимфома, рак кости, хондросаркома, миелома, множественная миелома, миелодиспластический синдром, опухоль Крукенберга, миелопролиферативная опухоль, плоскоклеточная карцинома, саркома Юинга, системный амилоидоз легких цепей или карцинома из клеток Меркеля.

31. Применение по п. 30, где лимфома выбрана из группы, состоящей из ходжкинской лимфомы, неходжкинской лимфомы, диффузной В-крупноклеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы, первичной медиастинальной В-крупноклеточной лимфомы, мантийноклеточной лимфомы, малой лимфоцитарной лимфомы, В-крупноклеточной лимфомы, богатой Т-клетками/гистиоцитами и лимфоплазмоцитарной лимфомы, рак легкого выбран из группы, состоящей из немелкоклеточного рака легкого и мелкоклеточного рака легкого, и лейкоз выбран из группы, состоящей из хронического миелоидного лейкоза, острого миелоидного лейкоза, лимфоцитарного лейкоза, лимфобластного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза, хронического лимфоцитарного лейкоза и миелоидно-клеточного лейкоза.