Способ комплексной оценки энергообеспеченности иммунокомпетентных клеток крови Российский патент 2022 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, акушерству, репродуктологии, терапии, педиатрии и может быть использовано для оценки степени нарушения энергообеспеченности иммунокомпетентных клеток крови (ИКК) у взрослого населения, у беременных женщин и детей.

Существуют различные способы оценки функционального состояния митохондрий клеток в различных тканях, в том числе иммунокомпетентных клетках как в целом, так и в отдельных популяциях, например, в лимфоцитах и других клетках крови - тромбоцитах. Группу высокого риска составляют женщины репродуктивного возраста, особенно в период гестации, дети дошкольного возраста, с хронической соматической патологией.

В работах зарубежных авторов состояние митохондриальных функций, способность митохондрий генерировать энергию изучалось как один из биомаркеров женской фертильности, в частности качества ооцитов и последующей жизнеспособности эмбриона и плода (Cecchino G.N., Alves da Motta E.L., The role of mitochondrial activity in female fertility and assisted reproductive technologies: overview and current insights // Reproductive biomedicine online. - 2018. - №36. - P. 686-697. Проводилось изучение роли митохондриальных функций (например, биоэнергетика, стероидогенез, активность дыхательной цепи, производство активных форм кислорода в опосредованном программировании развития мозга у плода при различных стрессовых ситуациях (физических, социальных, воздействие окружающей среды) у женщин во время гестации по данным плацентарной и пуповинной крови (Anke Hoffmann, Dietmar Spengler. The Mitochondrion as Potential Interface in Early-Life Stress Brain Programming. Frontiers in Behavioral Neuroscience., 2018, Vol. 12, doi: 10.3389/fnbeh.2018.00306. Представлена оценка митохондриальной дисфункции в лимфоцитарных клетках периферической крови методом проточной цитометрии при субклиническом гипотиреозе у женщин в гестационном периоде во взаимосвязи с неблагоприятными исходами беременности (Feldthusen A.-D. et al. Pregnancy-induced alterations in mitochondrial function in euthyroid pregnant women and pregnant women with subclinical hypothyroidism; relation to adverse outcome // Journal of Clinical & Translational Endocrinology. - 2014. - №1. - P. 13-17.)

Известным аналогом заявляемого изобретения являются исследования по оценке со сниженным мембранным потенциалом (МПМ) общих лейкоцитов с использованием набора Mito Probe™ JC-1 Assay Kit (Life Technologies, США) в соответствии с инструкцией к набору на проточном цитофлуориметре BD FACS CANTO II (BD Biosciences, США) при хронической обструктивной болезни легких у взрослых. Выявленное увеличение количества лейкоцитов со сниженным МПМ указывает на уменьшение энергообеспечения клетки, кислородное голодание и предрасположенность к развитию клеточной гипоксии (Денисенко Ю.К., Новгородцева Т.П., Виткина Т.И., Антонюк М.В., Жукова Н.В. К вопросу о митохондриальной дисфункции при хронической обструктивной болезни легких // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. - 2016. - Вып. 60. - С. 28-33).

Наиболее близким аналогом предлагаемого изобретения, является способ диагностики нарушения энергетического метаболизма лимфоцитов при внебольничной пневмонии у детей, который заключается в определении степени нарушений энергообеспеченности лимфоцитов крови методом проточной цитометрии по проценту лимфоцитов со сниженным мембранным потенциалом митохондрий (RU 2579317 С1 10.04.2016).

Недостатком данных аналогов является:

- оценка общей лейкоцитарной популяции или только отдельных пулов ИКК;

- отсутствие комплексной оценки энергообеспеченности иммунокомпетентных клеток крови;

- отсутствие возможности оценить степень выраженности энергодефицита ИКК крови, что особенно важно для обоснования, объема и подбора доз лечебно-профилактических мероприятий;

- рассмотрено влияние только в рамках одной нозологии, хотя рассматриваемый механизм является универсальным для любой иммунозависимой патологии.

Проблема состоит в улучшении диагностики, с возможностью доклинического определения и упрощения интерпретации данных при высокой точности комплексной оценки энергообеспеченности иммунокомпетентных клеток крови (лимфо-, грануло- и моноцитов) в случае риска или уточненной патологии среди наблюдаемых пациентов.

Технический результат - возможность ранней доклинической, технически быстрой диагностики и комплексной оценки степени дефицита энергообеспеченности иммунокомпетентных клеток крови, в частности у взрослых, беременных женщин, детей путем учета процента лимфо-, грануло- и моноцитов периферической крови с пониженным МПМ (Δψ) методом проточной цитометрии.

Способ осуществляют следующим образом.

На начальном этапе методом проточной лазерной цитометрии на приборе BD FACS Calibur (USA) с использованием программы Cell Quest Pro и красителя JC-1 (Bector Dikcenson, USA) учитывается количество 3-х пулов иммунокомпетентных клеток периферической крови (лимфо-, грануло- и моноцитов) с пониженным МПМ. Верхние границы нормы определили опытным путем при обследовании пациентов различных возрастных групп (женщины репродуктивного возраста вне беременности, n=58 исследований, во время беременности, n=170, дети, n=30) соответственно критериям с минимальными факторами риска по какой-либо патологии или осложненного течения в период гестации. На основании полученных результатов были рассчитаны групповые диапазоны значений сниженных МПМ: для взрослого населения (лимфоциты - более 35%, гранулоциты и моноцитов - более 5%), для беременных женщин (лимфоциты - более 40%, гранулоциты и моноциты - более 10%), для детей (лимфоциты - более 35%, гранулоциты - более 3%, моноциты - более 5%).

В зависимости от сочетания ИКК крови со сниженным мембранным потенциалом митохондрий выделяются 3 степени энергодефицита: первая степень - моновариантные композиции ИКК (лимфоциты, или гранулоциты, или моноциты); вторая степень энергодефицита - одновременные бивариационные композиции (лимфоциты и гранулоциты, или лимфоциты и моноциты, или гранулоциты и моноциты); третья степень дефицита энергообеспеченности иммунокомпетентных клеток крови - одномоментное увеличение количества клеток со сниженным мембранным потенциалом митохондрий всех типов (лимфоциты, гранулоциты и моноциты).

Способ позволяет с высокой точностью и достоверностью комплексно диагностировать энергодефицит ИКК на доклинической стадии, что дает возможность определять тактику лечебно-профилактических мероприятий на ранних этапах патологических состояний.

Технический результат достигается и тем, что кроме одномоментного учета количества лимфоцитов, гранулоцитов и моноцитов со сниженным мембранным потенциалом митохондрий определяют границы нормы и патологии этих показателей.

В таблицах приведены результаты 503 исследований беременных женщин при постановке на учет в женской консультации на ранних сроках гестации и в динамике (табл. 1), а также 42 детей с бронхиальной астмой (табл. 2).

Использование заявляемого способа комплексной оценки энергообеспеченности иммунокомпетентных клеток крови, как дополнительного к утвержденным медицинским стандартам метода, выполненного технически в быстрые сроки и с высокой точностью позволяет провести раннюю доклиническую диагностику дефицитных состояний при различных патологических проявлениях, по степени выявленных нарушений возможно обоснованно определить выбор, объем необходимой терапии и оценить эффективность лечения.

Преимущества предлагаемого способа:

1. Комплексная оценка энергообеспеченности 3-х пулов лейкоцитарной популяции крови в разных вариациях позволяет судить о выраженности митохондриальной недостаточности ИКК;

2. Изменения МПМ ИКК опережают клиническую картину и другие данные иных способов диагностики;

3. Использование высокотехнологического метода проточной лазерной цитометрии и специализированной программы Cell Quest Pro позволяют одномоментно, на большом количестве клеток проанализировать отдельно все субпопуляции лейкоцитов с высокой точностью измерения.

4. Определение степени энергодефицита ИКК крови является доклинической диагностикой, дает возможность обоснования и выбора схем коррекции выявленных нарушений, а также оценкой эффективности.

Далее приведены примеры использования заявляемого способа среди различных групп населения.

Пример 1. Беременная Н., 35 лет. Встала на учет в женской консультации в 7-8 недель. Настоящая беременность - вторая, первая беременность закончилась срочными, нормальными родами, ребенок родился с весом 2900, рост 48 см. Из экстрагенитальных заболеваний отмечалась грыжа позвоночника, не оперирована, соблюдает режим физических нагрузок. Гинекологический анамнез отягощен: эндометриоз в течение 3 лет, хронический аднексит. Социальные условия хорошие. Данная беременность планирована. Вредных факторов до и во время беременности не отмечено. Источник питания преимущественно рынок, дача, магазин, воду использует фильтрованную. При первичном осмотре жалобы на слабость, сонливость к вечеру, одышка, сердцебиение при физической нагрузке, отмечена бледность и сухость кожных покровов. Проведенное лабораторное обследование показало отсутствие отклонений в общем, биохимическом анализах крови, в показателях ферродинамики, отмечено снижение йодидов крови до 7,41 мкмоль/л. Определено снижении МПМ во всех трех пулах иммунокомпетентных клеток крови: процент лимфоцитов со сниженным МПМ - 55,89%, гранулоцитов - 17,76%, моноцитов - 15,69%. Заключение: имеет место энергетический дефицит ИКК крови 3 степени (снижение всех 3-х пулов: лимфо-, грануло-моноцитов). На сроке 10-11 недель по УЗИ был выставлен диагноз: замершая беременность и проведены медицинские мероприятия.

Пример 2. Беременная О., 39 лет. Встала на учет в женской консультации в 11-12 недель. Настоящая беременность - третья (ЭКО). Из экстрагенитальных заболеваний отмечался геморрой. Акушерско-гинекологический анамнез отягощен: первая беременность (16 лет назад) была замершая, закончилась ранним выкидышем на сроке 8-9 недель, вторая (15 лет назад) - протекала с анемией, выявлен хламидиоз, уреаплазмоз, закончилась срочными, нормальными родами, ребенок родился с весом 3275, ростом 48 см, с обвитием пуповины. В последующие 10 лет наблюдалась по поводу бесплодия, миомы. Социальные условия хорошие. Данная беременность планирована. Вредных факторов до и во время беременности не отмечено. На дополнительное обследование была направлена в связи с нарушением маточно-плацентарно-плодового кровотока 3 степени на сроке 20-21 неделя. При осмотре жалобы на периодические судороги в ногах. Проведенное лабораторное обследование показало ЛДЖ по общему анализу крови и ферродинамике, отсутствие отклонений биохимических показателях, снижение йодидов крови до 8,91 мкмоль/л. Определено снижение МПМ в двух пулах иммунокомпетентных клеток крови: гранулоцитах - 14,72%, моноцитах - 15,69%, в лимфоцитах МПМ в норме - 30,24%. Заключение: имеет место энергетический дефицит ИКК крови 2 степени (снижение МПМ 2-х пулах: грануло-, моноцитах). Повторно на сроке 28-29 недель сохранялся ЛДЖ, снижение йодидов крови до 8,3 мкмоль/л, по МПМ получены следующие результаты: снижении МПМ в двух пулах ИКК крови: в лимфоцитах до 53,07%, моноцитах - 15,54%, в гранулоцитах - норма 6,68%. Заключение: имеет место энергетический дефицит ИКК крови 2 степени (снижение МПМ 2-х пулах: лимфо- и моноцитах). На сроке 32-33 недели на третьем скрининге по УЗИ определен СЗРП 1 степени, ассиметричная форма, нарушение маточно-плацентарно-плодового кровотока 1а степени. Терапию женщина получала по стандарту. Беременность закончилась срочными родами, рождением ребенка с СЗРП 1 степени, ассиметричная форма, с весом 2040 г, ростом 49 см.

Пример 3. Беременная А., 38 лет. Встала на учет в женской консультации в 15-16 недель. Настоящая беременность - пятая. Из экстрагенитальных заболеваний отмечалось ожирение 2-3 степени, эзофагальный рефлюкс, эзофагит, хронического течения, геморрой, вегето-сосудистая дистония по кардиальному типу. Акушерско-гинекологический анамнез отягощен: 3 медицинских аборта, хронический аднексит, хламидиоз, кандидоз. Первая беременность (16 лет назад) протекала с ИЦН, преэклампсией, закончилась срочными, патологическими родами (кровотечение), ребенок родился с весом 3250, ростом 51 см. Социальные условия хорошие, брак второй. Данная беременность планирована. Вредных факторов до и во время беременности не отмечено, работа за компьютером по 7-8 часов в день до и во время беременности. На дополнительное обследование была направлена на сроке 21-22 недели. При осмотре жалобы на слабость, сонливость, периодически головокружения, одышка и сердцебиение при физических нагрузках, сухость кожных покровов, ломкость ногтей, редко судороги в икроножных мышцах, запоры. При комплексном лабораторном обследовании выявлены: ЛДЖ по общему анализу крови и ферродинамике, нарушение липидного профиля и глюкозотолерантного теста. Определено снижении МПМ в двух пулах иммунокомпетентных клеток крови: лимфоцитах - 49,5%, гранулоцитах - 14,72%, в моноцитах - норма 5,1%. Заключение: имеет место энергетический дефицит ИКК крови 2 степени (снижение МПМ 2-х пулах: лимфо- и гранулоцитах). Повторно на сроке 32-33 недель сохранялся ЛДЖ, гестационный сахарный диабет. Женщина была под наблюдением, получала необходимую терапию соответственно стандартам. По данным МПМ получены следующие результаты: снижение МПМ в одном пуле ИКК крови: в лимфоцитах до 57,89%, гранулоциты (2,7%) и моноциты (6,25%) соответствовали норме. Заключение: имеет место энергетический дефицит ИКК крови 1 степени (снижение МПМ 1 пула: лимфоцитарного). На сроке 34-35 недели на третьем скрининге по УЗИ определена преждевременная отслойка плаценты, нарушение маточно-плацентарного кровотока 2-3 степени. Проведено оперативное пособие на сроке 35 недель. Ребенок родился недоношенный, 7-8 баллов по шкале Апгар, с массой тела 2590, длиной 50 см. В плаценте признаки хронической плацентарной недостаточности, в стадии субкомпенсации, нарушение плацентарного кровообращения 2-3 степени.

Пример 4. Пациентка К., 15 лет. Поступила в стационар с жалобами на малопродуктивный кашель, одышка в покое и при физической нагрузке, шумное дыхание. Ребенок от 2 беременности, протекавшей на фоне токсикоза 1 половины, гестоза-2 половины беременности. Роды 1-е, срочные. Длительный безводный период. Оценка по шкале Апгар 3-7-8 балов, получала ИВЛ маской - 3 минуты.

С раннего возраста отмечались проявления аллергической реакции по типу крапивницы (причина не выяснена), чихание, затрудненное носовое дыхание при контакте с кошкой, полынью, сиренью. Наследственный анамнез не отягощен. Динамика развития настоящего заболевания: в 2014 г. ребенку установлен диагноз: Бронхиальная астма, средней степени тяжести. Получала базисную терапию: Серетид 125/25 1 т*2 раза до 2015 г, затем фликсотид 50 мкг по 1 т*2 раза, с 2016 года - монтелукаст с положительным клиническим эффектом, регулярно наблюдалась у аллерголога НИИ ОМиД. В конце 2016 года в связи с ремиссией заболевания, базисная терапия отменена аллергологом. В сентябре 2017 г. у ребенка на фоне ОРВИ появился кашель, приступы затрудненного вдоха, показатели пикфлуометра были ниже нормы. В связи с обострением заболевания находилась на госпитализации в клинике НИИ ОМиД, выписана с основным диагнозом: Бронхиальная астма, легкая, персистирующая, обострение. Приступ средней степени тяжести; сопутствующий диагноз: аллергический ринит, среднетяжелого течения. При обследовании на аллергены методом ИФА, выявлена сенсибилизации к плесени. После выписки в качестве базисной терапии рекомендован Серетид 25/50 мкг по 1 толчку 2 раза в день через спейсер. На фоне терапии положительная динамика в течение года. В связи с повторным обострением основного заболевания (приступ снят амбулаторно), с апреля 2018 г. (по данным осмотра аллерголога), получала Серетид 25/125 мкг по 1 толчку 2 раза в день. В декабре 2018 г. обострение на фоне ОРВИ, увеличена доза Серетид 25/250 мкг по 1 толчку 2 раза в день. На фоне усиления базисной терапии, явлений бронхиальной обструкции не отмечено в течение 3 месяцев. Со слов девочки, с марта 2019 г. получала Серетид 25/125 мкг по 1 толчку 2 раза в день с положительным эффектом. Настоящее обострение с 13.06.19, связанное с цветением и увеличением количества деревьев. Появился надсадный кашель, одышка. Получала Серетид в той же дозировке, беродуал эпизодически в момент усиления одышки при физической нагрузке. На фоне терапии сохранялся кашель, затрудненный вдох. Обратились к аллергологу НИИ ОМиД, направлены на госпитализацию. На рентгенограмме ОГК от 17.06.19 - усиление легочного рисунка, инфильтративные изменения отсутствуют. Установлен диагноз: Бронхиальная астма, средней тяжести, неконтролируемая, обострение, приступ бронхиальной обструкции тяжелого течения. Персистирующий аллергический ринит средней тяжести.

При исследовании выявлено снижении МПМ во всех трех пулах иммунокомпетентных клеток крови: процент лимфоцитов со сниженным МПМ - 95,6%, моноцитов - 87,43%, гранулоциты - 90,21%. Заключение: у ребенка имеет место энергетический дефицит ИКК крови 3 степени (резкое снижение всех 3-х пулов: лимфо-, грануло- моноцитов), что соответствует тяжести состояния на данный момент - приступный период - и неконтролируемому течения основного заболевания.

Пример 5. Пациент А., 15 лет. Жалоб при поступлении активно не предъявляет.Динамика развития настоящего заболевания: в 2007 году установлен диагноз: Бронхиальная астма, легкая персистирующая, получал базисную терапию фликсотидом. Наблюдался в НИИ ОМиД, госпитализация в стационар в 2007, 2009 гг. по поводу обострения заболевания. Сенсибилизация к клещу домашней пыли. Базисную терапию получал непродолжительное время. Наблюдался аллергологом-иммунологом, в динамике отмечено значительное улучшение. Эпизодов обструкции, в течение 10 лет не было. Занимается активно спортом (хоккей), физическую нагрузку переносит хорошо. Направлен на плановое стационарное обследование. С учетом анамнеза, длительности заболевания, отсутствием обследования в течение продолжительного времени, госпитализирован в педиатрическое отделение с целью оценки состояния бронхолегочной системы. Объективно признаков обструкции не отмечено, ФВД в пределах нормы, проба с бронхолитином - отрицательная, подтверждена сенсибилизация к клещу домашней пыли. Установлен диагноз: Бронхиальная астма, интерметирующая, контролируемая, длительная клиническая ремиссия. В базисной терапии не нуждается.

При исследовании выявлено незначительное снижении МПМ в лимфоцитах до 44,9%, в остальных пулах процент снижения МПМ в пределах референтных возрастных показателей: моноцитов - 1,4%, гранулоцитов - 0,46%. Заключение: у ребенка имеет место легкий энергодефицит ИКК крови, 1 степени (моновариантное снижение МПМ в лимфоцитах).

Таким образом, приведенные примеры показали диагностическую значимость определения степени энергообеспеченности иммунокомпетентных клеток крови, необходимость ранней диагностики, разработки прогностических и лечебно-профилактических рекомендаций.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, акушерству, репродуктологии, терапии, педиатрии. Способ определения степени энергообеспеченности иммунокомпетентных клеток крови (ИКК) с помощью проточной цитометрии с определением процентного содержания ИКК с пониженным мембранным потенциалом митохондрий заключается в том, что осуществляют комплексную оценку состояния иммунной системы. Причем в качестве иммунологических показателей используют показатели лимфоцитов, гранулоцитов, моноцитов, определяя процентное содержание ИКК: лимфоцитов, гранулоцитов, моноцитов со сниженным мембранным потенциалом митохондрий, и в сравнении с аналогичными показателями образцов крови здоровых лиц определяют отклонения от нормы: для взрослого населения: лимфоциты - более 35%, гранулоциты и моноциты - более 5%, для беременных женщин это лимфоциты - более 40%, гранулоциты и моноциты - более 10%, для детей это лимфоциты - более 35%, гранулоциты более 3%, моноциты - более 5%. При этом в зависимости от комбинаций ИКК с отклонениями от нормы, определяют степень нарушения энергообеспеченности ИКК: первая степень - моновариантное сочетание ИКК с пониженным мембранным потенциалом митохондрий: лимфоциты, или гранулоциты, или моноциты; вторая степень нарушений энергообеспеченности ИКК - одновременные бивариационные сочетания ИКК с пониженным мембранным потенциалом митохондрий: лимфоциты и гранулоциты, или лимфоциты и моноциты, или гранулоциты и моноциты; третья степень нарушений энергообеспеченности ИКК - одномоментное увеличение количества клеток со сниженным мембранным потенциалом митохондрий всех типов: лимфоцитов, гранулоцитов, моноцитов. Изобретение обеспечивает возможность ранней доклинической, технически быстрой диагностики и комплексной оценки степени дефицита энергообеспеченности иммунокомпетентных клеток крови у беременных женщин, детей и иных групп взрослого населения. 2 табл., 5 пр.

Способ определения степени энергообеспеченности иммунокомпетентных клеток крови (ИКК) с помощью проточной цитометрии с определением процентного содержания ИКК с пониженным мембранным потенциалом митохондрий, отличающийся тем, что одновременно осуществляют комплексную оценку состояния иммунной системы, причем в качестве иммунологических показателей используют показатели лимфоцитов, гранулоцитов, моноцитов, определяя процентное содержание ИКК: лимфоцитов, гранулоцитов, моноцитов со сниженным мембранным потенциалом митохондрий, и в сравнении с аналогичными показателями образцов крови здоровых лиц определяют отклонения от нормы: для взрослого населения: лимфоциты - более 35%, гранулоциты и моноциты - более 5%, для беременных женщин это лимфоциты - более 40%, гранулоциты и моноциты - более 10%, для детей это лимфоциты - более 35%, гранулоциты более 3%, моноциты - более 5%; при этом в зависимости от комбинаций ИКК с отклонениями от нормы определяют степень нарушения энергообеспеченности ИКК: первая степень - моновариантное сочетание ИКК с пониженным мембранным потенциалом митохондрий: лимфоциты, или гранулоциты, или моноциты; вторая степень нарушений энергообеспеченности ИКК - одновременные бивариационные сочетания ИКК с пониженным мембранным потенциалом митохондрий: лимфоциты и гранулоциты, или лимфоциты и моноциты, или гранулоциты и моноциты; третья степень нарушений энергообеспеченности ИКК - одномоментное увеличение количества клеток со сниженным мембранным потенциалом митохондрий всех типов: лимфоцитов, гранулоцитов, моноцитов.