СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ К ВОЗДЕЙСТВИЮ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ Российский патент 2008 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к области медицины и биологии, а именно к биофизике клеточных мембран человека. Может быть использовано для диагностики токсического действия тяжелых металлов, обусловленного загрязнением окружающей среды, и оценки состояния организма людей, в том числе беременных женщин.

Под воздействием тяжелых металлов наиболее наглядно нарушаются свойства мембран эритроцитов, что приводит к изменению их формы и конфигурации.

Существуют способы определения оценки состояния клеточных мембран эритроцитов, а именно чувствительности, стабильности и изменения, состоящие в том, что на них оказывают воздействие in vitro инсулином (RU 94024809 A1, 27.09.1996), хлористым лантаном (RU 2082968 C1, 27.06.1997), глюкокортикоидом (RU 2202791 C1, 20.04.2003). Кроме того, имеются способы воздействия металлов, но на лимфоциты (RU 2128841 C1, 10.04.1999, Бюл. №10) и нейтрофилы (Фрадкин В.А. Диагностика аллергии реакциями нейтрофилов крови. - М.: Медицина, 1985).

Наиболее близким аналогом-прототипом является способ определения трансформации эритроцитов (Лисовский В.А., Кидалов В.Н., Гущ В.В. Трансформация эритроцитов как диагностический тест в клинической практике. - Лабораторное дело. - 1986. - №10. - С.594-598). Капиллярную кровь - 0,5 мл - набирают из пальца в пробирку с 2 мл охлажденного до 4°С 0,15 М фосфатного буфера с рН 7,2. Эритроциты отмывают центрифугированием при 720 g в указанном буферном растворе. В пробирку с эритроцитами добавляют 2 мл 0,25% раствора охлажденного глутарового альдегида на том же буфере. Далее пробу помещают в холодильник при температуре 4°С на 30 мин для фиксации формы клеток, после чего содержимое пробирки осторожно перемешивают и 0,02 мл клеточной взвеси помещают на предметное стекло. Сверху каплю покрывают покровным стеклом 24×24 мм, края которого с внутренней стороны по периметру смазаны иммерсионным маслом. Препарат помещают на столик микроскопа и создают иммерсионную прослойку между ним, конденсором и объективом микроскопа. При этих условиях значительно снижается рассеивание светового пучка осветителя при микроскопии и достигается четкое и объемное изображение эритроцитов при их увеличении до 900 раз.

Недостатками прототипа являются:

- способ выявляет только общую оценку трансформации эритроцитов;

- отсутствие возможности индивидуальной оценки токсического действия конкретных тяжелых металлов, обусловленного загрязнением окружающей среды;

- необходимость большего объема капиллярной крови 0,5 мл, что не позволяет применить данный способ у новорожденных и детей раннего возраста;

- многоступенчатая сложная подготовка взятой капиллярной крови к исследованию, что усложняет сам процесс забора;

- невозможность длительного хранения взятой пробы, т.е. невозможность используемого способа в условиях экспедиции.

Задача изобретения: предложить способ определения чувствительности мембран эритроцитов к воздействию тяжелых металлов.

Технический результат - возможность ранней доклинической диагностики патологии, связанной с воздействием тяжелых металлов.

Технический результат достигается тем, что кроме определения дискоцитов под световым микроскопом в нативном мазке взвеси цельной крови, фосфатного буфера и глутарового альдегида определяют дискоциты после их инкубации с раствором солей тяжелых металлов, например: Zn, Mn, Ni, Pb.

Для этого капиллярную кровь 0,02 мл помещают в охлажденную смесь, состоящую из 0,5 мл 0,15 М фосфатного буфера, имеющего рН 7,4 и 0,5 мл 0,25% раствора глутарового альдегида в соотношении 1:1, ресуспендируют, оставляя в холодильнике при 4°С на 60 мин для фиксации формы клеток. После фиксации содержание пробирки вновь ресуспендируют и 0,01 мл клеточной взвеси помещают на предметное стекло. Сверху каплю покрывают покровным стеклом 24×24 мм, края которого с внутренней стороны по периметру смазаны иммерсионным маслом. Препарат помещают на столик микроскопа и создают иммерсионную прослойку между ним, конденсором и объективом микроскопа. При этих условиях значительно снижается рассеивание светового пучка осветителя при микроскопии и достигается четкое и объемное изображение эритроцитов при их увеличении до 900 раз. В нативном препарате отсчитывают 250 клеток и вычисляют количество дискоцитов. Затем после осторожного перемешивания оставшейся клеточной взвеси берут 0,08 мл охлажденной клеточной взвеси, наливают в четыре пробирки. Затем в одну пробирку добавляют 0,02 мл 0,01% раствора ZnSO₄, в другую пробирку - 0,02 мл 0,1% MnSO₄, в третью пробирку - 0,02 мл 0,005% раствор NiSO₄, в четвертую пробирку - 0,02 мл 0,01% Pb(NO₃)₂ и при комнатной температуре 18-20°С инкубируют в течение 30 минут. После инкубации содержимое пробирки вновь ресуспендируют и 0,01 мл клеточной взвеси помещают на предметное стекло. Сверху каплю покрывают покровным стеклом 24×24 мм, края которого с внутренней стороны по периметру смазаны иммерсионным маслом. Препарат помещают на столик микроскопа и создают иммерсионную прослойку между ним, конденсором и объективом микроскопа. При этих условиях значительно снижается рассеивание светового пучка осветителя при микроскопии и достигается четкое и объемное изображение эритроцитов при их увеличении до 900 раз. В каждом препарате отсчитывают 250 клеток и вычисляют процентное соотношение дискоцитов.

О чувствительности, т.е. о воздействии металлов на мембрану эритроцитов судят по соотношению количества дискоцитов при определении в нативном мазке и при воздействии тяжелых металлов, например: Zn, Mn, Ni, Pb и вычисляют коэффициент чувствительности мембран эритроцитов

где К_чм - коэффициент чувствительности мембран эритроцитов;

Дн - количество дискоцитов в нативном мазке, %;

Дм - количество дискоцитов при воздействии конкретных тяжелых металлов, %.

Опытным путем было установлено, что если количество дискоцитов (%) в мазке после инкубации с растворами тяжелых металлов составляет менее 95% от количества начального уровня, то в этом случае клеточные мембраны эритроцитов необходимо считать чувствительными к данному тяжелому металлу, а у конкретного индивидуума - высокий фактор риска развития патологии на уровне клеточных мембран при действии повышенных концентраций или длительном воздействии данного металла.

Преимущества предлагаемого способа:

- возможность определения индивидуальной чувствительности организма к конкретным тяжелым металлам, например: Zn, Mn, Ni, Pb;

- возможность ранней доклинической диагностики воздействия избыточных доз или длительное воздействие малых доз тяжелых металлов, обусловленных загрязнением окружающей среды, в различных возрастных категориях;

- способ универсален для выявления повышенной чувствительности к воздействию металлов у групп риска по развитию любой патологии;

- способ прост и доступен, т.к. используется оборудование - световой микроскоп, имеющийся в любой клинической лаборатории;

- возможность использовать капиллярную кровь из пальца у детей, особенно у новорожденных и детей раннего возраста, т.к. количество необходимой крови для исследования составляет 0,02 мл, т.е. в 25 раз меньше, чем по прототипу;

- сокращение количества необходимых реактивов в 4 раза по сравнению с прототипом;

- возможность хранения пробы до 4-х суток взятой таким образом, позволяет использовать данный способ в условиях экспедиций.

Использование заявляемого способа определения чувствительности мембран эритроцитов к воздействию тяжелых металлов посредством трансформации позволяет более наглядно и правильно оценить патологический процесс и компенсаторные резервы организма.

Способ эффективен как для диагностики, так и для контроля лечения, т.к. изменение свойств мембран клеток опережает клиническую картину и другие данные иных способов диагностики.

Пример 1.

Беременная Ч., 37 лет. Встала на учет в женскую консультацию при сроке беременности 16-17 недель. Настоящая беременность - третья, две предыдущие беременности заканчивались медицинскими абортами. Из экстрагенитальных заболеваний отмечается вегетососудистая дистония по гипотоническому типу, мочекаменная болезнь, поллиноз в стадии ремиссии. Из анамнеза выяснено, что женщина работает программистом, за компьютером проводит достаточно много времени, не соблюдает правила режима работы и отдыха. Источник питания преимущественно магазин и рынок, воду использует фильтрованную. При первичном осмотре жалобы на сухость кожных покровов, периодически носовые кровотечения, запоры. Проведенное лабораторное обследование показало отсутствие отклонений в общем анализе крови, показатели ферродинамики: сывороточное железо - 31,6 мкмоль/л, общая железосвязывающая способность сыворотки - ОЖСС - 75,8 мкмоль/л, сывороточный ферритин - 26,2 мкг/л и биохимии крови: общий белок - 75 г/л, холестерин - 5,0 ммоль/л, В-липопротеиды - 69 ед., тимоловая проба - 1,73 ед., АЛТ - 0,44 мккат/л, ACT - 0,39 мккат/л, билирубин - 11,51 мкмоль/л соответствовали норме. В микроэлементном статусе крови отмечено снижение йодидов крови до 5,89 мкмоль/л, меди в форменных элементах крови до 3,59 мкмоль/л, повышение в форменных элементах крови лития до 1,53 мкмоль/л, кобальта до 1,50 мкмоль/л. Содержание марганца и свинца находились на верхней границе нормы. Результаты обследования на гормоны щитовидной железы не выявили функциональных нарушений.

Было проведено определение чувствительности мембран эритроцитов к воздействию тяжелых металлов посредством трансформации. Выявлены следующие результаты: количество дискоцитов в спонтанном мазке крови - 59%, при воздействии Zn - 51%, Mn - 39%, Ni - 44%, Pb - 44%. О чувствительности мембраны эритроцитов судили по соотношению количества дискоцитов при определении в спонтанном мазке и при воздействии тяжелых металлов Mn, Ni, Pb, что соответствовало: Zn - 86,4%, Mn - 66,1%, Ni - 74,6%, Pb - 74,6% и было значительно ниже 95%.

Оценка клинико-лабораторных данных показала, что у данной женщины отмечена повышенная чувствительность клеточной мембраны эритроцитов к Mn, Ni, Pb, Zn. По всей вероятности, это может быть связано с нарушением обмена веществ, что подтверждается МКБ в анамнезе, наличием аллергического заболевания в виде поллиноза, а также возрастом женщины (первородящая в 37 лет), проживающей в регионе с экстремальными климатическими и определенными биогеохимическими условиями проживания, не исключено вредное воздействие неконтролируемой работы за компьютером. Повышенная чувствительность мембран эритроцитов ко всем используемым нами тяжелым металлам является показателем нарушений в данном организме на клеточном уровне.

Назначенное профилактическое лечение беременная не принимала. Исходом беременности стали патологические роды. Ребенок родился доношенный, но с признаками хронической гипоксии и внутриутробной гипотрофии.

Пример 2.

Беременная К., 24 года. Встала на учет в женскую консультацию при сроке беременности 13-14 недель. Настоящая беременность - первая. Экстрагенитальных заболеваний нет. Из анамнеза выяснено, что женщина незадолго до беременности работала в химчистке, затем перешла на другую работу - продавец-консультант. Источник питания преимущественно магазин и дача, воду использовала фильтрованную. При первичном осмотре жалобы только на пристрастие к запахам. Лабораторное обследование показало отсутствие отклонений в общем анализе крови, показателях ферродинамики: сывороточное железо - 24,55 мкмоль/л, ОЖСС - 64,7 мкмоль/л, сывороточный ферритин - 21,1 мкг/л и биохимии крови: общий белок - 70 г/л, холестерин - 4,7 ммоль/л, В-липопротеиды - 21 ед., тимоловая проба - 1,7 ед., АЛТ - 0,15 мккат/л, ACT - 0,19 мккат/л, билирубин - 9,47 мкмоль/л соответствовали норме. Йодиды крови были снижены до 9,55 мкмоль/л. В сыворотке крови отмечалось снижение содержания меди до 3,96 мкмоль/л, повышение свинца до 1,98 мкмоль/л, лития до 1,23 мкмоль/л, марганца до 1,77 мкмоль/л, кобальта до 1,31 мкмоль/л. Со стороны тиреоидной системы гормональных изменений не было.

Показатели трансформации были следующие: количество дискоцитов в спонтанном мазке крови - 52%, при воздействии Zn - 52%, Mn - 46%, Ni - 44%, Pb - 41%. Учитывая оценку определения чувствительность клеточных мембран эритроцитов соответственно предлагаемому способу, выявлены изменения: Zn - 100%, Mn - 88,5%, Ni - 84,6%, Pb - 78,8%.

Оценка клинико-лабораторных данных показала, что у данной женщины отмечена повышенная чувствительность клеточной мембраны эритроцитов к 3-м исследуемым тяжелым металлам в следующем порядке Мn, Ni, Pb. Можно предположить, что изменение чувствительность клеточных мембран эритроцитов связаны с действием химических реактивов на работе, с одной стороны, беременностью и биогеохимическими условиями проживания, с другой стороны. Беременной было назначено профилактическое лечение. Переход на другую, не связанную с воздействием химических веществ, работу также способствовал улучшению показателей крови. Результаты гемограммы и биохимии крови не имели отрицательной динамики. Значительно снизилась чувствительность мембран эритроцитов, что выразилось в повышении %: Zn - 100%, Mn - 97,1%, Ni - 98,0%, Pb - 99,0%. Улучшились показатели микроэлементов крови: повысилось содержание меди до 11,32 мкмоль/л, снизилось содержание свинца с 1,98 мкмоль/л до 1,22 мкмоль/л, лития до 1,16 мкмоль/л, марганца до 1,21 мкмоль/л, кобальта до 0,92 мкмоль/л.

Исходом беременности стали нормальные срочные роды. Ребенок родился доношенный, без патологии.

Пример 3.

Женщина К., 21 год. Взята в группу сравнения как практически здоровая. На момент обследования жалоб не было, состояние удовлетворительное, по органам без изменений. Обследована соответственной разработанной программе. Общий анализ крови без патологии. Изменений со стороны сывороточного железа, ферритина, ОЖСС не выявлено. В микроэлементном статусе крови отмечено некоторое снижение меди в сыворотке и форменных элементах, содержание селена, лития, марганца, кобальта соответствовало физиологическим нормам. Обследование щитовидной железы патологии не выявило.

При определении чувствительности мембран эритроцитов к тяжелым металлам по предлагаемому способу получены результаты: количество дискоцитов в спонтанном мазке крови - 60,5%, при воздействии Zn - 59%, Mn - 60%, Ni - 59%, Pb - 58,5%. Соотношение количества дискоцитов в спонтанном мазке и при воздействии микроэлементов: Zn - 97,5%, Mn - 99,2%, Ni - 97,5%, Pb - 96,7% выше 95%, что означает отсутствие гиперчувствительности к тяжелым металлам, подтвержденное клинико-лабораторными данными у практически здоровой женщины.

Таким образом, приведенные примеры показали значимость изучения чувствительности мембран эритроцитов к тяжелым металлам в ранней диагностике клеточной патологии, возможности применения предлагаемого способа в клинической практике с целью коррекции на доклиническом уровне при различной патологии.

Изобретение относится к области медицины и биологии, а именно к биофизическим способам исследования крови, и может быть использовано для диагностики токсического действия тяжелых металлов, обусловленного загрязнением окружающей среды, и оценки состояния организма людей, в том числе беременных женщин. Изобретение заключается в том, что для исследования набирают 0,02 мл капиллярной крови, помещают в охлажденную смесь, состоящую из 0,5 мл 0,15 М фосфатного буфера, имеющего рН 7,4 и 0,5 мл 0,25% раствора глутарового альдегида, в соотношении 1:1, ресуспендируют, оставляя в холодильнике при 4°С на 60 мин для фиксации формы клеток, затем после фиксации содержание пробирки вновь ресуспендируют и, поместив 0,01 мл клеточной взвеси на предметное стекло, отсчитывают 250 клеток и вычисляют количество дискоцитов в нативном препарате, после этого осторожного перемешивания оставшуюся клеточную взвесь, берут 0,08 мл охлажденной клеточной взвеси, наливают в четыре пробирки: в одну пробирку добавляют 0,02 мл 0,01% раствора ZnSO₄, в другую пробирку - 0,02 мл 0,1% MnSO₄, в третью пробирку - 0,02 мл 0,005% раствор NiSO₄, в четвертую пробирку - 0,02 мл 0,01% Pb(NO₃)₂ и при комнатной температуре 18-20°С инкубируют в течение 30 минут, после инкубации содержимое пробирки вновь ресуспендируют и, поместив 0,01 мл клеточной взвеси на предметное стекло, отсчитывают 250 клеток, вычисляют количество дискоцитов и коэффициент чувствительности мембран эритроцитов где К_чм - коэффициент чувствительности мембран эритроцитов; Дн - количество дискоцитов в нативном мазке, %; Дм - количество дискоцитов при воздействии конкретных тяжелых металлов, %; при этом, если К_чм менее 95% от первоначального уровня, то клеточные мембраны чувствительны к данному тяжелому металлу. Изобретение обеспечивает возможность ранней доклинической диагностики патологии, связанной с воздействием тяжелых металлов.

Способ определения чувствительности мембран эритроцитов к воздействию тяжелых металлов, включающий биофизические исследования крови, взятой из пальца в пробирку с охлажденным до 4°С фосфатным буфером с рН 7,2 с последующим добавлением раствора охлажденного глутарового альдегида на том же буфере, дальнейшем охлаждении при 4°С, перемешивании, помещении клеточной взвеси на предметное стекло и подсчете нормальных форм эритроцитов-дискоцитов, отличающийся тем, что для исследования набирают 0,02 мл капиллярной крови, помещают в охлажденную смесь, состоящую из 0,5 мл 0,15 М фосфатного буфера, имеющего рН 7,4 и 0,5 мл 0,25% раствора глутарового альдегида, в соотношении 1:1, ресуспендируют, оставляя в холодильнике при 4°С на 60 мин для фиксации формы клеток, затем после фиксации содержание пробирки вновь ресуспендируют и, поместив 0,01 мл клеточной взвеси на предметное стекло, отсчитывают 250 клеток и вычисляют количество дискоцитов в нативном препарате, после этого осторожного перемешивания оставшуюся клеточную взвесь, берут 0,08 мл охлажденной клеточной взвеси, наливают в четыре пробирки: в одну пробирку добавляют 0,02 мл 0,01% раствора ZnSO₄, в другую пробирку - 0,02 мл 0,1% MnSO₄, в третью пробирку - 0,02 мл 0,005% раствор NiSO₄, в четвертую пробирку - 0,02 мл 0,01% Pb(NO₃)₂ и при комнатной температуре 18-20°С инкубируют в течение 30 мин, после инкубации содержимое пробирки вновь ресуспендируют и, поместив 0,01 мл клеточной взвеси на предметное стекло, отсчитывают 250 клеток, вычисляют количество дискоцитов и коэффициент чувствительности мембран эритроцитов:

где К_чм - коэффициент чувствительности мембран эритроцитов;

Дн - количество дискоцитов в нативном мазке, %;

Дм - количество дискоцитов при воздействии конкретных тяжелых металлов, %;

при этом, если К_чм менее 95% от первоначального уровня, то клеточные мембраны чувствительны к данному тяжелому металлу.