СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ЗАДЕРЖКИ РОСТА ПЛОДА У ЖЕНЩИН С УГРОЖАЮЩИМИ ПРЕЖДЕВРЕМЕННЫМИ РОДАМИ Российский патент 2023 года по МПК G01N33/533 G01N33/577 

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, неонатологии, и может быть использовано для прогнозирования задержки роста плода у беременных с угрожающими преждевременными родами в 22-34 недели гестации.

Задержка роста плода - это синдром, который появляется во внутриутробном периоде и характеризуется замедлением, остановкой или отрицательной динамикой размеров плода и проявляется у новорожденного снижением массы тела (как интегрального показателя размеров плода) ниже 10-го центиля по сравнению с долженствующей для гестационного возраста [Неонатология: национальное руководство / под ред. Н.Н. Володина. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. - 848 с.]. Задержка роста плода (ЗРП), являясь одним из наиболее часто встречающихся осложнений беременности, составляет 5 - 10% от всех беременностей [Society for Maternal-Fetal Medicine Consult Series# 52: diagnosis and management of fetal growth restriction: (replaces clinical guideline number 3, April 2012) / J.G. Martins, J.R. Biggio, A. Abuhamad et al. // American journal of obstetrics and gynecology. - 2020. - Vol. 223, № 4. - P. B2-B17. https://doi.org/10.1016/j.ajog.2020.05.010]. Одной из причин, приводящих к развитию ЗРП, являются угрожающие преждевременные роды, приводящие к снижению маточно-плацентарной перфузии и питания плода [Westby A., Miller L. Fetal Growth Restriction Beforeand After Birth // American family physician. - 2021. - Vol. 104, № 5. - P. 486-492]. При массе тела новорожденного при рождении менее 10-го процентиля отмечается более высокий риск перинатальной смертности, в том числе мертворождения. ЗРП - фактор риска интранатальных осложнений, а также различных, нередко тяжелых, неврологических и ментальных дефицитов после рождения [Недостаточный рост плода, требующий предоставления медицинской помощи матери (задержка роста плода): клинические рекомендации / З.С. Ходжаева, Р.Г. Шмаков, Т.А. Ярыгина и др. - М., 2022. - 76 с.]. Более чем у половины детей с данной патологией отмечены неврологические расстройства, отставание в физическом и интеллектуальном развитии [Состояние проблемы лечения и прогнозирования задержки развития плода / Р.С. Замалеева, Л.И. Мальцева, Н.А. Черепанова и др. // Практическая медицина. - 2016. - № 1(93). - С. 41-44].

Проведение ультразвуковой фетометрии является основным методом диагностики ЗРП, так как позволяет оценить степень и форму задержки роста плода, а также определить внутриутробное состояние плода путем допплерометрии плодово-плацентарного кровотока. Однако, проведение ультразвуковой фетометрии носит достаточно субъективный характер: размеры плода и рассчитываемая предполагаемая масса имеют погрешность до 10%, в зависимости от техники измерения, квалификации специалиста и характеристик оборудования. [American College of Obstetricians and Gynecologists Committee on Practice Bulletins--Gynecology. ACOG Practice Bulletin. Clinical management guidelines for obstetrician-gynecologists // Medical management of abortion. Obstetrics and gynecology. - 2001. - Vol. 97, № 4. - P. 1-13]. Кроме того, выявление ЗРП часто бывает затруднительным, поскольку рост плода не может быть оценен при однократном измерении его размеров, а потенциал роста является понятием гипотетическим. [Недостаточный рост плода, требующий предоставления медицинской помощи матери (задержка роста плода): клинические рекомендации / З.С. Ходжаева, Р.Г. Шмаков, Т.А. Ярыгина и др. - М., 2022. - 76 с.]. Поэтому ЗРП может быть верифицирована с точностью 100% только после рождения ребенка и оценки его антропометрических параметров.

Таким образом, разработка способа прогнозирования ЗРП у женщин с угрозой преждевременных родов в сроке гестации 22 - 34 недели позволит оптимизировать тактику ведения беременности, срок и способ родоразрешения, тем самым будет способствовать снижению перинатальной заболеваемости и смертности.

Известен способ прогнозирования развития синдрома задержки развития плода путем исследования периферической венозной крови беременной женщины, отличающейся тем, что в 6 - 12 недель гестации определяют показатель содержания васкулоэндотелиального фактора роста (VEGF) и при его значениях, равных или меньших 20 пг/мл, прогнозируют развитие синдрома задержки развития плода [Патент № 2295132 Российская Федерация. Способ раннего прогнозирования синдрома задержки развития плода / Сотникова Н.Ю., Кудряшова А.В., Веденеева М.В. // Изобретения. Полезные модели. - 2007. - № 7].

Данный способ имеет ряд недостатков:

1. Более низкая точность (81,25%) и специфичность (87,5%), по сравнению с заявляемым способом;

2. Изменение содержания васкулоэндотелиального фактора роста (VEGF), являющегося маркером эндотелиальной дисфункции, имеет место и при преэклампсии, сахарном диабете, плацентарной недостаточности, что свидетельствует о недостаточной специфичности данного показателя. [Role of VEGF165b/VEGFTOTAL ratio in gestational diabetes mellitus / S. Krishnasamy, V. Ravi, B. Rajaraman et al. // Gynecol Endocrinol. - 2019. - Vol. 35, № 9. - P. 811-814. doi:10.1080/09513590.2019.1595576].

Известен способ прогнозирования задержки внутриутробного роста плода, отличающийся тем, что с ранних сроков беременности определяют относительное содержание CD3+CD16+56+-лимфоцитов, уровень С3-компонента комплемента и растворимого рецептора фактора некроза опухоли (sTNF-R) в венозной крови женщины, вычисляют прогностический индекс (PI) по формуле: PI=-0,8911X1-0,0321X2-2,3669X3+11,0779,

где X1 - относительное содержание CD3+CD16+CD56+-лимфоцитов, %;

Х2 - концентрация С3-компонента комплемента, мг/дл;

Х3 - концентрация sTNF-R, нг/мл

и при PI менее 0 прогнозируют задержку внутриутробного роста плода во второй половине беременности, а при PI более 0 делают заключение о низком риске развития данного патологического состояния [Патент № 2526178 Российская Федерация. Способ прогнозирования задержки внутриутробного роста плода / Газиева И.А., Чистякова Г.Н., Ремизова И.И., Тарасова М.Н. // Изобретения. Полезные модели. - 2014. - № 23].

Способ имеет ряд недостатков:

1. Отсутствуют данные о возможности применения данного способа у женщин с угрожающими преждевременными родами;

2. Способ является трудоемким и длительным: предполагает определение трех иммунологических показателей с проведением математического расчета;

3. Более низкая точность (82,2%) и специфичность (72,2%) способа, по сравнению с заявляемым.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ прогнозирования синдрома задержки развития плода, сущность которого заключается в том, что в периферической венозной крови беременной женщины в 6 - 12 недель гестации определяют относительное содержание HLA-DR+ моноцитов и при его значении, равном или меньшем 57,9%, прогнозируют развитие синдрома задержки развития плода [Патент № 2265224 Российская Федерация. Способ прогнозирования синдрома задержки развития плода / Борзова Н.Ю., Сотникова Н.Ю., Гагаева Ю.В., Кудряшова А.В. // Изобретения. Полезные модели. - 2005. - № 33].

Способ имеет следующие недостатки:

1. Более низкая точность (75%) и специфичность (78,95%), по сравнению с заявляемым способом;

2. Известно, что относительное содержание HLA-DR+ моноцитов может изменяться при преэклампсии [Прогнозирование преэклампсии по содержанию CD16-негативных моноцитов / Д.А. Борис, Н.Е. Волгина, А.М. Красный и др. // Акушерство и гинекология. - 2019. - № 7. - С. 49-55.http://dx.doi.org/10.18565/aig.2019.7.49-55;], гестационном сахарном диабете, что свидетельствует о недостаточной специфичности данного показателя [Особенности иммунной системы детей, родившихся у женщин с гестационным сахарным диабетом / Г.Н. Чистякова, И.И. Ремизова, И.А. Газиева и др. // Российский вестник перинатологии и педиатрии. - 2015. - Т. 60, № 2. - С. 42-48].

Технический результат направлен на повышение точности и расширение арсенала средств прогнозирования задержки роста плода у женщин с угрожающими преждевременными родами в сроке 22 - 34 недели гестации.

Заявляемый технический результат достигается тем, что в периферической венозной крови беременных с угрожающими преждевременными родами в сроке 22 - 34 недели гестации до начала сохраняющей терапии определяют относительное содержание Perforin-позитивных клеток в пуле центральных клеток памяти с фенотипом CD45RA-CD62L+ в популяции CD8+ Т-лимфоцитов, и при их значении равном 34,5% или менее прогнозируют задержку роста плода с точностью 92,1%.

Способ осуществляется следующим образом:

1. У беременной женщины с угрожающими преждевременными родами в сроке 22 - 34 недели гестации до начала сохраняющей терапии забирают 1 мл крови из локтевой вены в центрифужную пробирку с 2,7% раствором ЭДТА из расчета 3 мл крови на 1 мл раствора и подслаивают 1 мл фиколл-верографина с градиентом плотности 1,078. Клеточную фракцию лимфоцитов получают методом скоростного центрифугирования при 1500 об/мин в течение 20 минут.

2. К 50 мкл выделенных клеток в концентрации 1×10⁶ кл/мл добавляют по 20 мкл анти-CD8+, анти-CD62L+ и анти-CD45RA+ моноклональных антител, меченных флуорохромами и инкубируют 20 минут в темноте при комнатной температуре.

3. Клетки от моноклональных антител отмывают в 2 мл фосфатно-солевого буфера центрифугированием при 1500 об/мин и фиксируют в течение 15 минут в 100 мкл фиксирующего буфера из набора «FIX & PERM cell permeabilization reagents». Повторяют процедуру отмывки, а затем инкубируют 15 минут со 100 мкл пермеабилизирующего буфера и с 10 мкл анти-Perforin-моноклональными антителами для внутриклеточного окрашивания с последующей отмывкой.

4. Учет реакции проводят на проточном цитофлуориметре. Анализ проводят методом тройного гейтирования: первый гейт (R1) ограничивает на графике прямого и бокового светорассеяния область расположения лимфоцитов; второй гейт (R2) выстраивается в R1 по флуоресценции моноклонального антитела анти-CD8, ограничивая популяцию цитотоксических Т-лимфоцитов; третий гейт (R3) выстраивается в гейте R2 по флуоресценции моноклональных антител анти-CD62L и анти-CD45RA и включает популяцию CD45RA-CD62L+ клеток памяти. На заключительном этапе в R3 определяют уровень Perforin-позитивных клеток.

5. При относительном содержании Perforin-позитивных клеток в пуле центральных клеток памяти с фенотипом CD45RA-CD62L+ в популяции CD8+ Т-лимфоцитов равном 34,5% или менее прогнозируют задержку роста плода у женщин с угрожающими преждевременными родами в сроке 22 - 34 недели гестации.

Новизна заявляемого способа заключается в том, что впервые предлагается прогнозировать задержку роста плода у женщин с угрожающими преждевременными родами в сроке 22 - 34 недели гестации по определению относительного содержания Perforin-позитивных клеток в пуле центральных клеток памяти с фенотипом CD45RA-CD62L+ в популяции CD8+ Т-лимфоцитов в периферической крови.

Возможными причинами задержки роста плода, могут быть субклинический хориоамнионит и виллит неизвестной этиологии (VUE), приводящий к разрушению и дисфункции плаценты [Maternal T Cells in the Human Placental Villi Support an Allograft Response During Noninfectious Villiti / E.A.L. Enninga, P. Raber, R.A. Quinton et al. // J. Immunol. - 2020. - Vol. 204, № 11. - P. 2931-2939. 10.4049/jimmunol.1901297]. Причины этих воспалительных процессов неизвестны, а инфекционные агенты могут быть не идентифицированы [Chronic Inflammation of the Placenta: Definition, Classification, Pathogenesis, and Clinical Significance / C.J. Kim, R. Romero, P. Chaemsaithong, J.S. Kim // Am. J. Obstet .Gynecol. - 2015. - Vol. 213, Suppl. 4. - P. S53-69. 10.1016/j.ajog.2015.08.041]. Некоторые исследования показывают, что ведущую роль в патогенезе субклинического хориоамнионита играет инфильтрация материнских цитотоксических CD8+ Т-лимфоцитов, обладающих высокой эффекторной активностью, в плаценту [Maternal T Cells in the Human Placental Villi Support an Allograft Response During Noninfectious Villitis / E.A.L. Enninga, P. Raber, R.A. Quinton et al. // J. Immunol. - 2020. - Vol. 204, № 11. - P. 2931-2939; Involvement of Hofbauer Cells and Maternal T Cells in Villitis of Unknown Aetiology / J.S. Kim, R. Romero, M. R. Kim et al. // Histopathology. - 2008. - Vol. 52, № 4. - P. 457-464. 10.1111/j.1365-2559.2008.02964.x]. Вероятно, снижение центральных клеток памяти с фенотипом CD45RA-CD62L+ в популяции CD8+ Т-лимфоцитов в периферической крови женщин с угрожающими преждевременными родами может быть связано с их миграцией в плаценту и околоплодные воды, что приводит к развитию асептического воспаления, дисфункции плаценты и нарушению роста плода [Dendrimer-Based N-Acetyl Cysteine Maternal Therapy Ameliorates Placental Inflammation via Maintenance of M1/M2 Macrophage Recruitment / Y. Liu, Q. Na, J. Liu et al. // Frontiers in bioengineering and biotechnology. - 2022. - Vol. 10. - P. 819593. https://doi.org/10.3389/fbioe.2022.819593].

Отличительные признаки способа:

у беременных с угрожающими преждевременными родами в сроке гестации 22 - 34 недели до начала сохраняющей терапии определяют относительное содержание Perforin-позитивных клеток в пуле центральных клеток памяти с фенотипом CD45RA-CD62L+ в популяции CD8+ Т-лимфоцитов, и при его значении равном 34,5% или менее прогнозируют задержку роста плода.

Сущность заявляемого способа поясняется следующими примерами:

Клинический пример 1.

Беременная М., 32 года, беременность 3 (в анамнезе 2 медикаментозных аборта в ранние сроки беременности). Беременность протекала на фоне хронического гастрита.

Пациентка поступила в акушерский стационар с жалобами на схваткообразные боли внизу живота в сроке гестации 23 недели. По данным клинико-лабораторных и функциональных методов исследования поставлен диагноз: Беременность 23 недели. Головное предлежание плода. Угрожающие преждевременные роды.

Согласно предложенному способу до начала проведения сохраняющей терапии в периферической венозной крови беременной определено относительное содержание Perforin-позитивных клеток в пуле центральных клеток памяти с фенотипом CD45RA-CD62L+ в популяции CD8+ Т-лимфоцитов, которое составило 13%.

Заключение: прогноз - задержка роста плода.

Беременной проводилась токолитическая терапия с эффектом. Через 7 дней пациентка была выписана под наблюдение врача женской консультации в удовлетворительном состоянии с диагнозом: Беременность 24 недели. Головное предлежание плода.

Беременность завершилась 1 своевременными родами в сроке 39 недель. Родился доношенный мальчик с массой тела 2650 г, ростом 50 см. При оценке антропометрических параметров с помощью центильных таблиц INTERGROWTH-21^st значение веса соответствовало 7 центилю то есть находилось ниже 10 центиля, значение роста соответствовало 67 центилю.

Диагноз: Доношенный новорожденный, маловесный для гестационного возраста.

Прогноз по заявляемому способу подтвердился.

Клинический пример 2.

Беременная С., 31 год, беременность 3, в анамнезе 1 преждевременные роды в 35 недель беременности и 1 своевременные роды без осложнений. Пациентка поступила в акушерский стационар с жалобами на схваткообразные боли внизу живота в сроке гестации 30 недель 1 день. По данным клинико-лабораторных и функциональных методов исследования поставлен диагноз: Беременность 30 недель 1 день. Головное предлежание плода. Угрожающие преждевременные роды. Мочекаменная болезнь, стадия ремиссии. Хронический пиелонефрит, стадия ремиссии.

Согласно предложенному способу до начала проведения сохраняющей терапии в периферической венозной крови беременной определено относительное содержание Perforin-позитивных клеток в пуле центральных клеток памяти с фенотипом CD45RA-CD62L+ в популяции CD8+ Т-лимфоцитов, которое составило 34,5%.

Заключение: прогноз - задержка роста плода.

Беременной была назначена токолитическая терапия с эффектом, глюкокортикостероидная терапия для профилактики респираторного дистресс-синдрома плода. Через 12 дней пациентка была выписана под наблюдение врача женской консультации в удовлетворительном состоянии с диагнозом: Беременность 31 неделя 6 дней. Головное предлежание плода. Мочекаменная болезнь, стадия ремиссии. Хронический пиелонефрит, стадия ремиссии.

В 34 недели женщина поступила в стационар с началом регулярной родовой деятельности, произошли 3 преждевременные роды через естественные родовые пути. Родился живой недоношенный мальчик с массой тела 1380 г, длиной 40 см. При оценке антропометрических параметров с помощью центильных таблиц INTERGROWTH-21^st значение веса соответствовало 3 центилю, то есть находились ниже 10 центиля, значение роста соответствовало 1 центилю, то есть находились ниже 10 центиля.

Диагноз: Недоношенный новорожденный, малый для гестационного возраста.

Прогноз по заявляемому способу подтвердился.

Клинический пример 3.

Беременная В., 31 год, беременность первая, поступила в акушерский стационар с жалобами на схваткообразные боли в нижних отделах живота в сроке гестации 34 недели. По данным клинико-лабораторных и функциональных методов исследования поставлен диагноз: Беременность 34 недели. Головное предлежание плода. Угрожающие преждевременные роды.

Согласно предложенному способу до начала проведения сохраняющей терапии в периферической венозной крови беременной определено относительное содержание Perforin-позитивных клеток в пуле центральных клеток памяти с фенотипом CD45RA-CD62L+ в популяции CD8+ Т-лимфоцитов, которое составило 31,4%.

Заключение: прогноз - задержка роста плода.

Беременной проводилась токолитическая терапия с эффектом и глюкокортикостероидная терапия с целью профилактики респираторного дистресс-синдрома плода. Через 7 дней пациентка была выписана под наблюдение врача женской консультации с диагнозом: Беременность 35 недель. Головное предлежание плода.

Беременность завершилась первыми своевременными родами в сроке 38 недель и рождением доношенного ребенка женского пола с массой тела 2330 г, ростом 45 см. При оценке антропометрических параметров с помощью центильных таблиц INTERGROWTH-21^st значение веса соответствовало 5 центилю, то есть находилось ниже 10 центиля, значение роста соответствовало 5 центилю, то есть находилось ниже 10 центиля.

Диагноз: Доношенный новорожденный, малый для гестационного возраста.

Прогноз по заявляемому способу подтвердился.

Клинический пример 4.

Беременная К., 28 лет, беременность третья (в анамнезе одни своевременные роды и один медикаментозный аборт) поступила в акушерский стационар в сроке гестации 27 недель с жалобами на схваткообразные боли внизу живота. По данным клинико-лабораторных и функциональных методов исследования поставлен диагноз: Беременность 27 недель. Головное предлежание плода. Угрожающие преждевременные роды. Анемия легкой степени.

Согласно предложенному способу до начала проведения сохраняющей терапии в периферической венозной крови беременной проведено определение относительное содержание Perforin-позитивных клеток в пуле центральных клеток памяти с фенотипом CD45RA-CD62L+ в популяции CD8+ Т-лимфоцитов, которое составило 68,9%.

Заключение: прогноз - отсутствие задержки роста плода.

Беременной была назначена токолитическая терапия с эффектом, глюкокортикостероидная терапия с целью профилактики респираторного дистресс-синдрома плода. Через 10 дней беременная была выписана под наблюдение врача женской консультации с диагнозом: Беременность 28 недель. Головное предлежание плода. Анемия легкой степени.

В 39 недель гестации у женщины произошли вторые своевременные роды через естественные родовые пути, родился живой доношенный ребенок женского пола массой 3100 г, ростом 49 см. При оценке антропометрических параметров с помощью центильных таблиц INTERGROWTH-21^st значение веса и роста соответствовало 50 центилю.

Диагноз: Доношенный новорожденный.

Прогноз по заявляемому способу подтвердился.

Пример 5

Беременная Б., 30 лет, беременность вторая (в анамнезе одни своевременные роды) поступила в акушерский стационар в сроке 28 недель с жалобами на схваткообразные боли внизу живота. По данным клинико-лабораторных и функциональных методов исследования поставлен диагноз: Беременность 28 недель. Головное предлежание плода. Угрожающие преждевременные роды.

Согласно предложенному способу до начала проведения сохраняющей терапии в периферической венозной крови беременной проведено определение относительного содержание Perforin-позитивных клеток в пуле центральных клеток памяти с фенотипом CD45RA-CD62L+ в популяции CD8+ Т-лимфоцитов, которое составило 51,7%.

Заключение: прогноз - отсутствие задержки роста плода.

Беременной была назначена токолитическая терапия с эффектом, глюкокортикостероидная терапия с целью профилактики респираторного дистресс-синдрома плода. Через 7 дней женщина выписана под наблюдение врача женской консультации с диагнозом: Беременность 29 недель. Головное предлежание плода.

В 40 недель гестации у женщины произошли вторые своевременные роды, родился живой доношенный ребенок женского пола массой 4150 г, ростом 53 см. При оценке антропометрических параметров с помощью центильных таблиц INTERGROWTH-21^st значение веса и роста соответствовало 95 центилю.

Прогноз по заявляемому способу подтвердился.

Диагноз: Доношенный новорожденный, крупный для гестационного возраста.

Результаты исследования приведены в таблице 1

Таблица №1 Показатель Количество обследуемых женщин - 63 Истинно-положительный результат 21 Ложно-положительный результат 3 Истинно-отрицательный результат 37 Ложно-отрицательный результат 2 точность способа 92,1% чувствительность 91,3% специфичность 92,5%

Преимущества способа:

1. Способ позволяет с высокой точностью 92,1%, чувствительностью 91,3% и специфичностью 92,5% прогнозировать задержку роста плода у женщин с угрожающими преждевременными родами в широком диапазоне сроков гестации (22 - 34 недели).

2. Представленный способ прост в интерпретации результатов обследования.

3. Предлагаемый способ может использоваться как скрининговый.

Изобретение относится к медицине, а именно к неонатологии, акушерству и гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования задержки роста плода. У беременных женщин с угрожающими преждевременными родами в сроке гестации 22–34 недели до начала сохраняющей терапии в периферической венозной крови определяют относительное содержание Perforin-позитивных клеток в пуле центральных клеток памяти с фенотипом CD45RA-CD62L+ в популяции CD8+ Т-лимфоцитов. При значении, равном 34,5% или менее, прогнозируют задержку роста плода. Способ обеспечивает повышение точности и расширение арсенала средств прогнозирования задержки роста плода у женщин с угрожающими преждевременными родами в сроке 22-34 недели гестации за счет определения относительного содержания Perforin-позитивных клеток в пуле центральных клеток памяти с фенотипом CD45RA-CD62L+ в популяции CD8+ Т-лимфоцитов. 1 табл., 5 пр.

Способ прогнозирования задержки роста плода путем исследования периферической венозной крови беременных женщин, отличающийся тем, что у беременных с угрожающими преждевременными родами в сроке гестации 22–34 недели до начала сохраняющей терапии определяют относительное содержание Perforin-позитивных клеток в пуле центральных клеток памяти с фенотипом CD45RA-CD62L+ в популяции CD8+ Т-лимфоцитов и при его значении, равном 34,5% или менее, прогнозируют задержку роста плода.