ПРОБИОТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ И ПОДДЕРЖАНИЯ СБАЛАНСИРОВАННОЙ МИКРОФЛОРЫ КИШЕЧНИКА У ДЕТЕЙ И МЛАДЕНЦЕВ И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2022 года по МПК A61K35/745 A61K35/747 A61K47/38 A61K31/20 A61K31/733 A61K9/20 

Область техники

Настоящее изобретение относится к пробиотической композиции (биологически активной добавке) для применения у детей для восстановления и поддержания сбалансированной микрофлоры кишечника, содержащей смесь, включающую три вида пробиотических бифидобактерий и по меньшей мере один вид пробиотических лактобацилл, а также неперевариваемый пребиотический фруктоолигосахарид, способствующий росту и жизнедеятельности указанных пробиотических бифидобактерий и лактобацилл и восстановлению нормальной микрофлоры кишечника у детей и младенцев. Также изобретение относится к способу получения указанной биологически активной добавки (пробиотической композиции), обеспечивающему возможность быстрого и недорогого изготовления биологически активной пищевой добавки, которая может быть успешно использована в питании детей для профилактики дисбактериоза, и позволяет в течение длительного времени сохранить полезные свойства указанных пробиотических микроорганизмов. Биологически активная добавка по изобретению обеспечивает восстановление и поддержание сбалансированной микрофлоры кишечника ребенка и профилактика дисбактериоза, а также расширение ассортимента биологически активных добавок на основе пробиотических бактерий, предназначенных для нормализации микрофлоры кишечника у детей и для профилактики дисбактериоза у детей. Под ребенком в контексте настоящего изобретения понимается ребенок в возрасте от 1 до 5 лет, более предпочтительно, в возрасте от 1,5 до 3 лет.

Под термином «пробиотики» здесь и далее понимаются живые микроорганизмы, которые при введении их в организм человека или животного способствуют жизнедеятельности организма хозяина за счет улучшения баланса кишечной микрофлоры (Fuller R., 1989 [1] - см. список ссылок в конце настоящего описания). Термины «пробиотик» и «пробиотический микроорганизм» здесь и далее в рамках настоящей заявки используются в качестве синонимов. Микроорганизм считается пробиотическим, если он остается жизнеспособным в условиях, характерных для пищеварительного тракта (низкий рН в желудке, наличие кислот пищеварительной системы и т.п.), способен прикрепляться к стенкам кишечника, осуществлять метаболизм в кишечнике, технологически применим (подвергается обработке) и демонстрирует клинически подтвержденные и задокументированные оздоравливающие эффекты, и при этом безопасен для потребления человеком (Lee, Y-K, Salmien, S., 1995 [2]).

Важнейшими для поддержания здоровья человека пробиотическими микроорганизмами являются бифидобактерий и лактобациллы. В литературе неоднократно было показано, что лактобациллы и бифидобактерий, колонизирующие кишечник новорожденного, при рождении стерильный, оказывают важное влияние на здоровье хозяина, играя важную роль в работе пищеварительной системы, в том числе, в усвоении минеральных веществ, в работе иммунной системы (Coxam V., 2007 [3] и Seifert S., Watzl В., 2007 [4]). Первичная контаминация новорожденного пробиотическими микроорганизмами (преимущественно, лактобациллами) происходит через рот, при прохождении новорожденного по родовым путям матери; в литературе показано также, что на формирование микрофлоры кишечника младенца влияет микрофлора кишечника матери.

В течение примерно первых 3-5 дней жизни новорожденного происходит первичная микробная колонизация кишечника, а бифидобактерий появляются в кишечнике младенца спустя примерно 10 дней после его рождения, поскольку их размножение становится возможным только после того, как в кишечнике сформирована среда, благоприятная для их размножения.

Показано, что дети, рожденные путем кесарева сечения, имеют существенно меньшее содержание лактобактерий по сравнению с детьми, рожденными естественным путем (Hall М.А., Cole С.В., et al., 1990 [5]; Хавкин А.И., Бельмер С.В. и др., 2006 [6]).

У детей, находящихся на естественном (грудном) вскармливании, в микрофлоре кишечника преобладают бифидобактерий. Ряд авторов связывает с этим меньший риск развития инфекционных заболеваний, в том числе, гастроинтестинальных инфекционных заболеваний и/или заболеваний, требующих антибиотикотерапии, у детей, находящихся на естественном вскармливании (Braun ОН., 1981 [7]; Modler H.W., McKellar R.C., Yaguchi М., 1990 [8]; Moreau М.С, Thomassen М., et al., 1986 [9]; Yoshita M., Fujita K., et al., 1991 [10]; Lohner, S, , D, et al., 2014 [11]). У детей, находящихся на естественном вскармливании, примерно к 2 годам состав микрофлоры кишечника ребенка практически не отличается от состава микрофлоры кишечника взрослого человека (Румянцев А.Г., 2000 [12]). Напротив, у детей, находящихся на искусственном вскармливании, видовое разнообразие микрофлоры кишечника значительно больше; показано, что для микрофлоры кишечника таких детей характерно большее видовое разнообразие бактероидов, клостридий и энтеробактерий (Benno V., Sawada K., Mitsuoka Т., 1984 [13]).

Показано, что различные виды бифидобактерий различаются между собой метаболизмом, активностью ферментов, использованием различных пребиотических олиго- и полисахаридов, композицией клеточной стенки и другими особенностями.

Для нормального роста и жизнедеятельности пробиотических бактерий, колонизирующих кишечник, необходимы пребиотики. Под термином «пребиотик» здесь и далее понимаются пищевые ингредиенты, которые не перевариваются пищеварительной системой человека и не усваиваются в верхних отделах желудочно-кишечного тракта, однако ферментируются микрофлорой ободочной кишки, избирательно стимулируя рост и жизнедеятельность одного или нескольких пробиотических микроорганизмов - представителей микрофлоры кишечника, благоприятной для нормализации функциональной деятельности толстого кишечника человека и для поддержания здоровья человека (Gibson G.R., Roberfroid М.В., 1995 [14]; Tanaka R., Takayama H., Morotomi M. et al., 1983 [15]).

Как правило, пребиотик представляет собой неперевариваемый углевод или сахарный спирт, не расщепляющийся в верхних отделах пищеварительной системы. Наиболее важными пребиотиками являются низкомолекулярные углеводы, такие как фруктоолигосахариды, галактоолигосахариды, моносахариды, такие как ксилит, сорбит, раффиноза и др., дисахариды, такие как лактулоза, и др. (Ардатская М.Д., 2015 [16]). Показано, что пребиотические олигосахариды стимулируют рост бифидобактерий и лактобактерий в толстом кишечнике (Gibson G.R., 1999 [17]; Gibson G.R., Beatty Е.В., et al., 1995 [18]), препятствуют адгезии патогенных микроорганизмов к стенкам кишечника (Bode L., 2012 [19]), а также уменьшают риск развития рака толстой кишки и воспалительной болезни кишечника, включая болезнь Крона и неспецифический язвенный колит (Geier M.S., Butler R.N., Howarth G.S., 2006 [20]; Hedin С., Whelan K., Lindsay J.О., 2007 [21]).

Из уровня техники известны составы, содержащие комплексы пребиотических олиго- и полисахаридов. Так, в патенте США US 9763466 В2, 19.09.2017 [22] описан пребиотический состав, предназначенный для стимулирования роста пробиотических микроорганизмов, таких как лактобациллы и бифидобактерий, содержащий смесь пребиотических олигосахаридов, причем по меньшей мере 60 масс. % составляют галактоолигосахариды, и полисахаридов, причем по меньшей мере 60 масс. % составляют фруктоолигосахариды, а также композиция для детского питания, содержащая данный состав. Несмотря на достоинства композиции [22], она не учитывает потребности в пребиотиках, характерные для детей, находящихся на частично грудном вскармливании или искусственном вскармливании.

Обычно дети, находящиеся на грудном вскармливании, получают пребиотические вещества с молоком матери. Показано, что грудное молоко содержит пребиотические олигосахариды, которые служат субстратом для микрофлоры кишечника младенцев (German J.В., Freeman S.L., et al., 2008 [23]). Напротив, дети, находящиеся на искусственном вскармливании или частичном грудном вскармливании, имеют приблизительно от одной десятой до двух третьих от количества бифидобактерий у младенцев, находящихся на грудном вскармливании. Из уровня техники известны различные композиции, содержащие комплекс пробиотиков и пребиотиков, призванные обеспечить формирование у детей, в том числе у детей, особенно у детей, находящихся на искусственном вскармливании или частичном грудном вскармливании, количественного и качественного состава микрофлоры кишечника, максимально соответствующего составу микрофлоры кишечника детей, находящихся на естественном (грудном) вскармливании.

Из уровня техники известен состав для питания детей, находящихся на искусственном вскармливании или частичном грудном вскармливании, содержащий живые бифидобактерий Bifidobacterium breve и смесь по меньшей мере двух неусваиваемых водорастворимых пребиотических углеводов, где первый углевод составляет от 5% до 95% от общего количества углеводов, где по меньшей мере 50 масс. % от общего количества неусваиваемых углеводов составляют дисахариды и эйкозасахариды и где первый и второй углеводы различаются средним числом моносахаридных единиц в углеводной цепи и/или структурой указанных моносахаридных единиц (WO 2005/039319 А2, 06.05.2005 [24]). Состав [24] предназначен для профилактики иммунных расстройств у младенцев, находящихся на искусственном вскармливании или частичном грудном вскармливании, благодаря колонизации пробиотическими бифидобактериями, входящими в указанный состав, кишечника ребенка и их положительной роли в становлении иммунной системы ребенка (ранее показанной в работе Seifert S., Watzl В., 2007 [4]).

Несмотря на известность из уровня техники пробиотического состава [24], содержащего пробиотические бифидобактерий и смесь нескольких пребиотических углеводов, по-прежнему остается актуальной задача создания пробиотической композиции (биологически активной добавки), предупреждающей развитие дисбактериоза у конечного потребителя, такого как ребенок, и обеспечивающей восстановление и поддержание сбалансированной микрофлоры кишечника.

Из уровня техники известна предлагаемая в качестве ближайшего аналога настоящего изобретения пробиотическая композиция для перорального применения, предназначенная для нормализации микрофлоры кишечника человека, содержащая по крайней мере один пребиотический полисахарид, отличный от крахмала и целлюлозы, и по крайней мере один пробиотический микроорганизм, выбранный из бифидобактерий одного или нескольких видов рода Bifidobacterium, способных расщеплять указанный длинноцепочечный полисахарид, и, не обязательно, второй пробиотический микроорганизм, неспособный расщеплять инулин, причем указанный второй пробиотический микроорганизм выбран из штамма LMG Р-21381 Lactobacillus acidophilus, штамм LMG Р-21380 Lactobacillus paracasei, штамма LMG Р-21021 Lactobacillus plantarum, штамма LMG P-21019 Lactobacillus pentosus, штамма LMG P-21020 Lactobacillus plantarum, штамма LMG P-21022 Lactobacillus plantarum, штамма LMG P-21023 Lactobacillus plantarum, штамма LMG P-21384 Bifidobacterium animalis subsp. lactis, штамма DSM 16506 Streptococcus thermophilus, штамма DSM 16507 Streptococcus thermophilus, штамма DSM 16603 Bifidobacterium longum, штамма DSM 16604 Bifidobacterium breve, штамма DSM 16605 Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus и штамма DSM 16607 Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus, описанная в публикации международной заявки WO 2007/125558 A1, 08.11.2007 [25].

В более предпочтительном воплощении технического решения [25], пробиотический микроорганизм выбран из Bifidobacterium adolescentis (штамм АТСС 15703), Bifidobacterium bifidum (штамм DSM 20082), Bifidobacterium thermophilum (штамм АТСС 258 66) и Bifidobacterium adolescentis (штамм DSM 17103). Альтернативно, композиция [25] может содержать в качестве второго пробиотического микроорганизма смесь двух или более перечисленных выше пробиотических микроорганизмов. Пребиотический полисахарид, отличный от крахмала и целлюлозы, представляет собой фруктан, галактоманнан, арабиногалактан, арабиноксилан, галактан или смесь указанных полисахаридов. В самом предпочтительном воплощении [25], пребиотический полисахарид представляет собой фруктан, такой как инулин. Композиция [25] может быть выполнена в виде различных форм, пригодных для перорального применения, включая капсулы, гранулы, спрессованные гранулы, растворы и суспензии для приема внутрь, таблетки, саше, порошки, формы с контролируемым высвобождением, формы с кишечнорастворимой оболочкой, формы, полученные лиофилизацией, и т.д. и т.д.

Пробиотическую композицию [25] получают традиционными для данной области техники способами, которые выбирают в зависимости от вида соответствующей препаративной формы, в которой выполнена композиция, с использованием традиционных для соответствующей препаративной формы вспомогательных компонентов - носителей, лубрикантов, диспергирующих веществ, антиагрегантов, ароматизирующих добавок, стабилизаторов и так далее.

В одном из наиболее предпочтительных воплощений, композиция [25] содержит от 5 до 90 масс. % пребиотика и от 1 до 15 масс. % инулина. В более предпочтительном воплощении, композиция [25] содержит 5-10 масс. % пробиотического микроорганизма. В качестве пребиотика композиция согласно WO 2007/125558 А1 использует неперевариваемый длинноцепочечный полисахарид, такой как инулин. Наличие в составе композиции инулина избирательно стимулирует рост бифидобактерий и колонизацию ими кишечника человека; одновременно инулин препятствует росту колонизации кишечника патогенными и условно патогенными микроорганизмами и усиливает детоксикационные функции микрофлоры и ее способность поддерживать все виды обмена веществ в организме, особенно углеводный и липидный метаболизм. Образующиеся в процессе микробного метаболизма биологически активные вещества (летучие жирные кислоты, витамины, аминокислоты и др.) используются для выработки энергии и метаболизма кишечника и организма в целом.

Несмотря на достоинства композиции [25], ее состав разработан без учета потребностей в пробиотиках и пребиотиках, характерных именно для детского организма. Более того, возможность использования композиции [25] у детей и младенцев, в частности, у младенцев, находящихся на искусственном или частично грудном вскармливании, в принципе не показана. Кроме того, для конкретных препаративных форм пробиотической композиции [25] срок хранения составляет всего лишь 30 дней.

Таким образом, остается актуальной задача разработки оптимального состава пробиотической композиции (биологически активной добавки), которая расширяла бы арсенал средств, предназначенных для нормализации количественного и качественного состава микрофлоры кишечника у детей и младенцев, особенно у детей, находящихся или находившихся на искусственном или частично грудном вскармливании.

Данная задача решена в рамках настоящего изобретения путем создания пробиотической композиции (биологически активной пищевой добавки), предназначенной для нормализации количественного и качественного состава микрофлоры кишечника у детей и младенцев, содержащей сухую бактериальную массу (сухую смесь), включающую три вида пробиотических бифидобактерий, включая Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum и Bifidobacterium breve, и по меньшей мере один вид пробиотических лактобацилл, представляющий собой Lactobacillus rhamnosus, а в качестве пребиотика - неперевариваемый пребиотический фруктоолигосахарид, а также нутрицевтически приемлемые вспомогательные компоненты, такие как нутрицевтически приемлемые наполнители, нутрицевтически приемлемые связующие и нутрицевтически приемлемые лубриканты. Предпочтительно (без ограничения), пробиотическая композиция по изобретению выполнена в форме таблетки, содержащей от 0,04 до 0,1 г сухой бактериальной массы и от 0,1 до 0,2 г неперевариваемого пребиотического фруктоолигосахарида. Наиболее предпочтительно, композиция по изобретению выполнена в форме таблетки, содержащей 0,046 г сухой бактериальной массы (бактериальной смеси), включающей вышеуказанные пробиотические бифидобактерий и пробиотические лактобациллы, 0,12 г инулина, 0,132 г микрокристаллической целлюлозы и 0,002 г кальция стеарата, причем 1 грамм указанной сухой бактериальной массы содержит не менее 1×10⁸ КОЕ, более предпочтительно, не менее 1×10⁹ КОЕ каждого из видов Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum и Bifidobacterium breve, а также не менее 1×10⁸ КОЕ, более предпочтительно, не менее 1×10⁹ КОЕ пробиотических лактобацилл Lactobacillus rhamnonsus. В качестве микрокристаллической целлюлозы, предпочтительно (без ограничения), используют модифицированную микрокристаллическую целлюлозу фармакопейного качества, например, Prosolv^®, в частности, Prosolv^® SMCC, представляющий собой силикатированную микрокристаллическую целлюлозу, получаемую путем сопроцессинга микрокристаллической целлюлозы (98%) и коллоидного диоксида кремния (2%), выпускаемый JRC Pharma Family (Prosolv^® SMCC: Silicified Macrocrystalline Cellulose (The Original Silicified MCC).

«JRC Pharma Family», 13.07.2016 [26]). Благодаря равномерному распределению коллоидного диоксида кремния по поверхности частиц микрокристаллической целлюлозы, Prosolv^® SMCC по сравнению с традиционной микрокристаллической целлюлозой обладает в пять раз большей удельной поверхностью и уровнем шероховатости частиц, что обеспечивает существенно более высокую прессуемость, текучесть, смешиваемость и распадаемость Prosolv^® SMCC по сравнению с традиционной микрокристаллической целлюлозой, а также позволяет существенно повысить дисперсность активных веществ и стабильность порошковой смеси для инкапсулирования. Специалисту при этом понятно, что для осуществления настоящего изобретения может быть использованы и другие разновидности микрокристаллической целлюлозы фармакопейного качества.

Решаемая изобретением задача - создание пробиотической композиции (биологически активной пищевой добавки), предназначенной для использования у детей, включая детей, находящихся или находившихся на искусственном или частично грудном вскармливании, для формирования сбалансированной микрофлоры кишечника и для профилактики дисбактериоза у детей, содержащей жизнеспособные пробиотические бифидобактерий и лактобациллы, а также разработка способа изготовления пробиотической биологически активной добавки, который позволил бы сохранить жизнеспособность и полезные свойства пробиотических бактерий, входящих в состав добавки, как при изготовлении композиции, так и на протяжении всего срока ее хранения. Под сбалансированной (нормальной) микрофлорой кишечника здесь и далее понимается микрофлора кишечника, количественные и качественные характеристики которой максимально приближены к соответствующим характеристикам микрофлоры кишечника здорового ребенка, в частности, здорового ребенка, находящегося на грудном вскармливании.

Технический результат изобретения, относящегося к пробиотической композиции, - расширение арсенала средств для восстановления и поддержания сбалансированной микрофлоры кишечника и для профилактики дисбактериоза у детей. Технический результат изобретения, относящегося к способу получения указанной пробиотической композиции, - обеспечение пробиотической композиции, содержащей живые пробиотические бактерии (бифидобактерий и лактобациллы), в которой жизнеспособность и полезные свойства пробиотических бактерий сохранялись бы как при изготовлении композиции, так и при ее хранении на протяжении длительного времени.

Видовой состав бактериальной массы, входящей в состав биологически активной пищевой добавки по изобретению и включающей лактобациллы и бифидобактерий, позволяет обеспечить у потребителя такой пищевой добавки формирование количественного и качественного профиля микрофлоры кишечника, максимально приближенного к профилю микрофлоры кишечника у детей, в том числе, у детей, находящихся или находившихся на грудном вскармливании.

В предпочтительном воплощении, неперевариваемый пребиотический фруктоолигосахарид представляет собой инулин. В различных предпочтительных воплощениях инулин может представлять собой инулин, получаемый из растительного сырья, в частности (без ограничения), из агавы или топинамбура.

В предпочтительном воплощении, биологически активная пищевая добавка содержит нутрицевтически приемлемые вспомогательные вещества. В более предпочтительном воплощении указанные нутрицевтически приемлемые вспомогательные вещества, без ограничения, включают нутрицевтически приемлемое связующее, облегчающее возможность прессования таблетировочной смеси и увеличивающее механическую прочность таблетки, и нутрицевтически приемлемый лубрикант (смазывающее вещество). В более предпочтительном воплощении, в качестве связующего используют микрокристаллическую целлюлозу, а в качестве лубриканта - соль стеариновой кислоты, такую как стеарат кальция или стеарат магния. В наиболее предпочтительном воплощении, используют микрокристаллическую целлюлозу и стеарат кальция фармакопейного качества. Здесь и далее термин «вспомогательный компонент фармакопейного качества» означает соответствие указанного вспомогательного компонента требованиям Европейской фармакопеи (European Pharmacopoeia), Фармакопеи США (United States Pharmacopoeia) или Государственной фармакопеи РФ XIII издания.

В предпочтительном воплощении, одна таблетка биологически активной добавки по изобретению содержит от 0,07 до 0,15 г микрокристаллической целлюлозы и от 0,001 до 0,03 г стеарата кальция. В наиболее предпочтительном воплощении, одна таблетка биологически активной добавки по изобретению содержит 0,0 9 г микрокристаллической целлюлозы и 0,01 г стеарата кальция.

Также изобретение относится к способу изготовления такой биологически активной добавки, где указанный способ включает раздельную подготовку каждой из культур Lactobacillus rhamnonsus, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum и Bifidobacterium breve для ферментации, где указанная подготовка включает в себя раздельное высевание культур Lactobacillus rhamnonsus, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum и Bifidobacterium breve на питательные среды (предпочтительно - на жидкую среду МРС, разлитую по пробиркам), с последующим термостатированием указанных культур в течение 24-72 часов (предпочтительно, при температуре 37±0,5°С) и с последующими засеванием термостатированными культурами емкостей с жидким МРС агаром и инкубированием в течение 48-60 часов при температуре 37±0,5°С, переносом указанных культур в ферментер с последующим выращиванием указанных культур в указанном ферментере, причем указанное выращивание осуществляется при температуре 37±0,5°С и при избыточном давлении в полости ферментера, составляющем 0,025±0,005 МПа, концентрированием указанных культур до заданного объема концентрата, добавлением защитной среды, охлаждением, сублимационной сушкой, где указанную сублимационную сушку осуществляют в течение 30-40 часов при температуре не выше -40°С и давлении не более 30 Па, объединением сухих бактериальных масс, смешиванием с предварительно подготовленными компонентами таблетировочной смеси, включая нутрицевтически приемлемое связующее и нутрицевтически приемлемый лубрикант, и прессование таблетировочной смеси с получением таблетки

«Предварительная подготовка» вспомогательных компонентов таблетировочной смеси здесь включает в себя помол указанных компонентов на мельнице, например, такой как мельница молотковая ММ-10, и просеивание указанных компонентов через сито. Предпочтительно, для просеивания компонентов смеси используют сито с квадратными ячейками, со стороной квадрата 1 мм.

«Жидкая среда МРС» здесь представляет собой питательную среду, приготовленную согласно de Man J.D., Rogosa М., Sharpe М.Е., 1960 [27]. Наиболее предпочтительно, термостатирование культур, ферментацию и последующее инкубирование осуществляют при температуре 37±0,5°С. При этом при выборе защитной среды для проведения сублимационной сушки учитывают количественный и качественный состав ее компонентов, необходимых для снижения гибели клеток бифидобактерий и лактобацилл в ходе замораживания и сублимационного высушивания. В качестве защитной среды при проведении сублимационной сушки могут быть использованы, без ограничения, желатин (в частности, 8% желатин), натрий-карбоксиметилцеллюлоза (в частности, 1% натрий-карбоксиметилцеллюлоза), крахмал (в частности, 10% крахмал) и поливинилпирролидон (в частности, 10% поливинилпирролидон), а также среды более сложного состава, например, среды, известные из диссертации Бахтина И.А., 2012 [28].

Здесь и далее термин «нутрицевтически приемлемый компонент» указывает на совместимость компонента с другими ингредиентами биологически активной пищевой добавки, а также на допустимость использования указанного компонента при изготовлении нутрицевтических композиций и на его безопасность для потребителя пищевой добавки.

Предварительная подготовка компонентов таблетировочной смеси, включая нутрицевтически приемлемое связующее и нутрицевтически приемлемый лубрикант, включает в себя помол указанных компонентов и их последующее просеивание через сито с размером ячейки 1 мм. Помол может осуществляться при помощи любого пригодного для этих целей оборудования, например, при помощи фармацевтической мельницы или молотковой мельницы. Прессование осуществляется путем механического сдавливания определенного количества таблетировочной смеси между двумя пуансонами. Способ согласно изобретению дополнительно может включать стадию обеспыливания полученных таблеток. Также получение таблетки биологически активной добавки по изобретению, по необходимости, может также включать в себя стадию нанесения на таблетку риски или маркировки (например, маркировки, содержащей товарный знак производителя и др.). В этом случае нанесение на таблетку риски или маркировки осуществляют на стадии прессования таблетировочной смеси. Также способ по изобретению дополнительно может включать в себя стадию фасовки таблеток в заводскую упаковку, например, по 10, 20, 30, 40 и т.д. таблеток.

Технический результат предлагаемого способа - сохранение жизнеспособности и полезных свойств пробиотических микроорганизмов, входящих в состав композиции, на протяжении длительного времени.

Нижеприведенный пример приводится исключительно в целях иллюстрации настоящего изобретения, а не в целях ограничения объема притязаний.

Пример 1. Получение пробиотической композиции по изобретению. Исследование стабильности пробиотической композиции в условиях ускоренного хранения.

Исходные культуры пробиотических бифидобактерий Bifidobacterium bifidum, предпочтительно штаммы, выбранные из Bb-06, DSM20239, НА-132, Idcc 4201, JCM7003, KCTC3357, L22, LMG13195, S28a, BKM Ас-2773D, Bifidobacterium longum, предпочтительно штаммы, выбранные из В379М, ВВ46, ВВ536, Bl-05, DSM20219, НА-135, SD5219, BKM AC-2775D, и Bifidobacterium breve, предпочтительно штаммы, выбранные из Bb-03, НА-129, LMG13208, R0070, SD5206, BKM AC-2776D, а также пробиотических лактобацилл Lactobacillus rhamnonsus, предпочтительно штаммы, выбранные из А119, CLR2, GR-1, GG, НА-111, HN001, LB21, Lcr35, Lr-32, R0011, BKM AC-3170D, с чашек Петри пересевают на жидкую среду МРС [26], разлитую по пробиркам, и выращивают в течение 2 суток в термостате при 37°С. Далее культурами из пробирок засевают бутыль объемом 3000 мл, содержащую жидкую среду МРС; выращивание осуществляют при температуре 37°С в течение 48-60 часов, после чего жидкий посевной материал передают на стадию ферментации. Предпочтительно (без ограничения), ферментацию осуществляют в ферментере «Биор-250», предварительно простерилизованном в течение 90 минут при температуре 132±2°С. При этом питательную среду перед высеванием культур стерилизуют глухим паром при температуре 112-115°С. После захолаживания питательной среды в нее раздельно добавляют культуры Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve и Lactobacillus rhamnonsus и помещают в ферментер для осуществления ферментации. При этом ферментацию осуществляют при температуре 37±0,5°С и избыточном давлении в полости ферментера, составляющем 0,025±0,005 МПа. После окончания ферментации культуральные жидкости с каждого ферментера поочередно концентрируют на фильтрационной установке до заданного объема концентрата. По окончанию процесса концентрирования концентраты культур Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve и Lactobacillus rhamnonsus каждой из культур отдельно сливают в реактор и добавляют защитную среду.

В качестве защитных сред применяются вещества, образующие с водой истинные и коллоидные растворы. Эти среды могут быть разделены на три группы: коллоидные среды животного, растительного и минерального происхождения; среды, содержащие растворимые вещества, такие как углеводы и продукты гидролиза белков - пептоны и аминокислоты и среды сложного состава, в которых коллоидные вещества сочетаются с растворимыми.

Для подготовки защитной среды используют либо сахарозо-желатиновый агар (СЖА) (10% сахарозы, 1,5% желатина, 0,1% агар-агара в дистиллированной воде), либо натуральное снятое молоко, сепарированное три раза, или сухое молоко для бактериологических целей (Difco, США) в концентрации 10%, либо используют иные хорошо известнее защитные среды, такие как среда Стэмпа, содержащая 10% желатина и 0,25-0,5% аскорбиновой кислоты в гидролизате натурального обезжиренного молока или минимальная среда М9 с добавлением 1% тиомочевины, либо 10% сахарозы, 10% мальтозы, 10% лактозы, 1,5% желатина.

Защитную среду разливают в стеклянные пробирки (12 мл) по 5 мл; 3 раза стерилизуют текучим паром и проверяют стерильность путем инкубации 3 суток при 37°С Защитные среды хранят при 5°С не более 1 месяца.

Полученный объем технологической жидкости каждой из культур охлаждают до температуры 5°С и разливают в стерильные бутыли, которые затем передают на стадию сублимационной сушки. В процессе сублимационной сушки технологическую жидкость разливают в поддоны из нержавеющей стали с достижением толщины слоя технологической жидкости, содержащей каждую из культур Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve и Lactobacillus rhamnonsus, составляющей 10±1 мм. Затем поддоны с разлитой в них технологической жидкостью помещают в камеру установки для сублимационной сушки и осуществляют в течение 30-40 часов сублимационную сушку технологической жидкости при давлении не выше 30 Па, при этом температура на протяжении всего цикла сушки меняется согласно заложенной программе от -30°С до 30°С. Полученные сухие бактериальные массы пробиотических микроорганизмов каждой из культур Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve и Lactobacillus rhamnonsus, смешивают с микрокристаллической целлюлозой (предпочтительно, с силикатированной микрокристаллической целлюлозой, такой как Prosolv^® SMCC) для доведения содержания каждой из культур Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve и Lactobacillus rhamnonsus до не менее 1±10⁸ КОЕ на 1 грамм смеси. Определение количества жизнеспособных бактерий проводили в соответствии с ОФС.1.7.1.0003.15 "Бифидосодержащие пробиотики".

Полученные смеси пробиотических микроорганизмов Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve и Lactobacillus rhamnonsus в суммарном количестве 0,4 6 г на капсулу с микрокристаллической целлюлозой от 0,09 до 0,14 г на капсулу смешивают друг с другом и перемешивают со вспомогательными компонентами, включая инулин 0,12 г на капсулу и стеарат кальция от 0,002 до 0,004 г на капсулу, которые предварительно измельчают и просеивают через сито с размером пор не более 1 мм, в течение по крайней мере 10 минут вплоть до образования однородной смеси и передают на стадию таблетирования. Отбирают навеску таблетировочной смеси (0,3±0,03 г), размещают указанную навеску между верхним и нижним таблетировочными пуансонами таблетировочного пресса РТП-24, осуществляют собственно таблетирование путем механического сдавливания навески между указанными пуансонами, при этом, если необходимо, на таблетки наносят риску и/или маркировку. Изготовленные таким образом таблетки, по необходимости, обеспыливают в вытяжном шкафу, на ситах с ячейкой в виде квадрата со стороной 5 мм. Готовые обеспыленные таблетки упаковывают в блистеры по 20, 30, 60 и т.д. таблеток при помощи любого счетно-фасовочного устройства, используемого в технологии твердых препаративных форм.

Жизнеспособность пробиотических бактерий, входящих в состав композиции по изобретению, а также сохранение полезных свойств композиции, полученной выше, при ее хранении исследуют в условиях ускоренного старения.

Метод «ускоренного старения» заключается в выдерживании испытуемой биологически активной добавки при температурах и влажности, превышающих температуру и влажность его хранения в процессе обращения. При повышенных температурах, как правило, ускоряются протекающие в лекарственных средствах физико-химические процессы, приводящие со временем к нежелательным изменениям качества. Таким образом, при повышенной температуре промежуток времени, в течение которого контролируемые показатели качества лекарственного средства сохраняются в допустимых пределах (экспериментальный срок годности), искусственно сокращается в сравнении со сроком годности при температуре хранения. Это позволяет значительно сократить время, необходимое для установления срока годности.

Срок годности (С) при температуре хранения (t_xp) связан с экспериментальным сроком годности (С_Э) при повышенной температуре экспериментального хранения (t_э) следующей зависимостью:

С=K-С_э,

где коэффициент соответствия .

Температурный коэффициент скорости химической реакции (А) принят равным 2,5. Приведенная зависимость основана на правиле Вант-Гоффа о 2-4-кратном росте скоростей химических реакций при увеличении температуры на 10°С.

Значение коэффициента соответствия (K) в зависимости от выбранного температурного интервала (t_э-t_xp), равного 25°С, составляет 9,9. Срок экспериментального хранения при выбранном сроке годности 2 года составляет 74 суток. В качестве композиции сравнения выбрана композиция пробиотических бифидобактерий Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve и пробиотических лактобацилл Lactobacillus rhamnosus с лактозой.

При этом для пробиотической композиции по изобретению показано, что ее полезные свойства сохраняются в течение по меньшей мере 24 месяцев. При этом композицию необходимо хранить в невскрытой заводской упаковке при температуре не выше 25°С, в защищенном от прямых солнечных лучей месте. Если заводская упаковка уже вскрыта, композицию по изобретению необходимо хранить в плотно закрытом флаконе не более 24 месяцев.

Предпочтительно, пробиотическую композицию (биологически активную добавку) по изобретению употребляют по 1 таблетке 2 раза в день во время еды на протяжении 14 дней, при этом ребенку потребителю биологически активной добавки дают проглотить ее таблетку, запив небольшим количеством негорячей жидкости, либо растворяют таблетку перед применением в небольшом количестве негорячей жидкости.

Таким образом, биологически активная добавка в соответствии с настоящим изобретением обеспечивает расширение ассортимента пробиотических композиций (биологически активных добавок) на основе пробиотических бифидобактерий и лактобацилл, которые могут применяться для восстановления и поддержания сбалансированной микрофлоры кишечника у детей. В свою очередь, способ в соответствии с настоящим изобретением обеспечивает получение указанной биологически активной добавки с минимальными экономическими затратами и затратами времени, с сохранением жизнеспособности и полезных свойств пробиотических микроорганизмов, входящих в ее состав, в течение длительного времени.

Изобретение может быть использовано в медицине, фармакологии, химико-фармацевтической, пищевой промышленности

Ссылки

1. Fuller R. Probiotics in man and animals. // "Journal of Applied Microbiology", 1989, 66: 365-378.

2. Lee, Y-K, and Salmien, S. 1995. The coming age of probiotics. // "Trends in Food Science & Technology", 1995, 6: 241-245.

3. Coxam V. Current data with inulin-type fructans and calcium, targeting bone health in adults. // "The Journal of Nutrition", NOV 2007; 137 (11 Suppl): 2527S-2533S.

4. Seifert S., Watzl B. Inulin and oligofructose: review of experimental data on immune modulation. // "The Journal of Nutrition", Nov. 2007; 137 (11 Suppl): 2563S-2567S.

5. Hall M.A., Cole C.B., et al. Factors influencing the presence of faecal lactobacilli in early infancy. // "Archives of Disease in Childhood", 1990; 65: 185-8.

6. Хавкин A.M., Бельмер С.В., Волынец Г.В., Жихарева Н.С. Функциональные заболевания пищеварительного тракта у детей. Принципы рациональной терапии. // Справочник педиатра: ежемесячный научно-практический журнал. - 2006. - №2. - С. 17-32.

7. Braun ОН. Effect of consumption of human milk and other formulas on intestinal bacterial flora in infants. - In: Lebenthal B. ed. Gastroenterology and nutrition in infancy. // New York: "Raven Press", 1981: 247-51.

8. Modler H.W., McKellar R.C, Yaguchi M. Bifidobacteria and bifidogenic factors. // "Canadian Institute of Food Science and Technology Journal", 1990; 23: 29-41.

9. Moreau M.C, Thomassen M., et al. Cinetique d'establissement de la microflore digestive chez le nouveau-ne humain en fonction de la nature du lait. (Establishment of the digestive tract microflora in newborn infants as a function of milk type.). // "Reproduction, Nutrition, Development", 1986; 26: 745-53 (in French).

10. Yoshita M., Fujita K., et al. Development of the normal intestinal flora and its clinical significance in infants and children. // "Bifidobacteria Microflora", 1991; 10: 11-27.

11. Lohner, S., , D., et al. Prebiotics in healthy infants and children for prevention of acute infectious diseases: a systematic review and meta-analysis. // "Nutrition Reviews", Aug. 2014; 72 (8): 523-31.

12. Benno V. Sawada K, Mitsuoka T. The intestinal microflora of infants: composition of fecal flora in breast-fed and bottle-fed infants. // "Microbiology and Immunology", 1984; 28: 975-86.

13. Румянцев А.Г. Дисбактериоз как индикатор здоровья и показание к терапии у детей: национальный миф и научная реальность. // "Детская больница", 2000, №1, стр. 75-77.

14. Gibson G.R., Roberfroid М.В. Dietary modulation of the human colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics. // "The Journal of Nutrition", 1995 Jun; 125(6): 1401-12.

15. Tanaka R., Takayama H., Morotomi M., et al. Effect of administration TOS and B. breve 4006 on the human fecal flora. // "Bifidobacteria microflora", 1983; 2: p. 17-24.

16. Ардатская М.Д. Пробиотики, пребиотики и метабиотики в коррекции микроэкологических нарушений кишечника. // "Медицинский совет", 2015. - №13 - С. 94-99.

17. Gibson G.R. Dietary modulation of the human gut microflora using the prebiotics oligofructose and inulin. // "The Journal of Nutrition", 1999; 129 (7) Suppl: 1438S-41S.

18. Gibson G.R., Beatty E.B., et al. Selective stimulation of bifidobacteria in the human colon by oligofructose and inulin. // "Gastroenterology", 1995; 108: 975-82.

19. Bode L. Human milk oligosaccharides: Every baby needs a sugar mama. // "Glycobiology", 2012 Sep; 22(9): 1147-1162.

20. Geier M.S., Butler R.N., Howarth G.S. Probiotics, prebiotics and synbiotics: a role in chemoprevention for colorectal cancer? // "Cancer Biology & Therapy", 2006 Oct; 5 (10): 1265-1269.

21. Hedin C, Whelan K., Lindsay J.O. Evidence for the use of probiotics and prebiotics in inflammatory bowel disease: a review of clinical trials. // "The Proceedings of the Nutrition Society", 2007 Aug; 66 (3): 307-315.

22. US 9763466 B2 «Carbohydrate mixture», патентообладатель: "N.V. Nutricia" (NL), МПК: A23L 1/29, A61K 31/715, A61K 31/7016, A61K 31/702, A61K 31/733, A23L 29/30, A23L 33/00, A23L 33/10, A23L 33/21, опубликовано: 19.09.2017.

23. German J.В., Freeman S.L., et al. Human Milk Oligosaccharides: Evolution, Structures and Bioselectivity as Substrates for Intestinal Bacteria. // " Nutrition workshop series. Paediatric programme", 2008; 62: 205-22.

24. WO 2005/039319 A2 «SYNBIOTIC COMPOSITION FOR INFANTS», заявитель: "N.V. NUTRICIA" (NL), МПК: A23L 1/29, A23L 1/30, A23L 1/308, A61K 31/702, A61K 31/733, A61K 35/74, опубликовано: 06.05.2005.

25. WO 2007/125558 A1 «SYMBIOTIC COMPOSITION COMPRISING NON-DIGESTIBLE POLYSACCHARIDES AND BIFIDOBACTERIA WHICH METABOLIZE THEM AND ITS USES», заявитель: "ANIDRAL S.R.L." (IT), МПК: A23L 1/03, A23L 1/052, A61K 35/74, A23C 9/12, опубликовано: 08.11.2007.

26. Prosolv^® SMCC: Silicified Microcrystalline Cellulose (The Original Silicified MCC). - «JRC Pharma Family», 13.07.2016. Доступно посредством сети Интернет; режим доступа (URL): http://www.jrspharma.com/pharma-wAssets/docs/brochures/PROSOLV-SMCC.pdf.

27. De Man J.D., Rogosa, M., Sharpe, M.E. A Medium for the Cultivation of Lactobacilli. // "Journal of Applied Bacteriology", 1960; 23, pp. 130-135.

28. Бахтин И.А. Совершенствование процесса сублимационного высушивания лекарственных препаратов. Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук. Пермь, 2012. Доступно посредством сети Интернет по адресу (URL): http://www.pfa.ru/files/Bachtin.pdf.

Изобретение может быть использовано для восстановления и поддержания сбалансированной микрофлоры кишечника, а также для профилактики дисбактериоза у детей и младенцев. Способ изготовления пробиотической композиции включает раздельное высевание культур пробиотических лактобацилл Lactobacillus rhamnosus и пробиотических бифидобактерий Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum и Bifidobacterium breve, в жидкую среду МРС с последующим термостатированием указанных культур в течение 24-72 часов при температуре 37±0,5°С и с последующими засеванием термостатированными культурами емкостей с жидким МРС агаром и инкубированием в течение 48-60 часов при температуре 37±0,5°С. Затем осуществляют перенос указанных культур в ферментер и их выращивание в ферментере при температуре 37±0,5°С, pH 6,0-7,0 и избыточном давлении в полости ферментера, составляющем 0,025±0,005 МПа, концентрирование указанных культур, добавление защитной среды, охлаждение концентратов и их сублимационную сушку. Полученные сухие бактериальные массы объединяют и смешивают с нутрицевтически приемлемыми вспомогательными компонентами, с последующим перемешиванием до образования однородной смеси, и инкапсулированием или таблетированием указанной смеси. Обеспечивается получение биологически активной добавки с минимальными экономическими затратами и затратами времени, с сохранением жизнеспособности и полезных свойств пробиотических микроорганизмов, входящих в ее состав, в течение длительного времени. 3 з.п. ф-лы, 1 пр., 1 табл.

1. Способ изготовления пробиотической композиции, включающий раздельное высевание культур пробиотических лактобацилл Lactobacillus rhamnosus и пробиотических бифидобактерий Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum и Bifidobacterium breve в жидкую среду МРС с последующим термостатированием указанных культур в течение 24-72 часов при температуре 37±0,5°С и с последующими засеванием термостатированными культурами емкостей с жидким МРС агаром и инкубированием в течение 48-60 часов при температуре 37±0,5°С, перенос указанных культур в ферментер с последующим выращиванием указанных культур в указанном ферментере при температуре 37±0,5°С, pH 6,0-7,0 и избыточном давлении в полости ферментера, составляющем 0,025±0,005 МПа, концентрирование указанных культур до заданного объема концентрата, добавление защитной среды, охлаждение концентратов, сублимационную сушку концентратов, объединение сухих бактериальных масс культур Lactobacillus rhamnosus, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum и Bifidobacterium breve, смешивание с предварительно подготовленными нутрицевтически приемлемыми вспомогательными компонентами, включая пребиотик, нутрицевтически приемлемое связующее и нутрицевтически приемлемый лубрикант, с последующим перемешиванием до образования однородной смеси, и инкапсулирование указанной смеси или таблетирование указанной смеси с получением таблетки.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что защитная среда представляет собой сахарозо-желатиновый агар.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что после добавления защитной среды концентраты охлаждают до 5°С.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что дополнительно включает стадии обеспыливания таблеток или капсул и стадию фасовки таблеток или капсул.