ПРОБИОТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ МИКРОФЛОРЫ КИШЕЧНИКА И ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ СИНДРОМА ИЗБЫТОЧНОГО БАКТЕРИАЛЬНОГО РОСТА И ДИАРЕЙ И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2020 года по МПК A61K35/745 A61K35/747 A61K31/7016 A61K47/38 A61K31/20 A61K9/48 

Область техники:

Настоящее изобретение относится к пробиотической композиции (биологически активной пищевой добавке) для восстановления микрофлоры кишечника и для профилактики синдрома избыточного бактериального роста и диарей, включая антибиотик-ассоциированный дисбактериоз и антибиотик-ассоциированную диарею, а также к технологии получения такой пробиотической композиции.

Уровень техники:

Бифидобактерии являются одними из нескольких основных бактериальных культур, присутствующих в микрофлоре толстой кишки человека, и представляют собой пробиотические микроорганизмы. (Под термином «пробиотический микроорганизм» здесь и далее понимаются активные микроорганизмы, способные приносить организму-хозяину пользу в отношении здоровья в том случае, когда их введение осуществляется в достаточном количестве. См.: "Joint FAO/WHO Expert Consultation Probiotics in food." - "FAO Food and nutrition paper", №85 [1]; см. список ссылок в конце настоящего описания).

В уровне техники показано, что важнейшими для поддержания здоровья человека пробиотическими микроорганизмами являются бифидобактерии (Bifidobacterium) и лактобациллы (Lactobacillus) (Reid G., Jass J., et al., 2003 [2]). Бифидобактерии и лактобациллы широко применяются для создания пробиотических композиций, предназначенных для различных целей, в частности, для профилактики и коррекции нарушения деятельности пищеварительной системы, в том числе, для профилактики диареи. Из уровня техники хорошо известно, что диарея, связанная с применением антибиотиков, является одним из наиболее распространенных осложнений антибиотикотерапии. Показано, что с антибиотик-ассоциированной диареей сталкиваются от 5 до 39% пациентов, использующих антибиотики. Другим важным осложнением антибиотикотерапии часто бывает Clostridium dificile (С. dificile)-ассоциированная диарея. Ее развитие связано с подавлением нормальной микрофлоры кишечника под действием антибиотиков, что создает благоприятные условия для размножения C. difficile и для перехода нетоксигенных клостридий в токсинобразующие формы. Другими факторами риска для C. difficile-ассоциированной диареи являются пожилой возраст пациента (старше 65 лет), иммуносупрессивная терапия и др.

В работах McFarland L.V., 2011 [3-5] показано, что лактобактерии и бифидобактерии обладают очень высоким профилактическим потенциалом, который позволяет применять их для профилактики диарей и, в частности, для профилактики антибиотик-ассоциированных и C. dificile-ассоциированных диарей.

Из уровня техники известен ряд препаратов на основе пробиотических бактерий, которые могут быть использованы для профилактики диарей, в том числе, антибиотик-ассоциированных диарей и C. dificile-ассоциированный диарей. Например, из патента RU 2466185 C2, 10.11.2012 [6] известен пробиотический штамм бифидобактерий Bifidobacterium longum, депонированный в Национальных коллекциях промышленных, пищевых и морских бактерий (NCIMB), номер депонирования 41387, и пробиотическая композиция, содержащая указанный штамм Bifidobacterium longum совместно с фармацевтически приемлемым носителем, таким как капсула, таблетка или порошок для приема внутрь, или пищевым носителем, таким как сквашенное молоко, йогурт, замороженный йогурт, сухое молоко, молочный концентрат и так далее. Пробиотический штамм и пробиотическая композиция [6] могут использоваться, в частности, для профилактики и/или лечения воспалительного заболевания кишечника, синдрома раздраженного кишечника, а также диареи, включая антибиотик-ассоциированную диарею. Тем не менее, пробиотическая композиция [6] не использует пробиотический потенциал других бифидобактерий, а также лактобацилл, что ограничивает возможности ее применения.

Из патента РФ RU 2546251 C2, 10.04.2015 [7] известен пробиотический штамм бифидобактерий Bifidobacterium longum NCIMB 41676, а также пробиотический состав, содержащий данный штамм. Штамм и состав [7] могут использоваться для профилактики и/или лечения болезни воспаленного кишечника, синдрома раздраженного кишечника, диарейных состояний, диареи, вызванной антибиотиками, детской диареи и др. заболеваний. Так же, как и композиция [6], композиция [7] не использует пробиотический потенциал других пробиотических микроорганизмов, например, лактобацилл.

Из патента РФ RU 2473681 С2, 27.01.2013 [8] известен пробиотический штамм Bifidobacterium longum NCIMB 41382, и пробиотическая композиция, содержащая указанный штамм. Штамм [8] и композиция, содержащая данный штамм бифидобактерий, могут использоваться, в частности, в профилактике и/или лечении воспалительной активности, например, нежелательной воспалительной активности желудочно-кишечного тракта. В частности, штамм и композиция [8] могут использоваться для профилактики и/или лечения диареи, ассоциированной с приемом антибиотиков. Однако, аналогично композициям [6] и [7], композиция [8] не использует пробиотический потенциал других пробиотических микроорганизмов, например, лактобактерий.

Необходимо, таким образом, создание новых пробиотических средств, использующих пробиотический потенциал различных пробиотических лактобактерий и бифидобактерий и способных обеспечивать более эффективную профилактику заболеваний органов желудочно-кишечного тракта, в частности, профилактику диареи, включая диарею, ассоциированную с приемом антибиотиков, и диарею, вызванную Clostridium dificile.

Из европейского патента EP 0199535 B1, 02.01.1992 [9] известна пробиотическая композиция, содержащая штамм лактобактерий Lactobacillus acidophilus, депонированный в Американской коллекции типовых культур (ATCC) под номером 53103, совместно с фармацевтически приемлемым или пищевым носителем, предлагаемая в качестве ближайшего аналога настоящего изобретения. Согласно патенту [9], носитель, без ограничения, может представлять собой пищевой носитель, например, молочный продукт, такой как молоко или йогурт. Композиция [9] предназначена для лечения и профилактики нежелательного побочного действия антибиотиков, в первую очередь, для профилактики антибиотик-ассоциированной диареи. Пробиотическую композицию [9] используют путем приема внутрь непосредственно перед приемом антибиотиков или одновременно с антибиотиками либо в течение 24 часов после приема антибиотиков.

По-прежнему актуальной, однако, остается задача расширения арсенала средств (пробиотических композиций), использующих живые бифидобактерии, а также усиления пробиотических свойств таких композиций за счет использования других групп пробиотических микроорганизмов, способных при попадании в организм хозяина колонизировать кишечник и положительно влиять на здоровье хозяина. Кроме того, в ряде случаев срок хранения известных пробиотических композиций существенно ограничен и составляет 1-2 месяца.

Одной из важнейших групп пробиотических организмов, благодаря которым свойства пробиотических композиций на основе бифидо- и лактобактерий могут быть усилены, являются дрожжи (Saccharomyces), в частности, пивные дрожжи (Saccharomyces cerevisiae). В работе Middelbos I. S., Godoy M. R., et al., 2007 [10] показано, что дрожжи при попадании их в организм хозяина оказывают положительное влияние на состояние здоровья последнего, при этом соответствующий пробиотический потенциал дрожжей может быть успешно использован для лечения и профилактики антибиотик-ассоциированной диареи, диареи путешественников, симптомов геликобактерной инфекции, острой диареи взрослых, воспалительной болезни кишечника, клостридиальной инфекции, синдрома раздраженного кишечника, ВИЧ-ассоциированной диареи и лямблиоза.

В ряде исследований, результаты которых обобщены в обзоре Taverniti V., Guglielmetti S., 2011 [11], показано, что полезное действие на здоровье человека способны оказывать не только живые дрожжи, но и убитые клетки дрожжей и даже фрагменты клеток дрожжей, при этом для таких инактивированных клеток и фрагментов клеток дрожжей, обладающих пробиотическим действием, Taverniti V. и Guglielmetti S. [11] предложили термин «парапробиотики».

В работах Szajewska H., Skórka A., Dylag M., 2007 [12] и Feizizadeh S., Salehi-Abargouei A., Akbari V., 2014 [13] показан терапевтический потенциал живых дрожжей в лечении острой диареи у детей. Помимо этого, из краткого сообщения Omer Erdeve, Ulku Tiras и Yildiz Dallar, 2004 [14] известно, что живые дрожжи Saccharomyces boulardii эффективны в комплексном лечении и профилактике антибиотик-ассоциированной диареи у детей, включая диарею, вызванную комбинированными препаратами ампициллина и сульбактама, а также диарею, вызванную азитромицином. В опубликованной международной заявке WO 2006/021965 A1, 02.03.2006 [15] описана пробиотическая композиция для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний, содержащая живые дрожжи (Saccharomyces spp., предпочтительно, Saccharomyces boulardii) и вспомогательные компоненты, выбранные из фармацевтически приемлемых и физиологически приемлемых компонентов, например, таких как стеарат магния и/или лактоза. Композиция [15] активна в отношении условно-патогенной микрофлоры кишечника, поддерживает полезное действие пробиотиков и может использоваться для профилактики диареи, такой как антибиотик-ассоциированная диарея. Однако работа [14], как и документы [12], [13] и опубликованная заявка [15], не рассматривают применение лизатов дрожжей, в частности, применение лизатов дрожжей совместно с пробиотическими бактериями, включая пробиотические лакто- или бифидобактерии, в составе комбинированных препаратов для профилактики антибиотик-ассоциированной диареи.

Несмотря на достоинства композиции [15] и возможность ее использования для профилактики антибиотик-ассоциированной диареи, она не задействует пробиотический потенциал лактобактерий и бифидобактерий и также не показывает возможность использования лизата дрожжей вместо живых дрожжей.

Таким образом, по-прежнему остается актуальной задача создания новых пробиотических композиций – биологически активных пищевых добавок на основе пробиотических лакто- и бифидобактерий, которые могли бы успешно использоваться для восстановления микрофлоры кишечника, особенно после прохождения курса антибиотикотерапии, в том числе, для профилактики антибиотик-ассоциированного дисбактериоза и антибиотик-ассоциированных диарей, а также смягчали бы или устраняли симптомы синдрома избыточного бактериального роста, такие как боль в животе, урчание в животе, вздутие живота, избыточное газообразование, нарушение характера и частоты стула. В то же время, технология изготовления таких пробиотических композиций должна позволять сохранить жизнеспособность и полезные свойства пробиотических бактерий как при изготовлении композиции, так и в течение длительного времени при ее хранении. В настоящем документе термин «синдром избыточного бактериального роста» включает в себя дисбактериозы любой природы.

Задача расширения арсенала пробиотических композиций, которые могут использоваться для восстановления нарушенных функций желудочно-кишечных тракта и для нормализации микрофлоры кишечника, а также для профилактики антибиотик-ассоциированных диарей и для устранения симптомов синдрома избыточного бактериального роста, решается в рамках заявляемого изобретения путем создания пробиотической композиции, выполненной в форме капсулы и содержащей от 0,05 до 0,1 г сухой смеси (сухой бактериальной массы), содержащей пробиотические бифидобактерии Bifidobacterium longum и Bifidobacterium bifidum и пробиотические лактобациллы Lactobacillus rhamnosus, а также лизат дрожжей Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae Hansen CBS 5926) и нутрицевтически приемлемые вспомогательные компоненты, включая лактозу, микрокристаллическую целлюлозу и нутрицевтически приемлемую соль стеариновой кислоты (например, без ограничения, кальция стеарат или магния стеарат), причем содержание в композиции пробиотических лактобацилл Lactobacillus rhamnosus и каждого из видов пробиотических бифидобактерий, включая Bifidobacterium longum и Bifidobacterium bifidum, составляет не менее 1х10⁸ колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 грамм указанной смеси (более предпочтительно, не менее 1х10⁹ КОЕ на 1 грамм смеси). Предпочтительно (без ограничения), заявляемая пробиотическая композиция выполнена в форме твердой желатиновой капсулы. Более предпочтительно, указанная капсула содержит от 0,06 до 0,08 г указанной сухой смеси, от 0,02 до 0,025 г лактозы, от 0,09 до 0,17 г микрокристаллической целлюлозы. В самом предпочтительном воплощении, заявляемая пробиотическая композиция выполнена в форме твердой желатиновой капсулы, содержащей: (а) 0,0675 г сухой бактериальной массы, включающей не менее 1х10⁹ каждого из видов пробиотических бифидобактерий Bifidobacterium longum и Bifidobacterium bifidum, не менее 1х10⁹ пробиотических лактобацилл Lactobacillus rhamnosus, а также лизат дрожжей Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae Hansen CBS 5926), (б) 0,0225 г лактозы, (в) 0,1575 г микрокристаллической целлюлозы и (г) 0,0025 г кальция стеарата.

Задача получения биологически активных добавок (пробиотических композиций), позволяющих сохранить жизнеспособность и полезные свойства пробиотических бактерий на протяжении длительного времени, решается в рамках настоящего изобретения путем разработки способа изготовления пробиотической композиции, включающего раздельное высевание культур бифидобактерий Bifidobacterium longum и Bifidobacterium bifidum и лактобацилл Lactobacillus rhamnosus на жидкую среду МРС, разлитую по пробиркам, с последующим термостатированием в течение 24-72 часов при температуре 37±0,5°С и с последующим засеванием термостатированными культурами емкостей с жидким МРС агаром и инкубированием в течение 48-60 часов при температуре 37±0,5°С, перенос указанных культур бифидобактерий и лактобацилл в ферментер с последующим выращиванием указанных культур в указанном ферментере, причем указанное выращивание осуществляется при температуре 37±0,5°С, при избыточном давлении в полости ферментера, составляющем 0,025±0,005 МПа, без аэрации в среде инертного газа, при постоянном перемешивании и поддержании значения рН 6-7 путем титрования щелочным раствором, с последующим концентрированием указанных культур до заданного объема концентрата, добавлением защитной среды, охлаждением и последующей сублимационной сушкой, объединением сухих бактериальных масс культур бифидобактерий Bifidobacterium longum, бифидобактерий Bifidobacterium bifidum и лактобацилл Lactobacillus rhamnosus, смешиванием полученной сухой смеси, содержащей пробиотические бифидобактерии Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum и Lactobacillus rhamnosus, с лизатом клеток дрожжей Saccharomyces cerevisae и с предварительно подготовленными нутрицевтически приемлемыми вспомогательными компонентами смеси для наполнения капсул – лактозой, микрокристаллической целлюлозой и нутрицевтически приемлемой солью стеариновой кислоты, с последующим перемешиванием и формированием смеси для наполнения капсул, заполнения капсул указанной смесью. Сублимационную сушку, предпочтительно (без ограничения), осуществляют в течение 30-40 часов при температуре не выше -40°С и давлении не более 40 Па. При необходимости, способ согласно изобретению включает в себя также стадию обеспыливания капсул и стадию фасовки капсул. Фасовка капсул может осуществляться на любом счетно-фасовочном устройстве, используемом в фармацевтической отрасли, при этом капсулы фасуют в блистеры или в банки (по 10 или по 30 штук соответственно).

Термин «нутрицевтически приемлемый» для целей настоящей заявки означает, что данный компонент может в принципе использоваться при изготовлении нутрицевтических композиций, что он является безопасным для потребителя указанной пробиотической композиции и что он совместим с другими компонентами данной пробиотической композиции.

Лизат дрожжей для целей настоящего изобретения получают, разрушая клетки дрожжей известными из уровня техники методами. Без ограничения, лизат дрожжей может быть получен путем разрушения клеток дрожжей ультразвуком, вортексирования дрожжей со стеклянными шариками, обработки дрожжей ферментами – зимолиазами и литиказами (согласно Müller F.M., Werner K.E., et al., 1998 [16]) и другими методами, известными специалисту в данной области техники и доступными в соответствующей специальной литературе.

Технический результат, обеспечиваемый композицией по изобретению, заключается в расширении арсенала пробиотических композиций (биологически активных пищевых добавок), предназначенных для профилактики диарей, включая антибиотик-ассоциированные диареи, и, в частности, C. dificile-ассоциированные диареи.

Технический результат, обеспечиваемый способом по изобретению, заключается в обеспечении пробиотической композиции, содержащей живые пробиотические бактерии, в которой жизнеспособность и полезные свойства пробиотических бактерий сохранялись бы как при изготовлении композиции, так и при ее хранении на протяжении длительного времени.

Предпочтительно, пробиотическая композиция согласно изобретению выполнена в виде капсулы, содержащей сухую бактериальную массу, содержащую вышеуказанные пробиотические бифидобактерии Bifidobacterium longum и Bifidobacterium bifidum, а также пробиотические лактобациллы Lactobacillus rhamnosus с лизатом дрожжей совместно с такими нутрицевтически приемлемыми вспомогательными компонентами - лактозой, микрокристаллической целлюлозой и нутрицевтически приемлемой солью стеариновой кислоты. Наиболее предпочтительно, пробиотическая композиция согласно изобретению выполнена в виде кишечнорастворимой капсулы, содержащей не более 27 масс. % указанной сухой бактериальной массы, не более 63 масс. % микрокристаллической целлюлозы и не более 1 масс. % нутрицевтически приемлемой соли стеариновой кислоты. Наиболее предпочтительно, нутрицевтически приемлемая соль стеариновой кислоты представляет собой стеарат кальция или стеарат магния.

Наиболее предпочтительно, используют лактозу, микрокристаллическую целлюлозу и стеарат кальция (или стеарат магния) фармакопейного качества. В особо предпочтительном воплощении изобретения в качестве микрокристаллической целлюлозы используют модифицированную микрокристаллическую целлюлозу фармакопейного качества, например, Prosolv^® SMCC – коммерчески доступную силикатированную микрокристаллическую целлюлозу, получаемую путем сопроцессинга микрокристаллической целлюлозы (98%) и коллоидного диоксида кремния (2%) (Prosolv^® SMCC: Silicified Microcrystalline Cellulose (The Original Silicified MCC). – «JRC Pharma Family», 13.07.2016 [17]). Благодаря равномерному распределению коллоидного диоксида кремния по поверхности частиц микрокристаллической целлюлозы, Prosolv^® SMCC по сравнению с традиционной микрокристаллической целлюлозой обладает в пять раз большей удельной поверхностью и уровнем шероховатости частиц, что обеспечивает существенно более высокую прессуемость, текучесть, смешиваемость и распадаемость Prosolv^® SMCC по сравнению с традиционной микрокристаллической целлюлозой, а также позволяет существенно повысить дисперсность активных веществ и стабильность порошковой смеси для инкапсулирования. Специалисту при этом понятно, что для осуществления настоящего изобретения может быть использованы и другие разновидности микрокристаллической целлюлозы фармакопейного качества.

Предпочтительно, нутрицевтически приемлемая соль стеариновой кислоты представляет собой кальция стеарат или магния стеарат.

Нутрицевтически приемлемый наполнитель, предпочтительно, представляет собой комбинацию лактозы и микрокристаллической целлюлозы. Наиболее предпочтительно, лактоза представляет собой лактозу фармакопейного качества, а микрокристаллическая целлюлоза представляет собой модифицированную (силикатированную) микрокристаллическую целлюлозу фармакопейного качества (не более 63% от массы содержимого капсулы) и стеарат кальция (не более 1% от массы содержимого капсулы).

Далее приводятся примеры осуществления изобретения, которые иллюстрируют отдельные предпочтительные варианты осуществления изобретения, не ограничивая при этом объем испрашиваемых притязаний.

Пример 1. Получение капсул пробиотической композиции по изобретению.

Исходные культуры пробиотических бифидобактерий Bifidobacterium longum, предпочтительно штаммы, выбранные из B379M, BB46, BB536, Bl-05, DSM20219, HA-135, SD5219, BKM Ac-2775D,-и Bifidobacterium bifidum, предпочтительно штаммы, выбранные из Bb-06, DSM20239, HA-132, Idcc 4201, JCM7003, KCTC3357, L22, LMG13195, S28a, BKM Ac-2773D, и пробиотических лактобацилл Lactobacillus rhamnosus, предпочтительно штаммы, выбранные из A119, CLR2, GR-1, GG, HA-111, HN001, LB21, Lcr35, Lr-32, R0011, BKM Ac-3170D, высевают на жидкую среду МРС, разлитую по пробиркам, и выращивают в течение 2-3 суток в термостате при температуре 37°С. Затем средой из пробирок засевают бутыль объемом 3000 мл, содержащую жидкую среду МРС, выращивают культуры в течение 48-60 часов при температуре 37°С, после чего передают жидкий посевной материал на стадию ферментации. Ферментацию осуществляют в ферментере «Биор-250» или аналогичном, предварительно простерилизованном при температуре 132±2°С. В указанный ферментер вносят все компоненты питательной среды, после чего питательную среду стерилизуют глухим паром при температуре 112 - 115°С. После захолаживания в простерилизованную питательную среду стерильно добавляют посевной материал. Выращивание культур пробиотических бифидобактерий Bifidobacterium longum и Bifidobacterium bifidum и пробиотических лактобацилл Lactobacillus rhamnosus в ферментерах проводят при температуре 37±0,5°С, избыточном давлении в полости аппарата 0,025±0,005 МПа без аэрации в среде инертного газа, при постоянном перемешивании и поддержании значения рН 6-7 (путем титрования щелочным раствором).

По окончании ферментации культуральную жидкость с каждого ферментера поочередно концентрируют на фильтрационной установке до заданного объема концентрата. По окончанию процесса концентрирования концентраты каждой из культур отдельно сливают в реактор, в котором происходит добавление защитной среды.

В качестве защитных сред применяются вещества, образующие с водой истинные и коллоидные растворы. Эти среды могут быть разделены на три группы: коллоидные среды животного, растительного и минерального происхождения; среды, содержащие растворимые вещества, такие как углеводы и продукты гидролиза белков – пептоны и аминокислоты и среды сложного состава, в которых коллоидные вещества сочетаются с растворимыми.

Для подготовки защитной среды используют либо сахарозо-желатиновый агар (СЖА) (10% сахарозы, 1,5% желатина, 0,1% агар-агара в дистиллированной воде), либо натуральное снятое молоко, сепарированное три раза, или сухое молоко для бактериологических целей (Difco, США) в концентрации 10%, либо используют иные хорошо известнве защитные среды, такие как среда Стэмпа, содержащая 10% желатина и 0,25-0,5% аскорбиновой кислоты в гидролизате натурального обезжиренного молока или минимальная среда М9 с добавлением 1% тиомочевины, либо 10% сахарозы, 10% мальтозы, 10% лактозы, 1,5% желатина.

Защитную среду разливают в стеклянные пробирки (12 мл) по 5 мл; 3 раза стерилизуют текучим паром и проверяют стерильность путем инкубации 3 суток при 37 °С Защитные среды хранят при 5 °С не более 1 месяца.

Полученный объем технологической жидкости каждой из культур охлаждают до температуры 5°С и разливают в стерильные бутыли, которые затем передают на стадию сублимационной сушки. В процессе сублимационной сушки технологическую жидкость разливают в поддоны из нержавеющей стали с достижением толщины слоя технологической жидкости, содержащей каждую из культур Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum и Lactobacillus rhamnosus, составляющей 10±1 мм. Затем поддоны с разлитой в них технологической жидкостью помещают в камеру установки для сублимационной сушки и осуществляют в течение 30-40 часов сублимационную сушку технологической жидкости при давлении не выше 30 Па, при этом температура на протяжении всего цикла сушки меняется согласно заложенной программе от -30°С до 30°С. Полученные сухие бактериальные массы пробиотических микроорганизмов каждой из культур Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum и Lactobacillus rhamnosus смешивают с микрокристаллической целлюлозой (предпочтительно, с силикатированной микрокристаллической целлюлозой, такой как Prosolv^® SMCC) для доведения содержания каждой из культур Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum и Lactobacillus rhamnosus до не менее 1х10⁸ КОЕ на 1 грамм указанной массы. Определение количества жизнеспособных бактерий проводили в соответствии с ОФС.1.7.1.0003.15 "Бифидосодержащие пробиотики". Полученные смеси пробиотических микроорганизмов Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum и Lactobacillus rhamnosus от 0,06 до 0,08 г на капсулу с микрокристаллической целлюлозой от 0,09 до 0,17 г на капсулу смешивают друг с другом и перемешивают со вспомогательными компонентами, включая предварительно измельченные и просеянные через сито лактозу от 0,02 до 0,025 г на капсулу, лубрикант от 0,002 до 0,004 г на капсулу (предпочтительно, со стеаратом кальция) и лизат дрожжей Saccharomyces cerevisiae из расчёта 0,5 мг лизата дрожжей на 250 мг конечной смеси, тщательно перемешивают на протяжении по крайней мере 10-15 минут вплоть до образования однородной смеси для наполнения капсул, после чего указанной однородной смесью наполняют желатиновые капсулы по 250 мг. При этом процесс наполнения капсул включает в себя стадию ориентирования капсул, а также стадии открытия капсул, собственно наполнения капсул и закрытия капсул. Заполненные капсулы подвергают обеспыливанию в вытяжном шкафу и фасуют в блистеры или во флаконы, по 10 штук или по 30 штук соответственно при помощи любого счетно-фасовочного устройства, используемого в фармацевтической промышленности в технологии твердых препаративных форм.

Жизнеспособность пробиотических лактобактерий и бифидобактерий, входящих в состав пробиотической композиции, полученной выше, по настоящему изобретению, а также сохранность полезных свойств композиции при хранении исследуют в условиях ускоренного старения.

Метод «ускоренного старения» заключается в выдерживании испытуемой биологически активной добавки при температурах и влажности, превышающих температуру и влажность его хранения в процессе обращения. При повышенных температурах, как правило, ускоряются протекающие в лекарственных средствах физико-химические процессы, приводящие со временем к нежелательным изменениям качества. Таким образом, при повышенной температуре промежуток времени, в течение которого контролируемые показатели качества лекарственного средства сохраняются в допустимых пределах (экспериментальный срок годности), искусственно сокращается в сравнении со сроком годности при температуре хранения. Это позволяет значительно сократить время, необходимое для установления срока годности.

Срок годности (С) при температуре хранения (t_хр) связан с экспериментальным сроком годности (С_Э) при повышенной температуре экспериментального хранения (t_э) следующей зависимостью:

,

где коэффициент соответствия $$K=A^{\frac{t_{\text{э}}-t_{хр.}}{10}}$$.

Температурный коэффициент скорости химической реакции (A) принят равным 2,5. Приведенная зависимость основана на правиле Вант-Гоффа о 2-4-кратном росте скоростей химических реакций при увеличении температуры на 10°С.

Значение коэффициента соответствия (K) в зависимости от выбранного температурного интервала (t_э-t_хр), равного 25^оС, составляет 9,9. Срок экспериментального хранения при выбранном сроке годности 2 года составляет 74 суток. В качестве композиции сравнения выбрана композиция пробиотических бифидобактерий Bifidobacterium longum и Bifidobacterium bifidum и пробиотических лактобацилл Lactobacillus rhamnosus с лактозой.

Таблица 1. Оценка стабильности методом ускоренного старения в сравнении с прототипом.

  время хранения при (t_э-t_хр) = 25^оС, сутки Содержание пробиотических бактерий в % от теоретического содержания Пробиотическая композиции по настоящему изобретению Композиция сравнения 0 100,0 100,0 10 99,9 98,5 20 98,4 93,5 30 95,0 92,2 40 93,5 90,7 50 92,8 88,3 60 91,9 86,8 74 90,4 83,0

В результате исследования показано, что полезные свойства пробиотической композиции по изобретению и жизнеспособность пробиотических бактерий в композиции сохраняются как при изготовлении композиции, так и на протяжении по меньшей мере 24 месяцев хранения композиции в невскрытой заводской упаковке при температуре не выше 25°С в защищенном от прямых солнечных лучей месте. В случае, если заводская упаковка уже вскрыта, пробиотическую композицию по изобретению хранят в плотно закрытом флаконе не более 24 месяцев.

Таким образом, биологически активная добавка в соответствии с настоящим изобретением обеспечивает расширение ассортимента пробиотических композиций (биологически активных добавок) на основе пробиотических бактерий, предназначенных для профилактики антибиотик-ассоциированных диарей. В свою очередь, способ в соответствии с настоящим изобретением обеспечивает получение указанной биологически активной добавки с минимальными экономическими затратами и затратами времени, с сохранением жизнеспособности и полезных свойств пробиотических микроорганизмов, входящих в ее состав, в течение длительного времени.

Изобретение может быть использовано в медицине, фармакологии, химико-фармацевтической, пищевой промышленности

Ссылки:

1. "Joint FAO/WHO Expert Consultation Probiotics in food." - "FAO Food and nutrition paper", №85.

2. Reid G., Jass J., Sebulsky M.T., and McCormick J.K. Potential uses of probiotics in clinical practice. // "Clinical Microbiology Reviews", 2003; 16:658-672.

3. McFarland L.V. Epidemiology, risk factors and treatments for antibiotic-associated diarrhea. // "Digestive Diseases", 1998 Sep-Oct;16(5):292-307.

4. McFarland L.V. Probiotics for the Primary and Secondary Prevention of C. difficile Infections: A Meta-analysis and Systematic Review. // "Antibiotics" (Basel), 2015 Apr 13;4(2): 160-78. Публикация доступна посредством сети Интернет; режим доступа (URL): https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4790329.

5. McFarland L.V. Meta-analysis of probiotics for the prevention of antibiotic associated diarrhea and the treatment of Clostridium difficile disease. // "The American journal of gastroenterology", 2006 Apr;101(4):812-22.

6. RU 2466185 C2 «ПРОБИОТИЧЕСКИЙ ШТАММ Bifidobacterium longum, ПРОБИОТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ ШТАММА Bifidobacterium longum», патентообладатель: Элиментари Хелт Лимитед (IE), МПК: C12N 1/20, A61K 35/74, A61P 37/02, опубликован 10.11.2012.

7. RU 2546251 C2 «ПРОБИОТИЧЕСКИЙ ШТАММ БИФИДОБАКТЕРИЙ», патентообладатели: АЛИМЕНТАРИ ХЕЛС ЛИМИТЕД (IE), ДЗЕ ПРОКТЕР ЭНД ГЭМБЛ КОМПАНИ (US), МПК: C12N 1/20, A61K 35/74, A61P 25/00, A61P 31/00, A61P 3/00, опубликован 10.04.2015.

8. RU 2473681 С2 «ПРОБИОТИЧЕСКИЙ ШТАММ Bifidobacterium longum, КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ТАКОЙ ШТАММ, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ», патентообладатель: Элиментари Хелт Лимитед (IE), МПК: C12N 1/20, A61K 35/74, опубликован 27.01.2013.

9. EP 0199535 B1 «LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS STRAINS OF BACTERIA AND COMPOSITIONS THEREOF», патентообладатели: NEW ENGLAND MEDICAL CENTER INС (GB); THE NEW ENGLAND MEDICAL CENTER HOSPITALS, INC (GB); GORBACH, SHERWOOD L (US); GOLDIN, BARRY R (US), МПК: A23L 1/30; A61K 35/74; A61P 1/04; A61P 1/12; A61P 1/14; C12N 1/20, опубликован 02.01.1992.

Middelbos I.10. S., Godoy, M. R., et al. A dose–response evaluation of spray-dried yeast cell wall supplementation of diets fed to adult dogs: Effects on nutrient digestibility, immune indices, and fecal microbial populations. // "Journal of Animal Science", 2007; 85:3022–3032.

11. Taverniti V., Guglielmetti S. The immunomodulatory properties of probiotic microorganisms beyond their viability (ghost probiotics: proposal of paraprobiotic concept). // "Genes & Nutrition", 2011 Aug; 6(3): 261–274.

12. Szajewska H., Skórka A., Dylag M. Meta-analysis: Saccharomyces boulardii for treating acute diarrhoea in children. // "Alimentary pharmacology & therapeutics", 2007 Feb 1;25(3):257-64.

13. Sahar Feizizadeh, Amin Salehi-Abargouei, Vajihe Akbari. Efficacy and Safety of Saccharomyces boulardii for Acute Diarrhea. // "Pediatrics", vol. 134, №1, July 01, 2014. Публикация доступна посредством сети Интернет; режим доступа (URL): http://pediatrics.aappublications.org/content/134/1/e176.long.

14. Erdeve Omer, Tiras Ulku, and Dallar Yildiz. The Probiotic Effect of Saccharomyces boulardii in a Pediatric Age Group (brief report). – "Journal of Tropical Pediatrics", 2004, Vol. 50, №4, pp. 234-236. Публикация доступна посредством сети Интернет; режим доступа (URL): http://www.herbalsilnan.altervista.org/RICERCA_SCIENTIFICA/Probiotici-Prebiotici/36_pre_probiotici.pdf.

15. WO 2006/021965 A1 «EUKARYOTIC BASED SYNERGISTIC FORMULATION FOR GASTRO-INTESTINAL DISORDERS», заявители: BHARAT BIOTECH INTERNATIONAL LIMITED (IN), ELLA KRISHNA MURTHY (IN); VELLIMEDU SRINIVAS KANNAPPA (IN); SUNKARA SIVASANKARA RAO (IN), МПК: A61K 36/062, A61K 36/064, A61P 1/00, опубликована 02.03.2006.

16. Müller F.M., Werner K.E., et al. Rapid extraction of genomic DNA from medically important yeasts and filamentous fungi by high-speed cell disruption. - "Journal of Clinical Microbiology", 1998 Jun;36(6):1625-9. Публикация доступна посредством сети Интернет; режим доступа (URL): https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC104890.

17. Prosolv^® SMCC: Silicified Microcrystalline Cellulose (The Original Silicified MCC). – «JRC Pharma Family», 13.07.2016. Доступно посредством сети Интернет; режим доступа (URL): http://www.jrspharma.com/pharma-wAssets/docs/brochures/PROSOLV-SMCC.pdf.

Группа изобретений относится к области нутрицевтики, а именно к пробиотической композиции для восстановления микрофлоры кишечника и для профилактики синдрома избыточного бактериального роста и диарей, включая антибиотик-ассоциированную диарею и Clostridium dificile-ассоциированную диарею. Композиция выполнена в форме капсулы, содержащей сухую смесь пробиотических бифидобактерий Bifidobacterium longum и Bifidobacterium bifidum и пробиотических лактобацилл Lactobacillus rhamnosus в количестве от 0,05 до 0,1 г, а также лизат дрожжей Saccharomyces cerevisiae в количестве 0,0005 г и нутрицевтически приемлемые вспомогательные компоненты, включая микрокристаллическую целлюлозу и нутрицевтически приемлемую соль стеариновой кислоты в количестве от 0,002 до 0,004 г, выбранную из кальция стеарата и магния стеарата, причем содержание в указанной композиции каждого из видов пробиотических бифидобактерий, включая Bifidobacterium longum и Bifidobacterium bifidum, составляет не менее 1х10⁸ КОЕ на 1 грамм сухой смеси, содержание пробиотических лактобактерий Lactobacillus rhamnosus также составляет не менее 1х10⁸ КОЕ на 1 грамм сухой смеси. Группа изобретений также относится к способу изготовления пробиотической композиции. Группа изобретений обеспечивает сохранение жизнеспособности и полезных свойств пробиотических бактерий как при изготовлении, так и на протяжении длительного времени (в течение 3 лет, а также по окончании 24 месяцев хранения жизнеспособность пробиотических бактерий, входящих в состав пробиотической композиции по изобретению, сохраняется на высоком уровне, не менее 90%). 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 1 табл., 1 пр.

1. Пробиотическая композиция для восстановления микрофлоры кишечника и для профилактики синдрома избыточного бактериального роста и диарей, включая антибиотик-ассоциированную диарею и Clostridium dificile-ассоциированную диарею, отличающаяся тем, что указанная композиция выполнена в форме капсулы, содержащей сухую смесь пробиотических бифидобактерий Bifidobacterium longum и Bifidobacterium bifidum и пробиотических лактобацилл Lactobacillus rhamnosus в количестве от 0,05 до 0,1 г, а также лизат дрожжей Saccharomyces cerevisiae в количестве 0,0005 г, и нутрицевтически приемлемые вспомогательные компоненты, включая микрокристаллическую целлюлозу и нутрицевтически приемлемую соль стеариновой кислоты в количестве от 0,002 до 0,004 г, выбранную из кальция стеарата и магния стеарата, причем содержание в указанной композиции каждого из видов пробиотических бифидобактерий, включая Bifidobacterium longum и Bifidobacterium bifidum, составляет не менее 1х10⁸ КОЕ на 1 грамм сухой смеси, содержание пробиотических лактобактерий Lactobacillus rhamnosus также составляет не менее 1х10⁸ КОЕ на 1 грамм сухой смеси.

2. Пробиотическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что количество сухой смеси на одну капсулу указанной пробиотической композиции составляет от 0,06 до 0,08 г.

3. Пробиотическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что содержание каждого из видов пробиотических бифидобактерий, включая Bifidobacterium longum и Bifidobacterium bifidum, составляет не менее 1х10⁹ КОЕ на 1 грамм сухой смеси.

4. Пробиотическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что содержание пробиотических лактобацилл Lactobacillus rhamnosus составляет не менее 1х109 КОЕ на 1 грамм сухой смеси.

5. Пробиотическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что микрокристаллическая целлюлоза представляет собой силикатированную микрокристаллическую целлюлозу.

6. Пробиотическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что количество микрокристаллической целлюлозы на одну капсулу составляет от 0,09 до 0,17 г.

7. Способ изготовления пробиотической композиции по любому из пп. 1-6, включающий раздельное высевание культур бифидобактерий Bifidobacterium longum и Bifidobacterium bifidum и лактобацилл Lactobacillus rhamnosus на жидкую среду МРС, разлитую по пробиркам с последующим термостатированием в течение 24-72 часов при температуре 37±0,5°С и с последующим засеванием термостатированными культурами емкостей с жидким МРС агаром и инкубированием в течение 48-60 часов при температуре 37±0,5°С, перенос указанных культур бифидобактерий и лактобацилл в ферментер с последующим выращиванием указанных культур в указанном ферментере, причем указанное выращивание осуществляется при температуре 37±0,5°С, при избыточном давлении в полости ферментера, составляющем 0,025±0,005 МПа, без аэрации в среде инертного газа, при постоянном перемешивании и поддержании значения рН 6-7 путем титрования щелочным раствором, с последующим концентрированием указанных культур до заданного объема концентрата, добавлением защитной среды, охлаждением и последующей сублимационной сушкой, объединением сухих бактериальных масс культур бифидобактерий Bifidobacterium longum, бифидобактерий Bifidobacterium bifidum и лактобацилл Lactobacillus rhamnosus, смешиванием полученной сухой смеси, содержащей пробиотические бифидобактерии Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum и Lactobacillus rhamnosus, с лизатом клеток дрожжей Saccharomyces cerevisae и с предварительно подготовленными нутрицевтически приемлемыми вспомогательными компонентами смеси, включая нутрицевтически приемлемый наполнитель и нутрицевтически приемлемый лубрикант, с последующим перемешиванием и формированием смеси для наполнения капсул и заполнения капсул указанной смесью.

8. Способ по п. 7, дополнительно включающий стадии обеспыливания капсул и фасовки капсул.