СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ЛАКТОАМИЛОВОРИНА Российский патент 2013 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения пробиотика лактоамиловорина на основе штамма Lactobacillus amylovorus БТ-24/88 (депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под N В-6253).

Пробиотики широко применяются в ветеринарии. На основе пробиотиков, в том числе лактоамиловорина, создают эффективные лекарства и биологически активные добавки к пище, которые используются для борьбы с дисбактериозом, профилактики и лечения различных заболеваний пищеварительного тракта, повышения и укрепления защитных сил организма.

К настоящему времени известно большое количество пробиотиков, получаемых с использованием различных видов энтеробактерий (B.bifidum, Str.faecium, E.coli и др.), Bacillus subtilis, Rumenococcus albus, а также лактобактерий (Lactobacillus plantarum, fermentum, amylovorus).

Описан способ получения препарата Субтилис, с содержанием спор и живых вегетативных клеток бактерий Bacillus subtilis BKM В-2250Д путем аэробного культивирования при рН среды в пределах 6,8-7,2 с подпитыванием среды 40% глюкозой (RU 2184774, 2002 г.).

Известен также способ получения сухого пробиотического препарата, включающий выращивание в жидкой питательной среде на основе ферментативного гидролизата казеина штаммов энтеробактерий, например, Bifidobacterium globosum БФ-4 или Streptococcus falcium ВГНКИ-27 в течение 12-15 ч, с последующим охлаждением нативной культуральной жидкости и ее концентрированием в 10-15 раз. Полученный концентрат биомассы отмывают 2,5-3,5%-ным раствором сахарозы или лактозы и обезвоживают при температуре минус 25-35°С. При этом концентрирование нативной культуральной жидкости проводят методом ультрафильтрации на полых волокнах, или микрофильтрацией на плоских мембранах, или сепарированием (RU 2065305, 1996 г.).

Известен способ получения лактобактерина, включающий получение чистых культур Lactobacillus fermenti и Lactobacillus plantarum, внесение их на подготовленную питательную среду, выращивание 8-10 ч при температуре 37°С и лиофильное высушивание препарата (RU 2200566).

В начале девяностых годов появились сообщения о выделении нового вида крахмалгидролизующих лактобацилл Lactobacillus amylovorus (Nakamura L.K. Lactobacillus amylovorus, a new Starchhydrolyzing species from cattle wastecom fermentations. Int. I. Syst. Bacteriol., 1981, 31, N 1, p.56-63), J.Bacteriol, 2011, 3, №5, p.1, Microbial Drag Resistance 2000, V/12(4), p.284-288, однако сведений о возможности их использования в промышленности крайне мало.

В 1992 году был создан пробиотик лактоамиловорин, ингибирующий в пищеварительном тракте гемолитические бактерии и стимулирующий микроорганизмы, гидролизующие сложные полисахариды, повышающий ферментативную активность в тонком кишечнике, оказывающий профилактическое и лечебное действие при диарее. Препарат в настоящее время широко применяется в ветеринарии (Прикладная микробиология 58,3355-3359, 1992). Для производства лактоамиловорина используют штамм Lactobacillus amylovorus L-471.

Описаны условия получения бактериоцина - пептида, обладающего антибактериальной активностью в отношении Pseudomonas aeruginosa, продуцируемого штаммом Lactobacillus amylovorus DCE 471, и используемого в качестве консерванта пищевых продуктов и кормов (Прикладная микробиология, 66(2),606-613, 2000. Microbiol Let, 286, 199-206, 2008 г.).

Основным недостатком указанных методов является значительная длительность процесса получения различных форм выпуска пробиотиков, приводящая к потере их активности.

В 1996 году была показана возможность получения лактоамиловорина с использованием штамма Lactobacillus amylovorus БТ-24/88, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под N В-6253 (Пат RU 2054478, 1996 г.).

Этот метод получения лактоамиловорина на основе штамма Lactobacillus amylovorus БТ-24/88 является наиболее близким к заявляемому.

Штамм выращивают на жидкой молочной среде при температуре 37°С в течение 24 часов. Схематичное описание технологии получения пробиотика не дает представления о качественных показателях целевого продукта, стабильности получаемых результатов, что имеет важное значение для его промышленного использования.

Целью данного изобретения является создание способа получения лактоамиловорина на основе чистой культуры штамма Lactobacillus amylovorus БТ-24/88, позволяющего стабильно получать целевой препарат с высокими значениями титра антимикробных тел не только в культуральной жидкости, но и во всех формах выпуска препарата (жидкой и в виде сухого порошка).

Для достижения указанной цели были созданы жидкие искусственные среды на основе ферментолизата сухого обезжиренного молока, позволяющие максимально использовать потенциальные возможности штамма Lactobacillus amylovorus БТ-24/88 (табл.1). Было также показано, что при обработке культуральной жидкости, содержащей лактоамиловорин с целью получения его в виде сухого порошка, происходит значительное уменьшение титра антимикробных тел, которого можно избежать при использовании защитных сред с добавлением определенных количеств стабилизаторов, подобранных нами экспериментально. Кроме этого выпуск препарата в виде жидкости также показал, что в процессе хранения происходит значительное снижение титра антимикробных тел. Нами были подобраны стабилизаторы, добавление которых в конце процесса биосинтеза пробиотика позволяет стабильно сохранять высокий уровень титра антимикробных тел при выпуске пробиотика в виде жидкости (табл.2).

Лактоамиловорин получают, используя для этого штамм Lactobacillus amylovorus БТ-24/88, обладающий широким спектром антагонистической активности против условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, устойчивый к экстремальным условиям среды пищеварительного тракта и антибиотикам. Штамм непатогенен, токсичных и токсигенных свойств не проявляет (Пат. RU 2054478, 1996).

Пробиотик получают путем глубинного культивирования штамма Lactobacillus amylovorus БТ-24/88 в жидкой искусственной среде, основу которой составляет гидролизат сухого обезжиренного молока, получаемый с помощью ферментов, в который затем добавляют кукурузный экстракт, лактозу и необходимые минеральные соли (среда №1, среда 1-1) при температуре 38°С в течение 24 часов. После окончания процесса биосинтеза к культуральной жидкости добавляют стабилизатор (метабисульфит натрия, гидросульфит натрия, аскорбиновую кислоту), перемешивают 10 минут и выделяют продукт в жидком состоянии или в виде сухого порошка. Сухой препарат получают путем лиофилизации культуральной жидкости совместно с защитной средой и выбранными нами стабилизаторами.

Заявленный способ получения пробиотического препарата отличается от прототипа:

1. Составом жидкой питательной среды (основу которой составляет гидролизат сухого обезжиренного молока, являющийся источником азота для культивируемого штамма), что позволяет получать препарат с высоким уровнем титра антимикробных тел.

2. Использованием стабилизаторов, способствующих сохранению этого уровня при получении различных форм выпуска препарата и при его хранении.

Эти отличия позволяют сделать вывод о соответствии заявляемых технических решений критерию "новизна".

Технический результат, получаемый при осуществлении изобретения, выражается в возможности стабильного получения пробиотика с высокими значениями титра антимикробных тел не только в культуральной жидкости, но и после ее обработки, необходимой для получения различных форм выпуска препарата, и при его хранении.

Заявляемый метод получения лактоамиловорина иллюстрируется следующими примерами

Пример 1.

Получение пробиотика лактоамиловорин в жидкой форме.

Культуру Lactobacillus amylovorus БТ-24/88 выращивают на среде MRS в пробирках при температуре 38°С в течение 24 ч. Выросшую культуру переносят в колбы, содержащие по 100 мл и далее для масштабирования по 1000 мл питательной среды (г/л: пептон - 10, энзиматический гидролизат казеина - 5, KН₂РO₄ - 6, цитрат аммония - 2, глюкоза - 10, твин-80 - 1, солевой раствор - 5 мл, ацетат натрия - 1, МПБ - 100 мл, капустный отвар - 900 мл. Состав солевого раствора (г/100 мл): MgSO₄×7H₂O - 11.5, MnSO₄×2H₂O - 2.4, FeSO₄×7H₂O - 0.68, дистиллированная вода - 100 мл. рН среды - 6,8-7,0. Посевной материал в колбах выращивают 24 часа при температуре 38°С в термостате и далее используют для засева ферментера. Посевная доза - 5-10%.

Культивирование ведут при температуре 38°С в асептических условиях без аэрации, при постоянном перемешивании на питательной среде №2 следующего состава, г/л:

Лактоза - 30 г

Кукурузный экстракт - 5 мл;

Дрожжевой автолизат - 8 мл;

Мел химически осажденный - 0,5 г;

Калий фосфорнокислый однозамещенный - 2,0 г;

Натрий уксуснокислый 3-водный - 3,0 г;

Магний сернокислый семиводный - 0,6 г;

Железо сернокислое - 0,05 г;

Марганец сернокислый 5-водный - 0,05 г;

Водопроводная вода до 1 л.

Длительность процесса 24-26 часов при рН (6,9±0,1). После окончания процесса к культуральной жидкости добавляют метабисульфит натрия из расчета 0.03 г/л и перемешивают еще 10 минут. Количество жизнеспособных клеток лактобацилл составляет (3-5)×10⁹ КОЕ/мл.

Пример 2.

Получение пробиотика лактоамиловорина в виде сухого порошка включает следующие этапы: приготовление посевного материала, получение инокулята, выращивание штамма-продуцента в ферментере, отделение бактериальной массы от культуральной жидкости, приготовление защитной среды, смешивание бактериальной массы с защитной средой, замораживание, лиофильная сушка суспензии биомассы.

Получение посевного материала в пробирках и колбах аналогично примеру 1.

Процесс ферментации ведется при температуре 38°С, рН (6,9±0,1) в течение 24 часов при непрерывном перемешивании без аэрации на питательной среде №1 следующего состава, г/л:

Кукурузный экстракт - 10;

Лактоза - 20;

Мел химически осажденный - 0,5;

Натрий лимоннокислый трехзамещенный - 7,5;

Натрий уксуснокислый 3-водный - 2;

Железо сернокислое - 0,1;

Марганец сернокислый 5-водный - 0,16;

Гидролизат сухого обезжиренного молока - до 1 л.

Сухое обезжиренное молоко (30±1) г растворяют в (250±50) мл питьевой воды с температурой (43±2)°С, выдерживают в течение (45±15) мин при перемешивании до полного растворения. Восстановленное молоко фильтруют, добавляют горячую воду до 1 л, температура (55±1)°С, рН (6,8±0,1). В приготовленное молоко вносят фермент протосубтилин Г3х или Г10х с протеолитической активностью 70 ед/г в количестве (0,23±0,08) г/л, предварительно активизированный в небольшом количестве воды. Молоко с внесенным ферментом выдерживают при температуре (55±1)°С в течение (2±0,25)ч.

В 800 мл полученного гидролизата сухого обезжиренного молока добавляют (7,5±0,05) г натрия лимоннокислого трехзамещенного, (0,160±0,002) г марганца сернокислого, (20±0,05) г сахара молочного (лактозы), (2±0,01) г натрия уксуснокислого, (0,1±0,001) г железа сернокислого, (0,5±0,01) г мела химически осажденного, (10±0,01) мл кукурузного экстракта. Кукурузный экстракт предварительно стерилизуют при температуре (121±2)°С в течение (30±0,5) мин, а перед внесением в гидролизованное молоко нейтрализуют 30% раствором гидроокиси натрия до рН (6,9±0,1). Смесь перемешивают в течение 10 минут, затем добавляют гидролизат сухого обезжиренного молока до 1 литра.

Количество жизнеспособных клеток лактобацилл в культуральной жидкости составляет (1-5)×10¹⁰ КОЕ/мл.

Затем полученная культуральная жидкость используется для получения различных форм выпуска пробиотика.

Для получения пробиотика в виде порошка готовую культуральную жидкость подвергают сепарированию.

По окончании сепарирования полученный осадок биомассы, представляющий собой пасту желто-коричневого цвета, смешивают с защитной средой и стабилизатором (в качестве которого используют гидросульфит натрия), в соотношении 1 л раствора на 1 кг биомассы. Для получения однородной массы смесь перемешивают в течение 20-25 мин. В качестве защитной среды используют раствор трехзамещенного 5,5-водного лимоннокислого натрия (50 г/л) и сахарозы (100 г/л), гидросульфит натрия (3 г/л). Раствор готовят на водопроводной воде, стерилизуют его в автоклаве и охлаждают до комнатной температуры.

Полученную сметанообразную суспензию направляют на лиофильную сушку. Остаточная влажность полученного целевого продукта 5%.

Содержание жизнеспособных клеток Lactobacillus amylovorus в порошке (3-5)×10¹¹ КОЕ/г.

Пример 3.

Получение посевного материала, приготовление питательной среды, культивирование, сепарирование ведутся аналогично примеру 2, выращивание штамма проводят на среде 1-1, а перед сушкой концентрат культуральной жидкости смешивают с защитной средой и стабилизатором, в качестве которого используют аскорбиновую кислоту из расчета 5 г/л.

Содержание жизнеспособных клеток Lactobacillus amylovorus в лиофильно высушенном концентрате (5-8)×10¹¹ КОЕ/г.

Состав среды 1-1:

Кукурузный экстракт - 10;

Лактоза - 20;

Мел химически осажденный - 0,5;

Натрий лимоннокислый трехзамещенный - 7,5;

Натрий уксуснокислый 3-водный - 2;

Железо сернокислое - 0,1;

Марганец сернокислый 5-водный - 0,16;

Гидролизат сухого обезжиренного молока - до 1 л.

(Гидролизат сухого обезжиренного молока получают с использованием протеолитического фермента Алкалаза 2,4Л аналогично примеру 2).

ПРИЛОЖЕНИЕ

Таблица 1 Данные по активности штамма Lactobacillus amylovorus БТ - 24/88 на различных средах:   Продуктивность штамма КОЕ/мл Среда 1 3×10¹⁰ Среда 2 5×10⁹ Среда 3 2×10⁹ Среда 4 8×10⁸ Среда 1-1 4×10¹⁰

Среда №2 (состав, г/л):

Лактоза - 30 г;

Кукурузный экстракт - 5 мл;

Дрожжевой автолизат - 8 мл;

Мел химически осажденный - 0,5 г;

Калий фосфорнокислый однозамещенный - 2,0 г;

Натрий уксуснокислый 3-водный - 3,0 г;

Магний сернокислый семиводный - 0,6 г;

Железо сернокислое - 0,05 г;

Марганец сернокислый 5-водный - 0,05 г;

Водопроводная вода до 1 л.

Среда №3 (состав, г/л)

Пептон - 10

Энзиматический гидролизат казеина - 5;

KН₂РO₄ - 6;

Цитрат аммония - 2;

Глюкоза - 10;

Твин-80 - 1;

Ацетат натрия - 1;

Солевой раствор - 5 мл (MgSO₄×7H₂O - 11.5, MnSO₄×2H₂O - 2.4, FeSO₄×7H₂O - 0.68, дистиллированная вода - 100 мл);

Капустный отвар - 900 мл.

Среда 4:

Сухое обезжиренное молоко - 12;

Дрожжевой экстракт - 10;

Водопроводная вода до 1 л.

Данные по хранению лактоамиловорина в соответствии с ОСТ 42-2-72.

Упаковка: Банки полимерные.

Флаконы темного стекла.

Условия хранения. В защищенном от света месте при температуре не выше 12°С.

Дата закладки на хранение. 20.02.2010 г.

Исходная активность жидкой формы 5×10¹⁰ КОЕ/мл.

Исходная активность порошка 5-8×10¹¹ КОЕ/г.

Таблица 2   Жидкая форма выпуска Лиофилизированный порошок   Титр антимикробных тел, КОЕ/мл Титр антимикробных тел, КОЕ/г   Через год хранения Через год хранения Без стабилизатора 5×10⁷ 3×10⁷ 5×10⁷ 3×10⁷ 2×10¹⁰ 1×10¹⁰ 2×10¹⁰ 1×10¹⁰ С метабисульфитом натрия 6×10⁹ 5×10⁹ 5×10⁹ 6×10⁹ 5×10¹⁰ 7×10¹⁰ 7×10¹⁰ 5×10¹⁰ С аскорбиновой кислотой 5×10⁹ 3×10⁹ 4×10⁹ 3×10⁹ 6×10¹⁰ 5×10¹⁰ 5×10¹⁰ 5×10¹⁰ С гидросульфитом натрия 3×10⁹ 4×10⁹ 3×10⁹ 5×10⁹ 7×10¹⁰ 6×10¹⁰ 5×10¹⁰ 7×10¹⁰ Номера серий 1 2 3 4 1 2 3 4

Пробиотик лактоамиловорин получают путем глубинного выращивания штамма Lactobacillus amylovorus ВКПМ В-6253 на жидкой питательной среде, содержащей: кукурузный экстракт - 10±0,01 мл, лактоза - 20±0,005 г, мел химически осажденный - 0,5±0,01 г, натрий лимоннокислый трехзамещенный - 7,5±0,05 г, натрий уксуснокислый 3-водный - 2±0,01 г, железо сернокислое - 0,1±0,001 г, марганец сернокислый 5-водный - 0,16±0,002 г, гидролизат сухого обезжиренного молока - до л. Последующее выделение целевого продукта в жидком состоянии или в виде сухого порошка ведут с предварительным добавлением стабилизатора к культуральной жидкости или к защитной среде, используемой при получении пробиотика в виде сухого порошка. Стабилизатор выбирают из: метабисульфита натрия, гидросульфита натрия и аскорбиновой кислоты. Изобретение обеспечивает стабильное получение пробиотика с высокими значениями титра антимикробных тел не только в культуральной жидкости, но и после ее обработки, необходимой для получения различных форм выпуска препарата. 2 з.п. ф-лы, 2 табл., 3 пр.

1. Способ получения пробиотика лактоамиловорина, предусматривающий культивирование штамма Lactobacillus amylovorus ВКПМ В-6253 в жидкой питательной среде и приготовление целевого продукта из полученной культуральной жидкости в жидком состоянии или в виде сухого порошка с использованием стабилизатора, отличающийся тем, что культивирование ведут в питательной среде, содержащей:
кукурузный экстракт 10±0,01 мл лактоза 20±0,005 г мел химически осажденный 0,5±0,01 г натрий лимоннокислый трехзамещенный 7,5±0,05 г натрий уксуснокислый 3-водный 2±0,01 г железо сернокислое 0,1±0,001 г марганец сернокислый 5-водный 0,16±0,002 г гидролизат сухого обезжиренного молока до 1 л

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для получения гидролизата сухого обезжиренного молока используют протосубтилин Г3х, протосубтилин Г10х или алкалазу 2,4Л.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что стабилизатор выбирают из: метабисульфита натрия, гидросульфита натрия и аскорбиновой кислоты.