Изобретение относится к биотехнологии, пищевой промышленности и может быть использовано в производстве продуктов функционального питания, неферментированных продуктов, фармпрепаратов, при приготовлении косметических и гигиенических средств.
Широкий ассортимент биологически активных и технологичных штаммов бифидобактерий дает возможность разрабатывать новые моно- и комплексные продукты функционального питания, лечебного питания и бакпрепараты, способные обеспечивать высокую колонизационную резистентность кишечника человека, восстанавливать его нормальную микрофлору, снижать заболеваемость различными кишечными инфекциями.
На настоящий момент разработан ряд бактерийных препаратов и продуктов лечебно-диетического питания на основе отечественных штаммов бифидобактерий Bifidobacterium bifidum 1, В.bifidum 791, В.bifidum ВКПМ S-1257, В.bifidum ВКПМ Ac - 1578 и др. (А.С. 343588, патент SU 1347221, патент SU 849779, RU 2152993).
Качество продуктов функционального питания и бакпрепаратов обусловлено свойствами штамма-продуцента, его специфической активностью и производственно-ценными свойствами.
Известен штамм Bifidobacterium bifidum 791 БАГ, используемый для получения жидкого концентрата бифидобактерий, кисломолочных лечебно-диетических продуктов и биологически активных добавок. Характерной особенностью штамма является его способность утилизировать 9 свободных аминокислот в стерильном обезжиренном молоке без ростовых добавок: глицин, аланин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, фенилаланин, гистидин и аргинин. Штамм проявляет высокие технологические свойства. Максимальный титр бифидобактерий на стерильном обезжиренном молоке без ростовых факторов через 24 ч культивирования составляет 1-2×1010, через 30 дней хранения в этой среде - 1-2×108 (RU 2165454 С1).
В качестве ближайшего аналога предлагаемого изобретения выбран штамм Bifidobacterium bifidum 791. Штамм выделен из кишечника здорового грудного ребенка, депонирован в ЦМПМ "ВНИИгенетика" под номером В-3300 и характеризуется следующими признаками.
Культурально-морфологические признаки.
Клетки палочковидные с V-образными раздвоениями на одном или двух концах, неподвижные, в мазке образуют скопления, грамположительные.
В 0,72%-ном печеночном и гидролизатно-молочном агарах образует колонии в виде гречишных зерен или дисков размером до 3 мм в диаметре. В жидких питательных средах растет по всей высоте объема, кроме зоны аэробиоза. Пигмента не образует.
Физиолого-биохимические признаки.
Облигатный анаэроб, оптимальная температура 37,5°С, рН 7,2-7,4.
Ферментирует лактозу с образованием уксусной и L(+) молочной кислот, закисляя среду выращивания до рН 4,0. Арабинозу, ксилозу, маннозу, целлобиозу, инулин, маннит, сорбит, салицин не ферментирует.
Сбраживает молоко с образованием к 16-18 ч стабильного сгустка. Газообразующая способность, каталозообразующая способность, разжижение желатины отсутствует.
Кислотообразующая активность: к 24 ч - 70°Т, к 72 ч - 90-100°Т (на печеночной среде), на гидролизатно-молочной среде - до 100°Т и 200°Т соответственно.
Антагонистические свойства.
Проявляет антагонистическую активность по отношению к шигеллам Зонне, Флекснера, энтеропатогенным кишечным палочкам, стафилококкам.
ДНК штамма относится к выраженному ГЦ-типу с коэффициентом специфичности 1,58, молекулярный процент содержания ГЦ-пар в ДНК равен 61.35.
Устойчив к канамицину, мономицину, чувствителен к антибиотикам пенициллинового ряда, кефзолу, гентамицину (патент 1347221).
Известный штамм недостаточно устойчив к повреждающим факторам агрессивных сред гастроинтестинального тракта (кислот, протеолитических ферментов) при прохождении бифидобактерий штамма в желудочно-кишечном тракте, что указывает на недостаточную его колонизирующую способность и жизнеспособность.
Задачей предлагаемого изобретения является выявление штамма Bifidobacterium bifidum 791-МБ, обладающего устойчивостью к широкому спектру антибиотиков, выраженной антиоксидантной активностью, биологической активностью, высокой жизнеспособностью и колонизирующими свойствами, что обеспечивает получение продуктов функционального питания, продуктов на его основе и препаратов с высокими лечебно-профилактическими свойствами.
Штамм В. bifidum 791-МБ получен из селекционного штамма В bifidum 791 путем последовательного перепассирования на тиогликолевой среде и обезжиренном молоке в течение 50 пассажей. Отбирали клоны по признаку максимального накопления биомассы бифидобактерий в стерильном обезжиренном молоке за срок не более 18-20 ч не менее lg 9, а также с выраженной антиоксидантной активностью: супероксиддисмутазная активность штамма не ниже 23,3 ед/мг белка.
В результате проведенной селекции получен штамм В.bifidum 791-МБ, который депонирован и хранится во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов "ВНИИГенетика" за номером ВКПМ Ас-1688 и характеризуется следующими признаками:
Культурально-морфологические признаки.
Палочковидные клетки с V-образными раздвоениями на одном или двух концах, неподвижные, в мазке образуют скопления грамположительные.
Физиолого-биохимические признаки.
Облигатный анаэроб, оптимальная температура 37,5°С, рН 7,2-7,4.
Ферментирует лактозу с образованием уксусной и L(+)-изомера молочной кислоты.
Арабинозу, ксилозу, маннозу, маннит, инулин, целлобиозу, сорбит и салицин не ферментирует.
Сбраживает молоко с образованием к 16-18 ч стабильного сгустка. Газообразующая способность, каталазообразующая способность, разжижение желатины - отсутствуют.
Кислотообразующая активность: к 24 ч - 70°Т, к 72 ч - 90-100°Т (на печеночной среде), на гидролизатно-молочной среде - до 100°Т и 200°Т соответственно.
Максимальный титр бифидобактерий в гидролизатно-молочной агаризованной среде через 24 ч культивирования составляет 1×1010; максимальный титр бифидобактерий в стерильном обезжиренном молоке без ростовых факторов через 24 ч культивирования составляет 1-3×1010.
Штамм растет на общепринятых в производстве питательных средах с накоплением биомассы не менее lg 8-9 микробного числа за 18-20 ч культивирования.
ДНК штамма относится к выраженному ГЦ-типу с коэффициентом специфичности 1,58, молекулярный процент содержания ГЦ-пар в ДНК равен 61,35.
Антагонистические свойства, устойчивость к антибиотикам:
Штамм устойчив к антибиотикам: канамицину, линкомицину, амикоцину, ампициллину, бензилпенициллину, стрептомицину, тетрациклину, а также к сульфадимезину (см. таблицу 1).
Определение уровня устойчивости штамма к антибиотикам проводили по методу серийных разведений в жидкой питательной среде - стерильном обезжиренном молоке. В питательную среду вводили различные концентрации стерильных растворов антибиотиков и 16-часовую культуру бифидобактерий в количестве 5%. Устойчивость определяли по изменению титруемой кислотности в образцах после 48 ч инкубирования при 37-38°С.
Полученные данные свидетельствуют о том, что штамм В.bifidum 791-МБ устойчив к наибольшим концентрациям следующих антибиотиков: к ампициллину, канамицину, линкомицину, стрептомицину, бензилпенициллину.
У штамма наблюдается выраженная антагонистическая активность к патогенным и условно патогенным микроорганизмам: Е.coli, S.aureus, Candida aibirans, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumonia, Shigella sonnei, Citrobacter freundii. Bacillus subtilis (см. таблица 2).
Сравнение антагонистических свойств штаммов В.bifidum 791* и В.bifidum 791-МБ
Полученные данные свидетельствуют о том, что наибольшее антагонистическое действие штамм оказывает на Sh.Sonne, E.coli, Candida typhimurium, Proteus vulgarus, S.aureus, которые наиболее часто являются причиной пищевых отравлений, возникающих при потреблении кисломолочных продуктов.
Условия хранения заявляемого штамма.
Свежеприготовленный штамм В.bifidum 791-МБ на питательной среде с массовой долей сухих веществ 14-16% с добавлением защитной среды, содержащей сахарозу, желатин, лимоннокислый натрий, высушивают сублимационным способом в ампулах. Штамм хорошо хранится при 6-8°С без потери титра активности в течение года.
Основным производственно-полезным признаком штамма В.bifidum 791-МБ, отличающим его от штамма В.bifidum 791, является то, что выращенная в стационарных условиях на тиогликолевой среде в объеме 300 см3 культура обладает выраженной супероксиддисмутазной активностью. СОД-активность штамма В.bifidum 791-МБ составляет 25,6±2,3 ед/мг белка, содержащегося в бактериальной массе. Выявленная СОД-активность культуры бифидобактерий свидетельствует о том, что штамм обладает выраженным пробиотическим действием, которое может проявляться в условиях in vivo, так и in vitro. Высокая активность кислотообразования, устойчивость штамма к основным антибиотикам, способствует эффективному восстановлению нормальной микрофлоры кишечника уже в процессе антибиотикотерапии.
Заявляемый штамм может быть использован в качестве биологически активного начала пробиотической направленности при производстве различных форм бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, кисломолочных продуктов, неферментированных пищевых продуктов, в приготовлении косметических и гигиенических средств, например: кремов, салфеток, лосьонов-тампонов, питательных масок, женских прокладок, мыла, косметического молока и т.п., обеспечивает пробиотический и бактериологический эффект, способствует восстановлению бифидофлоры.
Изобретение также направлено на расширение арсенала аналогичных средств. При этом повышается биологическая ценность продуктов функционального питания и препаратов, приготовляемых на его основе. Употребление в пищу продуктов, использующих заявленный штамм, способствует колонизации слизистой кишечника, вытеснению патогенной и условно патогенной микрофлоры, коррегированию кишечного дисбактериоза, и способствует восстановлению бифидофлоры.
Установлено, что штамм В.bifidum 791-МБ не является бактериогенным и не обладает бактериоциноустойчивостью к штаммам бифидобактерий вида В.longum, что позволяет использовать его при совместном культивировании в заквасках, в составе комплексного бакпрепарата или консорциума бифидобактерий, также направлено на расширение арсенала аналогичных средств.
Пример 1. Использование штамма B.bifidum 791-МБ в составе заквасок для приготовления кисломолочных продуктов.
1-й пассаж. Лиофилизированный штамм бифидобактерий в количестве 0,1 г (1 доза) сухой биомассы титруют методом десятикратных разведений до 10-9 и выращивают при 37,5-38°С до появления отдельных колоний в последних разведениях. Или 1 дозу сухой биомассы вносят в емкость с питательной средой и выращивают до появления отдельных колоний в последних разведениях. Или 1 дозу сухой биомассы штамма вносят в емкость с питательной средой и выращивают до получения биомассы с содержанием клеток не менее 108/мл.
2-й пассаж. Выросшую культуру объемом не более 10% вносят в среду выращивания и культивируют до получения биомассы с содержанием микробных тел не менее 108/мл.
3-й пассаж - (продукт). Полученную биомассу в объеме не более 5% вносят в стерильное молоко и культивируют до образования сгустка, который разливают в емкости и охлаждают. Полученный продукт содержит в 1 мл не менее 108 живых бифидобактерий.
Пример 2. Использование штамма B.bifidum 791-МБ в составе биологически активной добавки.
1-й пассаж. Лиофилизированный штамм активизируют путем посева в питательную среду и выращивают при 37-38,5°С до получения биомассы с содержанием клеток не менее 108/мл.
2-й пассаж. Выросшую культуру в объеме не более 10% вносят в питательную среду и культивируют до получения биомассы с количеством клеток не менее 108/мл.
3-й пассаж. Полученную маточную культуру в количестве не более 5% вносят в питательную среду и выращивают при 37,5-38°С.
Получение биологически активной добавки -Выросшая биомасса представляет собой жидкий концентрат с высоким, не менее 108/мл, титром бифидобактрий. В концентрат можно вносить различные бифидогенные факторы, способствующие стабилизации свойств культуры и лучшей приживляемости штамма в организме. Концентрат, разлитый в емкости, можно непосредственно использовать в качестве биологически активной добавки лечебно-профилактического действия. Можно получить сухую биологическую активную добавку, для этого к биомассе 3-го пассажа добавляют защитные среды высушивания (сахарозожелатиновую, обезжиренное молоко), суспензию замораживают при температуре не менее -45°С, лиофилизируют, укупоривают и получают сухой концентрат с содержанием бифидобактерий не менее 107/мл, который можно использовать в качестве биологической добавки, внося ее в пищевом сырье непосредственно перед употреблением.
Пример 3. Использование штамма B.bifidum 791-MB для получения бифидосодержащего препарата.
1-й пассаж. Лиофилизированный штамм активизируют путем посева в питательную среду и выращивают при 37-38,5°С до получения биомассы с содержанием клеток не менее 108/мл.
2-й пассаж. Выросшую культуру в объеме не более 10% вносят в питательную среду и культивируют до получения биомассы с количеством клеток не менее 108/мл.
3-й пассаж. Полученную маточную культуру в количестве не более 5% вносят в питательную среду и выращивают при 37,5-38°С.
Получение бифидосодержащего препарата - Выросшая биомасса представляет собой жидкий концентрат с высоким, не менее 108/мл титром бифидобактрий. К биомассе 3-го пассажа добавляют защитные среды высушивания (сахарозожелатиновую, обезжиренное молоко), суспензию замораживают при температуре не менее -45°С, лиофилизируют, укупоривают и получают сухой концентрат с содержанием бифидобактерий не менее 108/мл, который можно использовать в качестве бифидосодержащего препарата.
Пример 4. Использование штамма B.bifidum 791-МБ для получения кваса или сока.
1-й пассаж. Лиофилизированный штамм в количестве 0,1 г сухой биомассы активизируют путем посева в питательную среду. Выращивают при 37,5-38°С до получения биомассы с содержанием микробных клеток не менее 108/мл.
2-й пассаж. Выросшую культуру в объеме не более 10% вносят в питательную среду и культивируют до получения биомассы с содержанием клеток не менее 108/мл.
3-й пассаж (получение продукта). Выросшую биомассу в объеме не более 5% вносят в хлебный квас или сок после их пастеризации из расчета, чтобы содержание бифидобактерий в 1 мл кваса или сока составило не менее 108. Квас или сок охлаждают и употребляют без последующего брожения.
Пример 5. Использование штамма B.bifidum 791-МБ для получения косметического средства.
1-й пассаж. Лиофилизированный штамм в количестве 0,1 г сухой биомассы активизируют путем посева в питательную среду. Выращивают при 37,5-38°С до получения биомассы с содержанием микробных клеток не менее 108/мл.
2-й пассаж. Выросшую культуру в объеме не более 10% вносят в питательную среду и культивируют до получения биомассы с содержанием клеток не менее 108/мл.
3-й пассаж (получение косметического средства). Выросшую биомассу в объеме не более 5% вносят в биореактор с тиогликолевой средой и инкубируют при 37,5-38°С при слабом перемешивании до достижения титра бифидобактерий 109 клеток/мл. Впоследствии полученную суспензию клеток разрушают нагреванием в автоклаве. Полученную взвесь биологически активных компонентов охлаждают и смешивают с кремовой основой в соотношении 1:2-1:20 в зависимости от назначения изготовляемого крема.
Изобретение относится к биотехнологии, пищевой и медицинской промышленности и может быть использовано в производстве продуктов функционального питания пробиотического назначения, гигиенических и косметических средств. Штамм Bifidobacterium bifidum 791-МБ получен методом селекции путем длительного перепассирования на тиогликолевой среде и обезжиренном молоке. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов "ГосНИИГенетика" за номером ВКПМ Ас-1688. Штамм Bifidobacterium bifidum 791-МБ активно размножается в питательных средах с накоплением необходимого титра жизнеспособных бактерий, обладает высокой кислотообразующей активностью, антагонистическими свойствами в отношении патогенной и условно патогенной микрофлоры, проявляет выраженную антиоксидантную активность. Супероксиддисмутазная активность культуры свидетельствует о выраженном пробиотическом действии, проявляемом в условиях in vivo и in vitro. Использование штамма в производстве кисломолочных, неферментированных продуктов, биологически активных добавок, бифидосодержащих препаратов, косметических и гигиенических средств обеспечивает пробиотический и бактериологический эффект, способствует восстановлению нормальной микрофлоры, кожных и слизистых покровов, а также направлено на расширение арсенала аналогичных средств. 2 табл.
Штамм бифидобактерий Bifidobacterium bifidum 791-МБ, ВКПМ Ас-1688, используемый для приготовления кисло-молочных, неферментированных продуктов, биологически активных добавок, бифидосодержащих препаратов, косметических и гигиенических средств.
