СПОРИЦИДНЫЕ СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ Российский патент 2022 года по МПК C11D3/39 A61L2/16 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке в соответствии с 35 U.S.С. §119(e) испрашивается приоритет по предварительной заявке на патент США № 62/678562, поданной 31 мая 2018 г., содержание которой включено в настоящее изобретение в качестве ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к композициям на основе надкарбоновой кислоты, предназначенным для уменьшения степени загрязнения эндоспорами.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Некоторые виды бактерий вследствие жестких условий или недостатка питательных веществ могут образовывать эндоспоры. Эндоспоры являются спящими, многослойными, неразмножающимися структурами, содержащими чрезвычайно плотную микробную ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота). Эндоспоры являются устойчивыми к неблагоприятным воздействиям окружающей среды, например, к воздействию высокой температуры, УФ-излучения, отсутствию влаги, к химической и ферментативной обработке, которые обычно уничтожают бактерии. В результате этого, эндоспоры затруднительно уничтожить путем стандартных противомикробных обработок. При попадании в подходящие условиях, таких как тепло и питательная среда, эндоспоры могут прорастать и продуцировать жизнеспособные бактерии. Эндоспоры могут оставаться спящими в течение длительных промежутков времени. Патогенные для человека микроорганизмы, такие как Bacillis anthracis и Clostridium botulinum, являются спорогенными бактериями. Загрязнение эндоспорами, например, загрязнение медицинского оборудования, оборудования, использующегося в фармацевтическом производстве или для упаковки пищевых продуктов, а также самих пищевых продуктов, может представлять собой существенную опасность для здоровья человека. Постоянно необходимы способы, с помощью которых безопасным и эффективным образом устраняется загрязнение эндоспорами и образующими эндоспоры микробами.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способам уменьшения степени загрязнения подложки эндоспорами или спорогенными микроорганизмами, способ включает введение подложки во взаимодействие с композицией, содержащей надкарбоновую кислоту и пероксид водорода при отношении выраженных в мас. % количеств, составляющем примерно от 1,2 до 30,0, при отсутствии разлагающего пероксид фермента в течение промежутка времени, достаточного для уменьшения степени загрязнения. Эндоспоры могут продуцироваться микробом, выбранным из группы, состоящей из следующих: Paenibacillus chibensis, Paenibacillus favisporus, Bacillus cereus, Bacillus atrophaeus, Bacillus subtilis и Geobacillus stearothermophilus или их комбинация. Надкарбоновая кислота может включать C₁-С₁₀-надкарбоновую кислоту, например, надуксусную кислоту. Отношение выраженного в мас. % количества надкарбоновой кислоты к выраженному в мас. % количеству пероксида водорода может составлять примерно 1,2, 1,6, 1,8, 2,0, 2,2, 2,4, 2,5, 2,6, 2,8, 3,0, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4,0, 4,2, 4,4, 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8 или 6,0. Настоящее изобретение также относится к способам уменьшения степени загрязнения подложки эндоспорами или спорогенными микроорганизмами, способ включает введение подложки во взаимодействие с композицией, содержащей надкарбоновую кислоту и пероксид водорода, обладающей окислительно-восстановительным потенциалом (ОВП), равным более примерно 500 мВ, при отсутствии разлагающего пероксид фермента в течение промежутка времени, достаточного для уменьшения степени загрязнения. Настоящее изобретение также относится к способу обработки подложки, загрязненной или подверженной риску загрязнения эндоспорами, способ включает стадии получения раствора, содержащего надкарбоновую кислоту и пероксид водорода; регулирования концентрации надкарбоновой кислоты и пероксида водорода для обеспечения окислительно-восстановительного потенциала (ОВП), равного более 500 мВ; и введения подложки во взаимодействие с обладающим подобранными характеристиками раствором при отсутствии разлагающего пероксид фермента в течение промежутка времени, достаточного для уменьшения степени загрязнения эндоспорами, где во время стадии взаимодействия непрерывно проводят мониторинг ОВП.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Эти и другие особенности и преимущества настоящего изобретения будут более подробно раскрыты или станут очевидными при рассмотрении приведенного ниже подробного описания предпочтительного варианта осуществления настоящего изобретения, который следует рассматривать вместе с прилагаемыми чертежами, на которых одинаковые номера означают одинаковые части и, кроме того, на которых представлено следующее.

На фиг. 1 представлена зависимость значения D от отношения НУК (надуксусная кислота)/Н₂О₂ для P. chibensis ВАА-725 при концентрации НУК, равной 2900 част./млн, при 55°С.

На фиг. 2 представлена зависимость значения D от отношения НУК/Н₂О₂ для P. favisporus при концентрации НУК, равной 2900 част./млн, при 55°С.

На фиг. 3 представлена зависимость значения D от отношения НУК/Н₂О₂ для P. favisporus при концентрации НУК, равной 6000 част./млн, при 65°С.

На фиг. 4 представлена зависимость окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) от концентрации НУК для разных содержащих НУК композициях.

На фиг. 5 представлена зависимость окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) от концентрации НУК в присутствии вспомогательного вещества - H₂SO₄.

На фиг. 6 представлена схема, иллюстрирующая один вариант осуществления предназначенной для обработки системы.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНОГО ВАРИАНТА ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Это описание предпочтительных вариантов осуществления необходимо рассматривать вместе с прилагаемыми чертежами, которые считаются частью всего письменного описания настоящего изобретения. Чертежи необязательно выполнены в масштабе и для ясности и краткости некоторые аспекты настоящего изобретения могут быть представлены в увеличенной в масштабе или схематично. В настоящем описании относительные термины, такие как "горизонтальный", "вертикальный", "наверху", "внизу", "верх" и "низ", а также их производные (например, "горизонтально", "направленный вниз", "направленный вверх" и т.п.) следует понимать, как означающие ориентацию, описанную или представленную на рассматриваемом чертеже. Эти относительные термины предназначены для удобства описания и обычно они не предназначены для предписания конкретной ориентации. Термины, включающие термин "внутри" в противоположность термину "снаружи", термин "продольно" в противоположность термину "поперечно" и т.п. следует интерпретировать друг относительно друга или относительно продольных осей, или относительно осей или центра вращения, если это является подходящим. Термины, относящиеся к положениям присоединения, соединения и т.п., такие как "связанные" и "взаимосвязанные" означает такую взаимосвязь, где структуры прикреплены или присоединены друг к другу непосредственно или опосредованно через находящиеся между ними структуры, а также подвижные или неподвижные скрепления или соединения, если явно не описано иное. Термин "функционально связанные" означает такое прикрепление, соединение или связь, которая позволяют соответствующим структурам работать так, как предполагается в соответствии с такой взаимосвязью. Если проиллюстрирован только один механизм, то термин "механизм" также включает любую группу механизмов, которые по отдельности или вместе представляют собой набор (или несколько наборов) инструкций для выполнения одной или большего количества методологий, описанных в настоящем изобретении. В формуле изобретения пункты "средство плюс функция", если они используются, предназначены для охвата структур, описанных, предложенных или ставших очевидными из письменного описания или чертежей, предназначенных для выполнения указанной функции, включая не только структурные эквиваленты, но и эквивалентные структуры.

Настоящее изобретение относится к способам и композициям, предназначенным для уменьшения степени загрязнения подложки эндоспорами. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что композиция, содержащая надкарбоновую кислоту и пероксид водорода при отношении выраженных в мас. % количеств, составляющем примерно от 1,2 до 6,0, при отсутствии разлагающего пероксид фермента эффективно уменьшает степень загрязнения эндоспорами. Точнее, при использовании отношения выраженных в мас. % количеств, составляющего примерно от 1,2 до 6,0, при отсутствии разлагающего пероксид фермента обеспечивается более существенное уменьшение степени загрязнения эндоспорами при меньших продолжительностях взаимодействия, чем обеспеченное при использовании отношения выраженных в мас. % количеств, составляющего менее примерно 1,2. Композиции обладают спорицидной активностью по отношению к микробам, которые обычно являются устойчивыми к обработке стандартным противомикробным средством.

Авторы настоящего изобретения также обнаружили, что окислительно-восстановительный потенциал (ОВП) растворов надуксусная кислота/пероксид водорода (НУК/Н₂О₂) увеличивается при увеличении концентрации НУК. Неожиданно оказалось, что ОВП и, таким образом, окислительная способность раствора увеличивается при увеличении значения отношения количеств НУК/Н₂О₂, даже если концентрация НУК остается постоянной. В противоположность этому, увеличение количества Н₂О₂ при постоянной концентрации НУК приводит к уменьшению ОВП и, таким образом, окислительной способности раствора, несмотря на то, что Н₂О₂ обычно считается сильным окислительным реагентом. Соответственно, предложены системы, предназначенные для спорицидной обработки, основанные на непрерывном мониторинге ОВП.

Если не ограничиваться какими-либо конкретными теоретическими соображениями, то можно предположить, что взаимосвязь между значением ОВП и значениями отношения НУК/Н₂О₂ обусловлена двойной ролью Н₂О₂, которую он играет в композициях на основе надкислоты, где Н₂О₂ может действовать или как окислительный реагент, или как восстановительный реагент.

Композиции

Композиции, раскрытые в настоящем изобретении, содержат надкарбоновую кислоту. Надкарбоновые кислоты могут включать органические алифатические надкислоты. содержащие 2 или 3 атома углерода, например, надуксусную кислоту и пероксипропановую кислоту. Надкарбоновые кислоты могут включать C₁-С₁₀-карбоновые надкислоты. Другие надкарбоновые кислоты могут включать С₂-С₅-дикарбоновые надкислоты или С₆-С₁₂-монокарбоновые надкислоты. Дополнительными надкислотами являются органические низшие алифатические монокарбоновые кислоты, содержащие 2-5 атомов углерода, такие как уксусная кислота (этановая кислота), пропионовая кислота (пропановая кислота), масляная кислота (бутановая кислота), изомасляная кислота (2-метил пропановая кислота), валериановая кислота (пентановая кислота), 2-метилбутановая кислота, изовалериановая кислота (3-метилбутановая кислота) и 2,2-диметилпропановая кислота.

Надкислотами, применимыми в способах, предлагаемых в настоящем изобретении, являются надуксусная кислота (пероксиуксусная кислота или НУК) или надмуравьиная кислота или их комбинация. Содержащие надкарбоновые кислоты растворы, например, содержащие надуксусную кислоту растворы, обычно представляют собой находящиеся в динамическом равновесии смеси надуксусной кислоты, воды, пероксида водорода, уксусной кислоты и воды. Массовые отношения этих компонентов могут меняться. Подходящие массовые отношения надуксусная кислота/пероксид водорода (НУК/Н₂О₂) могут находиться в диапазоне от примерно 1,2 до примерно 30,0. Таким образом, массовое отношение НУК/Н₂О₂ может составлять примерно 1,2, примерно 1,6, примерно 1,8, примерно 2,0, примерно 2,2, примерно 2,4, примерно 2,5, примерно 2,6, примерно 2,8, примерно 3,0, примерно 3,2, примерно 3,4, примерно 3,6, примерно 3,8, примерно 4,0, примерно 4,2, примерно 4,4, примерно 4,6, примерно 4,8, примерно 5,0, примерно 5,2, примерно 5,4, примерно 5,6, примерно 5,8, примерно 6,0, примерно 6,5, примерно 7,0, примерно 7,5, примерно 8,0, примерно 8,5, примерно 9,0, примерно 9,5, примерно 10,0, примерно 12,0, примерно 14,0, примерно 16,0, примерно 18,0, примерно 20,0, примерно 22,0, примерно 24,0, примерно 26,0, примерно 28,0 или примерно 30,0. В некоторых вариантах осуществления массовое отношение НУК/Н₂О₂ может составлять примерно 1,5, примерно 2,2, примерно 5,0 или примерно 5,5.

Содержащие надуксусную кислоту растворы можно охарактеризовать концентрацией надуксусной кислоты и пероксида водорода. Имеющиеся в продаже содержащие надуксусную кислоту растворы обычно обладают таким составом, что они содержат 2-35% надуксусной кислоты и 5-30% пероксида водорода, при этом оставшуюся часть составляет уксусная кислота и вода. Типичные содержащие надуксусную кислоту растворы могут содержать 15% надуксусной кислоты и 10% пероксида водорода; 22% надуксусной кислоты и 10% пероксида водорода; 35% надуксусной кислоты и 7% пероксида водорода; 15% надуксусной кислоты и 3% пероксида водорода; 22% надуксусной кислоты и 4% пероксида водорода. Типичными содержащими НУК растворами являются растворы, обладающие массовыми отношениями НУК:пероксид водорода:уксусная кислота, составляющими 15:10:36; 15:10:35; 35:10:15; 20-23:5-10:30-45 и 35:10:15.

Концентрация надуксусной кислоты, содержащейся в композициях, может находиться в диапазоне от примерно 1 до примерно 10000 част./млн. Таким образом, концентрация надуксусной кислоты может составлять примерно 1 част./млн, примерно 2 част./млн, примерно 3 част./млн, примерно 4 част./млн, примерно 5 част./млн, примерно 6 част./млн, примерно 7 част./млн, примерно 8 част./млн, примерно 9 част./млн, примерно 10 част./млн, примерно 12 част./млн, примерно 15 част./млн, примерно 18 част./млн, примерно 20 част./млн, примерно 25 част./млн, примерно 30 част./млн, примерно 35 част./млн, примерно 40 част./млн, примерно 45 част./млн, примерно 50 част./млн, примерно 60 част./млн, примерно 75 част./млн, примерно 100 част./млн, примерно 125 част./млн, примерно 150 част./млн, примерно 200 част./млн, примерно 250 част./млн, примерно 300 част./млн, примерно 350 част./млн, примерно 400 част./млн, примерно 450 част./млн, примерно 500 част./млн, примерно 1000 част./млн, примерно 1500 част./млн, примерно 2000 част./млн, примерно 2200 част./млн, примерно 2500 част./млн, примерно 2900 част./млн, примерно 3000 част./млн, примерно 3500 част./млн, примерно 4000 част./млн, примерно 4500 част./млн, примерно 5000 част./млн, примерно 6000 част./млн, примерно 7500 част./млн или примерно 10000 част./млн.

Пероксиды можно получить в виде исходных водных растворов и разбавить для использования. Исходные водные растворы пероксида водорода могут содержать не менее примерно 8 мас. % Н₂О₂, не менее примерно 15 мас. % Н₂О₂, не менее примерно 20 мас. % Н₂О₂., не менее примерно 27% Н₂О₂, не менее примерно 35 мас. % Н₂О₂. Исходные водные растворы пероксида водорода, обладающие этими концентрациями, подходящие для применения в настоящем изобретении, можно легко приобрести у поставщиков в виде стабилизированных растворов Н₂О₂. Также можно использовать высококонцентрированные исходные водные растворы пероксида водорода (существенно более 50 мас. % Н₂О₂). Исходные водные растворы Н₂О₂, содержащие более примерно 50 мас. % Н₂О₂, обычно требуют осторожного обращения и мер предосторожности. Таким образом, исходные водные растворы пероксида водорода могут обладать концентрацией, находящейся в диапазоне от примерно 8 до примерно 70 мас. % Н₂О₂, от примерно 15 до примерно 50 мас. % Н₂О₂, от примерно 25 до примерно 40 мас. % Н₂О₂. Подходящие исходные растворы могут обладать концентрацией, находящейся в диапазоне от примерно 30 до примерно 40 мас. % Н₂О₂.

Композиции, раскрытые в настоящем изобретении, не содержат разлагающий пероксид фермент, например каталазу. Такие ферменты катализируют разложение пероксида с образованием воды и кислорода. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что, в отличие от использующихся ранее методик, в которых для повышения эффективности путем обработки каталазой обеспечивают уменьшение концентрации пероксида в содержащих НУК/Н₂О₂ композициях, содержащие НУК/Н₂О₂ композиции при отношении выраженных в мас. % количеств, составляющем примерно от 1,2 до 6,0, обладают эффективным спорицидным воздействием при отсутствии каталазы. Таким образом, при отсутствии каталазы обеспечивается спорицидное воздействие без затрат и без необходимости дополнительной обработки образца для удаления остаточных количеств фермента.

Композиции, раскрытые в настоящем изобретении, не содержат секвестрант пероксида, который представляет собой реагент, который может образовывать комплекс с пероксидом для устранения активности пероксида. Реагентом, образующим комплекс с пероксидом, может являться, например, соль титана (ГУ), такая как ацетат титана.

Композиции, раскрытые в настоящем изобретении, могут содержать или не содержать вспомогательное вещество. Вспомогательным веществом может являться стабилизатор, смачивающий агент или реагент, который повышает биоцидную активность композиции. В некоторых вариантах осуществления вспомогательным веществом может являться кислота, например, серная кислота (H₂SO₄). В некоторых вариантах осуществления вспомогательным веществом может являться гидроксикислота, такая как лимонная кислота, изолимонная кислота, молочная кислота, глюконовая кислота и яблочная кислота. В некоторых вариантах осуществления вспомогательным веществом может являться соединение, образующее хелат с металлами, например, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТК). В некоторых вариантах осуществления вспомогательным веществом может являться стабилизатор, например, фосфоновая кислота или фосфонат, например, DeQuest 2010. В некоторых вариантах осуществления вспомогательным веществом может являться секвестрант, например, дипиколиновая кислота. В некоторых вариантах осуществления вспомогательным веществом может являться поверхностно-активное вещество, например, анионогенный лаурат, сорбитан и его соответствующие сложные эфиры, т.е. полиэтиленсорбитанмонолаурат; и обладающий короткой цепью жирный сложный эфир (С₆-С₁₂).

Композиции, раскрытые в настоящем изобретении, широко и различным образом применимы для обработки подложек, которые загрязнены спорогенным микроорганизмом или подвержены риску загрязнения, или предположительно загрязнены спорогенным микроорганизмом. Композиции можно приготовить разными путями. В одном варианте осуществления надкарбоновую кислоту и пероксид водорода можно объединить до использования с получением концентрированного водного раствора. Концентрированный водный раствор можно разбавить непосредственно перед использованием с обеспечением соответствующей концентрации. Можно проводить непрерывный мониторинг окислительной способности раствора путем определения окислительно-восстановительного потенциала. Окислительно-восстановительный потенциала можно определить с использованием одного или большего количества датчиков ОВП. Обычно подходящими значениями ОВП являются равные примерно 450 мВ, примерно 480 мВ, примерно 500 мВ, примерно 520 мВ, примерно 540 мВ, примерно 560 мВ, примерно 580 мВ, примерно 600 мВ, примерно 620 мВ, примерно 640 мВ, примерно 660 мВ, примерно 680 мВ, примерно 700 мВ, примерно 720 мВ, примерно 740 мВ, примерно 760 мВ, примерно 780 мВ, примерно 800 мВ, примерно 820 мВ, примерно 840 мВ, примерно 860 мВ, примерно 880 мВ, примерно 900 мВ, примерно 920 мВ, примерно 940 мВ, примерно 960 мВ, примерно 980 мВ или примерно 1000 мВ.

Разбавленный водный раствор можно наносить на подложку в виде жидкости или льда, аэорозоля, тумана, пара или надкритической жидкости.

Подложку можно ввести во взаимодействие с композицией разными путями, включая, например, погружение, заводнение, окунание или распыление в виде аэрозоля или тумана. Альтернативно, композиции можно испарить с получением газообразного пара и нанести в виде пара. В некоторых вариантах осуществления концентрированный водный раствор можно добавить к находящейся в баке воде и обеспечить конечную концентрацию, подходящую для противомикробной обработки.

Продолжительность взаимодействия композиций с подложкой может меняться в зависимости от температуры, природы подложки, методики нанесения и конкретного целевого микроорганизма. Продолжительность взаимодействия композиций с подложкой может находиться в диапазоне от нескольких секунд до более одного часа. Типичные продолжительности взаимодействия включают примерно 1 с, примерно 2 с, примерно 3 с, примерно 4 с, примерно 5 с, примерно 6 с, примерно 7 с, примерно 8 с, примерно 9 с, примерно 10 с, примерно 15 с, примерно 20 с, примерно 25 с, примерно 30 с, примерно 40 с, примерно 45 с, примерно 50 с, примерно 60 с, примерно 90 с, примерно 120 с, примерно 3 мин, примерно 5 мин, примерно 8 мин, примерно 10 мин, примерно 15 мин, примерно 30 мин, примерно 45 мин или примерно 60 мин.

Уменьшение степени микробного загрязнения обычно можно оценить путем определения количества жизнеспособных микробов, находящихся на обработанной подложке. В некоторых вариантах осуществления уменьшение степени микробного загрязнения обработанного пищевого продукта может составлять примерно 50%, примерно 80% примерно 90%, примерно 95%, примерно 99% или примерно 99,9% от степени загрязнения необработанной контрольной подложки. Альтернативно или дополнительно, степень уменьшения можно определить, как уменьшение, выраженное в единицах Log₁₀. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления степень микробного загрязнения может уменьшаться на 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 Log₁₀ по сравнению со степенью загрязнения необработанной контрольной подложки. Степень микробного загрязнения можно определить, например, по стандартным методикам выращивания культур, включая разрастание микробов, методики с использованием нуклеиновой кислоты, такие как полимеразная цепная реакция, и иммунологические исследования.

В некоторых вариантах осуществления эффективность обработки можно выразить с помощью "значения D". Значение D означает период времени (например, количество секунд), необходимый для обеспечения уменьшения количества целевого микроорганизма при заданных температуре и концентрации НУК, составляющего 1 Log₁₀ (или 90%). Таким образом, чем меньше значение D, тем выше эффективность противомикробного средства.

Способы и композиции, раскрытые в настоящем изобретении, применимы для уменьшения степени загрязнения спорогенными бактериями, включая и анаэробные, и аэробные спорогенные микроорганизмы. Типичные анаэробные микроорганизмы включают Clostridium spp., например, Clostridium botulinum и Clostridium perfringens. Типичные аэробные микроорганизмы включают Paenibacillus spp, например, Paenibacillus chibensis и Paenibacillus favisporus; Geobacillus spp., например, Geobacillus stearothermophilus; Bacillus spp., например, Bacillus cereus, Bacillus atrophaeus, Bacillus subtilis; Brevibacillus spp., например, Brevibacillus agri и Brevibacillus borstelensis; Sporosarcina spp., например, Sporosarcina ureae и Paenisporosarcina.

Композиции можно применять для нанесения на целый ряд подложек, представляющих собой разные материалы, включая металл, пластмассу, керамику, стекло, дерево, резину, композит или их комбинацию. Подложкой может являться подложка, которая загрязнена спорогенным микробом, или подложка, которая чувствительна к загрязнению или подвержена риску загрязнения спорогенным микробом. Так, например, композиции можно наносить на подложку, включающую медицинский прибор, оборудование для приготовления пищевых продуктов или напитков, оборудование для фармацевтического производства или пищевые продукты. Типичные подложки включают оборудование и упаковку, использующуюся для приготовления и обработки пищевых продуктов, например, контейнеры для напитков, машины для асептического наполнения, оборудование для молочной промышленности; оборудование и контейнеры, использующиеся для приготовления и упаковки фармацевтических средств, медицинское оборудование и приборы, такие как хирургические инструменты или другие инструменты, использующиеся в диагностике, например, эндоскопы, зубоврачебные инструменты и другое оборудование, и ветеринарное оборудование.

Композиции можно наносить на целый ряд различных объектов, включая здания и их внутренние части. Таким образом, композиции можно наносить на полы, стены, двери, дверные ручки и приспособления, находящиеся в любом из указанных выше объектов. Композиции также можно наносить на предметы, находящиеся в этих объектах. Композиции являются особенно подходящими для предметов, находящихся в медицинских учреждениях, включая, но не ограничиваясь только ими, медицинские приборы и медицинское оборудование, например, операционные столы и другие приспособления в операционных, больничные койки, столы-подносы, каталки, кресла для перевозки больных, ходунки, медицинские приборы многократного использования и вспомогательное оборудование, например, тазы для инструментов, ножницы, стетоскопы, катетеры, скальпели, ланцеты, стетоскопы, кардиостимуляторы, кабели для кардиостимуляторов, трахеотомические трубки, термометры, шовный материал или хирургические зажимы. Другие типичные объекты включают, но не ограничиваются только ими, предметы и поверхности в ванной комнате (например, полы, ванны, душевые кабины, зеркала, туалеты, биде и сантехнику), поверхности на кухне (например, плиты столов, печи, духовки, плиты, раковины, холодильники, морозильники, микроволновые печи, электроприборы, столы, стулья, шкафы, выдвижные ящики и полы).

Композиции и способы, предлагаемые в настоящем изобретении, применимы для целого ряда различных материалов, включая, но не ограничиваясь только ими, керамику, винил, не содержащий воск винил, линолеум, меламин, стекло, эмаль, пластмассу, пластифицированную древесину, металл (например, нержавеющую сталь или хромированные поверхности), любую окрашенную или лакированную, заклеенную поверхность, ткани или резину.

Композиции также можно наносить на поверхности предметов, которые соприкасаются с пищей. Эти предметы могут включать оборудование для приготовления и обработки пищевых продуктов, например, посуду, столовые приборы, аппараты для перемешивания, измельчители, например, мясорубки, барабаны, миксеры, баки для разжижения, баки для ферментации, баки для хранения или холодильное оборудование. Композиции также можно наносить на поверхности, использующиеся для приготовления пищевых продуктов, включая кухонные столы, разделочные доски, раковины и другие рабочие поверхности.

Композиции и способы, описанные в настоящем изобретении, также можно применять для обработки поверхностей пищевых продуктов, например, растений и частей растений (например, семян, овощей и фруктов). Подходящие растения и части растений включают сырые сельскохозяйственные продукты (т.е. необработанные продукты) и обработанные продукты, а также пищевые продукты, содержащие животный белок, например, мясо, рыбу или моллюски.

Настоящее изобретение также относится к системам, предназначенным для уменьшения степени загрязнения материала эндоспорами, основанным на обнаружении авторами настоящего изобретения того, что противомикробная эффективность систем на основе надкислоты зависит от окислительной способности, на которую указывает значение ОВП. Типичная система, предназначенная для осуществления способа, описанного в формуле изобретения, представлена на фиг.6. Путем мониторинга ОВП можно поддерживать концентрацию НУК и оптимальное значение отношения НУК/Н₂O₂.

Система включает один или большее количество подпиточных баков 1 для разбавления концентрированной НУК, которую подают из содержащей НУК емкости 6 через модуль 8 для подачи НУК вместе с водой из модуля 7 для подачи воды, датчик 2 для НУК и датчик 3 для ОВП, предназначенный для мониторинга потока, выходящего из подпиточного бака 1, и бак 4 для спорицидной обработки, в который загружают разбавленную НУК. Система может включать необязательную линию рециркуляции 5 для обеспечения возможности использования НУК после проведения обработки. Полагают, что вследствие разложения НУК с образованием Н₂О₂ концентрация Н₂О₂ в рециркулированном растворе будет выше, чем в исходном растворе. Для поддержания оптимального значения отношения НУК/Н₂О₂ с помощью датчика для ОВП проводят непрерывный мониторинг ОВП загружаемого раствора. Модуль очистки 9 можно настроить соответствующим образом. Датчик для НУК используют для мониторинга и регулирования подачи концентрата НУК и воды для обеспечения целевой концентрации НУК. Альтернативно, с целью мониторинга значения отношения НУК/Н₂О₂ вместо датчика для ОВП или в дополнение к нему можно использовать датчик для Н₂О₂.

Примеры

Пример 1

Микроорганизмы. Все микроорганизмы в виде спор приобретали у сертифицированных поставщиков. Поставщики микроорганизмов перечислены ниже.

Paenibacillus chibensis - American Type Culture Collection (ATCC);

Paenibacillus favisporus - DSMZ;

Bacillus cereus 14579 - Presque Isle Cultures;

Bacillus atrophaeus 9372 - Mesa Labs;

Bacillus subtilis 6633 - Presque Isle Cultures;

Bacillus subtilis 19659 - Presque Isle Cultures.

После получения определяли титр споровой культуры путем серийного разведения в буфере Баттерфилда и помещения в планшеты 3М AC Petrifilm™. Затем планшеты Petrifilm™ инкубировали при 35°С в течение примерно 48 ч и считывали. Культуры хранили в специальном холодильнике. Каждый раз перед использованием споровую культуру повторно анализировали для подтверждения того, что культура оставалась жизнеспособной и незагрязненной.

Пример 2

Paenibacillus chibensis ВАА-725 обрабатывали содержащими НУК композициями, обладающими отношениями НУК/Н₂О₂, приведенными в таблице 1.

Перед использованием содержащие НУК композиции разбавляли деионизированной водой до концентрации, равной примерно 2900 част./млн. Температуру композиций повышали до равной 55°С и непосредственно перед использованием с помощью автомата для титрования определяли фактические концентрации НУК и Н₂О₂.

Изготовленные из нержавеющей стали полоски инокулировали с помощью P. chibensis ВАА-725. P. chibensis ВАА-725 вводили во взаимодействие с содержащей НУК композицией путем погружения полосок в композицию на 10, 20 или 30 с. Все выжившие микроорганизмы извлекали, инкубировали и подсчитывали. Микроорганизмы извлекали путем суспендирования культуры в бульоне Летина, содержащем 0,5% тиосульфата натрия, обработки ультразвуком в течение 5 мин и энергичного перемешивания в течение 30 с. Затем образцы серийно разводили в буфере Баттерфилда, помешали в планшеты 3М АС Petrifilm™ и инкубировали при 35°С в течение примерно 48 ч. После инкубирования подсчитывали количество находящихся в Petrifilm™ выживших микроорганизмов.

Эффективность уничтожения спор выражали с помощью значения D. Значение D означает период времени (например, количество секунд), необходимый для обеспечения уменьшения количества целевого микроорганизма при заданных температуре и концентрации НУК, составляющего 1 Log₁₀ (или 90%). Таким образом, чем меньше значение D, тем выше эффективность уничтожения спор.

Как показано на фиг. 1, значение D уменьшается от равного примерно 16-18 с до равного примерно 4 с при увеличении значения отношения НУК/Н₂О₂ от равного 0,2 до равного 1,2. Значение D остается относительно постоянным при значениях отношения НУК/Н₂О₂, равных от примерно 1,8 до примерно 5,0. Эти результаты показывают, что значение отношения НУК/Н₂О₂, подходящее для уничтожения спор P. chibensis ВАА-725, равно более примерно 1,2.

Пример 3

Paenibacillus chibensis ВАА-725 обрабатывали содержащими НУК композициями в присутствии и при отсутствии каталазы, фермента, который гидролизует Н₂О₂.

Равновесный раствор смеси НУК/Н₂О₂, содержащий 35 мас. % НУК и 7 мас. % Н₂О₂, разбавляли деионизированной водой (ДИ) до обеспечения концентрации НУК, равной примерно 2900 част./млн. Для обработки каталазой 1 мкл каталазы (Sigma-Aldrich, каталаза из Aspergillus, ≥4000 (Ед./мг белка), примерно 14,4 мг/(мл белка)) добавляли к 200 мл раствора и инкубировали при комнатной температуре в течение 45 мин. Затем раствор нагревали до 55°С на водяной бане. Продолжительность стадии нагревания составляла примерно 38 мин. После установления целевой температуры с помощью автомата для титрования определяли фактические концентрации НУК и Н₂О₂.

Изготовленные из нержавеющей стали полоски инокулировали с помощью P. chibensis ВАА-725 в соответствии с методикой, описанной в примере 1, и вводили во взаимодействие с обработанным каталазой содержащим НУК раствором и с контрольным содержащим НУК раствором, который не обрабатывали каталазой. Образцы обрабатывали содержащими НУК растворами в течение 10, 20 и 30 с. Значения D рассчитывали так, как описано выше. Результаты этого исследования приведены в таблице 2.

Как показано в таблице 2, значение D, полученное при использовании содержащего НУК раствора при значении отношения НУК/Н₂О₂, равном 4,7, является очень сходным с полученным при использовании такого же содержащего НУК раствора, который обрабатывали каталазой для уменьшения содержания Н₂О₂ до составляющего менее 100 част./млн. Эти результаты показывают, что содержащий НУК раствор при значении отношения НУК/Н₂О₂, равном 4,7, обладает по меньшей мере такой же эффективностью при уничтожении P. chibensis ВАА-725, как содержащие НУК образцы, которые не подвергали требующей больших затрат времени обработке ферментом. Эти результаты также показывают, что для эффективного уничтожения спор обработка ферментом не является необходимой.

Пример 4

Paenibacillus favisporus обрабатывали содержащими НУК композициями, обладающими отношениями НУК/Н₂О₂, приведенными в таблице 3.

Перед использованием содержащие НУК композиции разбавляли деионизированной водой до концентрации, равной примерно 2900 част./млн. Температуру композиций повышали до равной 55°С и непосредственно перед использованием с помощью автомата для титрования определяли фактические концентрации НУК и Н₂О₂.

Изготовленные из нержавеющей стали полоски инокулировали с помощью P. favisporus. Образцы P. favisporus вводили во взаимодействие с содержащей НУК композицией путем погружения полосок в композицию на 10, 20 или 30 с. Все выжившие микроорганизмы извлекали, инкубировали и подсчитывали. Эффективность уничтожения спор выражали с помощью значения D.

Как показано на фиг. 2, значение D уменьшается от равного примерно 120 с до равного примерно 20 с при увеличении значения отношения НУК/Н₂О₂ от равного 0,2 до равного примерно 3,5. Значение D остается относительно постоянным при значениях отношения НУК/Н₂О₂, равных от примерно 3,5 до примерно 4,5. Эти результаты показывают, что значение отношения НУК/Н₂О₂, подходящее для уничтожения P. favisporus, равно примерно 3,5. Эти результаты также показывают, что P. favisporus более затруднительно уничтожить, чем Р. chibensis ВАА-725.

Пример 5

Исследовали влияние концентрации НУК и температуры инкубирования на эффективность НУК/Н₂О₂ для уничтожения спор P. favisporus.

Аликвоты равновесного раствора смеси НУК/Н₂О₂, содержащего 35 мас. % НУК и 7 мас. % Н₂О₂, разбавляли деионизированной водой (ДИ) до обеспечения концентрации НУК, равной примерно 2900, 4500 или 6000 част./млн. Температуру композиций повышали до равной 55 или 65°С и непосредственно перед использованием с помощью автомата для титрования определяли фактические концентрации НУК и Н₂О₂.

Изготовленные из нержавеющей стали полоски инокулировали с помощью P. favisporus. Ρ. favisporus вводили во взаимодействие с содержащей НУК композицией путем погружения полосок в композицию на 10, 20 или 30 с. Все выжившие микроорганизмы извлекали, инкубировали и подсчитывали. Эффективность уничтожения спор выражали с помощью значения D. Результаты этого эксперимента приведены в таблице 4.

Как показано в таблице 4, при температуре, равной 55°С, значение D уменьшается от равного примерно 38 с до равного примерно 14 с при увеличении концентрации НУК от равной 2900 до равной 6000 част./млн НУК при изменении значения отношения НУК/Н₂О₂, равного примерно 4,7 до равного примерно 4,6. При повышении температуры до 65°С при концентрации НУК, равной 6000 част./млн, при значении отношения НУК/Н₂О₂, равном примерно 4,6, значение D уменьшается до равного 6.

Пример 6

P. favisporus обрабатывали содержащими НУК композициями в присутствии и при отсутствии каталазы, фермента, который гидролизует Н₂О₂. Композиции приведены в таблице 5.

Содержащий НУК раствор разбавляли с деионизированной водой (ДИ) до обеспечения концентрации НУК, равной примерно 6000 част./млн. Для обработки каталазой от 1 до 15 мкл каталазы (Sigma-Aldrich, каталаза из Aspergillus, ≥4000 (Ед./мг белка)) добавляли к 200 мл растворов НУК и инкубировали при комнатной температуре в течение 45 мин. Затем растворы инкубировали при 65°С на водяной бане в течение от примерно 40 до примерно 70 мин до установления целевой температуры. После установления целевой температуры с помощью автомата для титрования определяли фактические концентрации НУК и Н₂О₂.

Изготовленные из нержавеющей стали полоски инокулировали с помощью P. favisporus в соответствии с методикой, описанной в примере 1, и вводили во взаимодействие с обработанным каталазой содержащим НУК раствором и с содержащим НУК раствором, который не обрабатывали каталазой. Образцы Р. favisporus вводили во взаимодействие с НУК путем погружения полосок в содержащие НУК композиции на 10, 20 или 30 с. Все выжившие микроорганизмы извлекали, инкубировали и подсчитывали. Эффективность уничтожения спор выражали с помощью значения D. Результаты этого исследования приведены на фиг. 3.

Как показано на фиг. 3, в случае раствора, содержащего НУК при концентрации, равной 6000 част./млн НУК, и при 65°С значения D уменьшаются от равного примерно 40 с до равного примерно 5 с при увеличении значения отношения НУК/Н₂О₂ от равного 0,2 до равного примерно 5,0. В случае таких же растворов, обработанных каталазой, наблюдается такая же тенденция уменьшения значений D от равных более 40 с до равных примерно 6 с при увеличении значения отношения НУК/Н₂О₂ от равного 0,2 до равного примерно 5,0. Эти результаты показывают, что обработка каталазой не повышает эффективность спорицидного воздействия НУК.

Пример 7

Исследовали воздействие содержащих НУК/Н₂О₂ композиций на споры Bacillus cereus 14579, Bacillus atrophaeus 9372, Bacillus subtilis 6633 и Bacillus subtilis 19659. Композиции приведены в таблице 6.

Перед использованием содержащие НУК композиции разбавляли деионизированной водой до концентрации, равной примерно 1500 част./млн. Температуру композиций повышали до равной 50°С и непосредственно перед использованием с помощью автомата для титрования определяли фактические концентрации НУК и Н₂О₂.

Изготовленные из нержавеющей стали полоски инокулировали спорами Bacillus cereus 14579, Bacillus atrophaeus 9372, Bacillus subtilis 6633 и Bacillus subtilis 19659. Образцы спор, указанных выше, вводили во взаимодействие с содержащей НУК композицией путем погружения полосок в композицию на 10, 20 или 30 с. Все выжившие микроорганизмы извлекали, инкубировали и подсчитывали. Эффективность уничтожения спор выражали с помощью значения D. Результаты этого исследования приведены в таблице 7.

Как показано в таблице 7, обе композиции обладают спорицидным воздействием по отношению ко всем исследованным видам Bacillus при концентрации НУК, равной 1500 част./млн, и при 50°С.

Пример 8

Определяли окислительно-восстановительный потенциал (ОВП) содержащих НУК водных растворов. Растворы представлены в таблице 8.

Для проведения исследования содержащие НУК композиции серийно разводили ДИ водой до обеспечения концентрации, равной примерно 6000 част./млн. Значения ОВП определяли с помощью датчика для ОВП Accumet с Pt наконечником и электродом сравнения Accumet Ag/AgCl. Фактические концентрации НУК и Н₂О₂ определяли с помощью автомата для титрования. Все растворы исследовали при комнатной температуре.

Зависимость ОВП от концентрации НУК для содержащих НУК композиций представлена на фиг. 4. Как показано на фиг. 4, для всех композиций значение ОВП увеличивается с увеличением концентрации НУК. Неожиданно оказалось, что значение ОВП также увеличивается с увеличением значения отношения НУК/Н₂О₂, даже если концентрация НУК поддерживается постоянной. Так, например, при концентрации НУК, равной примерно 90 част./млн, и при значении отношения НУК/Н₂О₂, равном 0,2 (композиция 4, приведенная в таблице 8), значение ОВП равно примерно 420 мВ. При значении отношения НУК/Н₂О₂, равном 0,6 (композиция 3, приведенная в таблице 8), значение ОВП увеличивается до равного примерно 480 мВ. При значении отношения НУК/Н₂О₂, равном 1,5 (композиция 2, приведенная в таблице 8), значение ОВП увеличивается до равного до примерно 520 мВ. В заключение, при значении отношения НУК/Н₂О₂, равном 2,5 (композиция 1, приведенная в таблице 8), значение ОВП увеличивается до равного примерно 540 мВ. Эта зависимость сохраняется даже в случае самых высоких исследованных концентраций НУК (500 част./млн). При концентрации НУК, равной 500 част./млн, значение ОВП составляло 440 мВ, 500 мВ, 540 мВ и 580 мВ при значениях отношения НУК/Н₂О₂, равных 0,2, 0,6, 1,5 и 2,5 соответственно. Эти результаты показывают, что увеличение концентрации Н₂О₂ в содержащем НУК растворе оказывает неблагоприятное воздействие на значение ОВП и, таким образом, на окислительную способность раствора. Эти результаты согласуются с результатами, полученными в предыдущих примерах, в которых содержащие НУК композиции, обладающие более высокими значениями отношения НУК/Н₂О₂, обладали более высокой спорицидной эффективностью, чем содержащие НУК композиции, обладающие более низкими значениями отношения НУК/Н₂О₂.

Если не ограничиваться какими-либо конкретными теоретическими соображениями, то можно предположить, что взаимосвязь между значением ОВП и значениями отношения НУК/Н₂О₂ обусловлена двойной ролью Н₂О₂, которую он играет в композициях.

Пример 9

Исследовали влияние вспомогательного вещества на значение ОВП содержащих НУК водных растворов. Растворы представлены в таблице 9.

Для проведения исследования содержащие НУК композиции серийно разводили ДИ водой до обеспечения концентрации, равной примерно 1000 част./млн. Значения ОВП определяли с помощью датчика для ОВП Accumet с Pt наконечником и электродом сравнения Accumet Ag/AgCl. Фактические концентрации НУК и Н₂О₂ определяли с помощью автомата для титрования. Все растворы исследовали при комнатной температуре.

Зависимость ОВП от концентрации НУК для содержащих НУК композиций представлена на фиг. 5. Как показано на фиг. 5, для всех композиций значение ОВП увеличивается с увеличением концентрации НУК. Значение ОВП также увеличивается в присутствии вспомогательного вещества - H₂SO₄.

Пример 10

Исследовали влияние значения отношения НУК/Н₂О₂ на противомикробную эффективность по отношению к неспорообразующим бактериям, Е. coli и Salmonella.

В экспериментах использовали Escherichia coli 8739 и Salmonella enterica 14028. 10 мкл Инокулированной суспензии с помощью пипетки помещали на стерильные полоски изготовленной из нержавеющей стали фольги и им давали полностью высохнуть. Исследуемые содержащие надкислоту растворы разбавляли до обеспечения указанных концентраций. В каждую стерильную пробирку для центрифуги добавляли по 50 мл содержащих НУК растворов. Высушенные полоски погружали в содержащие надкислоту растворы, как это описано выше. Salmonella обрабатывали при 22°С.

Затем полоски нейтрализовывали в 10 мл бульона Летина с добавлением 0,5% тиосульфата натрия. Пробирки для центрифуги закрывали крышками и встряхивали. Пробирки с нейтрализованными полосками обрабатывали ультразвуком в течение 5 мин и затем энергично встряхивали в течение 30 с. Образцы серийно разводили в буфере Баттерфилда, помешали в планшеты Petrifilm АРС и инкубировали при 35°С в течение 48 ч.

Как показано в таблице 10, более высокие значения отношений НУК/Н₂О₂ обеспечивают более высокую эффективность, выражающуюся в уменьшении значений D и для Е. coli, и для Salmonella.

Пример 11

Исследовали влияние значения отношения НУК/Н₂О₂ на применимость НУК. Bacillus atrophaeus 9372 обрабатывали содержащими НУК композициями, как это описано выше.

Как показано в таблице 11, композиция 22/10 НУК при концентрации НУК, равной 1000 част./млн, и при 55°С, обеспечивала значение D (1,9 с), близкое к значению D (1,4 с), обеспеченному композицией 5/15 НУК при концентрации НУК, равной 1500 част./млн, и при 60°С. В отличие от этого, значение D, обеспеченное композицией 5/15 НУК при концентрации НУК, равной 1500 част./млн, и при 50°С, составляло 4,6 с. таким образом, использующееся количество НУК можно уменьшить на одну треть при поддержании противомикробной эффективности путем замены композиции 5/15 НУК, обладающей низким значением отношения НУК/Н₂О₂ на композицию 22/10 НУК, обладающую высоким значением отношения НУК/Н₂О₂.

Из приведенного выше описания для специалистов в данной области техники должно быть очевидно, что, хотя в настоящем изобретении описаны конкретные примеры, предназначенные для иллюстрации, без отклонения от сущности и объема настоящего изобретения в него можно внести различные изменения. Поэтому подразумевается, что приведенное выше подробное описание следует рассматривать, как иллюстративное, а не ограничивающее, и следует понимать, что приведенная ниже формула изобретения, включая все эквиваленты, предназначена для конкретного указания и явного заявления заявленного объекта.

Изобретение относится к биотехнологии. Заявлен способ уменьшения степени загрязнения подложки эндоспорами или спорогенными микроорганизмами, включающий введение подложки во взаимодействие с композицией, содержащей надкарбоновую кислоту и пероксид водорода при отношении от 1,2 до 30,0 мас. %, с окислительно-восстановительным потенциалом (ОВП) от 500 до 1000 мВВ в отсутствии разлагающего пероксид фермента в течение промежутка времени, достаточного для уменьшения степени загрязнения. Изобретение обеспечивает расширение арсенала способов осуществления спорицидной обработки подложки за счет использования непрерывного мониторинга ОВП. 14 з.п. ф-лы, 6 ил., 11 табл., 11 пр.

1. Способ уменьшения степени загрязнения подложки эндоспорами или спорогенными микроорганизмами, включающий введение подложки во взаимодействие с композицией, содержащей надкарбоновую кислоту и пероксид водорода при отношении выраженных в мас. % количеств, составляющем от 1,2 до 30,0, при отсутствии разлагающего пероксид фермента в течение промежутка времени, достаточного для уменьшения степени загрязнения, в котором окислительно-восстановительный потенциал (ОВП) композиции равен от 500 до 1000 мВ.

2. Способ по п. 1, в котором эндоспоры продуцируются микробом, выбранным из группы, состоящей из следующих: Paenibacillus chibensis, Paenibacillus favisporus, Bacillus cereus, Bacillus atrophaeus, Bacillus subtilis и Geobacillus stearothermophilus или их комбинации.

3. Способ по п. 1, в котором спорогенный микроорганизм выбран из группы, состоящей из следующих: Paenibacillus chibensis, Paenibacillus favisporus, Bacillus cereus, Bacillus atrophaeus, Bacillus subtilis и Geobacillus stearothermophilus или их комбинации.

4. Способ по п. 1, в котором подложка включает материал, выбранный из группы, состоящей из следующих: металл, пластмасса, керамика, стекло, дерево, резина, композит или их комбинации.

5. Способ по п. 4, в котором подложка включает медицинский прибор, оборудование для приготовления пищевых продуктов или напитков, оборудование для фармацевтического производства или пищевые продукты.

6. Способ по п. 1, в котором надкарбоновой кислотой является C₁-С₁₀-надкарбоновая кислота.

7. Способ по п. 1, в котором надкарбоновой кислотой является надуксусная кислота.

8. Способ по п. 7, в котором концентрация надуксусной кислоты в композициях находится в диапазоне от 1 до 10000 част./млн.

9. Способ по п. 1, в котором отношение выраженного в мас. % количества надкарбоновой кислоты к выраженному в мас. % количеству пероксида водорода находится в диапазоне от 1,2 до 6,0.

10. Способ по п. 1, в котором отношение выраженного в мас. % количества надкарбоновой кислоты к выраженному в мас. % количеству пероксида водорода равно 1,2, 1,6, 1,8, 2,0, 2,2, 2,4, 2,5, 2,6, 2,8, 3,0, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4,0, 4,2, 4,4, 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8 или 6,0.

11. Способ по п. 1, в котором композиция содержит кислоту, такую как серная кислота в качестве вспомогательного вещества.

12. Способ по п. 1, в котором стадия взаимодействия включает погружение, заводнение, окунание или распыление.

13. Способ по п. 1, в котором продолжительность стадии взаимодействия составляет от 3 до 60 с.

14. Способ по п. 1, в котором степень загрязнения эндоспорами уменьшена на 1 Log₁₀.

15. Способ по п. 1, в котором степень загрязнения эндоспорами уменьшена на 90%.