Способ генетического прогнозирования эффективности экстракорпорального оплодотворения при идиопатическом бесплодии по количеству копий рибосомных генов (генов, кодирующий рибосомную РНК) в геноме женщины Российский патент 2022 года по МПК G01N33/50 C12Q1/6804 A61B5/145 

Область техники

Настоящее изобретение относится к области медицинской генетики, молекулярной биологии, акушерства, гинекологии и может быть использовано в репродуктивной медицине, а именно, для выявления женщин с генетически детерминированной высокой вероятностью серии неудачных попыток ЭКО (экстракорпорального оплодотворения).

Уровень техники

Общемировой современной тенденцией является рост заболеваемости бесплодием и, соответственно, растущее количество случаев вспомогательных репродуктивных процедур, таких как ЭКО (экстракорпоральное оплодотворение). Шансы на успех ЭКО сильно варьируют у разных пар, не превышая 25-35%. Результат в каждом конкретном случае зависит от состояния здоровья женщины, причины бесплодия, возраста женщины, эмоционального состояния, образа жизни, подготовки к ЭКО, качества спермы мужчины и многих других факторов. Даже в случае успешного зачатия и начала вынашивания при ЭКО существует повышенный риск невынашивания беременности (остановка развития плода, спонтанный аборт, выкидыш). Поиск новых, еще не известных факторов бесплодия и неудач ЭКО жизненно необходим для дальнейшего прогресса в репродуктивной медицине.

Беременность - мощный стрессорный фактор для женщины. Известно, что индивидуальная стрессоустойчивость существенно различается в пределах популяции и генетически детерминирована. На клеточном уровне неспецифическая стресс-реакция, согласно учению Г. Селье, выражается в перестройке белкового анаболизма на синтез защитных белков, таких как белки теплового шока. Успех этого ответа зависит от его скорости, лимитируемой количеством доступных и собранных de novo рибосом в клетке. В свою очередь, мобилизационные мощности клетки в отношении биосинтеза рибосом непосредственно обусловлены копийностью рибосомной РНК в геноме данного индивида [1]. Таким образом, можно предположить наличие зависимости между индивидуальной стрессоустойчивостью и исходами беременности от количества в геноме женщины рибосомных генов как источника рРНК (рибосомной РНК), формирующей структуру рибосомы.

В пролиферирующих клетках млекопитающих доля рРНК достигает 40% от общего количества транскриптов в клетке [2, 3, 4]. У дрожжей рДНК, состоящая из ~150 копий, продуцирует рРНК в объеме приблизительно 80% от общего количества внутриклеточной РНК [5]. Накоплен целый ряд экспериментальных доказательств в пользу того, что у самых разных организмов, в первую очередь, у человека число копий рибосомных генов (рДНК) в геноме имеет многочисленные и разнообразные фенотипические проявления в норме и патологии [6].

Поскольку количество копий рибосомных повторов лимитирует максимально возможный уровень биосинтеза белка в организме и служит характеристикой адаптивной способности индивида, мы предположили, что низкая копийность рибосомного повтора может быть причиной низкого уровня биосинтеза белков и, как следствие, снижать шансы успешного зачатия и вынашивания. Это предположение ранее было проверено нами путем сравнения выборок бесплодных и многодетных пар по одному расчетному параметру, связанному с количеством транскрипционно активных рибосомных генов (рДНК) в геноме, и результаты экспериментов косвенно показали связь бесплодия с копийностью рибосомных генов [7].

В данном изобретении производится измерение общего числа копий рибосомного повтора (генов основных рРНК) методом нерадиоактивной дот-гибридизации или полимеразной цепной реакции. В том случае, если количество генов ниже порогового значения 330 копий на диплоидный геном, серия попыток ЭКО с наибольшей степенью вероятности окажется неудачной.

В настоящее время генетическое обследование женщины и пары перед проведением ЭКО при идиопатическом бесплодии сводится к семейному анализу, который в подавляющем большинстве случаев оказывается бесполезным, и проведению кариотипирования пациентки или супружеской пары. Кариотипирование, даже в случае микроматричного анализа с высоким разрешением, позволяет выявлять лишь структурные перестройки (делеции, инсерции, инверсии и транслокации) на хромосомном уровне, которые захватывают участки, содержащие много генов. Ни однонуклеотидные замены, ни вариации количества копий (CNV) умеренных повторов, таких как рибосомные, при помощи кариотипирования выявлены быть не могут.

Известны способы прогнозирования неблагоприятных исходов ЭКО, основанные на определении молекулярно-биологических факторов.

Известен способ прогнозирования результатов лечения бесплодия методов экстракорпорального оплодотворения (патент RU 2357673 С1 от 01.10.2007). Способ осуществляют следующим образом. Проводят трансвагинальную пункцию фолликулов под контролем УЗИ (ультразвукового исследования) с последующим исследованием полученной фолликулярной жидкости. Фолликулярную жидкость подвергают хемиолюминисцентному анализу по стандартной методике, определяют свободнорадикальную активность образцов и по показателям общей антиоксидантной активности дают прогноз наступления беременности. При показателях общей антиоксидантной активности 0,05 и выше дают неблагоприятный прогноз. При показателях общей антиоксидантной активности ниже 0,05 дают благоприятный прогноз - вероятность наступления беременности, по данным авторов, составляет более 50%.

Известен также способ прогнозирования исходов программы ЭКО (экстрокорпорального оплодотворения) и ПЭ (переноса эмбрионов) (патент RU 2581027 С1 от 10.04.2016), который отличается тем, что пациенткам с бесплодием до начала лечения по протоколам ЭКО и ПЭ предварительно определяют в венозной крови уровень антимюллерова гормона (АМГ). При его уровне, составляющем 1,14 нг/мл и ниже, дополнительно определяют уровень тревожности по Спилбергу-Ханну, и если он 45 и выше баллов прогнозируют неблагоприятный исход программы ЭКО для данной пациентки.

Наиболее близким прототипом является способ прогнозирования эффективности программ ЭКО при трубноперитонеальном бесплодии, ассоциированном с хроническим эндометритом (патент RU 2677467 С1 от 17.01.2019), включает перед проведением ЭКО курс лечения и лабораторное исследование сыворотки крови. В день пункции фолликулов в программе ЭКО получают образец крови, в котором методом твердофазного иммуноферментного анализа определяют ЛФ (лактоферрин в мкг/мл) и ИЛ-8 (интерлейкин-8 в пкг/мл) а затем определяют прогноз. При концентрации ЛФ до 1,8 мкг/мл, ИЛ-8 до 10 пкг/мл прогнозируют высокую вероятность положительного результата ЭКО и переносят в полость матки свежий эмбрион. При повышении концентрации ЛФ более 2,0 мкг/мл и ИЛ-8 более 10 пкг/мл прогнозируют высокую вероятность негативного результата ЭКО и рекомендуют криоконсервацию и отсроченный перенос эмбриона после дополнительных курсов антибактериальной, противовоспалительной и иммунокоррегирующей терапий.

Таким образом, в настоящее время отсутствуют экспресс-методики генетического анализа матери на уровне ниже хромосомного, которые позволили бы прогнозировать эффективность процедуры экстракорпорального оплодотворения при идиопатическом бесплодии.

Раскрытие сущности изобретения

Отбор крови и выделение ДНК: венозную кровь отбирают в пробирки с гепарином; ДНК выделяют методом экстракции органическим растворителем; Раствор, содержащий 0,04 М ЭДТА, 2% натрий лаурил саркозилата и 150 мкг/мл РНКазы A ("Sigma", США), добавляют к свежеотобранной крови на 45 минут при 37°С, обрабатывают протеиназой K (200 мкг/мл, "Promega", США) в течение 24 часов при 37°С, экстрагируют равными объемами смеси фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (25:24:1), фенола и смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1). ДНК осаждают добавлением 1/10 объема 3 М ацетата натрия (рН 5,2) и 2,5 объемов ледяного этилового спирта. Фенол стабилизируют 8-гидроксихинолином. ДНК собирают путем центрифугирования при 10000 G в течение 15 минут при 4°С, промывают 70% этанолом (об./об.), высушивают и растворяют в воде.

Определение копийности рибосомных генов: содержание рибосомных повторов в геномной ДНК пациента определяют методом нерадиоактивной количественной гибридизации. Для выявления рДНК человека (образец "GenBank" № U1 3369) используют смесь зондов к рДНК олиго(185) биотин-CTGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTAC и олиго(28Б) биотин-TATCGGTCTCGTGCCGGTATTTAGCCTTAG. Денатурированную ДНК наносят на фильтр (Optitran BA-S85, "GE Healthcare") в количестве 4-6 точек на каждый образец. Стандартные образцы геномной ДНК (50 нг/мл) с известным содержанием рДНК наносят на тот же самый фильтр, чтобы построить калибровочную кривую зависимости интенсивности сигнала от числа копий рДНК. ДНК фага лямбда (50 нг/мл) также наносят на тот же самый фильтр, чтобы контролировать уровень шума. Затем фильтр прогревают при 80°С в вакууме в течение 1,5 ч. После завершения гибридизации мембранный фильтр обрабатывают конъюгатом стрептавидин с щелочной фосфатазой ("Sigma") и помещают в раствор субстратов для щелочной фосфатазы (БХИФ/НСТ). После этого фильтр промывают водой, высушивают в темноте и сканируют. Для количественного определения рДНК используется написанная нами специальная программа "Imager 6", позволяющая вычислять интегральную интенсивность сигнала от каждой точки. Сигналы от всех точек, соответствующих одному и тому же образцу, суммируют и вычисляют среднее арифметическое и среднеквадратическую ошибку каждого образца.

Осуществление изобретения

В пилотном исследовании принимали участие 38 женщин с идиопатическим бесплодием, которые обратились к эмбриологам за проведением процедуры ЭКО [8]. Из них 15 случаев оказались неудачными после нескольких протоколов (попыток), 10 были удачными с первого протокола и в 12 случаях первые протоколы были неудачными, но один из следующих (второй или последующий) протокол завершился беременностью (Фигура 1).

В геномах вышеуказанных 38 паценток исследовали количества рДНК (областей ДНК, содержащих гены рРНК). Значения копийности рДНК в геномах трех подгрупп пациенток, которые подверглись ЭКО, показаны на Фигуре 2. Распределения сравнили по методу Колмогорова-Смирнова. Данные описательной статистики приведены в Таблице 1.

Содержание рДНК в геномах подгруппы женщин, у которых не было удачных попыток ЭКО, было значимо ниже, чем в геномах двух других подгрупп. В 6 из 16 (40%) образцах ДНК из подгруппы 1 число повторов рДНК было меньше, чем в любом из образцов ДНК из подгрупп 2 и 3.

Таким образом, полученные результаты дают основания считать доказанным, что число копий рДНК в геноме входит в число факторов, определяющих успех ЭКО. Если копийность рДНК в геноме женщины менее 330, процедура ЭКО у данной женщины с большой вероятностью завершается неудачей.

Пример 1.

У пациентки А. в процессе обследования была взята венозная кровь за неделю перед проведением пункции фолликулов. Обнаружено, что число копий рДНК в геноме пациентки составляет 225. Проведено перенесение оплодотворенного эмбриона в полость матки. Через 25 дней после пересадки живого эмбриона с помощью УЗИ обнаружено отсутствие сердечной деятельности зародыша. Определен диагноз: замершая беременность, проведена операция удаления плодного яйца. Через 13 месяцев после неудачной попытки ЭКО проведено повторное обследование, которое показало, что число копий рДНК в геноме пациентки составляет 240. Небольшая разница между результатами первого и второго измерения лежит в пределах обычной погрешности измерений метода (+/-3%). После переноса живого эмбриона в матку на 36 день выявлена повторная замершая беременность и проведена операция удаления плодного яйца.

Пример 2.

У пациентки Л. в процессе обследования также была взята венозная кровь за неделю перед проведением пункции фолликулов. Обнаружено, что число копий рДНК в геноме пациентки составляет 468. Проведено перенесение оплодотворенного эмбриона в полость матки. Беременность развивалась без осложнений. В 39 недель беременности произошли своевременные роды плодом мужского пола, массой 3350 гр., длиной 51 см, с оценкой по шкале Апгар 9 баллов. Неонатальный период протекал также без осложнений.

Использование данного способа генетического прогнозирования эффективности экстракорпорального оплодотворения при идиопатическом бесплодии по количеству копий рибосомных генов (генов, кодирующих рибосомную РНК) в геноме женщины, перед началом первого протокола быстро и с большой степенью надежности укажет на риск неблагоприятного исхода.

Краткое описание чертежей

Фигура 1. Распределение случаев удачного и неудачного ЭКО в группе 38 женщин.

Фигура 2. Содержание рДНК в геномах женщин, проходящих процедуру ЭКО.

Список литературы

1. Larson D.E., Zahradka P., Sells B.H. Control points in eukaryotic ribosome biogenesis. Biochem Cell Biol. 1991. V. 69. №1. P. 5-22

2. Moss T.A., Langlois F., Gagnon-Kugler Т., Stefanovsky V. A housekeeper with power of attorney: the rRNA genes in ribosome biogenesis. // Cell Mol Life Sci 2007. 64 (1): 29-49.

3. Cavanaugh A., Hirschler-Laszkiewicz I., Rothblum L.I. Ribosomal DNA Transcription in Mammals // Olson М.О.J. (Ed.), The Nucleolus, Kluwer Academic / Plenum Publishers 2004. 89-129.

4. Moss Т., Stefanovsky V.Y. At the center of eukaryotic life // Cell 2002. 109 (5): 545-548.

5. Miyazaki Т., Kobayashi T. Visualization of the dynamic behavior of ribosomal RNA gene repeats in living yeast cells // Genes Cells 2011. 16 (5): 491-502. doi: 10.1111/j.1365-2443.2011.01506.x.

6. Porokhovnik L.N., Lyapunova N.A. Dosage effects of human ribosomal genes (rDNA) in health and disease // Chromosome Research. 2019; 27 (1-2): 5-17

7. Пороховник Л.Н., Еголина Н.А., Косякова Н.В., Цветкова Т.Г, Ляпунова Н.А. Зиготический и эмбриональный отбор по геномной дозе активных рибосомных генов как один из возможных факторов сниженной плодовитости супружеских пар // Медицинская генетика. 2012. Т. 11. №6. С. 31-34

8. Пороховник Л.Н., Вейко Н.Н., Ершова Е.С., Полеткина А.А., Шмарина Г.В., Долгих О.А., Клименко П.А., Клименко М.П., Аветисова К.Г., Костюк Э.В., Курцер М.А., Писарев В.М., Ижевская В.Л., Куцев С.И., Костюк С.В. Копийность рибосомной ДНК (рДНК) в геномах женщин как фактор успешности ЭКО и наличия осложнений беременности. Медицинская генетика. 2019;18(11):14-25. https://doi.org/10.25557/2073-7998.2019.11.14-25

Изобретение относится к области медицинской генетики, молекулярной биологии, акушерства и гинекологии. Предложен способ выявления женщин с генетически детерминированной низкой вероятностью удачных попыток экстракорпорального оплодотворения при идиопатическом бесплодии. Определяют копийность рибосомных генов в геноме женщины методом нерадиоактивной количественной дот-гибридизации ДНК, выделенной из клеток крови. При определении менее чем 330 копий рибосомных генов на диплоидный геном прогнозируют неудачную серию из нескольких протоколов процедуры экстракорпорального оплодотворения у данной пациентки с большой вероятностью. Изобретение обеспечивает быстрое и надежное прогнозирование риска неблагоприятного исхода беременности. 2 ил., 1 табл., 2 пр.

Способ выявления женщин с генетически детерминированной низкой вероятностью удачных попыток экстракорпорального оплодотворения при идиопатическом бесплодии, отличающийся тем, что определяют копийность рибосомных генов (генов, кодирующих рибосомную РНК) в геноме женщины методом нерадиоактивной количественной дот-гибридизации ДНК, выделенной из клеток крови, и при определении менее чем 330 копий на диплоидный геном, прогнозируют неудачную серию из нескольких протоколов процедуры экстракорпорального оплодотворения у данной пациентки с большой вероятностью.