СПОСОБ ПОЭТАПНОГО УДЕРЖИВАНИЯ И ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ МОДУЛЬ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАКРОМОЛЕКУЛ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2022 года по МПК C12M1/12 C12M1/36 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к производству биологических продуктов, более конкретно, к промышленному производству биомакромолекул, в частности, к подготовительной стадии технологического процесса получения полипептидов, гибридных белков и иммуноглобулинов.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Биомакромолекулы, особенно рекомбинантные белки и молекулы иммуноглобулинов, привлекают большое внимание в современной биофармацевтической области. Как правило, биомакромолекулы получают посредством следующих стадий: подготовительная стадия, включающая культивирование клетки; заключительная стадия, включающая сбор, очистку, выделение и концентрирование молекул антител из культуральной жидкости; а также добавление молекул антител в раствор препарата, подходящий для людей.

Экспрессионная система, используемая в подготовительной стадии технологического процесса получения рекомбинантных белков, основана в основном на клетках млекопитающих. Как правило, при продуцировании, клетки активируют в одной пробирке рабочего банка клеток, а затем последовательно культивируют: в колбе Эрленмейера, 2-литровых, 10-литровых и 50-литровых резервуарах для культивирования и 500-литровом клеточном ферментере. Поскольку в средах, участвующих в процессе культивирования клеток, содержится до 70-80 видов компонентов, в процессе культивирования в клетке могут накапливаться различные примеси, такие как секретируемые протеазы, остатки мелких клеток, белки клетки-хозяина, молекулы ДНК и РНК, в результате чего процесс разделения и очистки будет затруднен. В то же время, в системе культивирования клеток имеются также неполные молекулы антител или молекулы антител с различным распределением заряда вследствие окислительно-восстановительного потенциала, так что требуется выполнить аффинную хроматографию на протеине А-сефароз для сбора нужных антител, после этапа удаления клеток посредством центрифугирования и глубинной фильтрации, на заключительной стадии технологического процесса, в результате чего выход продукта превышает 95%. Однако, в дополнение к большинству интактных молекул антител с фрагментом Fc, существуют также некоторые неполные молекулы антител и примеси, относящиеся к антителу, что усложняет этапы очистки и выделения, относящиеся к заключительной стадии процесса. С учетом вышеизложенного, чтобы обеспечить высокое качество продукта или его воспроизводимость, выход продукции будет, как правило, подвергаться определенной потере на заключительных стадиях очистки и выделения.

В действующем крупномасштабном промышленном производстве биомакромолекул подготовительную стадию, включающую культивирование клеток, часто осуществляют посредством перфузионного культивирования и культивирования с подпиткой, а также применяют различные методы удерживания клеток чтобы получать клетки высокой плотности при одновременном удалении примесей из среды для культивирования. Метод фильтрации с чередующимся тангенциальным потоком (ATF) – представляет собой передовую технологию удерживания, которая обеспечивает низкий поперечный сдвиг, большую площадь фильтрации и высокую проходимость клеток, упрощая фильтрацию клеток с высокой плотностью. Однако, на практике, из-за непрерывного роста клеток, во время крупномасштабного культивирования в дополнение к экспрессированному белку, будут накапливаться продукты метаболизма или связанные с ними примеси с различными свойствами, например, клетки в основном генерируют метаболиты в среде на ранней стадии культивирования, в то же время на ранней стадии быстрой пролиферации клеток будет продуцироваться небольшое количество продуктов антител в культуральной среде, которые восприимчивы к высокой температуре культивирования и претерпевают такие изменения, как дезаминирование или разложение с образованием связанных с продуктом веществ или примесей. Концентрация этих метаболитов и связанных с продуктом примесей увеличивается с увеличением концентрации клеток и необходимого белка, что напрямую влияет на выход и чистоту конечного белкового продукта и естественную форму белкового продукта, так что белки будут агрегироваться при накоплении в высокой концентрации, что приводит к увеличению стоимости и времени, а также к невосполнимым потерям.

Поскольку ограничения получения биомакромолекул в существующем подготовительном этапе затрудняют достижение высококачественного, быстрого и высокопроизводительного производства, необходимо найти решение для снижения воздействия продуктов метаболизма и связанных с ними продуктов примеси, образующихся на подготовительной стадии технологического процесса, включающей культивирования клеток.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью настоящего изобретения является создание способа получения биомакромолекулы путем поэтапного удерживания на подготовительной стадии, используемого производственного модуля, а также применение способа/модуля в промышленном производстве полипептидов, рекомбинантных белков и молекул иммуноглобулина. Представленный способ оптимизирует процесс крупномасштабного производства рекомбинантного белка предшествующего уровня техники, улучшая эффективность производства, выход и чистоту продукта.

Технические решения настоящего изобретения более подробно описаны ниже.

В первом аспекте настоящего изобретения представлен способ поэтапного удерживания на подготовительной стадии процесса получения биомакромолекулы, включающий:

(1) введение первой удерживающей системы в биореактор для выполнения первого этапа производства; при этом первая удерживающая система содержит первый фильтрующий модуль; где первый фильтрующий модуль содержит первый фильтрующий узел с размером пор 0,05-1 мкм; и

(2) замену первой удерживающей системы второй удерживающей системой для выполнения второго этапа получения биомакромолекулы; при этом вторая удерживающая система содержит второй фильтрующий модуль; где второй фильтрующий модуль содержит второй фильтрующий узел, имеющий отсечку по молекулярной массе 1/15-2/3 от молекулярной массы биомакромолекулы.

В одном варианте осуществления размер пор первого фильтрующего узла составляет 0,1-0,5 мкм, предпочтительно 0,2-0,3 мкм.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения отсечка по молекулярной массе второго фильтрующего узла составляет 2/15-7/15, предпочтительно 1/5-1/3 от молекулярной массы биомакромолекулы.

В одном варианте осуществления молекулярная масса биомакромолекулы составляет 50-300 кДа, предпочтительно 100-250 кДа, и более предпочтительно 150-200 кДа.

Первый этап производства соответствует начальной стадии пролиферации клеток и может называться стадией синтеза и оптимизации продукта. Из-за высокой температуры культивирования (37°C) в исходной среде, клетки быстро размножаются, и накапливается большое количество клеточных метаболических отходов, продуктов молочной кислоты и небольшого количества примесей, образующихся в результате дезаминирования или разложения антител. Второй этап производства - это этап синтеза и сбора продукта, и неожиданно было обнаружено, что после удаления продуктов метаболизма и примесей, образующихся на первом этапе производства, более эффективным является синтез и сбор высококачественных продуктов на втором этапе производства. Так, для улучшения качества и выхода последующих продуктов дополнительно вводят систему поэтапного удерживания.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения первая удерживающая система в основном используется для удержания клеток с целью удаления метаболитов и примесей; а вторая удерживающая система в основном используется для удержания клеток, обогащения белковых продуктов и удаления низкомолекулярных метаболитов.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения на подготовительной стадии получения биомакромолекул, первый этап производства может быть начат, как только клетки засеваются в биореактор.

В некоторых вариантах осуществления на подготовительном этапе получения биомакромолекул, первый этап производства начинается, когда плотность клеток достигает 6 ± 1,5 × 10⁶.

В некоторых вариантах осуществления на подготовительном этапе получения биомакромолекул, первый этап производства начинается, когда плотность клеток достигает 10 ± 5 × 10⁶.

В одном варианте осуществления плотность клеток на втором этапе производства составляет не менее 15 ± 5 × 10⁶ клеток/мл, предпочтительно не менее 35 ± 5 × 10⁶ клеток / мл.

В одном варианте осуществления плотность клеток на втором этапе производства составляет 10 × 10⁶-30 × 10⁶ клеток/мл.

В одном варианте осуществления плотность клеток на втором этапе производства составляет 30 × 10⁶-50 × 10⁶ клеток/мл.

В одном варианте осуществления плотность клеток на втором этапе производства составляет 10 × 10⁶-300 × 10⁶ клеток/мл. Для завершения второго этапа производства жидкость для ферментации клеток собирают до тех пор, пока жизнеспособность клеток не упадет до 50%, предпочтительно до 70%, более предпочтительно до 80%; и наиболее предпочтительно до 90%.

В одном варианте осуществления плотность клеток на втором этапе производства составляет 30 × 10⁶-100 × 10⁶ клеток / мл.

В одном варианте осуществления плотность культуры клеток на втором этапе производства остается относительно стабильной, а ее диапазон колебаний не превышает 10 × 10⁶ клеток/мл.

В одном варианте осуществления плотность культуры клеток на втором этапе производства проявляет тенденцию к повышению колебаний превышающим 10 × 10⁶ клеток/мл.

В одном варианте осуществления диапазон колебаний составляет 10 × 10⁶-290 × 10⁶ клеток/мл.

В одном варианте осуществления диапазон колебаний составляет 10 × 10⁶-90 × 10⁶ клеток/мл.

В одном варианте осуществления представлена первая и вторая удерживающие системы, каждая из которых независимо, представляют собой систему с чередующимся тангенциальным потоком, систему фильтрации с тангенциальным потоком, вращающуюся систему фильтрации, систему глубинной фильтрации, систему центрифуги или систему отстаивания.

В одном из вариантов осуществления понятие биореактор включает в себя, но не ограничивается, биореактор с воздушным подъемом, биореактор с механическим перемешиванием, биореактор с барботажной колонкой и мембранный биореактор.

В одном из вариантов осуществления понятие биореактор включает в себя, но не ограничивается, инкубатор со встряхиванием, микробиореактор, настольный биореактор, биореактор из нержавеющей стали, стеклянный биореактор, одноразовый биореактор, качающийся биореактор и несколько параллельных резервуаров.

В одном варианте осуществления понятие клетки включает, но не ограничивается, клетки млекопитающих, клетки растений, клетки насекомых и микробные клетки, которые подходят в качестве экспрессионной системы для промышленной ферментационной культуры. В одном варианте осуществления клетки представляют собой клетки млекопитающих, причем понятие клетки млекопитающих включает в себя, но не ограничиваются, клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки NSO (клетки мышиной миеломы), клетки Sp2/0 (клетки мышиной миеломы), клетки HEK (эмбриональная клетка почки человека) и клетки BHK (клетки почек детенышей хомяка).

В одном из вариантов осуществления, культивирование клеток осуществляют посредством перфузионного культивирования, концентрированного перфузионного культивирования, культивирования с подпиткой или концентрированного культивирования с подпиткой.

В одном варианте осуществления подготовительный этап получения биомакромолекулы включает:

(S1) активацию клеток, которые должны пролиферировать, поэтапную культивацию с увеличением клеточной массы, для культивирования клеток в биореакторе с предварительно заданными параметрами;

(S2) введение первой удерживающей системы, содержащей первый фильтрующий модуль, взаимодействующий с биореактором для выполнения первого этапа производства;

(S3) замена первой системы удерживания на вторую систему удерживания, содержащую второй фильтрующий модуль, для выполнения второго этапа производства, когда плотность клеток достигнет 15 ± 5 × 10⁶ клеток / мл; и

(S4) контроль жизнеспособности клеток в реальном времени; и сбор клеточного ферментационного бульона для заключительной стадии производственного процесса, когда жизнеспособность клеток падает до, не менее чем 50%, предпочтительно 70% и более предпочтительно 80% и наиболее предпочтительно 90%.

В одном варианте осуществления, когда плотность клеток достигает 35±5×10⁶ клеток/мл, первая система удерживания заменяется второй системой удерживания для выполнения второго этапа производства.

В одном варианте осуществления, когда плотность клеток достигает 55±5×10⁶ клеток/мл, первая система удерживания заменяется второй системой удерживания для выполнения второго этапа производства.

Поскольку заключительная стадия выделения и очистки разработана на основе характеристик конкретного биомолекулярного продукта, получение биоподобных препаратов герцептина используется в качестве примера, для иллюстрации преимуществ поэтапного удерживания, представленного в настоящем изобретении, относящихся к выходу и качеству готового продукта.

В одном варианте осуществления производство биоподобных препаратов авастина используется в качестве другого примера для иллюстрации преимуществ получения продукции методом поэтапного удержания, относящихся к выходу и качеству продукта.

Во втором аспекте настоящего изобретения представлен производственный модуль, используемый на подготовительной стадии получения биомакромолекул методом поэтапного удерживания, причем производственный модуль может быть интегрирован в системы удерживания и использоваться совместно с биореактором; производственный модуль содержит не менее двух фильтрующих модулей; первый фильтрующий модуль содержит первый фильтрующий узел с размером пор 0,05-1 мкм, который используется для удаления продуктов метаболизма, и связанных с ними примесей, из жидкости для культивирования клеток; второй фильтрующий модуль включает второй фильтрующий узел, имеющий отсечку по молекулярной массе 1/15-2/3 от молекулярной массы биомакромолекулы, который используется для сбора и обогащения продуктов биомакромолекул.

В одном варианте осуществления размер пор первого фильтрующего узла составляет 0,1-0,5 мкм, предпочтительно 0,2-0,3 мкм; и отсечка по молекулярной массе второго фильтрующего узла составляет 2/15-7/15, предпочтительно 1/5-1/3, от молекулярной массы биомакромолекулы.

В одном варианте осуществления модуль фильтрации примесей имеет размер, соответствующий диаметру молекулы 20-50 кДа, предпочтительно 50 кДа.

В одном варианте осуществления каждый фильтрующий узел представляет собой независимый друг от друга фильтрующий узел с полым волокном, трубчатый, рулонный или плоский.

В одном варианте осуществления фильтрующие узлы, изготовлены из сложного эфира целлюлозы или сложного эфира не содержащего целлюлозу, где сложный эфир целлюлозы содержит, но не ограничивается, ацетат целлюлозы, нитроцеллюлозу и этилцеллюлозу; сложный эфир без содержания целлюлозы содержит, но не ограничивается, полисульфон (PS), полипропилен (PP), полиэтилен (PE), поливинилхлорид (PVC), полиэфирсульфон (PES) и поливинилиденфторид (PVDF).

В одном из вариантов осуществления понятие биореактор включает в себя, но не ограничивается, биореактор с воздушным подъемом, биореактор с механическим перемешиванием, биореактор с барботажной колонкой и мембранный биореактор.

В одном из вариантов осуществления понятие биореактор включает в себя, но не ограничивается, инкубатор со встряхиванием, микробиореактор, настольный биореактор, биореактор из нержавеющей стали, стеклянный биореактор, одноразовый биореактор, качающийся биореактор и несколько параллельных резервуаров.

В одном варианте осуществления удерживающие системы включают, но не ограничиваются, системы с чередующимся тангенциальным потоком, системы фильтрации с тангенциальным потоком, вращающиеся системы фильтрации, системы глубокой фильтрации, системы центрифугирования и системы отстаивания.

В одном варианте осуществления понятие клеток включает, но не ограничивается, клетки млекопитающих, клетки растений, клетки насекомых и микробные клетки, которые подходят в качестве экспрессионной системы для промышленной ферментационной культуры. В одном варианте осуществления клетки представляют собой клетки млекопитающих, причем понятие клетки млекопитающих включает в себя, но не ограничиваются, клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки NSO (клетки мышиной миеломы), клетки Sp2/0 (клетки мышиной миеломы), клетки HEK (эмбриональная клетка почки человека) и клетки BHK (клетки почек детенышей хомяка).

В третьем аспекте настоящего изобретения описывается применение вышеуказанного производственного модуля/способа для промышленного производства биомакромолекулы.

В одном варианте осуществления биомакромолекула представляет собой полипептид или рекомбинантный белок.

В одном из вариантов осуществления понятие рекомбинантный белок представляет собой иммуноглобулин или генно-инженерное антитело и включает, но не ограничивается, химерные антитела человек-мышь, гуманизированные антитела, полностью человеческие антитела, фрагменты Fab, F(ab')2, Fv, ScFv, однодоменные антитела и би/мультиспецифические антитела.

В одном варианте осуществления рекомбинантный белок представляет собой новый белок, образованный путем слияния биологически активного функционального белка и фрагмента Fc.

Модуль и способ применимы для микробной культуры, среды, скрининга клонов или экспрессирующих векторов, мелкомасштабного производства белкового продукта, усовершенствования процесса, оптимизации и определения характеристик, разрастания посевной культуры и производства.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг. 1 схематично показан первый этап подготовительной стадии производственного процесса получения клеток.

На фиг. 2 схематически показан второй этап подготовительной стадии производственного процесса.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Учитывая проблемы низкой эффективности, низкого выхода и низкой чистоты в существующем процессе получения биомакромолекул предшествующего уровня техники, автор настоящего изобретения, в результате масштабных исследований обнаружил, что применение процесса поэтапного удерживания на подготовительной стадии производства, значительно оптимизирует заключительную стадию производства экспрессированного белка, улучшая выход высококачественного белка.

Для облегчения понимания настоящего изобретения, основные термины определены следующим образом.

SEC-HPLC

Эксклюзионно-высокоэффективная жидкостная хроматография ‒ один из наиболее часто используемых методов определения чистоты продукта, в котором чистота рассчитывается в соответствии с методом нормализации площадей. Компоненты в образце разделяют на мономеры, полимеры (группа с высокой молекулярной массой) и фрагменты (группа с низкой молекулярной массой), и чем больше процентное содержание мономера, тем выше чистота образца.

CEX-HPLC

Метод катионообменной высокоэффективной жидкостной хроматографии ‒ один из наиболее часто используемых методов для определения чистоты заряда продуктов, который может использоваться для отражения однородности продуктов. В соответствии со свойством заряда компоненты в образце разделяются на группу кислотных пиков, группу главных пиков и группу щелочных пиков, где, чем выше соотношение кислотных пиков и щелочных пиков, тем выше степень неоднородности заряда продуктов, что указывает на плохую однородность продукта.

rCE-SDS

Восстановленный капиллярный SDS гель-электрофорез использует высоковольтное электрическое поле для создания движущей силы, при которой после уменьшения, компоненты, в соответствии с молекулярной массой, движутся в капиллярной трубке с разными скоростями, чтобы отделиться друг от друга в соответствии с молекулярной массой. Чем выше соотношение тяжелой цепи и легкой цепи, тем выше чистоту образца.

nrCE-SDS

Невосстановленный капиллярный SDS гель-электрофорез также использует высоковольтное электрическое поле для создания движущей силы, при которой компоненты, в зависимости от молекулярной массы, движутся в капиллярной трубке с разными скоростями, отделяясь друг от друга. Соотношение мономера положительно коррелирует с чистотой продукта.

Жизнеспособность клеток/выживаемость клеток - отношение живых клеток к общему количеству клеток в единице объема.

Поскольку во время ферментации антитело чувствительно к воздействию температуры культивирования, времени культивирования, скорости перемешивания и pH, будут происходить различные посттрансляционные модификации и изменения, такие как дезаминирование, окисление, гликирование и циклизация N-концевого пироглутамата, которые будут влиять на распределение заряда на поверхности антитела.

Является ли посттрансляционная модификация ключевым показателем качества или нет, зависит от того, происходит ли она в критическом положении (например, происходит в области CDR чтобы воздействовать на функцию и на связывающем участке FcRn чтобы воздействовать на PK). В то же время распределение заряда/чистоту заряда является нестабильным показателем качества и может использоваться в качестве предпочтительного показателя для оценки однородности. При этом контроль гетерогенности зарядов является сложной задачей, с которой сталкиваются при производстве лекарственных препаратов на основе антител. По сравнению с предшествующим уровнем техники настоящее изобретение имеет ряд преимуществ в поддержании более высокой чистоты заряда продукта для снижения возникновения посттрансляционных модификаций и деградации, которые могут влиять на заряд и одновременно дополнительно обеспечить сходство распределения заряда среди различных партий в крупномасштабном производстве. Кроме того, вещества, образующиеся во время фазы пролиферации клеток, такие как ионы аммония, протеазы, другие белки-хозяева и ДНК, могут влиять на рост клеток и качество продукта (например, на деградацию продуктов некоторых ферментов, вызванную определенными факторами), при этом, присутствие этих примесей в собранной жидкости сильно влияет на выход после очистки, а также на выход и качество продукта из-за невозможности полного удаления.

Также, система и способ представленные в настоящем изобретении могут дополнительно решить проблемы неудовлетворительного качества продукта и однородности в существующей системе культивирования с подпиткой. При крупномасштабном производстве антител, так как культивирование с подпиткой не обеспечивает стабильного распределения примесей, его часто переводят на перфузионное культивирование, что приводит к сложности осуществления процесса. Настоящее изобретение может решить проблемы нестабильности и высокого содержания примесей, связанных с продуктом, в процессе с подпиткой, в результате чего, возможно производить высококачественные продукты без необходимости переключения процессов, способствуя развитию отрасли крупномасштабного производства антител.

Следовательно, по сравнению с предшествующим уровнем техники, в настоящем изобретении используется первый фильтрующий узел, для удаления примесей и метаболитов клеток, и второй фильтрующий узел, подходящий для последовательного сбора и обогащения желаемого продукта в процессе культивирования клеток, способствуя масштабному и высокопроизводительному получению продуктов антител за относительно короткий период времени в условиях относительно фиксированного прохождения клеток, плотности и жизнеспособности на стадии удержания продукта. Ниже перечислены основные положительные эффекты настоящего изобретения.

(1) Настоящее изобретение улучшает однородность продукта, решая задачу неоднородности заряда при продуцировании антител.

(2) Настоящее изобретение позволяет эффективно удалять метаболиты, продуцируемые на стадии пролиферации клеток, в частности протеасомы с высоким молекулярным весом, уменьшая влияние этих метаболитов на продукт на стадии удержания и улучшая чистоту и качество продукта.

(3) Настоящее изобретение позволяет удалять небольшое количество продуктов антител, появление которых вызвано относительно высокой температурой инкубации на ранней стадии пролиферации клеток. Эти начальные продукты предрасположены к разложению в условиях относительно высоких температур и попадут в конечный продукт в виде примесей, связанных с продуктом. Следовательно, настоящее изобретение эффективно для дальнейшего уменьшения примесей, связанных с продуктом, и обеспечивает высокую производительность и высокую чистоту конечного продукта.

(4) Согласно настоящему изобретению, производственный цикл сокращается, а заключительная стадия выделения и очистки продукта упрощается, в результате чего снижается стоимость производства.

Настоящее изобретение поясняется далее со ссылкой на варианты осуществления. Следует понимать, что представленные варианты осуществления являются просто иллюстративными для настоящего изобретения и не ограничивают объем раскрытия. Если не указано иное, эксперименты в следующих примерах, как правило, проводят в соответствии с обычными условиями или основными методами испытаний, описанными в третьем издании «Молекулярного клонирования: лабораторное руководство» или в условиях, рекомендованных производителем.

Пример 1. культивирование в биореакторе объемом 200 л методом поэтапного удерживание

Антитело

Антитело, полученное в данном примере, было биоаналогом, разработанным на основе доступного для приобретения терапевтического антитела Герцептин. Экспрессирующая клеточная линия представляла собой клетки яичников китайского хомячка (СНО), а моноклональные антитела представляли собой IgG1 / каппа, имеющую ту же аминокислотную последовательность, что и исходное лекарственное средство Герцептин (Герцептин®) (МНН: трастузумаб, номер IMGT: 7637); и его молекулярная масса составляла 145 кДа.

Технологические процессы первого этапа подготовительной стадии схематично показаны на Фиг. 1, а процессы второго этапа схематично показаны на Фиг.2.

Размораживания клеток

Для быстрого размораживания клеток пробирку для криоконсервации клеток непосредственно вынимали и погружали в водяную баню при 37°C часто встряхивая. Пробирку для криоконсервации переносили из водяной бани 37°C, стерилизовали 75% спиртом и открывали в стерильном боксе. Суспензию клеток перенесли в центрифужную пробирку с помощью стерильной пипетки объемом 15 мл, содержащую 1 мл предварительно инкубированной среды CD FortiCHO ™, и равномерно встряхивали. Спустя 30-60 с в центрифужную пробирку добавили 2 мл предварительно инкубированной основной среды и равномерно встряхивали. Через 30-60 с в центрифужную пробирку добавили 4 мл предварительно инкубированной основной среды и равномерно встряхивали. Спустя 30-60 с центрифужную пробирку центрифугировали при 700 об/мин в течение 5 минут и удалили супернатант. Клетки суспендировали в 2 мл предварительно инкубированной основной среды, перенесли в колбу для культивирования клеток, содержащую 8 мл основной среды, и равномерно встряхивали.

Культивирование с экспансией

Клетки были подсчитаны и подвержены культивированию с экспансией один раз в 2 дня, где в качестве среды использовалась среда CD OptiCHO ™ (Thermo Fisher Scientific), затем начальная плотность клеток возвращалась к 6-10×10⁵ клеток/мл. Культивирование продолжали до тех пор, пока увеличивающийся объем не соответствовал требованиям для инокуляции реактора объемом 10 л, т.е. плотность клеток составляла 2,5-4,5×10⁶ клеток/мл, а выживаемость составляла ≥90%. Конкретные контрольные параметры представлены в Таблице 1.

Таблица 1. Условия для культивирования с размножением

Скорость встряхивания Температура Концентрация углекислого газа 120 об/мин 5%

После инокулирования в биореактор WAVE объемом 10 л образцы клеток отбирали каждый день, специальные контрольные параметры представлены в Таблице 2.

Таблица 2. Условия для культивирования

Температура pH Жидкий кислород Скорость вращения Угол поворота Воздухообмен (вентилирование) 7 50% 25 об/мин 8° 0,2 л/мин

После культивирования в течение 3 дней клетки были дополнительно перенесены для культивирования в 50-литровый биореактор, конкретные контрольные параметры представлены в таблице 3.

Таблица 3. Условия для культивирования в биореакторе объемом 50 л

Температура pH Жидкий кислород Скорость вращения Время культивирования 7 50% 25 об/мин 3 дня

Перфузионное культивирование в биореакторе объемом 200 л с применением системы с чередующимся тангенциальным потоком (ATF)

В данном примере была использована система с чередующимся тангенциальным потоком объемом 200 л от Refine Techology, LLC. В устройстве ATF была собрана колонна из полых волокон и диафрагмы в верхней части основания, затем устройство ATF было подключено к вакуумному насосу и контроллеру. Вакуумные волоконно-оптические мембраны с размером пор 0,2 мкм для удержания веществ 50 кДа установлены в двух системах ATF (в дальнейшем сокращенно обозначаемых как система ATF 0,2 мкм и система ATF 50 кДа), были промыты 25% этанолом в течение 10 мин, далее для удаления остаточного этанола несколько раз промывали деионизированной водой и затем для дальнейшего использования были простерилизованы паром в высокотемпературном стерилизаторе в течение 45 мин.

Система ATF 0,2 мкм была подключена к биореактору объемом 200 л. После того, как клетки культивировали в 50-литровом биореакторе в течение 3 дней, клетки инокулировали в 200-литровый биореактор с начальной плотностью клеток 1×10⁶ клеток/мл, конкретные контрольные параметры представлены в таблице 4.

Таблица 4. Условия для культивирования в биореакторе объемом 200 л

Температура культивирования pH Жидкий кислород Скорость вращения 7 50% 90 об/мин

Когда плотность клеток достигла 10×10⁶ клеток/мл, была подключена система ATF, и включен контроллер и вакуумный насос.

Объем среды, которую необходимо заменять каждый день, рассчитывали в соответствии с объемом роста клеток и скоростью роста клеток, регулируя скорость, с которой подавалась свежая культуральная среда, и скорость, с которой отходы культуральной среды выгружались. Когда плотность клеток выросла до 40-50×10⁶ клеток/мл, система ATF 0,2 мкм была заменена системой ATF 50 кДа, а контроллер и вакуумный насос в устройстве ATF продолжали работать для выполнения второго этапа производства. В одном из вариантов осуществления, прежде чем плотность клеток достигнет 40-50 × 10⁶ клеток/мл, контролировались параметры в биореакторе, поддерживали - температуру культивирования 34°C, pH 6,9, содержание растворенного кислорода 50% и скорость вращения 125 об/мин. (результаты, полученные в данных условиях, представлены в таблице 6). В одном из вариантов осуществления температуру и другие условия культивирования в биореакторе можно регулировать одновременно с заменой системы ATF 0,2 мкм на систему ATF 50 кД. Когда плотность клеток достигла приблизительно 100 × 10⁶ клеток/мл, собирали супернатант.

Очищение клеток

Очищение жидкости для культивирования клеток обычно выполняли центрифугированием или микрофильтрацией в сочетании с глубинной фильтрацией для завершения удаления клеток и клеточного дебриса из культуральной жидкости.

В данном примере суспензию клеток из биореактора объемом 200 л центрифугировали при 6000×g и 4°C в течение 15 минут, затем клетки удаляли и собирали супернатант ферментации. После этого супернатант ферментации обрабатывали методом глубинной фильтрации, который в настоящее время обычно используется для очищения жидкости для культивирования. В методе глубинной фильтрации использовалась рыхлая и пористая каркасная структура из целлюлозы заполненная диатомитовой землей, где поверхность входной части структуры была снабжена воронкообразными порами. Вышеупомянутая структура устраняет недостатки традиционной микрофильтрации, заключающиеся в том, что поверхностная структура была склонна к засорению, а эффективность фильтрации была низкой, и способствовала удержанию клеточного мусора небольшого объема по сравнению с центрифугированием. Кроме того, посредством адсорбции с использованием диатомовой земли могут улавливаться ДНК и белки клетки-хозяина (HCP). В данном примере использовался глубинный фильтр MX0HC10FS1 от Millipore, и после того, как контейнер, в котором хранился супернатант ферментации, был подключен к перистальтическому насосу (могут применяться любые имеющиеся в продаже перистальтические насосы, отвечающие требованиям по скорости потока), мембрану глубинного фильтра промыли 10 CV (объемами колонки) сверхчистой воды. Затем 1 CV буфера для глубинной фильтрации, содержащего 25 мМ Трис-HCl и 100 мМ NaCl (pH 7,4±0,2), использовали для промывки мембраны глубинного фильтра со скоростью потока 100-300 л/м²/ч. Супернатант ферментации фильтровали со скоростью потока 100-300 л/м²/ч и собирали фильтрат. После того, как образец был полностью загружен, мембрану фильтра промывали 2 CV буфера для глубинной фильтрации и собирали фильтрат. Давление перед мембраной во время процесса поддерживали на уровне 2 бар или меньше.

Аффинная хроматография на протеине А

Аффинная хроматография на протеине А влияет на улавливание белков клетки-хозяина, эндотоксинов и ДНК при очистке антител. В данном примере в качестве наполнителя для аффинной хроматографии на протеине А был использован Mabselect Sure (производитель: GE). Фильтрат, полученный в результате глубинной фильтрации, загружали со скоростью потока 300 см/ч, при этом отношение загружаемого количества (мг) к наполнителю (мл) составляло менее 35 мг/мл.

После того, как образец полностью загружен, хроматографическую колонку промывали 5 CV (объемами колонки) элюента, содержащего 25 мМ Трис-HCl и 50 мМ NaCl (pH 7,4), со скоростью потока 300 см/ч. Затем хроматографическую колонку промывали элюентом, содержащим 100 мМ ацетат натрия уксусной кислоты (pH 3,6±0,2, проводимость 0,9±0,2 мСм/см) со скоростью потока 300 см/ч. Во время промывания элюат отслеживали в реальном времени на длине волны 280 нм, и когда поглощение возрастало до 0,1 AU (е.о.п), начинали собирать элюат, при снижении до 0,5 AU (е.о.п), сбор прекращался. Было проведено три цикла аффинной хроматографии на протеине А.

Вирусная инактивация и глубинная фильтрация инактивированных вирусов

В данном примере инактивацию ретровирусов и вирусов в оболочке проводили путем инкубации с элюатом с низким pH, полученным методом аффинной хроматографии. PH элюата доводили до 3,6-3,8 с помощью 10% уксусной кислоты, и в течение 60-120 мин была проведена инактивацию вирусов.

Образец инактивированного вируса фильтровали методом глубинной фильтрации MX0HC10FS1 от Millipore. Так, мембрану глубинного фильтра промывали последовательно 10 CV ультрачистой воды и 1 CV 50 мМ натрий ацетатного буфера уксусной кислоты (pH 5,2), затем подсоединяли трубки для фильтрации пробы со скоростью потока 100-300 л/м²/час и фильтрационным давлением менее 2 бар. После того, как образец был загружен, мембрану глубинного фильтра промывали последовательно 1 CV и 2 CV 50 мМ натрий ацетатного буфера уксусной кислоты (pH 5,2) и собирали фильтрат.

Катионообменная хроматография

Для дальнейшего удаления примесей, ДНК и эндотоксинов из продукта было проведено три цикла катионообменной хроматографии с применением глубинной фильтрации инактивированных вирусов. В качестве наполнителя катионообменной хроматографии был выбран Fractogel EMD COO-(M) (производитель: Merck). Хроматографическую колонку уравновешивали 3 CV уравновешивающего буфера (50 мМ ацетат натрия уксусной кислоты, pH 5,2). Загрузка образца осуществлялась со скоростью потока 120 см/ч, при этом соотношение загружаемого количества (мг) к наполнителю (мл) составило менее 45 мг/мл. После того, как образец был полностью загружен, хроматографическую колонку промывали 5 CV уравновешивающего буфера со скоростью потока 180 см/ч. Затем проводили градиентное элюирование с использованием 10 CV элюента, где элюент состоял из уравновешивающего буфера (постепенно снижающегося от 100% до 0) и буфера (постепенно увеличивающегося от 0 до 100%), содержащего 50 мМ ацетат натрия уксусной кислоты и 300 мМ хлорида натрия (pH 5,2); где скорость потока составила 180 см/ч. Элюат собирали в процессе промывания.

Анионообменная хроматография

Следы примесей в образце, таких как различные вирусы, ДНК и эндотоксин, могут быть эффективно удалены с помощью анионообменной хроматографии. В анионообменной хроматографии обычно используется проточный режим, в котором примеси будут связываться с наполнителем, в то время как целевой белок (например, моноклональные антитела) напрямую вытекает через хроматографическую колонку без связывания с наполнителем из-за его высокой изоэлектрической точки. В данном примере в анионообменной хроматографии был использован Capto Q (производитель: GE). Хроматографическую колонку уравновешивали 2 CV предварительно уравновешенного раствора (50 мМ Трис-HCl + 1 М NaCl, pH 8,0), а затем уравновешивали 3 CV равновесного раствора (50 мМ Трис-HCl, pH 8,0). Образец загружали со скоростью потока 180 см/ч, при этом отношение загружаемого количества (мг) к наполнителю (мл) поддерживалось ниже 40 мг/мл. Элюат собирали, когда показание UV280 увеличивается до 0,1 AU. После завершения загрузки образца, хроматографическую колонку промывали 3 CV равновесного раствора со скоростью потока 180 см/ч, и когда показание UV280 уменьшалось до 0,1 AU, сбор прекращался.

Вирусная фильтрация

Вирусная фильтрация может использоваться для удаления вирусов без оболочки. В технологическом процессе для фильтрации использовалась вирусная фильтрующая мембрана в количестве 1,02 м² на партию. Для фильтрации был использован резервуар высокого давления, резервуар обрабатыли 0,5 м NaOH, промывали водой путем инъекции и затем подсоединяли сжатый воздух. В данном примере для глубинной фильтрации применялся VPMG201NB1 (производитель: Merck Millipore). Перед использованием мембрану глубинного фильтра промывали последовательно 10 CV сверхчистой воды и 2 CV 500 мМ натрий ацетатного буфера уксусной кислоты (pH 5,2). Затем для фильтрации образца подсоединяли трубки, где скорость потока составляла 100-300 л/м²/ч, а фильтрационное давление составляло 1,9-2,0 бар. После того, как образец был загружен, мембрану глубинного фильтра промывали последовательно 1 CV и 2 CV 50 мМ натрий ацетатного буфера уксусной кислоты (pH 5,2), и затем собирали фильтрат.

Регидратация методом ультрафильтрации

Ультрафильтрационную мембрану с размером пор 30 кД и номером модели P2C030C25 (производитель: Merck Millipore) очищали и промывали 20 мМ натрий-фосфатным буфером (pH 6,0) до тех пор, пока pH после мембраны не достигнет 6,0. Образец закачивали в ультрафильтрационную мембрану с помощью перистальтического насоса, где скорость потока на входе поддерживалась на уровне 200 л/м²/ч, а трансмембранное давление ‒ на уровне 0,35 бар. 20 мМ натрий-фосфатный буфер (pH 6,0) использовали для восстановления объёма потерянной жидкости для сбора продукта антитела.

Сравнительный пример 1. Культивирование клеток в биореакторе объемом 200 л на основе метода однократного удерживания

Представленный процесс отличается от Примера 1 тем, что, когда плотность клеток выросла до 10×10⁶ клеток/мл, была подключена система ATF, контроллер и вакуумный насос в устройстве ATF были включены. Используемая в данном примере система ATF содержит модуль вакуумной мембраны с удерживаемой молекулярной массой 50 кДа. Ферментация продолжалась до тех пор, пока плотность клеток не увеличивалась примерно до 100×10⁶ клеток/мл. Последующая очистка такая же, как в Примере 1.

После завершения аффинной хроматографии на протеине А образцы, полученные в примере 1 и сравнительном примере 1, загружали для анализа CEX-HPLC чтобы определить содержания вариантов, отличающихся зарядами, распределение кислотных и щелочных пиков представлено в таблице 5.

Таблица 5. Распределение пиков по анализу CEX-HPLC

CEX-HPLC Проба Кислотный пик Нейтральный пик Щелочной пик Метод поэтапного удерживания
(Пример 1) 24.9 67.8 7.3 Метод однократного удерживания
(Сравнительный пример 1) 30.7 61.8 7.5

Из таблицы 5 можно увидеть, что по сравнению с продуктами антител, полученными методом однократного удерживания, продукты антител, полученные методом поэтапного удерживания, имеют лучшую чистоту заряда, более высокий уровень нейтрального пика и более низкий уровень кислотного пика.

Воздействие двух подготовительных стадий производственного процесса на конечные продукты сравнивали после завершения очистки. Также можно обнаружить, что соотношение кислотных пиков конечного продукта, полученного методом однократного удерживания, было улучшено до определенной степени, но не существенно, что отразилось на биологической активности. Продукты, полученные методом поэтапного удерживания, показали значительно лучшую биологическую активность, чем продукты, полученные методом однократного удерживания. В то же время метод поэтапного удержания может привести к более высокому выходу качественных конечных продуктов по сравнению с методом однократного удерживания. Результаты представлены в таблице 6.

Таблица 6. Характеристики продуктов, полученных методом

однократного удерживания и методом поэтапного удерживания

Подготовительная стадия технологического процесса Метод однократного удерживания
(Сравнительный пример 1) Метод поэтапного удерживания
(Пример 1) Этап культивирования клетки 12 г/л 12 г/л Выход конечного продукта 6 г/л 9,2 г/л Признак/цвет Светло-желтая жидкость (Y5) Светло-желтая жидкость (Y5) pH 6.0 5.9 Осмотическое давление 63 63 SEC-HPLC Полимер 0.8 0.6 Пик определяемого компонента 99.2 99.4 Фрагмент 0 0 Восстановленный чистый CE-SDS (легкая цепь + тяжелая цепь) 99.3 99.1 Невосстановленный чистый CE-SDS (мономер) 97.1 97.3 CEX-HPLC Кислотный пик 29.3 22.7 Нейтральный пик 63.2 67.8 Щелочной пик 7.5 9.5 Биологическая активность 94% 103%

Пример 2. Культивирование клеток в биореакторе объемом 2л на основе метода поэтапного удерживания

Антитела

Антитело, полученное в настоящем изобретении, представляет собой рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело против фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), которое получают путем ферментативной экспрессии в клетках млекопитающих in vitro. Использовались клетки яичников китайского хомячка (СНО), а моноклональные антитела представляли собой IgG1/каппа с аминокислотной последовательностью, такой же, как у исходного препарата Авастин® (МНН: бевацизумаб, номер IMGT: 8017, http: //www.imgt .org / mAb-DB /) и молекулярной массой 149 кДа.

Размораживание клеток и перфузионное культивирование в биореакторе объемом 2 л с системой ATF

Процедура размораживания клеток такая же, как в Примере 1.

Посевные клетки культивировали по стандартной технологии культивирования клеток, более конкретно, когда были выполнены требования для инокуляции, то есть плотность клеток достигала 4,0-6,5×10⁶ клеток/мл, а жизнеспособность составляла ≥90%, посевные клетки были инокулированы в стерильных условиях в биореактор объемом 2 л, содержащий среду для культивирования CD FortiCHO™. После инокуляции плотность клеток составляла 1,0×10⁶ клеток/мл, а жизнеспособность ≥90%. Начальные условия культивирования клеток следующие: температура культивирования 37° C; скорость перемешивания: 95 об/мин; pH: 7,20±0,05; и концентрация растворенного кислорода: 50%.

В данном примере была использована система с чередующимся тангенциальным потоком от Refine Techology. В устройстве ATF была собрана колонна из полых волокон и диафрагмы в верхней части основания, затем устройство ATF было подключено к вакуумному насосу и контроллеру. Верх колонны из полых волокон с размером пор 0,2 мкм соединен трубкой с реактором. Когда клетки были культивированы в биореакторе до плотности 4,5-5,5×10⁶ клеток/мл, в устройстве ATF включали вакуумный насос и контроллер, где определяли объем среды, требующий замены в день, на основании количества растущих клеток и скорости роста клеток, регулируя скорость подачи свежей среды и скорость удаления отходов процесса культивирования. Когда объем перфузии достигал заданного значения каждый день, в случае если глюкозы было недостаточно, добавляли дополнительный 30% раствор глюкозы. Когда плотность клеток достигла 65±ч×10⁶ клеток/мл, температуру культивирования снизили до 32°C, а pH - до 7±0,05. Когда плотность клеток была дополнительно увеличена до 95±5×10⁶ клеток/мл, для выполнения второй стадии производства, исходная мембрана из полых волокон 0,2 мкм была заменена обработанной стерильной вакуумной мембраной 50 кДа. Колебание плотности клеток поддерживалось в пределах 10×10⁶ клеток/мл. Когда жизнеспособность клеток снизилась до 90%, культивирование в биореакторе прекращали и собирали культуральную жидкость.

В одном из вариантов осуществления культуральную жидкость собирали, когда жизнеспособность клеток снижалась до 80%. В одном варианте осуществления культуральную жидкость собирали, когда жизнеспособность клеток снижалась до 70%. В одном варианте осуществления культуральную жидкость клеток собирали, когда жизнеспособность клеток снижалась до 50%.

Очистка

В данном примере после того, как мембрана глубинного фильтра (D0HC (номер MD0HC10FS1, производитель: Merck)) была подключена к перистальтическому насосу (могут применяться любые имеющиеся в продаже перистальтические насосы, отвечающие требованиям по скорости потока), для промывки было закачано 10 CV сверхчистой воды для промывания мембраны глубинного фильтра. Затем мембрану глубинного фильтра промывали 1 CV буфера для глубинной фильтрации, содержащего 25 мМ Трис-HCl и 100 мМ NaCl (pH 7,4 ± H,2), со скоростью потока 100-300 л/м²/ч. После этого культуральную жидкость фильтровали со скоростью потока 100-300 л/м²/ч и сразу собирали фильтрат. После этого мембрану глубинного фильтра промывали 2 CV буфера для глубокой фильтрации, содержащего 25 мМ Трис-HCl и 100 мМ NaCl (pH 7,4±0,2), и собирали фильтрат, при этом давление перед мембраной во время процесса поддерживали на уровне 2 бар или меньше.

Аффинная хроматография на протеине А

В качестве сорбента, используемого в аффинной хроматографии на протеине А, был выбран JWT 203 (производитель: JSR). Фильтрат, полученный посредством глубинной фильтрации, загружали со скоростью потока 300 см/ч, при этом соотношение загружаемого количества (мг) к сорбенту составило менее 35 мг/мл. После загрузки образца хроматографическую колонку промывали 5 CV промывочного буфера, содержащего 25 мМ Трис-HCl и 50 мМ NaCl (pH 7,4), со скоростью потока 300 см/ч, а затем элюировали 100 мМ ацетатом натрия уксусной кислоты (pH 3,6±0,2, проводимость 0,9±0,2 мСм/см) со скоростью потока 300 см/ч. Элюат отслеживали на длине волны 280 нм в реальном времени. Когда показание UV280 возросло до 0,1 AU, начали собирать элюат, а когда показание UV280 уменьшилось до 0,5 AU, сбор прекращали. Собранный образец доводили до значения pH 3,5-3,7 при комнатной температуре и использовали для обработки вирусов в течение 1-2 часов для инактивации.

Анионообменная хроматография

Необработанный образец очищали хроматографией для приготовления исходного раствора. В анионообменной хроматографии в качестве сорбента был использован Capto Q (производитель: GE healthcare). Хроматографическую колонку уравновешивали последовательно 2 CV предварительно уравновешенного раствора (50 мМ Трис-HCl + 1M NaCl, pH 8,0) и 3 CV равновесного раствора (50 мМ Трис-HCl, pH 8,0). Образец загружали со скоростью 180 см/ч. Пик элюирования регистрировался, когда показание UV280 увеличивалось до 0,1 AU, а отношение количества загрузки (мг) к сорбенту (мл) поддерживалось менее 40 мг/мл. После завершения загрузки образца хроматографическую колонку промывали 3 CV равновесного раствора со скоростью потока 240 см/ч. Сбор прекращался, когда показание UV280 снижалось до 0,1 AU.

Катионообменная хроматография

Собранный образец дополнительно обрабатывали катионообменной хроматографией. Для катионообменной хроматографии в качестве обменника был выбран Fractogel EMD COO-(M) (производитель: Merck). Хроматографическую колонку уравновешивали 3 CV уравновешивающего раствора (50 мМ ацетат натрия уксусной кислоты, pH 5,2). Образец GB222 загружали со скоростью 180 см/ч, при этом соотношение загружаемого количества (мг) к сорбенту составило менее 45 мг/мл. После загрузки образца колонку промывали 5 CV равновесной жидкости со скоростью 180 см/ч. Затем колонку подвергали градиентному элюированию 10 CV элюента, где элюент состоял из буфера (постепенно увеличивающегося от 0 до 100%), содержащего 50 мМ ацетата натрия уксусной кислоты и 300 мМ хлорид натрия (pH 5,2) и равновесный раствор (постепенно уменьшающийся от 100% до 0), загружаемый со скоростью потока 180 см/ч. Элюат собирали в процессе промывания.

Регидратация методом ультрафильтрации

Очищенный образец подвергали регидратации путем ультрафильтрации. Мембрану для ультрафильтрации с номером модели P2C030C25 и размером пор 30 кД (производитель: Merck Millipore) очищали и ополаскивали 20 мМ натрий-фосфатным буфером (pH 6,0) до тех пор, пока pH после мембраны не достиг 6,0. Образец закачивали в ультрафильтрационную мембрану с помощью перистальтического насоса для ультрафильтрации и концентрирования, где скорость входящего потока регулировалась на уровне 300 л/м²/ч, а трансмембранное давление - на уровне 0,3-0,7 бар. Образец концентрировали примерно до 20 мг/мл с помощью первой ультрафильтрации, затем для восполнения объема жидкости использовали 20 мМ натрий-фосфатный буфер (pH 6,0), при этом натрий-фосфатный буфер был в 10 раз больше, чем образец. После этого мембрану для ультрафильтрации очищали, чтобы получить исходный раствор.

Сравнительный пример 2. Продуцирование антител в системе 2 L-ATF на основе метода однократного удерживания

В данном примере также использовалась система ATF от Refine Technology. Сначала были собраны колонна из полых волокон в устройстве ATF и диафрагма в верхней части основания, а затем были подключены вакуумный насос и контроллер. Была установлена трубка, соединяющая верх колонны из полых волокон с размером пор 50 кД с реактором, помещена в 25% этанол и стерилизована в соответствии со способом Примера 1.

Способ культивирования клеток, в сущности, такой же, как в Примере 2, основное отличие заключалось в том, что, когда плотность клеток возрастала до 4,5-7,5×10⁶ клеток/мл, была подключена система ATF, а контроллер и вакуумный насос в устройстве ATF были включены. Используемая система ATF включала узел вакуумной волоконной мембраны с удерживающей молекулярной массой 50 кДа. Культивирование продолжали до тех пор, пока жизнеспособность клеток не снизилась до 90%. Последующие стадии очистки были такими же, как в Примере 2.

Культуральную жидкость брали для предварительного анализа на 10-й день культивирования клеток методом однократного удерживания. Результаты показали, что содержание кислотного пика составило около 26%, в то время как на 10-й день культивирования с поэтапным удерживанием, кислотный пик составил только около 10%. После завершающий очистки содержание кислотного пика в конечном продукте, полученным методом поэтапного удерживания также было ниже, чем в конечном продукте, полученным методом однократного удерживания. После ультрафильтрации и регидратации условием для выпоолнения SEC-HPLC заключалось в том, чтобы чистота мономера антитела составляла ≥ 95%, в то время как для трех партий продуктов, полученных методом однократного удерживания, обнаруженная чистота мономера антитела составляла только 93%. 92,8% и 93%, что было намного ниже, чем чистота продукта, полученного методом поэтапного удерживания из Примера 2.

Следовательно, помимо выхода, метод поэтапного удерживания значительно превосходил метод однократного удерживания по чистоте заряда и чистоте размера молекул. Результаты дальнейшего анализа и сравнения продуктов, полученных соответственно указанными выше способами удерживания, представлены в таблице 7.

Таблица 7. Сравнение параметров продуктов, полученных

соответственно методом однократного и поэтапного удерживания

Подготовительная стадия технологического процесса Метод однократного удерживания Метод поэтапного удерживания Признак/цвет Светло-коричневая жидкость
(B6) Светло-коричневая жидкость
(B6) pH 6.1 6.2 Осмотическое давление 280 272
SEC-HPLC Полимер 6.2 3.5 Пик определяемого компонента 93.7 96.5 Фрагмент 0 0 Восстановленный чистый CE-SDS 97.3 98.2 Невосстановленный чистый CE-SDS 96.7 97.8
CEX-HPLC Кислотный пик 31.7 21.9 Нейтральный пик 57.2 68.8 Щелочной пик 11.2 9.3 Биологическая активность 99% 104%

Пример 3. Поэтапное удерживание на подготовительной стадии технологического процесса при различной плотности клеток

Кроме того, было обнаружено, что соответствующая плотность клеток в процессе поэтапного удержания может составлять всего 15±5×10⁶ клеток/мл. Например, в условиях культивирования клеток с низкой плотностью второй этап продуцирования может быть начат, когда плотность клеток достигает 15±5×10⁶ клеток/мл, предпочтительно 35±5×10⁶ клеток/мл. Когда второй этап производства была начат при вышеуказанных условиях плотности ячеек, конечный продукт все еще был значительно лучше, чем продукт, полученный при традиционном однократном удерживании по выходу и чистоте заряда.

Антитело из Примера 2 использовали в качестве примера, и сравнение между методом однократного удерживания и методом поэтапного удерживания при плотности клеток соответственно 15±5×10⁶ клеток/мл (в диапазоне от 10×10⁶ клеток/мл до 20×10⁶ клеток/мл) и 35±5×10⁶ клеток/мл (в диапазоне от 30×10⁶ клеток/мл до 40×10⁶ клеток/мл), как показано в таблице 8.

Таблица 8. Сравнение однократного удерживания и ступенчатого удерживания при разной плотности клеток

Плотность клеток 15±5×10⁶ клеток/мл 35±5×10⁶ клеток/мл Технологический режим Метод однократного удерживания Метод поэтапного удерживания Метод однократного удерживания Метод поэтапного удерживания SEC-HPLC главный пик 91% 95% 93% 96% CEX-HPLC кислотный пик 31% 20% 26% 17%

Пример 4. Применимость продуктов с разной молекулярной массой

Поэтапная технология, представленная в настоящем изобретении, также подходит для производства белковых продуктов с различной молекулярной массой. Рекомбинантные генно-инженерные антитела были использованы в качестве примера, где процесс поэтапного удерживания был применим как для получения области Fab антитела со средней молекулярной массой около 50 кДа, так и для получения би/мультиспецифических антител, имеющих молекулярную массу около 300 кДа. В частности, при производстве би/мультиспецифических антител, так как эти антитела имеют сложную структуру и часто включают специально разработанные мутации, вероятно, будут образовываться примеси, связанные с продуктом. При использовании метода поэтапного удерживания данные примеси будут проходить через более крупные отверстия фильтра, и будут удалены на первом этапе производства, что способствовало бы последующей очистке и выделению. Из-за большой разницы в молекулярной массе белковых продуктов в настоящем изобретении дополнительно указан размер фильтрующих пор фильтровальных узлов, используемых на двух этапах производства. Размер пор фильтрующего узла, используемого на первом этапе, составил 0,05–1 мкм, что позволяло удалять низкомолекулярные метаболиты и примеси, связанные с крупномолекулярными продуктами. В предпочтительном варианте размер пор фильтра составил 0,1-0,5 мкм, что может значительно повысить эффективность очистки и выход продукта. Фильтрующий узел, используемый на втором этапе производства, имел отсечку по молекулярной массе 1/15-2/3 от молекулярной массы продукта, что может гарантировать требуемое обогащение продукта. Когда граничная молекулярная масса составляла от 2/15 до 7/15 молекулярной массы продукта, выход продукта был выше, а когда граничная молекулярная масса составляла от 1/5 до 1/3 молекулярной массы продукта, выход из обогащенных антител достигал максимума.

В данном примере метод однократного удерживания и метод поэтапного удерживания соответственно использовали для экспрессии и очистки белковых фрагментов области Fab (~ 50 кД) последовательности антитела герцептина в примере 1. В методе поэтапного удерживания использовалась система ATF-2L от Refine Technology. На первом этапе культивирования использовали колонку из полых волокон с размером пор 0,1 мкм. Когда плотность клеток достигала 10-15×10⁶ клеток/мл, мембрану из полых волокон с размером пор 0,1 мкм заменяли предварительно обработанной стерильной вакуумной мембраной 10 кДа для выполнения второго этапа производства. Для метода однократного удерживания вначале в системе ATF была установлена вакуумная мембрана 10 кДа. В тех же условиях культивирования, по сравнению с методом однократного удерживания, метод поэтапного удерживания может достигать 4%ного увеличения выхода Fab-области последовательности антитела герцептина и повышения эффективности очистки на 2%. Более того, другие фрагменты белка с молекулярной массой 50 кДа также обрабатывались с использованием вышеуказанных методов, и результаты также показали, что по сравнению с традиционным методом однократного удерживания, метод поэтапного удерживания может эффективно увеличить выход в среднем на 2%-4% и эффективность очистки в среднем на 1% -2%.

В данном примере для экспрессии и очистки биспецифического антитела были также применены методы однократного и поэтапного удерживания, где биспецифическое антитело было образовано путем прямого лигирования С-конца (карбоксильный конец) области Fab (~ 50 кДа) последовательности антитела герцептина Примера 1, до N-конца вариабельной области исходного лекарственного средства антитела Авастин Примера 2, с симметричной структурой и молекулярной массой около 250 кДа. В методе поэтапного удерживания все еще использовалась система с чередующимся тангенциальным потоком ATF-2L от Refine Technology. Колонку из полых волокон с размером пор 0,5 мкм использовали для получения культуры на первом этапе, и когда плотность клеток достигла 30-40×10⁶ клеток/мл, мембрану из полых волокон с размером пор 0,5 мкм заменили стерильной вакуумной мембраной 50 кДа для выполнения второго этапа производства. В методе однократного удерживания вначале в системе ATF была установлена вакуумная мембрана 50 кДа. В тех же условиях культивирования, по сравнению с методом однократного удерживания, из-за сложности биспецифического антитела метод поэтапного удерживания может удалять метаболиты, полимеры и молекулы антител с плохим качеством на ранней стадии культивирования клеток на первом этапе производства. Следовательно, метод поэтапного удерживания может обеспечить увеличение выхода последовательностей биспецифических антител на 10% и повышение эффективности очистки на 5%. Другие фрагменты белка с молекулярной массой 250 кДа также были обработаны этими двумя методами для сравнения, и результаты показали, что, при получении биспецифических или триспецифических антител с большой молекулярной массой, по сравнению с традиционным методом однократного удерживания метод поэтапного удерживания может эффективно увеличить выход в среднем на 5-10% и эффективность очистки в среднем 3-5%.

Описанные выше примеры являются лишь предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения, которые не предназначены для ограничения объема раскрытия. Следует понимать, что производственный процесс с поэтапным удерживанием может быть интегрирован при культивирование в различных формах биореакторов или использоваться в различных существующих системах удержания, таких как системы тангенциальной фильтрации (TFF), системы ротационной фильтрации, системы глубинной фильтрации, системы центрифугирования и отстаивания. Различные изменения и модификации, выполненные без отклонения от сущности изобретения, должны находиться в пределах объема изобретения, определенного прилагаемой формулой изобретения.

Изобретение относится к биотехнологии. Представлены способ поэтапного удерживания для подготовительной стадии получения биомакромолекул, используемый производственный модуль и применение способа/модуля в промышленном производстве полипептидов, слитых белков и молекул иммуноглобулинов. Способ, в соответствии с настоящим изобретением, может улучшить эффективность получения, выход и чистоту продукта при крупномасштабном производстве рекомбинантного белка. 3 н. и 15 з.п. ф-лы, 2 ил., 8 табл., 4 пр.

1. Способ поэтапного удерживания для подготовительной стадии получения биомакромолекулы, включающий:

(1) введение первой удерживающей системы в биореактор на первом этапе производства, представляющем собой стадию пролиферации клеток; при этом первая удерживающая система, используемая для удержания клеток, содержит первый фильтрующий модуль; где первый фильтрующий модуль содержит первый фильтрующий узел с размером пор 0,05-1 мкм для удаления продуктов метаболизма, и связанных с ними примесей, из жидкости для культивирования клеток; и

(2) замену первой системы удержания второй системой удержания на втором этапе производства, представляющем собой стадию синтеза и сбора продукта.; при этом вторая удерживающая система, используемая для удержания клеток, содержит второй фильтрующий модуль; где второй фильтрующий модуль содержит второй фильтрующий узел, имеющий отсечку по молекулярной массе 1/15-2/3 от молекулярной массы биомакромолекулы, для сбора и обогащения продуктов биомакромолекул.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что размер пор первого фильтрующего узла составляет 0,1-0,5 мкм; и/ или отсечка по молекулярной массе второго фильтрующего узла составляет 2/15-7/15 от молекулярной массы биомакромолекулы.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что размер пор первого фильтрующего узла составляет 0,2-0,3 мкм; и/или отсечка по молекулярной массе второго фильтрующего узла составляет 1/5–1/3 от молекулярной массы биомакромолекулы.

4. Способ поэтапного удерживания по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что биомакромолекула имеет молекулярную массу 50-300 кДа.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что молекулярная масса биомакромолекулы составляет 100-250 кДа или 150-200 кДа.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что плотность клеток на втором этапе производства составляет не менее 15±5×106 клеток/мл.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что плотность клеток на втором этапе производства составляет не менее 35±5×106 клеток/мл.

8. Способ по п.6, отличающийся тем, что отклонение плотности клеток во время второго этапа производства не превышает 10×106 клеток/мл, или плотность клеток прогрессивно увеличивается на втором этапе производства с отклонением выше 10×106 клеток/мл.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что каждая первая и вторая системы удерживания представляют собой систему с чередующимся тангенциальным потоком, систему фильтрации с тангенциальным потоком, вращающуюся систему фильтрации, систему глубинной фильтрации, систему центрифуги или систему отстаивания; и/или биореактор представляет собой биореактор с воздушным подъемом, биореактор с механическим перемешиванием, биореактор с барботажной колонкой или мембранный биореактор; и/или клетки представляют собой клетки млекопитающих, клетки растений, клетки насекомых или микробные клетки, предпочтительно клетки млекопитающих.

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что подготовительную стадию производства биомакромолекулы осуществляют с помощью перфузионного культивирования, концентрированного перфузионного культивирования, периодического культивирования с подпиткой или концентрированного периодического культивирования с подпиткой.

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что биомакромолекула представляет собой полипептид или рекомбинантный белок.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что рекомбинантный белок представляет собой генно-инженерное антитело, функциональный белок с биологической активностью или белок, образованный в результате слияния Fc-фрагмента.

13. Применение производственного комплекта в способе поэтапного удержания по п.1, содержащего первый фильтрующий модуль и второй фильтрующий модуль; при этом первый фильтрующий модуль содержит первый фильтрующий узел с размером пор 0,05-1 мкм для удаления продуктов метаболизма, и связанных с ними примесей, из жидкости для культивирования клеток; второй фильтрующий модуль содержит второй фильтрующий узел, имеющий отсечку по молекулярной массе 1/15-2/3 от молекулярной массы биомакромолекулы, для сбора и обогащения продуктов биомакромолекул; первый фильтрующий модуль и второй фильтрующий модуль соответственно размещены в первой и второй удерживающих системах.

14. Применение производственного комплекта по п.13, отличающееся тем, что размер пор первого фильтрующего модуля составляет 0,2-0,3 мкм; и/или отсечка по молекулярной массе второго фильтрующего модуля составляет 1/5-1/3 от молекулярной массы биомакромолекулы.

15. Применение производственного комплекта по п.14, отличающееся тем, что размер пор первого фильтрующего модуля составляет 0,2-0,3 мкм; и/или отсечка по молекулярной массе второго фильтрующего модуля составляет 1/5-1/3 от молекулярной массы биомакромолекулы.

16. Применение способа поэтапного удержания по любому из пп.1-12 на подготовительной стадии при получении биомакромолекулы, отличающееся тем, что биомакромолекула представляет собой белковый продукт.

17. Применение способа по п.16, отличающееся тем, что биомакромолекула представляет собой полипептид или рекомбинантный белок.

18. Применение способа по п.17, отличающееся тем, что рекомбинантный белок представляет собой генно-инженерное антитело, функциональный белок с биологической активностью или белок, образованный в результате слияния Fc-фрагмента.