Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится, главным образом, к области детекции антител, и в частности, относится к анализам для детекции аутоантител, связанных с раком печени, в образце, содержащем физиологическую жидкость пациента.
Уровень техники для изобретения
Множество диагностических, прогностических и/или мониторирующих анализов основано на детекции биологического маркера конкретного состояния заболевания или чувствительности к заболеванию. Такие биологические маркеры обычно представляют собой белки или полипептиды, которые являются характерными для конкретного заболевания или ассоциированными с чувствительностью к заболеванию и являются часто используемыми для детекции злокачественных опухолей, включая рак печени.
Рак печени, и конкретно, печеночно-клеточная карцинома (HCC), является шестым из наиболее распространенных злокачественных опухолей во всем мире, кроме того, он является второй из наиболее распространенных причин смерти от злокачественных опухолей. Высокий уровень смертности вызван поздней диагностикой, часто после метастазирования, и предсуществующими заболеваниями печени. Поздняя диагностика обусловлена недостатком ранних симптомов и неоптимальными способами визуализации для использования в диагностике.
Ультразвуковой скрининг и оценка уровней альфа-фетопротеина (AFP) в крови в настоящее время являются наиболее широко используемыми инструментами для рака печени. Однако их плохая производительность выявляет серьезную недостаточность в улучшенном тесте для ранней детекции/скрининга рака печени.
Ясно, что тест, который можно использовать в клинике для анализа присутствия рака печени, является очень ожидаемым, поскольку он может позволять раннюю диагностику рака печени. Кроме того, диагностический тест, проводимый на образце физиологической жидкости, например, образце крови, может являться быстрым и относительно неизвазивным, увеличивая скорость скрининга участников по сравнению с другими способами. Детекция заболевания на ранних стадиях открывает широкие возможности лечения с менее тяжелыми побочными эффектами. Современные способы лечения рака печени на умеренных стадиях включают полную трансплантацию печени, и более ранняя идентификация пациентов с заболеванием на ранней стадии может облегчить нагрузку на регистр донорских органов.
Улучшенный тест скрининга для рака печени может являться полезным во всем мире, поскольку частота рака печени увеличивается во всем мире. В настоящее время, в Китае насчитывают приблизительно 50% всех случаев HCC, в то время как в Египте также присутствует очень высокая частота HCC. Считают, что высокая встречаемость HCC в этих странах обусловлена, частично, высокой встречаемостью гепатита B в Китае и высокой встречаемостью гепатита C в Египте. Гепатит B и гепатит C являются известными факторами риска рака печени вместе с циррозом печени, неалкогольной жировой дистрофией печени, алкогольной болезнью печени, болезнью Вильсона, наследственным гемохроматозом, аутоиммуннм гепатитом, документированным воздействием афлатоксина, шистозоматозом и сахарным диабетом. Увеличивающаяся встречаемость этих условий во всем мире делает неотложной необходимостью разработку быстрого и неинвазивного теста для рака печени.
В недавние годы стало очевидным, что антитела, и в частности, аутоантитела, могут служить биологическими маркерами заболевания или чувствительности к заболеванию. Аутоантитела представляют собой природные антитела, нацеленные на антиген, который иммунная система индивидуума узнает как чужеродный, даже несмотря на то, что этот антиген фактически происходит от индивидуума. Они могут присутствовать в кровотоке как циркулирующие свободные аутоантитела, или в форме циркулирующих иммунных комплексов, состоящих из аутоантител, связанных со своим белком-мишенью. Различия между белком дикого типа, экспрессированным «нормальными» клетками, и измененной формой белка, продуцированной пораженной заболеванием клеткой или в ходе процесса заболевания, может, в некоторых случаях, приводить к узнаванию измененного белка иммунной системой индивидуума как «не своего» и таким образом, к вызову иммунного ответа у этого индивидуума. Это может быть гуморальный (т.е. опосредованный B-клетками) иммунный ответ, приводящий к продукции аутоантител, иммунологически специфических для измененного белка.
Анализы, измеряющие иммунный ответ индивидуума на присутствие маркерных белков опухолей в отношении продукции аутоантител, обеспечивают альтернативу непосредственному измерению или детекции маркерных белков опухолей в физиологических жидкостях. Такие анализы в основном составляют непрямую детекцию присутствия маркерного белка опухоли. Характер иммунного ответа означает, что существует вероятность того, что образование аутоантител может быть вызвано очень небольшим количеством циркулирующего маркерного белка опухоли, и непрямые способы, основанные на детекции иммунного ответа на маркерные белки опухолей, следовательно, могут являться более чувствительными, чем способы прямого измерения уровней маркерного белка опухоли в физиологических жидкостях. Способы анализа, основанные на детекции аутоантител, могут, таким образом, иметь особенную ценность на ранних стадиях в процессе заболевания.
Авторы изобретения неожиданно определили четыре маркерных антигена опухолей, ранее не известных как ассоциированные с раком печени. Посредством детекции аутоантител, детектированных против любого одного из этих маркерных антигенов опухолей, необязательно, в комбинации с одним или несколькими дополнительными маркерными антигенами опухолей, авторы изобретения разработали эффективный и неинвазивный способ скрининга для рака печени, и соответствующий набор.
Сущность изобретения
Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что аутоантитела, иммунологически специфические для любого одного из маркерных белков опухолей матриксной металлопептидазы 9 (MMP9), фактора воспаления аллотрансплантата 1 (AIF1), молекулы адгезии эпителиальных клеток (EpCAM) и ингибитора 1B циклинзависимой киназы (CDKN1B), являются показателями присутствия рака печени. Таким образом, детекцию аутоантител, иммунологически специфических для любого одного из этих маркерных белков опухолей, можно использовать для диагностики рака печени.
В соответствии с первым аспектом изобретение относится к способу детекции антитела в тестируемом образце, содержащем физиологическую жидкость от субъекта-млекопитающего, где антитело представляет собой аутоантитело, иммунологически специфическое для маркерного белка опухоли, выбранного из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B, где способ включает стадии:
(a) приведения тестируемого образца в контакт с маркерным антигеном опухоли, выбранным из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B; и
(b) определения присутствия или отсутствия комплексов маркерного антигена опухоли, связанного с аутоантителами, присутствующими в тестируемом образце.
В этом аспекте у субъекта, предпочтительно, подозревают наличие рака печени.
В соответствии с вторым аспектом изобретение относится к способу детекции рака печени у субъекта-млекопитающего посредством детекции антитела в тестируемом образце, содержащем физиологическую жидкость от субъекта-млекопитающего, где антитело представляет собой аутоантитело, иммунологически специфическое для маркерного белка опухоли, выбранного из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B, где способ включает стадии:
(a) приведения тестируемого образца в контакт с маркерным антигеном опухоли, выбранным из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B; и
(b) определения присутствия или отсутствия комплексов маркерного антигена опухоли, связанного с аутоантителами, присутствующими в тестируемом образце;
При этом присутствие указанных комплексов является показателем присутствия рака печени.
В соответствии с третьим аспектом изобретение относится к способу диагностики и лечения рака печени у субъекта-млекопитающего посредством детекции антитела в тестируемом образце, содержащем физиологическую жидкость от субъекта-млекопитающего, где антитело представляет собой аутоантитело, иммунологически специфическое для маркерного белка опухоли, выбранного из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B, где способ включает стадии:
(a) приведения тестируемого образца в контакт с маркерным антигеном опухоли, выбранным из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B;
(b) определения присутствия или отсутствия комплексов маркерного антигена опухоли, связанного с аутоантителами, присутствующими в тестируемом образце;
(c) диагностики у субъекта рака печени, когда детектированы комплексы маркерного антигена опухоли, связанного с аутоантителами, присутствующими в тестированном образце; и
(d) подвергания диагностированного субъекта лечению рака печени.
В соответствии с четвертым аспектом изобретение относится к способу прогнозирования ответа на лечение против рака печени, включающему детекцию антитела в тестируемом образце, содержащем физиологическую жидкость от субъекта-млекопитающего, где антитело представляет собой аутоантитело, иммунологически специфическое для маркерного белка опухоли, выбранного из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B, где способ включает стадии:
(a) приведения тестируемого образца в контакт с маркерным антигеном опухоли, выбранным из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B;
(b) определения присутствия или отсутствия комплексов маркерного антигена опухоли, связанного с аутоантителами, присутствующими в тестируемом образце;
(c) детекции уровня специфического связывания между маркерным антигеном опухоли и аутоантителами, присутствующими в тестируемом образце; и
(d) сравнения уровня специфического связывания между маркерным антигеном опухоли и аутоантителом с ранее установленной связью между уровнем связывания и вероятным исходом лечения;
при этом по изменению уровня специфического связывания, по сравнению с контролем, прогнозируют, что пациент будет или не будет отвечать на лечение против рака печени.
В этом аспекте изобретения лечение против рака печени может быть выбрано из группы, состоящей из химиотерапии, радиочастотной абляции, резекции печени, трансплантации печени, вакцинации, лекарственных средств против факторов роста или передачи сигнала, эндокринной терапии, терапии человеческим антителом, транскатетерной артериальной химиоэмболизации, чрескожной инъекции этанола, микроволновой абляции, введения сорафениба и радиоэмболизации.
В соответствии с пятым аспектом изобретение относится к применению маркерного антигена опухоли, выбранного из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B, в способе детекции рака печени у субъекта-млекопитающего посредством детекции аутоантитела, иммунологически специфического для MMP9, AIF1, EpCAM или CDKN1B, в тестируемом образце, содержащем физиологическую жидкость от субъекта-млекопитающего, где способ включает стадии:
(a) приведения тестируемого образца в контакт с маркерным антигеном опухоли, выбранным из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B; и
(b) определения присутствия или отсутствия комплексов маркерного антигена опухоли, связанного с аутоантителами, присутствующими в тестируемом образце;
при этом присутствие указанных комплексов является показателем присутствия рака печени.
В соответствии с шестым аспектом изобретение относится к набору для детекции аутоантител в тестируемом образце, содержащем физиологическую жидкость от субъекта-млекопитающего, содержащему:
(a) маркерный антиген опухоли, выбранный из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B; и
(b) реагент, способный к детекции комплексов маркерного антигена опухоли, связанного с аутоантителами, присутствующими в тестированном образце.
В соответствии с шестым объектом изобретение относится к способу in vitro определения профиля антител индивидуума, страдающего раком печени, в тестируемом образце, содержащем физиологическую жидкость от субъекта-млекопитающего, где антитело представляет собой аутоантитело, иммунологически специфическое для маркерного белка опухоли, выбранного из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B, где способ включает стадии:
a) приведения тестируемого образца в контакт с маркерным антигеном опухоли, выбранным из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B; и
b) определения присутствия или отсутствия комплексов маркерного антигена опухоли, связанного с аутоантителами, присутствующими в тестируемом образце, где способ повторяют для построения профиля продукции антител.
Во всех аспектах изобретения субъект-млекопитающее предпочтительно представляет собой человека. В настоящем описании, термины «субъект-млекопитающее» и «субъект» используют взаимозаменяемо для обозначения субъекта, представляющего собой млекопитающее, предпочтительно, человека.
Во всех аспектах изобретения способ предпочтительно осуществляют in vitro на тестируемом образце, содержащем физиологическую жидкость, полученную или подготовленную от субъекта-млекопитающего.
Неожиданное обнаружение, что аутоантитела, иммунологически специфические для маркерного белка опухоли, выбранного из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B, можно использовать в качестве маркеров рака печени, позволило авторам изобретения разработать способы для детекции таких аутоантител, которые можно использовать для детекции и диагностики рака печени. Такую детекцию можно осуществлять с использованием набора, и эти способы и наборы формируют основу настоящего изобретения.
Краткое описание фигур
Фигура 1. Представление в виде диаграммы для демонстрации выведения вторичных параметров кривой: Фигура 1A=угол наклона кривой, точка пересечения с осью, площадь под кривой (AUC) и максимальный угол наклона кривой; Фигура 1B=константа диссоциации (Kd).
Фигура 2. Схема планшетов для микротитрования аутоантител: Фигура 2A=схема высокопроизводительного анализа (HTPA); Фигура 2B=схема титрования.
Подробное описание изобретения
Изобретение относится, в общем, к способу иммуноанализа для детекции аутоантитеа, иммунологически специфического для маркерного белка опухоли, выбранного из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B. Этот способ иммуноанализа можно использовать для детекции или диагностики рака печени.
Способ детекции аутоантитела
В соответствии с первым аспектом изобретение относится к способу детекции антитела в тестируемом образце, содержащем физиологическую жидкость от субъекта-млекопитающего, где антитело представляет собой аутоантитело, иммунологически специфическое для маркерного белка опухоли, выбранного из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B, где способ включает стадии:
(a) приведения тестируемого образца в контакт с маркерным антигеном опухоли, выбранным из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B; и
(b) определения присутствия или отсутствия комплексов маркерного антигена опухоли, связанного с аутоантителами, присутствующими в тестируемом образце.
Термин «аутоантитело», в рамках изобретения относится к природному антителу, детектированному против антигена, который иммунная система индивидуума узнает как чужеродный, даже несмотря на то, что этот антиген фактически происходит от индивидуума. Как правило, аутоантитела включают антитела, детектированные против измененных форм природных белков, продуцированных пораженной заболеванием клеткой или в ходе процесса заболевания. Измененная форма белка происходит от индивидуума, но может рассматриваться иммунной системой индивидуума как «не своя», и таким образом, вызывает иммунный ответ у этого индивидуума в форме аутоантител, иммунологически специфических к измененному белку. Такие измененные формы белка могут включать, например, мутанты, имеющие измененную аминокислотную последовательность, необязательно, сопровождающуюся изменениями вторичной, третичной или четвертичной структуры, укороченные формы, варианты сплайсинга, измененные гликоформы и т.д. В других вариантах осуществления можно детектировать аутоантитело против белка, сверхэкспрессированного в состоянии заболевания, или в результате амплификации гена или аномальной регуляции транскрипции. Сверхэкспрессия белка, с которым в норме не встречаются клетки иммунной системы, в значительных количествах, может запускать иммунный ответ, приводящий к продукции аутоантител. В следующих вариантах осуществления можно детектировать аутоантитело против эмбриональной формы белка, которая начинает экспрессироваться в состоянии заболевания. Если эмбриональный белок, который в норме экспрессируется только на ранних стадиях развития, до того, как иммунная система становится функциональной, начинает экспрессироваться в состоянии заболевания, эмбриональная форма, экспрессированная в состоянии заболевания у полностью развитого человека, может быть узнана иммунной системой как «чужеродная», запуская иммунный ответ, приводящий к продукции аутоантител. В следующих вариантах осуществления может быть детектировано аутоантитело против белка, который экспрессируется в другой локализации в состоянии заболевания. Например, белок может экспрессироваться во внутренней локализации у здоровых индивидуумов, но экспрессироваться в экспонированной на поверхности локализации в состоянии заболевания, таким образом, что он является экспонированным для кровотока и таким образом, для иммунной системы в состоянии заболевания, но не у здорового индивидуума. В настоящем описании, белок, аутоантитело против которого детектировано, обозначен как «маркерный белок опухоли».
В рамках изобретения предусматривают, что можно детектировать аутоантитела, иммунологически специфические для любого одного из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B. Изобретение также относится к детекции аутоантител, которые являются иммунологически специфическими для одного из этих маркерных белков опухолей, и аутоантител, которые являются иммунологически специфическими для второго из этих маркерных белков опухолей, необязательно, в комбинации с детекцией аутоантител, которые являются иммунологически специфическими для третьего из этих маркерных белков опухолей, и кроме того, необязательно, к детекци аутоантител, которые являются иммунологически специфическими для четвертого из этих маркерных белков опухолей. Однако изобретение никаким образом не является ограниченным в этом отношении. Когда детектируют аутоантитела, иммунологически специфические для двух или трех из идентифицированных маркерных белков опухолей, предусматривают все комбинации двух или трех маркерных белков опухолей.
В контексте настоящего изобретения термин «антиген» используют для обозначения иммуноспецифического реагента, который образует комплексы с аутоантителами, присутствующими в тестируемом образце. Антиген представляет собой вещество, содержащее по меньшей мере одну антигенную детерминанту или эпитоп, способные специфически взаимодействовать с аутоантителом-мишенью, которое желательно детектировать, или любое связывающее вещество, специфически взаимодействующее с вариабельной областью или определяющими комплементарность областями указанного аутоантитела. Антиген, как правило, может представлять собой природную или синтетическую биологическую макромолекулу, например, такую как белок или пептид, полисахарид или нуклеиновая кислота, и может включать антитела или их фрагменты, такие как антиидиотипические антитела. «Маркерный антиген опухоли» представляет собой антиген, уровень которого увеличен у субъектов с злокачественной опухолью, конкретно, в контексте рака печени. В настоящем описании, термины «маркерный антиген опухоли» и «антиген» используют взаимозаменяемо.
Как применяют в настоящем описании, термин «физиологическая жидкость», по отношению к материалу, подлежащему тестированию по присутствию аутоантител с использованием способа по изобретению, включает, среди прочего, плазму, сыворотку, цельную кровь, мочу, пот, лимфу, фекалии, спинномозговую жидкость, асцитную жидкость, плевральный выпот, семенную жидкость, мокроту, аспират из сосков, послеоперационную серому, слюну, амниотическую жидкость, слезы или жидкость от дренирования раны. Как указано выше, способы по изобретению предпочтительно осуществляют in vitro для тестируемого образца, содержащего физиологическую жидкость, отобранную у тестируемого субъекта. Тип используемой физиологической жидкости может меняться в зависимости от идентичности аутоантитела, подлежащего тестированию, и клинической ситуации, в которой используют анализ. Как правило, является предпочтительным осуществлять анализы в образцах сыворотки или плазмы. Тестируемый образец может включать дополнительные компоненты в дополнение к физиологическим жидкостям, например, такие как разбавители, консерванты, стабилизаторы, буферы и т.д.
В конкретных вариантах осуществления, способ по изобретению может дополнительно включать стадии:
(c) детекции уровня специфического связывания между маркерным антигеном опухоли и аутоантителами, присутствующими в тестируемом образце,
где присутствие или отсутствие аутоантитела основано на сравнении между наблюдаемым уровнем специфического связывания и предопределенным порогом отсечения.
В этом варианте осуществления уровень специфического связывания между маркерным антигеном опухоли и аутоантителами, присутствующими в тестируемом образце, может представлять собой относительный уровень связывания или абсолютный уровень связывания.
В настоящем описании, аутоантитело можно считать присутствующим, если уровень специфического связывания между маркерным антигеном опухоли и аутоантителами, присутствующими в тестируемом образце, либо выше, либо ниже предопределенного порога отсечения. Однако, как правило, аутоантитело считают присутствующим, если уровень специфического связывания между маркерным антигеном опухоли и аутоантителами, присутствующими в тестируемом образце, выше предопределенного порога отсечения. Предопределенный порог отсечения можно определять посредством проведения контрольного анализа известных отрицательных образцов (например, нормальных индивидуумов) в исследованиях случай-контроль. «Нормальные» индивидуумы предпочтительно представляют собой совпадающих по возрасту контрольных индивидуумов, не имеющих диагноза рак печени, основанного на клинических критериях, критериях визуализации и/или биохимических критериях. В конкретных вариантах осуществления известные отрицательные образцы могут происходить от индивидуумов с доброкачественными заболеваниями печени, т.е. индивидуумов, которые подвержены высокому риску развития рака печени, но для которых не показано никаких доказательств рака печени. Предпочтительно, нормальные индивидуумы не имеют диагноза никакой злокачественной опухоли. В настоящем описании, уровень специфического связывания между маркерным антигеном опухоли и аутоантителами, присутствующими в тестируемых образцах от нормальных пациентов, можно детектировать и усреднять для получения предопределенного порога отсечения. В конкретных вариантах осуществления предопределенный порог отсечения можно определять посредством выбора порога отсечения, дающего наибольший индекс Юдена, поддерживающего специфичность выше 90%.
Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что аутоантитела, иммунологически специфические для любого из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B, ассоциированы с раком печени. Таким образом, в конкретных вариантах осуществления, у субъекта могут подозревать наличие рака печени. Предусматривают любую причину подозрений, что субъект может иметь рак печени.
Во всех аспектах по настоящему изобретению, рак печени может представлять собой печеночно-клеточную карциному (HCC).
В конкретных вариантах осуществления можно подозревать наличие у субъекта-млекопитающего рака печени, поскольку он ранее тестирован как положительный в скрининге рака печени. В настоящем описании предусматривают любой скрининг рака печени. В конкретных вариантах осуществления субъект может быть ранее тестирован как положительный по альфа-фетопротеину (AFP). Как правило, уровни AFP детектируют в образце крови, взятом от субъекта, и субъект мог, таким образом, быть тестирован ранее как положительный по AFP в образце крови. Однако предусмотрен любой способ детекции AFP. В альтернативных вариантах осуществления, субъект может быть ранее тестирован как положительный по дез-гамма-карбоксипротромбину (DCP) или реакционноспособному по отношению к лектину альфа-фетопротеину (AFP-L3). Как правило, уровни DCP и AFP-L3 детектируют в образце крови, взятых от субъекта, и субъект может, таким образом, быть ранее тестирован как положительный по DCP или AFP-L3 в образце крови. Однако предусматривают любой способ детекции DCP или AFP-L3.
В других вариантах осуществления субъект может быть тестирован как положительный по раку печени с использованием ультразвуковой проверки или любого другого способа визуализации.
В рамках изобретения, субъект может быть тестирован как положительный в скрининге рака печени в любой точке до осуществления способа по изобретению. Например, скрининг рака печени можно проводить за один час, два часа, три часа, четыре часа, пять часов, шесть часов, семь часов, восемь часов, девять часов, десять часов, одиннадцать часов, двенадцать часов, двадцать четыре часа, двое суток, трое суток, четверо суток, пять суток, шесть суток, одну неделю, две недели, три недели, четыре недели, один месяц, два месяца, три месяца, четыре месяца, пять месяцев, шесть месяцев, один год, два года, три года, четыре года, пять лет, шесть лет, семь лет, восемь лет, девять лет, десять лет или более до осуществления способа по изобретению.
Для целей изобретения, субъектов, которых подвергают лечению рака печени или которых ранее подвергали лечению рака печени, все еще можно считать «подозреваемыми на наличие рака печени». В настоящем описании, лечение рака печени можно проводить в любое время, и субъекта затем можно тестировать или можно не тестировать по присутствию рака печени.
Субъекта можно подозревать в наличии рака печени из-за присутствия известного фактора риска для рака печени. В конкретных вариантах осуществления субъект может иметь цирроз печени, неалкогольную жировую дистрофию печени, алкогольную болезнь печени, болезнь Вильсона, наследственный гемохроматоз, аутоиммунный гепатит, гепатит B, гепатит C, документированное воздействие афлатоксина, шистозоматоз или сахарный диабет. Предусмотрены любые способы определения этих факторов риска, и субъекта могут подвергать или могут не подвергать или могли подвергать лечению, соответствующему фактору риска.
Поскольку авторы изобретения неожиданно определили, что аутоантитела, иммунологически специфические для MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B, являются ассоциированными с раком печени, детекцию в тестируемом образце аутоантител, иммунологически специфических для любого одного из этих маркерных белков опухолей, можно использовать в способе детекции рака печени. В одном аспекте изобретение, таким образом, относится к способу детекции рака печени у субъекта-млекопитающего посредством детекции антитела в тестируемом образце, содержащем физиологическую жидкость от субъекта-млекопитающего, где антитело представляет собой аутоантитело, иммунологически специфическое для маркерного белка опухоли, выбранного из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B, где способ включает стадии:
(a) приведения тестируемого образца в контакт с маркерным антигеном опухоли, выбранным из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B; и
(b) определения присутствия или отсутствия комплексов маркерного антигена опухоли, связанного с аутоантителами, присутствующими в тестируемом образце;
где присутствие указанных комплексов является показателем присутствия рака печени.
В его самых широких аспектах, настоящее изобретение относится к способам детекции аутоантител, иммунологически специфических для любого одного из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B, и не является ограниченным диагностикой рака печени или любым последующим лечением. Однако в одном аспекте изобретение относится к способу диагностики и лечения рака печени у субъекта-млекопитающего посредством детекции антитела в тестируемом образце, содержащем физиологическую жидкость от субъекта-млекопитающего, где антитело представляет собой аутоантитело, иммунологически специфическое для маркерного белка опухоли, выбранного из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B, где способ включает стадии:
(a) приведения тестируемого образца в контакт с маркерным антигеном опухоли, выбранным из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B;
(b) определения присутствия или отсутствия комплексов маркерного антигена опухоли, связанного с аутоантителами, присутствующими в тестируемом образце;
(c) диагностики у субъекта рака печени, когда детектированы комплексы маркерного антигена опухоли, связанного с аутоантителами, присутствующими в тестированном образце; и
(d) подвергания диагностированного субъекта лечению рака печени.
В этом аспекте, аутоантитело можно считать присутствующим, если уровень специфического связывания между маркерным антигеном опухоли и аутоантителами, присутствующими в тестируемом образце, либо выше, либо ниже предопределенного порога отсечения, как объяснено выше.
В рамках изобретения, лечение рака печени можно проводить в любое время после диагностики рака печени. Например, лечение рака печени можно проводить через один час, два часа, три часа, четыре часа, пять часов, шесть часов, семь часов, восемь часов, девять часов, десять часов, одиннадцать часов, двенадцать часов, двадцать четыре часа, двое суток, трое суток, четверо суток, пять суток, шесть суток, одну неделю, две недели, три недели, четыре недели, один месяц, два месяца, три месяца, четыре месяца, пять месяцев, шесть месяцев, один год или более после диагностики рака печени. Предусмотрено также проведение множества циклов лечения рака печени с любыми промежутками между циклами лечения.
Предусмотрено проведение лечения рака печени в географической локализации, отличной от географической локализации, в которой проведена диагностика рака печени. Кроме того, лечение рака печени может проводить лицо, отличное от лица, проводящего диагностику, вне зависимости от того, проводят ли диагностику и лечение в одной и той же или в различных географических локализациях.
В одном аспекте способ детекции аутоантитела по изобретению можно использовать для стратификации лечения, т.е. для определения того, может ли конкретный пациент или группа пациентов с большей или меньшей вероятностью отвечать на конкретное лечение против рака печени. Например, способ детекции аутоантитела по изобретению можно использовать для прогнозирования ответа субъекта на лечение против рака печени.
Изобретение, таким образом, относится к способу прогнозирования ответа на лечение против рака печени, включающему детекцию антитела в тестируемом образце, содержащем физиологическую жидкость от субъекта-млекопитающего, где антитело представляет собой аутоантитело, иммунологически специфическое для маркерного белка опухоли, выбранного из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B, где способ включает стадии:
(a) приведения тестируемого образца в контакт с маркерным антигеном опухоли, выбранным из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B;
(b) определения присутствия или отсутствия комплексов маркерного антигена опухоли, связанного с аутоантителами, присутствующими в тестируемом образце;
(c) детекции уровня специфического связывания между маркерным антигеном опухоли и аутоантителами, присутствующими в тестируемом образце; и
(d) сравнения уровня специфического связывания между маркерным антигеном опухоли и аутоантителом с ранее установленной связью между уровнем связывания и вероятным исходом лечения;
при этом изменение уровня специфического связывания, по сравнению с контролем, позволяет прогнозировать, будет или не будет пациент отвечать на лечение против рака печени.
В настоящем описании, контроль предпочтительно представляет собой образец физиологической жидкости, полученной от субъекта, как известно, имеющего рак печени, и как известно, не отвечающего на тестируемое лечение против рака печени, т.е. представляет собой неотвечающий контроль.
Следует отметить, что изобретение никаким образом не является ограниченным каким-либо конкретным лечением рака печени. В конкретных вариантах осуществления лечение рака печени может быть выбрано из группы, состоящей из химиотерапии, радиочастотной абляции, резекции печени, трансплантации печени, вакцинации, лекарственных средств против факторов роста или передачи сигнала, эндокринной терапии, терапии человеческим антителом, транскатетерной артериальной химиоэмболизации, чрескожной инъекции этанола, микроволновой абляции, введения сорафениба и радиоэмболизации.
Аспекты изобретения, описанные выше, обычно осуществляют один раз. Однако иммуноанализы in vitro являются неинвазивными, и их можно повторять так часто, как считают необходимым для построения профиля продукции аутоантител у пациента, либо до начала рака печени, как при скрининге «подверженных риску» индивидуумов, либо в ходе заболевания.
Изобретение, таким образом, относится к способу in vitro определения профиля антител индивидуума, страдающего раком печени, в тестируемом образце, содержащем физиологическую жидкость от субъекта-млекопитающего, где антитело представляет собой аутоантитело, иммунологически специфическое для маркерного белка опухоли, выбранного из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B, где способ включает стадии:
a) приведения тестируемого образца в контакт с маркерным антигеном опухоли, выбранным из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B; и
b) определения присутствия или отсутствия комплексов маркерного антигена опухоли, связанного с аутоантителами, присутствующими в тестируемом образце, где способ повторяют для построения профиля продукции антител.
Панели из двух или более маркерных антигенов опухолей
В конкретных вариантах осуществления изобретения способы могут детектировать два или более аутоантител.
Например, способы могут детектировать два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать, двадцать один, двадцать два, двадцать три, двадцать четыре, двадцать пять, двадцать шесть, двадцать семь, двадцать восемь, двадцать девять, тридцать, тридцать один, тридцать два, тридцать три, тридцать четыре, тридцать пять, тридцать шесть, тридцать семь, тридцать восемь или более аутоантител. В соответствии с основой изобретения, одно из аутоантител является иммунологически специфическим для маркерного белка опухоли, выбранного из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B.
В этих вариантах осуществления способ включает стадию:
(a) приведения тестируемого образца в контакт с панелью из двух или более маркерных антигенов опухолей, содержащей маркерный антиген опухоли, выбранный из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B, и один или нескольких дополнительных маркерных антигенов опухолей, иммунологически специфических по меньшей мере для одного из указанных аутоантител.
Эти способы могут быть далее в настоящем описании обозначены как «анализы панелей». Такие анализы, как правило, являются более чувствительными, чем детекция аутоантител против одного маркерного антигена опухоли, и приводят к намного более низкой частоте ложноотрицательных результатов (см. WO 99/58978, WO 2004/044590 и WO2006/126008, содержание которых приведено в настоящем описании в качестве ссылки).
Является общепринятым, что чувствительность анализа можно увеличивать посредством тестирования присутствия множества аутоантител. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, способы по изобретению предусматривают использование панели, содержащей множество маркерных антигенов опухолей, например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать, двадцать один, двадцать два, двадцать три, двадцать четыре, двадцать пять, двадцать шесть, двадцать семь, двадцать восемь, двадцать девять, тридцать, тридцать один, тридцать два, тридцать три, тридцать четыре, тридцать пять, тридцать шесть, тридцать семь, тридцать восемь или более маркерных антигенов опухолей.
Следует отметить, что вариант осуществления панели можно использовать со всеми способами по изобретению, включая способы детекции аутоантитела, способы детекции рака печени, способы диагностики и лечения рака печени, способы прогнозирования ответа на лечение против рака печени и способы определения профиля антител.
В конкретных вариантах осуществления панель может содержать два или более маркерных антигенов опухолей, представляющих собой отдельные антигены. В настоящем описании, термин «отдельные антигены» включает антигены, происходящие из различных белков или полипептидов (такие как антигены, происходящие из неродственных белков, кодируемых различными генами).
Изобретение относится также к способам использования панели, содержащей два или более вариантов антигенов из одного или нескольких из отдельных антигенов. Термин «вариант антигена» в рамках изобретения обозначает аллельные или другие варианты отдельного антигена, такого как отдельный белковый антиген, как определено выше. Варианты антигенов как правило, происходят из отдельного гена, и различные варианты антигенов могут экспрессироваться у различных членов популяции или в различных состояниях заболевания. Варианты антигенов могут отличаться по аминокислотной последовательности или по посттрансляционной модификации, такой как гликозилирование, фосфорилирование или ацетилирование. Кроме того, термин «вариант антигена» включает мутации антигенов, такие как замены, добавления или делеции аминокислот. Как правило, вариант антигена содержит менее, чем пять (например, менее, чем четыре, менее, чем три, менее, чем две или одну) мутаций по сравнению с антигеном дикого типа.
В варианте осуществления панели, «один или несколько дополнительных маркерных антигенов опухолей», предпочтительно, является иммунологически специфическим для аутоантитела, отличного от аутоантитела, иммунологически специфического для маркерного белка опухоли, выбранного из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B, как обсуждают далее ниже. Однако несмотря на то, что изобретение никаким образом не является ограниченным в этом отношении, изобретение предусматривает детекцию аутоантител, которые являются иммунологически специфическими для одного из этих четырех маркерных белков опухолей, и аутоантител, которые являются иммунологически специфическими для второго из этих четырех маркерных белков опухолей, необязательно, в комбинации с детекцией аутоантител, которые являются иммунологически специфическими для третьего из этих четырех маркерных белков опухолей, и кроме того, необязательно в комбинации с детекцией аутоантител, которые являются иммунологически специфическими для четвертого из этих четырех маркерных белков опухолей. Когда детектируют аутоантитела, иммунологически специфические для двух или трех из идентифицированных маркерных белков опухолей, предусматривают все комбинации из двух или трех маркерных белков опухолей. Панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может, таким образом, содержать два, три или четыре маркерных антигена опухолей, выбранных из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B. В конкретном специфическом варианте осуществления, панель может содержать MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B. В дополнительном конкретном варианте осуществления, панель может состоять из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B.
В одном варианте осуществления, панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может содержать один или несколько маркерных антигенов опухолей, выбранных из группы, состоящей из NY-ESO-1, виментина, HSPA4, трансферрина, HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, циклина B1, AFP, SOX2, AKR1B10, ApoA1, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, пролактина, RGN, SPP1, SSX2 и TGFB1. В этом варианте осуществления панель может содержать один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать, двадцать один, двадцать два, двадцать три, двадцать четыре, двадцать пять, двадцать шесть, двадцать семь, двадцать восемь, двадцать девять, тридцать, тридцать один, тридцать два, тридцать три или тридцать четыре из перечисленных маркерных антигенов опухолей. В рамках изобретения, панель может также содержать MMP9, AIF1, EpCAM или CDKN1B и может содержать один, два, три или четыре из этих маркерных антигенов опухолей. В вариантах осуществления, где два или три из этих маркерных антигенов опухолей включены в панель, предусмотрены все комбинации из двух или трех из этих антигенов. В конкретных вариантах осуществления панель может содержать MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B.
В одном варианте осуществления, панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может содержать MMP9, AIF1, EpCAM, NY-ESO-1, HSPA4, виментин, HNRNP-L и трансферрин. В другом варианте осуществления панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может состоять из MMP9, AIF1, EpCAM, NY-ESO-1, HSPA4, виментина, HNRNP-L и трансферрина.
В другом варианте осуществления, панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может содержать AIF1, EpCAM, HSPA4 и CPS1. В другом варианте осуществления панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может состоять из AIF1, EpCAM, HSPA4 и CPS1.
В следующем варианте осуществления, панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может содержать EpCAM, NY-ESO-1, виментин, HSPA2, HSPA4 и HNRNP-L. В другом варианте осуществления панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может состоять из EpCAM, NY-ESO-1, виментина, HSPA2, HSPA4 и HNRNP-L.
В дополнительном варианте осуществления, панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может содержать MMP9, AIF1, EpCAM, DDX3X, SALL4, MAGE A4, NY-ESO-1, CAGE, RalA и SOX2. В другом варианте осуществления панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может состоять из MMP9, AIF1, EpCAM, DDX3X, SALL4, MAGE A4, NY-ESO-1, CAGE, RalA и SOX2.
В дополнительном варианте осуществления, панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может содержать EpCAM, CAGE, SOX2, RalA, MAGE A4, DDX3X и NY-ESO-1. В другом варианте осуществления панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может состоять из EpCAM, CAGE, SOX2, RalA, MAGE A4, DDX3X и NY-ESO-1.
В дополнительном варианте осуществления, панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может содержать AIF1, CAGE, HSPD1, SOX2, SALL4, HSPA4 и трансферрин. В другом варианте осуществления панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может состоять из AIF1, CAGE, HSPD1, SOX2, SALL4, HSPA4 и трансферрина.
В конкретных вариантах осуществления, панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может отличаться в зависимости от пола субъекта, т.е., является ли субъект мужчиной или женщиной. В этом варианте осуществления панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может содержать или состоять из AIF1, EpCAM, HSPA4 и CPS1, или AIF1, CAGE, HSPD1, SOX2, SALL4, HSPA4 и трансферрина, когда субъект является женщиной. Кроме того, в этом варианте осуществления, панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может содержать или состоять из EpCAM, NY-ESO-1, виментина, HSPA2, HSPA4 и HNRNP-L, или EpCAM, CAGE, SOX2, RalA, MAGE A4, DDX3X и NY-ESO-1, когда субъект является мужчиной.
В конкретном варианте осуществления, панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может содержать NY-ESO-1, виментин, HSPA4, трансферрин, HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, циклин B1, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoA1, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, пролактин, RGN, SPP1, SSX2 и TGFB1. В рамках изобретения, панель может также содержать MMP9, AIF1, EpCAM или CDKN1B, и может содержать один, два, три или четыре из этих маркерных антигенов опухолей. В вариантах осуществления, где два или три из этих маркерных антигенов опухолей включены в панель, предусмотрены все комбинации из двух или трех из этих антигенов.
В конкретных вариантах осуществления панель может содержать MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B. Например, панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может содержать MMP9, AIF1, EpCAM, CDKN1B, NY-ESO-1, виментин, HSPA4, трансферрин, HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, циклин B1, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoA1, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, пролактин, RGN, SPP1, SSX2 и TGFB1.
В конкретном варианте осуществления панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может состоять из MMP9, AIF1, EpCAM, CDKN1B, NY-ESO-1, виментина, HSPA4, трансферрина, HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, циклина B1, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoA1, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, пролактин, RGN, SPP1, SSX2 и TGFB1.
В конкретном варианте осуществления панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может содержать CAGE, NY-ESO-1, MMP9, трансферрин, MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, циклин B1, EpCAM, DDX3X, и AIF1. В другом варианте осуществления панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может состоять из CAGE, NY-ESO-1, MMP9, трансферрина, MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, циклина B1, EpCAM, DDX3X и AIF1.
В конкретном варианте осуществления панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может содержать CAGE, NY-ESO-1, MMP9, трансферрин, MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, циклин B1, EpCAM, DDX3X, AIF1, SOX2 и AFP. В другом варианте осуществления панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может состоять из CAGE, NY-ESO-1, MMP9, трансферрина, MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, циклина B1, EpCAM, DDX3X, AIF1 SOX2 и AFP.
Дополнительные стадии скрининга
В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения, способы по изобретению могут дополнительно включать скрининг дополнительного маркера, ассоциированного с раком печени. В этом варианте осуществления предусмотрен любой способ скрининга любого маркера, как известно, ассоциированного с раком печени.
Например, способ может дополнительно включать детекцию альфа-фетопротеина (AFP), дез-гамма-карбоксипротромбина (DCP) или реакционноспособного по отношению к лектину альфа-фетопротеина (AFP-L3) в тестируемом образце, содержащем физиологическую жидкость от субъекта-млекопитающего. Предпочтительно, физиологическая жидкость представляет собой кровь. В вариантах осуществления, в которых способ дополнительно включает детекцию альфа-фетопротеина (AFP) в тестируемом образце, содержащем физиологическую жидкость от субъекта-млекопитающего, физиологическая жидкость, предпочтительно, представляет собой кровь, и порог отсечения 200 нг/мл предпочтительно используют для оценки положительности.
Титрование антигена
В WO2006/126008 (содержание которой приведено в настоящем описании в качестве ссылки), определили, что производительность, и более конкретно, клиническую полезность и надежность, анализов, основанных на детекции аутоантител в качестве биологических маркеров заболевания, можно очень сильно улучшать посредством включения стадии титрования антигена. Посредством тестирования образца, как подозревают, содержащего аутоантитела, против серии различных количеств антигена, и построения кривой титрования, можно надежно идентифицировать истинноположительные результаты скрининга, независимо от абсолютного количества аутоантитела, присутствующего в образце. Способ титрования антигена из WO2006/126008 обеспечивает большую специфичность и чувствительность, чем измерение реакционной способности аутоантитела при одной концентрации антигена, или способы, в которых титруют образец сыворотки, а не антиген.
В конкретных вариантах осуществления, изобретение таким образом, относится к способам, где маркерный антиген опухоли представлен во множестве различных количеств, и где способ включает стадии:
(a) приведения тестируемого образца в контакт со множеством различных количеств маркерного антигена опухоли;
(b) определения присутствия или отсутствия комплексов маркерного антигена опухоли, связанного с аутоантителами, присутствующими в тестируемом образце;
(c) детекции уровня специфического связывания между маркерным антигеном опухоли и аутоантителами;
(d) построения или расчета кривой уровня специфического связывания в зависимости от количества маркерного антигена опухоли для каждого количества маркерного антигена опухоли, использованного на стадии (a); и
(e) определения присутствия или отсутствия аутоантитела на основании уровня специфического связывания между маркерным антигеном опухоли и аутоантителом при каждом использованном различном количестве маркерного антигена опухоли.
На практике различные количества маркерного антигена опухоли, как правило, предоставляют посредством изменения используемой концентрации маркерного антигена опухоли. Таким образом, термины «различное количество» и «различная концентрация» можно использовать взаимозаменяемо. Однако в рамках изобретения, предусматривают любой способ изменения количества маркерного антигена опухоли. Специалисту в данной области понятно, что в способе по изобретению количество антигенных детерминант или эпитопов, доступных для связывания с аутоантителом-мишенью, является важным для разработки серий титрования (т.е. набора антигенов, представленных в различных количествах). Во многих форматах количество антигенных детерминант или эпитопов, доступных для связывания, напрямую коррелирует с количеством присутствующих молекул антигена. Однако в других вариантах осуществления, таких как определенные твердофазные системы анализа, количество экспонированных антигенных детерминант или эпитопов может не коррелировать напрямую с количеством антигена, но может зависеть от других факторов, таких как присоединение к твердой поверхности и конформационное представление. В этих вариантах осуществления, ссылки в настоящем описании на «различные количества антигена» в сериях титрования можно принимать как обозначающие различные количества антигенной детерминанты или эпитопа. В конкретных вариантах осуществления, варианты количества антигена можно осуществлять посредством изменения плотности антигена или эпитопа, против которого тестируют образец, или посредством сохранения плотности антигена или эпитопа, но увеличения площади поверхности, на которой иммобилизован антиген, или и того, и другого.
В этом варианте осуществления, «набор антигенов» относится к одному антигену, подлежащему тестированию, в различных количествах в способе по изобретению.
В вариантах осуществления, где предусмотрено множество антигенов, «набор отдельных антигенов» относится к отдельному антигену, подлежащему тестированию, в различных количествах в способе по изобретению, где каждый антиген представляет собой «отдельный антиген», происходящие из различных белков или полипептидов (такие как антигены, происходящие из неродственных белков, кодируемых различными генами), как определено выше. Данный микромассив может включать исключительные наборы из отдельных антигенов, происходящих из различных белков или полипептидов, или исключительные наборы из отдельных антигенов, происходящих из различных пептидных эпитопов одного белка или полипептида, или смесь из двух в любом соотношении. Следует отметить, что каждый индивидуальный набор антигенов в различных количествах из любого варианта осуществления изобретения, как правило, содержит только один антиген, а не их смеси.
Набор вариантов антигенов относится к одному варианту антигена, подлежащего тестированию, в различных количествах в способе по изобретению.
В конкретных вариантах осуществления, присутствие или отсутствие аутоантитела можно определять на основании объединенных значений уровня специфического связывания для всех использованных количеств маркерного антигена опухоли. В способах по изобретению, относительный или абсолютный уровень специфического связывания между аутоантителом и антигеном определяют для каждого тестированного различного количества антигена (антигенной детерминанты или эпитопа) и используют для построения или расчета кривой (относительного или абсолютного) уровня специфического связывания в зависимости от количества антигена для каждого тестированного количества антигена. Присутствие в тестируемом образце аутоантитела, реакционноспособного по отношению к антигену, используемому в анализе, определяют на основании уровня специфического связывания, наблюдаемого при каждом количестве антигена и, как правило, указывают посредством кривой зависимости ответа от дозы, которая, как правило, является S-образной или сигмоидной. Таким образом, в конкретных вариантах осуществления, присутствие или отсутствие аутоантитела определяют посредством скрининга графика по присутствию кривой зависимости ответа от дозы, как правило, такой как S-образная или сигмоидная кривая. Если не присутствует различий в поддающемся детекции связывании для различных количеств тестируемого антигена, тогда это можно оценивать как отсутствие поддающегося детекции количества аутоантитела.
В одном варианте осуществления, присутствие или отсутствие аутоантитела определяют посредством сравнения уровня специфического связывания между аутоантителом и антигеном с значениями предопределенного порога отсечения. В настоящем описании, строят кривую уровня специфического связывания в зависимости от количества антигена для каждого количества антигена, использованного в сериях титрования, и уровень связывания в известных положительных образцах (например, в популяциях пациентов с заболеванием) сравнивают с уровнем связывания, наблюдаемым в известных отрицательных образцах (например, от нормальных индивидуумов) в исследованиях случай-контроль. Выбирают пороги отсечения связывания аутоантитела в одной или нескольких точках на кривой титрования, которые максимизируют чувствительность (небольшое количество ложноотрицательных результатов) с сохранением в то же время высокой специфичности (небольшое количество ложноположительных результатов). При условии, что кривая уровня специфического связывания в зависимости от количества антигена для каждого количества антигена, использованного в сериях титрования, представляет собой кривую зависимости ответа от дозы, измерение считают положительным, если уровень специфического связывания определенный для одной или нескольких точек на кривой титрования, выше значения предопределенного порога отсечения для точки. В конкретных вариантах осуществления предопределенный порог отсечения можно определять посредством выбора порога отсечения, дающего наибольший индекс Юдена, с сохранением в то же время специфичности более 90%.
Следует отметить, что вариант осуществления титрования антигена можно использовать во всех способах по изобретению, включая способы детекции аутоантитела, способы детекции рака печени, способы диагностики и лечения рака печени, способы прогнозирования ответа на лечение против рака печени и способы определения профиля антител. Кроме того, титрование антигена можно использовать в вариантах осуществления, где детектируют только отдельное аутоантитело, так же как в вариантах осуществления, где панель антигенов используют для детекции множества аутоантител.
Двойной порог отсечения
Является общепринятым, что чувствительность анализа можно увеличивать посредством измерения аутоантител против множества антигенов. Однако эта увеличенная чувствительность обычно ассоциирована с пропорциональным уменьшением специфичности, и способы анализа могут, таким образом, являться ограниченными по количеству антигенов, которое можно в них использовать. В конкретных вариантах осуществления настоящего способа, уменьшение специфичности можно учитывать с использованием способа титрования антигена, в котором определяют уровень специфического связывания между аутоантителом и антигеном, и оценку вторичного параметра кривой, где рассматривают как положительные только результаты теста, когда, по сравнению с порогом отсечения, баллы для обоих из этих показателей классифицируют как положительные. Этот способ может быть обозначен в настоящем описании как способ «двойного порога отсечения» и полностью описан в WO2015/193678 (содержание которой приведено в настоящем описании в качестве ссылки).
В конкретных вариантах осуществления способы по изобретению дополнительно включают стадии:
(d1) расчета вторичного параметра кривой из кривой, построенной или рассчитанной на стадии (c); и
(e) определения присутствия или отсутствия аутоантитела на основании комбинации:
(i) уровня специфического связывания между аутоантителом и маркерным антигеном опухоли, определенного на стадии (b); и
(ii) вторичного параметра кривой, определенного на стадии (d1).
В способе двойного порога отсечения используют способ титрования антигена, описанный выше. После детекции уровня связывания антигена/аутоантитела при каждом количестве антигена, использованного в сериях титрования, и построения кривой уровня специфического связывания в зависимости от количества антигена для каждого количества антигена, использованного в сериях титрования, рассчитывают вторичный параметр кривой. Вторичный параметр кривой можно рассчитывать либо из линейной, либо из логарифмической кривой регрессии. В настоящем описании вторичный параметр кривой представляет собой любое рассчитанное значение, обеспечивающее показатель характера кривой. Например, вторичный параметр кривой может представлять собой угол наклона кривой, точку пересечения с осью, AUC, максимальный угол наклона кривой или константу диссоциации (Kd). Эти вторичные параметры кривой проиллюстрированы на фигуре 1.
Угол наклона кривой рассчитывают с использованием уравнения:
где b представляет собой угол наклона кривой, x относится к концентрации антигена (нМ), и y относится к значению OD в единицах оптической плотности (AU).
Угол наклона кривой можно рассчитывать либо из линейных, либо из логарифмических кривых регрессии, или как из линейных, так и из логарифмических кривых регрессии, для каждого образца.
Точка пересечения с осью линии регрессии представляет собой значение этой линии на y-оси, когда x=0.
Точку пересечения с осью можно рассчитывать либо из линейных, либо из логарифмических кривых регрессии, или как из линейных, так и из логарифмических кривых регрессии, для каждого образца.
AUC можно рассчитывать с использованием суммарного правила трапеций, которое можно осуществлять посредством определения определенного интеграла для каждого набора концентраций антигенов, следуя формуле:
Этот расчет повторяют для каждой пары последовательных концентраций антигена, и полученные значения суммируют для получения общего значения AUC.
AUC можно рассчитывать либо из линейных, либо из логарифмических кривых регрессии, или как из линейных, так и из логарифмических кривых регрессии, для каждого образца.
Максимальный угол наклона кривой можно рассчитывать с использованием такой же формулы, как для угла наклона кривой, обсуждаемой выше. Однако для определения наибольшего возможного значения угла наклона кривой для каждого образца, значение угла наклона кривой получают для каждой пары последовательных концентраций антигена, где наибольший размах значения угла наклона кривой представляет максимальный угол наклона кривой.
Максимальный угол наклона кривой можно рассчитывать либо из линейных, либо из логарифмических кривых регрессии, или как из линейных, так и из логарифмических кривых регрессии, для каждого образца.
Константу диссоциации (Kd) можно рассчитывать посредством подбора четырехпараметрической логистической кривой для каждого набора точек титрования, и способ итерационного решения используют для получения значений параметров для минимальной асимптоты (A), фактора угла наклона кривой (B), точки перегиба (C) и максимальной асимптоты (D) с использованием формулы F(x)=((A-D)/(1+((x/C)^B)))+D, при этом сумму квадратов остатков минимизируют. Точка перегиба для этих разрешенных данных соответствует Kd связывания антигена/аутоантитела.
В конкретных вариантах осуществления вторичный параметр кривой можно определять посредством подбора логистической кривой, такой как 4-параметрическая логистическая кривая, для кривой уровня специфического связывания в зависимости от количества антигена для каждого количества антигена, использованного в сериях титрования. В этом варианте осуществления вторичный параметр кривой может представлять собой максимальную асимптоту, минимальную асимптоту, угловой коэффициент Хилла (или фактор угла наклона кривой) или точку перегиба.
4-параметрическая логистическая (4PL) кривая представляет собой кривую, определенную формулой:
F(x)=((A-D)/(1+((x/C)^B)))+D,
где A=минимальная асимптота, B=угловой коэффициент Хилла (или фактор угла наклона кривой), C=точка перегиба и D=максимальная асимптота.
Для определения вторичных параметров кривой в этом варианте осуществления, 4PL кривую рассчитывают для каждого образца и антигена с использованием функции итерационного решения. В настоящем описании 4 параметра устанавливают на значения около ожидаемого значения для каждого, со следующими ограничениями: значение минимальной асимптоты фиксировано на 0, значение углового коэффициента Хилла ограничено положительными значениями, и точка перегиба ограничена максимальным значением 1000.
Затем можно рассчитать различие между каждой точкой на кривой титрования и соответствующей точкой на 4PL кривой (возвращаемое формулой F(x)=((A-D)/(1+((x/C)^B)))+D), возвести различия в квадрат, и суммировать значения всех квадратов различий.
Затем значения, используемые для 4 вторичных параметров кривой, корректируют, и сумму квадратов отклонений от среднего значения рассчитывают повторно итерационным способом, пока сумма квадратов отклонений от среднего значения не станет настолько близкой к нулю, насколько возможно. Итерационное решение можно осуществлять с использованием функции SOLVER из Microsoft Excel.
После получения вторичного параметра кривой, его можно комбинировать с данными связывания антигена/аутоантитела для определения присутствия или отсутствия аутоантитела. В настоящем описании, уровень специфического связывания между аутоантителом и антигеном можно сравнивать с предопределенным порогом отсечения, как описано выше.
Порог отсечения для вторичного параметра кривой определяют с использованием известных положительных образцов (например, набора из набора выборок случай-контроль, состоящих из когорты пациентов с заболеванием) и известных отрицательных образцов (например, когорты нормальных индивидуумов в исследованиях случай-контроль). Для каждого образца строят кривую уровня специфического связывания в зависимости от количества антигена для каждого количества антигена, использованного в сериях титрования, и вторичный параметр кривой, наблюдаемый в известном положительном образце (например, у пациентов с заболеванием) сравнивают с вторичным параметром кривой, наблюдаемым в известном отрицательном образце (например, у нормальных индивидуумов). Выбирают пороги отсечения для вторичных параметров кривой, максимизирующие специфичность (небольшое количество ложноположительных результатов) при использовании в комбинации с порогом отсечения для связывания антигена/аутоантитела, обсуждаемым выше.
После расчета порога отсечения для вторичного параметра кривой, определяют также направленность, необходимую для положительного считывания, т.е. считать ли положительным значение выше или ниже порога отсечения. Направленность, необходимая для положительного считывания, зависит от антигена и вторичного параметра кривой.
Измерение считают положительным в конечном счете, т.е. показателем присутствия аутоантитела в тестируемом образце, если оно как выше порога отсечения для связывания антигена/аутоантитела, так и имеет направленность, необходимую для положительного считывания, по сравнению с порогом отсечения для вторичного параметра кривой.
Как дополнительно описано в WO2015/193678 (содержание которой приведено в настоящем описании в качестве ссылки), включение вторичного параметра кривой в способ анализа увеличивает специфичность иммуноанализа, увеличивая прогностическую ценность положительного результата (PPV), по сравнению с альтернативными способами, основанными только на уровне специфического связывания с аутоантителом в тестируемом образце.
Следует понимать, что несмотря на то, что описание способа двойного порога отсечения, включенное в настоящее описание, сфокусировано на использовании одного вторичного параметра кривой в комбинации с измерением количества связывания антигена/аутоантитела, предусматривают использование множества вторичных параметров кривой. Таким образом, в конкретных вариантах осуществления, в способах по изобретению используют два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или более вторичных параметров кривой.
Способ двойного порога отсечения обеспечивает преимущества для использования в клинических диагностических, прогностических, предсказательных и/или мониторирующих анализах, где абсолютные количества присутствующего аутоантитела-мишени и уровень связывания, наблюдаемый в отсутствие аутоантитела-мишени, может быть невероятно изменчивым от пациента к пациенту. Если такие анализы основаны на детекции связывания аутоантитела с использованием одного количества/концентрации тестируемого антигена, образцы от пациентов, содержащие количество аутоантитела, находящееся на самом нижнем или на самом верхнем конце нормального физиологического диапазона количества аутоантител в популяции, можно пропустить из-за ограничений способа анализа; образцы с низким количеством аутоантитела могут быть оценены в баллах как ложноотрицательные результаты, в то время как образцы с очень высокими уровнями аутоантитела могут выпадать из шкалы точной детекции в рамках выбранного способа анализа. При использовании способа титрования в комбинации с расчетом вторичного параметра кривой можно учитывать эти наблюдаемые различия в уровнях аутоантител и различия в уровнях связывания.
Следует отметить, что варианты осуществления двойного порога отсечения можно использовать со всеми способами по изобретению, включая способы детекции аутоантитела, способы детекции рака печени, способы диагностики и лечения рака печени, способы прогнозирования ответа на лечение против рака печени и способы определения профиля антител. Кроме того, способ двойного порога отсечения можно использовать в вариантах осуществления, где детектируют только одно аутоантитело, так же как в вариантах осуществления, где панель антигенов используют для детекции множества аутоантител. Следует отметить, что в варианте осуществления панели вторичный параметр кривой, рассчитанный для каждого антигена в панели, не обязательно должен являться одинаковым. Однако в некоторых вариантах осуществления, вторичный параметр кривой, рассчитанный для каждого антигена в панели, может являться одинаковым.
Форматы анализа
Общие свойства иммуноанализов, например, ELISA, радиоиммунных анализов и т.п., хорошо известны специалистам в данной области (см. Immunoassay, E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996, содержание которого приведено в настоящем описании в качестве ссылки).
Иммуноанализы для детекции аутоантител, имеющих конкретную иммунологическую специфичность, как правило, требуют использования реагента (антигена), имеющего специфическую иммунологическую реакционную способность для соответствующего аутоантитела. В зависимости от формата анализа, этот антиген может являться иммобилизованным на твердой подложке. Тестируемый образец приводят в контакт с антигеном, и если аутоантитела необходимой иммунологической специфичности присутствуют в образце, они могут вступать в иммунологическую реакции с антигеном для формирования комплексов антигена/аутоантитела, которые можно затем детектировать или измерять количественно.
Способы по изобретению можно осуществлять в любом подходящем формате, позволяющем контакт между тестируемым образцом, как подозревают, содержащим аутоантитело, и антигеном. Удобным образом, контакт между тестируемым образцом и антигеном может происходить в отдельных реакционных камерах, таких как лунки планшета для микротитрования, позволяя параллельный анализ различных антигенов или различных количеств антигена, при необходимости. В вариантах осуществления, в которых необходимы различные количества антигена, ими можно покрывать лунки планшета для микротитрования посредством подготовки серийных разведений из раствора для хранения антигена в лунках планшета для микротитрования. Раствор для хранения антигена может иметь известную или неизвестную концентрацию. Затем аликвоты тестируемого образца можно добавлять в лунки планшета, сохраняя объем и разведение тестируемого образца постоянными в каждой лунке. Абсолютные количества антигена, добавленные в лунки планшета для микротитрования, можно менять в зависимости от таких факторов, как характер аутоантитела-мишени, характер тестируемого образца, разведение тестируемого образца и т.д. как понятно специалисту в данной области. Как правило, количества антигена и разведение тестируемого образца выбирают таким образом, чтобы получать диапазон силы сигналов, попадающий в приемлемый диапазон детекции считывания, выбранный для детекции связывания антигена/аутоантитела в способе. Удобным образом, тестируемые количества антигена может меняться в диапазоне от 1,6 нМ до 160 мМ.
В следующем варианте осуществления изобретения антиген может быть иммобилизован в отдельной локализации или участке реакции на твердой подложке. В вариантах осуществления, где необходимы различные количества антигена, каждое из них может быть иммобилизовано каждое из них может быть иммобилизовано в отдельных локализациях или участках реакции на твердой подложке. Затем всю подложку можно приводить в контакт с тестируемым образцом, и связывание аутоантитела с антигеном детектировать или измерять отдельно в каждой из отдельных локализаций или участках реакции. Подходящие твердые подложки включают микромассивы. Когда необходимы различные количества антигена, микромассивы можно получать посредством иммобилизации различных количеств конкретного антигена в отдельных, различимых участках реакции на массиве. В других вариантах осуществления фактическое количество иммобилизованных молекул антигена можно поддерживать по существу постоянным, но менять размер участков или пятен на массиве, чтобы изменять количество доступных связывающих эпитопов, обеспечивая серии титрования из участков или пятен различными количествами доступного связывающего эпитопа. В таких вариантах осуществления концентрация на двумерной поверхности связывающего эпитопа(эпитопов) на антигене является важной для получения серий титрования, а не абсолютное количество антигена. Способы получения и запроса белковых/пептидных микромассивов в основном известны в данной области.
Микромассивы можно использовать для проведения множества анализов аутоантител различной специфичности параллельно на одном образце. Это можно осуществлять с использованием массивов, содержащих множество антигенов или наборов антигенов.
Конкретные антигены могут содержать или могут происходить из белков или полипептидов, выделенных из природных источников, включая, но без ограничения, белки или полипептиды, выделенные из тканей или физиологических жидкостей пациента (например, плазмы, сыворотки, цельной крови, мочи, пота, лимфы, фекалий, спинномозговой жидкости, асцитной жидкости, плеврального выпота, семенной жидкости, мокроты, аспирата из сосков, послеоперационной серомы и жидкости от дренирования раны). В таких вариантах осуществления антиген может содержать в основном полностью природный белок, т.е. белок, в основном, в форме, в которой он выделен из природного источника, или он может содержать фрагмент природного белка. Чтобы является эффективным в качестве антигена в способе по изобретению, любой такой фрагмент должен сохранять иммунологическую реакционную способность по отношению к аутоантителам, для тестирования которых его будут использовать. Подходящие фрагменты можно, например, получать посредством химического или ферментного расщепления выделенного белка.
В конкретных вариантах осуществления, и в зависимости от точного характера анализа, в котором он будет использован, антиген может содержать природный белок или его фрагмент, связанный с одной или несколькими дополнительными молекулами, которые придают некоторые желательные характеристики, естественным образом не присутствующие в белке. Например, белок или фрагмент может являться конъюгированным с выявляющей меткой, например, такой как флуоресцентная метка, окрашенная метка, люминесцентная метка, радиоактивная метка или тяжелый металл, такой как коллоидное золото. В других вариантах осуществления белок или фрагмент можно экспрессировать в форме полученного рекомбинантным способом слитого белка. В качестве примера, слитые белки могут включать пептидную метку на N- или C-конце, чтобы способствовать очистке экспрессированного рекомбинантным способом антигена.
В зависимости от формата анализа, в котором он будет использован, антиген может быть иммобилизован на твердой подложке например, такой как чип, предметное стекло, лунки планшета для микротитрования, бусина, мембрана или наночастица. Иммобилизацию можно осуществлять посредством нековалентной абсорбции, ковалентного присоединения или посредством меток.
Можно использовать любые подходящие способы присоединения, не оказывающие неблагоприятное влияние на способность антигена вступать в иммунологическую реакцию с аутоантителом-мишенью в значительной степени.
Изобретение не является ограниченным твердофазными анализами, но также включает анализы, которые, полностью или частично, осуществляют в жидкой фазе, например, анализы бусин в фазе раствора или конкурентные анализы.
В одном варианте осуществления, антигены могут являться меченными лигандом, способствующим иммобилизации, таким как биотин. Затем антиген можно разводить до подходящего диапазона титрования и позволять вступать в реакцию с аутоантителами в образцах от пациента в растворе. Полученные иммунныые комплексы можно затем иммобилизовывать на твердой подложке посредством взаимодействия лиганд-рецептор (например, биотин-стрептавидин), и остальной анализ проводить, как описано ниже.
Чтобы способствовать получению биотинилированных антигенов для использования в способах анализа по изобретению, кДНК, кодирующие полноразмерный антиген, его укороченный вариант или его антигенный фрагмент, можно экспрессировать в форме слитого белка, меченного с использованием белковой или полипептидной метки, к которой можно присоединять биотиновый кофактор, например, посредством ферментной реакции.
Векторы для получения рекомбинантных биотинилированных антигенов являются коммерчески доступными из ряда источников. Альтернативно, биотинилированные антигены можно получать посредством ковалентного связывания биотина с молекулой антигена после экспрессии и очистки.
Как указано выше, иммуноанализ, используемый для детекции аутоантител по изобретению, может быть основан на стандартных способах, известных в данной области. В наиболее предпочтительном варианте осуществления, иммуноанализ может представлять собой ELISA. ELISA, как правило, хорошо известны в данной области. В типичных непрямых ELISA антиген, имеющий специфичность для тестируемых аутоантител, иммобилизуют на твердой поверхности (например, в лунках стандартного планшета для анализа микротитрования, или на поверхности микробусины или микромассива), и образец, содержащий физиологическую жидкость, подлежащую тестированию на присутствие аутоантител, приводят в контакт с иммобилизованным антигеном. Любые аутоантитела желательной специфичности, присутствующие в образце, связываются с иммобилизованным антигеном. Затем комплексы связанных антигена/аутоантитела можно детектировать с использованием любого подходящего способа. В одном предпочтительном варианте осуществления меченое вторичное антитело против иммуноглобулина человека, которое специфически узнает эпитоп, общий для одного или нескольких классов иммуноглобулинов человека, используют для детекции комплексов антигена/аутоантитела. Как правило, вторичное антитело может представлять антитело против IgG или против IgM. Вторичное антитело обычно является меченным поддающимся детекции маркером, как правило, ферментным маркером, например, таким как пероксидаза или щелочная фосфатаза, позволяющим количественную детекцию посредством добавления субстрата для фермента, образующего поддающийся детекции продукт, например, окрашенный, хемилюминесцентный или флуоресцентный продукт. Другие типы поддающихся детекции меток, известных в данной области, можно использовать с эквивалентным эффектом.
Применение способа по изобретению
Настоящее изобретение относится к применению маркерного антигена опухоли, выбранного из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B, в способе детекции рака печени у субъекта-млекопитающего посредством детекции аутоантитела, иммунологически специфического для MMP9, AIF1, EpCAM или CDKN1B, в тестируемом образце, содержащем физиологическую жидкость от субъекта-млекопитающего, где способ включает стадии:
(a) приведения тестируемого образца в контакт с маркерным антигеном опухоли, выбранным из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B; и
(b) определения присутствия или отсутствия комплексов маркерного антигена опухоли, связанного с аутоантителами, присутствующими в тестируемом образце;
при этом присутствие указанных комплексов является показателем присутствия рака печени.
В этом варианте осуществления изобретения, все ограничения, обсуждаемые выше применительно к различным способам по изобретению, предусмотрены применительно к этому применению.
Способы анализа по изобретению можно использовать во множестве различных клинических ситуациях. В частности, способ можно использовать в детекции или диагностике рака печени, в оценке прогноза для пациента с диагнозом рак печени, в прогнозировании ответа на терапию, в мониторировании прогрессирования рака печени у пациента, в скрининге популяции бессимптомных субъектов-людей для диагностики присутствия рака печени, в прогнозировании ответа пациента с раком печени на лечение против рака печени (например, химиотерапию, радиочастотную абляцию, резекцию печени, трансплантацию печени, вакцинацию, лекарственные средства против факторов роста или передачи сигнала, эндокринную терапию, терапию человеческим антителом, транскатетерную артериальную химиоэмболизацию, чрескожную инъекцию этанола, микроволновую абляцию, введение сорафениба и радиоэмболизацию), в мониторировании ответа пациента с раком печени на лечение против рака печени (например, химиотерапию, радиочастотную абляцию, резекцию печени, трансплантацию печени, вакцинацию, лекарственные средства против факторов роста или передачи сигнала, эндокринную терапию, терапию человеческим антителом, транскатетерную артериальную химиоэмболизацию, чрескожную инъекцию этанола, микроволновую абляцию, введение сорафениба и радиоэмболизацию), в детекции рецидивирующего заболевания у пациента, ранее диагностированного как имеющего рак печени, которого подвергали лечению против рака печени для уменьшения уровня присутствующего рака печени, в выборе терапии против рака печени (например, химиотерапии, радиочастотной абляции, резекции печени, трансплантации печени, вакцинации, лекарственных средств против факторов роста или передачи сигнала, эндокринной терапии, терапии человеческим антителом, транскатетерной артериальной химиоэмболизации, чрескожной инъекции этанола, микроволновой абляции, введения сорафениба и радиоэмболизации) для использования у конкретного пациента, или в определении профиля антител у пациента, имеющего или как подозревают, имеющего рак печени.
Наборы
Настоящее изобретение относится к набору, пригодному для осуществления любого из способов по изобретению где набор содержит
(a) один или несколько маркерных антигенов опухолей; и
(b) реагент, способный к детекции комплексов маркерного антигена опухоли, связанного с аутоантителами, присутствующими в тестированном образце.
Изобретение также относится к набору для детекции аутоантител в тестируемом образце, содержащем физиологическую жидкость от субъекта-млекопитающего, содержащему:
(a) маркерный антиген опухоли, выбранный из группы, состоящей из MMP9, AIF1 EpCAM и CDKN1B; и
(b) реагент, способный к детекции комплексов маркерного антигена опухоли, связанного с аутоантителами, присутствующими в тестированном образце.
В конкретных вариантах осуществления набор может дополнительно содержать:
(c) средства для приведения маркерного антигена опухоли в контакт с тестируемым образцом, содержащим физиологическую жидкость от субъекта-млекопитающего.
Примеры средств для приведения маркерного антигена опухоли в контакт с тестируемым образцом, содержащим физиологическую жидкость от субъекта-млекопитающего, включают иммобилизацию маркерного антигена опухоли на чипе, предметном стекле, лунках планшета для микротитрования, бусине, мембране или наночастице.
В некоторых вариантах осуществления маркерный антиген опухоли в наборе может присутствовать в панели из двух или более маркерных антигенов опухолей. В этом варианте осуществления, набор может содержать два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать, двадцать один, двадцать два, двадцать три, двадцать четыре, двадцать пять, двадцать шесть, двадцать семь, двадцать восемь, двадцать девять, тридцать, тридцать один, тридцать два, тридцать три, тридцать четыре, тридцать пять, тридцать шесть, тридцать семь, тридцать восемь или более антигенов. Эти антигены могут представлять собой отдельные антигены, где отдельные антигены представляют собой антигены, происходящие из различных белков или полипептидов (такие как антигены, происходящие из неродственных белков, кодируемых различными генами) или антигены, происходящие из различных пептидных эпитопов одного белка или полипептида, как определено выше.
В одном варианте осуществления, панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может содержать MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B. В конкретном специфическом варианте осуществления, панель может состоять из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B.
В одном варианте осуществления, панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может содержать один или несколько маркерных антигенов опухолей, выбранных из группы, состоящей из NY-ESO-1, виментина, HSPA4, трансферрина, HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, циклина B1, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoA1, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, пролактина, RGN, SPP1, SSX2 и TGFB1. В этом варианте осуществления панель может содержать один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать, двадцать один, двадцать два, двадцать три, двадцать четыре, двадцать пять, двадцать шесть, двадцать семь, двадцать восемь, двадцать девять, тридцать, тридцать один, тридцать два, тридцать три или тридцать четыре из перечисленных маркерных антигенов опухолей. В рамках изобретения, панель может также содержать MMP9, AIF1, EpCAM или CDKN1B и может содержать один, два, три или четыре из этих маркерных антигенов опухолей. В вариантах осуществления, где два или три из этих маркерных антигенов опухолей включены в панель, предусматривают все комбинации из двух или трех из этих антигенов. В конкретных вариантах осуществления панель может содержать MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B.
В одном варианте осуществления, панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может содержать MMP9, AIF1, EpCAM, NY-ESO-1, HSPA4, виментин, HNRNP-L и трансферрин. В другом варианте осуществления панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может состоять из MMP9, AIF1, EpCAM, NY-ESO-1, HSPA4, виментина, HNRNP-L и трансферрина.
В другом варианте осуществления, панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может содержать AIF1, EpCAM, HSPA4 и CPS1. В другом варианте осуществления, панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может состоять из AIF1, EpCAM, HSPA4 и CPS1.
В следующем варианте осуществления, панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может содержать EpCAM, NY-ESO-1, виментин, HSPA2, HSPA4 и HNRNP-L. В другом варианте осуществления, панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может состоять из EpCAM, NY-ESO-1, виментина, HSPA2, HSPA4 и HNRNP-L.
В дополнительном варианте осуществления, панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может содержать MMP9, AIF1, EpCAM, DDX3X, SALL4, MAGE A4, NY-ESO-1, CAGE, RalA и SOX2. В другом варианте осуществления, панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может состоять из MMP9, AIF1, EpCAM, DDX3X, SALL4, MAGE A4, NY-ESO-1, CAGE, RalA и SOX2.
В дополнительном варианте осуществления, панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может содержать EpCAM, CAGE, SOX2, RalA, MAGE A4, DDX3X и NY-ESO-1. В другом варианте осуществления, панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может состоять из EpCAM, CAGE, SOX2, RalA, MAGE A4, DDX3X и NY-ESO-1.
В дополнительном варианте осуществления, панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может содержать AIF1, CAGE, HSPD1, SOX2, SALL4, HSPA4 и трансферрин. В другом варианте осуществления панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может состоять из AIF1, CAGE, HSPD1, SOX2, SALL4, HSPA4 и трансферрина.
В конкретном варианте осуществления, панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может содержать NY-ESO-1, виментин, HSPA4, трансферрин, HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, циклин B1, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoA1, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, пролактин, RGN, SPP1, SSX2 и TGFB1. В рамках изобретения, панель может также содержать MMP9, AIF1, EpCAM или CDKN1B и может содержать один, два, три или четыре из этих маркерных антигенов опухолей. В вариантах осуществления, где два или три из этих маркерных антигенов опухолей включены в панель, предусматривают все комбинации из двух или трех из этих антигенов. В конкретных вариантах осуществления панель может содержать MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B. Например, панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может содержать MMP9, AIF1, EpCAM, CDKN1B, NY-ESO-1, виментин, HSPA4, трансферрин, HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, циклин B1, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoA1, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, пролактин, RGN, SPP1, SSX2 и TGFB1. Альтернативно, панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может состоять из MMP9, AIF1, EpCAM, CDKN1B, NY-ESO-1, виментина, HSPA4, трансферрина, HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, циклина B1, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoA1, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, пролактина, RGN, SPP1, SSX2 и TGFB1.
В конкретном варианте осуществления панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может содержать CAGE, NY-ESO-1, MMP9, трансферрин, MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, циклин B1, EpCAM, DDX3X, и AIF1. В другом варианте осуществления панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может состоять из CAGE, NY-ESO-1, MMP9, трансферрина, MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, циклина B1, EpCAM, DDX3X, и AIF1.
В конкретном варианте осуществления панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может содержать CAGE, NY-ESO-1, MMP9, трансферрин, MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, циклин B1, EpCAM, DDX3X, AIF1, SOX2 и AFP. В другом варианте осуществления панель из двух или более маркерных антигенов опухолей может состоять из CAGE, NY-ESO-1, MMP9, трансферрина, MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, циклина B1, EpCAM, DDX3X, AIF1 SOX2 и AFP.
Набор по изобретению может являться пригодным для детекции рака печени.
В конкретных вариантах осуществления набор может быть предназначен для детекции рака печени.
В наборах по изобретению, физиологическая жидкость может быть выбрана из группы, состоящей из плазмы, сыворотки, цельной крови, мочи, пота, лимфы, фекалий, спинномозговой жидкости, асцитной жидкости, плеврального выпота, семенной жидкости, мокроты, аспирата из сосков, послеоперационной серомы, слюны, амниотической жидкости, слез и жидкости от дренирования раны.
Изобретение можно дополнительно понять со ссылкой на следующие неограничивающие экспериментальные примеры.
Примеры
Пример 1 - общий протокол для измерения аутоантител против ассоциированных с опухолью белков
Образцы маркерных антигенов опухолей можно получать посредством рекомбинантной экспрессии, следуя способам, аналогичным описанным в WO 99/58978 (содержание которых приведено в настоящем описании в качестве ссылки). Кратко, кДНК, кодирующую представляющие интерес маркерные антигены, клонировали в вектор pET21 (Invitrogen), модифицированные для кодирования биотиновой метки и 6x-гистидиновой метки, чтобы способствовать очистке экспрессированного белка. Полученные клоны выращивали в E. coli BL21(DE3), с последующим лизисом бактерий. Экспрессированные антигены выделяли посредством никель-хелатных аффинных колонок (HiTrap, коммерчески доступных из GE Healthcare), следуя протоколу производителя. Чистоту, специфичность и выход экспрессированного белка оценивали посредством SDS-PAGE, Вестерн-блоттинга и анализа белка до хранения.
Отрицательный контрольный белок, VOL, получали посредством трансформации E. coli BL21(DE3) пустым вектором pET21 (т.е., без кДНК, кодирующей ассоциированный с опухолью антиген). Экспрессированный и очищенный белок включает такие же последовательности His-метки и биотиновой метки, как обнаружено на рекомбинантных ассоциированных с опухолью антигенах, и позволяет коррекцию по неспецифическому связыванию аутоантитела с остаточными бактериальными загрязнениями.
Номера доступа в GenBank для ряда маркерных кДНК являются следующими:
AFP: NM_001134.1
AIF1: NM_001623.3
AKR1B10: NM_020299.4.
APOA1: NM_000039.1.
BCL2: NM_000633.2
CAGE: NM_182699
CALR: NM_004343.3
CD44: NM_001001389
CDKN1B: NM_004064.4
CK18: NM_000224
CPS1: NM_001875.4
CCNB1: NM_031966.2
CYCLIN B1: NM_031966.2
DDX3X: NM_001356.3
EpCAM: NM_002354
FUCA1: NM_000147.4
GLUL: NM_001033044.2
HNRNP-A2: NM_002137.3
HNRNP-L: NM_001533.2
HSPA2: NM_021979.3.
HSPA4: NM_002154.3
HSPD1: NM_002156.4
IL8: NM_000584.3
MAGE A4: NM_001011548.1
MDM2: NM_002392.5
MMP9: NM_004994.2.
NPM1: NM_002520.6
NY-ESO-1: NM 001327
PEBP1: NM_002567.2
P62: NM_001007225.1
Пролактин: NM_000948.5
RalA: NM_005402.2
RGN: NM_004683.5
SALL4: NM_020436.3.
SOX2: NM_003106
SPP1: NM_001040058.1
SSX2: NM_175698.1
TGFB1: NM_000660.5
Трансферрин: NM_001063.3
Виментин: NM_003380.3
YWHAZ: NM_001135699.1
Антигены и VOL (отрицательный контроль) разводили до соответствующих концентраций в связывающем буфере с высоким содержанием фосфата, затем разводили для получения либо двух отдельных концентраций белка, как в формате высокопроизводительного анализа (HTPA) (фигура 2A), либо полулогарифмического диапазона титрования, как в формате анализа титрования (фигура 2B). Разведения антигена распределяли по 50 мкл/лунку в рядах планшета для микротитрования Falcon, в соответствии со схемой планшета (фигуры 2A и 2B) с использованием автоматизированной рабочей станции дозирования жидкостей. Планшеты накрывали и хранили при 18-22°C в течение 18-24 час.
Планшеты блокировали с использованием связывающего буфера с желатином из кожи свиньи (PSGBB, PBS+0,1% желатин из кожи свиньи+0,05% азид натрия) при 200 мкл/лунку в течение одного часа. Образцы сыворотки размораживали, встряхивали и разводили 1/110 в PSGBB при 18-22°C. Из планшетов отсасывали жидкость и высушивали постукиванием о бумажные салфетки. Каждый разведенный образец сыворотки распределяли по 50 мкл/лунку во все лунки планшета для микротитрования с использованием автоматизированной рабочей станции дозирования жидкостей. Планшеты накрывали и инкубировали в течение 1,5 часов при комнатной температуре при встряхивании.
Стадия промывки: Планшеты промывали три раза в PBS+0,1% tween 20 с использованием автоматического устройства для промывки планшетов, затем высушивали постукиванием о бумажные салфетки.
Конъюгированное с пероксидазой хрена антитело кролика против иммуноглобулина человека (Dako, 1/5000 в PSGBB) распределяли по 50 мкл/лунку во все лунки планшетов для микротитрования. Затем планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа при встряхивании. Планшеты промывали, как описано выше.
Предварительно подготовленный субстрат TMB добавляли в каждый планшет при 50 мкл/лунку и инкубировали на столе в течение 15 минут. Планшеты осторожно постукивали для перемешивания. Оптическую плотность для каждой лунки определяли при 650 нм с использованием стандартного спектрофотометрического считывателя для планшетов.
Пример 2 - Детекция аутоантител при печеночно-клеточной карциноме (HCC) посредством HTPA
Следующие данные получены в результате пилотного исследования для оценки чувствительности и специфичности анализов панели аутоантител при детекции HCC с использованием формата HTPA. Клинический и демографический статус субъектов, включенных в исследование, приведены в таблицах 1-4.
Таблица 1 - Демографический статус пациентов, включенных в исследование, описанное в примере 2
Таблица 2 - Размер первичной опухоли, присутствующей у пациентов с HCC
Таблица 3 - Стадия опухоли у пациентов с HCC с использованием определения стадий по TNM
TNM=Система TNM определения стадий при классификации злокачественных опухолей; N/A=недоступно
Таблица 4 - Заболевание печени, присутствующее у пациентов с доброкачественным заболеванием печени
Анализ проводили в соответствии с протоколом, приведенным в примере 1, с использованием антигенов, перечисленных в таблице 5. Порог отсечения для анализа определяли посредством выбора порога отсечения, дающего наибольший индекс Юдена с сохранением в то же время специфичности индивидуального маркера более 90%. Результаты показаны в таблице 5, и является очевидным, что для ряда этих маркерных аутоантител показаны более высокие уровни положительности у пациентов с HCC, чем у пациентов с доброкачественным заболеванием печени или у здоровых контрольных индивидуумов, таким образом, они могут иметь способность отличать пациентов с HCC от пациентов без свидетельств злокачественного заболевания.
Кроме того, является очевидным, что измерение панели AAb увеличивает способность отличать пациентов с HCC от пациентов с незлокачественными заболеваниями печени, по сравнению с любым одним AAb отдельно. На панелях 1 и 2 (в таблицах 6 и 10) показано, как можно комбинировать различные наборы AAb для достижения сходной производительности с оптимизацией в то же время определенных характеристик для соответствия различным клиническим нуждам. Панель 1 (таблица 6) содержит маркеры, которые можно использовать для всех пациентов. Оптимизация маркеров, включенных в панели в соответствии с полом, как в панели 2 (таблица 10), увеличивает специфичность по сравнению с панелью 1 с небольшим уменьшением чувствительности. Это показывает возможность построения различных панелей для соответствия различным клиническим нуждам. В таблицах 7 и 11 показано, что каждая из панелей может детектировать пациентов с злокачественными опухолями на стадиях 1 и 2, что представляет собой критическую раннюю диагностику, приводящую к эффективному лечению HCC.
Таблица 5 - Положительность индивидуальных маркерных AAb в каждой группе
Панель 1 - Общая панель
Панель 1 сформирована с использованием улучшения остаточного индекса реклассификации NRI (Net Reclassification Improvement) и содержит маркерные антигены опухолей EpCAM, AIF1 и MMP9 вместе с NY-ESO-1, HSPA4, виментином, HNRNP-L и трансферрином, где результат является положительным, если любой из данных уровней AAb выше его порога отсечения, полученного, как описано в примере 2. В таблицах 6 и 7 показана производительность панели в выборке образцов, описанной в примере 2.
Таблица 6 - Производительность и комплектация панели 1
Таблица 7 - Производительность панели 1 для стадий TNM
Панель 2 - Индивидуальные панели для мужчин и женщин
Панель 2 сформирована посредством разделения выборки образцов, описанной в примере 2, на отдельные группы по полу и проведения отдельного NRI для каждой группы. Панель 2 содержит маркерные антигены опухолей EpCAM, AIF1 и MMP9 вместе с HSPA4, CPS1, NY-ESO-1, виментином, HSPA2 и HNRNP-L. Результат является положительным, если пациент является женщиной, и любые из HSPA4, AIF1, EpCAM или CPS1 выше порога отсечения, полученного, как описано в примере 2, или если пациент является мужчиной, и любые из NY-ESO-1, виментина, EpCAM, HSPA2, HSPA4 или HNRNP-L выше порога отсечения, полученного, как описано в примере 2. В таблицах 10 и 11 показана производительность панели 2 в выборке образцов, описанной в примере 2.
Таблица 8 - Производительность и комплектация панели 2a -женщины
Таблица 9 - Производительность и комплектация панели 2b - мужчины
Таблица 10 - Производительность и комплектация панели 2 - объединенная
Таблица 11 - Производительность панели 2 для стадий TNM
Пример 3 - Дополнительное измерение AFP в комбинации с аутоантителами, измеренными посредством HTPA
Циркулирующий альфа-фетопротеин (AFP) измеряли в образцах сыворотки для выборки образцов, описанной в примере 2, с использованием коммерчески доступного ELISA (Aviva Systems Biology). Общепринятый порог отсечения 200 нг/мл использовали для оценки положительности. В таблице 12 показаны результаты добавления AFP к панелям 1 и 2, показанным в примере 2. Из этих результатов понятно, что производительность AFP в комбинации с панелями AAb больше, чем производительность панелей либо AFP, либо AAb отдельно.
Таблица 12 - Производительность AFP отдельно и при добавлении к панелям, описанным в примере 2
Пример 4 - Детекция аутоантител при печеночно-клеточной карциномы (HCC) посредством анализа титрования
Следующие данные получены из исследования для оценки чувствительности и специфичности анализов панели аутоантител при детекции HCC с использованием формата планшета для титрования (фигура 2B). Клинический и демографический статус субъектов, включенных в исследование, приведен в таблицах 13-16.
Таблица 13 - Демографический статус пациентов, включенных в исследование, описанное в примере 4
Таблица 14 - Размер первичной опухоли, присутствующей у пациентов с HCC
Таблица 15 - Стадия опухоли у пациентов с HCC с использованием определения стадий по TNM
N/A=неприменимо
Таблица 16 - Заболевание печени, присутствующее у пациентов с доброкачественным заболеванием печени
Анализ проводили в соответствии с протоколом, приведенным в примере 1, с использованием антигенов, перечисленных в таблице 17. Порог отсечения для анализа определяли посредством выбора порога отсечения, дающего наибольший индекс Юдена с сохранением в то же время специфичности индивидуального маркера более 90%. Результаты показаны в таблице 17, и является очевидным, что для некоторых из этих маркерных аутоантител показаны более высокие уровни положительности у пациентов с HCC, чем у пациентов с доброкачественным заболеванием печени или у здоровых контрольных индивидуумов, таким образом, они могут иметь способность отличать пациентов с HCC от пациентов без свидетельств злокачественного заболевания. AAb, как обнаружено, демонстрирующие способность отличать злокачественную опухоль/норму в исследовании, показанном в примере 2, продолжают демонстрировать способность отличать пациентов с HCC от пациентов с незлокачественными заболеваниями печени (доброкачественная) и здоровых контрольных индивидуумов (нормальная). Кроме того, является очевидным, что измерение панели снова увеличивает способность отличать пациентов с HCC по сравнению с любым одиночным маркером отдельно.
На панели 3 (таблица 18) и панели 4 (таблица 22) показано, как можно комбинировать различные наборы маркеров для достижения сходной производительности с оптимизацией в то же время определенных характеристик для соответствия различным клиническим нуждам. Панель 3 содержит маркеры, которые можно использовать для всех пациентов, в то время как в панели 4 указаны различные маркеры в соответствии с полом, что увеличивает специфичность с сохранением в то же время чувствительности (таблицы 20 и 21). Это показывает возможность построения различных панелей для соответствия различным клиническим нуждам. Каждый из примеров панелей может детектировать пациентов с злокачественными опухолями на стадиях 1 и 2, что является критическим для ранней диагностики и таким образом, для эффективного лечения HCC (таблицы 19 и 23).
Таблица 17 - Положительность индивидуальных маркерных AAb в каждой группе
Панель 3
Панель 3 сформирована с использованием NRI и содержит маркерные антигены опухолей EpCAM, AIF1 и MMP9 вместе с DDX3X, SALL4, MAGE A4, NY-ESO-1, CAGE, RalA и SOX2, где результат является положительным, если любой из уровней данных AAb выше его порога отсечения, полученного, как описано в примере 4. В таблицах 18 и 19 показана производительность панели в выборке образцов, описанной в примере 4.
Таблица 18 - Производительность и комплектация панели 3
Таблица 19 - Производительность панели 3 для стадий TNM
Панель 4 - Индивидуальная панель для мужчин и женщин
Панель 4 сформирована посредством разделения выборки образцов, описанной в примере 2, на отдельные группы по полу и проведения отдельного NRI для каждой группы. Панель 4 содержит маркерные антигены опухолей EpCAM и AIF1 вместе с CAGE, SOX2, RalA, MAGE A4, DDX3X, NY-ESO-1, HSPD1, SALL4, HSPA4 и трансферрином. Результат является положительным, если пациент является женщиной, и любые из CAGE, HSPD1, SOX2, SALL4, AIF1, HSPA4 или трансферрина выше порога отсечения, полученного, как описано в примере 4, или если пациент является мужчиной, и любые из CAGE, SOX2, RalA, MAGE A4, DDX3X, NY-ESO-1 или EpCAM выше порога отсечения, полученного, как описано в примере 4. В таблицах 10 и 11 показана производительность панели 4 в выборке образцов, описанной в примере 4.
Таблица 20 - Производительность и комплектация панели 4a - мужчины
Таблица 21 - Производительность и комплектация панели 4b - женщины
Таблица 22 - Производительность и комплектация панели 4 - объединенная
Таблица 23 - Производительность панели 4 для стадий TNM
Пример 5 - Дополнительное измерение AFP в комбинации с аутоантителами, измеренными посредством анализа титрования
Циркулирующий альфа-фетопротеин (AFP) измеряли в образцах сыворотки для выборки образцов, описанной в примере 4, с использованием коммерчески доступного ELISA (Aviva Systems Biology). Общепринятый порог отсечения 200 нг/мл использовали для оценки положительности. В таблице 24 показаны результаты добавления AFP к панелям 3 и 4, показанным в примере 4. Из этих результатов понятно, что производительность AFP в комбинации с панелями AAb больше, чем производительность панелей либо AFP, либо AAb отдельно.
Таблица 24 - Производительность AFP отдельно и при добавлении к панелям, описанным в примере 4
Пример 6 - Тренировочное исследование для дизайна и разработки панели CDT на ранних стадиях - LDT печени
Следующие данные получены из исследования для оценки анализов чувствительности и специфичности панели аутоантител при детекции HCC с использованием формата планшета для титрования (фигура 2B). Демографический статус субъектов и цирротический статус доброкачественной когорты приведен в таблицах 25-26, для когорты, отличной от когорт, использованных в предшествующих примерах.
Таблица 25 - Демографический статус когорты пациентов, использованной в примере 6
(доброкачественная)
(нормальная)
Таблица 26 - Цирротический статус доброкачественной когорты пациентов
Анализ проводили в соответствии с протоколом, приведенным в примере 1, с использованием антигенов, перечисленных в таблице 27. Пороги отсечения для каждого маркера определяли посредством использования способа прямого поиска Монте Карло, ограничивающего специфичность >85%. Результаты показаны в таблице 27, и является очевидным, что для некоторых из этих маркерных аутоантител показаны более высокие уровни положительности у пациентов с HCC, чем у пациентов в доброкачественной или нормальной когортах, таким образом, они имеют способность отличать пациентов с HCC от пациентов без свидетельств злокачественного заболевания. AAb, как обнаружено, демонстрирующие способность отличать злокачественную опухоль/норму в исследовании, показанном в примере 2, продолжают демонстрировать способность отличать пациентов с HCC от пациентов с незлокачественными заболеваниями печени (доброкачественная) и здоровых контрольных индивидуумов (нормальная). Кроме того, является очевидным, что измерение панели снова увеличивает способность отличать пациентов с HCC по сравнению с любым одиночным маркером отдельно. Панель может детектировать пациентов с злокачественными опухолями на стадиях 1 и 2, с чувствительностью 40-45%, что является критическим для ранней диагностики и таким образом, для эффективного лечения HCC (таблица 28).
Таблица 27 - Положительность индивидуальных маркерных AAb в каждой группе
Таблица 28 - Производительность панели AAb для стадий в когорте HCC: количество пациентов (n) по стадиям и полученная чувствительность
BCLC=Система клиники Барселоны для определения стадий рака печени (BCLC)
Циркулирующий альфа-фетопротеин (AFP) измеряли в образцах сыворотки для выборки образцов, описанной в примере 6, с использованием коммерчески доступного ELISA (Monobind). Общепринятый порог отсечения 200 нг/мл использовали для оценки положительности, разбитой по стадиям в таблице 29. Чувствительность антигена AFP увеличивалась со стадиями для этой когорты, с чувствительностью для заболевания на ранних стадиях, намного более низкой, чем для заболевания на поздних стадиях. Следует отметить также, что чувствительность для заболевания на ранних стадиях намного ниже для антигена AFP, по сравнению с панелью AAb для этого примера, в то время как производительность на поздних стадиях является сходной.
Таблица 29 - Производительность для антигена AFP для стадий в когорте HCC: количество пациентов (n) по стадиям и полученная чувствительность
Положительность и чувствительность для когорты HCC в примере 6 можно увеличивать посредством объединения результатов для антигена AFP с результатами для панели AAb (таблица 30), улучшая чувствительность для заболевания как на ранних, так и на поздних стадиях. Из этих результатов понятно, что производительность AFP в комбинации с панелью AAb больше, чем производительность либо AFP, либо панели AAb отдельно (таблица 31). Объединение панели AAb с AFP оказывает минимальный эффект на специфичность.
Таблица 30 - Производительность панели AAb+антигена AFP для стадий в когорте HCC: количество пациентов (n) по стадиям и полученная чувствительность
Таблица 31 - Производительность AFP отдельно и при добавлении в панель AAb, описанную в примере 6
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| УЛУЧШЕННЫЕ СПОСОБЫ ИММУНОАНАЛИЗА | 2010 |
|
RU2662555C2 |
| УЛУЧШЕННЫЕ СПОСОБЫ ИММУНОАНАЛИЗА | 2006 |
|
RU2416095C2 |
| УЛУЧШЕННЫЕ СПОСОБЫ ИММУНОАНАЛИЗА | 2006 |
|
RU2636532C2 |
| МУЛЬТИПЛЕКСНАЯ ДЕТЕКЦИЯ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПАНЕЛИ АГЕНТОВ, СВЯЗЫВАЮЩИХСЯ С ВНЕКЛЕТОЧНЫМИ МАРКЕРАМИ | 2008 |
|
RU2489720C2 |
| ПЕРОРАЛЬНАЯ КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБЫ ИММУНОТЕРАПИИ | 2015 |
|
RU2719586C2 |
| БИОМАРКЕРЫ, ПРИГОДНЫЕ ПРИ ДИАГНОСТИКЕ ФИБРОЗА ПЕЧЕНИ | 2009 |
|
RU2505821C2 |
| ХИМЕРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ РЕЦЕПТОРЫ С MND-ПРОМОТОРОМ | 2015 |
|
RU2708311C2 |
| ХИМЕРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ РЕЦЕПТОРЫ С MND-ПРОМОТОРОМ | 2015 |
|
RU2799573C2 |
| СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ В КРОВИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК МЕТОДОМ МНОГОПАРАМЕТРОВОЙ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ | 2024 |
|
RU2825188C2 |
| ПОЛУЧЕНИЕ АНТИГЕНСПЕЦИФИЧЕСКИХ T-КЛЕТОК | 2017 |
|
RU2745319C2 |
Группа изобретений относится к медицине и может быть использована для диагностики рака печени. Предложен способ диагностики рака печени у субъекта-млекопитающего посредством детекции аутоантитела, иммунологически специфического для маркерного белка опухоли, выбранного из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B, в тестируемом образце, содержащем физиологическую жидкость от субъекта-млекопитающего. Способ включает стадии приведения тестируемого образца в контакт с маркерным антигеном опухоли, выбранным из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B, и определения присутствия или отсутствия комплексов маркерного антигена опухоли, связанного с аутоантителами, присутствующими в тестируемом образце, причем присутствие указанных комплексов является показателем присутствия рака печени. Предложены также способ определения in vitro профиля антител индивидуума, страдающего раком печени, способ прогнозирования ответа на лечение против рака печени, применение маркерного антигена опухоли в способе детекции рака печени и набор для детекции рака печени. Обеспечивается эффективный и неинвазивный скрининг рака печени. 6 н. и 30 з.п. ф-лы, 2 ил., 31 табл., 6 пр.
1. Способ детекции рака печени у субъекта-млекопитающего посредством детекции антитела в тестируемом образце, содержащем физиологическую жидкость от субъекта-млекопитающего, где антитело представляет собой аутоантитело, иммунологически специфическое для маркерного белка опухоли, выбранного из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B, где способ включает стадии:
(a) приведения тестируемого образца в контакт с маркерным антигеном опухоли, выбранным из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B; и
(b) определения присутствия или отсутствия комплексов маркерного антигена опухоли, связанного с аутоантителами, присутствующими в тестируемом образце;
при этом присутствие указанных комплексов является показателем присутствия рака печени.
2. Способ по п. 1, где субъект-млекопитающее тестирован как положительный по альфа-фетопротеину (AFP), дез-гамма-карбоксипротромбину (DCP) или реакционноспособному по отношению к лектину альфа-фетопротеину (AFP-L3).
3. Способ по п. 1, где субъект-млекопитающее тестирован как положительный по раку печени с использованием ультразвуковой проверки.
4. Способ по п. 1, где субъект-млекопитающее имеет цирроз печени, неалкогольную жировую дистрофию печени, алкогольную болезнь печени, болезнь Вильсона, наследственный гемохроматоз, аутоиммунный гепатит, гепатит B, гепатит C, документированное воздействие афлатоксина, шистозоматоз или сахарный диабет.
5. Способ определения in vitro профиля антител индивидуума, страдающего раком печени, в тестируемом образце, содержащем физиологическую жидкость от субъекта-млекопитающего, где антитело представляет собой аутоантитело, иммунологически специфическое для маркерного белка опухоли, выбранного из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B, где способ включает стадии:
a) приведения тестируемого образца в контакт с маркерным антигеном опухоли, выбранным из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B; и
b) определения присутствия или отсутствия комплексов маркерного антигена опухоли, связанного с аутоантителами, присутствующими в тестируемом образце, где способ повторяют для построения профиля продукции антител.
6. Способ диагностики рака печени у субъекта-млекопитающего посредством детекции антитела в тестируемом образце, содержащем физиологическую жидкость от субъекта-млекопитающего, где антитело представляет собой аутоантитело, иммунологически специфическое для маркерного белка опухоли, выбранного из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B, где способ включает стадии:
(a) приведения тестируемого образца в контакт с маркерным антигеном опухоли, выбранным из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B;
(b) определения присутствия или отсутствия комплексов маркерного антигена опухоли, связанного с аутоантителами, присутствующими в тестируемом образце; и
(c) диагностики у субъекта рака печени, когда детектированы комплексы маркерного антигена опухоли, связанного с аутоантителами, присутствующими в тестированном образце.
7. Способ по п. 6, дополнительно содержащий стадию:
(d) подвергания диагностированного субъекта лечению рака печени.
8. Способ прогнозирования ответа на лечение против рака печени, включающий детекцию антитела в тестируемом образце, содержащем физиологическую жидкость от субъекта-млекопитающего, где антитело представляет собой аутоантитело, иммунологически специфическое для маркерного белка опухоли, выбранного из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B, где способ включает стадии:
(a) приведения тестируемого образца в контакт с маркерным антигеном опухоли, выбранным из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B;
(b) определения присутствия или отсутствия комплексов маркерного антигена опухоли, связанного с аутоантителами, присутствующими в тестируемом образце;
(c) детекции уровня специфического связывания между маркерным антигеном опухоли и аутоантителами, присутствующими в тестируемом образце; и
(d) сравнения уровня специфического связывания между маркерным антигеном опухоли и аутоантителом с ранее установленной связью между уровнем связывания и вероятным исходом лечения;
при этом изменение уровня специфического связывания, по сравнению с контролем, позволяет прогнозировать, будет или не будет пациент отвечать на лечение против рака печени.
9. Способ по п. 7 или 8, где лечение рака печени выбрано из группы, состоящей из химиотерапии, радиочастотной абляции, резекции печени, трансплантации печени, вакцинации, лекарственных средств против факторов роста или передачи сигнала, эндокринной терапии, терапии человеческим антителом, транскатетерной артериальной химиоэмболизации, чрескожной инъекции этанола, микроволновой абляции, введения сорафениба и радиоэмболизации.
10. Способ по любому из пп. 1-9, где детектируют два или более аутоантител и где способ включает стадию:
(a) приведения тестируемого образца в контакт с панелью из двух или более маркерных антигенов опухолей, содержащей маркерный антиген опухоли, выбранный из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B, и один или несколько дополнительных маркерных антигенов опухолей, иммунологически специфических по меньшей мере для одного из указанных аутоантител.
11. Способ по п. 10, где панель содержит два или более маркерных антигена опухолей, представляющих собой отдельные антигены.
12. Способ по п. 11, где панель содержит два или более вариантов антигенов из одного или нескольких отдельных антигенов.
13. Способ по п. 11, где панель из двух или более маркерных антигенов опухолей содержит MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B.
14. Способ по любому из пп. 10-12, где панель из двух или более маркерных антигенов опухолей содержит один или несколько маркерных антигенов опухолей, выбранных из группы, состоящей из NY-ESO-1, виментина, HSPA4, трансферрина, HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, циклина B1, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoA1, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, пролактина, RGN, SPP1, SSX2 и TGFB1.
15. Способ по п. 14, где панель из двух или более маркерных антигенов опухолей содержит или состоит из
(i) CAGE, NY-ESO-1, MMP9, трансферрина, MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, циклина B1, EpCAM, DDX3X и AIF1; или
(ii) CAGE, NY-ESO-1, MMP9, трансферрина, MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, циклина B1, EpCAM, DDX3X, AIF1, SOX2 и AFP; или
(iii) MMP9, AIF1, EpCAM, NY-ESO-1, HSPA4, виментина, HNRNP-L и трансферрина.
16. Способ по п. 14, где панель из двух или более маркерных антигенов опухолей содержит или состоит из:
(i) AIF1, EpCAM, HSPA4 и CPS1; или
(ii) AIF1, CAGE, HSPD1, SOX2, SALL4, HSPA4 и трансферрина.
17. Способ по п. 16, где субъект является женщиной.
18. Способ по п. 14, где панель из двух или более маркерных антигенов опухолей содержит или состоит из:
(i) EpCAM, NY-ESO-1, виментина, HSPA2, HSPA4 и HNRNP-L; или
(ii) EpCAM, CAGE, SOX2, RalA, MAGE A4, DDX3X и NY-ESO-1.
19. Способ по п. 18, где субъект является мужчиной.
20. Способ по п. 14, где панель из двух или более маркерных антигенов опухолей содержит или состоит из: MMP9, AIF1, EpCAM, DDX3X, SALL4, MAGE A4, NY-ESO-1, CAGE, RalA и SOX2.
21. Способ по п. 14, где панель из двух или более маркерных антигенов опухолей содержит NY-ESO-1, виментин, HSPA4, трансферрин, HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, циклин B1, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoA1, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, пролактин, RGN, SPP1, SSX2 и TGFB1.
22. Способ по п. 21, где панель из двух или более маркерных антигенов опухолей содержит или состоит из: MMP9, AIF1, EpCAM, CDKN1B, NY-ESO-1, виментина, HSPA4, трансферрина, HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, циклина B1, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoA1, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, пролактина, RGN, SPP1, SSX2 и TGFB1.
23. Способ по любому из предшествующих пунктов, где маркерный антиген опухоли представляет собой природный белок или полипептид, рекомбинантный белок или полипептид, синтетический белок или полипептид, синтетический пептид, пептидомиметик, полисахарид или нуклеиновую кислоту.
24. Способ по любому из пп. 1-23, где рак печени представляет собой печеночно-клеточную карциному (HCC).
25. Способ по любому из предшествующих пунктов, где физиологическая жидкость выбрана из группы, состоящей из плазмы, сыворотки, цельной крови, мочи, пота, лимфы, фекалий, спинномозговой жидкости, асцитной жидкости, плеврального выпота, семенной жидкости, мокроты, аспирата из сосков, послеоперационной серомы, слюны, амниотической жидкости, слез и жидкости от дренирования раны.
26. Способ по любому из предшествующих пунктов, где способ дополнительно включает детекцию альфа-фетопротеина (AFP), дез-гамма-карбоксипротромбина (DCP) или реакционноспособного по отношению к лектину альфа-фетопротеина (AFP-L3) в тестируемом образце, содержащем физиологическую жидкость от субъекта-млекопитающего.
27. Способ по п. 26, где способ включает детекцию альфа-фетопротеина (AFP) в тестируемом образце, содержащем физиологическую жидкость от субъекта-млекопитающего.
28. Способ по п. 27, где аутоантитела, иммунологически специфические для маркерных белков опухолей CAGE, NY-ESO-1, MMP9, трансферрина, MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, циклина B1, EpCAM, DDX3X и AIF1, детектируют в тестируемом образце, содержащем физиологическую жидкость от субъекта-млекопитающего.
29. Способ по п. 27, где аутоантитела, иммунологически специфические для маркерных белков опухолей CAGE, NY-ESO-1, MMP9, трансферрина, MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, циклина B1, EpCAM, DDX3X, AIF1, SOX2 и AFP, детектируют в тестируемом образце, содержащем физиологическую жидкость от субъекта-млекопитающего.
30. Способ по любому из пп. 26-29, где физиологическая жидкость представляет собой кровь.
31. Применение маркерного антигена опухоли, выбранного из группы, состоящей из MMP9 AIF1, EpCAM и CDKN1B, в способе детекции рака печени у субъекта-млекопитающего посредством детекции аутоантитела, иммунологически специфического для MMP9, AIF1, EpCAM или CDKN1B, в тестируемом образце, содержащем физиологическую жидкость от субъекта-млекопитающего, где способ включает стадии:
(a) приведения тестируемого образца в контакт с маркерным антигеном опухоли, выбранным из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B; и
(b) определения присутствия или отсутствия комплексов маркерного антигена опухоли, связанного с аутоантителами, присутствующими в тестируемом образце;
при этом присутствие указанных комплексов является показателем присутствия рака печени.
32. Набор для детекции рака печени посредством детекции аутоантител в тестируемом образце, содержащем физиологическую жидкость от субъекта-млекопитающего, где набор содержит панель из двух или более маркерных антигенов опухолей, содержащую или состоящую из:
(i) MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B;
(ii) CAGE, NY-ESO-1, MMP9, трансферрина, MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Cyclin B1, EpCAM, DDX3X и AIF1;
(iii) CAGE, NY-ESO-1, MMP9, трансферрина, MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Cyclin B1, EpCAM, DDX3X, AIF1, SOX2 и AFP;
(iv) MMP9, AIF1, EpCAM, NY-ESO-1, HSPA4, виментина, HNRNP-L и трансферрина;
(v) AIF1, EpCAM, HSPA4 и CPS1, необязательно, где субъект является женщиной;
(vi) AIF1, CAGE, HSPD1, SOX2, SALL4, HSPA4 и трансферрина, необязательно, где субъект является женщиной;
(vii) EpCAM, NY-ESO-1, виментина, HSPA2, HSPA4 и HNRNP-L, необязательно, где субъект является мужчиной;
(viii) EpCAM, CAGE, SOX2, RalA, MAGE A4, DDX3X и NY-ESO-1, необязательно, где субъект является мужчиной;
(ix) MMP9, AIF1, EpCAM, DDX3X, SALL4, MAGE A4, NY-ESO-1, CAGE, RalA и SOX2; или
(x) MMP9, AIF1, EpCAM, CDKN1B, NY-ESO-1, виментина, HSPA4, трансферрина, HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, циклина B1, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoA1, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, пролактина, RGN, SPP1, SSX2 и TGFB1,
и реагент, способный к детекции комплексов маркерного антигена опухоли, связанного с аутоантителами, присутствующими в тестированном образце.
33. Набор по п. 32, дополнительно содержащий:
средства для приведения маркерного антигена опухоли в контакт с тестируемым образцом, содержащим физиологическую жидкость от субъекта-млекопитающего.
34. Набор по п. 33, где средства для приведения маркерного антигена опухоли в контакт с тестируемым образцом, содержащим физиологическую жидкость от субъекта-млекопитающего, содержат маркерный антиген опухоли, иммобилизованный на чипе, предметном стекле, планшете, лунках планшета для микротитрования, бусине, мембране или наночастице.
35. Набор по п. 32, где панель из двух или более маркерных антигенов опухолей дополнительно содержит один или несколько маркерных антигенов опухолей, выбранных из группы, состоящей из NY-ESO-1, виментина, HSPA4, трансферрина, HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, циклина B1, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoA1, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, пролактина, RGN, SPP1, SSX2 и TGFB1.
36. Набор по любому из пп. 32-35, где физиологические жидкости выбраны из группы, состоящей из плазмы, сыворотки, цельной крови, мочи, пота, лимфы, фекалий, спинномозговой жидкости, асцитной жидкости, плеврального выпота, семенной жидкости, мокроты, аспирата из сосков, послеоперационной серомы, слюны, амниотической жидкости, слез и жидкости от дренирования раны.
| WO 2008061104 A2, 22.05.2008 | |||
| Способ защиты переносных электрических установок от опасностей, связанных с заземлением одной из фаз | 1924 |
|
SU2014A1 |
| YITING LI et al | |||
| Прибор с двумя призмами | 1917 |
|
SU27A1 |
| Cancer Research, July 2016, vol.76, Issue 13, pp.4002-4011 | |||
| WO 2005043165 A2, 12.05.2005 | |||
| WO 2003024304 A2, 27.03.2003 | |||
| WO 2015193678 A1, 23.12.2015. | |||
