КОМПОЗИЦИЯ ПРЕДШЕСТВЕННИКА ГИДРОГЕЛЯ И ЕЁ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2022 года по МПК C12N5/00 C08G65/00 C08G79/00 C08G81/00 

Настоящее изобретение относится к композициям предшественника гидрогеля, к способу получения композиции предшественника гидрогеля, к набору и способу получения гидрогеля в соответствии с преамбулой независимых пунктов формулы изобретения.

Было установлено, что трехмерные каркасы клеточных культур обеспечивают профили экспрессии генов и других клеточных активностей, которые более близко имитируют живые организмы, чем обычные двухмерные клеточные культуры на чашках.

Это привело к созданию новых семейств синтетических полимерных гидрогелей, которые часто называют искусственными внеклеточными матриксами (аЕСМ), так как они имитируют многие аспекты внеклеточного матрикса. Одной из основных проблем является создание химического состава, который позволяет сшивать матрикс в присутствии клеток или биомолекул, а также стабильно связывать биомолекулы с самим матриксом.

В последние годы были разработаны различные способы, позволяющие формировать гели в присутствии клеток или биомолекул. Например, были предложены способы, основанные на самосборке низкомолекулярных строительных блоков, таких как пептиды (Estroff et al.: “Water gelation by small organic molecules”; Chem. Rev. 2004; 104(3); 1201-18) или уреидопиримидинон (Zhang S.: “Fabrication of novel biomaterials through molecular self-assembly”; Nat. Biotechnol. 2003; 21(10); 1171-8) и амфифильные блок-сополимеры со средней молекулярной массой (например, см. Hartgerink et al.: “Peptide-amphiphile nonofibers: A versatile scaffold for the preparation of self-assembling materials”; Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 2002; 99(8); 5133-8).

Гидрогели могут быть получены на основе ковалентной сшивки функциональных групп, расположенных в молекулах - предшественниках гидрогеля, посредством либо неферментативных, либо ферментативных механизмов. Ферментативные механизмы определены так, что ковалентная поперечная связь опосредована сшивающим ферментом, который катализирует реакцию поперечной сшивки между функциональными группами. Сшивающие ферменты, известные из системы свертывания крови, принадлежат, например, к классу трансглутаминаз, которые катализируют образование изопептидной связи между аминогруппой, такой как лизин, связанный с белком/пептидом, и ацильной группой глутамина, связанного с белком/пептидом, в присутствии ионов кальция. Использование трансглутаминаз было приспособлено для производства гидрогелей в предшествующем уровне техники.

Гидрогели, известные в данной области техники, раскрыты, например, в “In situ crosslinking of a biomimetic peptide-PEG hydrogel via thermally triggered activation of factor XIII”, Sanborn et al. (Biomaterials 23 (2002), 2703-2710). Sanborn et al. использует контролируемое высвобождение иона кальция для активации человеческого рекомбинантного Фактора XIII путем термической индукции загруженных кальцием липосом. После высвобождения кальция компоненты геля сшиваются человеческим рекомбинантным Фактором XIII. Как таковая вся система гелеобразования может храниться в водном растворе при комнатной температуре без преждевременного формирования геля.

В WO 2014/180970 А1 описано получение гидрогелей с использованием молекул-предшественников на основе ПЭГ и активированного тромбином фактора XIIIa. Фактор XIII восстанавливают из лиофилизированного порошка и активируют тромбином в течение 30 мин при 37°С. Аликвоты активированного фактора XIIIa хранят при -80°C для дальнейшего использования. Растворы предшественников, образующие гидрогели, готовят в трис-буфере (TBS, 50 мМ, pH 7,6), содержащем 50 мМ хлорида кальция. Реакцию перекрестной сшивки инициируют добавлением тромбин-активированного фактора XIIIa и энергичного перемешивание. Одним из недостатков способа является то, что активация фактора XIIIa проводится отдельно перед стадией образования геля.

Поэтому цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы избежать недостатков известных композиций предшественников гидрогеля, и в частности, обеспечить композицию предшественника гидрогеля, которая воспроизводимо образует гидрогели. Эта задача решается с помощью композиции предшественника гидрогеля по п.1.

Настоящее изобретение относится к композиции предшественника гидрогеля, которая находится в форме непрореагировавшего порошка. Непрореагировавший порошок содержит активирующий фермент, предпочтительно тромбин, и сшивающий фермент, предпочтительно трансглутаминазу, более предпочтительно трансглутаминазу фактор XIII. Сшивающий фермент активируется активирующим ферментом в воде с буфером или без него, предпочтительно в воде с проводимостью <5 мкС/см с буфером или без него, и/или предпочтительно с pH в диапазоне от 5 до 8, более предпочтительно от 6 до 8, наиболее предпочтительно от 6,5 до 8. Кроме того, порошок содержит по меньшей мере одно структурное соединение A, предпочтительно два различных структурных соединения A и B. Указанное структурное соединение является сшиваемым путем избирательной реакции, опосредованной сшивающим ферментом с образованием гидрогеля, где сшивающий фермент активируется предпочтительно со степенью активации от 50 до 100%, предпочтительно от 75 до 100%, более предпочтительно по существу 100%. 100% активация означает, что 100% фактора XIII активируется в фактор XIIIa; 75% активация означает, что 75% фактора XIII активируется в фактор XIIIa; 50% активация означает, что 50% фактора XIII становится активированным фактором XIIIa, а 50% все еще остается фактором XIII.

Таким образом, композиция предшественника гидрогеля содержит основные компоненты, необходимые для гидрогеля. Это удобно, поскольку конечные пользователи не должны взвешивать и/или смешивать отдельные компоненты. Взвешивание и смешивание являются источником ошибки, которая снижается с помощью композиции согласно изобретению. Конечный пользователь ресуспендирует композицию предшественника гидрогеля в подходящем буфере, который обеспечивает условия, например, рН и/или ионную силу для образования гидрогеля. Таким образом, воспроизводимость гидрогелей, полученных из композиции предшественника гидрогеля, повышается, а производство гидрогелей упрощается.

Удивительно, что активированный фактор XIII стабилен в производственной смеси в течение по меньшей мере 24 часов. Это означает, что итоговые физико-химические свойства (например, время образования геля, модуль сдвига G', набухание Q) гидрогелей были неизменными, независимо от продолжительности, в течение которой сохранялась производственная смесь (содержащая активированный фактор XIII), из которой происходили гидрогели, например, при комнатной температуре до приготовления гидрогеля или лиофилизации (далее «время изготовления»). Следовательно, стабильность физико-химических свойств итогового геля для гидрогелей не зависит от времени приготовления производственной смеси. Это показывает, что в этих условиях не наблюдается потери активности сшивающего фермента и/или активирующего фермента.

Термин «комнатная температура» относится к температуре в диапазоне от 20 до 25°C. Однако повышенная температура, например, в лабораториях без кондиционера в тропических странах, может рассматриваться как комнатная температура.

Более предпочтительно сшивающий фермент активируется активирующим ферментом в воде с проводимостью 5 мкС/см с буфером или без него и/или содержащей <10 ч./млн. ионов кальция и/или содержащей <10 ч./млн ионов магния.

Непрореагировавший порошок композиции предшественника гидрогеля может содержать частицы, имеющие любой размер и форму. Альтернативно, порошок также может быть предоставлен в виде прессованной таблетки или пилюли. Наиболее предпочтительно, порошок предоставляется в форме стабильного компактного осадка, например, на дне контейнера. Это упрощает обработку композиции предшественника, поскольку порошок расположен на дне контейнера. Центрифугирование перед растворением порошка не является необходимым для концентрирования порошка на дне. Это улучшает воспроизводимость образования геля.

Порошок является непрореагировавшим, что означает, что почти ничего из по меньшей мере одного структурного соединения А не прореагировало с агентом, который участвует в избирательной реакции, образуя поперечную связь. Предпочтительно более 70%, более предпочтительно более 85%, наиболее предпочтительно более 95% соединений не вступили в избирательную реакцию.

Структурное соединение А предпочтительно имеет функциональность по меньшей мере равную трем, предпочтительно функциональность, равную четырем или более. «Функциональность» означает количество участков реакции, например, реактивных групп, на молекуле.

Композиция предшественника может быть по существу лишена одновалентных ионов, причем концентрация одновалентных ионов может предпочтительно находиться в диапазоне от 1 до 60 мМ, предпочтительно от 10 до 30 мМ, если конечный пользователь не добавляет одновалентные ионы. Когда получают гидрогель с композицией предшественника гидрогеля, лишенной одновалентных ионов, количество одновалентных ионов в образованном гидрогеле сводится к минимуму. Таким образом, количество одновалентных ионов в образованном гидрогеле можно регулировать буфером, добавляемым конечным пользователем, в зависимости от конечного применения. Одновалентные ионы могут оказывать влияние на клетки, которые конечный пользователь внедряет в гидрогель. Такие свойства, как рост или жизнеспособность клеток, не подвержены отрицательному влиянию присутствия одновалентных ионов. Таким образом, композиция предшественника гидрогеля приводит к образованию гидрогелей, которые проявляют пониженное отрицательное влияние на встроенные клетки.

Композиция предшественника может быть по существу лишена двухвалентных ионов, предпочтительно ионов кальция, где концентрация двухвалентных ионов может предпочтительно составлять <10 мкМ, более предпочтительно <1 мкМ, наиболее предпочтительно <10 ч./млн. Уменьшение двухвалентных ионов, в частности ионов кальция, присутствующих в композиции предшественника гидрогеля, приводит к получению композиции, которая не образует гидрогель до добавления двухвалентных ионов. Ионы кальция необходимы для каталитической активности активируемого тромбином фактора XIII. Следовательно, до добавления ионов кальция не происходит самопроизвольного образования геля из композиции предшественника, включающей активированный тромбином фактор XIII. Самопроизвольное образование геля значительно снижено по сравнению с известными композициями предшественников гидрогеля. Таким образом, гелеобразование гидрогелей контролируется или может контролироваться с помощью композиции предшественника гидрогеля, которая по существу лишена двухвалентных ионов, предпочтительно ионов кальция. Количество ионов кальция может быть выбрано таким, чтобы не происходило формирования геля при комнатной температуре до 30 часов, предпочтительно до 100 часов, в присутствии 20 Ед./мл фактора XIII, 0,2 Ед./мл тромбина и 5% масс./об. структурного соединения в трис-буферном солевом растворе (0,65 мМ Трис, 1,5 мМ NaCl, рН 7,5).

Кроме того, по меньшей мере одно структурное соединение A может содержать по меньшей мере две различные реакционноспособные группы. Отдельные реакционноспособные группы могут быть совместимыми группами, то есть они связаны, например, поперечной сшивкой друг с другом, для образования гидрогеля посредством химической реакции, катализируемой активированным сшивающим ферментом. Альтернативно, композиция предшественника включает структурное соединение A и структурное соединение B, где структурное соединение A и структурное соединение B отличаются по размеру и/или функциональности и/или функциональной/реакционноспособной группе. Композиция предшественника гидрогеля может содержать структурное соединение А и линкерное соединение. «Линкерное соединение» означает, что соединение образует линкер между двумя молекулами структурного соединения или двумя молекулами двух структурных соединений, соответственно. Линкерное соединение не вносит вклад в трехмерную природу гидрогеля, так как это линейная/неразветвленная молекула. «Структурные соединения» определяются как разветвленные молекулы, и следовательно, они вносят вклад в трехмерную структуру гидрогелей.

По меньшей мере одно структурное соединение A может содержать ацильный компонент, предпочтительно два ацильных компонента, более предпочтительно три ацильных компонента, и аминный компонент, предпочтительно, два аминных компонента, предпочтительно три аминных компонента. Ацильный фрагмент может представлять собой глутамин, а аминный фрагмент может представлять собой лизин.

Если два структурных соединения A и B содержатся в композиции, оба могут содержать по меньшей мере глутамин и по меньшей мере лизин. Альтернативно, одно из двух структурных соединений A и B содержит по меньшей мере один глутамин или по меньшей мере один лизин; второе структурное соединение содержит совместимую реакционноспособную группу, включающую по меньшей мере один глутамин или по меньшей мере один лизин, соответственно.

Композиция предшественника гидрогеля может содержать по меньшей мере одно дополнительное соединение гидрогеля, предпочтительно по меньшей мере одно сшиваемое биологически активное соединение. По меньшей мере одно дополнительное соединение гидрогеля, предпочтительно по меньшей мере одно сшиваемое биоактивное соединение, может быть ковалентно встроено в сеть гидрогеля посредством реакций сшивки с двумя субъединицами гидрогеля. Дополнительное соединение гидрогеля может содержать глутамин и/или лизин. Если дополнительное соединение содержит только один глутамин или один лизин, дополнительное соединение будет включено в гель в виде так называемой висячей молекулы, что означает, что включение дополнительных соединений определяет конец цепи. При этом дополнительные субъединицы не могут присоединиться.

Биоактивные соединения могут содержать пептидную RGD-последовательность, например TG-RGDGln пептиды, такие как пептиды NQEQVSPLGRGDSPG-NH2, или TG-RGDLys пептиды, такие как Ac-FKGGRGDSPG-NH2, или RGD-последовательность из фибронектина. или YISG-последовательность из ламинина; участок связывания фактора роста, такой как участок связывания гепарина; участок связывания протеазы или терапевтически активное соединение. Предпочтительно биоактивное соединение содержит участок клеточной адгезии, наиболее предпочтительно RGD-последовательность.

Биоактивное соединение содержит по меньшей мере одну активную группу, способную подвергаться избирательной реакции. Предпочтительно, биоактивное соединение содержит по меньшей мере один лизин и/или один глутамин.

Биоактивное соединение может быть способно к конъюгации со структурным соединением посредством избирательной реакции. Предпочтительно эта избирательная реакция является той же самой реакцией, что и избирательная реакция, используемая для образования гидрогеля. Альтернативно, биоактивное соединение может быть конъюгировано со структурным соединением посредством избирательной реакции перед образованием гидрогеля.

Структурное соединение может быть полиразветвленным полиэтиленгликолем, предпочтительно 8-лучевым полиэтиленгликолем. Предпочтительно, 8-лучевой полиэтиленгликоль имеет размер в диапазоне от 30 до 50 кДа, предпочтительно от 35 до 45 кДа, более предпочтительно 40 кДа. Каждая ветвь структурного соединения предпочтительно содержит функциональную группу.

Еще один аспект изобретения относится к способу получения композиции предшественника гидрогеля в форме непрореагировавшего порошка. Способ производства включает этапы (а), (b), и при необходимости (с).

Этап (а) включает смешивание активирующего фермента, сшивающего фермента и по меньшей мере одного структурного соединения А в воде с буфером или без него, предпочтительно в воде с проводимостью <5 мкС/см, с буфером или без него, и/или предпочтительно имеющей рН в диапазоне от 5 до 8, более предпочтительно от 6 до 8, наиболее предпочтительно от 6,5 до 8. Сшивающий фермент активируется активирующим ферментом в указанной воде.

Активирующий фермент предпочтительно представляет собой тромбин. Сшивающий фермент предпочтительно представляет собой трансглутаминазу, более предпочтительно трансглутаминазу фактор XIII. Предпочтительно два различных структурных соединения А и В смешивают на этапе (а).

Этап (b) может быть выполнен до или после этапа (а). Он включает инкубацию сшивающего фермента и активирующего фермента в течение времени, достаточного для того, чтобы характеристики геля, такие как время гелеобразования, модуль сдвига G 'и набухание Q геля, полученного из композиции предшественника гидрогеля, оставались по существу постоянными, независимо от продолжительности времени получения. «По существу постоянное» означает, что изменение характеристик геля во времени составляет менее 15%, предпочтительно менее 10%, более предпочтительно менее 5%. Эксперименты показали, что при достаточной инкубации достигается плато с вышеупомянутыми характеристиками (см. ниже); это означает, что характеристики не изменяются независимо от времени производства. Вариант (i) в дальнейшем относится к этапу (b), выполняемому после этапа (a). Вариант (ii) в дальнейшем относится к этапу (b), осуществляемому перед этапом (a).

Предпочтительно сшивающий фермент и активирующий фермент инкубируют в течение достаточного времени и в таких условиях, чтобы гидрогель, получаемый или полученный с помощью композиции предшественника, имел время образования геля предпочтительно в диапазоне от 0,5 до 30 минут, более предпочтительно от 1 до 20 мин, наиболее предпочтительно от 2 до 10 мин, когда от 1 до 20% масс./об. структурного соединения, от 0,1 до 100 Ед./мл сшивающего фермента и от 0,001 до 20 Ед./мл активирующего фермента используют в буфере, содержащем ионы кальция в диапазоне от 1 до 200 мМ, предпочтительно от 10 до 100 мМ, с рН в диапазоне от 6,5 до 8,5 при температуре от 4 до 37°С.

Предпочтительно сшивающий фермент и активирующий фермент инкубируют в течение достаточного времени и в таких условиях, чтобы гидрогель, получаемый или полученный с помощью композиции предшественника, имел модуль сдвига G' предпочтительно в диапазоне от 100 до 15 000 Па, более предпочтительно от 200 до 5 000 Па, когда от 1 до 20% масс./об. структурного соединения, от 0,1 до 100 Ед./мл сшивающего фермента и от 0,001 до 20 Ед./мл активирующего фермента используют в буфере, содержащем ионы кальция в диапазоне 1 до 200 мМ, предпочтительно от 10 до 100 мМ, с рН в диапазоне от 6,5 до 8,5 при температуре от 4 до 37°С.

Предпочтительно сшивающий фермент и активирующий фермент инкубируют в течение достаточного времени и в таких условиях, чтобы гидрогель, получаемый или полученный с помощью композиции предшественника, имел коэффициент набухания Q предпочтительно в диапазоне от 10 до 100, более предпочтительно от 20 до 80, когда от 1 до 20% масс./об. структурного соединения, от 0,1 до 100 Ед./мл сшивающего фермента и от 0,001 до 20 Ед./мл активирующего фермента используют в буфере, содержащем ионы кальция в диапазоне от 1 до 200 мМ, предпочтительно 10 до 100 мМ, с рН в диапазоне от 6,5 до 8,5, при температуре от 4 до 37°С.

Необязательный этап (с) включает после последнего из этапов (а) или (b) лиофилизацию смеси.

Структурное соединение является сшиваемым с помощью избирательной реакции, опосредованной сшивающим ферментом. Компоненты смешивают на этапе (а) в условиях, которые препятствуют реакции сшивания, опосредованной сшивающим ферментом.

Способ получения композиции предшественника гидрогеля в соответствии с изобретением является предпочтительным, поскольку либо (i) все компоненты, такие как сшивающий фермент, активирующий фермент и структурное соединение(ия), смешаны и приготовлены в виде готового к употреблению порошка (этап (b) после (а) согласно варианту (i)), либо (ii) сшивающий фермент активируется в воде, предпочтительно с минимальной проводимостью, как указано, с буфером или без него до смешивания с оставшимся гелевым соединением(ями) (этап (b) до (а), согласно варианту (ii)).

Вариант (i) упрощает процесс получения композиций предшественника гидрогеля, так как смешивание компонентов геля выполняется только в одну стадию. Образование гидрогелей также упрощается, так как готовый к использованию порошок ресуспендируют в буфере, и добавление сшивающего фермента к предшественникам гидрогеля не требуется. В целом, воспроизводимость вышеупомянутых процессов улучшается. В варианте (i) время инкубации равно времени изготовления.

Вариант (ii) позволяет адаптировать систему гидрогеля к потребностям конечного пользователя, так как конечная концентрация сшивающего фермента для образования гидрогеля может быть свободно выбрана. Здесь конечная концентрация сшивающего фермента не зависит от сухой массы предшественников гидрогеля, так как активированный сшивающий фермент может быть добавлен к соединениям гидрогеля до образования гидрогеля. В варианте (ii) предшественники гидрогеля и активированный сшивающий фермент могут быть лиофилизированы либо в предварительно смешанном состоянии, либо в отдельных контейнерах.

В качестве примера, согласно варианту (ii), сшивающий фермент фактор XIII активируют активирующим ферментом тромбином в воде с проводимостью <5 мкС/см с pH в диапазоне от 6 до 8 или в трис- буферном солевом растворе (например, 0,9 мМ Трис, 13 мМ NaCl, рН 7,6) при отсутствии ионов кальция при 37°С в течение 30 мин. Интересно, что активированный фактор XIII стабилен при смешивании в производственной смеси в течение 24 часов при комнатной температуре. Это означает, что результирующие физико-химические свойства (время образования геля, модуль сдвига G', набухание Q) гидрогелей не изменялись независимо от продолжительности, в течение которой хранили производственную смесь (содержащую активированный фактор XIII и предшественники гидрогеля), из которой происходили гидрогели, при комнатной температуре до лиофилизации. Следовательно, стабильность физико-химических свойств готового геля не зависит от времени изготовления. Это показывает, что в этих условиях не наблюдается потери активности сшивающего фермента и/или активирующего фермента.

Инкубация смеси, полученной на этапе (а), может проводиться в течение по меньшей мере 0,5 часа, предпочтительно менее 24 часов, более предпочтительно от 2 до 4 часов, при температуре в диапазоне от 4 до 37°С, предпочтительно от 10 до 25°С, более предпочтительно при комнатной температуре.

Если этап (b) выполняют перед этапом (a) согласно варианту (ii), инкубацию смеси на этапе (b) предпочтительно проводят в течение от 15 минут до 1 часа, в частности, 30 минут, при 37°C. Если этап (b) выполняют после этапа (a) согласно варианту (i), инкубацию смеси на этапе (b) предпочтительно проводят в течение от 2 до 4 часов при 20°C или от 1 до 2 часов при 37°C, чтобы достичь плато, на котором свойства (время образования геля, модуль сдвига G', набухание Q) гидрогеля, полученного из композиции предшественника гидрогеля, являются по существу постоянными. В варианте (i) время инкубации в основном равно времени изготовления.

Сшивающий фермент может иметь степень активации от 50 до 100%, предпочтительно от 75 до 100%, более предпочтительно по существу 100%, после этапа (b).

Кроме того, по меньшей мере, одно дополнительное соединение гидрогеля, предпочтительно по меньшей мере одно сшиваемое биоактивное соединение, может быть добавлено на этапе (а). По меньшей мере одно дополнительное соединение гидрогеля, предпочтительно по меньшей мере одно сшиваемое биоактивное соединение, может быть ковалентно встроено в сеть гидрогеля путем избирательных реакций сшивания по меньшей мере с одной субъединицей гидрогеля. Дополнительное соединение гидрогеля может содержать глутамин и/или лизин. Если дополнительное соединение содержит только один глутамин или один лизин, дополнительное соединение будет включено в гель в виде так называемой висячей молекулы, что означает, что включение дополнительных соединений определяет конец цепи конъюгированных субъединиц. При этом дополнительные субъединицы не могут присоединяться.

Способ получения композиции предшественника гидрогеля может использовать смесь на этапе (а), содержащую от 1 до 100 Ед./мл, предпочтительно от 2 до 50 Ед./мл, более предпочтительно от 4 до 25 Ед./мл сшивающего фермента и/или от 0,01 до 10 Ед./мл, предпочтительно от 0,02 до 5 Ед./мл, более предпочтительно от 0,04 до 0,7 Ед./мл активирующего фермента.

Способ может использовать смесь на этапе (а), содержащую от 0,5 до 25% масс./об., предпочтительно от 1 до 20% масс./об., более предпочтительно от 2 до 10% масс./об. по меньшей мере одного структурного соединения А.

Способ может использовать смесь на этапе (а), содержащую от 0,005 до 10% масс./об., предпочтительно от 0,01 до 2% масс./об. сшиваемого биоактивного соединения, такого как пептид. Альтернативно, смесь на этапе (а) может содержать от 0,005 до 5 мг/мл, предпочтительно от 0,2 до 2,5 мг/мл сшиваемого биоактивного соединения, такого как рекомбинантный белок, или белок, очищенный из ткани человека или животного. Примерным белком является ламинин.

Буферные композиции, используемые в способе получения композиции предшественника гидрогеля в соответствии с изобретением, могут включать средства для минимизации концентрации свободных двухвалентных ионов, в частности свободных ионов кальция. К таким средствам относятся, например, хелатирующие агенты, такие как ЭДТА или ЭГТА. В зависимости от типа клеток и времени воздействия, концентрации ЭДТА в диапазоне от 100 до 500 мкМ могут быть токсичными для клеток. Однако, когда клетки инкапсулируют в гидрогели и помещают в среду, концентрации ЭДТА разбавляются в 3–10 раз. ЭДТА может быть удалена путем замены среды, например, промывания.

Кроме того, смесь, содержащая предшественники гидрогеля в способе получения гидрогеля по изобретению, может включать фильтрацию, предпочтительно стерилизующую фильтрацию смеси перед лиофилизацией. Это приводит к композиции предшественника, не содержащей загрязняющих, и возможно вредных компонентов, например, бактерий.

Смесь, полученная на этапе (а), может быть стерильно профильтрована и/или аликвотирована для обработки объемов, которые полезны для последующей обработки.

После лиофилизации содержание кислорода в композиции предшественника может быть уменьшено путем хранения препарата в атмосфере инертного газа, такого как азот. Это сводит к минимуму окислительные процессы, вызываемые кислородом в композиции предшественника, и следовательно, повышает устойчивость композиции при хранении.

Еще один аспект изобретения относится к композиции предшественника гидрогеля, которую можно получить или которая получена способом согласно изобретению, как обсуждалось.

Дополнительный аспект изобретения относится к набору, который включает по меньшей мере один контейнер, заполненный композицией предшественника гидрогеля, как обсуждалось, контейнер с реакционным буфером, и при необходимости, инструкции для пользователя. Набор содержит все необходимые компоненты для производства гидрогеля, чтобы облегчить быстрое и простое производство гидрогелей конечным пользователем.

Реакционный буфер набора может содержать ионы кальция в диапазоне от 1 до 200 мМ, предпочтительно от 10 до 100 мМ, более предпочтительно от 20 до 100 мМ. Ионы кальция, которые важны для активности сшивающего фермента, предпочтительно трансглутаминазы, более предпочтительно трансглутаминазы фактора XIII, обеспечиваются реакционным буфером, и таким образом, образование гидрогеля инициируется путем ресуспендирования порошка композиции предшественника гидрогеля в реакционном буфере. Реакционный буфер предпочтительно представляет собой солевой буферный раствор, более предпочтительно трис-буферный солевой раствор (TBS).

Кроме того, реакционный буфер может иметь рН в диапазоне от 5 до 8, предпочтительно от 6 до 8, более предпочтительно от 6,5 до 8.

Дополнительный аспект изобретения относится к способу получения гидрогеля, включающему этапы ресуспендирования композиций предшественника гидрогеля, как обсуждалось, в реакционном буфере, предпочтительно включающем ионы кальция, и при необходимости, добавление суспензии клеточной культуры.

По меньшей мере один гель может быть отлит с раствором предшественника гидрогеля в способе производства гидрогеля.

Время образования геля для раствора предшественника геля может находиться в диапазоне от 1 до 20 минут, предпочтительно от 2 до 10 минут, более предпочтительно от 2 до 7 минут, при температуре в диапазоне от 4 до 37°С, предпочтительно от 10 до 30°С, более предпочтительно от 15 до 25°С. Время образования геля - это время, в течение которого раствор предшественника геля является жидким до того, как происходит образование геля.

Время полимеризации раствора предшественника геля может находиться в диапазоне от 10 до 60 минут, предпочтительно от 15 до 45 минут, при температуре в диапазоне от 4 до 37°С, предпочтительно 37°С. Время полимеризации - это время, начинающееся от окончания времени образования геля и продолжающееся до завершения полимеризации геля.

Полимеризацию раствора предшественника геля предпочтительно проводят при 37°С и/или в увлажненной атмосфере для культивирования клеток.

Среда для культивирования клеток или буфер могут быть добавлены после полимеризации.

Соединения

Структурные соединения предпочтительно выбирают из группы, состоящей из олигомеров, полимеров, биосинтетических или натуральных белков или пептидов и полисахаридов. Предпочтительно структурными соединениями являются полимеры, выбранные из группы, состоящей из поли(этиленгликоля), поли(этиленоксида), поли(винилового спирта), поли(этилен-со-винилового спирта), поли(акриловой кислоты), поли(этилена-со-акриловой кислоты), поли(этилоксазолина), поли(винилпирролидона), поли(этилен-со-винилпирролидона), поли(малеиновой кислоты), поли(этилен-со-малеиновой кислоты), поли(акриламида) или блок-сополимеров поли(этиленоксида)-со-поли(пропиленоксида), или их смесей. Структурные соединения более предпочтительно представляют собой разветвленный поли(этиленгликоль) с тремя, четырьмя или более лучами, наиболее предпочтительно восьмилучевой поли(этиленгликоль).

Дополнительные аспекты и детали настоящего изобретения станут очевидными из приведенных ниже чертежей и примеров, которые показывают:

Фигура 1: Свойства гидрогелей в зависимости от времени (времени производства), в течение которого производственную смесь, содержащую предшественники геля в растворе, фактор XIII и тромбин, обрабатывали перед замораживанием и лиофилизацией; порошок затем ресуспендировали с образованием гидрогелей и анализом их свойств;

Фигура 2: Свойства гидрогелей, полученных из композиций предшественников гидрогеля согласно изобретению, по сравнению с гидрогелем, описанным в WO 2014/180970 А1;

Фигура 3: Свойства гидрогелей в зависимости от времени получения производственных смесей, содержащих предшественники геля в растворе, фактор XIII и тромбин с различными концентрациями перед замораживанием и лиофилизацией; порошок затем ресуспендировали с образованием гидрогеля и анализом его свойств;

Фигура 4: Предшественники гидрогеля для использования в однокомпонентных гелях (C; D) и двухкомпонентных гелях (A; B);

Фигура 5: Свойства гидрогелей, полученных из композиций предшественников гидрогеля в соответствии с изобретением, при увеличении времени изготовления по сравнению с гидрогелем, описанным в WO 2014/180970 A1;

Фигура 6: Диапазон активации фактора XIII в производственной смеси в зависимости от времени согласно изобретению;

Фигура 7: Фотография конечной точки времени образования геля для капли жидкого геля.

На Фигуре 1 показаны графики свойств гидрогелей в зависимости от времени (времени изготовления, которое является «временем процесса производства»), в течение которого смесь, включающая предшественники геля в растворе, фактор XIII и тромбин, хранили при комнатной температуре до замораживания и лиофилизации.

Гидрогели в соответствии с изобретением были изготовлены так, как показано на фигуре 6 (этап (а), затем этап (b) и этап (с) в соответствии с вариантом (i)). Эти свойства относятся ко времени образования геля (A), модулю сдвига G’(B) и набуханию Q (C). Смесь, содержащую 5% масс./об. структурного соединения A (функционализированного глутамин-содержащим субстратом) и B (функционализированного лизин-содержащим субстратом), фактор XIII при 20 Ед./мл и тромбин при 0,2 Ед./мл без ионов кальция, готовили и оставляли при комнатной температуре (от 20 до 25°С). В различные моменты времени смесь использовали для наполнения флаконов, которые замораживали при -80°C и затем лиофилизировали. После лиофилизации флаконы герметизировали, закрывали крышкой и хранили при -20°С. После этого флаконы использовали для образования гелей со структурными соединениями в концентрации 2,5% масс./об. путем ресуспендирования лиофилизированной смеси в соответствующем буфере (трис-буфер, 50 мМ; рН 7,6), содержащем 50 мМ ионов кальция, для индукции образования геля, катализируемого активированным фактором XIII в конечной концентрации 10 Ед./мл. Графики A, B и C на фигуре 1 показывают, что горизонтальное плато итоговых свойств гидрогеля достигается приблизительно через 2-4 часа после изготовления. Это означает, что процесс производства более 2 часов не влияет на конечные свойства гидрогеля. Характеристики гидрогеля (свойства гидрогеля) остаются по существу постоянными, когда время изготовления превышает 2 часа.

На фигуре 2 показано сравнение свойств гидрогелей, полученных способом по настоящему изобретению в соответствии с вариантом (i) (левый столбец в A, B и C) и в соответствии со способом предшествующего уровня техники из WO 2014/180970 A1 (правый столбец в А, В и С). Смесь согласно изобретению была приготовлена, как описано для фигуре 1, где время изготовления приводит к горизонтальному плато итоговых свойств гидрогеля (здесь свойства гидрогеля остаются по существу постоянными). В WO 2014/180970 А1 раскрыта отдельная активация фактора XIII тромбином в кальций-содержащем буфере при 37°С в течение 30 мин перед замораживанием активированного фактора XIII, который затем добавляют в растворы предшественника гидрогеля для образования гидрогеля. Сравнение данных показывает, что гидрогели, полученные в соответствии со способом по настоящему изобретению без отдельной предварительной активации фактора XIII, неожиданно демонстрируют сходное время образования геля, модуль сдвига G′ и набухание Q с гидрогелями, известными в данной области техники. Однако продукты, полученные в результате способа по настоящему изобретению, легче обрабатывать для конечного пользователя, поскольку лиофилизированный порошок можно использовать непосредственно путем добавления подходящего буфера для проведения реакции сшивания без взвешивания и с меньшими этапами перемешивания, которые могут вызвать ошибки.

На фигуре 3 показано сравнение свойств гидрогелей в зависимости от времени изготовления, где смесь, содержащую предшественники геля в растворе, фактор XIII и тромбин с различными концентрациями, хранили при комнатной температуре до замораживания и лиофилизации. Тромбин присутствовал в смеси, достигая конечных концентраций в полученных гелях 0,1 Ед./мл, 0,3 Ед./мл и 1 Ед./мл. Графики A, B и C показывают, что горизонтальное плато, представляющее свойства итоговых гелей (время образования геля, модуль сдвига G’, набухание Q), достигается быстрее при использовании более высоких концентраций тромбина в смеси. Смесь готовили, как указано для фигуры 1 (согласно варианту (i)), причем время изготовления для каждой концентрации тромбина указано на горизонтальной оси (оси X) графиков.

На фигуре 4 показаны гелевые компоненты, которые можно использовать в композиции предшественника гидрогеля или в способе получения композиции предшественника гидрогеля в соответствии с изобретением. Показаны структурные соединения однокомпонентных гелей (C, D) и двухкомпонентных гелей (A, B). Функциональные молекулы, такие как Глн-содержащий субстрат для сшивания фактором XIII, обозначенный как X, и лиз-содержащий субстрат для сшивания фактором XIII, обозначенный как Y, связаны с лучами поли(этиленгликоля). На фигуре 4C показан 4-лучевой поли(этиленгликоль) в качестве структурного компонента, включающего два остатка глутамина и два остатка лизина. На фигуре 4D показан 8-лучевой поли(этиленгликоль) в качестве структурного компонента, включающего четыре остатка глутамина и четыре остатка лизина. Как таковые, структурные компоненты на фигуре 4С и 4D образуют полимерную сеть, например, гидрогель при сшивании, катализируемом фактором XIII в присутствии ионов кальция.

Двухкомпонентные гели требуют двух разных типов молекул, где, например, структурный компонент представляет собой многолучевой поли(этиленгликоль), содержащий по меньшей мере три остатка глутамина, а линкерное соединение содержит два остатка лизина (фиг.4А). Линкерное соединение ковалентно связывает отдельные молекулы структурного соединения при сшивании, катализируемом фактором XIII в присутствии ионов кальция. Однако линкерное соединение не вносит непосредственного вклада в трехмерную природу гидрогеля, чему способствует разветвленное структурное соединение.

На фигуре 4B показан сценарий двух структурных соединений A и B. Структурные соединения A и B основаны на 8-лучевом поли(этиленгликоле), функционализированном глутамин-содержащим субстратом (структурное соединение A) и лизин-содержащим субстратом (структурное соединение B). Оба структурных соединения вносят вклад в трехмерную природу образующегося гидрогеля при сшивании, катализируемом фактором XIII в присутствии ионов кальция.

Фигура 5

На фигуре 5 показаны свойства (а именно, время образования геля, модуль сдвига G', набухание Q) гидрогелей, полученных из композиций предшественников гидрогеля в соответствии с изобретением, а именно, варианта (ii) (этап (b) перед этапом (a) с последующим этапом (c)), при увеличении времени производства по сравнению с гидрогелем, описанным в WO 2014/180970 A1.

Гидрогели, полученные из композиций предшественников гидрогелей по изобретению, были получены следующим образом:

Функционализацию многолучевого ПЭГ (8-лучевой ПЭГ-OH, Mn = 40 кДа, Nektar, Хантсвилл, Алабама, США) с винилсульфоновыми группами (8-лучевой ПЭГ-ВС) выполняли, как описано ранее (Ehrbar M, Rizzi SC, Hlushchuk R, Djonov V, Zisch AH, et al. (2007) “Enzymatic formation of modular cell-instructive fibrin analogs for tissue engineering”. Biomaterials 28: 3856-3866.; Bott K, Upton Z, Schrobback K, Ehrbar M, Hubbell JA, Lutolf MP, Rizzi SC, “The effect of matrix characteristics on fibroblast proliferation in 3D gels”, Biomaterials. 2010 Nov;31(32):8454-64). Вкратце, пептиды (Bachem, Швейцария), содержащие комплементарные субстраты для катализируемой фактором XIII поперечной сшивки, NQEQVSPLERCG-NH2 (TG-Gln) или Ac-FKGGGPQGIWGQERCG-NH 2 (W-Lys), связывали с восьмилучевым ПЭГ-ВС посредством реакции сопряженного присоединения по Михаэлю между винилсульфоновыми группами функционализированного на концах ПЭГ и тиолами пептидных цистеиновых остатков с образованием предшественников гидрогеля TG-ПЭГ с 8 лучами (структурное соединение A) и Lys-ПЭГ с 8 лучами (структурное соединение B), соответственно. После реакции сочетания растворы подвергали интенсивному диализу против сверхчистой ddH2O и затем сушили лиофилизацией. Пептид W-Lys также включал субстрат матриксной металлопротеиназы (ММП), чтобы сделать конечные гидрогели восприимчивыми к протеолитической деградации. Также возможно получать гели с другими типами кинетики и/или чувствительности к другим протеиназам путем соответствующей модификации аминокислотной последовательности.

Гидрогели, испытанные для фигуры 5, были получены в соответствии со способом изобретения, включающим этапы: Этап (а), Этап (b) перед Этапом (а), и Этап (с) согласно варианту (ii).

Используемые соединения получали, как описано выше. Вкратце, FXIII (конечная концентрация 172 или 200 Ед./мл) и тромбин (конечная концентрация 1,72 или 2 Ед./мл) в воде или буфере (1 мМ трис-буфер с 15 мМ NaCl, при отсутствии Ca2+) смешивали и предварительно инкубировали при 37°С в течение 30 мин. (этап (b)). Фактор XIII, таким образом, полностью активируется перед использованием на этапе (а). Затем этот раствор FXIII/тромбина смешивали при комнатной температуре с раствором, содержащим структурные соединения и А, и В в воде (проводимость <5 мкС/см) со стехиометрически сбалансированными реагирующими группами (этап (а)). Когда требуется, сшиваемое биологически активное соединение, например, TG-RGDGln также можно добавлять в производственную смесь. После этапа (а) в определенные моменты времени (как указано на оси Х графиков) образцы аликвотировали, замораживали и проводили этап (с). После повторного суспендирования непрореагировавших предварительных смесей порошков (которые включают активирующий фермент, тромбин, сшивающий фермент, FXIII и структурные соединения A и B, и при необходимости, биоактивное соединение TG-RGDGln) с соответствующим буфером (см. ниже), полученные гели имеют тот же конечный состав и характеристики, что и описанные для предшествующего уровня техники ниже.

Способ предшествующего уровня техники - катализируемые FXIII гидрогели на основе ПЭГ (Гели), полученные с использованием способов предшествующего уровня техники и используемые в качестве эталона для гидрогелей, полученных с помощью нового способа, описанного в настоящей заявке.

Чтобы предварительно активировать фактор XIII (FXIII) до FXIIIa, FXIII (Behring, Швейцария) активировали, как описано в предшествующем уровне техники, с образованием FXIIIa (Ehrbar M, Rizzi SC, Hlushchuk R, Djonov V, Zisch AH, et al. (2007) “Enzymatic formation of modular cell-instructive fibrin analogs for tissue engineering”. Biomaterials 28: 3856-3866.; WO 2014/180970 A1; Bott K, Upton Z, Schrobback K, Ehrbar M, Hubbell JA, Lutolf MP, Rizzi SC, “The effect of matrix characteristics on fibroblast proliferation in 3D gels”, Biomaterials. 2010 Nov;31(32):8454-64). Вкратце, восстановленный FXIII из лиофилизированного порошка (172,41 или 200 Ед./мл) активировали человеческим тромбином (Sigma, 1,72 или 2 Ед./мл) в течение 30 мин при 37°С в 1 мМ трис-буфере с 15 мМ NaCL и 2,5 мМ CaCl₂ (рН 7,6). Затем аликвоты FXIIIa хранили при -80°С и использовали для образования гелей, как описано ниже.

Вкратце, гели получали путем сшивки, катализируемой FXIII, из стехиометрически сбалансированного 8-лучевого TG-ПЭГ (структурный компонент A) и 8-лучевого Lys-ПЭГ (структурный компонент B), полученного, как описано выше. Например, 100 мкл геля (2,5% масс./об. сухой массы) содержит 1,22 мг Структурного компонента A и 1,28 мг Структурного соединения B. Реакция образования геля обычно происходит в трис-буфере (TBS, 50 мМ, pH 7,6), содержащем 50 мМ хлорида кальция и конечную концентрацию FXIIIa 10 Ед./мл, которую добавляют в качестве последнего этапа после смешивания структурных соединений A и B. Когда необходимо, сшиваемое биоактивное соединение, примером которого является пептид клеточной адгезии RGD (TG-RGDGln, аминокислотная последовательность: NQEQVSPL-GRGDSPG-NH2; Bachem, Швейцария) также добавляют в реакцию образования геля (конечная концентрация в геле 50 мкМ) перед добавлением FXIIIa. Затем сшивающую реакционную смесь инкубируют при 37°С и в увлажненной атмосфере с 5% СО₂ в течение 30-45 мин.

Механические испытания и анализ набухания гидрогелей

Время гелеобразования - это время, в течение которого раствор предшественника геля, изготовленный конечным пользователем для получения гелей, остается жидким до того, как становится твердым и начинает превращаться в гель, который больше нельзя обрабатывать с помощью устройств для обработки жидкости. Вкратце, когда непрореагировавшие порошковые предварительные смеси (полученные, как описано в этом изобретении, и содержащие все соединения для получения гелей) ресуспендирует конечный пользователь с помощью соответствующего буфера, начинается реакция сшивания (то есть образование геля), и время измеряют до тех пор, пока жидкий раствор 1 не образует «небольшую нить» 2, прилипшую к наконечнику 3 пипетки, как показано на Фигуре 7. Нить 2 является показателем того, что этот раствор 1 с отвердевающим гелем больше не может обрабатываться конечными пользователями с устройствами для обработки жидкости. Реакция полимеризации с образованием конечного геля затем продолжается до тех пор, пока реагирующие группы не будут израсходованы. Те же измерения выполняют для гелей, полученных способом из предшествующего уровня техники, и в этом случае измерения времени гелеобразования начинают, когда конечный пользователь добавляет предварительно активированный FXIII (FXIIIa) в качестве последнего ингредиента в раствор, содержащий все гелевые соединения, для начала реакции сшивания.

Гели (например, 2,5% масс./об. сухой массы) готовили, как описано выше в различных производственных протоколах. Жидкие капли гелей перед отверждением (объем 80 мкл) помещали между стерильными гидрофобными предметными стеклами для микроскопии (покрытыми SigmaCote, Sigma, США) с прокладками толщиной 1 мм, и превращали в гель при 37°C и в увлажненной атмосфере 5% CO2 в течение 45 минут. После завершения образования геля и набухания в PBS в течение 24 часов гелевые диски диаметром 8 мм изготавливали с использованием пуансона для биопсии, и затем хранили в том же буфере до механических испытаний.

Реологические измерения выполняли с использованием реометра (MCR 302, Anton Paar). Гели помещали между двумя параллельными пластинами реометра и сжимали до 80% их первоначальной толщины, чтобы избежать скольжения. Сканирование деформации на постоянных частотах было проведено, чтобы подтвердить, что измерения были выполнены в пределах линейного диапазона вязкоупругого поведения гидрогелей. Эластический модуль сдвига (G’) регистрировали при постоянных напряжениях как функцию частоты. Значение G ’для каждого образца набухшего диска рассчитывали как среднее значение G’, измеренное в диапазоне от 0,1 до 0,2 Гц. Все измерения проводили при комнатной температуре (22°С). Набухание Q (= WS/Wd) рассчитывали как массовое отношение гидрогелей при равновесии набухания в PBS (Ws) к их теоретической сухой массе (Wd) (Bott K, Upton Z, Schrobback K, Ehrbar M, Hubbell JA, Lutolf MP, Rizzi SC, “The effect of matrix characteristics on fibroblast proliferation in 3D gels”, Biomaterials. 2010 Nov;31(32):8454-64).

На фигуре 5 показаны результаты, полученные с использованием способа согласно изобретению (вариант (ii)), по сравнению с известными способами, как описано выше.

Способ согласно варианту (ii) соответствует процессу изготовления, включающему следующие этапы: Этап (b), затем Этап (a) и Этап (c). Вкратце, сшивающие и активирующие ферменты предварительно смешивали и предварительно инкубировали в течение 30 минут при 37°С (Этап (b)). Затем структурные соединения добавляли в предварительную смесь ферментов при комнатной температуре (начинается производство смеси) (Этап а)) и подвергали стерилизующей фильтрации, затем в моменты времени 0,6 часов, 1 час, 2 часа, 4 часа, 6 часов и 21,8 часов аликвоты производственной смеси лиофилизировали (Этап (с)).

Предварительную инкубацию FXIII с тромбином при отсутствии Ca²⁺ проводили при 37°С в течение 30 минут перед смешиванием с остальным раствором предшественника (включая структурные соединения) для получения производственной смеси. Этот способ предварительной инкубации полезен, поскольку FXIII, по-видимому, уже активирован на 100% (и/или аналогичен предшествующему уровню техники). Впоследствии, независимо от продолжительности, производственную смесь оставляли при комнатной температуре (время изготовления) до лиофилизации, конечные свойства геля не изменялись. Графики A, B и C на Фигуре 5 иллюстрируют, что конечные свойства геля (время образования геля, модуль сдвига G’, набухание Q) стабильны в течение времени изготовления, то есть времени, в течение которого производственная смесь оставалась при комнатной температуре до лиофилизации. Кроме того, конечные свойства геля аналогичны свойствам, полученным с помощью способа из известного уровня техники.

Фигура 6

Фигура 6 показывает активацию фактора XIII в производственной смеси согласно изобретению (вариант (i)), в зависимости от времени.

Гидрогели, полученные в соответствии со способом изобретения, включающим этапы: Этап (а), Этап (b) после Этапа (а), и Этап (с) в соответствии с вариантом (i).

Далее показано, как получают непрореагировавшие порошковые предварительные смеси, которые включают активирующий фермент (тромбин), сшивающий фермент (FXIII), Структурные соединения A и B, и при необходимости, биоактивное соединение TG-RGDGln. Эти лиофилизированные предварительные смеси затем используются конечным пользователем для получения 2,5% масс./об. сухой массы гелей. Итоговые гели 2,5% масс./об. содержат точно такие же структурные (и биоактивные) соединения, концентрации FXIII и тромбина, что и 2,5% масс./об. гели, полученные способом из известного уровня техники, описанным для фигуры 5.

Растворы 5% масс./об. обоих структурных соединений A и B (полученные, как указано выше) готовили в воде с проводимостью <5 мкС/см) и смешивали со стехиометрически сбалансированными реагирующими группами. FXIII и тромбин (оба растворены в воде в отдельных контейнерах) смешивали со смесью 5% масс./об. структурного соединения до конечной концентрации примерно 20 Ед./мл и 0,2 Ед./мл, соответственно. Соотношение единиц FXIII и единиц тромбина поддерживали на уровне 100:1, чтобы имитировать отношение сшивающего фермента и активирующего фермента, как в условиях предшествующего уровня техники.

Когда необходимо, сшиваемое биологически активное соединение, например, TG-RGDGln также можно добавлять в производственную смесь. Приготовление производственной смеси проводили при отсутствии Ca²⁺, а процесс выполняли при комнатной температуре. Значение рН производственной смеси находилось в диапазоне 6,5-8.

После смешивания всех соединений, как указано выше, производственную смесь затем подвергали стерилизующей фильтрации, например, используя обычные шприцевые фильтры с размером пор 0,22 мкм. Впоследствии стерильный раствор разливали в контейнеры, которые сделаны для лиофилизации, чтобы получить непрореагировавший порошок, готовый к использованию.

Вообще говоря, в определенные моменты времени (между 0,25 и 25 часами инкубации производственной смеси при комнатной температуре; см. Фигуры 1 и 6) аликвоты замораживали и лиофилизировали для получения непрореагировавшего порошка (на дне контейнера) со всеми соединениями, необходимыми для приготовления гелей. Свойства (время образования геля, модуль сдвига G’) гелей, полученных из таких смесей, которые хранили при комнатной температуре более 2-4 часов, оставались стабильными (см. ниже).

Приготовление гелей путем повторного суспендирования лиофилизированного непрореагировавшего порошка, содержащего все соединения, необходимые для приготовления гелей.

Непрореагировавший порошок (полученный путем лиофилизации производственной смеси после инкубации в разное время, этап (с)) ресуспендировали в трис-буфере (трис 50 мМ, рН 7,6), содержащем 50 мМ хлорида кальция, с образованием гелей с 2,5% масс./об. сухой массы структурного соединения, и итоговыми концентрациями фактора XIII и тромбина 10 Ед./мл и 0,1 Ед./мл, соответственно (аналогично гелям, полученным с помощью способа из предшествующего уровня техники, как показано на Фигуре 5). Типичные объемы повторной суспензии находятся в диапазоне от 50 до 1000 мкл. Физико-химические характеристики этих гелей измеряли, как указано ниже, и сравнивали с гелями, полученными с использованием способа из предшествующего уровня техники, как показано ниже.

Гели в соответствии с предшествующим уровнем техники были изготовлены и испытаны, как показано на фигуре 5. Испытания включали концентрации полностью активированного FXIII (FXIIIa, следуя способу предшествующего уровня техники) 10 Ед./мл (как эталон 100% активации) и 5 Ед./мл (как эталон 50% активации). Чтобы получить фигуру 6А, эти данные затем наносили на график со значениями с фигуры 1А, изображающими время образования геля как функцию от времени изготовления (произведенного, как указано для фигуры 1). Исходя из времени образования геля (фигура 6А), кажется, что FXIII в производственной смеси проявляет активность спустя примерно 1 часа и 4 часов сопоставимо с эталоном активации 50% и 100%, соответственно.

G 'тех же образцов наносили на график на Фигуре 6В, и значения G', аналогичные гелям предшествующего уровня техники (эталон 100% активации), были получены уже после примерно 2 часов изготовления. Это указывает, что FXIII в производственной смеси перед лиофилизацией не должен быть полностью активирован (т.е. по сравнению с эталоном 100% активации), так как активация FXIII может продолжаться и/или завершаться в процессе гелеобразования, когда лиофилизированный порошок повторно суспендируют с подходящим буфером (50 мМ трис-буфер, 50 мМ CaCl₂, pH 7,6). Однако активация FXIII в производственной смеси, близкой к 100%, является предпочтительной.

Предпочтительный вариант осуществления

Таблица 1

Концентрация/ активность Поставщик Тромбин человека 0,1 Ед./мл Sigma Фактор XIII 10 Ед./мл Behring Структурное соединение А 8-лучевой поли(этиленгликоль),
функционализированный глутамин-
содержащим субстратом
(NQEQVSPLERCG-NH2); 2,5% масс./об. Структурное соединение В 8-лучевой поли(этиленгликоль),
функционализированный лизин-
содержащим субстратом (Ac-
FKGGGPQGIWGQERCG-NH2); 2,5% масс./об. рН 7,6 Буфер 50 мМ трис-буфер, рН 7,6 Добавленный Са²⁺ 50 мМ Время производства 4 часа Время образования геля Приблизительно 3 минуты Модуль сдвига G' 700-900 Па Набухание Q 37-41

Группа изобретений относится к биохимии и биотехнологии. Предложены композиция предшественника гидрогеля в форме непрореагировавшего порошка, включающая активирующий фермент тромбин, сшивающий фермент трансглутаминазу фактор XIII, структурные соединения A или A и B, представляющие собой разветвленный полиэтиленгликоль, каждый из которых имеет функциональную группу; способ получения этой композиции; набор для получения гидрогеля, содержащий контейнер, заполненный композицией предшественника гидрогеля, контейнер с реакционным буфером, и при необходимости, инструкции для пользователя; способ получения гидрогеля путем ресуспендирования заявленной композиции в реакционном буфере, предпочтительно содержащем ионы кальция. Изобретения обеспечивают воспроизводимость гидрогелей, полученных из композиции предшественника гидрогеля, и улучшение их потребительских свойств. 4 н. и 9 з.п. ф-лы, 7 ил., 1 табл.

1. Композиция предшественника гидрогеля в форме непрореагировавшего порошка для получения гидрогеля, включающая:

- активирующий фермент, где указанный активирующий фермент представляет собой тромбин,

- сшивающий фермент, где указанный сшивающий фермент представляет собой трансглутаминазу фактор XIII, где сшивающий фермент активируется активирующим ферментом в воде с буфером или без буфера, предпочтительно в воде с проводимостью <5 мкС/см с буфером или без буфера, и/или предпочтительно с pH в диапазоне от 5 до 8, более предпочтительно от 6 до 8, наиболее предпочтительно от 6,5 до 8,

- по меньшей мере одно структурное соединение A, предпочтительно два различных структурных соединения A и B, где указанные структурные соединения А и В представляют собой разветвленный полиэтиленгликоль, каждый из которых имеет функциональную группу,

где указанное структурное соединение сшивается с помощью избирательной реакции, опосредованной сшивающим ферментом, с образованием гидрогеля, где сшивающий фермент активируется предпочтительно со степенью активации от 50 до 100%, предпочтительно от 75% до 100%, более предпочтительно от по существу 100%.

2. Композиция предшественника гидрогеля по п.1, по существу лишенная двухвалентных ионов, предпочтительно ионов кальция, где концентрация двухвалентных ионов предпочтительно составляет <10 мкМ, более предпочтительно <1 мкМ, наиболее предпочтительно <10 ч./млн.

3. Композиция предшественника гидрогеля по любому из пп.1 или 2, где по меньшей мере одно структурное соединение содержит по меньшей мере две различные реакционноспособные группы.

4. Композиция предшественника гидрогеля по любому из пп.1-3, где по меньшей мере одно структурное соединение содержит ацильный компонент, предпочтительно два ацильных компонента, и аминный компонент, предпочтительно два аминных компонента.

5. Композиция предшественника гидрогеля по любому из пп.1-4, включающая по меньшей мере одно дополнительное сшиваемое биоактивное соединение, содержащее последовательность RGD.

6. Композиция предшественника гидрогеля по любому из пп.1-5, где структурное соединение представляет собой 8-лучевой полиэтиленгликоль.

7. Способ получения композиции предшественника гидрогеля в форме непрореагировавшего порошка по любому из пп.1-6, включающий этапы:

а) смешивания

- активирующего фермента, где указанный активирующий фермент представляет собой тромбин,

- сшивающего фермента, где указанный сшивающий фермент представляет собой трансглутаминазу, более предпочтительно трансглутаминазу фактора XIII, где сшивающий фермент активируется активирующим ферментом в воде,

- по меньшей мере одного структурного соединения A, предпочтительно двух различных структурных соединений A и B, где указанные структурные соединения А и В представляют собой разветвленный полиэтиленгликоль, каждый из которых имеет функциональную группу в воде с буфером или без буфера, предпочтительно в воде с проводимостью <5 мкС/см с буфером или без буфера, и/или предпочтительно с pH в диапазоне от 5 до 8, более предпочтительно от 6 до 8, наиболее предпочтительно от 6,5 до 8,

b) до или после этапа (а) инкубации сшивающего фермента и активирующего фермента в течение времени, достаточного для того, чтобы характеристики геля оставались по существу постоянными, независимо от продолжительности времени изготовления, так что гидрогель, который образуется соответственно при использовании от 1 до 20% (мас./об.) структурного соединения, от 0,1 до 100 ед./мл сшивающего фермента и от 0,001 до 20 ед./мл активирующего фермента в буфере, содержащем ионы кальция диапазон от 1 до 200 мМ, предпочтительно от 10 до 100 мМ, с рН в диапазоне от 6,5 до 8,5 при температуре от 4°С до 37°С, имеет модуль сдвига G' в диапазоне от 100 до 15000 Па и коэффициенте набухания от 10 до 100;

с) при необходимости, после последнего из этапов (а) или (b), лиофилизации смеси,

где структурное соединение является сшиваемым посредством избирательной реакции, опосредованной сшивающим ферментом, и

где компоненты смешивают на этапе (а) в условиях, которые препятствуют реакции сшивания, опосредованной сшивающим ферментом.

8. Способ по п.7, где инкубацию смеси, полученной на этапе (а), проводят в течение по меньшей мере 0,5 часа, предпочтительно менее 24 часов, предпочтительно от 2 до 4 часов, при температуре в диапазоне от 4°С до 37°С, предпочтительно от 10°С до 25°С, более предпочтительно при комнатной температуре.

9. Способ по п.7 или 8, где сшивающий фермент имеет степень активации от 50% до 100%, предпочтительно от 75% до 100%, более предпочтительно по существу 100%, после этапа (b).

10. Способ по любому из пп.7-9, в котором по меньшей мере одно дополнительное соединение гидрогеля, предпочтительно по меньшей мере одно сшиваемое биоактивное соединение, добавляют на этапе (а).

11. Набор для получения гидрогеля, содержащий по меньшей мере один контейнер, заполненный композицией предшественника гидрогеля по любому из пп.1-6, контейнер с реакционным буфером, и при необходимости, инструкции для пользователя, где реакционный буфер включает ионы кальция в диапазоне от 1 до 200 мМ, предпочтительно от 10 до 100 мМ, более предпочтительно от 20 до 100 мМ, и где реакционный буфер имеет рН от 5 до 8, предпочтительно от 6 до 8, более предпочтительно от 7 до 8.

12. Способ получения гидрогеля, включающий этапы:

а) ресуспендирования композиций предшественника гидрогеля по пп.1-6 в реакционном буфере, предпочтительно содержащем ионы кальция,

b) при необходимости, добавления клеточной суспензии,

где по меньшей мере один гель залит с раствором предшественника гидрогеля.

13. Способ по п.12, где время образования геля для раствора предшественника геля находится в диапазоне от 1 до 20 минут, предпочтительно от 2 до 10 минут, более предпочтительно от 2 до 7 минут, при температуре в диапазоне 4°С до 37°С, предпочтительно от 10°С до 30°С, более предпочтительно от 15°С до 25°С.