Способ получения суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 и его использование в качестве профилактического средства от болезней сельскохозяйственных птиц Российский патент 2022 года по МПК C07K1/02 C12R1/125 

Предлагаемое изобретение относится к разделу органической химии, к пептидам, обладающим антимикробной активностью. Может быть использовано в биотехнологиях производства биопрепаратов для применения в сельском хозяйстве для профилактики заболевания птиц, что особенно актуально при скученном содержании птиц в условиях птицефабрик.

Бактерии рода Bacillus являются продуцентами 66 различных антимикробных пептидов (АМП), некоторые из которых были выделены, очищены и нашли широкое применение в промышленности. Высокую антагонистическую активность Bacillus в отношении различных патогенов связывают со способностью синтезировать широкий спектр нерибосомальных АМП, таких как липопептиды сурфактин, итурин, фенгицин, полимиксин, курстакин, активность которых опосредуется разрушением бактериальных мембран, что при длительном временном интервале приводит к развитию резистентности к липопептидам сходным по действию с действием традиционых антибиотиков [N. Larsen, L. Thorsen, E. N. Kpikpi, et al., Appl. Microb. and Biotech. 98 (2014)]. Известно [N.V. Feoktistova, A.M. Mardanova, G.F. Hadieva, M.R. Sharipova, Uchenye Zapiski Kazanskogo Universiteta. Seriya Estestvennye Nauki, 159 (2017)], например, таких как липопептиды семейств фенгицина, сурфактина и итурина проявляют антимикробную активность в отношении патогенных, условно-патогенных и фитопатогенных бактерий и микромицетов, а также перспективны как биологические поверхностно-активные вещества. При этом недостаточно изучено влияние антимикробных липопептидов на животных моделях.

Далее заявителем приведены термины и определения, использованные в заявочных материалах.

Антагонистическая активность бактерий определяет выживание микроорганизмов при их взаимодействии в бактериальных ассоциациях, которые являются частью ассоциативного симбиоза - многокомпонентной системы, где, кроме хозяина и доминантного микросимбионта, участвуют ассоциативные симбионты, выполняющие функцию формирования и обеспечении стабильности и продуктивности симбиоза [О.В. Бухарин и др. Ассоциативный симбиоз. Екатеринбург: УрО РАН, (2007), 264 с.].

Антагонизм микроорганизмов - тип несимбиотических взаимоотношений микроорганизмов, при котором один штамм полностью подавляет или замедляет рост другого [Антагонизм // Биологический энциклопедический словарь / глав. ред. М.С. Гиляров. - М.: Советская энциклопедия, (1986) - С. 28].

Диаметр зоны задержки (торможения) роста микроорганизма [см] - учитывают по полному подавлению роста микроорганизмов определяемому визуально. Диаметр зоны измеряют с точностью до 1 мм при помощи линейки [О.В. Носкова. Методическая разработка составлена на основании рабочей программы по учебной дисцыплине «Основы микробиологии иммунологии». Читинский медицинский колледж. Чита (2018)]. Диаметр зоны задержки роста соответствует степени чувствительности исследуемого микроорганизма к исследуемому липопептиду [В.В. Лысак, Р.А. Желдакова. Микробиология: методические рекомендации к лабораторным занятиям и контроль самостоятельной работы студентов / Авт. - сост. В.В. Лысак, Р.А. Желдакова. - Мн.: БГУ, (2002). - 100 с.].

Коэффициент конверсии корма - отношение количества затраченного корма к единице полученной продукции (например, к 1 кг привеса, 1 л молока и т.д.). Таким образом, чем больше коэффициент конверсии, тем больше корма необходимо затратить на производство животноводческой продукции. Более низкий коэффициент конверсии свидетельствует о высоком качестве используемых кормов. Коэффициент конверсии кормов зависит от двух основных физиологических процессов в организме животных: усвояемости питательных веществ и их переваримости. Эти процессы находятся под влиянием ряда факторов, которые объединены в 2 группы. Первая обусловлена факторами, связанными с кормом: структура рациона и свойства кормов (полноценность рациона, набор кормов, их качество, использование балансирующих добавок и др.), ко второй же относят особенности пищеварения животных [https://fermer.ru/forum/574/konversiya-korma-297708].

Липопептид - молекула липида, ковалентно связанного с пептидом, бактериальный липопротеин. Бактерии синтезируют большое количество липопептидов, некоторые из которых являются естественными антибиотиками [https://ru.wikipedia.org/wiki/Липопептиды].

Из исследованного уровня техники заявителем выявлены аналоги предполагаемого изобретения. При описании аналогов использована терминология их (аналогов) описаний.

Из исследованного уровня техники заявителем выявлена группа изобретений по патенту RU 2553547 «Штамм Bacillus subtilis, вырабатывающий пептид с противомикробной активностью, и способ ингибирования нежелательных микроорганизмов в материале с использованием штамма». Сущностью известного технического решения является Штамм Bacillus subtilis Maseca-1, вырабатывающий пептид, имеющий противомикробную активность против Micrococcus luteus, Bacillus cereus и Aspergillus flavus, депонированный в Американской Коллекции Типовых Культур (далее по тексту - АТСС) под номером РТА-8831. При этом следует акцентировать внимание на том, что штамм Bacillus subtilis Maseca-1, вырабатывающий пептид, имеет противомикробную активность против Micrococcus luteus, Bacillus cereus и Aspergillus flavus.

Штамм Bacillus subtilis Maseca-1 был депонирован в международном депозитории, в условиях, которые гарантируют, что доступ к культуре был доступен в ходе рассмотрения данной патентной заявки кому-либо, определенному Комиссаром по Патентам и Торговым Знакам, уполномоченным для этой цели согласно 37 C.F.R. 1.14 и 35 U.S.C. 122. Штамм Bacillus Maseca-1, раскрытый в данном описании, был депонирован в АТСС, 10801 University Blvd., Манассас, Виргиния, 20110 США, как РТА-8831. Депозит был получен АТСС 12 декабря 2007 года и ему Международным Депозитарным Органом был присвоен учетный номер РТА-8831.

Bacillus subtilis Maseca-1 представлен в форме вегетативных клеток, спор или их комбинацией и раскрыт способ ингибирования нежелательных микроорганизмов Micrococcus luteus, Bacillus cereus и Aspergillus flavus в материале, содержащем или подвергнутом действию микроорганизмов, который включает воздействие на не идентифицированный в описании по изобретению материал эффективного количества штамма Bacillus subtilis Maseca-1, который является испеченным пищевым продуктом.

Недостатком известного технического решения является отсутствие антибактериальной активности продуцируемых штаммом Bacillus subtilis Maseca-1 пептидов в отношении вредоносных условно-патогенных грамположительных бактерий Sarcina sp., Enterococcus faecalis, Bacillus pumilus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus hominis, Streptococcus agalactiae. Кроме того, продуцируемые штаммом Bacillus subtilis Maseca-1 пептиды не применимы против вредоносных условно-патогенных грамотрицательных бактерий Serratia marcescens, Enterobacter ludwigii и микромицетов Fusarium sp. и Alternaria sp., вызывающих болезни животных и птиц, например - некротический энтерит птиц. Таким образом, приведенные недостатки существенно ограничивают область применения технического решения по патенту RU 2553547 в области сельского хозяйства, в частности - в птицеводстве.

Из исследованного уровня техники заявителем выявлена группа изобретений по патенту RU 2117672 «Липопептиды, способ получения, лекарственное средство и штамм Actinoplanes sp. DSM 7358 в качестве продуцента липопептидов». Сущностью известного технического решения является липопептиды общей формулы

разновидности которого различаются длиной цепи атомов углерода, а способ получения липопептидов заключается в том, что культивируют продуцента Actinoplanes sp. DSM 7358 в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные вещества в аэробных условиях с последующим выделением по методу кислотного осаждения целевого продукта и его очисткой по различным технологиям: хроматографией на ионообменных смолах, или хроматографией на гидрофобной матрице. Выделенный целевой продукт отличается антибиотической активностью против устойчивых к гликопептидам грамположительных бактерий.

Недостатком известного технического решения является узкий спектр действия, а именно - отсутствие антибактериальной активности продуцируемых Actinoplanes sp. DSM 7358 липопептидов в отношении условно-патогенных грамотрицательных бактерий, вызывающих болезни животных, например - диарею, иные кишечные инфекции.

Недостатки известного технического решения существенно ограничивают область применения известного технического решения по патенту RU 2117672 в области сельского хозяйства, в частности - в птицеводстве.

Из исследованного уровня техники заявителем выявлены изобретения по патенту RU 2663720 «Пробиотик на основе штамма бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 и способ применения пробиотика для профилактики желудочно-кишечных заболеваний у сельскохозяйственных животных и птиц».

Сущностью известного технического решения является пробиотик на основе бактерии рода Bacillus вида Bacillus subtilis штамма MG-8 ВКПМ В-12476, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-12476, устойчивый к антибиотикам и обладающий широким спектром антагонистического воздействия в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий, микромицетов. Способ применения пробиотика для животных заключается в получении биомассы, содержащей бактерии рода Bacillus вида Bacillus subtilis штамма MG-8 ВКПМ В-12476 и продукты их метаболизма, смешивании биомассы с полнорационным комбикормом в соотношении 1,0±0,3 л культуральной жидкости на 100 кг комбикорма, скармливании этого комбикорма в количестве 0,1-1,0% от живой массы животного в течение 7-10 сут с последующим перерывом в 15-25 сут и ежемесячным повторением этого курса профилактики в течение всего периода содержания животных, способ применения пробиотика для сельскохозяйственных птиц заключается в получении биомассы, содержащей бактерии рода Bacillus вида Bacillus subtilis штамма MG-8 ВКПМ В-12476 и продукты их метаболизма, смешивании биомассы с полнорационным комбикормом в соотношении 1,0±0,5 л культуральной жидкости на 100 кг комбикорма, скармливании этого комбикорма в количестве 1,0-2,0% от живой массы птицы в течение всего периода содержания птицы.

Недостатком известного технического решения является кратковременность срока хранения пробиотика на основе живой культуры бактерии рода Bacillus вида B. subtilis штамма MG-8 ВКПМ В-12476 и сложность соблюдения условий хранения, а именно - потребность применения холодильников и соблюдения стабильной температуры хранения, кратковременность сохранения эффективности пробиотика после вскрытия упаковки. Недостаток известного технического решения существенно ограничивает область применения пробиотика по патенту RU 2663720 на основе живой культуры в сельском хозяйстве, в частности - в птицеводстве.

Наиболее близким по совокупности совпадающих признаков и техническому результату к заявленному техническому решению, выбранный в качестве прототипа, является известный липопептидный препарат «CUBICIN®» (Cubist Pharmaceuticals, Inc., Lexington, MA) по патенту RU 2607526 «Липопептидные композиции и родственные способы». Сущностью известного технического решения является твердая фармацевтическая композиция антибиотика даптомицина для лечения бактериальной инфекции, где указанную композицию получают путем лиофилизации или распылительной сушки водного раствора даптомицина, содержащего даптомицин и по меньшей мере один эксципиент, выбранный из сахарозы или трегалозы, где молярное отношение даптомицина к эксципиенту составляет от 1:1,12 до 1:21,32. Фармацевтические композиции даптомицина различаются способами получения, используемыми буферными агентами (двухосновной фосфат натрия, цитрат натрия, бикарбонат натрия, моногидрохлорид гистидина, трис(гидроксиметил)аминометана, малеата или их комбинации), разбавителями (стерильная вода, стерильный хлорид натрия, бактериостатическая вода), рН водного раствора от 6.5 до 7.5, технологиями лиофилизации. Прототип на основе циклического липопептидного антибиотика даптомицина предназначен для лечения сложных инфекций кожи и структуры кожи и бактериемии, включая бактериемию с подозреваемым или доказанным инфекционным эндокардитом. Даптомицин для инъекции вводят внутривенно для лечения обозначенных инфекций, вызванных чувствительными штаммами многочисленных грамположительных микроорганизмов, включая метициллин-резистентный Staphylococcus aureus (MRSA).

Недостатком прототипа является:

1 - узкий спектр полезного действия антибиотика даптомицина,

2 - низкая результативность, т.е. низкая эффективность использования по назначению, ограниченная инфекциями кожи, структуры кожи, бактериемией,

3 - сложность способа использования для массового применения (инъекция),

4 - неприменимость против наиболее распространённых в животноводстве кишечных болезней - диареи, энтерита, кокцидозов,

5 - не проявляет активности в отношении грамотрицательных условно-патогенных бактерий и мицелиальных грибов (далее по тексту - микромицетов) - возбудителей микотоксикозов,

6 - антибактериальная активность ограничивается ингибированием роста грамположительных микроорганизмов, включая метициллин-резистентный Staphylococcus aureus,

7 - не влияет на суточный привес цыплят-бройлеров,

8 - не влияет на усвояемость корма цыплят-бройлеров.

Таким образом, недостатки прототипа (по патенту RU 2607526) существенно ограничивают область его применения в сельском хозяйстве, например, в птицеводстве.

Целью и заявленным техническим результатом предполагаемого изобретения является разработка способа получения и использования профилактического средства на основе суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476, обладающего широким спектром антимикробного воздействия в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий с грамположительным и грамотрицательным морфотипом, микромицетов - возбудителей микотоксикозов, используемого для профилактики болезней сельскохозяйственных птиц.

Средство на основе липопептидов, получаемое заявленным способом, обеспечивает:

1 - широкий спектр полезного действия суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476,

2 - высокую результативность, т.е. высокую эффективность использования по назначению для профилактики кишечных инфекций,

3 - легкость способа использования для массового применения (добавление в комбикорм),

4 - применимость против наиболее распространённых в животноводстве кишечных болезней - диареи, энтерита, кокцидозов,

5 - активность в отношении грамотрицательных условно-патогенных бактерий и микромицетов - возбудителей микотоксикозов,

6 - антибактериальную активность, которая не ограничивается ингибированием роста грамположительных микроорганизмов,

7 - повышение среднесуточного привеса цыплят-бройлеров,

8 - повышение усвояемости корма цыплят-бройлеров.

Сущностью заявленного технического решения является способ получения суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476, заключающийся в том, что берут маннит - 26.2 г/л, соевую муку - 21.9 г/л, NaNO₃ - 3.1 г/л, MnSO₄ х 4H₂O - 0.2 г/л при pH 7.5, автоклавируют при 121°C и 1 атм, при этом создают питательную среду; далее выполняют посев на питательную среду культуры B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476, с получением 2%-й концентрации клеток штамма в питательной среде; далее выполняют культивирование клеток штамма в термостате-шейкере при температуре от + 37°С до + 42°C и интенсивности качания 200 об/мин в течение 96 часов, получают биомассу клеток штамма-продуцента бактерий B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476; далее выполняют удаление клеток штамма B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 из полученной биомассы клеток, получают бесклеточную культуральную жидкость; далее выполняют выделение целевого продукта липопептидов из бесклеточной культуральной жидкости методом кислотного осаждения; далее выполняют высушивание и стерилизацию суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476; далее выполняют фасовку целевого продукта и хранение полученной сухой фракции липопептидов до его использования по назначению. Способ использования суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 по п.1 в качестве профилактического средства от болезней сельскохозяйственных птиц заключающийся в том, что вносят высушенную суммарную фракцию липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 в полнорационный комбикорм в количестве от 10 до 50 мг на 1 кг корма в зависимости от возраста сельскохозяйственных птиц в течение периода откорма, перемешивают, проводят кормление птиц.

Заявленное техническое решение поясняется Фиг.1 - Фиг.3.

На Фиг. 1 приведена антагонистическая активность суммарной фракции липопептидов, выделенных на разных стадиях роста Bacillus subtilis MG-8 В-12476 (далее по тексту В. subtilis MG-8 В-12476) при температуре тела человека (+37°С) и птицы (+42°С) против микромицетов Fusarium sp. и Alternaria sp., где:

Fusarium sp.1, Fusarium sp. 2, Alternaria sp. - рода микромицета,

А - диаметр зоны ингибирования фракцией липопептидов роста микромицета Fusarium sp.1, [мм],

B - диаметр зоны ингибирования фракцией липопептидов роста микромицета Fusarium sp. 2, [мм],

C - диаметр зоны ингибирования фракцией липопептидов роста микромицета Alternaria sp., [мм].

На Фиг. 2 представлена Таблица 1, в которой приведена антибактериальная активность суммарной фракции липопептидов В. subtilis MG-8 В-12476 в отношении непатогенных, патогенных и условно-патогенных бактерий Micrococcus luteus, Sarcina sp., Staphylococcus aureus, Staphylococcus hominis, Enterococcus faecalis, Bacillus cereus, Bacillus pumilus, Citrobacter freundii, Acinetobacter calcoaceticus, Serratia marcescens, Enterobacter ludwigii, где:

T - продолжительность культивирования штамма Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 (часы) при естественной температуре тела птицы t = +42°С.

На Фиг. 3 представлена Таблица 2, в которой приведены показатели роста цыплят-бройлеров кросса Кобб 500 с добавлением и без добавления в рацион заявленной суммарной фракции липопептидов В. subtilis MG-8 В-12476, где:

№ 1 - контрольная группа, получала полнорационный комбикорм,

№ 2 - опытная группа, получала полнорационный комбикорм с добавлением 10 мг суммарной фракции липопептидов В. subtilis MG-8 В-12476 на 1 кг корма,

№ 3 - опытная группа, получала полнорационный комбикорм с добавлением 30 мг суммарной фракции липопептидов В. subtilis MG-8 В-12476 на 1 кг корма,

№ 4 - опытная группа, получала полнорационный комбикорм с добавлением 50 мг суммарной фракции липопептидов В. subtilis MG-8 В-12476 на 1 кг корма.

Далее заявителем приведено описание заявленного технического решения.

Цели заявленного технического решения достигают разработкой способа получения и использования профилактического средства на основе суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476.

Далее заявителем приведена общая последовательность действий заявленного способа получения суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476:

- берут известные как таковые реактивы маннит - 26.2 г/л, соевую муку - 21.9 г/л, NaNO₃ - 3.1 г/л, MnSO₄ х 4H₂O - 0.2 г/л при pH 7.5, автоклавируют при 121°C и 1 атм, при этом создают питательную среду,

- выполняют посев на питательную среду культуры B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476, с получением 2%-й концентрации клеток штамма в питательной среде,

- далее выполняют культивирование клеток штамма в термостате-шейкере при температуре от + 37°С до + 42°C и интенсивности качания 200 об/мин в течение 96 часов, получают биомассу клеток штамма-продуцента бактерий B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476,

- далее выполняют удаление клеток штамма B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 из полученного концентрата клеток, получают бесклеточную культуральную жидкость,

- далее выполняют выделение собственно целевого продукта липопептидов из бесклеточной культуральной жидкости методом кислотного осаждения,

- далее выполняют высушивание и стерилизацию суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476,

- далее выполняют фасовку целевого продукта и хранение полученной сухой фракции липопептидов до его применения по назначению.

После получения целевого продукта выполняют растворение высушенной фракции липопептидов бактерии B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 в ДМСО для контроля качества антимикробной активности против тест-культур.

Заявитель поясняет, что температура культивирования ограничена пределами от +37°С до +42°C, так как +37°С является естественной температурой тела человека, а +42°C естественная температура тела цыплят-бройлеров.

Далее заявителем приведена общая последовательность действий заявленного способа использования суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 в качестве профилактического средства от болезней сельскохозяйственных птиц:

- вносят высушенную суммарную фракцию липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 в полнорационный комбикорм в количестве от 10 до 50 мг на 1 кг корма в зависимости от возраста сельскохозяйственных птиц в течение периода откорма,

- перемешивают,

- проводят кормление птиц.

Далее заявителем приведены примеры осуществления заявленного технического решения.

Пример 1. Получение суммарной фракции липопептидов B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 при температуре культивирования клеток штамма в термостате-шейкере + 37°С

Сначала получают биомассу клеток штамма-продуцента бактерий B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 известным способом [Hadieva, G., Lutfullin, M., Pudova, D., Akosah, Y., Shagimardanova, E., Gogoleva, N., Sharipova M., Mardanova, A. Supplementation of Bacillus subtilis GM5 enhances broiler body weight gain and modulates cecal microbiota. 3Biotech 11, 126 (2021)].

Для этого берут известные как таковые реактивы маннит - 26.2 г/л, соевую муку - 21.9 г/л, NaNO₃ - 3.1 г/л, MnSO₄ × 4H₂O - 0.2 г/л при pH 7.5, автоклавируют при 121°C и 1 атм, при этом создают питательную среду.

Далее выполняют посев на питательную среду культуры B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476, получают 2%-ю концентрацию клеток штамма в питательной среде.

Далее выполняют культивирование клеток штамма в термостате-шейкере, например, фирмы “IKA®KS 4000” (Германия), при температуре, например, + 37°С и интенсивности качания 200 об/мин в течение 96 часов, получают биомассу клеток штамма-продуцента бактерий B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476.

Заявитель поясняет, что интенсивность качания термостата-шейкера 200 об/мин, использованного в проведенных исследованиях, ограничивается параметрами термостата-шейкера, и при использовании более низких оборотов уменьшается и процент выхода целевого продукта.

Далее выполняют удаление клеток штамма B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 из полученной биомассы, например, центрифугированием, например, на центрифуге фирмы Eppendorf при 14000 об/мин в течение 30 мин при + 4°С, получают бесклеточную культуральную жидкость.

Для целей проверки чистоты эксперимента, заявителем проводилось определение антимикробной активности каждые 24 часа, посредством отбора из колбы по 100 мл бесклеточной культуральной жидкости.

Далее выполняют выделение собственно целевого продукта липопептидов из бесклеточной культуральной жидкости известным как таковым методом кислотного осаждения, для чего бесклеточную культуральную жидкость подкисляют, например, добавлением 6 N HCl до конечного pH 2.5 для осаждения тяжелых по молекулярной массе белков. Далее полученный осадок удаляют центрифугированием, например, при 10000 об/мин в течение 10 мин при + 4°С. Далее отделенный осадок растворяют в 50% этаноле (22.5 мл), после чего выполняют подщелачивание осадка добавлением 1 N NaOH до конечного pH 7.5. Получают промежуточный продукт - раствор белков.

Далее раствор белков центрифугируют, например, при 10000 об/мин в течение, например, 10 мин при + 4°С. Получают легкие по молекулярной массе липопептиды.

Полученные легкие липопептиды разбавляют в 20 мл дистиллированной воды, далее повторно осаждают добавлением 6 N HCl до конечного pH 2.5.

Далее легкие липопептиды центрифугируют, например, при 10000 об/мин в течение, например, 10 мин при + 4°С.

Таким образом получают суммарную фракцию липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476.

Далее выполняют высушивание и стерилизацию суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476, для чего их лиофильно высушивают, например, на роторном испарителе при температуре не более + 60°C, предпочтительно +37°C, т.к. эта температура является рекомендованной для используемого роторного испарителя.

Получают целевой продукт в виде высушенной суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476.

Выход = 0.106 ± 0.029 г/л культуральной жидкости.

Далее выполняют фасовку целевого продукта на фасовочном аппарате для фасовки сыпучих продуктов, и хранение полученной сухой фракции липопептидов до его применения по назначению. Продукт хранится в упаковке в стерильных условиях при температуре в диапазоне от - 40°С до + 40°С, и сохраняет свою эффективность в течение 24 месяцев после вскрытия упаковки.

Далее проводят контроль качества полученного целевого продукта для определения антимикробной активности против тест-культур, для чего растворяют высушенную фракцию липопептидов бактерии B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 в ДМСО и проводят контроль качества по известным методикам - см. Примеры № 5, 6. При этом заявитель поясняет, что данное действие используется исключительно для контроля качества антимикробной активности против тест-культур.

Пример 2. Получение суммарной фракции липопептидов B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 при температуре культивирования клеток штамма в термостате-шейкере + 42°С

Проводят последовательность действий аналогично Примеру 1, отличающуюся тем, что культивирование клеток штамма в термостате-шейкере проводят при температуре + 42°C.

Получают целевой продукт в виде высушенной суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476.

Выход = 0.107 ± 0.029 г/л культуральной жидкости.

Далее проводят контроль качества полученного целевого продукта для определения антимикробной активности против тест-культур, для чего растворяют высушенную фракцию липопептидов бактерии B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 в ДМСО и проводят контроль качества по известным методикам - см. Примеры № 5, 6. При этом заявитель поясняет, что данное действие используется исключительно для контроля качества антимикробной активности против тест-культур.

Пример 3. Получение суммарной фракции липопептидов B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 при температуре культивирования клеток штамма в термостате-шейкере + 40°С

Проводят последовательность действий аналогично Примеру 1, отличающуюся тем, что культивирование клеток штамма в термостате-шейкере проводят при температуре + 42°C.

Получают целевой продукт в виде высушенной суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476.

Выход = 0.106 ± 0.029 г/л культуральной жидкости.

Далее проводят контроль качества полученного целевого продукта для определения антимикробной активности против тест-культур, для чего растворяют высушенную фракцию липопептидов бактерии B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 в ДМСО и проводят контроль качества по известным методикам - см. Примеры № 5, 6. При этом заявитель поясняет, что данное действие используется исключительно для контроля качества антимикробной активности против тест-культур.

При этом заявитель поясняет, что в Примерах 1 - 3 температура культивирования в термостате-шейкере в условиях эксперимента варьировалась в широком диапазоне а именно - в диапазоне от 37°С до 42°C. При этом заявитель поясняет, что не выявлено влияние темпратуры на результаты выхода целевого продукта, т.е. на собственно синтез липопептидов бактерии B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476, из чего можно сделать логический вывод о том, что результаты исследования, полученные на цыплятах-бройлерах, могут быть транслированы в организм млекопитающих, в том числе и человека.

Пример 4. Использование суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 в качестве профилактического средства от болезней на примере цыплят-бройлеров

Эксперименты на цыплятах-бройлерах провели в условиях фермерского хозяйства «Лачын» («КФХ Алимчуева З.И.», Медведевский район, республика Марий Эль, Россия). Для эксперимента из местного коммерческого инкубатора (Медведевский район, Марий Эл, Россия).

Цыплят-бройлеров содержали в одинаковых вентилируемых клетках при комнатной температуре и освещении. Все эксперименты с цыплятами проводили с соблюдением биоэтических норм. Содержание, кормление и уход за животными, а также умерщвление животных для отбора проб проводили согласно требованиям Директивы Европейского парламента и Совета о защите животных, используемых в научных целях, от 22 сентября 2010 года (Директива 2010/63 / UE о защите животных, используемых в научных целях) по уходу и использованию экспериментальных животных.

В ходе эксперимента проводили ежедневное взвешивание цыплят-бройлеров 4-х групп для определения как веса так и среднесуточного прироста массы тела отдельного цыпленка. Количество потребляемого корма определено путем измерения остатка корма на еженедельной основе с начала эксперимента. Коэффициент конверсии корма (Фиг. 3) рассчитан путем деления потребленного корма на прирост массы тела.

Так как по Примерам 1 - 3 получен равноценный целевой продукт (порошок суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476), для изучения использования суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 в качестве профилактического средства от болезней птиц был произвольно выбран целевой продукт, полученный по Примеру 1, в виде порошка суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 (далее - порошок).

Порошок вносили в полнорационный комбикорм посредством простого механического перемешивания, например, на мешалке для комбикормов Push Pumps, при этом цыплята-бройлеры получали от 10 до 50 мг порошка на 1 кг корма в зависимости от от возраста.

Для исследования взяли 120 суточных цыплят-бройлеров кросса Кобб 500. Из них сформировали 4 группы по 30 цыплят без разделения по полу:

№ 1 - контрольная группа, получала полнорационный комбикорм,

№ 2 - опытная группа, получала полнорационный комбикорм с добавлением 10 мг суммарной фракции липопептидов В. subtilis MG-8 В-12476 на 1 кг корма,

№ 3 - опытная группа, получала полнорационный комбикорм с добавлением 30 мг суммарной фракции липопептидов В. subtilis MG-8 В-12476 на 1 кг корма,

№ 4 - опытная группа, получала полнорационный комбикорм с добавлением 50 мг суммарной фракции липопептидов В. subtilis MG-8 В-12476 на 1 кг корма.

Результат использования суммарной фракции липопептидов В. subtilis MG-8 В-12476 выявлен путем сравнительного анализа параметров роста цыплят-бройлеров контрольной и опытных групп.

На 35-е сутки средний привес массы одного цыпленка контрольной группы №1 составил 1298.0 ± 49.00 г, а цыплят опытной группы №4 - 1463.0 ± 76.25 г, что на 12.7 % (≈ 13%) выше контроля (Таблица 2 на Фиг. 3). Суточное потребление корма у цыплят опытной группы №4 составляет 3227.05±124.81 г в сравнении с контрольной группой №1 (3064.57 ± 115.49 г), что на 5.30 % превышает потребление корма контрольной группы. Среднесуточный привес цыплят опытной группы №4 составил 41.80 ± 1.86 г. Среднесуточный привес цыплят контрольной группы №1 составил 37.09 ± 1.40 г. Суточный привес цыплят опытной группы №4 составляет (41,8 х 100 %) / 37,09 ≈ 114 %, то есть на 14 % превышает суточный привес цыплят контрольной группы №1.

Конверсия корма у цыплят опытной группы №4 ниже на 6.36% и составляет 2.21 условных единиц (у.е.), в контрольной группе №1 - 2.36 у.е. (Таблица 2 на Фиг. 3). Известно - чем больше коэффициент конверсии, тем больше корма необходимо затратить на производство животноводческой продукции. Более низкий коэффициент конверсии свидетельствует о более высоком уровне усвояемости используемых кормов.

Таким образом, из Примера 4 можно сделать вывод, что суммарная фракция липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476, полученная по заявленному способу, при добавлении в полнорационный комбикорм улучшает показатели продуктивности, из чего можно сделать логический вывод о благоприятном воздействии на устранение кишечных инфекций сельскохозяйственных птиц и улучшении усвояемости, что доказывает достижение заявленного технического результата.

Пример 5. Оценка фунгистатической активности суммарной фракции липопептидов B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476

Экспериментально установлено, что суммарная фракция липопептидов В. subtilis MG-8 В-12476, в отличие от прототипа, ингибирует (задерживает, подавляет) рост и развитие микромицетов - возбудителей микотоксикозов животных и человека. Результаты исследования зоны подавления роста микромицетов представлены на Фиг. 1.

Для исследования фунгистатической активности суммарной фракции липопептидов B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 стерильным пробочным сверлом вырезают блоки чистых культур микромицетов Fusarium sp. и Alternaria sp. и помещают их в центр чашки Петри на среду Чапека следующего состава: (г/л: глюкоза - 14.0, CaCO₃ - 0.7, KNO₃ - 0.7, MgSO₄ - 0.35, NaCl - 0.35, K₂HPO₄ - 0.35, FeSO₄ - следы; агар-агар - 20.0). Стерильным пробочным сверлом вырезают лунки диаметром 7.0 мм, в которые добавляют разные фракции липопептидов в концентрации 10 мг/мл по 25.0 мкл. В качестве контроля используют DMSO. Расстояние между лунками 15-20 мм. Чашки инкубируют при + 28°С (оптимальная температура роста микромицетов) в течение 7 суток (188 ч). Фунгистатическую активность оценивают по диаметру зоны подавления роста микромицета.

Активность липопептидных фракций исследовали в отношении микромицетов Fusarium sp. 1, Fusarium sp. 2, Alternaria sp. и оценивали по диаметру зоны подавления роста колонии тест-культуры после истечения 4-х суток.

Как видно на Фиг. 1, разные штаммы Fusarium различаются по чувствительности к липопептидам. Максимальную активность фракции липопептидов проявляют в отношении изолята Fusarium sp. 2 (Фиг. 1В). Максимальную активность в отношении двух изолятов фузарий проявляет суммарная фракция липопептидов, выделенная через 48 ч культивирования при + 37°C. В отношении Fusarium sp. 1 максимальный ингибирующий эффект проявляют фракции, выделенные через 24 и 48 ч культивирования бацилл, инкубированные при + 37°C (Фиг.1А). Не выявлена зависимость активности фракции от температуры культивирования. Можно сделать вывод о том, что при + 37°C максимум активности липопептидов в отношении штаммов Fusarium sp. достигается через 48 ч культивирования В. subtilis MG-8 В-12476.

Максимальную активность в отношении Alternaria sp. проявляют фракции липопептидов, выделенные через 48 ч роста из культуры В. subtilis MG-8 В-12476, инкубированной при + 37°С. Установлено, что выделенные через 72 час культивирования и инкубированные при + 37°С и +42°С фракции липопептидов ингибируют рост Alternaria sp. с четвертой (4) по седьмые (7) сутки (Фиг. 1С), в отличие от фракций липопептидов, выделенных после культивирования в течение 24 и 48 ч; инкубированная при + 42°С 96-ти часовая фракция сохраняет стабильную ингибирующую активность в отношении Alternaria sp. с четвертой (4) по седьмые (7) сутки (Фиг. 1С).

Таким образом, рост микромицета Alternaria sp. эффективнее ингибируют фракции, полученные из бесклеточной культуральной жидкости B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 при + 37°С.

Пример 6. Оценка антибактериальной активности суммарной фракции липопептидов B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476

Для оценки антибактериальной активности использовали фракции, полученные через 24, 48, 72 и 96 ч роста (культивирования), например, при + 37°С.

Суммарная фракция липопептидов В. subtilis MG-8 В-12476 характеризуется антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных бактерий с грамположительным и грамотрицательным морфотипом строения клеточной стенки. Для исследования антибактериальной активности суммарной фракции липопептидов B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 на поверхность среды LA (г/л: триптон - 10.0, дрожжевой экстракт - 5.0, NaCl - 5.0, агар-агар (2 %) - 20.0) в чашке Петри газоном засевают бактериальные грамположительные тест-культуры Micrococcus luteus, Sarcina sp., Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus hominis, Enterococcus faecalis, Bacillus cereus, Bacillus pumilus и грамотрицательные Enterobacter ludwigii, Serratia marcescens по 100.0 мкл. Затем стерильным пробочным сверлом в агаризованой среде вырезают лунки диаметром 7.0 мм, в которые вносят разные фракции липопептидов в концентрации 10 мг/мл по 25.0 мкл. В качестве контроля используют ДМСО. Расстояние между лунками 15 - 20 мм. Посевы в чашках Петри инкубируют при + 37°С в течение 24 часов. Антибактериальную активность оценивают по диаметру зоны подавления роста тест-культур.

Результаты исследования антибактериальной активности фракции липопептидов B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 представлены в Таблице 1 на Фиг. 2. Наибольшую антимикробную активность в отношении Sarcina sp. среди всех исследованных фракций проявляет фракция липопептида, выделенная через 96 ч культивирования. Диаметр зоны подавления роста фракции липопептидов через 24 ч культивирования существенно превышает зону подавления роста в отношении M. luteus, E. faecalis 2 и составляет 19.00±7.07 мм и 19.9±3.96 мм (Таблица 1 на Фиг. 1). Выделенная через 48 ч культивирования (роста) бактерий B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 фракция липопептидов проявляет наибольшую активность в отношении клинических изолятов E. faecalis 1, S. aureus 1, S. hominis и S. agalactiae. Выделенная на 96 ч культивирования фракция липопептидов B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476, в отличие от прототипа, ингибирует рост как грамположительных так и грамотрицательных тест-культур. Широкий спектр действия фракций липопептидов B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 обеспечивается суммарной комбинацией разных липопептидов, которые продуцируются в среду культивирования SMN на разных фазах роста штамма. Например, синтез сурфактина индуцируется в активно растущих клетках во время перехода от экспоненциальной к стационарной фазе, синтез фенгицина связан с ранней стационарной фазой, а итурины накапливаются только в более позднем стационаре [A. Sarwar. Qualitative Analysis of Biosurfactants From Bacillus Species Exhibiting Antifungal Activity / A. Sarwar, G. Brader, E. Corretto, G. Aleti, M. A. Ullah, A. Sessitsch, F. Y. Hafeez // PLoS One. - 2018. - V. 13. N. 6].

Таким образом, выделенная из культуральной среды через 96 ч культивирования (роста) фракция липопетидов B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 стабильно сохраняет антибактериальную активность в отношении тест-культур.

Таким образом, из описанного выше можно сделать вывод, что заявителем достигнуты поставленные цели и заявленный технический результат, а именно: разработан способ получения и использования профилактического средства на основе суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476, обладающего широким спектром антимикробного воздействия в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий с грамположительным и грамотрицательным морфотипом, микромицетов - возбудителей микотоксикозов, используемого для профилактики болезней сельскохозяйственных птиц.

Средство на основе липопептидов, получаемое заявленным способом, обеспечивает:

1 - широкий спектр полезного действия суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476,

2 - высокая результативность, т.е. высокая эффективность использования по назначению для профилактики кишечных инфекций,

3 - легкость применения способа для массового применения (добавление в комбикорм),

4 - применимость против наиболее распространённых в животноводстве кишечных болезней - диареи, энтерита, кокцидозов,

5 - проявляет активность в отношении грамотрицательных условно-патогенных бактерий и микромицетов - возбудителей микотоксикозов (результаты представлены в на Фиг.1, Таблица 1 на Фиг.2),

6 - антибактериальная активность не ограничивается ингибированием роста грамположительных микроорганизмов (результаты представлены в Таблица 1 на Фиг.2),

7 - повышает среднесуточный привес цыплят-бройлеров на 14% (результаты представлены в Таблица 2 на Фиг. 3),

8 - повышает усвояемость корма цыплят-бройлеров на 5.3% (результаты представлены в Таблица 2 на Фиг. 3).

Получено экспериментальное подтверждение возможности использования полученных липопептидов на основе вторичных метаболитов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 в качестве профилактического средства для цыплят-бройлеров, обладающего антимикробной активностью в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий как с грамположительным морфотипом, так и грамотрицательным морфотипом, микромицетов и, как следствие, обеспечивающее высокий уровень эффективности для профилактики кишечных инфекций сельскохозяйственных птиц в отличие от прототипа.

При этом заявитель считает целесообразным обратить внимание на факт того, что в геноме заявленного штамма B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 выявлены генетические детерминанты, ответственные за синтез нерибосомально синтезируемых липопептидов: сурфактина, итурина, бацилломицина и фенгицина, наличие которых в геноме бактерии доказывает способность бактерии синтезировать эти группы липопептидов в среду культивирования, указанное является доказательством полученным заявителем в результате выполнения экспериментальных работ по заявленному техническому решению.

Заявленное техническое решение удовлетворяет условию патентоспособности «новизна», так как при определении уровня техники не обнаружено средство, которому присущи признаки, идентичные (то есть совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков) всем признакам, приведенным в формуле изобретения, включая характеристику назначения.

Заявленное техническое решение удовлетворяет условию патентоспособности «изобретательский уровень», поскольку не выявлены технические решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предполагаемого изобретения, и не установлена известность влияния отличительных признаков на указанный технический результат.

Заявленное техническое решение удовлетворяет условию патентоспособности «промышленная применимость» вследствие того, что осуществляется с использованием известных технических устройств, материалов и оборудования, его можно реализовать в сельскохозяйственном промышленном производстве, например - птицеводстве. Заявленное техническое решение обеспечивает профилактику, предупреждение массовых заболеваний сельскохозяйственных животных, ускоренное откармливание животных для обеспечения продовольственной безопасности, более детально обеспечивает снижение количества применяемых в птицеводстве антибиотиков в 2-3 раза, повышение среднесуточного привеса цыплят-бройлеров на 14%, повышение потребления корма цыплят-бройлеров на 5.3%, снижение себестоимости получаемого продукта (мясо птицы) на 5-10%, расширение арсенала средств используемых для профилактики и лечения кишечных инфекций.

Предлагаемое изобретение относится к области биотехнологии. Сущностью является способ получения суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476, заключающийся в том, что берут маннит – 26.2 г/л, соевую муку – 21.9 г/л, NaNO3 – 3.1 г/л, MnSO4 х 4H2O – 0.2 г/л при pH 7.5, автоклавируют при 121°C и 1 атм, при этом создают питательную среду; далее выполняют посев на питательную среду культуры B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476, с получением 2%-й концентрации клеток штамма в питательной среде; далее выполняют культивирование клеток штамма в термостате-шейкере при температуре от + 37°С до + 42°C и интенсивности качания 200 об/мин в течение 96 часов, получают биомассу клеток штамма-продуцента бактерий B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476; далее выполняют удаление клеток штамма B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 из полученной биомассы клеток, получают бесклеточную культуральную жидкость; далее выполняют выделение целевого продукта липопептидов из бесклеточной культуральной жидкости методом кислотного осаждения; далее выполняют высушивание и стерилизацию суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476; далее выполняют фасовку целевого продукта и хранение полученной сухой фракции липопептидов до его использования по назначению. Способ использования суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 по п.1 в качестве профилактического средства от болезней сельскохозяйственных птиц, заключающийся в том, что вносят высушенную суммарную фракцию липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 в полнорационный комбикорм в количестве от 10 до 50 мг на 1 кг корма в зависимости от возраста сельскохозяйственных птиц в течение периода откорма, перемешивают, проводят кормление птиц. Изобретение может быть использовано в биотехнологиях производства биопрепаратов для применения в сельском хозяйстве для профилактики заболевания птиц, что особенно актуально при скученном содержании птиц в условиях птицефабрик. 2 н.п. ф-лы, 6 пр., 3 ил.

1. Способ получения профилактического средства – суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476, заключающийся в том, что берут маннит – 26.2 г/л, соевую муку – 21.9 г/л, NaNO3 – 3.1 г/л, MnSO4 × 4H2O – 0.2 г/л при pH 7.5, автоклавируют при 121°C и 1 атм, при этом создают питательную среду; далее выполняют посев на питательную среду культуры B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476, с получением 2%-й концентрации клеток штамма в питательной среде; далее выполняют культивирование клеток штамма в термостате-шейкере при температуре от + 37°С до + 42°C и интенсивности качания 200 об/мин в течение 96 часов, получают биомассу клеток штамма-продуцента бактерий B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476; далее выполняют удаление клеток штамма B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 из полученной биомассы клеток, получают бесклеточную культуральную жидкость; далее выполняют выделение целевого продукта липопептидов из бесклеточной культуральной жидкости методом кислотного осаждения; далее выполняют высушивание и стерилизацию суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476; далее выполняют фасовку целевого продукта и хранение полученной сухой фракции липопептидов до его использования по назначению.

2. Способ защиты сельскохозяйственных птиц от болезней, заключающийся в том, что вносят высушенную суммарную фракцию липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476, полученную способом по п.1, в полнорационный комбикорм в количестве от 10 до 50 мг на 1 кг корма в зависимости от возраста сельскохозяйственных птиц в течение периода откорма, перемешивают, проводят кормление птиц.