НАНОКОНЪЮГАТЫ ДОКСОРУБИЦИН-ЗОЛОТО НАПРАВЛЕННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ДЛЯ ТЕРАПИИ ОПУХОЛЕЙ Российский патент 2022 года по МПК C07K17/14 A61K47/64 A61K47/00 G01N33/48 

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0001] Настоящее изобретение относится к наноконъюгатам доксорубицин-золото, которые можно применять для лечения рака. Настоящее изобретение также относится к способам получения и применения наноконъюгатов.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0002] Доксорубицин (DOX) представляет собой химиотерапевтическое лекарственное средство, в настоящее время применяемое в клинической практике для лечения нескольких видов опухолей, включая рак молочной железы, рак яичника, рак печени, рак почки и т.д.

Одним из серьезных побочных эффектов доксорубицина является его кардиотоксичность. Кардиотоксичность можно свести к минимуму путем направленного введения препарата или путем снижения его концентрации. Однако при уменьшении количества вводимого препарата соответственно снижается его цитотоксичность и эффективность. Для направленной доставки были разработаны конъюгаты антител с лекарственными средствами, но все еще существует необходимость в разработке несущей системы для доставки доксорубицина, которая обладала бы низкой кардиотоксичностью и/или высокой эффективностью.

ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0003] В настоящем изобретении предложены наноконъюгаты золота для направленной доставки доксорубицина. В настоящем изобретении предложен наноконъюгат, содержащий: наночастицу золота (AuNP), дитиолированную диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTDTPA), пептид с концевой тиоктовой кислотой и доксорубицин, где DTDTPA связана непосредственно с поверхностью наночастицы золота посредством по меньшей мере одной связи Au-S, пептид с концевой тиоктовой кислотой связан непосредственно с поверхностью наночастицы золота посредством по меньшей мере одной связи Au-S, а доксорубицин связан с DTDTPA.

[0004] В некоторых вариантах осуществления пептид с концевой тиоктовой кислотой представляет собой бомбезин с тиоктовой кислотой. В некоторых вариантах осуществления бомбезин с тиоктовой кислотой имеет последовательность: липоевая кислота-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂.

[0005] В некоторых вариантах осуществления доксорубицин связан с DTDTPA посредством амидной связи.

[0006] В настоящем изобретении также предложен способ получения наноконъюгата, описанного в настоящем документе, который включает конъюгацию наночастицы AuNP-DTDTPA с пептидом с концевой тиоктовой кислотой, причем золото в виде наночастицы золота и пептид с концевой тиоктовой кислотой присутствуют в стехиометрическом соотношении от около 1:0,5 до около 1:4. В некоторых вариантах осуществления золото в виде наночастицы золота и пептид с концевой тиоктовой кислотой присутствуют в стехиометрическом соотношении около 1:2.

[0007] В некоторых вариантах осуществления наноконъюгат, описанный в настоящем документе, содержит от около 1% до около 40% пептида с концевой тиоктовой кислотой по массе наноконъюгата. В некоторых вариантах осуществления наноконъюгат, описанный в настоящем документе, содержит от около 20% до около 30% пептида с концевой тиоктовой кислотой по массе наноконъюгата.

[0008] В некоторых вариантах осуществления наноконъюгат, описанный в настоящем документе, содержит от около 0,01% до около 0,05% доксорубицина по массе наноконъюгата. В некоторых вариантах осуществления наноконъюгат, описанный в настоящем документе, содержит около 0,03% доксорубицина по массе наноконъюгата.

[0009] В некоторых вариантах осуществления наноконъюгат имеет гидродинамический диаметр от около 110 нм до около 140 нм при измерении путем динамического светорассеяния (DLS). В некоторых вариантах осуществления наноконъюгат имеет гидродинамический диаметр от около 120 нм до около 130 нм при измерении путем динамического светорассеяния (DLS).

[0010] В некоторых вариантах осуществления значение дзета-потенциала наноконъюгата находится в диапазоне от около -15 мВ до около -30 мВ. В некоторых вариантах осуществления значение дзета-потенциала наноконъюгата находится в диапазоне от около -20 мВ до около -25 мВ.

[0011] В настоящем изобретении также предложена фармацевтическая композиция, содержащая наноконъюгат, описанный в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель.

[0012] В настоящем изобретении дополнительно предложен способ лечения рака, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества наноконъюгата, описанного в настоящем документе.

[0013] В некоторых вариантах осуществления вид рака выбран из группы, состоящей из острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ), острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), остеосаркомы, рака молочной железы, рака эндометрия, рака желудка, рака головы и шеи, лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы, рака печени, рака почки, множественной миеломы, нейробластомы, рака яичника, рака легкого, саркомы мягких тканей, тимом, рака щитовидной железы, рака мочевого пузыря, саркомы матки, рака предстательной железы, рака толстой кишки, рака яичника, немелкоклеточного рака легкого, рака поджелудочной железы, опухоли Вильмса и макроглобулинемии Вальденстрема.

[0014] В некоторых вариантах осуществления наноконъюгат вводят субъекту путем инъекции.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0015] Ниже приводится краткое описание графических материалов, которые представлены для целей иллюстрации примеров осуществления, описанных в настоящем документе, а не для целей их ограничения.

[0016] На ФИГ. 1 показан синтез BBN-AuNP-DTDTPA-DOX (NP2-DOX).

[0017] На ФИГ. 2 показана схематическая структура BBN-AuNP-DTDTPA-DOX (NP2-DOX).

[0018] На ФИГ. 3 показан график титрования бомбезина с концевой тиоктовой кислотой (TA-BBN) с помощью [AuNP(DTDTPA)] для определения количества TA-BBN, образовавшего конъюгат с [AuNP(DTDTPA)], по результатам измерения с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). В скобках представлены стехиометрические соотношения Au: BBN.

[0019] На ФИГ. 4А и 4В показаны изображения наноконъюгатов NP1 и NP2 соответственно, полученные с помощью трансмиссионного электронного микроскопа (ТЭМ). На ФИГ. 3С показан спектр поглощения в УФ-видимой области для наноконъюгатов NP1 и NP2.

[0020] На ФИГ. 5А показан спектр, полученный методом рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (РФЭС), для наноконъюгата NP2. На ФИГ. 5В показан спектр РФЭС высокого разрешения для области C1s наноконъюгата NP2.

[0021] На ФИГ. 6А показан спектр РФЭС высокого разрешения для области S2p наноконструкции NP2. На ФИГ. 6В показан спектр РФЭС высокого разрешения для области Au4f наноконструкции NP2.

[0022] На ФИГ. 7 показан спектр флуоресценции доксорубицина при длине волны возбуждения 580 нм и длине волны излучения 590 нм.

[0023] На ФИГ. 8 показана оценка нагрузки наноконъюгатов NP1 и NP2 доксорубицином по результатам флуоресцентной спектроскопии.

[0024] На ФИГ. 9 показан спектр флуоресценции наноконъюгатов NP1 и NP1-DOX.

[0025] На ФИГ. 10 показан спектр флуоресценции наноконъюгатов NP2 и NP2-DOX.

[0026] На ФИГ. 11 показан спектр поглощения в УФ-видимой области для NP1, NP2, NP1-DOX и NP2-DOX.

[0027] На ФИГ. 12А и 12В показаны исследования стабильности наноконъюгатов NP1 и NP2 in vitro по результатам абсорбционной спектроскопии в УФ-видимой области. На ФИГ. 12С и 12D показаны исследования стабильности наноконъюгатов NP1 и NP2 in vitro по результатам измерения гидродинамического размера. На ФИГ. 12Е и 12F представлены исследования стабильности наноконъюгатов NP1 и NP2 in vitro по результатам определения дзета-потенциала при инкубации в различных биологически значимых растворах.

[0028] На ФИГ. 13 показаны значения концентрации полумаксимального ингибирования (IC₅₀) для наноконъюгата NP2 с различными стехиометрическими соотношениями Au: BBN (1:0,4; 1:2; 1:4) в отношении 125I-BBN в клетках опухоли предстательной железы РС-3, экспрессирующих рецепторы GRP.

[0029] На ФИГ. 14 показана цитотоксичность доксорубицина in vitro, вводимого отдельно либо в виде NP1-DOX и NP2-DOX, в отношении клеток рака молочной железы человека MDА-МВ-231, не экспрессирующих GRP.

[0030] На ФИГ. 15 сравнивается воздействие NP1-DOX, NP2-DOX и доксорубицина, вводимого отдельно, на клетки рака молочной железы человека, не экспрессирующие GRP.

[0031] На ФИГ. 16 показана цитотоксичность доксорубицина in vitro, вводимого отдельно, а также в виде NP1-DOX и NP2-DOX, в отношении клеток рака предстательной железы человека РС3, экспрессирующих GRP.

[0032] На ФИГ. 17 сравнивается воздействие NP1-DOX, NP2-DOX и доксорубицина, вводимого отдельно, на клетки рака предстательной железы человека, экспрессирующие GRP.

[0033] На ФИГ. 18 сравниваются значения IC₅₀ для доксорубицина, вводимого в виде наноконъюгатов (NP1-DOX и NP2-DOX), и доксорубицина, вводимого отдельно, в отношении раковых клеток человека (РС3), экспрессирующих GRP.

[0034] На ФИГ. 19 сравниваются значения IC₅₀ для доксорубицина в виде наноконъюгатов (NP1-DOX и NP2-DOX) и доксорубицина, вводимого отдельно, в отношении раковых клеток человека (MDA-MB-231), не экспрессирующих GRP.

[0035] На ФИГ. 20 сравниваются различия в гибели клеток (в процентах), вызываемой NP1-DOX и NP2-DOX в отношении раковых клеток человека, экспрессирующих GRP (РС3) и не экспрессирующих GRP (MDA-MB-231).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0036] Рецепторы гастринвысвобождающего пептида (GRP) сверхэкспрессируются в различных раковых клетках человека, таких как клетки рака молочной железы, рака предстательной железы, рака толстой кишки и других видов рака. Известно, что пептид бомбезин и его аналоги нацелены на рецепторы GRP. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложена многокомпонентная система доставки наночастиц (наноконъюгат), содержащая наночастицы золота (AuNP), нацеливающий агент (например, бомбезин [BBN]) и доксорубицин (DOX) в качестве противоракового терапевтического агента. Наночастицы золота стабилизированы дитиолированной диэтилентриаминпентауксусной кислотой (DTDTPA) и могут иметь многослойную структуру. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления наноконъюгат может представлять собой BBN-AuNP(DTDTPA)-DOX. По результатам анализов цитотоксичности in vitro, проводимых с использованием клеток рака молочной железы, неожиданно было обнаружено, что BBN-AuNP(DTDTPA)-DOX является намного более эффективным по сравнению с доксорубицином.

[0037] Из приведенного в данном документе описания специалистам в данной области будет очевидно, что возможны различные примеры и варианты осуществления объекта изобретения, описанного в настоящем документе. В настоящем описании каждая из фраз и ссылка на «некоторые варианты осуществления», «определенные варианты осуществления» и аналогичные фразы означает, что данные варианты осуществления являются не имеющими ограничительного характера примерами объекта изобретения, и что не исключены альтернативные варианты осуществления.

[0038] Существительные в единственном числе использованы в настоящем документе для обозначения одного или более одного (т.е. по меньшей мере одного) из грамматических объектов публикации. Например, «элемент» означает один элемент или более одного элемента. Термин «или» означает «и/или». Термины «содержащий», «имеющий», «включающий в себя» и «охватывающий» следует понимать как неограничивающие термины (т.е. они означают «включающий в себя без ограничений»).

[0039] Термин «содержащий» использован в смысле, согласующемся с его неограничивающим значением, другими словами, означающем, что данный продукт или способ может также необязательно иметь дополнительные признаки или элементы, помимо указанных явным образом. Следует понимать, что везде, где варианты осуществления описаны с использованием формулировки «содержащий», также предусмотрены и включены в объем настоящего изобретения иные аналогичные варианты осуществления, описанные с использованием терминов «состоящий из» и/или «состоящий по существу из».

[0040] Используемый в настоящем документе термин «около» означает ±10% от указанного значения. Только в качестве примера композиция, содержащая «около 30 масс. %» соединения может включать от 27 масс. % соединения до 33 масс. % соединения включительно.

[0041] Используемый в настоящем документе термин «наноконъюгат» относится к наноматериалу, содержащему наночастицу золота и другие компоненты, такие как стабилизирующий агент, нацеливающий агент и терапевтический агент. В некоторых вариантах осуществления стабилизирующий агент и нацеливающий агент могут быть связаны непосредственно с поверхностью наночастицы золота посредством одной или более ковалентных или нековалентных связей. Некоторые компоненты, такие как терапевтический агент, могут быть связаны с наночастицей золота через другой компонент, такой как стабилизирующий агент.

[0042] Используемый в настоящем документе термин «терапевтически эффективное количество» означает количество, эффективное при введении пациенту для обеспечения предполагаемого терапевтического эффекта. Количество, которое является «эффективным», может быть отличаться среди разных субъектов, в зависимости от возраста и общего состояния здоровья субъекта и т.п.

[0043] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предложен наноконъюгат, содержащий: наночастицу золота (AuNP), дитиолированную диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTDTPA), пептид с концевой тиоктовой кислотой и доксорубицин, где DTDTPA связана непосредственно с поверхностью наночастицы золота посредством по меньшей мере одной связи Au-S, пептид с концевой тиоктовой кислотой связан непосредственно с поверхностью наночастицы золота посредством по меньшей мере одной связи Au-S, а доксорубицин связан с DTDTPA.

[0044] В некоторых вариантах осуществления наноконъюгат, описанный в настоящем документе, по существу состоит из: наночастицы золота (AuNP), дитиолированной диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTDTPA), пептида с концевой тиоктовой кислотой и доксорубицина, где DTDTPA связана непосредственно с поверхностью наночастицы золота посредством по меньшей мере одной связи Au-S, пептид с концевой тиоктовой кислотой связан непосредственно с поверхностью наночастицы золота посредством по меньшей мере одной связи Au-S, а доксорубицин связан с DTDTPA.

[0045] В данной области известны наночастицы золота, стабилизированные DTDTPA, т.е. AuNP-DTDTPA. Например, в WO 2015/103028 и у Debouttiere et al., Advan. Funt. Mater. 2006, 16:2330-39 описано получение и применение AuNP-DTDTPA, и оба источника в полном объеме включены в настоящий документ путем ссылки. Химическая структура DTDTPA показана ниже. Молекулы DTDTPA могут быть связаны с поверхностью наночастицы золота посредством одной или двух связей Au-S.

[0046] Без ограничения теорией считается, что петли DTDTPA, окружающие поверхность AuNP, могут содержать одну, две, три, четыре, пять или более молекул DTDTPA. Например, в некоторых вариантах осуществления также без ограничения конкретной теорией считается, что обе тиольные группы данной молекулы DTDTPA могут одновременно образовывать связь Au-S с поверхностью AuNP, таким образом формируя петлю с одной молекулой DTDTPA. В другом варианте осуществления одна тиольная группа данной молекулы DTDTPA может образовывать связь Au-S с поверхностью AuNP, тогда как вторая тиольная группа может образовывать межмолекулярный дисульфидный мостик (S-S) со второй молекулой DTDTPA. Вторая молекула DTDTPA может быть либо связана с еще одной молекулой DTDTPA посредством дисульфидного мостика, либо может быть связана с поверхностью AuNP посредством связи Au-S, таким образом формируя петлю, состоящую из двух или более молекул DTDTPA. В зависимости от того, как молекулы DTDTPA выстраиваются, стабилизированные наночастицы могут содержать многослойную органическую оболочку из молекул пентауксусной кислоты на поверхности частиц AuNP. См. Debouttiere et al., Advan. Funt. Mater. 2006, 16:2330-39; и Фиг. 2.

[0047] В некоторых вариантах осуществления наноконъюгат, описанный в настоящем документе, содержит от около 10% до около 60% DTDTPA по массе наноконъюгата. В некоторых вариантах осуществления наноконъюгат содержит около 10%, около 15%, около 20%, около 25%, около 30%, около 35%, около 40%, около 41%, около 42%, около 43%, около 44%, около 45%, около 46%, около 47%, около 48%, около 49%, около 50%, около 51%, около 52%, около 53%, около 54%, около 55%, около 60% DTDTPA по массе наноконъюгата, например около 45%, или количество в диапазоне между любыми двумя из вышеперечисленных значений, например от около 30% до около 60% или от около 40% до около 50%. В некоторых вариантах осуществления наноконъюгат содержит около 45% DTDTPA по массе наноконъюгата.

[0048] В типичном варианте осуществления, и как пояснено выше, наноконъюгат, описанный в настоящем документе, может содержать пептид с концевой тиоктовой кислотой в качестве нацеливающего агента. В определенных вариантах осуществления нацеливающий пептид может представлять собой пептид бомбезин. Пептид бомбезин можно использовать для функционализации наноматериалов золота для нацеливания на определенные опухолевые клетки. См. Chanda et al., Nano Lett. 2009, 9(5): 1798-1805; Chanda et al. PNAS 2010, 107(19): 8760-8765; Suresh et al., Bioconjuate Chem. 2014, 25, 1565-1579; и Silva et al., Bioconjuate Chem. 2016, 27, 1153-1164. Каждый из этих источников в полном объеме включен в настоящий документ путем ссылки. Пептид бомбезин, состоящий из 14 аминокислот и выделенный из кожи земноводных рода жерлянки, и соответствующие гастринвысвобождающие пептиды (GRP) проявляют усиленный ответ в различных опухолевых тканях, например в тканях мелкоклеточного рака легкого, рака молочной железы и рака толстой кишки. Сообщалось, что аналоги бомбезина с модифицированными структурами проявляли схожую или даже более высокую аффинность к рецепторам GRP. См., например, Chanda et al., Nano Lett. 2009, 9(5): 1798-1805 и приведенные в этой публикации ссылки. В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, в качестве нацеливающего агента использовали усеченный аналог бомбезина (BBN), состоящий из семи аминокислот, который показан на Фиг. 1.

[0049] В некоторых вариантах осуществления пептид с концевой тиоктовой кислотой может представлять собой бомбезин с концевой тиоктовой кислотой (TA-BBN, в настоящем документе также называемый BBN), который имеет последовательность: липоевая кислота-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2.

[0050] В некоторых вариантах осуществления пептид с концевой тиоктовой кислотой (например, TA-BBN) может быть связан с поверхностью наночастицы золота посредством одной или двух связей Au-S.

[0051] В некоторых вариантах осуществления наноконъюгат, описанный в настоящем документе, содержит от около 1% до около 40% пептида с концевой тиоктовой кислотой по массе наноконъюгата. В некоторых вариантах осуществления наноконъюгат содержит около 1%, около 5%, около 10%, около 11%, около 12%, около 13%, около 14%, около 15%, около 16%, около 17%, около 18%, около 19%, около 20%, около 21%, около 22%, около 23%, около 24%, около 25%, около 26%, около 27%, около 28%, около 29%, около 30%, около 35% или около 40% пептида с концевой тиоктовой кислотой по массе наноконъюгата, например около 20% или около 25%, или количество в диапазоне между любыми двумя из вышеперечисленных значений, например от около 10% до около 30%, от около 20% до около 30% или от около 15% до около 25%. В некоторых вариантах осуществления наноконъюгат содержит около 20% или около 25% пептида с концевой тиоктовой кислотой по массе наноконъюгата.

[0052] В некоторых вариантах осуществления конструкцию AuNP-DTDTPA-BBN, которая впоследствии может быть связана с доксорубицином, можно получать способом, включающим конъюгацию наночастицы AuNP-DTDTPA с пептидом с концевой тиоктовой кислотой, причем золото в виде наночастицы золота и пептид с концевой тиоктовой кислотой могут присутствовать в реакции конъюгации в стехиометрическом соотношении от около 1:0,5 до около 1:4. Используемый в настоящем документе термин «стехиометрическое соотношение» относится к молярному соотношению.

[0053] В некоторых вариантах осуществления стехиометрическое соотношение золота в виде наночастицы золота и пептида с концевой тиоктовой кислотой, используемых в реакции конъюгации, может составлять около 1:0,75, около 1:1, около 1:1,5, около 1:2, около 1:2,5, около 1:3, около 1:3,5 или около 1:4, например около 1:2, или находиться в диапазоне между любыми двумя из вышеперечисленных соотношений, например от около 1:1 до около 1:4, от около 1:1 до около 1:3, от около 1:1 до около 1:2, от около 1:1,5 до около 1:4, от около 1:1,5 до около 1:3, от около 1:1,5 до около 1:2,5 или от около 1:1,5 до около 1:2.

[0054] В некоторых вариантах осуществления соотношение пептида с концевой тиоктовой кислотой, используемого в реакции конъюгации, и золота в виде наночастицы золота составляет по меньшей мере около 1:1,5, по меньшей мере около 1:2, по меньшей мере около 1:2,5 или по меньшей мере около 1:3.

[0055] В некоторых вариантах осуществления стехиометрическое соотношение золота в виде наночастицы золота и пептида с концевой тиоктовой кислотой, используемого в реакции конъюгации, составляет около 1:2.

[0056] Как правило, доксорубицин в наноконъюгате связан с DTDTPA посредством амидной связи, образованной между карбоксилатной группой DTDTPA и аминогруппой доксорубицина.

[0057] В некоторых вариантах осуществления наноконъюгат, описанный в настоящем документе, содержит от около 0,01% до около 0,05% доксорубицина по массе наноконъюгата. В некоторых вариантах осуществления наноконъюгат может содержать около 0,01%, около 0,015%, около 0,02%, около 0,025%, около 0,03%, около 0,035%, около 0,04%, около 0,045% или около 0,05% доксорубицина по массе наноконъюгата, например около 0,03%, или количество в диапазоне между любыми двумя из вышеперечисленных значений, например от около 0,01% до около 0,04%, от около 0,01% до около 0,03%, от около 0,02% до около 0,05%, от около 0,02% до около 0,04%, от около 0,02% до около 0,03% или от около 0,025% до 0,035%. В некоторых вариантах осуществления наноконъюгат содержит около 0,03% доксорубицина по массе наноконъюгата.

[0058] Наноконъюгаты можно охарактеризовать по их гидродинамическому диаметру (т.е. гидродинамическому размеру). В некоторых вариантах осуществления наноконъюгат, описанный в настоящем документе, имеет гидродинамический диаметр от около 100 нм до около 150 нм или от около 110 нм до около 140 нм при измерении путем динамического светорассеяния (DLS). В некоторых вариантах осуществления наноконъюгат имеет гидродинамический диаметр около 100 нм, около 110 нм, около 115 нм, около 120 нм, около 125 нм, около 130 нм, около 135 нм, около 140 нм или около 145 нм или около 150 нм при измерении путем динамического светорассеяния (DLS), например около 125 нм или размер в диапазоне между любыми двумя из вышеперечисленных значений, например от около 120 нм до около 125 нм, от около 120 нм до около 130 нм или от около 125 нм до около 130 нм. В некоторых вариантах осуществления наноконъюгат имеет гидродинамический диаметр около 125 нм при измерении путем динамического светорассеяния (DLS).

[0059] Наноконъюгаты также можно охарактеризовать по их дзета-потенциалу. В некоторых вариантах осуществления значение дзета-потенциала наноконъюгата, описанного в настоящем документе, находится в диапазоне от около -15 мВ до около -30 мВ. В некоторых вариантах осуществления значение дзета-потенциала наноконъюгата составляет около -15 мВ, около -16 мВ, около -17 мВ, около -18 мВ, около -19 мВ, около -20 мВ, около -21 мВ, около -22 мВ, около -23 мВ, около -24 мВ, около -25 мВ, около -26 мВ, около -27 мВ, около -28 мВ, около -29 мВ или около -30 мВ, например около -23 мВ, или находится в диапазоне между любыми двумя из вышеперечисленных значений, например от около -15 мВ до около -25 мВ, от около -20 мВ до около -25 мВ или от около -20 мВ до около -30 мВ. В некоторых вариантах осуществления значение дзета-потенциала наноконъюгата составляет от около -20 мВ до около -25 мВ.

[0060] В одном варианте осуществления наноконъюгат, описанный в настоящем документе, по существу состоит из наночастицы золота (AuNP), дитиолированной диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTDTPA), пептида бомбезина с концевой тиоктовой кислотой (TA-BBN) и доксорубицина, где DTDTPA связана непосредственно с поверхностью наночастицы золота посредством по меньшей мере одной связи Au-S, TA-BBN связан непосредственно с поверхностью наночастицы золота посредством по меньшей мере одной связи Au-S, а доксорубицин связан с DTDTPA; причем предшественник наноконъюгата AuNP-DTDTPA-BBN получают способом, включающим конъюгацию наночастиц AuNP-DTDTPA с TA-BBN, причем золото в виде наночастицы золота и пептид бомбезин с концевой тиоктовой кислотой присутствуют в реакции конъюгации в стехиометрическом соотношении около 1:2.

[0061] В некоторых вариантах осуществления описанный выше наноконъюгат может содержать наночастицу золота (AuNP), дитиолированную диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTDTPA), пептид бомбезин с концевой тиоктовой кислотой (TA-BBN) и доксорубицин, причем наноконъюгат содержит от около 15% до около 25% TA-BBN, от около 25% до около 35% DTDTPA и от около 0,01% до около 0,05% доксорубицина по массе наноконъюгата.

[0062] В другом варианте осуществления наноконъюгат, описанный в настоящем документе, может содержать наночастицу золота (AuNP), дитиолированную диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTDTPA), пептид бомбезин с концевой тиоктовой кислотой (TA-BBN) и доксорубицин, причем наноконъюгат содержит около 20% TA-BBN, около 30% DTDTPA и около 0,03% доксорубицина по массе наноконъюгата.

[0063] Хотя в наноконъюгатах, описанных в настоящем документе, как правило, присутствует нацеливающий пептид, в некоторых вариантах осуществления наноконъюгат, описанный в настоящем документе, не содержит пептида с концевой тиоктовой кислотой. Например, в некоторых вариантах осуществления наноконъюга содержит наночастицу золота (AuNP), дитиолированную диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTDTPA) и доксорубицин, где DTDTPA связана непосредственно с поверхностью наночастицы золота посредством по меньшей мере одной связи Au-S, а доксорубицин связан с DTDTPA, как описано в других местах настоящего документа. В настоящем документе эта конструкция называется AuNP(DTDTPA)-DOX.

[0064] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложен способ получения наноконъюгата, описанного в настоящем документе, включающий связывание доксорубицина с наночастицей, функционализированной DTDTPA. В некоторых вариантах осуществления способ включает (1) конъюгацию AuNP-DTDTPA с пептидом с концевой тиоктовой кислотой (например, TA-BBN) с получением конъюгата; и (2) связывание конъюгата с доксорубицином с получением наноконъюгата.

[0065] В некоторых вариантах осуществления на этапе связывания между карбоксильной группой DTDTPA и аминогруппой DOX образуется амидная связь. В некоторых вариантах осуществления этап связывания осуществляют с использованием активирующего агента, такого как EDC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид) и сульфо-NHS (N-гидроксисульфосукцинимид).

[0066] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая наноконъюгат, описанный в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель.

[0067] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения также предложен способ лечения рака, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества наноконъюгата, описанного в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления субъект является человеком.

[0068] В некоторых вариантах осуществления вид рака, подлежащий лечению, может быть выбран из группы, состоящей из острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ), острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), остеосаркомы, рака молочной железы, рака эндометрия, рака желудка, рака головы и шеи, лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы, рака печени, рака почки, множественной миеломы, нейробластомы, рака яичника, рака легкого (например, мелкоклеточного рака легкого и немелкоклеточного рака легкого), саркомы мягких тканей, тимом, рака щитовидной железы, рака мочевого пузыря (например, переходно-клеточного рака мочевого пузыря), саркомы матки, рака предстательной железы, рака толстой кишки, рака яичника, рака поджелудочной железы, опухоли Вильмса и макроглобулинемии Вальденстрема.

[0069] В некоторых вариантах осуществления вид рака, подлежащий лечению в соответствии со способами, описанными в настоящем документе, связан со сверхэкспрессией GRP. В некоторых вариантах осуществления рак, связанный со сверхэкспрессией GRP, может представлять собой мелкоклеточный рак легкого, рак предстательной железы, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак яичника, немелкоклеточный рак легкого или рак поджелудочной железы.

[0070] Наноконъюгат или фармацевтическую композицию, описанные в настоящем документе, можно вводить субъекту различными способами, известными специалистам в данной области. Например, наноконъюгат или фармацевтическую композицию настоящего изобретения, можно вводить путем инъекции или перорального введения.

[0071] Следующие примеры являются лишь иллюстративными примерами композиций и способов, описанных в настоящем документе, и не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

[0072] Основные способы. Материалы, используемые для синтеза наночастиц золота (AuNP), получали у стандартных поставщиков. Тригидрат золотохлористоводородной кислоты (HAuCl₄⋅3H₂O), боргидрид натрия (NaBH₄), диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPА), уксусный ангидрид, безводный пиридин, гидрохлорид 2-аминоэтантиола, триэтиламин, ледяную уксусную кислоту (СН₃СООН), нитрат галлия (Ga(NO₃)₃), гидроксид натрия (NaOH), хлороводородную кислоту (НСl), метанол (МеОН), диэтиловый простой эфир (Et₂O), хлорид натрия (NaCl), диметилформамид (DMF) и диметилсульфоксид (DMSO) приобретали у компании Aldrich и использовали в полученном виде. Для получения водных растворов и для промывки наночастиц золота использовали (деионизированную) воду Milli-Q (ρ>18 MΩ). Набор для анализа пролиферации клеток МТТ приобретали у компании Promega Corporation, США.

[0073] Спектроскопия в УФ-видимой области. Спектры поглощения в УФ-видимой области регистрировали при комнатной температуре с использованием спектрофотометра Cytation 3 (Biotek) в одноразовом 96-луночном планшете с регулировкой длины пути.

[0074] Электронная микроскопия. Изображения получали с помощью трансмиссионного электронного микроскопа (ТЕМ) JEOL 1400 производства компании JEOL LTD., г. Токио, Япония. Образцы для ТЕМ получали путем помещения 5 мкл раствора наночастиц золота на медную сетку 300 меш с углеродным покрытием. Избыток раствора осторожно удаляли и сетку оставляли для высыхания в течение дополнительных пяти минут. Средний размер и распределение наночастиц по размерам определяли путем обработки изображений ТЕМ в графическом редакторе Adobe Photoshop с программным модулем Fovea.

[0075] Динамическое светорассеяние (DLS) и анализ дзета-потенциала. Измерения DLS проводили с помощью анализатора Malvern Zetasizer Nano ZS (от компании Malvern instruments, г. Мальверн, США), оснащенного гелий-неоновым лазером с длиной волны 633 нм и работающего под углом 173°. Для сбора и анализа данных использовали программное обеспечение Dispersion Technology Software (DTS) версии 5.10 от компании Malvern. 600 мкл каждого образца измеряли в одноразовых низкообъемных полумикрокюветах (Fisher Scientific, США) с длиной пути 10 мм. Измерения проводили в трех повторах в положении 4,65 мм от стенки кюветы с использованием автоматического аттенюатора. Для каждого образца проводили серию из 15 анализов по 10 секунд. Для всех образцов наночастиц рассчитывали автокорреляционную функцию с использованием «режима общего назначения» и по ней определяли распределение по размерам, средний диаметр Z и коэффициент полидисперсности (PDI). Применяли установленные по умолчанию значения коэффициента фильтрации (50%), а также нижнего (0,05) и верхнего (0,01) порогов. Измерения дзета-потенциала проводили в трех повторах с использованием воды в качестве диспергирующего вещества и модели Хюккеля. Для каждого образца проводили серию из 20 анализов в режиме автоматического анализа.

[0076] Анализ с отслеживанием наночастиц. Гидродинамические диаметры наночастиц AuNP измеряли с помощью системы NanoSight LM10-HSGFT в конфигурации, включающей терморегулируемую смотровую камеру для образцов LM14G, оборудованную лазером с длиной волны 532 нм (в зеленой области спектра) (от компании NanoSight Limited, г. Эймсбери, Великобритания). Видеозапись траектории наночастиц AuNP на основе рэлеевского рассеяния вели с помощью монохромной видеокамеры Marlin на основе приборов с зарядовой связью (ПЗС) (от компании Allied Vision Technologies, Германия). Образцы вводили в смотровую камеру с помощью шприца на 1 мл (от компании Becton Dickinson, штат Нью-Джерси, США) и поддерживали постоянную температуру 22°С. Для сбора и анализа данных по образцам использовали программу NanoSight 2.2. Каждое измерение размера было основано на 30-секундной видеозаписи, а средний гидродинамический диаметр рассчитывался по уравнению Эйнштейна - Стокса. Как отмечено ниже, перед анализом с отслеживанием наночастиц (NTA) образцы разбавляли в 30 раз относительно концентрации исходного раствора AuNP. Кратность разведения выбирали таким образом, чтобы в 30-секундной видеозаписи отслеживалось ~900 частиц. Такие условия позволили получить репрезентативную выборку для всего образца - это подтверждается тем фактом, что распределение наночастиц по размерам не изменилось с увеличением продолжительности видеозаписей, в которых было проанализировано существенно больше наночастиц. Для каждого образца проводили три измерения, чтобы получить средний размер и среднеквадратичное отклонение.

[0077] Клеточная культура. Клетки карциномы предстательной железы человека РС-3 и карциномы молочной железы человека MDA-MB231 (Американская коллекция типовых культур [АТСС], США) выращивали в среде RPMI 1640 (приобретенной у компании Gibco BRL, г. Гранд-Айленд, штат Нью-Йорк) с добавлением 4,5 г/л D-глюкозы, 25 мМ Hepes, 0,11 г/л пирувата натрия, 1,5 г/л бикарбоната натрия, 2 мМ L-глутамина, 10% инактивированной нагреванием эмбриональной бычьей сыворотки (от компании Atlanta Biologicals, США) и 1% раствора антибиотиков пенициллина/стрептомицина. Клетки культивировали в увлажненной атмосфере, состоящей из 95% воздуха и 5% СО₂, при 37°С (от компании Thermo Scientific, США) с заменой среды через день. Формировали монослои клеток, после слияния из колб с клеточными культурами и трипсином-ЭДТА (от компании Invitrogen) собирали клетки и дополнительно высевали их отдельно.

[0078] Измерения IС₅₀. Для конъюгатов определяли аффинность связывания с рецепторами посредством анализа конкурентного связывания с клетками, проводимого на клеточных культурах РС-3 с использованием ¹²⁵I-Tyr4-бомбезина в качестве GRP-специфического меченного радиоизотопом лиганда. Приблизительно 30000 клеток инкубировали при 37°С в течение 40 минут в атмосфере с 5% СО₂ при 20000 импульсов/мин ¹²⁵I-Tyr4-бомбезина (2200 Ки/ммоль) и увеличении концентрации исследуемого конъюгата. После инкубации реакционную среду отсасывали и клетки трижды промывали холодным модифицированным буфером RPMI 1640. Связанную с клетками радиоактивность определяли путем подсчета с помощью счетчика гамма-частиц Packard Riastar. Значения IC₅₀ рассчитывали с использованием программного обеспечения для построения графиков Graph Fit 4.0. Строили график зависимости % ¹²⁵I-Tyr4-бомбезина, связанного с клетками, от концентрации исследуемого конъюгата, чтобы определить его показатель IC₅₀.

[0079] Анализ цитотоксичности in vitro. Оценку цитотоксичности NP1-DOX и NP2-DOX in vitro с использованием соответствующих контролен, таких как NP1, NP2 и свободный доксорубицин, проводили на раковых клетках, экспрессирующих и не экспрессирующих GRP - РС3 и MDA-MB-231 соответственно. Оценку цитотоксичности проводили в трех повторах, следуя протоколу в соответствии с описанием производителя. Вкратце, 1×10⁵ мл^-1 клеток, находящихся в фазе экспоненциального роста, помещали в плоскодонный 96-луночный планшет с полистирольным покрытием и инкубировали в течение 12 часов в инкубаторе СО₂ при 5% СО₂ и 37°С. Готовили серию растворов NP1-DOX и NP2-DOX в среде в диапазоне концентраций от 0 до 10 мкг/мл (0; 0,31; 0,625; 1,25; 2,5; 5,0 и 10 мкг/мл). Раствор каждой концентрации добавляли в планшет в четырех повторах. Через 24 часа инкубации добавляли 10 мкл на лунку МТТ (в полученном от производителя виде, от компании Promega Corporation, США) и выдерживали в течение 4 часов, а затем образованные таким образом кристаллы формазана растворяли в 100 мкл детергентсодержащего/солюбилизирующего буфера. Планшеты выдерживали в течение 2 часов в темноте при 25°С, чтобы растворились все кристаллы, и измеряли интенсивность проявившегося окрашивания с помощью микропланшет-ридера (от компаний Epoch, Biotek, США), работающего на длине волны 570 нм. В качестве холостых проб использовали лунки с полноценной средой, наночастицами и МТТ, но без клеток. Необработанные клетки считали на 100% жизнеспособными.

[0080] Исследования стабильности in vitro. Исследования стабильности in vitro проводили путем инкубации растворов NP1 и NP2 в условиях с различными уровнями рН: 2, 5, 7, 10 и 12 в течение 24-часового периода. Стабильность обоих наноконъюгатов также проверяли путем провокационного введения в водные растворы NP1 и NP2 (0,5 мл) по 0,5 мл каждого из растворов 0,2 М цистеина, 0,2 М гистидина, 0,2 М человеческого сывороточного альбумина (HSA) и 10% солевого раствора. Для оценки стабильности проводили измерения поглощения в УФ-видимой области, гидродинамического радиуса и дзета-потенциала в период от 0 часов до 96 часов (0, 1, 24, 48, 72 и 96 часов). Пренебрежимо малое изменение полосы плазмонного поглощения NP1 и NP2 в УФ-видимой области подтвердило сохранение стабильности композиции наночастиц во всех провокационных растворах, за исключением цистеинового. Обработанные растворы не показали какого-либо заметного изменения гидродинамических радиусов, что подтверждает стабильность этих конъюгатов.

Пример 1

Синтез и определение характеристик конъюгатов BBN-AuNP-DTDTPA

[0081] Для конъюгации нацеливающего пептида (бомбезина [BBN]) и химиотерапевтического препарата (DOX) на поверхности наночастицы использовали наночастицы золота (AuNP-DTDTPA; NP1), функционализированные дитиолированной диэтилентриаминпентауксусной кислотой (DTDTPA), в качестве предшественника. См. Фиг. 1.

[0082] Первый этап заключался в конъюгации нацеливающего пептида с NP1. Для конъюгации пептида с NP1 через образование связи золото-тиол использовали бомбезин с концевой тиоктовой кислотой (TA-BBN). Использовали три различных стехиометрических соотношения AuNP : BBN (1:0,5, 1:2 и 1:4). Избыток непрореагировавшего BBN удаляли путем многократной промывки и выделяли BBN-AuNP-DTDTPA (NP2) в виде гранул чистых наночастиц. Для количественного определения TA-BBN, связанного с NP2, проводили ВЭЖХ-анализ растворов супернатанта, полученных после конъюгации TA-BBN с NP1. Стандартную калибровочную кривую строили с использованием различных концентраций TA-BBN, а площадь под кривой (AUC) для известных концентраций TA-BBN, использованного в реакциях, определяли посредством ВЭЖХ. Полученные значения AUC в супернатантах сопоставляли с известными концентрациями TA-BBNC, чтобы определить количество TA-BBN, конъюгированного на поверхности NP2 (Фиг. 3). В результате конъюгации конструкции AuDTDTPA с TA-BBN в соотношении 1:2 (Au : TA-BBN) в конструкцию было встроено около 0,26 мг TA-BBN на 1 мг AuDTDTPA. См. Фиг. 3. NP2, полученный с использованием соотношения 1:2, показал исключительную стабильность и поэтому был выбран для дополнительных исследований.

[0083] Определение подробных характеристик наноконъюгатов проводили посредством анализа изображений, полученных с помощью трансмиссионного электронного микроскопа (ТЕМ), абсорбционной спектроскопии в УФ-видимой области, динамического светорассеяния (DLS) и измерений дзета-потенциала. Изображения ТЕМ показали равномерное распределение наноконъюгатов по размерам в диапазоне 3-5 нм (Фиг. 4А и 4В). Спектр поглощения в УФ-видимой области для NP2 не отличался от такового для NP1 после конъюгации с BBN. (Фиг. 4С). Гидродинамический диаметр NP2 на 20 нм отличался от гидродинамического диаметра NP1 после конъюгации с BBN (1:2, Au : BBN). Изменение дзета-потенциала было пренебрежимо малым (~3 единицы) у NP2 по сравнению c NP1. Средний размер частиц, определенный с помощью анализа с отслеживанием наночастиц (NTA) хорошо коррелировал с результатами измерений динамического светорассеяния. Физико-химические свойства конъюгатов NP1 и NP2 в сводном виде представлены в таблице 1.

Пример 2

Анализ методом РФЭС

[0084] Для понимания природы связей и химических взаимодействий между AuNP-DTDTPA и TA-BBN провели подробный анализ методом РФЭС. На спектре РФЭС для NP2 присутствуют характерные пики С, N, О, S и Au (Фиг. 5А). На спектре РФЭС высокого разрешения для области Cls присутствуют различные области С-С, С-Н, С-О, C-N, O-С=O, N-C=O, как и следовало ожидать от конъюгированного пептида TA-BBN (Фиг. 5В). Относительные элементные составы и соотнесение пиков с разновидностями углерода в NP2 показаны в таблицах 2 и 3 соответственно.

[0085] Анализ спектра РФЭС высокого разрешения для области S 2р указывает на наличие двух различных разновидностей S (разновидность 1 и разновидность 1), сигнал каждой из которых расщепляется, образуя дублетный пик. Разновидность 1 проявляется двумя четко выраженными пиками серы при 162,3 и 163,5 эВ, которые относятся к связи Au-S DTDTPA. Дублетный пик серы, S 2p_3/2 и S 2p_1/2 с величиной взаимодействия [величиной спин-орбитального расщепления] 1,2 эВ, подтверждает адсорбцию тиолов на поверхности золота. Значения энергии связи и величины взаимодействия хорошо коррелируют с данными, приведенными в научной литературе в отношении NP1; однако после конъюгации с BBN пики смещаются в область немного более высокой энергии связи (0,5 эВ). Кроме того, два четко выраженных пика серы для разновидности 2 (при 163,2 и 164,4 эВ), находящиеся в соотношении 2:1, соответствуют связи Au-S (сера, соединенная координационной связью с AuNP) и связи S-CH3 (сера, присутствующая в аминокислоте метилцистеине, входящей в основную цепь пептида BBN) соответственно. Каждый класс пиков серы дополнительно расщеплялся, образуя дублет S 2р3/2 и S 2р1/2 с величиной взаимодействия 1,2 эВ, что подтверждает конъюгацию BBN с AuNP, как сообщалось в научной литературе. Такое присутствие дублета с эквивалентной площадью при более высокой энергии связи свидетельствует о том, что оба атома серы в TA-BBN образовали связь Au-S на поверхности AuNP. После конъюгации с BBN значения энергии связи смещаются в область более низкой энергии по сравнению со значениями для AuNP-BBN, приведенными в научной литературе. Это может быть обусловлено различием в размере ядер наночастиц, которые были использованы для конъюгации с BBN. Энергии элементарной S и некоторых органических форм S находятся в диапазоне 162-164 эВ (Фиг. 6А). Поскольку в области более высокой энергии спектра отсутствуют дополнительные пики, соответствующие окисленной сере, эти измерения согласуются с выводом, что BBN-AuNP-DTDTPA (NP2) является эксклюзивным продуктом, образующимся во время реакции наноконъюгации.

[0086] В области 4f спектра выявлены два различных сигнала золота со значениями энергии 83,6, 84,3 и 87,2, 88,0 эВ для Au 4f_7/2 и Au 4f_5/2 соответственно, которые относятся к атому золота Au(0) в ядре и к золоту на поверхности, частично обладающему [ионным] характером Au(I) (Фиг. 6В). На основании различных недавних исследований существует распространенное мнение, что дисульфид в тиоктовой кислоте присоединяется, окисляясь, к наночастицам AuNP, в результате чего золото на поверхности наночастицы частично приобретает характер Au(I). Сигналы, соответствующие энергиям связи 84,3 и 88 эВ для пиков Au в области 4f, аналогичны таковым у наночастиц AuNP, конъюгированных с пептидами, о которых сообщается в научной литературе, что указывает на наличие связи Au с атомом S в DTDTPA и TA-BBN. В подтверждение этого факта в спектре РФЭС были отмечены две различные степени окисления золота, соответствующие атому золота в ядре и атому золота на поверхности. Результаты различных исследований РФЭС, проведенных на наночастицах золота, подтверждают аналогичные выводы. Приведенные выше наблюдения четко доказывают факт связывания TA-BBN в наноконъюгате NP2.

Пример 3

Синтез и определение характеристик конъюгатов BBN-AuNP-DTDTPA-DOX

[0087] Карбоксильные группы DTDTPA на поверхности наночастиц AuNP доступны для дополнительной функционализации. Эти карбоксильные группы использовали для конъюгации доксорубицина. Для конъюгации аминогруппы DOX с карбоксильными группами DTDTPA использовали традиционную реакцию ЕDС/сульфо-NHS, чтобы получить AuNP-DTDTPA-доксорубицин ненаправленного действия (NP1-DOX) и BBN-AuNP-DTDTPA-DOX направленного действия (NP2-DOX).

[0088] Нагрузку NP1 и NP2 доксорубицином оценивали посредством флуоресцентной спектроскопии. При длине волны возбуждения 485 нм и длине волны излучения 590 нм доксорубицин демонстрирует характерный флуоресцентный сигнал на 600 нм (Фиг. 7). Выполняли серийные разведения DOX и строили стандартную калибровочную кривую для регистрации значений интенсивности флуоресценции (Фиг. 8). Регистрировали значения интенсивности флуоресценции и сопоставляли их со стандартной калибровочной кривой для определения количества доксорубицина, конъюгированного с наночастицами AuNP. Измерения флуоресценции показали, что доксорубицин был конъюгирован в количестве 0,53 мкг и 0,3 мкг на мг AuNP-DTDTPA и BBN-AuNP-DTDTPA соответственно. Дополнительно выполняли серийные разведения NP1-DOX и NP2-DOX и регистрировали значения интенсивности флуоресценции. Изменение интенсивности флуоресценции было пропорциональным и постоянным, что подтверждает конъюгацию DOX с NP1 и NP2. Измерение флуоресценции также указывает на то, что после конъюгации с наночастицами AuNP величина флуоресценции доксорубицина остается неизменной (Фиг. 9 и 10). Спектры в УФ-видимой области для NP1-DOX, NP2-DOX и соответствующих им контролей показаны на Фиг. 11. Наблюдалось изменение гидродинамического диаметра на 10-20 нм после конъюгации DOX как с NP1, так и с NP2. После конъюгации с DOX дзета-потенциал сместился ближе к области положительных значений. Изменение отрицательного значения дзета-потенциала с -72 и -69 мВ для NP1 и NP2 соответственно на -23 мВ указывает на то, что частицы отталкиваются друг от друга и что тенденция к агрегированию частиц отсутствует. Физико-химические свойства конъюгатов NP1-DOX и NP2-DOX в сводном виде представлены в таблице 1.

Пример 4

Исследования стабильности in vitro

[0089] Стабильность конъюгатов NP1 и NP2 исследовали в различных биологически значимых растворах. Растворы NP1 и NP2 подвергали нагрузке в виде введения 0,9% NaCl, 0,5% цистеина, 0,2 М гистидина, 0,5% человеческого сывороточного альбумина (HSA) и 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA). Стабильность наноконъюгатов в различных временных точках анализировали с помощью трех методов: (i) мониторинга плазмонного резонанса с использованием спектроскопии в УФ-видимой области, (ii) оценки изменений гидродинамического диаметра и (iii) измерения электрофоретического заряда (дзета-потенциала). Изменение длины волны поверхностного плазмонного резонанса и ширины полосы плазмонного поглощения, а также измерение гидродинамического диаметра непосредственно связаны с пониманием агрегационного поведения наночастиц. Измерение дзета-потенциала является показателем сил отталкивания, присутствующих в водном растворе, и может быть использовано для прогнозирования долгосрочной стабильности дисперсий наночастиц in vitro / in vivo. Для наноконъюгатов, полученных при стехиометрических соотношениях Au : BBN, равных 1:2 и 1:4, проводили исследования стабильности. При использовании соотношения Au : BBN 1:4 была выявлена агрегация в течение 24-часового периода, тогда как при соотношении Au : BBN 1:2 оба конъюгата, NP1 и NP2, оставались стабильными в этих биологически значимых растворах. Пики поглощения в УФ-видимой области остаются неизменными, а изменения гидродинамического диаметра и дзета-потенциала минимальны, что подтверждает структурную целостность и надежность конъюгата (Фиг, 12). Однако в присутствии цистеина как для NP1, так и для NP2 наблюдалось увеличение гидродинамического размера со временем (в течение 24 ч) из-за взаимодействий золото-тиол, но это увеличение было незначительным. Данные исследований стабильности in vitro указывают на то, что NP1 и NP2 имеют оптимальную кинетическую стабильность для использования в последующих исследованиях нацеливания на рецепторы in vivo.

Пример 5

Исследования аффинности связывания NP2 с рецепторами in vitro

[0090] Клетки опухоли предстательной железы человека РС-3 экспрессируют на своей поверхности большое количество рецепторов GRP. Аффинность связывания NP2 оценивали путем проведения анализа конкурентного ингибирования и определения значений IC₅₀. Использовали наночастицы, полученные при трех различных стехиометрических соотношениях Au : BBN (1:0,5; 1:2; 1:4). Построили сравнительный график значений IC₅₀ для различных стехиометрических соотношений Au : BBN (1:0,5; 1:2; 1:4) (Фиг. 13). Значения IC₅₀ конъюгата NP2 с различными соотношениями представлены в микрограммах, поскольку точно определить молекулярные массы наноконъюгатов не представляется возможным. Из данных видно, что у конъюгатов значения IC₅₀ или аффинность связывания с клетками зависят от степени покрытия поверхности наночастиц AuNP пептидом TA-BBN. Например, конъюгат NP2 с соотношением Au : BBN=1:4, у которого на поверхности наночастиц AuNP больше молекул пептида TA-BBN, показал более низкое значение IC₅₀ (или более высокую аффинность связывания с клетками) по сравнению с другими конъюгатами. Однако этот конъюгат является не очень стабильным и не использовался для клеточных исследований. Исследование конкурентного ингибирования подтверждает свойства нацеливания на рецепторы у NP2.

Пример 6

Анализ цитотоксичности in vitro.

[0091] Цитотоксичность in vitro конъюгированных с доксорубицином наночастиц AuNP, NP1-DOX и NP2-DOX в отношении раковых клеток человека, экспрессирующих GRP и не экспрессирующих GRP, изучали посредством МТТ с использованием соответствующих контролей. Клетки рака предстательной железы человека (Рс3) имеют на своей поверхности большое количество рецепторов GRP. В частности, в научной литературе есть данные о том, что на поверхности клеток рака предстательной железы человека присутствует 44000 сайтов рецепторов бомбезина. В качестве раковых клеток, не экспрессирующих GRP, использовали клетки рака молочной железы человека (MDA-МВ231). Свободный доксорубицин показал значения IC₅₀ 9,5 мкг/мл в раковых клетках РС3 (Фиг. 14) и >10 мкг/мл в раковых клетках MDA-MB231 (Фиг. 16). Сравнительные диаграммы, демонстрирующие влияние NP1-DOX, NP2-DOX и DOX на цитотоксичность в отношении клеток, экспрессирующих GRP и не экспрессирующих GRP, показаны на Фиг. 15, 17 и 20. В отношении раковых клеток, не экспрессирующих GRP, NP1-DOX и NP2-DOX показали значения IС₅₀ 6 мкг/мл и 9 мкг/мл соответственно, тогда как в отношении клеток РС3 значения IC₅₀ составили 10 мкг/мл и 5 мкг/мл соответственно (таблица 4). Следует отметить, что представленные здесь значения IC₅₀ для NP1-DOX и NP2-DOX основаны на общей массе наноконъюгата, а количество DOX, встроенного в наноконъюгат, составляет 0,53 мкг/мл и 0,3 мкг/мл соответственно. Значения IC₅₀ для наноконъюгатов в пересчете на доксорубицин, приведены в таблице 4 и на Фиг. 18 и 19.

[0092] Как видно из приведенного выше, конъюгированные с доксорубицином наночастицы AuNP проявили намного более сильную цитотоксичность, чем свободный доксорубицин. Например, по сравнению с цитотоксичностью свободного доксорубицина цитотоксичность NP2-DOX возросла в 3000 раз и в 6000 раз в отношении раковых клеток, не экспрессирующих GRP и экспрессирующих GRP соответственно.

Пример 7

Синтез AuNP-DTDTPA

[0093] Наночастицы AuNP, функционализированные дитиолированной диэтилентриаминпентауксусной кислотой (DTDTPA), получали по модифицированному протоколу, описанному в Brust et. al., J. Chem. Soc, Chem. Commun. 1995, 1655-1656. Вкратце, 200 мг (0,507 ммоль) HAuCl₄⋅3H₂O растворяли в 120 мл метанола в круглодонной колбе емкостью 500 мл. В отдельной колбе растворяли 482 мг (0,943 ммоль) DTDTPA в 40 мл МеОН и 2 мл ледяной уксусной кислоты. Этот раствор при непрерывном перемешивании добавляли в водный раствор соли золота с образованием раствора оранжевого цвета. К этой смеси добавляли 190 мг (5 ммоль) NaBH₄, растворенного в 14 мл деионизированной воды, при энергичном перемешивании при комнатной температуре. Сразу после добавления NaBH₄ раствор становился темно-коричневым с последующим появлением черных хлопьев. Полученную смесь оставляли для перемешивания в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем добавляли 5 мл 1 М водного раствора НСl. Затем этот черный раствор наночастиц золота подвергали центрифугированию со скоростью 7000 об/мин в течение 20 минут. Супернатант удаляли, и частицы дважды промывали 0,01 М НСl, используя такие же параметры центрифугирования, как указанные выше. Частицы дополнительно тщательно и последовательно промывали деионизированной водой, а затем диэтиловым простым эфиром. Полученный черный порошок AuNP-DTDTPA высушивали под вакуумом и хранили при -20°С. При необходимости частицы легко диспергировались в 0,01 М NaOH и оставались стабильными более месяца.

Пример 8

Синтез пептида BBN с тиоктовой кислотой

[0094] BBN получали с помощью твердофазного синтеза пептидов, применяя методику защиты Fmoc-группой, а конечные пептиды очищали посредством ВЭЖХ. В качестве твердой подложки для синтеза использовали 4-гидроксиметилфеноксиацетил-4'-метилбензигидриламиновую смолу. Защищенные Fmoc-группой аминокислоты активировали с использованием одного эквивалента растворов 0,45 М HBTU/HOBt и двух эквивалентов N,N-диизопропилэтиламина. Аминокислоты освобождали от защитной Fmoc-группы с использованием пиперидина и связывали с использованием NMM⋅HBTU. После связывания в соответствующей последовательности всех аминокислот присоединяли тиоктовую кислоту (липоевую кислоту) с использованием DIC⋅HOBt. Отщепление пептида от смолы проводили с использованием TFA. На этом этапе отщепления также удаляли защитные группы боковой цепи аминокислоты. Пептид очищали методом обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке С18 с использованием градиента АВ, начиная с 0% В, где А представляет собой 0,1% TFA в воде, а В представляет собой 0,1% TFA в ацетонитриле. После очистки пептидную массу измеряли методом жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией или матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации, а степень чистоты определяли с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ.

Пример 9

Синтез специфичных к рецептору бомбезина наноконъюгатов золота, стабилизированных DTDTPA (BBN-AuNP-DTDTPA)

[0095] Бомбезин с концевой тиоктовой кислотой подвергали взаимодействию с наночастицами золота в стехиометрических соотношениях Au : BBN, равных 1:0,25, 1:0,5, 1:1, 1:2 и 1:4. Как правило, в стеклянной виале емкостью 20 мл готовили раствор AuNP-DTDTPA ([Au]=2,28 мкмоль) с использованием смеси воды и метанола (1:9) 0,01 М NaOH. Бомбезин с концевой тиоктовой кислотой (TA-BBN) в количествах 0,64 мг (0,57 мкмоль), 1,28 мг (1,14 мкмоль), 2,56 мг (2,27 мкмоль), 5,12 мг (4,54 мкмоль) и 10,24 мг (9,08 мкмоль) растворяли в 4 мл МеОН, а затем добавляли раствор наночастиц. Реакционную смесь перемешивали в течение 2 часов при комнатной температуре, в результате чего наблюдалось образование темно-коричневого осадка. Смесь центрифугировали (9300 g, в течение 10 мин при 20°С) и удаляли супернатант. Осажденные наночастицы AuNP дважды промывали МеОН и трижды - водой. BBN-AuNP-DTDTPA высушивали при низком давлении и хранили при -20°С.

Пример 10

Синтез AuNP-DTDTPA-доксорубицина и BBN-AuNP-DTDTPA-доксорубицина

[0096] Синтез конъюгированных с доксорубицином наночастиц золота с пептидом бомбезином и без него проводили в трех повторах. Наночастицы золота в количестве 0,5 мг суспендировали в 1X PBS путем ультразвуковой обработки. К 100 мкл этого раствора добавляли 2 мг гидрохлорида 1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимида (EDC) и 2 мг N-гидроксисульфосукцинимида (сульфо-NHS) в 0,1 М буфера 2-(морфолино)этансульфоновой кислоты (MES) (рН 4,6). Поддерживали рН реакционной смеси на уровне 5,3-5,4 с помощью буфера MES. Реакционную смесь перемешивали в течение 3 ч при 37°С и 700 об/мин. Через 3 часа реакционную смесь центрифугировали при 20000 g в течение 20 мин при 25°С. Для конъюгации с наночастицами использовали 0,7 мг доксорубицина для клинического применения. К раствору доксорубицина добавляли наночастицы с активированными карбоксильными группами и реакционную смесь встряхивали. Связывание проводили в течение ночи при 25°С и 750 об/мин. Реакционную смесь центрифугировали при 20000 g в течение 20 минут при 25°С, впоследствии гранулы дважды промывали 1X PBS и ресуспендировали в растворе 1X PBS. Для исследования эффективности конъюгации посредством флуоресцентной спектроскопии использовали как гранулы, так и супернатанты.

[0097] Все процитированные патенты, описания патентов и другие документы в полном объеме включены в настоящий документ путем ссылки. Однако, если термин в настоящем описании находится в противоречии или конфликте с термином из включенного посредством ссылки документа, термин из настоящего описания имеет приоритет над конфликтным термином из включенного посредством ссылки документа.

[0098] Несмотря на то что были описаны конкретные варианты осуществления, возможно появление альтернативных вариантов, модификаций, вариаций, улучшений и существенных эквивалентов, которые в настоящее время являются или могут являться непредвиденными для заявителей или других специалистов в данной области. Соответственно считается, что прилагаемая формула изобретения в том виде, в котором она была подана, и в том виде, в котором она может быть изменена, охватывает все такие альтернативные варианты, модификации, вариации, улучшения и существенные эквиваленты.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к новым наноконъюгатам золота с терапевтическими агентами, и может быть использовано в медицине. Изобретение позволяет получить конъюгат наночастицы золота с доксорубицином и бомбезином, в котором стабилизированная дитиолированная диэтилентриаминпентауксусная кислота (DTDTPA) связана с поверхностью наночастицы золота, молекулы доксорубицина присоединены по концевым аминогруппам DTDTPA, а молекулы бомбезина присоединены к поверхности наночастицы золота через концевую тиоктовую кислоту. Изобретение раскрывает возможность применения такого наноконъюгата в составе фармацевтической композиции для направленной доставки терапевтического агента к опухолевым клеткам. 3 н. и 14 з.п. ф-лы, 10 пр., 4 табл., 20 ил.

1. Наноконъюгат направленного действия для терапии опухолей, содержащий

наночастицу золота (AuNP),

дитиолированную диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTDTPA),

пептид с концевой тиоктовой кислотой и

доксорубицин,

где DTDTPA связана непосредственно с поверхностью наночастицы золота посредством по меньшей мере одной связи Au-S;

пептид с концевой тиоктовой кислотой представляет собой бомбезин с концевой тиоктовой кислотой и связан непосредственно с поверхностью наночастицы золота посредством по меньшей мере одной связи Au-S; и

доксорубицин связан с DTDTPA.

2. Наноконъюгат по п. 1, в котором бомбезин с концевой тиоктовой кислотой имеет последовательность: липоевая кислота-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂.

3. Наноконъюгат по п.1 или 2, в котором доксорубицин связан с DTDTPA посредством амидной связи.

4. Наноконъюгат по любому из пп. 1-3, который получают способом, включающим конъюгацию наночастицы AuNP-DTDTPA с пептидом с концевой тиоктовой кислотой, причем золото в виде наночастицы золота и пептид с концевой тиоктовой кислотой присутствуют в реакции конъюгации в стехиометрическом соотношении от около 1:0,5 до около 1:4.

5. Наноконъюгат по п. 4, в котором золото в виде наночастицы золота и пептид с концевой тиоктовой кислотой присутствуют в реакции конъюгации в стехиометрическом соотношении около 1:2.

6. Наноконъюгат по любому из пп. 1-5, в котором пептид с концевой тиоктовой кислотой составляет от около 1 до около 40% по массе наноконъюгата.

7. Наноконъюгат по п. 6, в котором пептид с концевой тиоктовой кислотой составляет от около 20 до около 30% по массе наноконъюгата.

8. Наноконъюгат по любому из пп. 1-7, в котором доксорубицин составляет от около 0,01 до около 0,05% по массе наноконъюгата.

9. Наноконъюгат по п. 8, в котором доксорубицин составляет около 0,03% по массе наноконъюгата.

10. Наноконъюгат по любому из пп. 1-9, в котором наноконъюгат имеет гидродинамический диаметр от около 110 до около 140 нм при измерении путем динамического светорассеяния (DLS).

11. Наноконъюгат по п. 10, в котором наноконъюгат имеет гидродинамический диаметр от около 120 до около 130 нм при измерении путем динамического светорассеяния (DLS).

12. Наноконъюгат по любому из пп. 1-11, в котором наноконъюгат имеет значение дзета-потенциала от около -15 до около -30 мВ.

13. Наноконъюгат по п. 12, который имеет значение дзета-потенциала от около -20 до около -25 мВ.

14. Фармацевтическая композиция для терапии опухолей, содержащая терапевтически эффективное количество наноконъюгата по любому из пп. 1-13.

15. Способ лечения рака, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции для лечения опухолей по п. 14.

16. Способ по п. 15, в котором вид рака выбран из группы, состоящей из острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ), острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), остеосаркомы, рака молочной железы, рака эндометрия, рака желудка, рака головы и шеи, лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы, рака печени, рака почки, множественной миеломы, нейробластомы, рака яичника, рака легкого, саркомы мягких тканей, тимом, рака щитовидной железы, рака мочевого пузыря, саркомы матки, рака предстательной железы, рака толстой кишки, рака яичника, немелкоклеточного рака легкого, рака поджелудочной железы, опухоли Вильмса и макроглобулинемии Вальденстрема.

17. Способ по п. 15 или 16, в котором фармацевтическую композицию вводят субъекту путем инъекции.