ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ ПЕПТИДЫ ИЛИ ИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИ ПРИЕМЛЕМЫЕ СОЛИ Российский патент 1997 года по МПК C07K7/06 A61K38/08 

Изобретение относится к терапевтическим пептидам, пригодным, например, для лечения доброкачественных или злокачественных опухолей и расстройств желудочно-кишечного тракта.

Пептид земноводных бомбезин, pGlu -GIn-Arg-Leu-GIy-Asn-GIn-Trp-AIa-VaI-GIy-His-Leu-Met-NH₂ (Anastasi и др. Experientia, 27, 166-167, 1971) является близко родственным гастрин-выделяющим пептидам млекопитающих /GRP/, например GRP свиньи: H₂N-AIa-Pro-VaI-Ser-VaI-GIy-GIy-GIy-Thr-VaI-Leu-AIa-Lys-Met-Tyr-Pro-Arg-GIy-Asn-His-Trp-AIa-VaI-Giy-His-Leu-Met-/NH₂/ (McDonald и др. Biochem. Biophys. Res. Commun. 90, 227-233, 1979) и GRP человека: H₂N-VaI-Pro-Leu-Pro- AIa-GIy-GIy-GIy-Thr-VaI-Leu-Thr-Lys-Met-Tyr-Pro-Arg-GIy-Asn-His- Trp-AIa-VaI-GIy-His-Leu-Met-/NH₂/.

Бомбезин, как было обнаружено, представляет собой фактор роста для ряда линий клеток злокачественных опухолей человека, включая мелкоклеточный рак легкого /SCLC/, и был найден в злокачественных опухолях молочной железы и простаты человека (Haveman и др. Новые результаты в исследовании рака - пептидyые гормотна в злокачественной опухоли легкого, Нью-Йорк, изд-во "Springer-Verlad", 1986). Известно, что ряд этих злокачественных новообразований выделяет пептидные гормоны, родственные GRP или бомбезину. Следовательно, в качестве агентов для лечения этих злокачественных опухолей были предложены антогонисты бомбезина.

Cuttitta и др. показали, что специфическое моноклональное антитело к бомбезину ингибировало в условиях in vivo рост линии клеток мелкоклеточного рака легкого человека, ксенотрансплантированной голым мышам (Cuttitta и др. Cancer Survey, 4, 707-727, 1985). В ЗТЗ муриновых фибробластах, которые ответственны за митотический эффект бомбезина, Zachary и Rozengurt наблюдали, что антагонист субстанции P (спантид) действует как антагонист бомбезина (Zachary и др. Proc. Natl. Acad. Sci. /USA/, 82, 7616-7620, 1985). Heinz-Erian и др. заместили His в положении 12 в бомбезине на D-Phe и наблюдали бомбезиновую антагонистическую активность в диспергированном ацинусе из поджелудочной железы морской свинки (Heinz-Erian и др. Am. J. of Physiol. 252, G439-G442, 1987). Rivier сообщил о работе, связанной с ограничением конформационной свободы биоактивного C-концевого декапептида бомбезина введением внутримолекулярных дисульфидных мостиков, однако Rivier упомянул, что до сих пор с помощью такой модификации не удалось получить аналоги бомбезина, обладающие какой-либо антагонистической активностью (Rivier и др. Конкурентные антагонисты пептидных гормонов, сборник тезисов международного симпозиума по бомбензиноподобным пептидам в здравоохранении, Рим, Италия, октябрь, 1987).

Сокращения (необычные):
;

Pal=3-пиридиланин;
β-Ieu=b-гомолейцин;
g -Ieu гамма-гомолейцин;
D-Cpa D-пара-хлорофенилаланин;
HyPro гидроксипролин;
NaI нафтилаланин;
Sar саркозин;
Sta /3S, 4S/-4-амино-3-гидрокси-6-метилгептановая кислота и имеет следующую химическую структуру:

АНРРА /3S,4S/-4-амино-3-гидрокси-5-фенилпентановая кислота;
АСНРА /3S,4S/-4-амино-5-циклогексил-3-гидроксипентановая кислота;
R правая /D/ конфигурация;
S левая /L/ конфигурация;
рацемат равная смесь R и S;
I-метил-His;
3-метил-His метильная /CH₃/ группа на азоте в положениях I или 3 гистидина:

Краткое изложение изобретения.

Линейный пептид (т.е. нециклический), который является аналогом встречающегося в природе биологически активного бомбезина земноводных или гастрин-выделяющего пептида (GRP) млекопитающих, имеющего активный центр и связывающий центр, ответственный за связывание пептида с рецептором на клетке-мишени, где расщепление пептидной связи в активном центре встречающегося в естественных условиях бомбезина или GRP представляет собой ненужную в условиях in vivo биологическую активность, где аналог претерпевает одну из следующих модификаций: (a) делецию остатка внутри активного центра и модификацию остатка вне активного центра или (b) замещение одого или двух остатков внутри активного центра на синтетическую аминокислоту.

Этот аналог способен действовать как конкурентный ингибитор естественно встречающегося пептида путем связывания с рецептором и, благодаря одной из модификаций, отсутствием в условиях in vivo биологической активности естественно встречающегося пептида.

Расположение модификации, которая приводит к антагонистам, определяется расположением активного центра в естественно встречающемся пептиде.

Например, линейные пептиды, где для создания или увеличения антагонистической активности пригодно введение непептидной связи между двумя остатками или замещение двух природным аминокислот синтетической бета- или гамма-аминокислотой, или делеция ("des") C-концевого остатка это пептиды, в которых активность связана с двумя C-концевыми остатками аминокислотной цепи. Следовательно, активный центр естественно встречающегося пептида, аналогами которого являются пептиды по изобретению, предпочтительно включает, по крайней мере, одну аминокислоту в карбокси-концевой половине пептида, а линейный пептид по изобретению включает ту аминокислоту в своей карбокси-концевой половине.

По аналогии, там, где в естественно встречающемся пептиде активный центр расположен в амино-концевой части, соответствующие аналоги по изобретению будут обладать модификациями в своих амино-концевых фрагментах.

В предпочтительных вариантах активный цент включает, по крайней мере, один аминокислотный остаток, расположенный в карбоксиконцевой половине естественно встречающегося биологически активного пептида, и этот аминокислотный остаток локализован в карбокси-концевой половине линейного пептида.

В других предпочтительных вариантах активный центр включает, по крайней мере, один аминокислотный остаток, расположенный в аминоконцевой половине естественно встречающегося биологически активного пептида, и в линейном пептиде этот аминокислотный остаток расположен в его аминоконцевой половине.

Модификации могут быть введены в участок, включенный в рецепторное связывание, или в несвязывающий участок.

Аналоги по изобретению предпочтительно являются на 25% гомологичными, особенно предпочтительно на 50% гомологичными, с естественно встречающимися пептидами.

Аналоги по изобретению могут иметь одну из модификаций, даваемую общими формулами, представленными ниже; или непептидная связь вместо пептидной связи между аминокислотой активного центра и смежной аминокислотой; или остаток статина, или остаток АНРРА, или остаток АСНРА, или бета- или гамма- аминокислота вместо одной или двух природных аминокислот; или делеция C-концевой аминокислоты, которая может сопровождаться или может не сопровождаться добавлением заместителя на фактическую C-концевую группу; или наличие N-концевого остатка, который не является природной N-концевой аминокислотой пептидов, из которых выводят аналоги. (Статин, АНРРА и АСНРА имеют химические структуры, определенные выше. Там, где используют статин, можно также использовать АНРРА или АСНРА).

Под непептидной связью подразумевают, что углеродный атом, принимающий участие в связи между двумя остатками, восстановлен из карбонильного углерода в метиленовый углерод, т.е. CH₂-NH; или менее предпочтительно, что остаток, связанный с атомом углерода содержит атом серы или метиленовый углерод вместо своей аминогруппы, т.е. CH₂-S или CO-CH₂. (Детальное обсуждение химии непептидных связей представлено в работе Coy и др. Tetrahedron, 44, 3, 835-841, 1988, включенной здесь в качестве ссылки).

Одна модификация естественно встречающегося пептида для получения антагониста располагается на аминоконцевом конце молекулы, которая может быть электронодородным остатком, например, азотсодержащей аминокислотой, такой, как аминокислоты, описанные для аминоконцевых положений в общих формулах, представленных ниже; например N-концевой аминокислотой, которая представляет собой A⁰, или, если A⁰ отсутствует, является A¹, или, если A⁰ и A¹ отсутствуют, представляет собой A², как показано ниже, может быть ароматическим D-изомером или может быть алкилированной аминокислотой (где "D" не обозначает конфигурацию аминокислоты, а имеют в виду L-конфигурацию).

Другая модификация находится на C-концевом остатке, который может быть любой из групп "w", описанных ниже.

Данное изобретение включает терапевтический пептид, содержащий от семи до девяти аминокислотных остатков включительно, где пептид является аналогом одного из следующих естественно встречающихся пептидов, имеющих карбокси-конец на остатке Met: (a) литорина; (b) нейромедина; (c) карбокси-концевого участка из десяти аминокислот гастрин-выделяющего пептида млекопитающих и (d) карбоксиконцевого участка из десяти аминокислот бомбезина земноводных, где терапевтический пептид имеет формулу I:

где A⁰ GIy, D-AIa, D-Phe, D p- NaI, D-p-X-Phe;
(X галоид или OH) или отсутствует;
A¹ p-GIu, Asn, D-AIa, D-Phe, D-Leu, D-Trp, D-β-NaI-p-X-Pne (где X галоид или OH) или отсутствует;
A² p-GIu, GIn, Leu, His;
A⁴ AIa;
A⁵ VaI, Phe, Thr;
A⁶ Sar, GIy, D-AIa;
A⁷ NiS
при условии, что когда A⁰ присутствует, A¹ не может представлять собой pGIu, когда A⁰ или A¹ присутствует, A⁰ не может представлять собой pGIu, R₁ должен представлять собой H, а R₂ должен представлять собой ту часть GIu, которая образует в p-GIu иминное ядро и далее, при условии, что W может представлять собой фрагмент, выбранный из следующих:

где R₃ -CHR₁₄-(CH₂)-, (R₁₄ либо H, либо OH и n 0 или 1) или отсутствует;
Z₁ изопропил, циклогексилметил или идентифицирующая группа любой из аминокислот: Leu, Phe, βNal,
V либо OR₄, либо группа где R₄ низший алкил, каждый R₅ и R₆ независимо представляет собой любой из водорода, низшего алкила, фенил (низшего алкила или где R₁₅ водород или низший алкил, при условии, что если один R₅ или R₆ представляет -NHR₁₅, другой водород;

где R₄, и каждая из групп Z₁ и Z₂, независимо, представляет собой идентифицирующую группу из любой из нижеследующих аминокислот: Leu, β-Nal, Phe, p-x-Phe, где X галоид, Met, Pro;
V OCH₃, NH₂ или OH, или

где каждый R₁₂ и R₁₃ независимо представляет водород или низший алкил, и при условии, что любой асимметричный атом углерода в (I), (II) и (III) может представлять собой R, S или рецемическую смесь и далее, при условии, что каждая из групп R₁ и R₂ независимо представляет собой H, низший алкил, фенил (низший), алкил или COε (где e низший алкил, фенил, (низший)алкил;
R₁ и R₂ связаны с N -концевой аминокислотой указанного пептида, и кроме того, при условии, что когда одна из групп представляет собой COε другая должна представлять собой водород, или их фармацевтически приемлемые соли.

Терапевтический пептид предпочтительно имеет формулу I, где
A⁰ =GIy, D-Phe или отсутствует;
A¹ p-GIu, D-Phe, D-AIa, D-b-Nal, D-Cpa или D-Asn;
A²=G1n, His, 1-метил-His, или 3-метил-His;
A⁴ AIa;
A⁵ VaI;
A ⁶ =Sar, GIy, D-Phe или D-AIa;
A⁷ His; при условии, что там, где R₃ представляет собой группу CH₂-CH ₂ , Z ₁ является идентифицирующей группой из Leu или Phe; или, где R ₃ представляет собой группу CHOH-CH ₂ , Z₁ является идентифицирующей группой из Leu или представляет собой изопропил, циклогексилметил, бета-нафтилметил или фенилметил; при условии, что V является

а каждый R₅ и R ₆ представляют собой водород.

Данный пептид предпочтительно имеет общую формулу, где V является группой NHR₆, где R ₆ представляет собой NH₂.

Самый предпочтительный терапевтический пептид имеет следующие аминокислотные формулы: pGlu-G1n-Trp-AIa-VaI-GIy-His-статинамид и D-p-CI-Phe-G1n-Trp-AIa-VaI-GIy-His-β-Leu-NH₂.

Предпочтительно, если аминокислотная последовательность терапевтических пептидов формул, описанных здесь, является, по крайней мере на 25% гомологичной аминокислотной последовательности естественно встречающегося пептида; и наиболее предпочтительно, когда эта гомологичность составляет, по крайней мере, 50%
Непептидные связи, в которых пептидная связь восстановлена, обозначены здесь символом "j/CH₂NH/" или "j".

Антагонисты по настоящему изобретению пригодны для лечения заболеваний, включающих злокачественное и доброкачественное разрастание ткани, таких, как все формы рака, где бомбезин-связанные или GRP-связанные вещества действуют как аутокринные или паракринные митотические факторы, например, злокачественные опухоли желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, рак толстой кишки, рак легкого, особенно его мелкоклеточный подтип, или рак молочной железы; или для лечения атеросклероза и расстройств тканей желудочнокишечного тракта, связанных с желудочной и поджелудочной секрециями и сократительной способностью; например для подавления секреции амилазы или для контроля аппетита.

Активность в условиях in vivo соединений, общие формулы которых даны выше и где любой один из R₁-R₁₃ или R₁₅ представляет собой ароматическую липофильную группу, может длиться долго, и таким образом, может быть облегчена поставка этих соединений по изобретению в ткань-мишень.

Идентифицирующая группа альфа-аминокислоты представляет собой атом или группу атомов, отличных от альфа-карбонильного углеродного атома, атома азота альфа-аминогруппы или атома водорода, связанных с асимметрическим альфа-углеродным атомом. Чтобы проиллюстрировать это примерами, следует указать, что идентифицирующей группой аланина является CH₃, идентифицирующая группа валина представляет собой (CH₃)₂CH, идентифицирующей группой лизина является H₃N⁺(CH₂) ₄ и идентифицирующая группа фенилаланина представляет собой (C₆H₆)CH₂.

Идентифицирующей группой бета- или гамма-аминокислоты является аналогичный атом или группа атомов, присоединенных, соответственно, к бета- или гамма-углеродному атому. Там, где идентифицирующая группа аминокислоты не указана, это может быть альфа-, бета- или гамма-.

Другие характеристики и преимущества изобретения будут видны из следующего описания его предпочтительных вариантов и из формулы изобретения.

На фиг. 1 изображен график, где представлены кривые роста опухолей для ксенотрансплантатов NCI-H69; на фиг. 2 -ряд аминокислотных последовательностей естественно встречающихся пептидов, аналогами которых являются пептиды по изобретению; на фиг. 3 график, показывающий влияние инъекции аналога бомбезина: D-Phe⁶BN (6 13) метилового эфира при испытании активности бомбезин-стимулированной амилазы поджелудочной железы.

Структура, синтез и применение предпочтительных вариантов изобретения.

Структура
Все пептиды по изобретению имеют непептидную связь по крайней мере, в одном из указанных положений, за исключением замещенных аналогов статина и b-Leu, таких, как sta⁸-desLeu⁸ -Met⁹-литорин.

Под непептидной связью подразумевают, что углеродный атом, участвующий в связи между двумя остатками, восстановлен из карбонильного углерода в метиленовый углерод. Способ восстановления пептидной связи, который приводит к этой непептидной связи, описан Coy и др. в (заявке США N 879348), предназначенной для такого же рассмотрения, как и настоящая заявка, представленной здесь ссылкой. Одна любая аминокислота в положениях 0, 1, 2 и 9 в антагонистах литорина может быть удалена из пептидов, и такие пептиды являются еще активными как антагонисты.

Пептиды по изобретению могут быть получены в форме фармацевтически приемлемых солей.

Примерами предпочтительных солей являются соли с терапевтически приемлемыми органическими кислотами, например уксусной, молочной, малеиновой, лимонной, яблочной, аскорбиновой, янтарной, бензойной, салициловой, метансульфоновой, толуолсульфоновой или памовой кислотой, а также полимерными кислотами, такими, как дубильная кислота или карбоксиметилцеллюлоза, и соли с неорганическими кислотами, такими, как галогеноводородные кислоты, например хлористоводородная, серная или фосфорная кислота.

Синтез аналогов литорина
Синтез антагониста литорина pGIu-GIn-Trp-AIa-VaI -GIy-His-Levj/CH₂NH/Leu-NH₂ выглядит следующим образом. Другие антагонисты бомбезина, литорина, нейромедина или GRP могут быть получены путем соответствующих модификаций следующего синтетического метода.

Первый этап заключается в получении промежуточного соединения: pGIu-GIn-Trp-AIa-VaI-GIy-His (бензилоксикарбонил)-Leuj/CH₂ NH/-Leu-бензгидриламинная смола по следующей методике.

Бензгидриламинполистирольную смолу (производства фирмы "Vega Biochemicals, Inc. ) в хлоридной форме помещают в реакционный сосуд пептидного синтезатора марки "Бекман-99ОВ", запрограммированного на выполнение следующего реакционного цикла: (а) метиленхлорид; (в) 33% трифторуксусная кислота /TFA/ в метиленхлориде (2 раза по 1 ч 25 мин каждый); (с) метиленхлорид; (d) этанол; (e) метиленхлорид и (f) 10% триэтиламин в хлороформе.

Нейтрализованную смолу перемешивают с альфа-трет-бутоксикарбонил/Вос/-лейцином и диизопропилкарбодиимидом (1,5 моль каждого) в метиленхлориде в течение 1 ч и получающуюся в результате аминокислотную смолу затем проводят по циклу через этапы (а) (f) в вышеуказанной программе промывки. Вос-Лейцинальдегид (1,25 моль), полученный по методике (Fehrentz и Castro, Синтезы. 1983, с. 676) растворяют в 5 мл сухого диметилформамиде (DMF) и добавляют к суспензии соли смолы и трифторуксусной кислоты с последующим добавлением 100 мг (2 моль) цианоборогидрида натрия (Sasaki и Coy, Peptides, 8, 119-121, 1987), Coy и др. там же. После перемешивания в течение 1 ч обнаружено, что содержащая смолу смесь имеет отрицательную нингидриновую реакцию (1 мин), указывающую на то, что прореагировали все свободные аминогруппы.

Затем в присутствии диизопропилкарбодиимида (1,5 моль) последовательно присоединяют следующие аминокислоты (1,5 моль), и получающуюся в результате аминокислотную смолу проводят по циклу через стадии промывка/деблокирование (a) -(f) по аналогичной методике, указанной выше: Вос-His/бензилоксикарбонил/ Boc-GIy, Boc-VaI, Boc-AIa, Boc-Trp, Boc-GIn (присоединен в виде 6 М избытка пара-нитрофенилового эфира) и pGIu. Полученную в результате этих операций смолу промывают метанолом и сушат на воздухе.

Описанную выше смолу (1,6 г, 0,5 моль) смешивают с анизолом (5 мл) и безводным фтористым водородом (35 мл) при 0^oC и перемешивают в течение 45 мин. Избыток фтористого водорода быстро упаривают в токе сухого азота, и свободный пептид осаждают и промывают диэтиловым эфиром. Неочищенный пептид растворяют в минимальном объеме 2 M уксусной кислоты и элюируют на колонке (2,5х100 мм) с сефадексом G-25 (производства фирмы "Pharmacia Fine Chemicals").

Фракции, содержащие основной компонент, отобранные с помощью УФ-абсорбции и тонкослоевой хроматографии /TLC/, затем объединяют, упаривают до малого объема и наносят на колонку (2,5х50 см), наполненную системой: октадецилсилан-силикагель (типа "Whatman LRP-1", 15-20 мкм меш размер).

Пептид элюируют в линейном градиенте 0-30% ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте в воде. Фракции исследуют методом тонкослоевой хроматографии и аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии /HPLC/ и объединяют, получая продукт с максимальной частотой. Повторная лиофилизация раствора от воды дает 60 мг продукта в виде белого пушистого порошка.

Обнаружено, что этот продукт является гомогенным, как это следует из данных HPLC и TLC. Аминокислотный анализ кислого гидролизата подтверждает состав пептида. Присутствие Leu j /CH₂-NH/-связи показано масс-спектрометрией бомбардировки быстрого атомами. Аналогичным образом, модифицируя соответствующим образом вышеуказанную методику, с аналогичными выходами получают pGIu-GIn-Trp-AIa-VaI-GIy-His-Phe j /CH ₂NH/Leu-HN₂ и pGIu-GIn-Trp-AIa-VaI-GIy-His-Leu j /CH₂NH/Leu NH₂ или другие пептиды.

Твердофазный синтез D-Phe¹, Leu⁸ j /CH₂NH/D-Phe⁹-литорина, D-Phe GIn-Trp-AIa-VaI-GIy-His-Leu j /CH₂NH/-D-Phe-NH₂ проводили следующим образом: сначала синтезировали Boc-D-Phe-GIn-Trp-AIa-VaI-GIy-His /тозил/-Leu j /CH₂NH/-D-Phe-бензгидриламинную смолу.

Бензгидриламинполистирольную смолу (производства фирмы "Advanced ChemTesh, Inc.") (1,25 г, 0,5 моль) в хлоридной форме помещают в реакционный сосуд пептидного синтезатора типа "Advanced ChemTecn АСТ-200", запрограммированный на выполнение реакционного цикла, описанного выше как этапы (a) (f).

Нейтрализованную смолу перемешивают с Boc-D-фенилаланином и диизопропилкарбодиимидом (1,5 моль каждого) в хлористом метилене в течение 1 ч, и получающуюся в результате аминокислотную смолу затем проводят по циклу через этапы (a (g) в вышеуказанной программе промывки. Boc-Группу затем удаляют обработкой трифторуксусной кислотой. Boc-лейцинальдегид (1,25 моль), полученный по методу Fehrentz и Castro (1), растворяют в 5 мл сухого диметилформамида и добавляют к суспензии соли смолы и трифторуксусной кислоты с последующим добавлением 100 мг (2 моль) цианоборогидрида натрия (2,3). После перемешивания в течение 1 ч обнаружено, что содержащая смолу смесь характеризуется отрицательной реакцией на нингидрин (1 мин), что указывает на то, что прореагировали все свободные аминогруппы.

Затем по аналогичной методике последовательно присоединяют следующие аминокислоты (1,5 моль): Boc-His /бензилоксикарбонил/, Boc-GIy, Boc-VaI, Boc-AIa, Boc-Trp, Boc-GIn (связан в присутствии 1 эквивалента гидроксибензотриазола), Boc-D-Phe (связан в присутствии 1 эквивалента гидроксибензотриазола). После сушки пептидная смола весила 1,93 г.

Смолу (1,93 г, 0,5 моль) смешивают с анизолом (5 мл) и безводным фтористым водородом (35 мл) при 0^oC и перемешивают в течение 45 мин. Избыток фтористого водорода быстро упаривают в токе сухого азота, осаждают свободный пептид и промывают его диэтиловым эфиром. Неочищенный пептид растворяют в минимальном объеме 2 M уксусной кислоты и элюируют на колонке (2,5х100 мм) с сефадексом G-25. Фракции, содержащие основной компонент, отобранные по данным УФ-абсорбции и тонкослоевой хроматографии, затем объединяют, упаривают до малого объема и наносят на колонку (2,5х50 см) с октадецилсиланом марки "Vydac" (10-15 мкм). Вещество элюируют в линейном градиенте 15 45% ацетонитрила в 0,1%-ном растворе трифторуксусной кислоты в воде.

Фракции исследуют методом тонкослоевой хроматографии и аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии и объединяют, получая продукт с максимальной чистотой. Повторное лиофильное высушивание раствора от воды дает 120 мг продукта в виде белого пушистого порошка.

Используя, по существу, аналогичную методику, можно синтезировать другие пептиды, например: D-p-CI-Phe-GIn-Trp-AIa-VaI-GIy-His-Leu j /CH₂NH/-D-Phe-NH₂.

Синтез Leu⁸ j /CH₂NH/D Phe₉-литорина
Твердофазный синтез D-Phe-GIn-Trp-AIa-VaI-GIy-His-Leu j /CH₂NH/-D-Phe-NH₂ осуществляли следующим образом: сначала синтезировали Boc-D-Phe-GIn-Trp-AIa-VaI-GIy-His/тозил/-Leu j /CH₂NH/-D-Phe -бензгидриламинную смолу.

Бензгидриламинполистирольную смолу (производства фирмы "Advanced ChemTech, Inc. ), (1,25 г, 0,5 моль) в хлоридной форме помещают в реактор пептидного синтезатор типа "Advanced ChemTech АСТ-200", запрограммированного на выполнение следующего реакционного цикла: (a) метиленхлорид, (b) 33% трифторуксусная кислота в метиленхлориде (2 раза по 1 ч 25 мин каждый, (c) метиленхлорид, (d) этанол, (e) метиленхлорид, (f) 10% триэтиламин в хлороформе.

Нейтрализованную смолу перемешивают в Boc-D-фенилаланином и диизопропилкарбодиимидом (1,5 моль каждого) в хлористом метилене в течение 1 ч, и получающуюся в результате аминокислотную смолу затем проводят по циклу через этапы (a) (g) в вышеуказанной программе промывки. Затем Boc-группу удаляют обработкой трифторуксусной кислоты. Boc-Лейцинальдегид (1,25 моль), полученный по методу Fehrentz и Castro (1), растворяют в 5 мл сухого диметилформамида и добавляют к суспензии соли смолы и трифторуксусной кислоты с последующим добавлением 100 мг (2 моль) цианоборогидрида натрия (2,3). После перемешивания в течение 1 ч обнаружено, что содержащая смолу смесь характеризуется отрицательной реакцией на нингидрин (1 мин), что указывает на то, что прореагировали все свободные аминогруппы.

Затем по аналогичной методике последовательно присоединяют следующие аминокислоты (1,5 моль): Boc -His /бензилоксикарбонил/, Boc-GIy, Boc-VaI, Boc-AIa, Boc-Trp, Boc-GIn (связан в присутствии 1 эквивалента гидроксибензотриазола), Boc-D-Phe (связан в присутствии 1 эквивалента гидроксибензотриазола). После сушки пептидная смола весила 1,93 г.

Смолу (1,93 г, 0,5 моль) смешивают с анизолом (5 мл) и безводным фтористым водородом (35 мл) при 0^oC и перемешивают в течение 45 мин. Избыток фтористого водорода быстро испаряют в токе сухого азота, осаждают свободный пептид и промывают его диэтиловым эфиром. Неочищенный пептид растворяют в минимальном объеме 2 M уксусной кислоты и элюируют на колонке (2,5х100 мм) с сефадексом G-25. Фракции, содержащие основной компонент, отобранные по данным УФ-абсорбции и тонкослоевой хроматографии, затем объединяют, упаривают до малого объема и наносят на колонку (2,5х50 см) с октадецилсиланом марки "Vydas" (10-15 мкм).

Вещество элюируют в линейном градиента 15 45% ацетонитрила в 0,1%-ном растворе трифторуксусной кислоты в воде. Фракции исследуют методом тонкослоевой хроматографии и аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии и объединяют, получая продукт с максимальной чистотой. Повторное лиофильное высушивание раствора от воды дает 120 мг продукта в виде белого пушистого порошка.

Этот продукт, как обнаружено методами TLC и HPL C, является гомогенным. Аминокислотный анализ кислого гидролизата подтверждает состав октапептида. Присутствие Leu j /CH₂ NH/-пептидной связи показано методом масс-спектрометрии бомбардировки быстрыми атомами.

Синтез D-Phe¹-Des-Met⁹-литорина
Твердофазный синтез D-Phe-GIh-Trp AIa-Vai-GIy-His-Leu-NH₂ проводили следующим образом.

Стадия 1. Бензгидриламинполистирольную смолу (производства фирмы "Advanced Chem Tech, Inc".) (0,62 г, 0,25 моль) в хлоридной форме помещают в реактор пептидного синтезатора типа АСТ-200, запрограммированного на выполнение следующего реакционного цикла: (a) метиленхлорид, (b) 33% трифторуксусная кислота в метиленхлориде (2 раза по 1 ч 25 мин каждый), (c) метиленхлорид, (d) этанол, (e) метиленхлорид, (f) 10% триэтиламин в хлорформе.

Нейтрализованную смолу перемешивают с Вос-лейцином и диизопропилкарбодиимидом (1,5 моль каждого) в хлористом метилене в течение 1 ч, и получающуюся в результате аминокислотную смолу затем проводят по циклу через этапы (a) (g) в вышеуказанной программе промывки. Затем по аналогичной методике последовательно присоединяют следующие аминокислоты (1,5 моль): Bos-His /бензилоксикарбонил/, Boc-GIy, Boc-VaI, Boc-AIa, Boc-Trp, Boc-GIh (присоединен в виде 6 М избытка пара-нитрофенилового эфира) и pGIu (связан в присутствии гидроксибензотриазола). После сушки пептидная смола весила 0,92 г.

Стадия 2.

Смолу (0,92 г) смешивают в анизолом (5 мл), дитиотреитом (200 мг) и безводным фтористым водородом (35 мл) при 0^oC и перемешивают в течение 45 мин. Избыток фтористого водорода быстро испаряют в токе сухого азота, осаждают свободный пептид и промывают его диэтиловым эфиром. Неочищенный пептид растворяют в минимальном объеме 2 М уксусной кислоты и элюируют на колонке (2,5х100 см) с сефадексом G-25. Фракции, содержащие основной компонент, отобранные по данным УФ-абсорбции и тонкослоевой хроматографии, затем объединяют, упаривают до малого объема и наносят на колонку (2,5х50 см) с октадецилсиланом марки "Vydac" (10 15 мкм).

Вещество элюируют в линейном градиенте 0-30% ацетонитрила в 0,1%-ном растворе трифторуксусной кислоты в воде. Фракции исследуют методом тонкослоевой хроматографии и объединяют, получая продукт с максимальной чистотой. Повторное лиофильное высушивание раствора от воды дает белый пушистый порошок. Этот продукт, как обнаружено методами HPL C и TL c, является гомогенным. Аминокислотный анализ кислого гидролизата подтверждает состав пептида.

С использованием методики, аналогичной описанной выше (0,62 г, 0,25 моль бензгидриламинной смолы на стадии /1/, и 0,92 г на стадии /2/), осуществлен синтез D-NaI-GIn-Trp-AIa-VaI-GIy-His-Leu-NH₂.

Синтез N-ацетил-D-Phe-GIn-Trp-AIa-VaI-GIy-His-Leu-NH₂ был проведен по методике, аналогичной, описанной выше, с использованием 0,62 г, (0,25 моль) бензгидриламинной смолы на стадии /1/ и смешением 0,92 г смолы с анизолом на стадии /2/, за исключением того, что удаляли конечную Boc-группу, и смолу ацетилировали уксусным ангидридом в хлористом метилене.

Синтез Sta⁸-Des-Met⁹-литорина
Остаток статина, AHPPA или АСНРА может быть введен вместо двух любых аминокислот пептида, где пептид содержит только пептидные связи. Например, sta⁸-Des-Met⁹-литорин получали по аналогичной методике, сначала присоединяя статин к смоле и затем переходя к добавлению Boc-His /бензилоксикарбонила/. Статин или Boc-статин может быть синтезирован по методу, описанному в работе (Rich и др. J. Organic Chem. 43, 3624, 1978 и Rich и др. J. Med. Chem. 23, 27, 1980), а AHPPA и ACHPA могут быть синтезированы согласно методу, представленному в работах (Hui и др. J. Med. Chem. 30, 1287, 1987; Schuda и др. J. Org, Chem. 53, 873, 1988 и Rich и др. J. Org, Chem. 53, 869 1988).

Твердофазный синтез пептида BIM-26120, pGIn-CIn-Trp-AIa-VaI-GIy-His-Sta-NH₂, проводили посредством использования методик, в которых альфа-трет-бутоксикарбонил-статин (полученный по методу, описанному в работе (Rich и др. J. Org. Chem. 43, 3624, 1978) сначала присоединяют к метилбензгидриламинополистирольной смоле. После ацетилирования получают промежуточный продукт: p-GIu-GIn-GIn-Trp - AIa-VaI-GIy-His /бензилоксикарбонил/-Sta-метилбензгидриламинную группу. Более детально эта методика синтеза выглядит следующим образом.

1. Иммонобилизация альфа-трет-бутоксикарбонилстатина на метилбензгидриламинной смоле.

Метилбензгидриламинную смолу (производства фирмы "Vega Biochemicals, Inc. ") 1,0 г, 0,73 моль) в хлоридной форме перемещают в реактор пептидного синтезатора типа "Vega 25OC Coupier". Синтезатор был запрограммирован на выполнение следующих реакций: (a) метиленхлорид, (b) 10% триэтиламин в хлороформе, (c) метиленхлорид и (d) диметилформамид.

Нейтрализованную смолу смешивают на протяжении 18 ч с предварительно полученным активным эфиром, изготовленным из альфа - трет-бутоксикарбонилстатина (1,46 моль), диизопропилкарбодиимида (2 мoль) и гидроксибензотриазолгидрата (1,46 моль) в диметилформамиде при 0^oC в течение 1 ч. Полученную в результате аминокислотную смолу промывают на синтезаторе диметилформамидом и затем хлористым метиленом. В этот момент смесь, содержащая смолу, как было обнаружено с помощью нингидринового теста по Кайзеру (5 мин), характеризуется 84% уровнем иммобилизации статина на смоле.

Ацетилирование проводили смешением аминокислотной смолы с N-ацетилимидазолом (5 моль) в течение 15 в хлористом метилене. Как следует из данных нингидринового теста по Кайзеру (5 мин), уровень прорегировавших свободных аминогрупп смолы составляет 94 -99%
2. Присоединение остальных аминокислот
Пептидный синтезатор программируют на выполнение следующего реакционного цикла: (a) метиленхлорид, (b) 33% трифторуксусная кислота /TFA/ в метиленхлориде (2 раза по 5 ч 25 мин каждый), (c) метиленхлорид, (d) изопропиловый спирт, (e) 10% триэтиламин в хлороформе и (f) метиленхлорид.

Затем с помощью одного диизопропилкарбодиимида (4 моль) или диизопропилкарбодиимида (4 моль) плюс гидроксибензотриазолгидрат (1,47 или 0,73 моль) последовательно иммобилизуют следующие аминокислоты (2,19 моль), и получающуюся в результате пептидную смолу промывают на синтезаторе диметилформамидом и затем хлористым метиленом, а затем проводят по циклу через стадии промывки и деблокировки (a) (f) по описанной выше методике
Boc-His /бензилоксикарбонил/ (присоединенный в присутствии 2 эквивалентов гидроксибензотриазола); Boc-GIy; Boc-AIa и Boc-Trp (иммобилизованные через предварительно полученные гидроксибензотриазоловые активные эфиры, полученные по реакции с 1 эквивалентом гидроксибензотриазолгидрата при 0^oC в течение 1 ч); Boc-GIn и pGIu (также присоединенные через предварительно полученные активные эфиры гидроксибензотриазола по реакции с 1 эквивалентом гидроксибензотриазолгидрата при 0^oC в течение 1 ч). Окончательно полученную пептидную смолу затем промывают метанолом и сушат на воздухе.

Описанную выше пептидную смолу (1,60 г, 0,73 моль) смешивают с анизолом (2,5 мл), дитиотреитом (50 мг) и безводным фтористым водородом (30 мл) при 0^oC в течение 1 ч. Избыток фтористого водорода быстро испаряют в токе сухого азота, осаждают свободный пептид и промывают его диэтиловым эфиром. Неочищенный пептид растворяют в 100 мл 1 М уксусной кислоты, и раствор затем упаривают при пониженном давлении. Неочищенный пептид растворяют в минимальном объеме смеси: метанол/вода 1/1 и растирают в порошок с 10 объемами этилацетата.

Растертый пептид наносят на колонку (9,4 мм внутреннего диаметра х 50 см), наполненную системой: октадецилсилан-силикагель (типа "Whatman Partisil 10 ODS -2 M 9"). Пептид элюируют в линейном градиенте 20 80% системы: 0,1% трифторуксусная кислота/ацетонитрил 20/80 в 0,1%-ной трифторуксусной кислоте в воде. Фракции исследуют методом тонкослоевой хроматографии и аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии и объединяют, получая продукт с максимальной чистотой. Лиофильное высушивание раствора от воды дает 77 мг продукта в виде белого пушистого порошка.

По указанной выше методике могут быть получены другие соединения, включая D-Cpa¹, b -Ieu⁸, desMet⁹-литорин, которые могут быть проверены на эффективность в качестве агонистов и антагонистов по следующей программе испытаний.

В табл. 1 приведены данные масс-спектрометрии полученных соединений.

Стадия 1 Анализ стимулированного пептидом ЗТЗ поглощения [³H] тимидина
Культура клеток.

Запасные культуры клеток Swiss 3T3 выращивали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла /DMEM/ с добавлением 10% сыворотки телячьего эмбриона в увлажненной атмосфере, состоящей из 10% CO₂/90% воздуха, при 37^oC. Для использования в экспериментах клетки засевали в кюветы с 24 изолированными ячейками и использовали через 4 дн после последней смены среды. Клетки задерживали в фазе G1/G0 клеточного цикла с помощью перехода к не содержащей сыворотки DMEM за 24 ч до анализа поглощения тимидина.

Анализ синтеза ДНК.

Клетки дважды промывали одномиллилитровыми аликвотами DMEM (-сыворотка), затем инкубировали с DMEM (-сыворотка), 0,5 мкМ [метил-³H]тимидина (20 Кюри/моль, New Englend Nuclear), бомбезином (3 нМ) и первоначально четырьмя концентрациями тестируемых соединений (1, 10, 100, 1000 нM) в конечном объеме 1,0 мл. После 28 ч при 37^oC включение [метил-³H] тимидина в нерастворимые в кислоте пулы определяли следующим образом. Клетки дважды промывали ледяным 0,9% -ным раствором NaCl (аликвоты по 1 мл), и растворимую в кислоте радиоактивность удаляли 30-минутным инкубированием при 4^oC с 5%-ной трихлоруксусной кислотой (TXYK). Затем культуры один раз промывали 95%-ным этанолом (1 мл) и солюбилизировали 30-минутным инкубированием с 0,1N NaOH (1 мл). Солюбилизованный материал переносили в виалы, содержащие 10 мл ScintA /Packard/, и определяли радиоактивность жидкостной сцинтилляционной спектрометрией.

Стадия 2 Мелкоклеточная карцинома (МККЛ) Анализ стимулированного бомбезином поглощения [³H] тимидина
Культура клеток.

Культуры клеточной линии мелко-клеточной карциномы человека /NCl-H69/ (получен от American Type Culture Association) выдерживают в среде RPMI 1640 с добавлением 10% сыворотки телячьего эмбриона в атмосфере 10% CO₂/90% воздуха при 37^oC. За 24 ч до анализа клетки промывают не содержащей сыворотки средой и засевают в кюветы с 24 ячейками.

Анализ синтеза ДНК. К культурам добавляли бомбезин (1 нМ), 0,5 мкМ [метил-³H] тимидина (20 Кюри/моль, New England Nuclear) и тестируемые соединения в четырех разных концентрациях (1, 10, 100 и 1000 нМ) до достижения конечного объема 0,5 мл. После инкубирования в течение 28 ч при 37^oC клетки собирали на фильтрах GF/B из стекловолокна и осаждали ДНК ледяной TXYK. Включение [³H] тимидина в нерастворимые в кислоте фракции ДНК определяли жидкостной сцинтилляционной спектрометрией.

Стадия 3 Индуцированный пептидом панкреатит
Для этих экспериментов использовали самцов крыс Спрэга-Доули (250 г). Тестируемое соединение или 0,9% раствор NaCl вводили подкожно за 15 мин до инъекции бомбезина. Инъекции бомбезина осуществляли подкожно в дозе 10 мкг/кг; пробы крови брали через 1 ч 30 мин, 3 ч и 6 ч. Концентрацию амилазы в плазме определяли тестом Pantzak Amylase.

Стадия 4 Ингибирование связывания [¹²⁵I] выделяющего гастрин пептида /ВГП/ с бомбезиновыми рецепторами in vitro
Мембраны различных тканей (крысиный мозг, крысиная поджелудочная железа, крысиный аденогипофиз, МККЛ, клетки ЗТЗ) приготовляли, гомогенизируя клетки в 50 мМ ТрисHCl, содержащем 0,1%-ого бычьего сывороточного альбумина и 0,1 мг/мл бацитрацина, с последующим двукратным центрифугированием (39000g, 15 мин, 4^oC) с промежуточным ресуспендированием в свежем буфере.

Для анализа аликвоты (0,8 мл) инкубировали с 0,5 нМ [¹²⁵I] ВГП (2000 Кюри/моль, Amersham Corp. ) и тестируемыми веществами в различных концентрациях в конечном объеме 0,5 мл. После 30-мин инкубирования при 4^oC для уменьшения степени неспецифического связывания реакцию связывания прекращали быстрым фильтрованием через фильтры Whatman GF/C, которые были предварительно пропитаны в 0,3%-ном водном растворе полиэтиленимина. Фильтры и трубки трижды промывали 4-миллилитровыми аликвотами холодного (температура льда) буфера, и определяли захваченную фильтрами радиоактивность методом гамма-спектрометрии. Специфическое связывание определяли как общее количество связанного [¹²⁵I] ВГП минус количество, связанное в присутствии 1000 нМ бомбезина.

Стадия 5 Ингибирование выделение гастрина
Желудки анестезированных крыс заполняли физиологическим раствором, который собирали за 15 мин промежутки времени с помощью пилорической каннюляции, в то время как тестируемый пептид вливали через бедренную вену в периоды между 0 и 150 мин.

Стадия 6 Противоопухолевая активность in vivo
Клетки NCl-H69 мелкоклеточной карциномы легких трансплантировали из культуры in vitro, имплантируя каждому животному в правый бок эквивалент 5 сливных 75-миллилитровых кювет для тканевых культур. In vitro клетки NCl-H69 растут в виде суспензии клеточных агрегатов. Поэтому не делалось никаких попыток осуществить дисагрегацию клеточных агломератов физическими или химическими средствами. Размер опухоли вычисляли как среднее двух диаметров, т. е. (длина + ширина/2) мм.

Результаты испытаний тестируемых пептидов
Ряд аналогов бомбезина или ВГП, каждый из которых содержит непептидную связь или остаток статина, AHPPA или ACHRA, может быть синтезирован и испытан с помощью одного или нескольких вышеописанных анализов /Стадии 1 6/; результаты тестов стадий 1 и 2 приведены в табл. 2.

В табл. 2 приведены формулы для непептидных аналогов и результаты in vitro ингибирования связывания [¹²⁵I]ВГП с бомбезоновыми рецепторами фибробластов ЗТЗ и стимулированного бомбезином поглощения [³H] тимидина культивированными клетками ЗТЗ. (Данные для связывания ВГП с рецепторами ЗТЗ и поглощения тимидина выражены в IC50 /нМ/).

В табл. 2 приведены также результаты для содержащих непептидную связь аналогов еще одного природного пептида, нейтромедина C, в котором семь аминокислот C-конца аналогичны таковым в бомбезине и в ВГП. В табл. 2 "литорин" обозначает состоящий из 9 остатков пептидный аналог или его производное, а "нейромедин C" обозначает состоящий из 10 остатков аналог или его производное.

В табл. 2 положение непептидной связи обозначается положением символа j [CH₂NH] т.е. j[CH₂NH] всегда расположен перед аминокислотой, которая в этом пептиде связана с аминокислотой, находящейся со стороны N-конца, непептидной связью. Там, где в "структуре" аминокислота не указана, непептидная связь соединяет два пептида, представленные номерами, которые даны как постскрипты.

В табл. 2 можно видеть, что в аналогах литорина предпочтительным месторождением непептидной связи является положение A⁸-A⁹; двумя из наиболее активных аналогов (как свидетельствуют низкие величины IC50 для ингибирования рецепторного связывания ВГП) являются BIM-26100 /Phe⁸j[CH₂NH]Leu⁹/ и BIM-26101 /Leu⁸ j [CH ₂ NH]Leu⁹/.

Кроме того, как показано в табл. 2, BIM 26113 /D-Phe¹, Leu⁸ j [CH₂NN] Leu ⁹ и BIM-26114 /D-Nal¹, Leu⁸ j [CH₂ NH]Leu⁹/ проявляют активность в испытаниях с рецепторным связыванием ЗТЗ-ВГП и поглощением тимидина.

Наиболее примечательным является то, что BIM-26136 /D-Nal¹, Leu⁸ j [CH₂NH] Phe₉/, содержащий и на C-конце, и на N-конце ароматические остатки, способные вступать в гидрофобное взаимодействие, является наиболее сильнодействующим аналогом. Наконец, когда статин или b лейцин замещает остатки A⁸ и A⁹ литорина, получающиеся в результате аналоги BIM-26120 и BIM-26182 также являются сильными антагонистами.

Табл. 2 показывает также, что аналоги нейромедина, содержащие непептидную связь между остатками A⁹ A¹⁰, например, BIM-26092, 26095, 26106, также являются антагонистами, о чем свидетельствуют результаты анализов рецепторного связывания ЗТЗ-ВГП и поглощения тимилина.

Табл. 2 содержит также отрицательные результаты для аналогов нейромедина C, например для BIM-26108.

Таким образом, содержащиеся в данном описании указания относительно расположения непептидной связи следует использовать в сочетании с вышеописанными аналитическими процедурами для того, чтобы выбрать эффективные антагонисты.

Было показано, что бомбезин и аналоги бомбезина ингибируют действие интерлейкина-2 /TL-2/ (Финк и др. Klin. Wochenschar. 66, 1988. Приложение 13, 273). Поскольку IL-2 вызывает пролиферацию T-лимфоцитов, возможно, что антагонисты литорина могут предотвратить ингибиторное действие бомбезина или его аналогов в отношении IL-2. Стимулированные IL-2 лимфоциты способны эффективно разрушать клетки мелкоклеточной карциномы легких in vitro. Помимо того, что антагонисты бомбезина оказывают непосредственное антипролиферативное воздействие на опухолевые ткани, они могут также благоприятствовать пролиферации лимфоцитов, обладающих литической активностью по отношению к мелкоклеточной карциноме легких.

Эти наблюдения побудили оценить влияние BIM-26100 на рост in vivo клеточной линии МККЛ, описанной в стадии 6. Двадцати атимических, лишенным волосяного покрова самкам в возрасте от 5 до 6 нед в нулевой день имплантировали клетки CI-H69 МККЛ человека; затем животных индивидуально идентифицировали и статистически распределили по нижеследующим контрольной и тестовым группам (табл. 5).

Рост ксенотрансплантантов NCl-H69 и активность антагониста бомбезина BIM-26100
/pGlu-Gln-Trp-AIa-VaI-GIy-His-Phe j [CH₂NH] Leu-NH₂/ в ингибировании роста опухоли проиллюстрированы кривыми роста опухоли (фиг.1) и также относительными размерами опухоли в таблице 3. Введение В М-26100 в форме подкожного вливания вокруг опухоли приводит к существенному ингибированию роста опухоли. Эффективность противоопухолевой активности BIM-26100 очевидна, если принять во внимание большое количество инокулята опухолевых клеток NCI-H69 (а именно, эквивалент пяти сливных 75-миллилитровых кювет для тканевых культур для каждого животного) и агломентированное состояние клеток. В сливных кюветах агломераты NCI-H69 видны невооруженным глазом и вместе напоминают метастатическую опухолевую колонию. Каждому животному было имплантировано множество таких опухолевых колоний. Доза BIM-26100 была выбрана произвольно, исходя из доступности соединения, и не является оптимальной. Могут быть использованы большие дозы BIM-26100, о чем свидетельствует увеличение веса тела (минус вес опухоли) в ходе лечения (табл. 4). Это позволяет считать, что BIM-26100 не обладает местной или системной токсичностью и может использоваться в терапии как противосторонний фактор, обладающий противоопухолевой активностью.

Фиг. 3 иллюстрирует влияние антагониста бомбезина
D-p-Cl-Rhe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-Hi-Ley j [CH₂NH]Phe-NH₂
на стимулированную бомбезином секрецию амилазы у крыс. Результаты свидетельствуют о том, что этот аналог является сильным антагонистом; 5 нM аналога могут ингибировать секрецию амилазы, стимулированную 0,5 нМ бомбезина, в течение 150 мин после введения болюса.

Использование. Пептиды согласно изобретению можно вводить млекопитающим, особенно человеку, одним из традиционных способов (например, орально, парэнтерально, трансдермально или через слизистую оболочку) с помощью систем для пролонгированного выделения, используя биосовместимый биоразлагаемый полимер, или с помощью систем локального выделения (например, в случае противоракового бомбезина для легких), используя мицеллы, гели и липосомы.

Антагонисты бомбезина согласно изобретению можно использовать для лечения любых форм рака, при которых родственные бомбезину соединения действуют как аутокринные или паракринные митотические агенты, особенно для лечения мелкоклеточной карциномы легких. Эти пептиды можно также использовать для ингибирования секреции гастровой кислоты и лечения нарушений перистальтики желудочно-кишечного тракта, симптоматического ослабления и/или лечения экзокринной панкреатической аденокарциномы, и восстановления аппетита у кахексических больных. Пептиды можно вводить человеку в дозах от 0,5 до 5 мг/кг/день. Для некоторых видов рака, например, для мелкоклеточной карциномы легких, предпочтительная дозировка составляет для лечебной терапии 250 мг/ день на пациента.

Использование: в медицине. Сущность изобретения: терапевтические пептиды общей формулы 1: R₁ R₂ A⁰-A¹-Trp-A⁴-A⁵-A⁶ -A⁷-W, где A⁰ = GIy, D Ala, D Phe, D-βNal или отсутствует; A¹=p Glu, Asn, D Ala, D Phe, D Leu, D Irp, D-p-Nal или D-p-галоид Phe или отсутствует; A² = p Glu, Gln, Leu, His; A⁴ = AIa, A⁵ = Val, Phe, Thr; A⁶ = Sar, Gly, D Ala; A⁷ = His; W = фрагмент; NНСНZ, R₃ CO V или NHCHZ, R₄ CHZ₂ COV или NR₁₂ R₁₃ или фармацевтически приемлемые соли, обладающие бомбезиновой активностью. 18 з.п. ф-лы, 3 ил. 5 табл.

1. Терапевтические пептиды общей формулы I

где A₀ Gly, D Ala; D Phe, D β- Nal, D p X Phe, (где X галоид или OH) или отсутствует;
A₁ pGlu, Asn, D Ala, D Phe, D Leu, D Trp, D p X - Phe (где X галоид или OH), D β- Nal или отсутствует;
A₂ p Glu, Gln, Leu, His,
A₄ Ala;
A₅ Val, Phe, Thr,
A₆ Sar, Gly, D Ala,
A₇ His,
при условии, что когда A₀ присутствует, A₁ не может представлять собой p Glu; когда A₀ или A₁ присутствуют, A₂ не может представлять собой p Glu, и когда A₀ отсутствует, а A₁ представляют собой p Glu, R₁ должен представлять собой H, а R₂ должен представлять собой ту часть Glu, которая образует в p Glu иминное ядро и далее, при условии, что W может представлять собой любой фрагмент из следующих:

где R₃ -CHR_1 4 (CH₂)_n-, где R_1 4 либо H, либо OH и n 0 или 1, или R₃ отсутствует;
Z₁ изопропил, циклогексилметил или идентифицирующая группа любой из аминокислот: Leu, Phe, β -Nal;
V либо OR₄, либо группа

где R₄ низший алкил;
R₅ и R₆ каждый независимо любой радикал, выбранный из водорода, низшего алкила, фенил-низшего алкила или

где R_1 5 водород или низший алкил, при условии, что если один R₅ или R₆ NHR_1 5, другой водород;

где R₄ CH₂NH₂;
каждая из групп Z₁ и Z₂ независимо идентифицирующая группа из любой из нижеследующих аминокислот: Leu, β- Nal, Phe, p X Phe (где X галоид), Met, Pro;
V OCH₃, NH₂ или OH;

где R₁₂ и R₁₃ каждый независимо водород или низший алкил при условии, что любой асимметричный атом углерода в I, II может представлять собой R, S или рацемическую смесь; при условии, что каждая из групп R₁ и R₂ независимо H, низший алкил, фенил(низший)алкил, или СОЕ (где Е - низший алкил, фенил(низший)алкил), R₁ и R₂ связаны с N-концевой аминокислотой указанного пептида и, кроме того, при условии, что, когда одна из групп представляет собой СОЕ, другая должна представлять собой водород,
или их фармацевтически приемлемые соли. 2. Терапевтический пептид по п. 1, где R₃ -CH₂ - CH₂-, -CH₂-, -CH(OH)CH₂-. 3. Терапевтический пептид по п. 1, где A₀ отсутствует, A₁ - D Phe, D β- Nal, D Cpa, A₂ Gln, His; A₄ Ala; A₅ Val; A₆ Sar, Gly, D Ala; A₇ His; W фрагмент формулы I

где R₃ CH₂, CH(OH)CH₂ или отсутствует; Z₁ - идентифицирующая группа из любой из аминокислот Leu или β-- Nal;
где R₅ водород или низший алкил. 4. Терапевтический пептид по п. 3, где V NH₂. 5. Терапевтический пептид по п. 1, соответствующий формуле
p Glu Gln Trp Ala Val Gly His statine NH₂. 6. Терапевтический пептид по п. 1, соответствующий формуле I, где A₀ отсутствует, A₁ D Phe, D β- Nal, D Cpa; A₂ - Gln, His; A₄ Ala; A₅ Val; A₆ Sar, Gly, D Ala; A₇ His, W фрагмент формулы II

Z₁ циклогексиметил или идентифицирующая группа Leu или Phe; Z₂ идентифицирующая группа Met, Leu или Phe. 7. Терапевтический пептид по п. 6, где A₁ D β- Nal, а каждая из групп Z₁ и Z₂ независимо друг от друга представляет собой идентифицирующую группу Leu или Phe. 8. Терапевтический пептид по п. 6, соответствующий формуле

9. Терапевтический пептид по п. 6, соответствующий формуле

10. Терапевтический пептид по п. 6, где атом углерода, связанный с Z₂, имеет R-конфигурацию. 11. Терапевтический пептид по п. 10, соответствующий формуле

12. Терапевтический пептид по п. 6, где V OCH₃. 13. Терапевтический пептид по п. 12, соответствующий формуле

14. Терапевтический пептид по п. 1, где A₀ отсутствует, A₁ D Phe, D-β-Nal, D Cpa; A₂ Gln, His; A₄ Ala; A₅ - Val; A₆ Sar, Gly или D Ala, A₇ His; W фрагмент формулы III
15. Терапевтический пептид по п. 14, соответствующий формуле
D Phe Gln Trp Ala Val Gly His Leu NHC₂H₅. 16. Терапевтический пептид по п. 14, соответствующий формуле
D Phe Gln Trp Ala Val Gly His Leu NH₂. 17. Терапевтический пептид по п. 1, соответствующий формуле

18. Терапевтический пептид по п. 6, соответствующий формуле

19. Терапевтический пептид по п. 3, соответствующий формуле

Приоритет по признакам:
02.03.89 при R₂ -CH₂ CH₂-, -CH₂-, -CH(OH)CH₂-;
07.07.89 при R₂ -CH₂ CH₂-, -CH₂-, -CH(OH)CH₂- или отсутствует;
21.08.89 при R₃ -CHR_1 4(CH₂)_n, где R_1 4 H, OH, n 0 или 1, или возможно отсутствует.