УСТОЙЧИВАЯ ЖИДКАЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ Российский патент 2022 года по МПК A61K9/08 A61K39/395 A61K47/02 A61K47/18 A61K47/26 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к устойчивому жидкому препарату антитела, причем антитело включено в двойную буферную систему, включающую «фосфатно-аминокислотный буфер».

Уровень техники

Достижения в биотехнологии проложили путь для разработки большого числа антител для терапевтического применения. Однако для любых терапевтических средств на основе антител устойчивость препарата антитела является одним из наиболее важных критериев для уверенности в его безопасности, а также в его эффективном введении.

Жидкие препараты белков/антител как правило предпочтительны из-за удобства их введения и соответствия при введении со многими коммерчески доступными устройствами. Однако антитела, будучи крупнее и более сложными по сравнению с традиционными «низкомолекулярными» лекарственными средствами, также более неустойчивы в растворе. Антитела более чувствительны к рН, температуре и окислению и могут претерпевать различные ковалентные и нековалентные модификации и/или разрушения в растворе. В частности, разрушение антитела происходит быстрее в жидких препаратах, что ведет к физической и химической нестабильности молекулы. Примеры химической нестабильности включают деамидирование, гидролиз, окисление или изменение дисульфидной связи, в то время как физическая нестабильность может являться результатом денатурации, агрегации, адсорбции или осаждения.

Кроме того, жидкие препараты с высокими концентрациями антитела/белка показывают высокую вязкость и повышенную агрегацию в растворе, что влияет на устойчивость и эффективность молекулы. Таким образом, антитела в жидкости/растворе выставляют присущие им вопросы по включению в препараты для терапевтических применений.

Цель настоящего изобретения направлена на такие вопросы при разработке устойчивых препаратов антител.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к устойчивому жидкому препарату антител, причем препарат включает двойную буферную систему, включающую в качестве буфера фосфат и аминокислоту.

Компоненты. Аминокислотный компонент в двойной буферной системе является противоионом к фосфатному компоненту. Указанная «фосфатно-аминокислотная» двойная буферная система создает возможность стабилизации антитела в интервале концентраций от примерно 10 мг/мл до примерно 200 мг/мл. В частности, изобретение относится к устойчивому жидкому препарату в фосфато-аминокислотном буфере, включающему сорбит, поверхностно-активное вещество и, необязательно, аргинин.

Конкретно, указанный выше препарат по изобретению лишен какого-либо (каких-либо) известного(ых) антиоксиданта(ов). Иными словами, состав препарата по изобретению защищает антитела (например, тоцилизумаб) от окисления даже без использования в композиции какого-либо (каких-либо) известного(ых) антиоксиданта(ов).

Кроме того, настоящее изобретение относится к устойчивому жидкому препарату антител с низкой вязкостью, причем препарат включает «фосфатно-аминокислотную» буферную систему, и причем вязкость препарата составляет менее 10 сП и предпочтительно менее 5 сП.

Кроме того, антитело в препарате, включенное в «фосфатно-аминокислотную» буферную систему, устойчиво в таких условиях хранения, как 2-8°С в течение по меньшей мере 6 месяцев или при 25°С в течение по меньшей мере 6 месяцев или при 40°С в течение по меньшей мере 2 недель или при 40°С в течение по меньшей мере 4 недель.

Содержание агрегатов в композиции антитела, полученной в «фосфатно-аминокислотной» буферной системе, составляет менее 5%, и содержание мономеров составляет по меньшей мере 95% в указанных выше условиях хранения.

Краткое описание чертежей

Фигура I иллюстрирует эксклюзионную хроматографию (данные SEC), влияние различных буферов на содержание HMW и мономера в препаратах тоцилизумаба (230 мг/мл), полученных согласно примеру 1. Фигура I(а) представляет содержание HMW, фигура I(b) представляет содержание мономера.

Фигура II иллюстрирует данные ионообменной хроматографии (IEX), влияние различных буферов на содержание главного пика препаратов тоцилизумаба (230 мг/мл), полученных согласно примеру 1.

Фигура III иллюстрирует данные дифференциальной сканирующей флуориметрии (DSF), влияние различных сахаров на устойчивость тоцилизумаба после исследований с замораживанием-оттаиванием.

Фигура IV иллюстрирует данные дифференциального светорассеяния (DLS), влияние различных эксципиентов на устойчивость препаратов тоцилизумаба высокой концентрации, полученных согласно примеру 6.

Подробное описание изобретения

Определения

Термин «антитело» относится к гликопротеину, включающему по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, соединенные между собой дисульфидными связями, или его антигенсвязывающей части. Термин «антитело», используемый в настоящем описании, охватывает целые антитела или любой антигенсвязывающий фрагмент (т.е. «антигенсвязывающую часть») или его слитый белок.

Термин «устойчивый» препарат относится к препарату, в котором антитело сохраняет свою физическую стабильность и/или химическую стабильность и/или биологическую активность после хранения.

Термин «антиоксидант», упоминаемый в настоящем описании, включает агент, который ингибирует окисление и, таким образом, используется для предотвращения разрушения препаратов путем окислительного процесса. Такие соединения включают, например и без ограничения, метионин, цистеин, карнозин, аскорбиновую кислоту, аскорбилпальмитат, лимонную кислоту, бутилированный гидроксианизол, бутилированный гидрокситолуол, гидрофосфорную кислоту, монотиоглицерин, пропилгаллат, аскорбат натрия, цитрат натрия, сульфид натрия, сульфит натрия, бисульфит натрия, формальдегид-сульфоксилат натрия, тиогликолевую кислоту, метабисульфит натрия, ЭДТК (эдетат), пентетат. Раскрытый препарат по изобретению лишен антиоксиданта, в частности, метионина.

Исследования устойчивости предоставляют данные о качестве антитела под влиянием различных факторов окружающей среды со временем. В ICH «Q1A: Stability Testing of New Drug Substances and Products» указывается, что данные по ускоренным исследованиям устойчивости можно использовать для оценки влияния кратковременных отклонений в большую или меньшую сторону от условий хранения по инструкции, которые могут иметь место при транспортировке антител.

Различные аналитические методы доступны для измерения физического и химического разрушения антитела в фармацевтических препаратах. Антитело «сохраняет свою физическую стабильность» в фармацевтическом препарате, если он не показывает признаков агрегации, осаждения и/или денатурации после визуальной проверки цвета и/или прозрачности или при измерениях методами УФ-светорассеяния или эксклюзионной хроматографии. Говорят, что антитело «сохраняет свою химическую стабильность» в фармацевтическом препарате, когда оно не показывает или показывает минимальное образование вариантов продукта, которые могут включать варианты, полученные в результате химической модификации антитела, представляющего интерес, такой как деаминирование, окисление и т.д.. Аналитические методы, такие ионообменная хроматография и гидрофобная ионная хроматография, можно использовать для изучения химических вариантов продукта.

Термин «мономер», используемый в настоящем описании, описывает антитела, состоящие из двух легких цепей и двух тяжелых цепей. Содержание мономера в композиции антитела типично анализируют эксклюзионной хроматографией (SEC). По принципу разделения SEC крупные молекулы или молекулы с высокой молекулярной массой (HMW) элюируются первыми, а затем элюируются более мелкие или с меньшей молекулярной массой. В типичном профиле SEC для композиции антитела агрегаты, которые могут включать димеры, полимеры и т.л., элюируются первыми, а затем мономер, и усеченные варианты антитела или деграданты могут элюироваться последними. В некоторых условиях пик агрегатов или пики деградантов могут не элюироваться как базовые отдельные пики, а как выступ или аномально широкие пики. Для того, чтобы сохранить соответствующую активность антитела, в частности, терапевтического антитела, желательно уменьшить образование агрегатов или продуктов разрушения и, следовательно, регулировать содержание мономера на намеченном уровне. Способность ингибировать образование агрегатов и содержание деградантов, измеренное в различные моменты времени во время исследований стабильности, может указывать на пригодность кандидата в препарат для антитела, представляющего интерес. Можно использовать для выполнения SEC колонку TSK-GEL G3000SWXL (7,8 мм × 30 см) от TOSCH на водной ВЭЖХ.

Термин «главный пик», используемый в настоящем описании, относится к пику, который элюируется в изобилии (главный пик) во время катионообменной хроматографии. Пик, который элюируется во время катионообменной хроматографии раньше, чем главный пик, с зарядом, который является кислотным относительно главного пика, называется пиком кислотного варианта. Пик, который элюируется во время катионообменной хроматографии позднее, чем главный пик, с зарядом, который является щелочным относительно главного пика, называется пиком щелочного варианта. Содержание главного пика можно определить ионообменной хроматографией (IEC). Существуют два доступных типа IEC, а именно, катионо- и анионообменная хроматография. Положительно заряженные молекулы связываются с анионообменными смолами, в то время как отрицательно заряженные молекулы связываются с катионообменными смолами. В типичном катионообменном хроматографическом профиле первыми элюируется кислотные варианты композиции антител, затем главный пик, и после этого последними будут элюироваться щелочные варианты. Кислотные варианты являются результатом таких модификаций антител, как деамидирование аспарагиновых остатков. Щелочные варианты являются результатом неполного удаления С-концевого(ых) лизинового(ых) остатка(ов), неполной циклизации N-концевого глутамина, изомеризации аспарагина и также, особенно, окисления метиониновых остатков, присутствующих в Fc-участке антитела [Chromatographic analysis of the acidic and basic species of recombinant monoclonal antibodies; mAbs; Page number 581; Volume 4; Issue 5]. Как правило, в антителе лизиновый остаток присутствует на С-конце как тяжелой, так и легкой цепи. Молекула антитела, содержащая лизин как в тяжелой, так и легкой цепи, относится к варианту K2, молекула антитела, содержащая лизиновый остаток в любой одной тяжелой или легкой цепи, относится к варианту K1, и молекула антитела, не имеющая такового, является молекулой K0. Фермент карбоксипептидаза B (фермент CP-B) действует на C-концевые лизиновые остатки, присутствующие в вариантах K2 и K1, и превращает их таким образом в молекулы K0. По обстоятельствам случая, можно выполнить анализ IEC для образцов, гидролизованных ферментом карбоксипептидазой B (CP-B). В типичном исследовании стабильности ожидается, что устойчивый препарат во время исследования ведет к снижению образования заряженных вариантов (кислотных и щелочных вариантов) и, следовательно, минимизирует любое уменьшение содержания главного пика.

Динамическое светорассеяние (DLS) измеряет флуктуации в интенсивности рассеяния, возникающие от частиц, претерпевающих беспорядочное броуновское движение, в зависимости от времени. Сведения о коэффициенте диффузии и размере частиц можно получить из анализа таких флуктуаций. Конкретнее, метод дает возможность измерить характеристики размера белков в жидкой среде. Величины коэффициента диффузии, полученные этим методом, прямо пропорциональны устойчивости молекулы в данном растворе.

Дифференциальная сканирующая флуориметрия (DSF) дает возможность быстро определить устойчивость белков с высокой производительностью и позволяет непосредственно сравнивать различные белки или один и тот же белок в различных условиях исследования. DSF контролирует термическое развертывание белков в присутствии флуоресцентного красителя и типично выполняется с использованием инструмента ПЦР в реальном времени. Флуоресцентные красители, которые можно использовать для DSF, являются высокофлуоресцентными в неполярной среде, такой как гидрофобные сайты на развернутых белках, в сравнении с водным раствором, где флуоресценция гасится. Интенсивность флуоресценции наносят на график как функцию температуры; это дает сигмоидальную кривую, которую может описать двухшаговым переходом.

Термин «процент спасения» относится к пропорции концентрации антитела, полученной в буфере в конечном препарате, относительно концентрации антитела в буфере для способа, который предшествует стадии получения препарата. Например, буфер для способа может представлять собой буфер для элюирования или буфер для фильтрации на последующей стадии способа, которая предшествует стадии получения препарата.

Препарат с высокой концентрацией антител относится к препарату, который дает возможность вводить субъекту более высокую дозу, используя небольшой объем, который равен или меньше, чем объем препарата для стандартного лечения.

Фармацевтически приемлемые эксципиенты относятся к добавкам или носителям, которые могут вносить вклад в устойчивость антитела в препарате. Эксципиенты могут охватывать стабилизаторы и модификаторы тоничности. Примеры стабилизаторов и модификаторов тоничности включают, но без ограничения, сахара, полиолы, соли, аминокислоты или поверхностно-активные вещества и их производные и комбинации.

Сахара и полиолы можно отнести к моносахаридам, дисахаридам и полисахаридам. Примеры сахаров включают, но без ограничения, сахарозу, трегалозу, глюкозу, декстрозу, раффинозу и другие. Кроме того, полиол относится к спирту, содержащему несколько гидроксильных групп. Примеры полиолов включают, но без ограничения, маннит, сорбит и другие.

Поверхностно-активное вещество относится к фармацевтически приемлемым эксципиентам, используемым для защиты препаратов белка от различных стрессовых условий, подобных перемешиванию, сдвигу, воздействию высокой температуры и т.д. Подходящие поверхностно-активные вещества включают, но без ограничения, эфиры жирных кислот и полиоксиэтиленсорбитана, такие как твин 20™ или твин 80™, сополимер полиоксиэтилен-полиоксипропилен (например, полоксамер, плюроник), додецилсульфат натрия (SDS) и т.п. или их комбинации.

Соли используют в качестве модификаторов тоничности, и примеры солей включают, но без ограничения, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид магния, гидрохлорид аргинина, тиоцианат натрия, тиоцианат аммония, сульфат аммония, хлорид аммония, хлорид кальция, хлорид цинка и/или ацетат натрия.

Одна или несколько аминокислот также могут являться частью препарата антитела как стабилизаторы и могут быть выбраны из основных аминокислот или гидрофобных аминокислот или их комбинации.

Некоторые специфические аспекты и воплощения изобретения полнее описаны в следующих далее примерах. Однако эти примеры не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения каким-либо образом.

Подробное описание воплощений

Настоящее изобретение относится к жидкому препарату антител, включающему двойную буферную систему, включающую фосфат и аминокислоты как компоненты буфера. «Фосфатно-аминокислотная буферная система» подходит для включения антитела в препарат в низкой, а также высокой концентрациях. Кроме того, буферная система дает возможность препарату быть менее вязким даже при высоких концентрациях антитела. Кроме того, раскрытый буфер является выгодным в смысле «более активного восстановления» антитела в отношении «способа получения препарата». Этот способ после очистки антитела включает сначала стадию «замены буфера», на которой буфер со следующей стадии способа заменяют на буфер, который поглощает антитело для включения в препарат. Но эта стадия «замены» часто сопровождается значительной потерей антитела. Однако, когда «следующий буфер» заменяют «фосфатно-аминокислотным» буфером по настоящему изобретению, такая потеря антитела существенно снижается.

Воплощение изобретения раскрывает устойчивый препарат антитела, причем препарат включает фосфатно-аминокислотную двойную буферную систему.

В описанном выше воплощении изобретения аминокислотный компонент в указанной буферной системе действует как противоион к фосфатному компоненту буфера.

В другом воплощении изобретения аминокислоту выбирают из группы, включающей основную аминокислоту и гидрофобную аминокислоту.

В другом воплощении основную аминокислоту выбирают из гистидина, лизина и аргинина; гидрофобная аминокислота может представлять собой глицин или аланин.

В одном воплощении изобретение раскрывает устойчивый жидкий препарат антитела, причем антитело включают в состав препарата в фосфатно-аминокислотную буферную систему, и причем концентрация антитела колеблется от примерно 10 мг/мл до примерно 200 мг/мл.

В одном воплощении изобретение раскрывает устойчивый жидкий препарат с высокой концентрацией антитела, причем антитело включают в препарат в фосфатно-аминокислотной буферной системе, и причем концентрация антитела составляет по меньшей мере 20 мг/мл или по меньшей мере 50 мг/мл или по меньшей мере 100 мг/мл или по меньшей мере 150 мг/мл.

В одном воплощении изобретение раскрывает устойчивый жидкий препарат антитела низкой вязкости, причем препарат включает фосфатно-аминокислотную буферную систему, и причем вязкость препарата составляет менее 10 сП, предпочтительно менее 5 сП. Препарат может включать фармацевтически приемлемые соли, причем концентрация солей и/или буферирующих агентов составляет менее 100 мМ, предпочтительно менее 50 нМ.

В любом из вышеуказанных воплощений антитело, включенное в препарат в фосфатно-аминокислотном буфере, остается устойчивым по меньшей мере в одном из условий хранения, таких как при 2-8°С в течение по меньшей мере 6 месяцев или при 25°С в течение по меньшей мере 6 месяцев или при 40°С в течение по меньшей мере 2 недель или при 40°С в течение по меньшей мере 4 недель.

В одном воплощении изобретение раскрывает устойчивый жидкий препарат антитела, причем препарат включает фосфатно-аминокислотную двойную буферную систему, причем препарат лишен антиоксиданта(ов).

В любом из вышеуказанных воплощений изобретения антитело является терапевтическим антителом.

В вышеуказанном воплощении терапевтическое антитело представляет собой анти-ILR6 антитело или анти-HER2 антитело.

В одном воплощении изобретение раскрывает устойчивый фармацевтический препарат анти-ILR6 антитела в фосфатно-аминокислотном буфере, включающий сорбит и поверхностно-активное вещество.

В вышеуказанном воплощении анти-ILR6 антитело лишено антиоксиданта(ов).

В одном воплощении изобретение раскрывает устойчивый фармацевтический препарат анти-ILR6 антитела в фосфатно-аминокислотном буфере, включающий сорбит и поверхностно-активное вещество, и причем препарат лишен антиоксиданта(ов).

В еще одном воплощении изобретение раскрывает устойчивый фармацевтический препарат анти-ILR6 антитела в фосфатно-аминокислотном буфере, включающий сорбит, поверхностно-активное вещество и аргинин, причем препарат лишен какого(их)-либо антиоксиданта(ов).

В любом из вышеуказанных воплощений указанный антиоксидант представляет собой метионин.

В одном воплощении изобретение раскрывает устойчивый жидкий препарат тоцилизумаба, причем препарат включает фосфатно-аминокислотную буферную систему. Указанный фосфатно-аминокислотный буфер представляет собой предпочтительно фосфатно-гистидиновый, фосфатно-глициновый или фосфатно-аспартатный буфер.

В одном воплощении изобретение раскрывает устойчивый жидкий препарат тоцилизумаба, причем антитело включено в состав в фосфатно-аминокислотной буферной системе, и причем концентрация антитела колеблется от примерно 20 мг/мл до примерно 180 мг/мл.

В вышеуказанных воплощениях тоцилизумаб, включенный в препарат в фосфатно-аминокислотном буфере, остается устойчивым по меньшей мере в одном из условий хранения, таких как при 2-8°С в течение по меньшей мере 6 месяцев или при 25°С в течение по меньшей мере 6 месяцев или при 40°С в течение по меньшей мере 2 недель или при 40°С в течение по меньшей мере 4 недель.

В другом воплощении изобретение раскрывает устойчивый жидкий препарат тоцилизумаба, включающий фосфатно-аминокислотную буферную систему, причем препарат сохраняет по меньшей мере 95% содержания мономера в композиции антитела по меньшей мере в одном из условий хранения, таких как при 2-8°С в течение по меньшей мере 6 месяцев или при 25°С в течение по меньшей мере 6 месяцев или при 40°С в течение по меньшей мере 2 недель или при 40°С в течение по меньшей мере 4 недель.

В еще одном воплощении изобретение раскрывает устойчивый жидкий препарат тоцилизумаба, включающий фосфатно-аминокислотную буферную систему, причем препарат содержит менее 5% агрегатов в композиции антитела по меньшей мере в одном из условий хранения, таких как при 2-8°С в течение по меньшей мере 6 месяцев или при 25°С в течение по меньшей мере 6 месяцев или при 40°С в течение по меньшей мере 2 недель или при 40°С в течение по меньшей мере 4 недель.

В другом воплощении изобретение раскрывает устойчивый жидкий препарат тоцилизумаба, включающий фосфатно-аминокислотную буферную систему, причем препарат сохраняет по меньшей мере примерно 50% тоцилизумаба в содержании главного пика в одном из условий хранения, таких как при 2-8°С в течение по меньшей мере 3 месяцев или при 25°С в течение по меньшей мере 3 месяцев или при 40°С в течение по меньшей мере 2 недель или при 40°С в течение по меньшей мере 4 недель.

В вышеуказанном воплощении изобретения устойчивый препарат тоцилизумаба в фосфатно-аминокислотном буфере включает менее 10% щелочных вариантов антитела в препарате в одном из условий хранения, таких как при 2-8°С в течение по меньшей мере 3 месяцев или при 25°С в течение по меньшей мере 3 месяцев или при 40°С в течение по меньшей мере 2 недель или при 40°С в течение по меньшей мере 4 недель. Щелочные варианты антитела являются результатом неполного удаления С-концевого(ых) лизинового(ых) остатка(ов), неполной циклизации N-концевого глутамина, изомеризации аспарагина и, также важно, окисления метиониновых остатков, присутствующих в Fc-участке антитела.

В одном воплощении изобретение раскрывает устойчивый жидкий препарат тоцилизумаба, включающий фосфатно-гистидиновый буфер, сорбит и поверхностно-активное вещество.

В одном воплощении изобретение раскрывает устойчивый жидкий препарат тоцилизумаба, включающий фосфатно-гистидиновый буфер, сорбит, поверхностно-активное вещество и аргинин, причем препарат лишен метионина.

В вышеуказанных воплощениях антитело устойчиво даже после нескольких циклов замораживания-оттаивания. Сорбит, присутствующий в препарате, защищает/стабилизирует антитело при стрессовых условиях замораживания-оттаивания.

В вышеуказанном воплощении концентрация тоцилизумаба, стабилизированного сорбитом в фосфатно-гистидиновом буфере, колеблется от примерно 20 мг/мл до примерно 200 мг/мл.

В одном воплощении изобретение раскрывает устойчивый жидкий препарат тоцилизумаба, причем препарат включает фосфатно-аминокислотную буферную систему.

Кроме того, в любом из вышеуказанных воплощений препарат может включать фармацевтически приемлемые эксципиенты, такие как сахара, полиолы, поверхностно-активные вещества, соли, аминокислоты и их комбинации и производные. Предпочтительно полиол представляет собой сорбит.

ПРИМЕРЫ

Тоцилизумаб, подходящий для хранения в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, получают стандартными способами, известными в уровне технике. Например, тоцилизумаб получают рекомбинантной экспрессией генов легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина в клетке-хозяине млекопитающего, такой как клетки яичников китайского хомячка. Далее экспрессированный тоцилизумаб собирают, и неочищенный продукт подвергают стандартным последующим стадиям способа, которые включают очистку, фильтрацию и, необязательно, стадии разбавления или концентрирования. Например, неочищенный продукт тоцилизумаба можно очистить с использованием стандартных хроматографических методов, таких как аффинная хроматография, ионообменная хроматография и их комбинации. Раствор очищенного тоцилизумаба можно дополнительно подвергнуть одной или нескольким стадиям фильтрации, и полученный раствор подвергают последующим исследованиям препарата.

Пример 1. Одинарный буфер против фосфатно-аминокислотного буфера

Тоцилизумабу (в концентрации 35 мг/мл), полученному на конечной стадии последующего процесса, заменяют буфер и концентрируют до 230 мг/мл в одинарных буферах, а также в двойном буфере, таком как фосфатно-аминокислотный буфер. Состав буферных композиций приводен в таблице 1. После концентрирования тоцилизумаба в различных буферах до 230 мг/мл образцы проверяют на высокомолекулярные (HMW) частицы и содержание мономера с использованием эксклюзионной хроматографии [результаты приведены на фиг. I, (a) и (b)]. Также проверяют содержание главного пика с использованием ионообменной хроматографии [результаты приведены на фигуре II].

Таблица 1. Композиции буферов, используемых в примере 1

Композиция буфера Конечный pH 20 мM фосфатный буфер 6,0 20 мM гистидиновый буфер 6,0 20 мM фосфатно-гистидиновый буфер 6,0

Пример 2. Препараты с высокой концентрацией тоцилизумаба (180 мг/мл) в двойной буферной системе на фосфатно-аминокислотной основе

Для того, чтобы получить устойчивый жидкий высококонцентрированный препарат тоцилизумаба, как часть эксперимента, получают различные комбинации двойных буферов на «фосфатно-аминокислотной основе» в концентрациях 20 мМ. Тоцилизумабу (в концентрации 30,02 мг/мл), полученному на конечной стадии последующего процесса, заменяют буфер на различные фосфатно-аминокислотные буферы (перечисленные в таблице 2) и концентрируют до 180 мг/мл в указанных двойных буферах. Композицию буфера для тоцилизумаба, замененного на гистидиновый буфер, сохраняют как контроль, так как одобренные и продаваемые препараты со 180 мг/мл тоцилизумаба Actemra® или RoActemra® являются препаратами в гистидиновом буфере. Кроме того, один из двойных буферов поддерживается как буфер на «нефосфатно-аминокислотной» основе, который служит в качестве отрицательного контроля.

Вычисляют процент спасения тоцилизумаба в различных буферах (после замены буфера и концентрирования), и детали этого приводятся в таблице 2.

Таблица 2. Процент восстановления тоцилизумаба в препаратах со 180 мг/мл, полученных согласно примеру 2

Тоцилизумаб (180 мг/мл) в композиции буфера (20 мМ) % восстановления Гистидиновый буфер (контроль) 89,5 Фосфатно-гистидиновый 95,7 Фосфатно-аспартатный 96,0 Фосфатно-сукцинатный 90,0 Сукцинат-глициновый 80,2

Вязкость всех препаратов с двойным буфером на «фосфатно-аминокислотной» основе измеряют и следят, чтобы она была ниже 5 сП.

Пример 3. Измерения растворимости тоцилизумаба с использованипм динамического светорассеяния (DLS)

Для того, чтобы понять картину растворимости тоцилизумаба в различных буферных основах, в образце тоцилизумаба (в концентрации 30,02 мг/мл) с последней стадии способа заменяют буфер на различные буферные композиции, перечисленные в таблице 3, и концентрируют до 140-180 мг/мл. Затем тоцилизумаб в высоких концентрациях серийно разводят до более низких концентраций. Затем образцы подвергают DLS для измерения коэффициента диффузии, который является показателем растворимости тоцилизумаба. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3. Результаты DLS препаратов тоцилизумаба (140-180 мг/мл) согласно примеру 3

Композиция буфера Концентрация тоцилизумаба (мг/мл) Коэффициент диффузии (см²/с) Гистидиновый буфер
(контроль) 179,5 3,00Е-07 59,8 5,50Е-07 29,9 5,80Е-07 15,0 5,40Е-07 Фосфатно-гистидиновый 142,0 3,50Е-07 47,3 4,90Е-07 23,7 4,60Е-07 11,8 4,60Е-07 Фосфатно-аспартатный 163,9 3,50Е-07 54,6 4,90Е-07 27,3 5,20Е-07 13,7 4,90Е-07 Фосфатно-сукцинатный 148,3 3,50Е-07 49,4 4,90Е-07 24,7 4,60Е-07 12,4 4,60Е-07 Фосфатно-глициновый 179,9 2,90Е-07 60,0 4,70Е-07 30,0 5,30Е-07 15,0 5,20Е-07 Сукцинатно-глициновый 183,2 2,60Е-07 61,1 4,00Е-07 30,5 4,90Е-07 15,3 4,70Е-07

Пример 4. Ускоренные исследования стабильности

В образце тоцилизумаба (в концентрации 30,02 мг/мл) с нижней стадии способа заменяют буфер на различные буферные композиции, перечисленные в таблице 3, и концентрируют до 180 мг/мл. Затем эти образцы подвергают ускоренным исследованиям стабильности, в которых препараты тоцилизумаба в соответствующих буферных средах хранят при 40°С в течение 2 недель. После хранения образцы анализируют на высокомолекулярные (HMW) частицы и содержание мономера [результаты приводятся в таблице 4] с использованием эксклюзионной хроматографии (SEC). И анализируют кислые частицы и содержание главного пика образцов [результаты приведены в таблице 5] с использованием ионообменной хроматографии (IEX).

Таблица 4. Данные SEC препаратов тоцилизумаба (180 мг/мл), полученных согласно примеру 4 и хранившихся при 40°С в течение 2 недель

Композиция буфера (20 мM) %HMW, 2 недели при 40°C % мономера, 2 недели при 40°C Гистидиновый буфер (контроль) 3,7 96,9 Фосфатно-гистидиновый 3,2 96,6 Фосфатно-аспартатный 4,1 95,6 Фосфатно-сукцинатный 4,1 95,6 Фосфатно-глициновый 4,6 95,1 Сукцинатно-глициновый 9,0 90,5

Таблица 5. Данные IEX препаратов тоцилизумаба (180 мг/мл), полученных согласно примеру 4 и хранившихся при 40°С в течение 2 недель

Композиция буфера (20 мM) % кислых частиц при 40°C, 2 недели % содержания главного пика при 40°C, 2 недели Гистидиновый буфер (контроль) 30,0 58 Фосфатно-гистидиновый 30,9 58 Фосфатно-аспартатный 30,0 58 Фосфатно-сукцинатный 31,4 60 Фосфатно-глициновый 30,0 60 Сукцинатно-глициновый 59,6 34

Пример 5. Выбор соответствующего сахара для стабилизации тоцилизумаба с использованием сканирующей флуориметрии

Для того, чтобы представлять природу термического разворачивания тоцилизумаба с использованием DSF, получают препараты тоцилизумаба (20 мг/мл) в среде гистидин-фосфатного буфера и добавляют различные сахара. После этого все образцы подвергают нескольким (по меньшей мере 3) циклам замораживания-оттаивания, замораживая образцы до -80°С с использованием морозильника и оттаивая при комнатной температуре. Образцы анализируют с использованием DSF. Результаты представлены на фигуре 3.

Пример 6. Препараты тоцилизумаба (180 мг/мл) в двойной буферной системе на фосфатно-аминокислотной основе, включающие различные эксципиенты

Как часть эксперимента, для оценки роли различных эксципиентов в стабилизации тоцилизумаба в высокой концентрации, тоцилизумаб, который получают на последней хроматографической стадии, концентрируют до 180 мг/мл в среде фосфатно-гистидинового буфера. После этого добавляют различные эксципиенты, такие как полиол (сорбит), аминокислоты (метионин/аргинин), модификатор тоничности (хлорид натрия) и поверхностно-активное вещество (полисорбат 80) в различных концентрациях и различных комбинациях. Состав препаратов приводятся в таблице 6. Одобренный FDA подкожный препарат тоцилизумаба, содержащий гистидиновый буфер, аргинин, метионин и полисорбат, используют в последующем эксперименте как эталон. После этого все образцы подвергают ускоренным исследованиям стабильности при 25°С в течение 6 месяцев и 40°С в течение 4 недель. Образцы периодически извлекают в различные моменты времени и анализируют на изменение рН [результаты приводятся в таблице 7], проверяют визуально [результаты приводятся в таблице 8], анализируют на содержание мономера, HMW и содержание LMW [результаты приводятся в таблице 9 а-с] с использованием анализа SEC. И также образцы испытывают в исследованиях стабильности в реальном времени при 2-8°С.

Кроме того, указанные образцы также проверяют на коллоидную стабильность с использованием DLS [результаты приведены на фигуре 4].

Таблица 6. Препараты тоцилизумаба (180 мг/мл), полученные согласно примеру 6

ID образца Комбинация буфера с различными эксципиентами Toc mab SC-эт. 20 мМ гистидинового буфера, 21 мг/мл аргинина, 4,5 мг/мл L-метионина, 0,2 мг/мл полисорбата 80 (pH 6,0) Toc-SC-1 20 мМ фосфатно-гистидинового буфера, 4,5 мг/мл метионина, 40 мг/мл сорбита, 10 мM NaCl, 0,2 мг/мл полисорбата 80 (pH 6,0) Toc-SC-2 20 мМ фосфатно-гистидинового буфера, 4,5 мг/мл метионина, 40 мг/мл сорбита, 0,2 мг/мл полисорбата 80 (pH 6,0) Toc-SC-3 20 мМ фосфатно-гистидинового буфера, 30 мг/мл сорбита, 15 мг/мл аргинина, 0,2 мг/мл полисорбата 80 (pH 6,0)

Таблица 7. Изменение рН препаратов тоцилизумаба, полученных согласно примеру 6, при 2-8°С

ID образца pH препарата в момент времени «0» Температура 2-8°C 25°C 40°C T1M T1M T2Н T4Н Toc mab SC-эт. 6,15 6,23 6,27 6,18 6,23 Toc-SC-1 6,19 6,18 6,24 6,24 6,25 Toc-SC-2 6,37 6,28 6,38 6,32 6,33 Toc-SC-3 6,19 6,05 6,08 6,10 6,11

T- показывает время, M- месяцы и Н- недели

Таблица 8. Визуальная проверка препаратов тоцилизумаба, полученных согласно примеру 6, при 2-8°С, 25°С и 40°С

ID образца Температура 2-8°C 25°C 40°C T1M T3M T6M T1M T3M T6M T2Н T4Н Toc mab SC-эт. Прозр. Прозр. Прозр. Прозр. Прозр. Прозр. Прозр. Прозр. Toc-SC-1 Прозр. Прозр. Прозр. Прозр. Прозр. Прозр. Прозр. Прозр. Toc-SC-2 Прозр. Прозр. Прозр. Прозр. Прозр. Прозр. Прозр. Прозр. Toc-SC-3 Прозр. Прозр. Прозр. Прозр. Прозр. Прозр. Прозр. Прозр.

T- показывает время, M- месяцы и Н- недели

Таблица 9а. Данные SEC препаратов тоцилизумаба, полученных согласно примеру 6, при 2-8°С

ID образца Момент времени % HMW % мономера % LMW Toc mab SC-эт. T0 1,30 98,70 0,00 T1M 1,48 98,50 0,02 T3M 1,45 98,52 0,03 T6M 1,58 98,35 0,07 Toc-SC-1 T0 1,41 98,59 0,00 T1M 1,51 98,47 0,03 T3M 1,60 98,37 0,03 T6M 1,70 98,24 0,06 Toc-SC-2 T0 1,41 98,59 0,00 T1M 1,58 98,40 0,02 T3M 1,63 98,33 0,03 T6M 1,68 98,25 0,07 Toc-SC-3 T0 1,38 98,62 0,00 T1M 1,53 98,45 0,02 T3M 1,56 98,41 0,03 T6M 1,64 98,31 0,06

T- показывает время, M- месяцы и Н- недели

Таблица 9b. Данные SEC препаратов тоцилизумаба, полученных согласно примеру 6, при 25°С

ID образца Момент времени % HMW % мономера % мономерного крыла кривой % LMW Toc mab SC-эт. T0 1,30 98,70 0,00 0,00 T1M 1,39 98,48 0,00 0,13 T3M 1,55 96,87 1,37 0,21 T6M 1,78 96,03 1,59 0,61 Toc-SC-1 T0 1,41 98,59 0,00 0,00 T1M 1,64 98,27 0,00 0,10 T3M 1,86 96,24 1,67 0,23 T6M 3,10 94,88 1,48 0,54 Toc-SC-2 T0 1,41 98,59 0,00 0,00 T1M 1,55 98,34 0,00 0,11 T3M 1,86 97,36 0,56 0,22 T6M 2,53 95,51 1,47 0,49 Toc-SC-3 T0 1,38 98,62 0,00 0,00 T1M 1,79 98,14 0,00 0,07 T3M 1,91 96,33 1,57 0,18 T6M 2,61 95,80 1,18 0,41

T- показывает время, M- месяцы и Н- недели

Таблица 9с. Данные SEC препаратов тоцилизумаба, полученных согласно примеру 6, при 40°С

ID образца Момент времени % HMW % мономера %мономерного плеча кривой % LMW Toc mab SC-эт. T0 1,30 98,70 0,00 0,00 T2Н 1,30 98,50 0,00 0,20 T4Н 1,78 96,39 1,35 0,49 Toc-SC-1 T0 1,41 98,59 0,00 0,00 T2Н 1,58 98,30 0,00 0,12 T4Н 2,30 96,12 1,18 0,40 Toc-SC-2 T0 1,41 98,59 0,00 0,00 T2Н 1,61 98,24 0,00 0,15 T4Н 2,37 96,00 1,22 0,41 Toc-SC-3 T0 1,38 98,62 0,00 0,00 T2Н 1,48 98,36 0,00 0,16 T4Н 2,07 96,35 1,17 0,41

T- показывает время, M- месяцы и Н- недели

Пример 7. Стабильные препараты тоцилизумаба (180 мг/мл), лишенные антиоксидантов

Вообще, окисление, конкретно окисление метиониновых остатков, генерирует щелочные варианты, элюируемые во время хроматографии IEX как щелочной пик (т.е., позднее главного пика). Из описанного выше эксперимента видно, что препараты тоцилизумаба, содержащие сорбит и аргинин, наиболее устойчивы по сравнению с препаратами, которые не содержат аргинин. Кроме того, различные концентрации сорбита и аргинина, содержащихся в препаратах тоцилизумаба без какого-либо антиоксиданта (метионина), оценивают на образование щелочных частиц. Состав препаратов приведен в таблице 10. Все образцы подвергают исследованиям стабильности при 2-8°С, 25°С и 40°С. Образцы периодически извлекают в различные моменты времени и анализируют на содержание кислых, щелочных частиц и главного пика с использованием хроматографии IEX [результаты приведены в таблице 11 а-с].

Таблица 10. Препараты тоцилизумаба (180 мг/мл), полученные согласно примеру 7

ID образца Комбинация буфера с различными эксципиентами Toc mab SC-эт. 20 мМ гистидинового буфера, 21 мг/мл аргинина, 4,5 мг/мл L-метионина, 0,2 мг/мл полисорбата 80 (pH 6,0) Toc-SC-3 20 мМ фосфатно-гистидинового буфера, 30 мг/мл сорбита, 15 мг/мл аргинина, 0,2 мг/мл полисорбата 80 (pH 6,0) Toc-SC-4 20 мМ фосфатно-гистидинового буфера, 15 мг/мл сорбита, 10 мг/мл аргинина, 0,2 мг/мл полисорбата 80 (pH 6,0) Toc-SC-5 20 мМ фосфатно-гистидинового буфера, 10 мг/мл сорбита, 15 мг/мл аргинина, 0,2 мг/мл полисорбата 80 (pH 6,0)

Таблица 11а. Данные IEX препаратов тоцилизумаба, полученных согласно примеру 7, при 2-8°С

ID образца Момент времени % кислых % главного пика % щелочных Toc mab SC-эт. T0 18,80 75,21 5,99 T1M 18,59 75,61 5,80 T3M 19,05 76,60 4,35 Toc-SC-3 T0 18,54 75,28 6,18 T1M 18,68 75,96 5,36 T3M 19,31 76,36 4,34 Toc-SC-4 T0 18,87 75,04 6,09 T1M 18,62 76,26 5,11 T3M 19,17 76,57 4,26 Toc-SC-5 T0 18,96 74,54 6,50 T1M 18,61 76,42 4,97 T3M 19,20 76,27 4,54

T- показывает время, M- месяцы и Н- недели

Таблица 11b. Данные IEX препаратов тоцилизумаба, полученных согласно примеру 7, при 25°С

ID образца Момент времени % кислых % главного пика % щелочных Toc mab SC-эт. T0 18,80 75,21 5,99 T1M 20,56 74,44 5,00 T3M 25,16 69,98 4,87 Toc-SC-3 T0 18,54 75,28 6,18 T1M 20,29 74,52 5,18 T3M 24,98 69,85 5,17 Toc-SC-4 T0 18,87 75,04 6,09 T1M 19,37 74,53 6,09 T3M 25,10 69,25 5,65 Toc-SC-5 T0 18,96 74,54 6,50 T1M 20,09 74,74 5,17 T3M 23,53 70,00 6,47

T- показывает время, M- месяцы и Н- недели

Таблица 11с. Данные IEX препаратов тоцилизумаба, полученных согласно примеру 7, при 40°С

ID образца Момент времени % кислотных % главного пика % щелочных Toc mab SC-эт. T0 18,80 75,21 5,99 T2Н 24,08 69,41 6,51 T4Н 31,54 62,51 5,95 Toc-SC-3 T0 18,54 75,28 6,18 T2Н 26,77 66,59 6,64 T4Н 33,76 59,64 6,61 Toc-SC-4 T0 18,87 75,04 6,09 T2Н 26,15 66,49 7,36 T4Н 33,84 59,98 6,18 Toc-SC-5 T0 18,96 74,54 6,50 T2Н 26,05 67,36 6,59 T4Н 33,29 60,27 6,44

T- показывает время, M- месяцы и Н- недели

Пример 8. Препараты тоцилизумаба (20 мг/мл) в двойной буферной системе на фосфатно-аминокислотной основе, включающие различные эксципиенты

Как часть экспериментального решения, для получения препаратов с низкой концентрацией тоцилизумаба (20 мг/мл) получают различные «фосфатно-аминокислотные» буферы в концентрации 20 мМ, к которым добавляют различные эксципиенты, такие как сахара/полиолы и поверхностно-активные вещества. Необязательно, в некоторые «фосфатно-аминокислотные» буферные комбинации добавляют соль, а именно, хлорид натрия. Буфер для тоцилизумаба (в концентрации 30,02 мг/мл), полученного на конечной нижней стадии способа, заменяют различными двойными буферными системами, включающими фосфатно-аминокислотные буферы и фармацевтически приемлемые эксципиенты [состав приводится в таблице 12]. Затем образцы разводят/доводят в соответствующей буферной среде, содержащей эксципиенты, до достижения концентрации тоцилизумаба 20 мг/мл. В качестве эталона используют тоцилизумаб, включенный в буферную композицию, содержащей фосфатный буфер, сахарозу и полисорбат 80, поскольку одобренный препарат с дозировкой 20 мг/мл Actemra® или Roactemra® представлен в этой буферной композиции.

Таблица 12. Тоцилизумаб (20 мг/мл), включенный в различные двойные буферные комбинации согласно примеру 8

ID образца Буферные комбинации с различными эксципиентами Toc-эт. 15 мМ фосфатный буфер, сахароза (50 мг/мл), полисорбат 80 (0,5 мг/мл), pH 6,5 Toc-IV1 20 мМ фосфатно-гистидиновый, сахароза (60 мг/мл), полисорбат 80 (0,5 мг/мл), pH 6,0 Toc-IV2 20 мМ фосфатно-сукцинатный, сорбит (50 мг/мл), полисорбат 80 (0,5 мг/мл), pH 6,0 Toc-IV3 20 мМ фосфатно-глициновый, сорбит (50 мг/мл), полисорбат 80 (0,5 мг/мл), pH 6,0 Toc-IV4 20 мМ фосфатно-глутаматный, сорбит (50 мг/мл), полисорбат 80 (0,5 мг/мл), pH 6,0 Toc-IV5 20 мМ фосфатно-гистидиновый, сорбит (10 мг/мл), 15 мМ NaCl, полисорбат 80 (0,5 мг/мл), pH 6,5 Toc-IV6 20 мМ фосфатно-гистидиновый, сорбит (30 мг/мл), полисорбат 80 (0,5 мг/мл), pH 6,0

Препараты тоцилизумаба, упомянутые в таблице 6, подвергают ускоренному испытанию на стабильность в условиях 40°С в течение 4 недель. Затем препараты анализируют на содержание высокомолекулярных частиц и мономера с использованием эксклюзионной хроматографии (SEC), а результаты представлены в таблице 13. Процентное содержание кислых частиц и главного пика анализируют с использованием ионообменной хроматографии (IEX), а результаты представлены в таблице 14.

Таблица 13. Данные SEC препаратов тоцилизумаба (20 мг/мл), полученных согласно примеру 8 и хранившихся при 40°С в течение 4 недель

ID образца % HMW при 40°C в 0 неделю Содержание мономера, % через 4 недели при 40°C 0 неделя 4^ая неделя Toc-эт. 1,3 2,1 97,4 Toc-IV1 1,3 1,7 97,7 Toc-IV2 0,9 3,3 92,1 Toc-IV3 1,3 1,9 97,6 Toc-IV4 1,1 2,0 97,5 Toc-IV5 0,2 0,3 98,0 Toc-IV6 0,1 0,2 97,9

Таблица 14. Данные IEX препаратов тоцилизумаба (20 мг/мл), полученных согласно примеру 8 и хранившихся при 40°С в течение 4 недель

ID образца Щелочные частицы, %, 4 недели при 40°C Содержание главного пика, % через 4 недели при 40°C Toc-Ref 8,0 52,9 Toc-IV1 10,9 44,8 Toc-IV2 7,1 33,8 Toc-IV3 8,4 52,3 Toc-IV4 9,3 52,0 Toc-IV5 4,8 59,9 Toc-IV6 5,8 56,2

Препараты тоцилизумаба, составленные согласно таблице 12, подвергают ускоренным исследованиям стабильности и проверяют визуально [результаты приведены в таблице 15].

Таблица 15. Результаты визуальной проверки препаратов тоцилизумаба (20 мг/мл), полученных согласно примеру 8

ID образца Визуальная проверка при 40°C 0 недель 2 недели 4 недели Toc-эт. Прозрачный Прозрачный Прозрачный Toc-IV1 Прозрачный Прозрачный Прозрачный Toc-IV2 Прозрачный Мутный Мутный Toc-IV3 Прозрачный Прозрачный Прозрачный Toc-IV4 Прозрачный Прозрачный Мутноватый Toc-IV5 Прозрачный Прозрачный Прозрачный Toc-IV6 Прозрачный Прозрачный Прозрачный

Пример 9. Другие антитела, включенные в среду фосфатно-аминокислотного двойного буфера

Трастузумаб (Tmab), 21 мг/мл, включают в одинарный, а также двойной буфер. Состав препарата приведен в таблице 16.

Таблица 16. Композиция трстузумаба в одинарном буфере и двойном буфере

ID образца Состав препарата Tmab-буфер His, pH 5,5 Трастузумаб, гистидиновый буфер, трегалоза, метионин и полисорбат Tmab-буфер His-Phos, pH 5,5 Трастузумаб, гистидин-фосфатный буфер, трегалоза, метионин и полисорбат

Описанные выше образцы подвергают ускоренным исследованиям стабильности, выдерживая указанные образцы при 37°С в течение 4 недель. Кроме того, образцы испытывают на изменение рН (результаты приведены в таблице 17).

Таблица 17. Измерения рН при 37°С препаратов T-mab, полученных согласно примеру 7

ID образца pH при 37°C 0 недель 2 недели 4 недели Tmab в буфере His 5,4 5,5 5,8 Tmab буфере His-Phos 5,5 5,6 5,6

Настоящее изобретение относится к стабильному жидкому препарату антитела тоцилизумаб в двойной буферной системе на фосфатно-аминокислотной основе. Антитело, включенное в двойную буферную систему на фосфатно-аминокислотной основе, приобретает оптимальную стабильность как при низких, так и при высоких концентрациях. Кроме того, препарат антитела, включенного в двойную буферную систему на фосфатно-аминокислотной основе, имеет низкую вязкость и подходит для терапевтического введения высоких концентраций антитела. 8 з.п. ф-лы, 4 ил., 21 табл., 9 пр.

1. Стабильный жидкий фармацевтический препарат тоцилизумаба, включающий тоцилизумаб и буфер, отличающийся тем, что указанный буфер представляет собой фосфатно-аминокислотную двойную буферную систему, причем этот буфер стабилизирует тоцилизумаб при концентрациях от около 10 мг/мл до около 200 мг/мл.

2. Препарат по п. 1, дополнительно включающий сорбитол, полисорбат и аргинин.

3. Препарат по п. 1 или 2, в котором антитело, включенное в фосфатно-аминокислотную буферную систему, остается стабильным в одном из таких условий хранения, как при 2-8°С в течение по меньшей мере 6 месяцев, или при 25°С в течение по меньшей мере 6 месяцев, или при 40°С в течение по меньшей мере 2 недель.

4. Препарат по п. 1, в котором аминокислота действует как противоион фосфатному компоненту буфера в препарате.

5. Препарат по любому из пп. 1 или 4, отличающийся тем, что аминокислота представляет собой гистидин, глицин или аспартат.

6. Препарат по п. 1, который имеет вязкость менее 10 сП.

7. Препарат по любому из пп. 1 или 2, который не содержит антиоксиданта.

8. Препарат по п. 7, где антиоксидантом является метионин.

9. Препарат по любому из пп. 1 или 2, причем препарат является стабильным и поддерживает содержание мономера по меньшей мере на 95% и/или содержит менее 5% агрегатов антитела после хранения при 2-8°С в течение по меньшей мере 6 месяцев, или при 25°С в течение по меньшей мере 6 месяцев, или при 40°С в течение по меньшей мере 2 недель.