СПОСОБ СТЕРИЛИЗАЦИИ АЦЕЛЛЮЛЯРНЫХ МАТРИКСОВ Российский патент 2022 года по МПК A61L2/16 G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно, к медицинским биотехнологиям и может быть использовано для стерилизации ацеллюлярных матриксов на основе нативного коллагена аллогенного и ксеногенного происхождения.

Нативный фибриллярный коллаген является одной из составляющих соединительной ткани, которая широко представлена практически во всех органах человека и животных. Ацеллюлярные матриксы, по сути, представляют собой нативный фибриллярный компонент соединительной ткани человека или животных, полученный в ходе процесса децеллюляризации - удаления клеток, их компонентов и белков.

В настоящее время получены ацеллюлярные матриксы из кожи, сердечных клапанов, печени, тонкой кишки, селезенки, легких, мочевого пузыря, почки, сухожилия и нервов.

В стерильном и упакованном виде ацеллюлярные матриксы представляют собой новым поколением имплантируемых материалов для решения целого ряда клинических задач реконструктивно-восстановительной и пластической хирургии, урологии, гинекологии, челюстно-лицевой хирургии и стоматологии, косметологии.

Для имплантируемых изделий медицинского назначения на основе коллагена различного происхождения в настоящее время широко применяют различные виды стерилизации: ионизирующим излучением (γ-лучи, пучки электронов); газовую (этиленоксидом); плазменную (пероксидом водорода). Ввиду того, что нативные молекулы коллагена являются по своей организации белками, то, тот или иной способ стерилизации изделий на их основе приобретает множество ограничений. Нередко, перед финишной стерилизацией изделия медицинского назначения на основе нативного коллагена подвергают консервации путем химической/ферментативной сшивки их молекул, либо лиофилизации. Это позволяет не только увеличить срок хранения упакованных изделий, но и придать им большую устойчивость к воздействию ферментов, тем самым продляя сроки биорезорбции после имплантации, имеющих значение для достижения должного клинического эффекта.

Известно, что коллаген, как и любые другие белки являются термолабильными, поэтому повышение температуры от 41°С и выше в ходе стерилизации паром под повышенным давлением сопряжено с процессами их тепловой денатурации за счет изменения молекулярной структуры. Схожие изменения претерпевают фибриллы коллагена при действии ионизирующего излучения, при этом их выраженность находится в прямой зависимости от дозы ионизирующего излучения. Стерилизация потоком быстрых электронов является в большей степени деструктивной, чем гамма-излучение. В целом, степень повреждения коллагеновых фибрилл зависит от проникающей способности излучения, времени экспозиции и поглощенной дозы, что следует учитывать при выборе режимов стерилизации. Если радиационной стерилизации предшествует процесс лиофилизации, то это приводит к значительному снижению радиационной устойчивости коллагеновых фибрилл (Шангина О.Р. Сохранность структуры биоматериалов в зависимости от вида консервации и стерилизации // Морфология. Научно-теоретический медицинский журнал. Санкт-Петербург. - №5, том 124, 2003 г. - С. 82).

Применение газового метода стерилизации этиленоксидом для изделий медицинского назначения сопряжено с последующим обязательным определением остаточного этиленоксида, этиленхлоргидрина этиленгликоля на их поверхности. Безопасные концентрации этого вещества могут быть различными в зависимости от длительности контакта изделия с организмом человека (ГОСТ ISO 10993-7-2016 Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 7. Остаточное содержание этиленоксида после стерилизации).

Сравнительно недавно, определенное распространение получили методы плазменной (низкотемпературной) стерилизации пероксидом водорода. Последний, является мощным окислителем, а следовательно, эффективным, однако в условиях плазменного стерилизатора его воздействие реализуется в диапазоне температур 50°С-60°С.

Наиболее обоснованными методами стерилизации медицинских изделий на основе нативного фибриллярного коллагена следует признать химические способы, где в качестве стерилизующих агентов могут выступать антисептические вещества с бактерицидной, вирулицидной, фунгицидной активностью (этиловый и изопропиловый спирты, хлоргексидин, сульфосалициловая кислота, глутаровый альдегид, формальдегид, сангвиритрин и т.д.), антибиотики и фунгициды, а также их комбинации: Методические указания по стерилизации ксенобиопротезов раствором глутарового альдегида. Минздрав СССР, №28-6/26 от 19.09.1986 г.; Бюллетень НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания», том 5, №11, 2004 г.; Матвейчук И.В., Сидельников Н.И., Литвинов Ю.В., Краснов В.В., Быков В.А., Розанов В.В. Способ получения костного имплантата на основе стерильного деминерализованного костного матрикса (патент RU №2679121, A61F 2/28, 06.02.2019); Костава В.Т., Анучина Н.М., Бакулева Н.П., Лютова И.Г., Кондратенко Ж.Е., Зеливянская М.В., Терещенкова И.А. Способ стерилизации и предимплантационного хранения биологических протезов из ксеногенной и аллогенной ткани для сердечно-сосудистой хирургии (патент RU №2291675, A61F 2/24, 20.01.2007); Кудрявцева Ю.А., Журавлева И.Ю., Леванова Р.Х., Барбараш Л.С., Гантимурова И.Л. Способ стерилизации и предимплантационного хранения биологических протезов для сердечно-сосудистой хирургии (патент RU №2357766, A61N 1/02, 10.06.2009). Для поддержания стерильности таких изделий широко применяют консерванты (парабены, глицерин и т.д.).

Независимо от выбора стерилизующего вещества суть всех способов сводится к погружению ацеллюлярных матриксов в стерилизующий раствор; экспозиции ацеллюлярных матриксов в нем в течение определенного времени при дополнительном воздействии одного или нескольких физических факторов (различные температуры; пониженное атмосферное давление); удалению стерилизующего раствора; подготовке к последующей консервации путем лиофилизации и/или криоконсервации (Савельев В.И. Способ стерилизации биологических тканей для трансплантации (патент RU, №2362589, A61L 2/16, 27.07.2009); Журавлева И.Ю. Биоцидная композиция для асептического хранения консервированного протезного материала из тканей животного происхождения (патент RU №2580621, A61L 2/16, 10.04.2016).

Недостатками известных способов являются применение сложных составов стерилизующих растворов; необходимость длительной экспозиции ацеллюлярных матриксов, в том числе с соблюдением определенного температурного режима; наличие токсичности стерилизующего вещества или образуемых им промежуточных и/или конечных химических веществ; риски недостаточной широты спектра активности некоторых стерилизующих веществ, в частности относительно спорообразующих микроорганизмов, некоторых вирусов и плесневых грибов; необходимость постоянного мониторинга за спектром антибактериальной, антифунгицидной активности стерилизующих веществ с периодической заменой при развитии устойчивости микроорганизмов и плесневых грибов к их действию; сложная трехмерная природная конфигурация ацеллюлярных матриксов, включающая многочисленные поры, в том числе содержащих воздух, что затрудняет контакт стерилизующего раствора со всей его поверхностью.

В последнее время для стерилизации ацеллюлярных матриксов на основе нативного коллагена и изделий из них применяется надуксусная кислота, которая, с одной стороны является низко стабильным соединением и обладает высокой кислотностью, с другой стороны разлагается с образованием нетоксичных продуктов, сначала - уксусной кислоты и пероксида водорода, а затем кислорода и воды. Надуксусная кислота является эффективной для уничтожения широкого спектра не только вегетативных форм грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, в том числе спорообразующих, а также всех известных вирусов и плесневых грибов.

В литературе описаны способы применения надуксусной кислоты для стерилизации ацеллюлярных матриксов, полученных из:

- сердечных клапанов (Luo J., Korossis S.A., Wilshaw S.-P., Jennings L.M., Fisher J., Ingham E. Development and characterization of acellular porcine pulmonary valve scaffolds for tissue engineering, Tissue engineering. Part. Accel. 2014; 20(21-22):2963-2974);

- печени (Sun D., Liu Y., Wang H., Deng F., Zhang Y., Zhao S., Ma X., Wu H., Sun G. Novel decellularized liver matrix-alginate hybrid gel beads for the 3D culture of hepatocellular carcinoma cells. Int. J. Biol. Macromol. 2018; 109:1154-1163);

- тонкой кишки (Gosztyla С, Ladd M.R., Werts A., Fulton W., Johnson В., Sodhi C, Hackam D.J. A comparison of sterilization techniques for production of decellularized intestine in mice, tissue engineering. Part C, Methods. 2020; 26(2):67-79);

- селезенки (Liu P., Tian В., Yang L., Zheng X., Zhang X., Li J., Liu X., Lv Y., Xiang J. Hemocompatibility improvement of decellularized spleen matrix for constructing transplantable bioartificial liver. Biomed. Mater. 2019; 14(2); - легких (Zvarova В., Uhl F.E., Uriarte J.J., Borg Z.D., Coffey A.L., Bonenfant N.R., Weiss D.J., Wagner D.E. Residual detergent detection method for nondestructive cytocompatibility evaluation of decellularized whole lung scaffolds, tissue engineering. Part C, Methods. 2016; 22(5):418 28);

- мочевого пузыря (O'Neill J.D., Freytes D.O., Anandappa A.J., Oliver J.A., Vunjak-Novakovic G.V. The regulation of growth and metabolism of kidney stem cells with regional specificity using extracellular matrix derived from kidney. Biomaterials. 2013;34(38):9830-9841);

- почки (Moradi L., Mohammadi Jobania В., Jafarnezhad-Ansariha F., Ghorbani F., Esmaeil-Pour R., Majidi Zolbina M., Kajbafzadeh A.-M. Evaluation of different sterilization methods for decellularized kidney tissue. Tissue Cell. 2020;66:101396);

- сухожилия (Jones G., Herbert A., Berry H., Edwards J.H., Fisher J., Ingham E. Decellularization and characterization of porcine superflexor tendon: a potential anterior cruciate ligament replacement, tissue engineering. Part. Accel. 2017;23(3-4): 124-134);

- нервов (Sridharan R., Reilly R.B., Buckley C.T. Decellularized grafts with axially aligned channels for peripheral nerve regeneration. J Mech Behav Biomed Mater. 2015; 41: 124-35).

Наряду с изолированным применением надуксусной кислоты, предложена ее комбинация с этанолом для стерилизации ацеллюлярных матриксов, полученных из:

- кровеносных сосудов (Fercana G.R., Yemeni S., Billaud M., Hill J.C., VanRyzin P., Richards T.D., Sicari B.M., Johnson S.A., Badylak S.F., Campbell P.G., Gleason T.G., Phillippi J.A. Perivascular extracellular matrix hydrogels mimic native matrix microarchitecture and promote angiogenesis via basic fibroblast growth factor. Biomaterials. 2017; 123:142-154);

- пищевода (Barnes C.A., Brison J., Michel R., Brown B.N., Castner D.G., Badylak S.F., Ratner B.D. The surface molecular functionality of decellularized extracellular matrices. Biomaterials. 2011; 32(1): 137-143);

- печени (Hussein К.Н., Park K.M., Teotia P.K., Hong S.H., Yang S.R., Park S.M., Ahn C, Woo H.M. Sterilization using electrolyzed water highly retains the biological properties in tissue-engineered porcine liver scaffold. Int. J. Artif. Organs. 2013; 36(ll):781-792);

- тонкой кишки (Luo J.-C, Chen W., Chen X.-H., Qin T.-W., Huang Y.-C, Xie H.-Q., Li X.-Q., Qian Z.-Y., Yang Z.-M. A multi-step method for preparation of porcine small intestinal submucosa (SIS) Biomaterials. 2011; 32(3):706-713);

- трахеи (Kutten J.C., McGovern D., Hobson СМ., Luffy S.A., Nieponice A., Tobita K., Francis R.J., Reynolds S.D., Isenberg J.S., Gilbert T.W. Decellularized tracheal extracellular matrix supports epithelial migration, differentiation, and function, Tissue engineering. Part. Accel. 2015; 21(1-2):75- 84);

- легкого (Bonenfant N.R., Sokocevic D., Wagner D.E., Borg Z.D., Lathrop M.J., Lam Y.W., Deng В., Desarno M.J., Ashikaga Т., Loi R., Weiss D.J. The effects of storage and sterilization on de-cellularized and re-cellularized whole lung. Biomaterials. 2013; 34(13):3231-3245);

- мочевого пузыря (Liu Y., Bharadwaj S., Lee S.J., Atala A., Zhang Y. Optimization of a natural collagen scaffold to aid cell-matrix penetration for urologic tissue engineering. Biomaterials. 2009; 30(23-24):3865-3873);

- почки (Poornejad N., Nielsen J.J., Morris R.J., Gassman J.R., Reynolds P.R., Roeder B.L., Cook A.D. Comparison of four decontamination treatments on porcine renal decellularized extracellular matrix structure, composition, and support of human renal cortical tubular epithelium cells. J. Biomater. Appl. 2016; 30(8):1154-1167);

- селезенки (Xiang J., Zheng X., Liu P., Yang L., Dong D., Wu W., Liu X., Li J., Lv Y. Decellularized spleen matrix for reengineering functional hepatic-like tissue based on bone marrow mesenchymal stem cells. Organogenesis. 2016; 12(3):128-142);

- нервов (Crapo P.M., Medberry C.J., Reing J.E., Tottey S., van der Merwe Y., Jones K.E., Badylak S.F. Biologic scaffolds composed of central nervous system extracellular matrix. Biomaterials. 2012; 33(13):3539-3547).

Суть всех предложенных способов заключается в предварительном (для ряда способов) погружении матриксов в коктейль, состоящий из смеси антибиотика и антимикотика; перекладывании матриксов в предварительно подготовленный раствор надуксусной кислоты с концентрацией 0,05% или 0,08% или 0,2% или 0,5% или 1% или 1,5%, с добавлением (не во всех случаях) 4,0%) или 4,8% раствора этанола; экспозиции матриксов в стерилизующем растворе в течение 50 минут или 2 часов или 3 часов или 4 часов или 24 часов при температуре 4°С или комнатной температуре или 37°С; последующим промыванием деионизированной водой или фосфатно-солевым раствором с доведением рН 7,2-7,4 и лиофилизацией или криоконсервацией в финале.

Недостатками предложенных способов является наличие этапа (для ряда способов) обработки ацеллюлярных матриксов антибиотиками и антимикотиками, что удлиняет процесс производства и предусматривает обязательные мероприятия по мониторингу спектра активности применяемых антибиотиков и антимикотиков. Добавление в стерилизующий раствор наряду с надуксусной кислотой этанола способствует частичной сшивке нативных молекул коллагена, что изменяет не только физические свойства ацеллюлярных матриксов, но и их биосовместимость. Погружение ацеллюлярных матриксов в стерилизующий раствор с последующей экспозицией является недостаточной мерой, вследствие сложной трехмерной организации их структуры с множеством пор, в том числе содержащих воздух, который препятствует эффективному и полному взаимодействию стерилизующего вещества с его поверхностью.

Проведя анализ существующих способов стерилизации ацеллюлярных матриксов, автор не выбрал ни один из них в качестве прототипа.

Задачей изобретения является получение стерильного биосовместимого ацеллюлярного матрикса с сохраненной нативной структурой, образующего его коллагена.

Технический результат предлагаемого способа заключается в возможности стерилизации ацеллюлярного матрикса в относительно короткие сроки без нарушения нативной молекулярной структуры коллагена.

Указанный технический результат достигается тем, что ацеллюлярные матриксы погружают во флакон для стерилизации, добавляют стерилизующий раствор 0,5% надуксусной кислоты в соотношении к ацеллюлярным матриксам 1:4. Устанавливают на шейкер и запускают его в режиме работы платформы 150 движений в минуту на 60 минут при комнатной температуре. После чего стерилизующий раствор сливают и заливают деионизированную воду в том же соотношении, затем флакон для стерилизации устанавливают на шейкер и запускают его в режиме работы платформы 250 движений в минуту на 12 часов при комнатной температуре; по истечении времени процедуру промывки ацеллюлярных матриксов деионизированной водой повторяют при тех же условиях. По истечении времени деионизированную воду из флакона для стерилизации сливают, а в промывных водах определяют остаточное содержание надуксусной кислоты и пероксида водорода. При отсутствии остатков надуксусной кислоты и продуктов ее распада в виде пероксида водорода ацеллюлярные матриксы промывают стерильным фосфатно-солевым буферным раствором с рН 7,2 в соотношении 1:4 при помощи шейкера в режиме работы платформы 250 движений в минуту в течение 12 часов при комнатной температуре. При обнаружении остаточных количеств надуксусной кислоты и пероксида водорода процедуру промывки деионизированной водой повторяют до полного их удаления. Фасовку стерильных ацеллюлярных матриксов осуществляют в индивидуальную стерильную тару, содержащую предварительно подготовленный стерильный и разведенный в 9 раз фосфатно-солевой раствор с рН 7,2-7,4, соблюдая при фасовке соотношение ацеллюлярный матрикс - фосфатно-солевой раствор 1:2. Все работы выполняют в ламинарном боксе не ниже второго класса с защитой продукта.

Физический фактор в виде удара и встряхивания, создаваемый платформой шейкера, обеспечивает эффективное проникновение надуксусной кислоты и полное взаимодействие с поверхностями ацеллюлярных матриксов. Контроль остаточного содержания надуксусной кислоты и продуктов ее распада в виде пероксида водорода позволяет регулировать число отмывок ацеллюлярных матриксов при полном удалении продуктов ее распада, тем самым сокращая время агрессивного воздействия образующегося пероксида водорода на молекулярную структуру ацеллюлярных матриксов, представленную нативным коллагеном.

Стерилизуемые и консервируемые в фосфатно-солевой буферной системе с рН 7,2-7,4 ацеллюлярные матриксы готовы к применению, так как в клинике нет необходимости их предварительной регидратации, как это требуют лиофилизированные. Это делает возможным применение ацеллюлярных матриксов сразу после вскрытия и извлечения их из первичной упаковки совместно с персонифицированными продуктами на базе клеток и крови человека. Такие ацеллюлярные матриксы полностью готовы для процесса сокультивирования, протекающего в жидких средах с различными клетками in vitro при создании ткане-инженерных конструкций и прототипов органов.

Для каждой партии ацеллюлярных матриксов, подвергнутых стерилизации раствором надуксусной кислоты, были проведены исследования на присутствие жизнеспособных микроорганизмов в стерилизующем растворе, в консервирующем растворе, представленном разведенным фосфатно-солевым буфером и в готовых продуктах.

Контроль стерильности ацеллюлярных матриксов осуществляли путем посевов в тиогликолевую среду и в среду Сабуро, после чего их инкубировали при температуре 32-35°С и 20-22°С в течение 14 суток. По истечении времени признаков роста микроорганизмов не были обнаружены.

Также проводилась оценка молекулярной структуры стерильных ацеллюлярных матриксов при помощи метода электрофореза. Для этого образцы стерильных матриксов помещали в стеклянные пробирки, содержащие 2% SDS с 5% меркаптоэтанола и инкубировали в водяной бане при 100°С в течении 5 минут. Стандарты молекулярной массы (Sigma-Aldrich) обрабатывали аналогично. После чего центрифугировали элюат в течение 10 минут при 3 тыс.об./мин и наносили на гель. Электрофоретическое разделение вели в фосфатной буферной системе в течении 7 часов. После окончания электрофореза гели извлекали и окрашивали Кумасси и дифференцировали 7% уксусной кислотой.

В исследуемых образцах, так же, как и в нативных, отчетливо визуализировали фракции в зонах коллагенов (α-цепи - 130 кДа, димеры - 260 кДа), а также фракции в зоне молекулярных масс более 80 кДа. Таким образом, процесс химической стерилизации надуксусной кислотой позволил сохранить нативную структуру коллагена, входящего в состав матрикса.

На практике способ стерилизации ацеллюлярных матриксов осуществляют следующим образом. Полученные ацеллюлярные матриксы из различных органов и тканей человека или животных погружают во флакон для стерилизации, добавляют 0,5% стерилизующего раствора надуксусной кислоты в соотношении к ацеллюлярным матриксам 1:4 и неплотно завинчивают крышкой. Перемещают флакон для стерилизации с ацеллюлярными матриксами на шейкер, запускают его в режиме работы платформы 150 движений в минуту на 60 минут при комнатной температуре. После чего стерилизующий раствор во флаконе для стерилизации заменяют на деионизированную воду в том же объеме, а флакон для стерилизации неплотно завинчивают крышкой и устанавливают на шейкер и запускают его в режиме работы платформы 250 движений в минуту на 12 часов при комнатной температуре. По истечении времени процедуру промывки ацеллюлярных матриксов деионизированной водой повторяют, при этом, повторную промывку осуществляют при тех же условиях. По истечении времени деионизированную воду из флакона для стерилизации сливают, а в промывных водах определяют остаточное содержание надуксусной кислоты и пероксида водорода. При отсутствии надуксусной кислоты и продуктов ее распада в виде пероксида водорода, переходят к промывке ацеллюлярных матриксов стерильным фосфатно-солевым буферным раствором с рН 7,2 в соотношении 1:4 при помощи шейкера в режиме работы платформы 250 движений в минуту в течение 12 часов при комнатной температуре. При обнаружении остаточных количеств надуксусной кислоты и пероксида водорода, процедуру промывки деионизированной водой повторяют до полного удаления продуктов распада надуксусной кислоты. Далее осуществляют фасовку стерильных ацеллюлярных матриксов в индивидуальную стерильную тару, содержащую предварительно подготовленный стерильный и разведенный в 9 раз фосфатно-солевой раствор с рН 7,2-7,4, соблюдая при фасовке соотношение ацеллюлярный матрикс - раствор 1:2.

Способ может применяться при производстве изделий медицинского назначения, источником сырья для которых служат ткани и органы животных и человека.

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинским биотехнологиям. Ацеллюлярные матриксы погружают во флакон для стерилизации, добавляют стерилизующий раствор 0,5% надуксусной кислоты в соотношении 1:4, устанавливают на шейкер и запускают его в режиме работы платформы 150 движений в минуту на 60 минут при комнатной температуре. После чего стерилизующий раствор сливают и заливают деионизированную воду в том же соотношении, затем флакон для стерилизации устанавливают на шейкер и запускают его в режиме работы платформы 250 движений в минуту на 12 часов при комнатной температуре; по истечении времени процедуру промывки ацеллюлярных матриксов деионизированной водой повторяют при тех же условиях. При отсутствии остатков надуксусной кислоты и продуктов ее распада в виде пероксида водорода ацеллюлярные матриксы промывают стерильным фосфатно-солевым буферным раствором с рН 7,2 в соотношении 1:4 при помощи шейкера в режиме работы платформы 250 движений в минуту в течение 12 часов при комнатной температуре. При обнаружении остаточных количеств надуксусной кислоты и пероксида водорода процедуру промывки деионизированной водой повторяют до полного их удаления. Изобретение обеспечивает возможность стерилизации ацеллюлярного матрикса в относительно короткие сроки без нарушения нативной молекулярной структуры коллагена.

Способ стерилизации ацеллюлярных матриксов, заключающийся в том, что ацеллюлярные матриксы погружают во флакон для стерилизации, добавляют стерилизующий раствор 0,5% надуксусной кислоты в соотношении к ацеллюлярным матриксам 1:4, устанавливают на шейкер и запускают его в режиме работы платформы 150 движений в минуту на 60 минут при комнатной температуре; после чего стерилизующий раствор сливают и заливают деионизированную воду в том же соотношении, после чего флакон для стерилизации устанавливают на шейкер и запускают его в режиме работы платформы 250 движений в минуту на 12 часов при комнатной температуре; по истечении времени процедуру промывки ацеллюлярных матриксов деионизированной водой повторяют при тех же условиях; по истечении времени деионизированную воду из флакона для стерилизации сливают, а в промывных водах определяют остаточное содержание надуксусной кислоты и пероксида водорода; при отсутствии остатков надуксусной кислоты и продуктов ее распада в виде пероксида водорода ацеллюлярные матриксы промывают стерильным фосфатно-солевым буферным раствором с рН 7,2 в соотношении 1:4 при помощи шейкера в режиме работы платформы 250 движений в минуту в течение 12 часов при комнатной температуре; при обнаружении остаточных количеств надуксусной кислоты и пероксида водорода процедуру промывки деионизированной водой повторяют до полного их удаления; фасовку стерильных ацеллюлярных матриксов осуществляют в индивидуальную стерильную тару, содержащую предварительно подготовленный стерильный и разведенный в 9 раз фосфатно-солевой раствор с рН 7,2-7,4, соблюдая при фасовке соотношение ацеллюлярный матрикс - фосфатно-солевой раствор 1:2.