ПЛАНШЕТ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК, УСТРОЙСТВА И СПОСОБЫ ВОЗДЕЙСТВИЯ IN VITRO Российский патент 2022 года по МПК C12M1/32 C12M3/06 C12M1/42 C12M1/34 C12M1/36 C12M1/12 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к планшету для культивирования клеток и устройству для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии. Одним подходящим типом клеток для применения в настоящем изобретении являются клетки или ткани, представляющие собой 3D-органотипические культуры. Текучая среда, такая как среда для культивирования клеток или смесь сред для культивирования клеток, может перекачиваться или циркулировать по планшету для культивирования клеток, что обеспечивает одновременное культивирование клеток или тканей in vitro. Клетки могут подвергаться воздействию одного или более средств, таких как аэрозоли, с целью изучения влияния средства на клетки и с возможностью отбора образцов среды для культивирования клеток в режиме реального времени во время воздействия.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Токсикологические исследования с применением 2-мерных систем культивирования клеток применяли для изучения влияний одного или более средств (например, лекарственных средств) на выживание и ферментативную активность клеток и т. д. Хотя возможность выращивания клеток плоскими слоями на поверхностях пластмассовых материалов является незатейливой и обеспечивает возможность изучать некоторые аспекты клеточной физиологии и реакции на раздражители, они не отражают настоящую структуру и строение органа. В 2-мерных монослоях внеклеточный матрикс, межклеточные взаимодействия и взаимодействия клеток с матриксом, которые являются существенными для дифференцировки, пролиферации и клеточных функций, утрачиваются.

В 3-мерных системах для культивирования может образовываться функциональная ткань с признаками, сходными с наблюдаемыми in vivo. По сравнению с 2-мерными системами культивирования 3-мерная культура клеток обеспечивает взаимодействие клеток с их окружающей средой во всех трех измерениях и является физиологически более релевантным. Такие клетки могут демонстрировать улучшения в отношении жизнеспособности, пролиферации, дифференцировки, морфологических характеристик, реакции на раздражители, метаболизма лекарственных средств, экспрессии генов и синтеза белка и т. п. 3-Мерная культура клеток может обеспечить получение специфических тканеподобных структур и имитацию функций и реакций настоящих тканей таким образом, который является более физиологически релевантным, чем в традиционных 2-мерных клеточных монослоях.

Коммерчески доступными являются несколько 3-мерных тканей, имитирующих органы человека. Например, 3-мерные органотипические ткани легкого можно получать c применением первичных клеток человека, выращиваемых на поверхности раздела жидкость-воздух (ALI), где эти клетки будут дифференцироваться и образовывать функциональную ткань. Эти 3-мерные ткани по морфологическим и метаболическим характеристикам имеют близкое сходство с бронхиальными тканями человека. Также были описаны другие 3-мерные модели, в том числе 3-мерные модели сфероидов из клеток печени. Сфероиды из клеток печени могут состоять из нескольких типов клеток, которые изначально применяли в 2-мерных культурах для определения влияний обработок на клетки печени.

Были разработаны разные методики для 2-мерных и 3-мерных культур клеток. Способы 3-мерного культивирования клеток включают применение планшетов для работы по методу висячей капли, магнитной левитации или каркасов из биоматериалов. Однако эти методики часто являются дорогостоящими и/или затратными по времени и могут не допускать возможности одновременного культивирования двух или более разных типов клеток. Они могут быть сложными для применения, не быть пригодными для автоклавирования, что означает, что их нельзя применять повторно, для них может требоваться значительный объем жидкости и поток для замены жидкости, может отсутствовать возможность их применения со стандартным оборудованием, при этом они часто не способны обеспечить водонепроницаемость и непригодны для путей применения, предусматривающих отбор образцов, где требуется высокая пропускная способность, или в режиме реального времени. Настоящее изобретение направлено на обеспечение улучшения в отношении культивирования клеток и отбора образцов среды для культивирования клеток.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном аспекте раскрыт планшет для культивирования клеток, содержащий по меньшей мере две последовательно расположенные лунки и канал, приспособленный для сообщения по текучей среде между лунками, где канал соединен или сообщается с первым насосом посредством отверстий на каждом конце канала, и где указанный первый насос является пригодным для обеспечения циркуляции текучей среды между по меньшей мере двумя лунками. Также раскрыта система для культивирования клеток или устройство для культивирования клеток, содержащие (i) планшет для культивирования клеток, содержащий по меньшей мере две последовательно расположенные лунки и канал, приспособленный для сообщения по текучей среде между лунками; и (ii) первый насос, где канал соединен или сообщается с первым насосом посредством отверстий на каждом конце канала, и где первый насос является пригодными для обеспечения циркуляции текучей среды между по меньшей мере двумя лунками. Соответственно, диаметр канала составляет 3 миллиметра или меньше или представляет собой микрофлюидный канал.

Соответственно, насос представляет собой перистальтический насос.

Соответственно, насос содержит шаговый двигатель или бесщеточный двигатель, содержащие энкодер.

Каждым двигателем можно управлять с помощью контроллера двигателя, функционированием и датчиками которого можно управлять с помощью микроконтроллера. Функционированием микроконтроллера можно управлять с помощью беспроводного контроллера, такого как контроллер Bluetooth®, при этом для облегчения применения это можно выполнять с помощью беспроводного устройства, такого как планшет.

Соответственно, канал дополнительно выполнен с возможностью обеспечения выведения текучей среды из планшета для культивирования клеток.

Соответственно, канал соединен или сообщается со вторым насосом, где указанный второй насос является пригодным для обеспечения выведения текучей среды из планшета.

Соответственно, двигатель первого насоса и/или второго насоса помещен в водонепроницаемую камеру.

Соответственно, планшет для культивирования клеток оснащен крышкой.

В определенных вариантах осуществления применяют четыре наноса.

Соответственно, планшет для культивирования клеток с необязательной крышкой помещен в инкубатор. Инкубатор может быть выполнен с возможностью инкубирования при определенной фиксированной температуре, такой как приблизительно 37°C. Инкубатор может быть выполнен с возможностью инкубирования при разных температурах в течение периода времени, например, в ходе эксперимента.

Соответственно, как планшет для культивирования клеток, так и насос(насосы) помещен в инкубатор.

Соответственно, температура внутри инкубатора не колеблется на более чем приблизительно 0,5°C во время применения, например, в ходе эксперимента.

Соответственно, канал содержит два или более отверстий в стенках канала, при этом два или более отверстий канала сообщаются или соединены с лунками.

Соответственно, канал соединен с основанием или верхней частью лунок.

Соответственно, канал соединен с верхней частью лунок, если в нем содержатся сфероиды из клеток печени.

Соответственно, канал выполнен с возможностью образования петли, такой как U-изгиб.

Соответственно, лунки образуют линейное расположение лунок в планшете.

Соответственно, планшет содержит 1, 2, 3 или 4 или более каналов, каждый из которых соединен с по меньшей мере одним насосом, который способен обеспечивать сообщение по текучей среде между лунками.

Соответственно, насос расположен снаружи от лунок планшета, соответственно, при этом насос расположен смежно с лунками, расположенными последовательно, что представляет собой схему расположения лунок планшета. При расположении снаружи насос может быть соединен с планшетом с помощью коннектора, такого как коннектор Люэра, или коннектор с фиксатором Люэра, или простой трубный коннектор.

Соответственно, одна или более лунок содержат вставку для культивирования клеток, при этом указанная вставка содержит проницаемую мембрану, которая обеспечивает прохождение среды для культивирования между лункой и вставкой.

Соответственно, одна или более лунок содержат поверхностное покрытие.

Соответственно, проницаемая мембрана расположена на основании вставки.

Соответственно, лунки содержат текучую среду, соответственно, среду для культивирования клеток.

Соответственно, лунки или вставки содержат клетки.

Соответственно, лунки являются открытыми и не запечатаны.

Соответственно, клетки представляют собой 2-мерные или 3-мерные культуры клеток.

Соответственно, среда для культивирования клеток содержит одно или более средств.

Соответственно, тип клеток в каждой из лунок представляет собой такой же тип клеток или разный тип клеток.

Соответственно, разные типы клеток выбраны из клеток надпочечника, мочевого пузыря, кровеносных сосудов, костной ткани, костного мозга, головного мозга, хрящевой ткани, шейки матки, роговицы, эндометрия, пищевода, желудочно-кишечного тракта, иммунной системы, печени, легкого, лимфатической системы, мышечной ткани, нервной ткани, яичника, поджелудочной железы, гипофиза, предстательной железы, почки, слюнной железы, кожи, сухожилия, яичка и щитовидной железы, соответственно, при этом типы клеток представляют собой клетки легкого или клетки печени, или нейроны.

Соответственно, скорость потока, обеспечиваемая первым насосом, составляет от приблизительно 10 мкл в минуту до приблизительно 1000 мкл в минуту. Соответственно, функция первого насоса управляется компьютером. Соответственно, лунки планшета для культивирования клеток или планшет для культивирования клеток изготовлены из полиэфирэфиркетона (PEEK). PEEK представляет собой молекулу из семейства полиарилэфиркетонов (PAEK).

Соответственно, лунки планшета для культивирования клеток или планшет для культивирования клеток содержат или состоят из PEEK. Соответственно, канал находится в сообщении по текучей среде с планшетом, содержащим один или более резервуаров, способных удерживать или хранить текучую среду.

Соответственно, основание лунки содержит неоднородную поверхность, приспособленную для обеспечения снижения степени или предотвращения агломерации сфероидов.

Соответственно, основание лунок является по сути круглым по форме, соответственно, при этом диаметр основания составляет от приблизительно 6 мм±5% до приблизительно 16 мм±5%, соответственно, при этом диаметр основания составляет приблизительно 6 мм±5%, приблизительно 11 мм±5% или приблизительно 16 мм±5%.

Соответственно, неоднородная поверхность содержит множество канавок, в которых глубина и ширина канавок соответствуют максимальному диаметру сфероида ±10%.

Соответственно, глубина и ширина множества канавок составляет от приблизительно 200 до приблизительно 1000 мкм, соответственно, от приблизительно 600 до приблизительно 1000 мкм.

Соответственно, канавки образуют множество концентрических колец на основании лунки.

Соответственно, неоднородная поверхность содержит множество углублений, имеющих закрытое дно и открытую верхнюю часть, при этом размер углублений составляет в глубину и ширину на приблизительно 10% больше, чем максимальный диаметр сфероида.

Соответственно, лунка содержит среду для культивирования клеток для обеспечения культивирования сфероидов.

Соответственно, лунка содержит отдельные сфероиды, удерживаемые на неоднородной поверхности лунки.

Соответственно, сфероиды представляют собой сфероиды клеток легкого.

Соответственно, скорость потока текучей среды от впускного отверстия к выпускному отверстию лунки, при наличии в ней текучей среды, составляет от приблизительно 1 до приблизительно 500 мкл/мин, соответственно, приблизительно 40 мкл/мин.

Соответственно, напряжение сдвига в лунке составляет менее 0,1 дин/см².

Соответственно, основание по меньшей мере одной из лунок содержит плоскую поверхность, которая лишена неоднородностей.

Соответственно, по меньшей мере одна лунка содержит вставку, расположенную выше основания лунки, соответственно, при этом вставка расположена над проницаемой мембраной, расположенной внутри лунки, с образованием поверхности, которая способна обеспечивать культивирование клетки на границе раздела воздух/жидкость.

Соответственно, глубина по меньшей мере одной лунки, содержащей плоскую поверхность, которая лишена неоднородностей, отличается от глубины по меньшей мере одной лунки, содержащей неоднородную поверхность, соответственно, при этом глубина по меньшей мере одной лунки, содержащей плоскую поверхность, которая лишена неоднородностей, составляет меньше, чем глубина по меньшей мере одной лунки, содержащей неоднородную поверхность.

Соответственно, лунка содержит среду для культивирования клеток для обеспечения культивирования клетки на поверхности раздела жидкость-воздух.

Соответственно, лунка содержит клетки, расположенные на проницаемой мембране, при этом указанные клетки способны расти на поверхности раздела воздух-жидкость.

Соответственно, клетки представляют собой клетки легкого.

Соответственно, канал находится в сообщении по текучей среде с планшетом, содержащим один или более резервуаров, способных удерживать текучую среду. В дополнительном аспекте раскрыто устройство для культивирования клеток, содержащее планшет для культивирования клеток в соответствии с настоящим изобретением, расположенное в инкубаторе.

В дополнительном аспекте раскрыт способ обеспечения циркуляции текучей среды между двумя или более последовательно расположенными лунками, включающий (a) обеспечение планшета для культивирования клеток или устройства для культивирования клеток, описанных в данном документе; (b) приведение в контакт по меньшей мере двух лунок с текучей средой; и (c) обеспечение циркуляции текучей среды через лунки планшета.

Дополнительный аспект связан со способом определения влияния средства на клетку, включающим стадии (a) обеспечения планшета для культивирования клеток или устройства для культивирования клеток, описанных в данном документе; (b) приведения в контакт по меньшей мере двух лунок планшета для культивирования клеток с клетками и средой для культивирования клеток; (c) обеспечения циркуляции среды для культивирования клеток через лунки планшета; (d) воздействия на лунки планшета по меньшей мере одного средства; (e) удаления и исследования образца среды для культивирования клеток из одной или более лунок; и (f) определения влияния средства на клетки до и после воздействия по меньшей мере одного средства.

Дополнительный аспект относится к устройству для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии, содержащему (a) планшет для культивирования клеток, описанный в данном документе; и (b) планшет для образцов, содержащий одну или более лунок для хранения множества образцов, где указанный второй насос является пригодным для обеспечения выведения текучей среды из планшета для культивирования клеток в планшет для образцов.

Соответственно, текучая среда сообщается с планшетом для образцов с помощью многоканального микродозатора.

Соответственно, количество пипеток в дозирующей станции соответствует количеству лунок в рядах планшета для образцов.

Соответственно, устройство для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии содержит резервуар для хранения текучей среды, где указанный резервуар находится в сообщении по текучей среде с лунками планшета для культивирования клеток.

Соответственно, устройство для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии дополнительно содержит по меньшей мере один дополнительный насос, приспособленный для обеспечения выведения среды для культивирования клеток из резервуара с повторным заполнением лунок планшета для культивирования клеток.

Соответственно, по меньшей мере один дополнительный насос приспособлен для повторного заполнения лунок планшета для культивирования клеток таким же объемом среды для культивирования клеток, который отбирают в лунки планшета для образцов.

Соответственно, устройство для отбора образцов дополнительно содержит компьютеризованный контроллер, пригодный для автоматического управления функционированием устройства.

В дополнительном аспекте предусмотрен способ отбора образцов среды для культивирования клеток, содержащей клетки, подвергшиеся воздействию одного или более средств, включающий стадии (a) обеспечения устройства для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии, описанного в данном документе; (b) приведения в контакт по меньшей мере одной из лунок со средой для культивирования клеток, содержащей клетки; (c) обеспечения циркуляции среды для культивирования клеток через лунки планшета для культивирования клеток; (d) воздействия на лунки планшета для культивирования клеток по меньшей мере одного средства; и (e) отбора образцов среды для культивирования клеток из планшета для культивирования клеток, где образцы среды для культивирования клеток необязательно отбирают в режиме реального времени во время воздействия средства.

Соответственно, на стадии (d) лунки планшета для культивирования клеток подвергаются воздействию по меньшей мере одного средства в нескольких временных точках.

Соответственно, объем среды для культивирования клеток, отобранный в качестве образцов на стадии (e), составляет от приблизительно 50 мкл до приблизительно 200 мкл.

Соответственно, способ включает дополнительную стадию (f) определения влияния средства(средств) на отобранные в качестве образцов клетки в среде для культивирования клеток.

Соответственно, способ включает дополнительную стадию (g) определения кинетических показателей для средства(средств) на подвергнутой воздействию культуре клеток.

В дополнительном аспекте раскрыто применение планшета для культивирования клеток, описанного в данном документе, для циркуляции текучей среды между двумя или более лунками.

В дополнительном аспекте раскрыто применение устройства для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии для отбора образцов текучей среды из лунок планшета для культивирования клеток, соответственно, в режиме реального времени.

В дополнительном аспекте раскрыто устройство для культивирования клеток, содержащее полиэфирэфиркетон или состоящее из него, и содержащее средство, включающее (i) алкалоид табака; или (ii) табак-специфичный нитрозамин; или (iii) органический растворитель, при условии, что органический растворитель не представляет собой галогенированный органический растворитель, или диметилсульфоксид, или тетрагидрофуран, или комбинацию двух или более из них.

Раскрыт способ приведения в контакт клетки с одним или более средствами, включающий (i) приведение в контакт клетки с устройством для культивирования клеток, содержащим полиэфирэфиркетон или состоящим из него; (ii) культивирование клетки и (iii) приведение в контакт клетки, содержащейся в устройстве для культивирования клеток, с одним или более средствами, включающими (i) алкалоид табака; или (ii) табак-специфичный нитрозамин; или (iii) органический растворитель, при условии, что органический растворитель не представляет собой галогенированный органический растворитель, или диметилсульфоксид, или тетрагидрофуран, или комбинацию двух или более из них.

В дополнительном аспекте раскрыт способ снижения или подавления поглощения средства с использованием устройства для культивирования клеток, содержащего полиэфирэфиркетон или состоящего из него, включающий приведение в контакт устройства для культивирования клеток с одним или более средствами, включающими (i) алкалоид табака; или (ii) табак-специфичный нитрозамин; или (iii) органический растворитель, при условии, что органический растворитель не представляет собой галогенированный органический растворитель, или диметилсульфоксид, или тетрагидрофуран, или комбинацию двух или более из них.

В дополнительном аспекте раскрыто применение устройства для культивирования клеток, содержащего полиэфирэфиркетон или состоящего из него, для снижения или подавления поглощения средства, включающего (i) алкалоид табака; или (ii) табак-специфичный нитрозамин; или (iii) органический растворитель, при условии, что органический растворитель не представляет собой галогенированный органический растворитель, или диметилсульфоксид, или тетрагидрофуран, или комбинацию двух или более из них.

Соответственно, табак-специфичный низторазмин представляет собой 4-(метилнитрозамино)-1-(3-пиридил)-1-бутанон.

Соответственно, алкалоид табака выбран из группы, состоящей из никотина, анабазина, норникотина, анатабина, котинина и миосмина или комбинации двух или более из них.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На фигуре 1 изображена вставка для применения в настоящем изобретении.

На фигуре 2 изображен один вариант осуществления планшета для культивирования клеток по настоящему изобретению.

На фигуре 3 изображен дополнительный вариант осуществления планшета для культивирования клеток по настоящему изобретению.

На фигуре 4 представлено 3-мерное изображение планшета для культивирования клеток, представленного на фигуре 3.

На фигуре 5 представлена фотография сконструированного планшета для культивирования клеток, представленного на фигуре 4.

На фигуре 6 изображен дополнительный вариант осуществления планшета для культивирования клеток по настоящему изобретению.

На фигуре 7 изображен дополнительный вариант осуществления планшета для культивирования клеток по настоящему изобретению, в котором планшет для культивирования клеток (который может быть оснащен необязательной крышкой) и насос(насосы) помещен в инкубатор.

На фигуре 8 изображено устройство для отбора образцов, которое включает планшет для культивирования клеток по настоящему изобретению.

На фигуре 9(a) изображен один вариант осуществления планшета для культивирования клеток по настоящему изобретению, содержащего один канал с 2 лунками и один канал без лунок, который обеспечивает возвращение текучей среды. Коннектор применяется для соединения трубки с обеспечением прохождения текучей среды из канала с 2 лунками в канал без лунок и затем обратно к одному насосу.

На фигуре 9(b) изображен вариант осуществления, в котором более 2 лунок соединены друг с другом с обеспечением соединения вместе большего числа клеток или тканей. Таким образом можно соединить 2, 4, 6 или 8 лунок и т. д. Каждый конец канала соединен с таким же одним насосом.

На фигуре 10 изображен дополнительный вариант осуществления устройства для отбора образцов по настоящему изобретению, которое включает планшет для культивирования клеток и три насоса.

На фигуре 11 представлено поперечное сечение лунки с множеством концентрических канавок для удерживания отдельных сфероидов (обозначено как «см. деталь B» на фигуре 14). Размеры представлены в миллиметрах.

На фигуре 12 представлен схематический вид сверху лунки с множеством концентрических канавок для удерживания отдельных сфероидов (обозначено как «см. деталь B» на фигуре 14). Размеры представлены в миллиметрах.

На фигуре 13 представлен схематический вид сверху лунки, содержащей микрофлюидный канал (обозначено как «см. деталь С» на фигуре 4). Размеры представлены в миллиметрах.

На фигуре 14 представлен схематический вид сверху многолуночного планшета, содержащего лунки с множеством концентрических канавок для удерживания отдельных сфероидов (обозначено как «см. деталь B») и лунки, содержащие вставку (обозначено как «см. деталь С»). Лунки соединены с помощью канала таким образом, что каждая из первой лунки («см. деталь B») и второй лунки («см. деталь C») находится в сообщении по текучей среде друг с другом. Размеры представлены в миллиметрах.

На фигуре 15 представлено поперечное сечение по линии C-C на фигуре 14.

На фигуре 16 представлено поперечное сечение лунки с множеством углублений для обеспечения функции удерживания отдельных сфероидов (обозначено как «см. деталь B» на фигуре 15).

На фигуре 17 представлен схематический вид сверху отдельной лунки с множеством углублений для удерживания отдельных сфероидов, как показано на фигуре 16. Размеры представлены в миллиметрах.

На фигуре 18 представлен схематический вид сверху многолуночного планшета, содержащего лунки с множеством углублений для удерживания отдельных сфероидов (обозначено как «см. деталь B») и лунки, содержащие вставку (обозначено как «см. деталь С»). Лунки соединены с помощью канала таким образом, что каждая из первой лунки («см. деталь B») и второй лунки («см. деталь C») находится в сообщении по текучей среде друг с другом. Размеры представлены в миллиметрах.

На фигуре 19 представлено поперечное сечение по линии C-C на фигуре 18.

На фигуре 20 показаны результаты определения напряжения сдвига, рассчитанные для каждой из двух разных лунок, как показано на фигуре, и параметры, используемые для расчета напряжения сдвига.

На фигуре 21(a) показаны агломерированные сфероиды. На фигуре 21(b) показаны неагломерированные сфероиды в индивидуализированной форме, полученные в соответствии с настоящим изобретением.

На фигуре 22 показан график, на котором приведено сравнение количества никотина, оставшегося в планшете PEEK и планшете PDMS после 8 часов инкубации при 4 °C.

На фигуре 23 показан планшет для культивирования клеток, соединенный с планшетом с резервуарами, который можно применять для увеличения объема циркулирующей текучей среды.

НЕКОТОРЫЕ ПРЕИМУЩЕСТВА

В настоящем изобретении могут применяться стандартные планшеты для культивирования клеток, что упрощает разработку, снижает стоимость и обеспечивает прочную основу для осуществления экспериментов, поскольку стандартные планшеты для культивирования клеток широко применяются в лабораториях. Например, анализ с применением стандартного планшета для культивирования клеток может выполняться с применением стандартного лабораторного оборудования. Соответственно, стандартный планшет для культивирования клеток содержит две или более или множество лунок, которые по сути являются круглыми по форме. Соответственно, диаметр основания лунок составляет от приблизительно 6 мм±5% до приблизительно 16 мм±5%, соответственно, при этом диаметр основания составляет приблизительно 6 мм±5%, приблизительно 11 мм±5% или приблизительно 16 мм±5%. В одном варианте осуществления диаметр основания лунок составляет от приблизительно 6 мм±5% (например, приблизительно 6,4 мм) до приблизительно 16 мм±5% (например, приблизительно 15,5 мм).

Планшет для культивирования клеток/устройство для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии можно применять со стандартными вставками для культивирования клеток, что упрощает разработку и обеспечивает снижение стоимости планшета для культивирования клеток.

Планшет для культивирования клеток/устройство для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии можно применять для культивирования и изучения 3-мерных культур клеток.

Планшет для культивирования клеток/устройство для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии обеспечивает преодоление ограничений стандартных методик культивирования клеток. Например, они могут точно имитировать естественное микроокружение для клеток.

Разные 3-мерные культуры клеток могут быть культивированы на одном и том же планшете, который обеспечивает соединение вместе разных типов клеток таким образом, что можно определять взаимодействие между клетками.

Планшет для культивирования клеток/устройство для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии могут обеспечивать снижение риска контаминации, поскольку они пригодны для автоклавирования.

Планшет для культивирования клеток/устройство для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток можно изготавливать без применения клея, что может обеспечить улучшение биосовместимости.

Планшет для культивирования клеток и соответствующий(соответствующие) насос(насосы), применяемые для обеспечения циркуляции текучей среды между лунками, могут быть помещены вместе в инкубатор. Инкубатор может оставаться закрытым во время применения и клетки могут оставаться непотревоженными. Скорость потока текучей среды, которая определяется насосами, можно модулировать (например, посредством Bluetooth®) не потревожив клетки. Поскольку инкубатор может оставаться закрытым во время применения, температура внутри инкубатора может оставаться стабильной с обеспечением сведения к минимуму колебаний температуры. Поскольку планшет для культивирования клеток и соответствующий(соответствующие) насос(насосы) помещают вместе в один и тот же инкубатор, количество проводов, проходящих между внутренней частью и наружной частью инкубатора, можно свести к минимуму и это может обеспечить улучшение в отношении герметичности инкубатора и дополнительное снижение частоты колебаний температуры. Обычно потребуется только один кабель снаружи инкубатора для соединения насоса с источником энергии, хотя при необходимости можно применять насосы, работающие на аккумуляторах. Это может обеспечить упрощение разработки инкубатора, содержащего планшет для культивирования клеток и соответствующий(соответствующие) насос(насосы), что делает его менее громоздким и более легким для применения. Циркулирующую текучую среду, такую как среда для культивирования клеток, можно смешивать автоматически, что может обеспечить улучшение в отношении культивирования клеток/тканей.

Лунки планшета для культивирования клеток могут быть открытыми и не запечатанными. Во время применения ткани или клетки в лунках могут подвергаться воздействию воздуха окружающей среды, присутствующему в инкубаторе. Такая система обеспечивает уравновешивание среды с воздухом, присутствующим в инкубаторе, поддерживая pH среды на физиологическом уровне и обеспечивая удаление газов, испускаемых тканями, из среды. Данная конфигурация является особенно предпочтительной при применении тканей или клеток, выращиваемых на поверхности раздела воздух-жидкость, которые являются более зависимыми от влажности воздуха окружающей среды и концентрации газов.

Планшет для культивирования клеток/устройство для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии обеспечивают возможность культивирования двух или более типов клеток одновременно. Это обеспечивает возможность взаимодействия клеток, подлежащих изучению, друг с другом.

Планшет для культивирования клеток/устройство для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии обеспечивает возможность специалисту в данной области техники изучать как метаболизируемое средство из первого типа клеток влияет на второй тип клеток.

Планшет для культивирования клеток/устройство для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии обеспечивает возможность специалисту в данной области техники изучать, как метаболизируемое средство из второго типа клеток влияет на первый тип клеток.

Планшет для культивирования клеток/устройство для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии обеспечивает возможность изучать влияние метаболизируемых средств из разных типов клеток, в том числе комбинаций разных типов клеток.

Планшет для культивирования клеток/устройство для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии можно приспособить для применения в анализах, где требуется высокая пропускная способность, таких как отбор образцов или скрининг, где требуется высокая пропускная способность.

Планшет для культивирования клеток/устройство для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии можно приспособить для применения в анализах в режиме реального времени, таких как отбор образцов или скрининг в режиме реального времени.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

При осуществлении на практике настоящего изобретения применяют, если не указано иное, традиционные методики инженерии, микроинженерии, микробиологии, клеточной биологии и биохимии. Такие методики полностью объяснены в литературе, такой как Molecular Cloning: A Laboratory Manual, второе издание (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (MJ. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. CeIMs, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, IB. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994). Процедуры, в которых применяются коммерчески доступные наборы и реагенты, обычно будут применяться в соответствии с протоколами, определенными производителем, если не указано иное.

Используемым в данном документе техническим терминам и выражениям следует придавать значение, которое обычно применяется к ним в соответствующей области молекулярной биологии, микробиологии, клеточной биологии и биохимии. Все нижеследующие определения терминов применяются ко всему содержанию настоящей заявки.

Используемые в данном документе формы единственного числа включают формы единственного и множественного числа, если из контекста явно не следует иное.

Термин «и/или» означает (а) или (b) или как (а), так и (b).

Термины «содержащий», «содержит» и «в состав входят», используемые в данном документе, являются синонимами «включающий», «включает» или «содержащий в себе», «содержит в себе» и являются включающими или неограничивающими и не исключают дополнительных, не перечисленных представителей, элементов или этапов способа.

Термин «состоящий из» означает, что дополнительные компоненты исключены и имеются только упомянутые элементы и ничего больше.

Упоминание числовых диапазонов с помощью конечных точек включает все числа и дробные значения, включенные в соответствующие диапазоны, а также упомянутые конечные точки.

Предусматривается, что термин «приблизительно», используемый в данном документе в отношении измеряемого значения, такого как параметр, количество, продолжительность и т. п., охватывает изменчивость указанного значения и отклонения от него, в частности отклонения на +/-10% или менее, предпочтительно на +/-5% или менее, более предпочтительно на +/-1% или менее и еще более предпочтительно на +/-0,1% или менее от указанного значения, если такие изменения являются допустимыми при осуществлении настоящего изобретения. Следует понимать, что значение, к которому относится модификатор «приблизительно», также конкретно и предпочтительно раскрыто само по себе.

Принимая во внимание, что термин «один или более», как, например, один или более членов из группы членов, является ясным per se, с целью дополнительного пояснения термин охватывает, inter alia, ссылку на любой из указанных членов или на любые два или более из указанных членов, как, например, любые ≥3, ≥4, ≥5, ≥6 или ≥7 и т. д. из указанных членов и вплоть до всех указанных членов.

Планшет для культивирования клеток

Планшет для культивирования клеток для применения в настоящем изобретении может быть изготовлен в различных форматах, таких как 24, 48 или 96-луночные форматы, и может быть легко выбран специалистом в данной области техники на основе размера и выбора эксперимента, который предполагается выполнять. Соответственно, планшет для культивирования клеток для применения в настоящем изобретении, представляет собой планшет для культивирования клеток в 24, 48 или 96-луночном формате. Обычно планшет для культивирования клеток имеет размеры, составляющие приблизительно 12 см в длину и приблизительно 8 см в ширину.

Планшет для культивирования клеток обычно будет находиться в виде плоского планшета, содержащего множество лунок. Как правило, весь планшет является прямоугольным.

Соответственно, диаметр основания лунок составляет от приблизительно 6 мм±5% до приблизительно 16 мм±5%, соответственно, при этом диаметр основания составляет приблизительно 6 мм±5%, приблизительно 11 мм±5% или приблизительно 16 мм±5%. В одном варианте осуществления диаметр основания лунок составляет от приблизительно 6 мм±5% (например, приблизительно 6,4 мм) до приблизительно 16 мм±5% (например, приблизительно 15,5 мм).

Емкость каждой лунки может составлять от приблизительно 300 мкл до приблизительно 3400 мкл, или от приблизительно 350 мкл до приблизительно 3400 мкл, или от приблизительно 370 мкл до приблизительно 3400 мкл. Обычно объем текучей среды, которая циркулирует в планшете для культивирования клеток, будет составлять от приблизительно 2,5 мл до приблизительно 12 мл, например, приблизительно 8 мл. Планшет для культивирования клеток выполнен с возможностью содержания по меньшей мере двух последовательно расположенных лунок. Планшет для культивирования клеток может быть выполнен с возможностью содержания по меньшей мере двух линейно расположенных лунок.

Обычно лунки в планшете для культивирования клеток будут расположены по рядам и столбцам. Например, 24-луночный планшет может быть выполнен в виде 6 линейных рядов из 4 смежных лунок в каждом ряду. В качестве дополнительного примера, 48-луночный планшет может быть выполнен в виде 8 линейных рядов из 6 смежных лунок в каждом ряду. В качестве дополнительного примера, 96-луночный планшет может быть выполнен в виде 12 линейных рядов из 8 смежных лунок в каждом ряду. Планшеты для культивирования клеток при необходимости можно даже изготовить или выполнить индивидуально для обеспечения необходимого количества лунок в планшете.

Необязательно использовать каждую лунку в планшете. При условии, что по меньшей мере две последовательно расположенные лунки используются в планшете для культивирования клеток, этого будет достаточно для выполнения эксперимента в соответствии с настоящим изобретением.

Лунки планшета для культивирования клеток обычно будут открытыми и не запечатанными, что может облегчить культивирование/поддержание клеток и циркуляцию аэрозоля.

Планшет для культивирования клеток может быть оснащен крышкой сверху планшета, которая способствует снижению риска контаминации в лунках. Крышка предпочтительно является не припаянной к планшету с тем, чтобы воздух мог циркулировать внутри планшета, что также может облегчать культивирование/поддержание клеток и циркуляцию аэрозоля.

Планшет для культивирования клеток может быть изготовлен из политетрафторэтилена (PTFE), нержавеющей стали (например, 316L/1.4435), PEEK, полипропилена, или полисульфона, или комбинации двух или более из них. Покрытие, такое как покрытие из парилена, может быть нанесено на любой из материалов, представляющих собой PTFE, нержавеющую сталь (например, 316L/1.4435), PEEK, полипропилен или полисульфон.

В определенных вариантах осуществления применение PEEK является предпочтительным, поскольку он имеет преимущество, проявляющееся в отсутствии поглощения никотина и NNK, как описано в данном документе.

При необходимости планшеты для культивирования клеток могут быть разработаны с помощью компьютерного дизайна (CAD) или они являются коммерчески доступными. Планшеты CAD могут быть изготовлены с помощью микромеханической обработки с применением способов, которые хорошо известны из уровня техники.

Соответственно, планшет для культивирования клеток представляет собой цельный планшет для культивирования клеток. Поскольку планшет для культивирования клеток является цельным, то он лишен слоев. Поскольку планшет для культивирования клеток является цельным, то он не содержит клея. Поскольку планшет для культивирования клеток является цельным, то он не содержит слоев и клея. Это может облегчать стерилизацию планшета для культивирования клеток, поскольку его можно полностью автоклавировать.

В одном варианте осуществления планшет для культивирования клеток представляет собой микрофлюидный планшет для культивирования клеток, который широкодоступен из уровня техники. Например, микрофлюидный планшет для культивирования клеток M04S доступен от Cellasic, Калифорния, США, и содержит 4 независимые лунки, при этом диаметр каждой лунки составляет приблизительно 2,8 мм при высоте 120 микрон. Размеры этого планшета составляют приблизительно 8,5 см в ширину, приблизительно 12,7 см в длину и приблизительно 1,4 см в высоту.

В определенных вариантах осуществления длина планшета для культивирования клеток составляет приблизительно 10 см или больше в длину, или приблизительно 11 см или больше в длину, или более 12 см в длину. В определенных вариантах осуществления длина планшета для культивирования клеток составляет менее приблизительно 10 см в длину, например, приблизительно 9 см в длину, приблизительно 8 см в длину, приблизительно 7 см в длину, приблизительно 6 см в длину или приблизительно 5 см в длину.

Планшет для культивирования клеток приспособлен для обеспечения сообщения по текучей среде между по меньшей мере двумя последовательно расположенными лунками. Этого можно достичь путем образования по меньшей мере одного отверстия в каждой из двух лунок планшета для культивирования клеток и затем соединения каждой из лунок посредством отверстия(отверстий) с каналом (например, трубой или трубкой). В одном варианте осуществления канал(каналы) непосредственно вырезан(вырезаны) или встроен(встроены) внутри планшета для культивирования клеток для обеспечения соединения вместе по меньшей мере двух лунок. Соответственно, канал(каналы) проходит(проходят) под лунками планшета для культивирования клеток. При необходимости канал(каналы) может(могут) соединяться с дном или верхней частью лунок. Диаметр канала может составлять приблизительно 3 мм, приблизительно 1,6 мм или приблизительно 1 мм или меньше. Канал может иметь круговой диаметр с целью снижения образования воздушных пузырьков. Канал может представлять собой микрофлюидный канал, который будет иметь диаметр менее 1 мм. Применение микрофлюидных каналов хорошо известно специалисту в данной области техники.

Канал содержит отверстия на каждом конце. Обычно каждый конец с отверстием соединен с тем же насосом. Соответственно, каждый конец с отверстием будет заканчиваться в том же насосе.

Различные виды коннекторов могут применяться для соединения канала с первым насосом. Один пример представляет собой коннектор Люэра, такой как коннектор с фиксатором Люэра, или простой трубный коннектор. Применение коннекторов Люэра является предпочтительным, поскольку они являются легкодоступными, легкими в установке и могут обеспечивать улучшение в отношении стерильности и герметичности.

Часть канала, которая обеспечивает выведение текучей среды в направлении первого насоса или от него, называется в данном документе «канал для передачи текучей среды». Стенки канала для передачи текучей среды обычно будут запаянными за исключением отверстия на одном конце, которое может быть соединено или сообщаться с первым насосом. Другими словами, стенки этой части канала будут лишены каких-либо отверстий. Другая часть канала называется в данном документе «канал для сообщения лунок», поскольку он обеспечивает сообщение по текучей среде с каждой лункой через отверстия в стенках канала. Количество отверстий в стенках канала для сообщения лунок будет зависеть от количества лунок, с которыми текучая среда должна сообщаться. Обычно отверстия в стенках канала для сообщения лунок будут располагаться в верхней части канала для сообщения лунок. Канал для сообщения лунок обычно будет соединяться либо с основанием, либо с верхней частью лунок. В определенных вариантах осуществления предпочтительно, чтобы канал для сообщения лунок был соединен с верхней частью лунок, если в нем содержатся сфероиды из клеток печени. Канал для сообщения лунок может обеспечивать сообщение по текучей среде в направлении насоса или от него. Канал для передачи текучей среды и канал для сообщения лунок, как правило, будут выполнены по сути в линейном расположении и могут быть расположены по сути параллельно друг с другом.

Эти каналы могут быть в виде трубок, таких как гибкие трубки. Таким образом, каналы могут быть выполнены с соединением трубкой, таким как соединение гибкой трубкой, или соединение силиконовой трубкой, или соединение трубкой Pharmed. Петля или U-изгиб соединяет канал для передачи текучей среды и канал для сообщения лунок. Петля выполнена с возможностью выведения текучей среды из насоса, а затем возвращения ее в направлении насоса.

Петля может быть расположена внутри или снаружи планшета для культивирования клеток. Если петля расположена снаружи планшета для культивирования клеток, то коннектор, такой как коннектор Люэра, или коннектор с фиксатором Люэра, или простой трубный коннектор, можно применять для обеспечения герметичности и включения петли в планшет для культивирования клеток.

Соединение трубкой можно применять для соединения разных каналов вместе, такое как соединение силиконовой трубкой или трубкой Pharmed.

Когда текучая среда переносится в канале, она может переноситься из насоса, а затем возвращаться обратно в насос. При необходимости текучая среда может циркулировать по часовой или против часовой стрелки через лунки. Первый насос обычно выполнен с возможностью ориентации на противоположную сторону планшета для культивирования клеток в направлении петли, которая обеспечивает возвращение текучей среды через канал для передачи текучей среды или канал для сообщения лунок. Первый насос и петля могут располагаться на противоположных сторонах планшета для культивирования клеток по сути в линейном расположении. При этом в определенных вариантах осуществления текучая среда передается из первого насоса в канал для передачи текучей среды и в канал для сообщения лунок через петлю и обратно в первый насос (см. фигура 2), также предусмотрено, что текучая среда передается из первого насоса в канал для сообщения лунок и в канал для передачи текучей среды через петлю и обратно в первый насос (см., фигура 3c и 9a, например). Также предусмотрено, что текучая среда передается из первого насоса в первый канал для передачи текучей среды и затем в первый канал для сообщения лунок через первую петлю, а затем через вторую петлю во второй канал для передачи текучей среды и во второй канал для сообщения лунок через третью петлю (см. фигура 9b, например) и затем обратно в первый насос.

Планшет для культивирования клеток, содержащий по меньшей мере две последовательно расположенные лунки и канал, приспособленный для сообщения по текучей среде между лунками, который соединен или сообщается с первым насосом посредством отверстий на каждом конце канала, может образовывать контур для циркуляции текучей среды между по меньшей мере двумя лунками. Текучая среда может циркулировать между лунками через канал и насос. В определенных вариантах осуществления планшет составлен из 1, 2, 3 или 4 или более контуров. Каждый контур может содержать 2, или 4, или 6, или 8 или более лунок. Одна или более лунок могут быть разработаны с целью специфического обеспечения расположения вставок, таких как вставки Transwell™, в лунках. При необходимости планшет может быть различных размеров, таким как стандартный 24- или 96-луночный планшет. Соответственно, стандартные планшеты содержат две или более или множество лунок, которые по сути являются круглыми по форме.

Эти 2, или 4, или 6, или 8 лунок на контур могут быть соединены между собой с помощью канала, такого как микроканал, проходящего вдоль их дна. На одной стороне каждого контура могут присутствовать два коннектора для обеспечения соединения каждого контура с перистальтическим насосом. Поскольку контуры заполнены средой и соединены с насосом, дизайн планшета обеспечивает достаточный уровень циркулирующей среды для осуществления контакта с вставкой в первой лунке и для покрытия сфероидов, присутствующих во второй лунке.

Два контура также могут быть соединены вместе (путем соединения отводящего коннектора одного контура с загрузочным коннектором второго контура) с обеспечением соединения между собой вплоть до 4 тканей.

Также можно менять путь, по которому среда циркулирует в контурах: контуры могут быть в виде замкнутой петли, где среда циркулирует повторно, или открытой петли со средой, выполняющей один проход через каждую лунку. В последнем случае первая трубка может быть соединена с резервуаром, заполненным средой в первой концевой части и с загрузочным коннектором контура на второй стороне. Отводящий коннектор этого последнего контура затем будет соединяться с трубкой, проходящей через насос, и отводить среду в коллектор.

Планшет для культивирования клеток может быть открытым с тем, чтобы обеспечивать оптимальный газообмен между тканями в планшете и воздухом, присутствующим в инкубаторе. В определенных вариантах осуществления планшет для культивирования клеток оснащен крышкой или покрытием, которые обеспечивают циркуляцию воздуха, идентичную для таковой для стандартного планшета для культивирования клеток.

Возвращаясь к фигурам, более подробно описаны конкретные неограничивающие варианты осуществления планшета для культивирования клеток. На фигуре 2 изображен один вариант осуществления планшета 20 для культивирования клеток, содержащего 24 лунки 17, расположенные в 6 рядов, содержащих 4 линейно расположенные лунки 17. Каждые 4 из рядов выполнены с возможностью обеспечения сообщения по текучей среде между каждой из 4 линейно расположенных лунок 17 посредством канала 23. Показаны канал 23a для передачи текучей среды и канал 23b для сообщения лунок. Канал может содержать впускное отверстие 26 для обеспечения сообщения по текучей среде с подачей в планшет 20 для культивирования клеток и выпускное отверстие 25 для обеспечения сообщения по текучей среде с выведением текучей среды из планшета 20 для культивирования клеток и обратно в насос 17. По меньшей мере каждая из двух лунок 17 будет содержать по меньшей мере одно отверстие для обеспечения соединения с ними канала 23b для сообщения лунок. Канал 23 может быть выполнен с возможностью образования петли 24 на одном его конце. Петля 24 может содержаться внутри планшета 20 для культивирования клеток или снаружи планшета 20 для культивирования клеток, как представлено в качестве примера на фигуре 3, на которой изображена расположенная снаружи петля 39. При расположении снаружи петля 24 будет соединена с планшетом 20 для культивирования клеток посредством коннекторов, которые соединяют петлю с планшетом 20 для культивирования клеток. Возвращаясь к фигуре 2, канал 23 соединен на одном конце с по меньшей мере одним насосом 29 посредством отверстий 25, 26 на каждом конце канала 23 для перекачивания текучей среды между лунками 17. Концы с отверстиями 25, 26 соединены с насосом 29 посредством коннекторов 28, которые можно видеть на фигуре 3. Если применяют два или более насосов 29, для удобства они могут быть выполнены в шахматной конфигурации на противоположных сторонах планшета 20 для культивирования клеток.

На фигуре 3 изображен дополнительный вариант осуществления планшета 20 для культивирования клеток. На фигуре 3a изображено поперечное сечение A-A, проходящее через лунки 17, изображенные на фигуре 3c, на которой изображена конфигурация лунок 17 и вставок 10 в планшете. На фигуре 3b изображены поперечные сечения B-B и C-C, проходящие через каналы 23, содержащиеся в планшете 20 для культивирования клеток, показанные на фигуре 3d. На фигуре 3c изображено направление кругового потока текучей среды при нахождении в канале 23. Жидкость передается из насоса в канал 23b для сообщения лунок и в канал 23a для передачи текучей среды через петлю и обратно в насос (не показано). Водонепроницаемый кожух 34 может быть использован для вмещения планшета 20 для культивирования клеток. Водонепроницаемый кожух может содержать крышку 38. В иллюстративном варианте осуществления коннекторы 28 и петля 39 каналов 23 расположены снаружи водонепроницаемого кожуха. На фигуре 3d изображена линейная конфигурация канала 23a для передачи текучей среды.

На фигуре 4 представлено 3-мерное изображение планшета для культивирования клеток, представленного на фигуре 3.

На фигуре 5 представлена фотография сконструированного планшета для культивирования клеток, представленного на фигуре 4.

На фигуре 6 изображен дополнительный вариант осуществления планшета 40 для культивирования клеток. На фигуре 6(a) изображен планшет 40 для культивирования клеток, содержащий 48 лунок, выполненных в виде 8 рядов, содержащих 6 линейно расположенных лунок 47. Каждый из рядов выполнен с обеспечением сообщения по текучей среде между каждой из 6 линейно расположенных лунок 47 посредством канала 43. Канал, представленный на данной фигуре, представляет собой канал для передачи текучей среды. Канал может содержать впускное отверстие 45 для обеспечения сообщения по текучей среде с подачей в лунки 47 и выпускное отверстие 46 для обеспечения сообщения по текучей среде с выведением текучей среды из лунок 47. На фигуре 6(b) представлено поперечное сечение, проходящее через планшет, изображенный на фигуре 6(a). На фигуре 6(c) представлен схематический вид сверху планшета, изображенного на фигуре 6(a).

На фигуре 7 изображен дополнительный вариант осуществления планшета 50 для культивирования клеток, содержащий в общей сложности 8 лунок 57, выполненных в виде 4 рядов, содержащих 2 линейно расположенные лунки 57 в каждом ряду. Каждый ряд соединен с отдельным насосом 59, содержащим двигатель 54. Каждый насос может характеризоваться отличающимся параметром накачки. Показаны флюидные коннекторы 52. Двигатели насоса(насосов) могут находиться в герметизированной камере 56, которая может быть водонепроницаемой. Герметизированная камера 56 может содержать крышку. Планшет для культивирования клеток может быть расположен на подложке планшета 55. Каждым двигателем 54 можно управлять с помощью контроллера двигателя, функционированием которого можно управлять с помощью микроконтроллера. Функционированием микроконтроллера можно управлять с помощью беспроводного контроллера, такого как контроллер Bluetooth®, при этом для облегчения применения это можно выполнять с помощью беспроводного устройства, такого как планшет. Планшет для культивирования клеток и насос(насосы) можно вместе помещать в инкубатор 51.

В определенных вариантах осуществления скорость потока текучей среды через лунку составляет от приблизительно 1 до приблизительно 100 мкл/мин.

В определенных вариантах осуществления скорость потока текучей среды через лунку составляет от приблизительно 1 до приблизительно 500 мкл/мин.

В определенных вариантах осуществления скорость потока текучей среды через лунку составляет от приблизительно 10 до приблизительно 400 мкл/мин, или от приблизительно 10 до 250 мкл/мин, или от приблизительно 10 до 100 мкл/мин.

В определенных вариантах осуществления скорость потока текучей среды через лунку составляет приблизительно 40 мкл/мин.

При применении более одного насоса один или более из разных насосов могут характеризоваться разными скоростями потока. При применении более одного насоса каждый из разных насосов может характеризоваться отличающейся скоростью потока. Соответственно, скорости потока в каждом контуре могут быть одинаковыми или разными.

Как будет понятно специалисту в данной области техники, если текучая среда течет по границе твердого тела, она будет подвергаться напряжению сдвига на этой границе, что может привести к нарушению спокойного состояния клеток, подвергающихся воздействию напряжения сдвига. В контексте настоящего изобретения, если текучая среда перемещается через лунку, будет возникать напряжение сдвига. Требуется, чтобы напряжение сдвига в лунке составляло менее 0,1 дин/см², например, приблизительно 0,08 дин/см² или меньше, или 0,04 дин/см² или меньше, поскольку оно не вызывает нарушения спокойного состояния клеток, подвергающихся воздействию напряжения сдвига. Напряжение сдвига может быть разным в разных лунках. Например, лунка с неоднородной поверхностью может характеризоваться напряжением сдвига, составляющим приблизительно 0,04 дин/см². Например, лунка с плоской и не являющейся неоднородной поверхностью может характеризоваться напряжением сдвига, составляющим приблизительно 0,08 дин/см². Соответственно, напряжение сдвига в лунке с неоднородной поверхностью является более низким, чем в лунке с плоской и не являющейся неоднородной поверхностью.

Поскольку для скрининга можно применять оптический анализ, дно лунки может быть сделано из материала, характеризующегося общим светопропусканием, составляющим 70%, или 80%, или 90% или больше.

Глубина множества лунок не должна быть одинаковой по всему планшету для культивирования клеток, и предполагается, что лунки могут иметь разную глубину. Канал, соединяющий по меньшей мере две лунки, может располагаться на такой же высоте, что и канал, расположенный на разных расстояниях от основания по меньшей мере двух лунок. Данная конфигурация обеспечивает то, что поток текучей среды, поступающий в лунку, не нарушает спокойного состояния сфероидов или не тревожит их, при этом обеспечивает то, чтобы текучая среда могла все еще проходить через проницаемую мембрану вставки. В одном варианте осуществления лунка(лунки) для культивирования сфероидов имеет(имеют) самую большую глубину. В одном варианте осуществления лунка(лунки) для культивирования сфероидов имеет(имеют) глубину, которая больше, чем у лунки(лунок) для культивирования клеток, отличных от сфероидов. В одном варианте осуществления лунка(лунки) для культивирования сфероидов имеет(имеют) глубину, которая больше, чем у лунки(лунок), содержащей(содержащих) вставку.

При необходимости планшет для культивирования клеток можно применять вместе с планшетом 261 с резервуарами, представленным на фигуре 23. Планшет с резервуарами содержит один или более резервуаров 269 для текучей среды. Резервуар(резервуары) 269 для текучей среды может(могут) быть выполнен(выполнены) с возможностью содержать текучую среду. На данной фигуре изображен один вариант осуществления планшета 20 для культивирования клеток, содержащего 8 лунок 17, выполненных в виде 4 рядов, содержащих 2 линейно расположенные лунки 17, хотя будет понятно, что можно легко применять другие конфигурации лунок. В отличие от каналов 23, образующих петлю на планшете для культивирования клеток или смежно с ним, каналы проходят в одном или более резервуарах 269 для текучей среды планшета 261 с резервуарами. Каналы образуют петлю на планшете 261 с резервуарами или смежно с ним. Текучая среда передается из одного или более резервуаров 269 для текучей среды в планшет для культивирования клеток и циркулирует. Планшет 261 с резервуарами можно применять для обеспечения увеличения объема текучей среды. Обычно объем текучей среды, применяемой в данной конфигурации, будет составлять от приблизительно 8 мл до приблизительно 12 мл.

Планшет для образцов

Планшет для образцов для применения в настоящем изобретении может быть изготовлен в различных форматах, таких как 24, 48 или 96-луночные форматы, и может быть легко выбран специалистом в данной области техники на основе размера и выбора эксперимента, который предполагается выполнять.

Планшет для образцов также выполнен с возможностью содержания по меньшей мере двух последовательно расположенных лунок. Планшет для образцов может быть выполнен с возможностью содержания по меньшей мере двух линейно расположенных лунок.

Обычно лунки в планшете для образцов будут расположены по рядам и столбцам. Например, 8-луночный планшет может быть выполнен в виде 4 линейных рядов из 2 смежных лунок в каждом ряду. В данной конфигурации отдельные насосы можно применять для каждого ряда. Каждый насос может характеризоваться отличающимся параметром накачки.

В качестве дополнительного примера, 24-луночный планшет может быть выполнен в виде 6 линейных рядов из 4 смежных лунок в каждом ряду.

В качестве дополнительного примера, 48-луночный планшет может быть выполнен в виде 8 линейных рядов из 6 смежных лунок в каждом ряду. В данной конфигурации можно применять один насос для всех рядов таким образом, что такой же параметр накачки применяется во всех рядах. В другой конфигурации применяют 3 насоса. Такой же параметр накачки можно применять во всех рядах.

В качестве дополнительного примера, 96-луночный планшет может быть выполнен в виде 12 линейных рядов из 8 смежных лунок в каждом ряду. Планшеты для образцов при необходимости можно даже изготовить или выполнить индивидуально для обеспечения необходимого количества лунок в планшете для образцов.

При условии, что планшет для образцов содержит по меньшей мере две последовательно расположенные лунки, его можно применять в соответствии с настоящим изобретением, несмотря на то, что применение планшетов большего размера является предпочтительным, поскольку можно проводить больше экспериментов. Необязательно использовать каждую лунку в планшете для образцов. При условии, что по меньшей мере две последовательно расположенные лунки используются в планшете для образцов, этого будет достаточно для выполнения эксперимента в соответствии с настоящим изобретением.

Планшет для образцов может быть оснащен крышкой сверху планшета, которая способствует снижению риска контаминации.

Планшет для образцов может быть изготовлен из политетрафторэтилена (PTFE), нержавеющей стали (например, 316L/1.4435), полиэфирэфиркетона (PEEK), полипропилена, полисульфона, или РТЕЕ, или комбинации двух или более из них, необязательно с покрытием из парилена.

В определенных вариантах осуществления применение PEEK является предпочтительным, поскольку он имеет преимущество, проявляющееся в отсутствии поглощения никотина и NNK, как описано в данном документе.

При необходимости планшеты для образцов могут быть разработаны с помощью компьютерного дизайна (CAD) или они являются коммерчески доступными. Планшеты CAD могут быть изготовлены с помощью микромеханической обработки с применением способов, которые хорошо известны из уровня техники.

В одном варианте осуществления планшет для образцов представляет собой микрофлюидный планшет для культивирования клеток, который широкодоступен из уровня техники. Например, микрофлюидный планшет для культивирования клеток M04S доступен от Cellasic, Калифорния, США, и содержит 4 независимые лунки, при этом диаметр каждой лунки составляет приблизительно 2,8 мм при высоте приблизительно 120 микрон.

В отличие от планшета для культивирования клеток, планшет для образцов обычно будет лишен канала в планшете для образцов, поскольку текучая среда может сообщаться с лунками планшета для образцов с помощью микродозатора, такого как автоматический микродозатор. Кроме того, боковые стенки и основание лунок планшета для образцов будут обычно запаяны, поскольку сообщение по жидкой среде с каналом не требуется.

Планшет для культивирования клеток и планшет для образцов могут иметь одинаковое количество рядов лунок или планшет для образцов может иметь большее количество рядов лунок, как обсуждается ниже.

Насос

В одном варианте осуществления насос(насосы) для применения в настоящем изобретении представляет(представляют) собой поршневой(поршневые) насосы прямого вытеснения, который(которые) пригоден(пригодны) для обеспечения циркуляции текучей среды, такие как перистальтический насос. Как понимается в данной области техники, перистальтический насос представляет собой насос, применяемый для обеспечения движения текучей среды. Текучая среда содержится в канале, описанном в данном документе, при этом канал может представлять собой гибкую трубку, которая помещена внутрь корпуса насоса. В качестве альтернативы, если канал непосредственно вырезан (например, встроен) в планшете, то адаптор может быть использован для соединения вырезанного или встроенного канала с насосом. Ротор, прикрепленный к его внешней окружности, сжимает гибкую трубку или канал. По мере того, как ротор поворачивается, часть трубки или канала при сжатии сдавливается с проталкиванием текучей среды через трубку или канал.

Первый (циркулирующий) насос может быть использован для управления потоком текучей среды в планшете для культивирования клеток. Второй (для образцов) насос может быть использован для продвижения текучей среды из планшета для культивирования клеток в планшет для образцов.

В одном варианте осуществления скорость потока, обеспечиваемая первым насосом, составляет от приблизительно 10 мкл в минуту до приблизительно 1000 мкл в минуту.

В одном варианте осуществления скорость потока, обеспечиваемая вторым насосом, составляет от приблизительно 10 мкл в минуту до 2000 мкл в минуту. Скорость потока, обеспечиваемая вторым насосом, может быть выше скорости потока, обеспечиваемой первым насосом. Это может облегчать смешивание перед отбором образцов. Иллюстративные более высокие скорости потока, обеспечиваемые вторым насосом, составляют от 550 мкл в минуту до 2000 мкл в минуту.

В одном варианте осуществления насос(насосы) содержит(содержат) шаговый двигатель или бесщеточный двигатель, содержащие энкодер.

Каждым двигателем можно управлять с помощью контроллера двигателя, функционированием и датчиками которого можно управлять с помощью микроконтроллера. Функционированием микроконтроллера можно управлять с помощью беспроводного контроллера, такого как контроллер Bluetooth®, при этом для облегчения применения это можно выполнять с помощью беспроводного устройства, такого как планшет. В дополнительном варианте осуществления первый насос расположен либо внутри, либо снаружи планшета для культивирования клеток. Соответственно, расположенный снаружи первый насос расположен смежно с последовательно расположенными лунками планшета для культивирования клеток. При применении нескольких первых насосов вместе с одним планшетом для культивирования клеток, все первые насосы могут располагаться на одной и той же стороне планшета для культивирования клеток, как представлено в качестве примера на фигуре 5. В качестве альтернативы, в связи с пространственными ограничениями первые насосы могут быть расположены на противоположных сторонах планшета для культивирования клеток, соответственно, в шахматном порядке, как представлено в качестве примера на фигуре 2.

Второй насос обычно будет расположен снаружи планшета для образцов. Соответственно, расположенный снаружи второй насос расположен смежно с планшетом для культивирования клеток таким образом, что он может обеспечивать выведение текучей среды из планшета для культивирования клеток в планшет для образцов. Соответственно, второй насос расположен на противоположной стороне планшета для культивирования клеток относительно первого насоса.

Пример коммерчески доступного второго насоса для применения в настоящем изобретении представляет собой перистальтический насос WPM (Welco Co, Ltd, Япония) или перистальтический насос Boxer 6KP Series (Boxer GmbH, Германия).

В определенных вариантах осуществления можно применять три или более насосов. По меньшей мере один насос можно применять для отбора образцов, по меньшей мере один насос можно применять для повторного заполнения текучей средой и по меньшей мере один насос можно применять для обеспечения циркуляции текучей среды через планшет (см., например, фигуру 10).

По меньшей мере один насос может содержаться в кожухе, таком как герметизированная камера. Герметизированная камера может быть водонепроницаемой. Если применяют более одного насоса, то при необходимости насосы могут содержаться в одном и том же кожухе или в отдельных кожухах.

По меньшей мере один насос может содержаться в инкубаторе.

Если по меньшей мере один насос содержится в кожухе, то насос в кожухе может дополнительно содержаться в инкубаторе. Данный вариант осуществления представлен в качестве примера на фигуре 7, на которой каждый из двигателей 56 содержится в герметизированной камере 56 и помещен в инкубатор 51.

Культивирование клеток

Культивирование клеток в целом относится к удалению клеток из ткани перед ростом в искусственной среде. Клетки, подлежащие культивированию, можно удалять непосредственно из ткани, содержащей клетки, подлежащие культивированию, и необязательно обрабатывать с помощью ферментных или механических средств перед культивированием. В качестве альтернативы, клетки, подлежащие культивированию, можно получать из ранее установившихся штамма или линии клеток. Планшет для культивирования клеток, описанный в данном документе, может обеспечивать систему или устройство для отбора образцов текучей среды, такой как среда для культивирования клеток, из лунок. Планшет для культивирования клеток, описанный в данном документе, может обеспечивать систему или устройство для изучения различных аспектов клетки, в том числе физиологии; биохимии; влияний средств, в том числе аэрозолей; скрининга и разработки или оптимизации средств; изучения эффективности средств; изучения поглощения средств; скрининговых исследований токсичности; токсикологии; выявления мишеней; фармакокинетики; фармакодинамики и регенеративной медицины, необязательно в реальном времени.

Планшет для культивирования клеток может быть использован в биологических анализах критических точек, таких как клеточные анализы, которые указывают на общее состояние здоровья клеток (например, анализ жизнеспособности 3D клеток CellTiter-Glo® и анализ ApoTox-Glo®Triplex). Он может быть использован для изучения морфологии и фенотипа клеток (например, гистологии и иммуногистохимии). Он может быть использован для изучения метаболической способности (например, анализы P450-Glo®). Он может быть использован для изучения функции клеток (например, анализ ROS-Glo® H₂0₂ или анализ GSH/GSSG-Glo®).

Планшет для культивирования клеток может быть использован для изучения, например, токсикологии в целом, для изучения токсикологии средств, для изучения токсикологии метаболизируемых средств и для изучения влияния средств на одну или более клеток.

Вставки и лунки

Определенные клетки для применения в настоящем изобретении можно культивировать во вставках, которые располагаются в лунках планшета для культивирования клеток. Определенные клетки можно выращивать на проницаемой мембране, содержащейся во вставке. Как правило, клетки будут расти на верхней части проницаемой мембраны. Вставку помещают в лунку планшета для культивирования клеток. Если лунку планшета для культивирования клеток заполняют текучей средой, такой как среда для культивирования клеток, то текучая среда будет проходить через проницаемую мембрану и контактировать с клетками таким образом, что их можно культивировать во вставке. Текучая среда может касаться только нижней части вставки. Разные типы клеток можно культивировать во вставке, как описано в данном документе. Пример типа клеток, который культивируют с применением вставки, представляет собой клетку легкого.

Другие типы клеток для применения в настоящем изобретении можно культивировать без применения вставки, а вместо этого можно культивировать в лунках планшета для культивирования клеток, содержащего поверхностное покрытие. Например, сфероиды можно выращивать с применением микропланшетов для сфероидов Corning®, которые имеют поверхностное покрытие для прикрепления, которое является гидрофильным, биологически инертным и неразлагающимся, и ковалентно связано с внутренней поверхностью дна лунки. Дизайн дна лунки обеспечивает высоковоспроизводимый рост 3D-сфероидов клеточных культур. Пример типа клеток, который культивируют без применения вставки, представляет собой клетку печени.

В определенных вариантах осуществления по меньшей мере две лунки имеют различную глубину. Например, если применяют клетку легкого и клетку печени, то лунка, содержащая клетку печени, будет более глубокой, поскольку необходимо, чтобы текучая среда покрывала сфероиды из клеток легкого, в то время как в лунке, содержащей клетки легкого, необходимо, чтобы текучая среда достигала только нижней части вставки.

В определенных вариантах осуществления уровень текучей среды в по меньшей мере двух лунках характеризуется разной глубиной.

На фигуре 1 изображен вариант осуществления, в котором вставка 10 содержит проницаемую мембрану 12 у основания вставки 10. Ткань/клетки 14 могут содержаться во вставке 10 у ее основания. Вставка может содержать необязательную крышку 19 на верхней части вставки 10 с целью снижения риска контаминации. Вставка 10 может содержаться в лунке 17. Лунка 17 может содержать текучую среду. Несколько лунок 17 могут быть соединены вместе с помощью канала, такого как микрофлюидный канал, описанный в данном документе.

Преимущественно вставки являются коммерчески доступными, что способствует упрощению разработки и конструирования планшета для культивирования клеток. В качестве примера можно использовать проницаемые вставки для культивирования клеток ThinCert^TM (USA Scientific, Флорида, США). Они доступны с различными размерами и видами конечного покрытия и могут быть легко выбраны специалистом в данной области техники для применения в настоящем изобретении. Каждая вставка может иметь самоустанавливающиеся крепления, которые обеспечивают устранение капиллярных эффектов и максимальный доступ микродозатора в лунку путем расположения вставки слегка эксцентрично. Вставки для культивирования клеток ThinCert^TM являются совместимыми со стандартными многолуночными планшетами. В качестве дополнительного примера могут быть использованы проницаемые подложки Corning® HTS Transwell® (Sigma Aldrich, Дорсет, Великобритания). Проницаемые подложки Corning® HTS Transwell® имеют схему размещения из 24 или 96 лунок с проницаемыми вставками, соединенными с помощью жесткой пластинки.

Неоднородная поверхность

Авторами настоящего изобретения было замечено, что сфероиды могут иметь склонность к агломерации друг с другом в одном и том же месте во время 3-мерного культивирования клеток с образованием одного большого участка ткани. Не ограничиваясь теорией, авторами настоящего изобретения было замечено, что клетки в середине сфероида имеют меньше доступа к питательным веществам по сравнению с клетками, расположенными вблизи наружной части сфероида, так что клетки, расположенные вблизи середины сфероида, имеют склонность к гибели. Если сфероиды агломерируют (что может происходить спустя 5 часов культивирования клеток), то это становится проблематичным, поскольку большее количество клеток в сфероиде будет иметь меньше доступа к питательным веществам. Это также дополнительно увеличивает количество погибших клеток в сфероиде. Это может быть проблематичным по ряду причин, включая (1) молекулы, высвобождаемые из погибших клеток, могут оказывать отрицательное влияние на другие клетки в сфероиде; (2) погибшие клетки не являются метаболически активными, поэтому метаболическая активность сфероида будет снижена; и (3) многие анализы требуют применения одного сфероида. Авторы настоящего изобретения попытались решить проблему агломерации сфероидов в 3-мерных культурах клеток. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что эта проблема могла быть легко решена с помощью образования неоднородной поверхности на основании лунки, такой как лунка многолуночного планшета, поскольку на неоднородной поверхности сфероиды становятся удерживаемыми на неоднородной поверхности. Это обеспечивает эффективное снижение степени агломерации сфероидов или предотвращает ее. Преимущественно авторы настоящего изобретения обнаружили, что сфероиды можно поддерживать в виде индивидуализированных одиночных сфероидов.

В определенных вариантах осуществления основание одой или более лунок, такое как основание одной или более лунок многолуночного планшета, может содержать неоднородную поверхность, приспособленную для обеспечения снижения степени или предотвращения агломерации сфероидов. Следует понимать, что не каждая лунка должна содержать неоднородную поверхность, поскольку не все лунки могут быть использованы для культивирования сфероидов. Например, некоторые лунки могут быть использованы для культивирования других типов клеток, которые не требуют применения неоднородной поверхности. Например, некоторые лунки могут быть использованы для культивирования других типов клеток, которые требуют применения вставки для создания поверхности раздела жидкость-воздух.

Соответственно, неоднородная поверхность удерживает сфероиды с обеспечением снижения степени или предотвращения их агломерации. Соответственно, неоднородная поверхность удерживает одиночные сфероиды с обеспечением снижения степени или предотвращения их агломерации.

В определенных вариантах осуществления неоднородная поверхность образована одной или более канавками. Канавки могут выполнять функцию удерживания сфероидов с обеспечением снижения степени или предотвращения их агломерации. Размер канавки(канавок) будет, как правило, соответствовать максимальному диаметру сфероида ±10%, так что сфероиды могут удерживаться или содержаться в канавке(канавках). Соответственно, канавка(канавки) будет(будут) покрывать большую часть основания лунки, поскольку наличие плоской поверхности на основании лунки может приводить к агломерации сфероидов, что может приводить к образованию больших клеточных агрегатов, которое является нежелательным. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или 100% основания лунки будет содержать неоднородную поверхность, такую как канавка(канавки).

Соответственно, глубина и ширина неоднородной поверхности, такой как множество канавок в основании лунки, составляет от приблизительно 200 мкм до приблизительно 1000 мкм, соответственно, от приблизительно 600 мкм до приблизительно 1000 мкм. Фактическая глубина и ширина будет определяться размером сфероидов, которые предполагается использовать в лунке и удерживать. Таким образом, например, некоторые сфероиды имеют максимальный диаметр, составляющий приблизительно 600 мкм, и в таком случае глубина и ширина неоднородной поверхности, такой как множество канавок, будет составлять приблизительно 600 мкм ±10%. В некоторых вариантах осуществления требуется, чтобы глубина и ширина неоднородной поверхности, такой как множество канавок, были больше максимального диаметра сфероида, например, на 20%, 30%, 40%, 50% или 60% или больше максимального диаметра сфероида. В одном варианте осуществления сфероид имеет максимальный диаметр, составляющий 600 мкм, а неоднородная поверхность, такая как множество канавок, имеет высоту, составляющую приблизительно 1 мм, и ширину, составляющую приблизительно 1 мм, или ширину, составляющую приблизительно 2 мм.

Как правило, форма канавок может характеризоваться плоским дном, быть U-образной, V-образной или V-образной с плоским дном и т. п. В одном варианте осуществления канавки имеют V-образную форму с плоским дном. В одном варианте осуществления максимальная ширина отверстия канавки составляет приблизительно 2,4 мм, глубина канавки составляет приблизительно 1 мм и ширина плоского дна в основании канавки составляет приблизительно 400 мкм. Угол между противоположными сторонами канавки в соответствии с данным вариантом осуществления составляет приблизительно 90 градусов.

Возвращаясь к фигуре 11, на ней показан планшет 110 для культивирования клеток, содержащий лунку 112 с множеством канавок 116 на его основании, содержащем V-образные канавки, каждая из которых имеет плоское дно. Максимальная ширина отверстия в канавках составляет приблизительно 2,4 мм, глубина канавок составляет приблизительно 1 мм и ширина плоского дна в основании канавок составляет приблизительно 400 мкм. Угол между противоположными сторонами канавок составляет приблизительно 90 градусов. Несмотря на то, что множество канавок показаны таким образом, что они имеют одинаковую форму, предполагается, что могут быть использованы канавки с разными формами. Например, основание лунки может содержать множество канавок, у которых форма одной или более канавок является разной. Таким образом, основание лунки может содержать множество канавок, содержащее две или более канавки с плоским дном, U-образные, V-образные или V-образные с плоским дном и т. п.

В определенных вариантах осуществления канавки образуют множество концентрических колец на основании лунки. В одном варианте осуществления радиус концентрических колец составляет приблизительно 1,05 мм, приблизительно 3,45 и приблизительно 5,85 мм. Возвращаясь к фигуре 12, на ней показано основание планшета 112 для культивирования клеток с множеством концентрических колец 117, образованных канавками 116, при этом радиус концентрических колец составляет приблизительно 1,05 мм, приблизительно 3,45 и приблизительно 5,85 мм.

Возвращаясь к фигуре 14, на ней показан схематический вид сверху планшета 110 для культивирования клеток в виде многолуночного планшета. Планшет 110 для культивирования клеток содержит множество лунок 112, при этом лунки содержат либо множество концентрических канавок 117, либо содержат микрофлюидный канал 118. Лунки линейно расположены по рядам. Ряд может быть выполнен с возможностью содержания по меньшей мере одной лунки, содержащей концентрические канавки 117. Ряд может быть выполнен с возможностью содержания по меньшей мере одной лунки, содержащей концентрические канавки 117, и по меньшей мере одной лунки, содержащей микрофлюидный канал 118, как показано на фигуре 4.

Канал 119 соединяет лунку, содержащую множество концентрических канавок 117, и лунку, содержащую микрофлюидный канал 118. Каждая лунка содержит впускное отверстие и выпускное отверстие для обеспечения сообщения по текучей среде с подачей в каждую лунку и с выведением из каждой лунки. Несмотря на то, что на фигуре 14 показано, что каждая лунка 112 для клеток в планшете 110 для культивирования клеток содержит либо концентрические канавки 117, либо содержит микрофлюидный канал 118, специалисту в данной области техники будет понятно, что необязательно, чтобы каждая лунка 112 была выполнена таким образом, и что возможно, чтобы одна или более лунок 12 не содержали концентрические канавки 117 и/или не содержали микрофлюидный канал 118. При необходимости некоторые из лунок 112 могут быть пустыми и не использоваться.

В определенных вариантах осуществления неоднородная поверхность образована с помощью одной или более канавок, которые имеют форму волн и проходят по основанию лунки.

В определенных вариантах осуществления неоднородная поверхность содержит множество углублений. Обычно углубления будут иметь закрытое дно и открытую верхнюю часть. Углубления выполняют функцию удерживания отдельных сфероидов с обеспечением снижения степени или предотвращения их агломерации. Размер углублений будет, как правило, соответствовать максимальному диаметру сфероида ±10% так что сфероиды могут удерживаться или содержаться в отверстиях. Неоднородная поверхность может содержать 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 или 200 или более углублений, распределенных по дну лунки. Неоднородная поверхность может содержать от 130 до 160 углублений, распределенных по дну лунки. Неоднородная поверхность может содержать от 130 до 150 углублений, распределенных по дну лунки. Неоднородная поверхность может содержать от 130 до 140 углублений, распределенных по дну лунки. Как правило, форма углублений может предусматривать плоское дно, быть U-образной, V-образной или V-образной с плоским дном и т. п. Форма углублений не является особенно ограниченной, при условии, что отверстия способны вместить сфероид с максимальным диаметром ±10% с целью удерживания отдельных сфероидов. В определенных вариантах осуществления глубина и ширина углублений составляет от приблизительно 200 до приблизительно 1000 мкм, соответственно, от приблизительно 600 до приблизительно 1000 мкм. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере 70%, 80% или 90% или более основания лунки будет занято углублениями.

Возвращаясь к фигуре 16, на ней показан планшет 120 для культивирования клеток, содержащий лунку 122 с множеством углублений 126 в ее основании. Углубления имеют закрытое дно и открытую верхнюю часть. Максимальная ширина каждого углубления оставляет приблизительно 0,8 мм, глубина канавок составляет приблизительно 0,5 мм. Угол между противоположными сторонами углублений составляет приблизительно 118 градусов. Несмотря на то, что множество углублений показаны таким образом, что они имеют одинаковую форму, предполагается, что могут быть использованы углубления с разными формами. Например, основание лунки может содержать множество углублений, у которых форма одного или более углублений является разной. Таким образом, основание лунки может содержать множество углублений, содержащее два или более углубления с плоским дном, U-образные, V-образные или V-образные с плоским дном и т. п.

На фигуре 17 показан схематический вид сверху планшета 120 для культивирования клеток, показанного на фигуре 16. Радиус планшета 120 для культивирования клеток составляет приблизительно 8 мм. Радиус основания лунки 122, содержащей множество углублений 126, составляет приблизительно 5,8 мм. Радиус каждого углубления 26 составляет приблизительно 0,4 мм.

Возвращаясь к фигуре 18, на ней показан схематический вид сверху планшета 121 для культивирования клеток в виде многолуночного планшета. Планшет 121 для культивирования клеток содержит множество лунок 122, при этом лунки содержат либо множество углублений 127, либо содержат микрофлюидный канал 128. Лунки 122 линейно расположены по рядам. Ряд может быть выполнен с возможностью содержания по меньшей мере одной лунки, содержащей множество отверстий 127. Ряд может быть выполнен с возможностью содержания по меньшей мере одной лунки, содержащей множество углублений 127, и по меньшей мере одной лунки, содержащей микрофлюидный канал 128, как показано на фигуре 14. Канал 129 соединяет лунку, содержащую множество углублений 127, и лунку, содержащую микрофлюидный канал 128. Каждая лунка содержит впускное отверстие и выпускное отверстие для обеспечения сообщения по текучей среде с подачей в каждую лунку и с выведением из каждой лунки.

Несмотря на то, что на фигуре 18 показано, что каждая лунка 122 в планшете 121 для культивирования клеток содержит либо углубления 127, либо содержит микрофлюидный канал 128, специалисту в данной области техники будет понятно, что необязательно, чтобы каждая лунка 122 была выполнена таким образом, и что возможно, чтобы одна или более лунок 122 не содержали углубления 127 и/или не содержали микрофлюидный канал 128. При необходимости некоторые из лунок 122 могут быть пустыми и не использоваться.

Глубина множества лунок при использовании в соответствии с настоящим изобретением не должна быть одинаковой по всему планшету для культивирования клеток, и предполагается, что лунки могут иметь разную глубину. В одном варианте осуществления лунка, содержащая неоднородную поверхность или углубления, имеет глубину, которая больше, чем у лунки, содержащей вставку. Канал, соединяющий по меньшей мере две лунки, может располагаться на такой же высоте, что и канал, расположенный на разных расстояниях от основания по меньшей мере двух лунок для клеток. Данная конфигурация обеспечивает то, что поток текучей среды, поступающий в лунку, не нарушает спокойного состояния сфероидов, удерживаемых на неоднородной поверхности, или не тревожит их, при этом обеспечивает то, чтобы текучая среда могла все еще проходить через проницаемую мембрану вставки.

Данная конфигурация представлена на фигуре 15, где показан планшет 110 для культивирования клеток, содержащий первую лунку 112a с множеством канавок 116 в ее основании и вторую лунку 112b с микрофлюидным каналом 118 в ней. Первая лунка 112a имеет глубину, которая больше, чем у второй лунки 112b. Первая лунка 112a имеет глубину, составляющую приблизительно 20 мм, а вторая лунка 112b для клеток имеет глубину, составляющую приблизительно 18,3 мм. Канал 119 находится в сообщении по текучей среде с каждой из лунок 112a и 112b. Канал 119 расположен дальше от основания первой лунки 112a по сравнению со второй лункой 112b.

Данная конфигурация также представлена на фигуре 19, где показан планшет 120 для культивирования клеток, содержащий первую лунку 122a с множеством углублений 126 в ее основании и вторую лунку 122b с микрофлюидным каналом 128 в ней. Первая лунка 122a имеет глубину, которая больше, чем у второй лунки 122b. Первая лунка 122a имеет глубину, составляющую приблизительно 20 мм, а вторая лунка 112b имеет глубину, составляющую приблизительно 18,3 мм. Канал 129 находится в сообщении по текучей среде с каждой из лунок 122a и 122b. Канал 129 расположен дальше от основания первой лунки 122a по сравнению со второй лункой 122b.

Источники клеток

В настоящем изобретении используют разные источники клеток. В одном варианте осуществления настоящее изобретение не включает стадию выделения или получения образца клеток от субъекта. Клетки могут быть криоконсервированными. Клетки могут находиться в трехмерной культуре. Клетки могут быть представлены в форме сфероидов. Клетки могут активно делиться. Клетки можно культивировать в среде для культивирования клеток (например, содержащей питательные вещества (например, белки, пептиды, аминокислоты), источник энергии (например, углеводы), основные металлы и минеральные вещества (например, кальций, магний, железо, фосфаты, сульфаты), буферные средства (например, фосфаты, ацетаты), индикаторы изменения pH (например, феноловый красный, бромкрезоловый пурпурный), селективные средства (например, химические соединения, противомикробные средства) и т. д.). Среда для культивирования одиночных клеток может быть использована для выращивания клеток одинаковых или разных типов. Разные среды для культивирования клеток могут быть использованы для выращивания разных типов клеток. Поскольку среда для культивирования клеток циркулирует в соответствии с настоящим изобретением, то будет происходить смешивание разных сред для культивирования клеток.

В некоторых вариантах осуществления одно или более средств добавляют в среду для культивирования клеток или среды для культивирования клеток. Клетки можно выделять из ткани или текучей среды с помощью способов, хорошо известных в данной области техники. Клетки можно получить в результате дифференцировки из стволовых клеток, таких как эмбриональные стволовые клетки или индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, или непосредственно получить в результате дифференцировки из соматических клеток. Клетки могут представлять собой встречающиеся в природе клетки или измененные клетки (например, клетку, содержащую одно или более не встречающихся в природе генетических изменений). Клетка может представлять собой клетку с патологией или клетку модели заболевания. Например, клетка может представлять собой раковую клетку или клетку, которая может быть индуцирована в гиперпролиферативное состояние (например, трансформированные клетки).

Клетки могут быть получены от субъектов-людей или субъектов-животных или из клеток человека или животного, в том числе любого из совокупности видов млекопитающих, предпочтительно человека, но в том числе из крысы, мыши, свиньи, кролика и приматов, отличных от человека, и т. п., или происходить из них. Клетки и линии клеток можно получать из коммерческих источников. Клетки могут быть получены из любого требуемого типа ткани или органа, в том числе без ограничения из надпочечника, мочевого пузыря, кровеносного сосуда, кости, костного мозга, головного мозга, хряща, шейки матки, роговицы, эндометрия, пищевода, гастроинтестинального тракта, иммунной системы (например, T-лимфоциты, B-лимфоциты, лейкоциты, макрофаги и дендритные клетки), печени, легкого, лимфатической системы, мышцы (например, сердечной мышцы), нервной ткани, яичника, поджелудочной железы (например, островковые клетки), гипофиза, предстательной железы, почки, слюнной железы, кожи, сухожилия, яичка и щитовидной железы, или происходить из них.

Одним типом клеток, представляющим особый интерес, являются клетки легкого, в том числе клетки легочного эпителия. Клетки бронхиального эпителия и/или эпителия дыхательных путей являются особенно применимыми в настоящем изобретении. Клетки бронхиального эпителия человека можно отбирать посредством браш-биопсии легких донора в ходе процедуры бронхоскопии. В одном варианте осуществления клетки легкого представляют собой нормальные клетки бронхиального эпителия человека (NHBE). Клетки легочного эпителия можно культивировать в виде монослоя недифференцированных клеток, или из них можно дополнительно сформировать органотипическую ткань, подобную легочному эпителию, на поверхности раздела жидкость-воздух. Клетки легочного эпителия можно получать от субъектов-людей или субъектов-животных с разными патологиями, в том числе от субъектов, классифицированных как курящие или некурящие.

Другим типом клеток, представляющим особый интерес, являются клетки печени. В одном варианте осуществления используемыми клетками являются гепатоциты. Гепатоциты представляют собой клетки печени, которые составляют 70-85% цитоплазматической массы печени. Функциональность гепатоцитов сильно зависит от их способности образовывать фенотип полярности, который устанавливается только при 3-мерном культивировании. Одним источником клеток печени являются первичные гепатоциты, которые представляют собой модель in vitro, широко используемую для исследования многочисленных аспектов физиологии и патологии печени. Методика, используемая для выделения гепатоцитов человека, может основываться на двухстадийной перфузии донорской печени коллагеназой. Однако данные клетки не экспрессируют ферменты метаболизма в течение более 5 дней. Другим ограничением является их низкая жизнеспособность. Эти недостатки можно преодолеть путем применения альтернативных, долгоживущих линий клеток печени, таких как линии клеток-предшественников печени человека или животного. Одним таким примером линии клеток-предшественников печени человека является линия клеток HepaRG (ThermoFisher Scientific). Клетки HepaRG сохраняют многие характеристики первичных гепатоцитов человека. Они характеризуются более высокой экспрессией печеночноспецифических генов и генов метаболизма и большей продолжительностью жизни по сравнению с первичными гепатоцитами. Реорганизация клеток HepaRG в 3-мерные сфероиды дополнительно увеличивает как продолжительность их жизни, так и метаболические способности, давая возможность предположить, что сфероиды могут предоставить лучшую альтернативную модель печени in vitro для токсикологического тестирования. Сфероиды из клеток печени также можно создавать из смеси первичных гепатоцитов и звездчатых клеток печени или первичных гепатоцитов и стволовых клеток, полученных из жировой ткани.

В одном варианте осуществления клетка легкого представляет собой клетку легочного эпителия, такую как клетка бронхиального эпителия и/или эпителия дыхательных путей.

В одном варианте осуществления клетка печени представляет собой клетку HepaRG, предпочтительно клетку сфероида HepaRG.

Комбинации клеток

Также рассматривается применение комбинаций любых клеток, описанных в данном документе. Рассматривается применение комбинаций любых клеток, описанных в данном документе, в планшете для культивирования клеток или в системе или устройстве, содержащих планшет для культивирования клеток. Одной иллюстративной комбинацией клеток является комбинация клеток печени и клеток легкого. Также рассматривается комбинация клетки легочного эпителия, такой как клетка бронхиального эпителия и/или эпителия дыхательных путей, и клетки печени, такой как клетка HepaRG, предпочтительно клетки сфероида HepaRG. При необходимости дополнительные клетки могут быть использованы вместе с этой комбинацией.

Разные клетки в комбинации будут, как правило, культивироваться в отдельных лунках.

В планшете для культивирования клеток, содержащем по меньшей мере две лунки или по меньшей мере две вставки, каждая из лунок или вставок могут содержать одинаковый или разный тип клеток. Соответственно, каждая из по меньшей мере двух лунок или вставок содержит разный тип клеток. Разный тип клеток может представлять собой разную линию клеток. Разный тип клеток может представлять собой разную клетку или ткань. В одном иллюстративном варианте осуществления разные типы клеток в планшете для культивирования клеток представляют собой клетки легкого и клетки печени.

Одно преимущество настоящего изобретения заключается в том, что влияние первого типа клеток на второй тип клеток может быть изучено, необязательно в режиме реального времени, по мере того, как текучая среда от первого типа клеток достигнет второго типа клеток, поскольку она циркулирует в планшете для культивирования клеток, описанном в данном документе.

Другое преимущество настоящего изобретения заключается в том, что влияние второго типа клеток на первый тип клеток может быть изучено, необязательно в режиме реального времени, по мере того, как текучая среда от второго типа клеток достигнет первого типа клеток, поскольку она циркулирует в планшете для культивирования клеток, описанном в данном документе.

Другое преимущество настоящего изобретения заключается в том, что может быть изучено влияние метаболизируемого средства из первого типа клеток на второй тип клеток, необязательно в режиме реального времени.

Другое преимущество настоящего изобретения заключается в том, что может быть изучено влияние метаболизируемого средства из второго типа клеток на первый тип клеток, необязательно в режиме реального времени.

Другое преимущество настоящего изобретения заключается в том, что может быть изучено влияние метаболизируемого средства из первого типа клеток и метаболизируемого средства из второго типа клеток на третий тип клеток и т.д., необязательно в режиме реального времени.

Другое преимущество настоящего изобретения заключается в том, что может быть изучено влияние метаболизируемого средства из комбинаций типов клеток, необязательно в режиме реального времени.

Другое преимущество настоящего изобретения заключается в том, что может быть изучено влияние воздействия двух или более типов клеток на средство, необязательно в режиме реального времени.

3-мерные культуры клеток

Настоящее изобретение включает применение «3-мерного культивирования клеток», которое включает любой способ, обеспечивающий культивирование клетки в 3-х измерениях с применением или без применения матрицы или подложки, такой как проницаемая мембрана во вставке. Был разработан ряд разных способов 3-мерного культивирования клеток, в том числе сфероидные культуры и органотипические культуры. 3-мерные клетки можно выращивать и/или поддерживать в планшете для культивирования клеток, описанном в данном документе.

Термин «сфероид» предполагает значение, обычно понимаемое в данной области техники, которое представлено одиночной клеткой, делящейся с образованием 3-мерной шарообразной структуры, либо 3-мерным агрегатом нескольких клеток с применением или без применения матрицы или подложки для поддержания 3-мерного роста клеток в пределах сфероида. 3-Мерный сфероид может представлять собой адгезивный сфероид или сфероид, растущий в суспензии.

В некоторых вариантах осуществления сфероид содержит один тип клеток. В некоторых вариантах осуществления сфероид содержит более одного типа клеток. В некоторых вариантах осуществления, где выращивается более одного сфероида, каждый сфероид может принадлежать к одному и тому же типу, в то время как в других вариантах осуществления выращивают два или более разных типов сфероидов.

3-Мерные сфероиды в большей степени повторяют ткань in vivo в том, что касается их клеточной коммуникации и формирования внеклеточных матриксов. Эти матриксы помогают клеткам перемещаться в пределах сфероида подобно тому, как клетки перемещаются в живой ткани. Таким образом, сфероиды представляют собой намного улучшенные модели дифференцировки, выживания, миграции клеток, поляризации клеток, экспрессии генов и роста.

Сфероиды можно собирать и изучать с помощью разных способов, хорошо известных в данной области техники, в том числе колориметрического, флуоресцентного и люминесцентного анализов с измерениями с помощью планшет-ридера, или их можно без труда оценивать с помощью микроскопии. Дополнительные методики включают вестерн-, нозерн- или Саузерн-блоттинг, гистологические методики (например, иммуногистохимический анализ, гибридизацию in situ, иммунофлуоресценцию) и т. п. Также рассматривается применение способов оптической визуализации, таких как методики инвертированной светлопольной микроскопии, флуоресцентной микроскопии, однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (SPECT), позитронно-эмиссионной томографии (PET), магнитно-резонансной визуализации (MRI) и люминесцентной визуализации по методу Черенкова (CLI).

Варианты применения 3-мерных сфероидов включают изучение пролиферации клеток и тканей in vitro в среде, которая наиболее приближена к существующей in vivo, скрининг соединений или средств, токсикологические анализы, клеточную терапию, доставку клеток, доставку средств, биохимическое замещение, получение биологически активных молекул, тканевую инженерию, получение биоматериалов и клинические испытания и т. п.

Применение сфероидов в 3-мерном культивировании клеток в целом рассматривается в Expert Opin. Drug Discov. (2015) 10, 519-540.

3-Мерные системы культивирования органов могут быть использованы в настоящем изобретении и они позволяют изучать функционирование органов. Можно изучать ответ на определенные раздражители, ответ на одно или более средств и фармакокинетическую активность таких средств. Миниатюризированные системы 3-мерного культивирования клеток предоставляют возможность комплексного изучения групп клеток или органов. Это позволяет воспроизводить сложность взаимодействия между разными тканями. 3-Мерное культивирование органов может быть органотипическим, что означает, что он стремится воспроизвести основные функции органа или системы органов. Также предусматривается миниатюризированная жидкостная система, соединяющая лунки.

Планшет для культивирования клеток может иметь по меньшей мере одну физиологическую функцию по меньшей мере одного типа ткани, или более предпочтительно имеет по меньшей мере одну физиологическую функцию по меньшей мере двух разных типов тканей.

3-Мерные культуры печени

Печень играет ключевую роль в детоксикации, метаболизме углеводов, липидов и белков, а также в биотрансформации эндогенных и экзогенных веществ. Функциональные возможности печени тесно связаны со сборкой высокоспециализированных клеток, большинство из которых представляют собой гепатоциты, встроенных в сложную 3-мерную структуру, состоящую из так называемых долек. Биотрансформация соединений, как правило, приводит к образованию нетоксичных и лучше растворимых метаболитов, однако иногда могут образовываться более токсичные метаболиты, вызывающие гепатотоксичность.

Гепатоциты можно трансформировать в 3-х мерные структуры посредством использования различных способов, в том числе путем применения многослойной культуры, подложки из твердых материалов, таких как полистирольные подложки, гидрогелей, таких как коллаген I типа, или самостоятельной сборки гепатоцитов в сфероиды.

При том, что используемые свежевыделенные первичные гепатоциты и клетки легкого человека могут быть предпочтительными типами клеток, их доступность ограничена. Другие варианты выбора линий клеток печени человека включают HepG2 и Hep2/C3A. Особенно подходящим источником клеток является линия клеток HepaRG. Другими источниками гепатоцитов человека являются гепатоциты, происходящие из эмбриональных стволовых клеток человека (hESC), и гепатоциты, происходящие из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC).

В одном варианте осуществления сфероид представляет собой клетку печени или получен из нее с образованием 3-мерного сфероида из клеток печени. Такие сфероиды из клеток печени можно получать с использованием различных способов, известных из уровня техники и описанных, например, в ALTEX (2014) 31, 441-477 и Toxicol. Sci. Off. J. Soc. Toxicol. (2013) 133, 67-78.

3-Мерные культуры легкого

Поскольку морфология респираторного тракта изменяется от верхних к нижним дыхательным путям, были получены многие разные установившиеся модели культур клеток с применением первичных клеток или линий клеток, и их применение рассматривается в настоящем изобретении. Выбор конкретной клетки или линии клеток с целью применения будет зависеть от участка респираторного тракта, представляющего интерес для данного исследования.

Поскольку поверхность легкого подвергается воздействию воздуха, клеточную модель можно культивировать на поверхности раздела жидкость-воздух с целью более реалистичной имитации легкого.

В одном варианте осуществления сфероид представляет собой клетку легкого или получен из нее с образованием 3-мерного сфероида из клеток легкого. Такие сфероиды из клеток легкого можно получать с помощью различных способов, известных из уровня техники, таких как описанные в ALTEX (2014) 31, 441-477 и Toxicol. Sci. Off. J. Soc. Toxicol. (2013) 133, 67-78.

Устройство для отбора проб текучей среды для культивирования клеток при воздействии

Планшет для культивирования клеток может представлять собой компонент более крупного устройства, такого как устройство для отбора образцов, соответственно, устройство для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии. Текучая среда, которая вступает контакт с клетками из по меньшей мере двух лунок, может циркулировать в устройстве или системе, и из нее можно отбирать образцы и необязательно измерять и/или анализировать, если это необходимо. С целью доставки образцов текучей среды из планшета для культивирования клеток в планшет для образцов второй (для отбора проб) насос может быть использован для обеспечения выведения текучей среды из планшета для культивирования клеток в планшет для образцов. Второй насос описан выше. Как правило, устройство может содержать три или более насосов. По меньшей мере один насос можно применять для отбора образцов, по меньшей мере один насос можно применять для повторного заполнения текучей средой и по меньшей мере один насос можно применять для обеспечения циркуляции текучей среды через планшет (см., например, фигуру 10). Преимущественно устройство для образцов представляет собой автоматическое устройство для отбора образцов, которое сводит к минимуму ручное взаимодействие с повышением производительности и снижением риска контаминации. В определенных вариантах осуществления устройство для отбора образцов представляет собой высокопроизводительное устройство для отбора образцов. В определенных вариантах осуществления устройство для отбора образцов выполнено с возможностью отбора образцов в режиме реального времени. В определенных вариантах осуществления устройство для отбора образцов выполнено с возможностью высокопроизводительного отбора образцов в режиме реального времени.

В некоторых вариантах осуществления устройство для отбора образцов содержит множество (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или больше) планшетов для культивирования клеток и множество (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или более) планшетов для образцов.

В некоторых вариантах осуществления устройство для отбора образцов содержит инкубатор для размещения планшета для культивирования клеток для поддержания его в оптимальных условиях культивирования (например, температуры, газообразной среды и влажности).

В некоторых вариантах осуществления устройство для отбора образцов размещено в инкубаторе.

В некоторых вариантах осуществления устройство для отбора образцов содержит один или более насосов или других компонентов, предназначенных для доставки или повторной доставки текучей среды к планшету (планшетам) для культивирования клеток.

В некоторых вариантах осуществления устройство для отбора образцов содержит один или более компонентов с автоматизированным управлением (например, дозаторов, держателей, манипуляторов планшетов и т. п.) для автоматизации применения и/или анализа устройств для культивирования или обращения с ними.

В некоторых вариантах осуществления устройство для отбора образцов содержит один или более резервуаров для доставки или восполнения (свежей или неиспользованной) текучей среды в устройство для отбора образцов.

В некоторых вариантах осуществления устройство для отбора образцов содержит один или более резервуаров для очистки, предназначенных для доставки очищающей текучей среды в устройство.

Устройство для отбора образцов может быть полностью или частично автоматизированным.

Устройство для отбора образцов содержит планшет для культивирования клеток, описанный в данном документе. Для обеспечения передачи текучей среды между планшетом для культивирования клеток и планшетом для образцов второй насос может быть использован для выведения текучей среды из планшета для культивирования клеток в планшет для образцов. Второй насос может обеспечивать сообщение с планшетом для культивирования клеток путем подгонки канала к дополнительному удлинению второго насоса. Альтернативно второй канал может соединяться или сообщаться с (первым) каналом в планшете для культивирования клеток, как это показано на фиг. 8 посредством номера позиции 64. Второй канал может соединяться или сообщаться со вторым насосом, который выполнен с возможностью выведения текучей среды из лунок в планшет для культивирования клеток и в планшет для образцов.

Устройство для отбора образцов может дополнительно содержать резервуар для хранения текучей среды в устройстве, при этом указанный резервуар находится в сообщении по текучей среде с лунками.

В определенных вариантах осуществления он может дополнительно содержать по меньшей мере один дополнительный насос, приспособленный для обеспечения выведения текучей среды из резервуара с повторным заполнением лунок планшета для культивирования клеток и/или планшета для сбора образцов. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере один дополнительный насос приспособлен для повторного заполнения лунок планшета для культивирования клеток таким же объемом текучей среды, который отбирают в лунки планшета для сбора образцов. В определенных вариантах осуществления он дополнительно содержит дозатор, приспособленный для переноса текучей среды в лунки планшета для сбора образца. Один или более образцов в одной или более разных точках времени для последовательно расположенных лунок в планшете для культивирования клеток могут быть отобраны с целью проведения анализа.

В определенных вариантах осуществления устройство для отбора образцов может содержать компьютеризованный контроллер, выполненный с возможностью автоматического управления функционированием устройства. В определенных вариантах осуществления оно может содержать средства для определения уровней текучей среды в устройстве.

Конкретный неограничивающий пример устройства для отбора образцов, в которое может быть вставлен планшет для культивирования клеток и планшет для образцов, более подробно описан далее. На фигуре 8 изображено устройство 60 для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии, в которое может быть вставлен планшета для культивирования клеток в конфигурации по настоящему изобретению и планшет для образцов. Устройство 60 для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии содержит первый резервуар 61, который содержит текучую среду, используемую для подачи текучей среды в устройство для отбора образцов с целью циркуляции в нем. Второй резервуар 75 может быть соединен с насосом 66a, таким как перистальтический насос, с помощью коннекторов 65. Между коннекторами 65 и насосом 66a можно использовать впускные клапаны 68a, такие как электроклапаны, для выбора того, какой резервуар использовать. Между насосом 66a и планшетом 62 для культивирования клеток могут быть встроены выпускные клапаны 68b для управления потоком текучей среды из насоса 66a в планшет 62 для культивирования клеток. Данная конфигурация позволяет точно управлять потоком и количеством текучей среды, доставляемой в планшет 62 для культивирования клеток. Жидкость циркулирует в планшете 62 для культивирования клеток, описанном в данном документе. Для доставки образцов текучей среды из планшета 62 для культивирования клеток в планшет 63 для образцов второй канал 64 можно соединяться или сообщаться с первым каналом 23 в планшете для культивирования клеток. Второй насос 66b может быть использован для перекачивания текучей среды из 62 планшета для культивирования клеток в планшет 63 для образцов. Текучая среда может передаваться в планшет 63 для образцов с помощью дозатора 67, такого как многоканальный дозатор. Дозатор 67 при необходимости может быть использован для передачи текучей среды из устройства для отбора образцов с целью проведения дополнительного анализа. Дозатор 67 может представлять собой автоматический дозатор, необязательно содержащий один или более датчиков 72 и необязательно один или более электрических двигателей 74, предназначенных для управления его функционированием. Может обеспечиваться горизонтальное перемещение дозатора 67, при этом текучая среда может перемещаться к последовательно расположенным лункам в планшете 63 для образцов. Показаны коннекторы 77. Также показан резервуар для удаления отходов 78. В определенных вариантах осуществления скорость потока может быть одинаковой во всех каналах. Каждый из используемых разных насосов может иметь свои собственные параметры накачивания. Далее более подробно описан дополнительный неограничивающий пример устройства для отбора образцов, в которое может быть вставлен планшет для культивирования клеток и планшет для образцов, которое показано на фигуре 10. В данном примере показаны три насоса. Насос 1 используется для повторного заполнения резервуара. Насос 2 используется для обеспечения циркуляции текучей среды в планшете. Насос 3 используется для отбора образцов.

Планшет 62 для культивирования клеток и планшет 63 для образцов могут иметь одинаковое количество рядов лунок или планшет 63 для образцов может иметь меньшее или большее количество рядов лунок. Образец отбирают из ряда всех лунок, содержащих текучую среду, в планшете 62 для культивирования клеток и доставляют в одну или более лунок планшета 63 для образцов. Множество аликвот одного и того же образца могут быть распределены во множество лунок планшета 63 для образцов, которые все, соответственно, расположены в одном и том же ряду. Или же множество образцов могут быть отобраны из ряда лунок, содержащих текучую среду, планшета 62 для культивирования клеток в различные временные точки или после воздействия различных средств и перенесены в планшет для образцов 63. Как правило, образец, отобранный из ряда лунок, содержащих текучую среду, планшета 62 для культивирования клеток будет перенесен в соответствующий ряд планшета 63 для образцов, за счет чего можно отслеживать перемещение образцов из планшета 62 для культивирования клеток в планшет 63 для образцов. В качестве примера образец, отобранный из ряда лунок, содержащих текучую среду, планшета 62 для культивирования клеток в ряду 1 будет перенесен в одну или более лунок планшета 63 для образцов в ряду 1. В качестве дополнительного примера образец, отобранный из ряда лунок, содержащих текучую среду, планшета 62 для культивирования клеток в ряду 2 будет перенесен в одну или более лунок планшета 63 для образцов в ряду 2 и т. д.

Параметры сбора образцов при необходимости могут быть заданы в пользовательском интерфейсе до начала проведения экспериментов.

Устройство может быть использовано для различных областей применения, описанных в данном документе. Например, устройство может быть использовано для изучения влияния одного или более средств в ходе воздействия в режиме реального времени. В качестве дополнительного примера устройство может быть использовано для изучения кинетики воздействия одного или более средств в ходе воздействия в режиме реального времени.

В одном аспекте предусмотрен способ, например полностью или частично автоматизированный способ, предназначенный для отбора образцов среды для культивирования клеток, подвергшихся воздействию одного или более средств, включающий стадии (a) обеспечения устройства для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии, описанного в данном документе; (b) приведения в контакт по меньшей мере одной из лунок со средой для культивирования клеток, содержащей клетки; (c) обеспечения циркуляции среды для культивирования клеток через лунки планшета для культивирования клеток; (d) воздействия на лунки планшета для культивирования клеток по меньшей мере одного средства; и (e) отбора образцов среды для культивирования клеток из планшета для культивирования клеток, где необязательно образцы среды для культивирования клеток отбирают в режиме реального времени в ходе воздействия средства. На стадии (d) лунки многолуночного планшета могут быть подвергнуты воздействию по меньшей мере одного средства в нескольких временных точках. Объем среды для культивирования клеток, отобранный на стадии (e), может составлять от приблизительно 50 до приблизительно 200 мкл. Способ может включать дополнительную стадию (f) определения влияния средства (средств) на отобранные в качестве образцов клетки.

Также раскрыто применение устройства для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии для отбора образцов клеток из одной или более лунок планшета для культивирования клеток.

Также раскрыто применение устройства для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии для отбора среды для культивирования клеток, подвергнутых влиянию одного или более средств из одной или более лунок планшета для культивирования клеток и скрининга клеток в среде для культивирования клеток для определения влияния одного или более средств на клетки.

Скрининг

Планшет для культивирования клеток или устройство для отбора образцов можно использовать в отборе образцов или скрининге необязательно в режиме реального времени. Влияние одного или более средств на клетки, содержащиеся в планшете для культивирования клеток, можно определить необязательно в режиме реального времени. Планшет для культивирования клеток и/или устройство для отбора образцов можно использовать, например, в разработке средств/лекарственных средств, определении характеристик средств/лекарственных средств, исследовании эффективности и исследовании токсичность и т. п. Такое исследование включает без ограничения оценку фармакологического эффекта, оценку канцерогенности, оценку характеристик средств для медицинской визуализации, оценку времени полужизни, оценку радиационной безопасности, исследование генотоксичности, исследование иммунотоксичности, исследование воздействия на репродуктивную систему и развитие эмбриона, оценку лекарственных взаимодействий/взаимодействий средств, оценку дозы, оценку поглощения, оценку метаболизма, исследования элиминации и т. п. Для определенных тестов можно использовать определенные типы клеток (например, гепатоциты для исследования гепатотоксичности, эпителиальные клетки проксимальных почечных канальцев для исследований нефротоксичности, клетки сосудистого эндотелия для исследования ангитоксичности, нейроны и клетки глии для исследования нейротоксичности, кардиомиоциты для исследования кардиотоксичности).

В одном аспекте описан способ in vitro оценки реакции клетки или ткани на определенное средство, при этом способ включает: (i) приведение клетки или ткани, содержащейся в планшете для культивирования клеток или устройстве для отбора образцов, описанных в данном документе, в контакт с по меньшей мере одним средством и (ii) измерение одной или более реакций после контакта с по меньшей мере одним средством; где различие в одной или более реакциях до и после контакта с по меньшей мере одним средством указывает на то, что средство модулирует реакцию клетки или ткани.

В дополнительном аспекте описан способ in vitro оценки реакции двух или более клеток, тканей или органов на определенное средство, при этом способ включает: (i) приведение по меньшей мере одного из клеток, тканей или органов, описанных в данном документе, в контакт с по меньшей мере одним средством и (ii) измерение одной или более реакций в одной (одном) или более клетках, тканях или органах после контакта с по меньшей мере одним средством; где различие в одной или более реакциях в одной или более клетках до и после контакта с по меньшей мере одним средством указывает на то, что средство модулирует реакцию по меньшей мере одной клетки, ткани или одного органа.

Соответственно, измеряют или определяют влияние или проникновение по меньшей мере одного средства в клетку или ткань. Соответственно, измеряют или определяют биоактивацию по меньшей мере одного средства в клетке или ткани. Соответственно, измеряют или определяют метаболизм по меньшей мере одного средства в клетке или ткани. Эти стадии можно проводить одновременно или последовательно относительно друг друга.

Влияние одного или более средств на проникновение такого средства, как аэрозоль, в одну (один) или более клеток, тканей или органов и его дополнительной биоактивации или метаболизма в другой клетке или ткани может быть определено с использованием способов, описанных в данном документе.

Средство может быть добавлено в одну или более лунок планшета для культивирования клеток, описанного в данном документе, и/или оно может быть добавлено в канал планшета для культивирования клеток, а его влияние на культивируемую клетку или ткань можно отслеживать или определять. При необходимости средство также может быть добавлено в резервуар (резервуары). Примеры эффектов, которые можно измерять, включают поглощение кислорода, продуцирование диоксида углерода, жизнеспособность клеток, экспрессию белка, активность фермента, проникновение, функцию проницаемости барьера, продуцирование сурфактанта, реакцию на цитокины, функции транспортеров, экспрессию цитохрома P450, секрецию альбумина и т. п.

Одна или более лунок планшета для культивирования клеток может быть подвергнута влиянию аэрозоля, при этом его влияние на культивируемую клетку или ткань можно отслеживать или определять. Примеры эффектов, которые можно измерять, включают поглощение кислорода, продуцирование диоксида углерода, жизнеспособность клеток, экспрессию белка, активность фермента, проникновение, функцию проницаемости барьера, продуцирование сурфактанта, реакцию на цитокины, функции транспортеров, экспрессию цитохрома P450, секрецию альбумина и т. п.

Параллельно можно проводить несколько анализов с разными концентрациями средства с получением различающейся реакции на разные концентрации. Как известно из уровня техники, в способе определения эффективной концентрации средства обычно используют диапазон концентраций, получаемый в результате разведений 1:10 или других разведений по логарифмической шкале. В случае необходимости концентрации можно дополнительно скорректировать посредством второй серии разведений. Как правило, одна из этих концентраций служит в качестве отрицательного контроля.

Средство

Средство может представлять собой любое представляющее интерес соединение и включает низкомолекулярные органические соединения, полипептиды, пептиды, относительно высокомолекулярные углеводы, полинуклеотиды, жирные кислоты и липиды, наночастицы, аэрозоль или один или более компонентов аэрозоля и т. п., лекарственное средство, токсин, патоген, антиген, антитело и малую молекулу и т. п. Средства можно подвергать скринингу по отдельности или в группах или комбинаторных библиотеках соединений. Средства можно получать из широкого разнообразия источников, в том числе из библиотек синтетических или встречающихся в природе соединений. Можно использовать библиотеки природных соединений в виде бактериальных, грибных, растительных и животных экстрактов. Природные или полученные синтетическим путем библиотеки и соединения, модифицированные посредством традиционных химических, физических и биохимических способов, можно использовать для получения комбинаторных библиотек. Известные фармакологические средства можно подвергать направленным или случайным химическим модификациям, таким как ацилирование, алкилирование, этерификация, превращение в кислотную форму, с получением структурных аналогов для скрининга. При скрининге с применением комбинаторной библиотеки можно подвергать скринингу большую библиотеку химически сходных или отличающихся средств. При комбинаторном скрининге количество обнаруженных хитов является пропорциональным количеству исследуемых средств. Большое количество соединений, которое может достигать нескольких тысяч тестируемых в день соединений, можно подвергнуть скринингу, в ходе которого можно использовать лабораторное автоматизированное оборудование и робототехнику. В уровне техники можно найти много примеров способов синтеза молекулярных библиотек. Низкомолекулярное органическое соединение включает соединение с молекулярной массой, составляющей менее приблизительно 5000, как правило, менее приблизительно 2500, как правило, менее приблизительно 2000, чаще менее приблизительно 1500, предпочтительно от приблизительно 100 до приблизительно 1000. Низкомолекулярные органические соединения могут представлять собой биологические либо синтетические органические соединения. Атомы, присутствующие в низкомолекулярном органическом соединении, обычно расположены в группе, состоящей из атомов углерода, водорода, кислорода и азота, и могут включать атомы галогенов, бора, фосфора, селена и серы, если они представлены в фармацевтически приемлемой форме. Как правило, атомы кислорода, азота, серы или фосфора, если такие присутствуют, связаны с атомом углерода, или друг с другом с одним или более из них, или с атомом водорода с образованием различных функциональных групп, таких как, например, карбоновые кислоты, спирты, тиолы, карбоксамиды, карбаматы, сложные эфиры карбоновых кислот, амиды, простые эфиры, тиоэфиры, сложные тиоэфиры, фосфаты, фосфонаты, олефины, кетоны, амины, альдегиды и т. п. Низкомолекулярные органические соединения в качестве термина, используемого в данном документе, также включают низкомолекулярные пептиды, низкомолекулярные олигонуклеотиды, низкомолекулярные полисахариды, жирные кислоты, липиды и т. п., имеющие молекулярную массу, составляющую менее приблизительно 5000. Примеры фамацевтических средств описаны в The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman and Gilman, McGraw-Hill, New York, N.Y., (1996), Ninth edition. Средство может представлять собой токсин.

Анализу можно подвергать средства в растворе и твердых образцах, которые можно растворять в подходящем растворителе. Средства в газообразной форме можно также подвергать анализу посредством воздействия на образцы газом в течение некоторого периода времени. Образцы, представляющие интерес, включают образцы окружающей среды, биологические образцы, производственные образцы, библиотеки соединений, а также синтетические и встречающиеся в природе соединения.

Можно подвергать скринингу полипептиды, которые имеют молекулярную массу, составляющую по меньшей мере приблизительно 5000, как правило, по меньшей мере приблизительно 10000. Тестируемые полипептиды, как правило, будут иметь молекулярную массу от приблизительно 5000 до приблизительно 5000000 или больше, как правило, будут иметь молекулярную массу от приблизительно 20000 до приблизительно 1000000. Можно рассматривать широкое разнообразие полипептидов, как, например, семейство полипептидов, имеющих сходные характерные структурные особенности, полипептидов, имеющих конкретные биологические функции, полипептидов, связанных с определенными микроорганизмами, в частности болезнетворными микроорганизмами. Такие полипептиды включают цитокины или интерлейкины, ферменты, протамины, гистоны, альбумины, иммуноглобулины, склерополипептиды, фосфополипептиды, мукополипептиды, хромополипептиды, липополипептиды, нуклеополипептиды, гликополипептиды, T-клеточные рецепторы, протеогликаны, соматотропин, пролактин, инсулин, пепcин, полипептиды, обнаруживаемые в плазме крови человека, факторы свертывания крови, факторы, определяющие группу крови, полипептидные гормоны, раковые антигены, тканеспецифические антигены, пептидные гормоны, маркеры алиментарного статуса, тканеспецифические антигены и синтетические пептиды, которые могут являться или не являться гликированными.

Полинуклеотиды можно подвергать скринингу. Тестируемый полинуклеотид может представлять собой природное соединение или синтетическое соединение. Полинуклеотиды включают олигонуклеотиды и состоят из природных нуклеотидов, таких как рибонуклеотиды и дезоксирибонуклеотиды, и их производных, хотя также рассматриваются неприродные миметики нуклеотидов, такие как 2'-модифицированные нуклеозиды, пептидные нуклеиновые кислоты и олигомерные нуклеозидфосфонаты. Сравнительно высокомолекулярные полинуклеотиды могут иметь от приблизительно 20 до приблизительно 5000000 или больше нуклеотидов.

Средство может представлять собой низкомолекулярную гидрофобную молекулу, такую как гидрофобную молекулу с молекулярной массой от 146 г/моль до 207 г/моль или от 146 г/моль до 176 г/моль, или органический растворитель, при условии, что органический растворитель не является галогенизированным органическим растворителем, или диметилсульфоксидом, или тетрагидрофураном. В одном варианте осуществления средство содержит алкалоид табака или состоит из него. В другом варианте осуществления средство представляет собой структуру формулы 1:

,

или ее фармацевтически приемлемую соль или их смеси;

или более предпочтительно структуру формулы 2:

,

или ее фармацевтически приемлемую соль или их смеси;

при этом:

z равняется 0 или 1;

R₁ представляет собой Н или C₁-C₇алкил;

R₂ представляет собой H, =O или C₁-C₇алкил;

R₃ представляет собой H, галоген или C₁-C₇алкил;

и пунктирной линией представлены либо

(a) одинарные связи;

(b) одна углерод-углеродная или углерод-азотная двойная связь и остальные одинарные связи; или

(c) две конъюгированные двойные связи, независимо выбранные из углерод-азотной двойной связи и углерод-углеродной двойной связи, и остальные одинарные связи.

Соответственно, средство формулы 2 представляет собой:

,

или

,

или ее фармацевтически приемлемую соль или их смеси.

Соответственно, средство формулы 2 представляет собой:

,

или

,

или ее фармацевтически приемлемую соль или их смеси.

Более предпочтительно средство формулы 1 или формулы 2 представляет собой алкалоид табака.

Более предпочтительно средство формулы 1 или формулы 2 представляет собой никотин, анабазин, норникотин, анатабин, котинин, миосмин, или их фармацевтически приемлемую соль, или их смеси.

Термин «C₁-C₇алкил» относится к прямой цепи и разветвленным насыщенным углеводородным группам, как правило, имеющим от 1 до 7 атомов углерода; более предпочтительно к C₁-C₆алкилу; более предпочтительно C₁-C₃алкилу. Примеры алкильных групп включают метил, этил, н-пропил, изо-пропил, н-бутил, втор-бутил, изо-бутил, т-бутил, пент-1-ил, пент-2-ил, пент-3-ил, 3-метилбут-1-ил, 3-метилбут-2-ил, 2-метилбут-2-ил, 2,2,2-триметилэт-1-ил, н-гексил, н-гептил и т. п. Подходящей алкильной группой является метил.

Термин «галоген» относится к F, Cl, Br или I. Подходящим галогеном является Cl.

Термин «фармацевтически приемлемая соль» относится к солям, которые в объеме медицинской точки зрения являются подходящими для применения в контакте с тканями субъекта без проявления излишних токсичности, раздражения, аллергической реакции и т. п., соизмеримы с целесообразным соотношением польза/риск и являются эффективными для своего предполагаемого применения. Эти соли включают нетоксичные соли присоединения кислоты (в том числе двухосновные соли) и соли оснований. Если соединение или средство является катионным или имеет функциональную группу, которая может быть катионной (например, -NH₂ может представлять собой -NH₃⁺), то соль присоединения кислоты может быть образована с помощью соответствующего аниона. Примеры подходящих неорганических анионов включают без ограничения анионы, полученные из неорганических кислот хлористоводородной кислоты, азотной кислоты, азотистой кислоты, фосфорной кислоты, серной кислоты, сернистой кислоты, бромистоводородной кислоты, йодистоводородной кислоты, фтористоводородной кислоты, фосфорной кислоты и фосфористых кислот. Примеры соответствующих органических анионов включают без ограничения анионы, полученные из следующих органических кислот: 2-ацетилоксибензойной, уксусной, аскорбиновой, аспарагиновой, бензойной, камфорсульфоновой, коричной, лимонной, этилендиаминтетрауксусной, этандисульфоновой, этансульфоновой, фумаровой, глюкгептоновой, глюконовой, глутаминовой, гликолевой, гидроксималеиновой, гидроксинафталинкарбоновой, изэтиновой, молочной, лактобионовой, лауриновой, малеиновой, яблочной, метансульфоновой, слизевой, олеиновой, щавелевой, пальмитиновой, памоевой, пантотеновой, фенилуксусной, фенилсульфоновой, пропионовой, пировиноградной, салициловой, стеариновой, янтарной, сульфаниловой, винной, толуосульфоновой и валериановой. Примеры подходящих полимерных органических анионов включают без ограничения анионы, полученные из следующих полимерных кислот: дигалловой кислоты, карбоксиметилцеллюлозы. Такие соли включают ацетатные, адипатные, аспартатные, бензоатные, безилатные, бикарбонатные, карбонатные, бисульфатные, сульфатные, боратные, камзилатные, цитратные, цикламатные, эдизилатные, эзилатные, формиатные, фумаратные, глюцептатные, глюконатные, глюкуронатные, гексафторфосфонатные, гибензатные, гидроксихлоридные/хлоридные, гидроксибромидные/бромидные, гидроксийодидные/йодидные, изетионатные, лактатные, малатные, малеатные, малонатные, мезилатные, метилсульфонатные, нафтилатные, 2-напсилатные, никотинатные, нитратные, оротатные, оксалатные, пальмиатные, памоатные, фосфатные, гидрофосфатные, дигидрофосфатные, пироглутаматные, сахаратные, стеаратные, сукцинатные, таннатные, тартратные, тозилатные, трифторацетатные и ксинафоатные соли. Например, если соединение является анионным или имеет функциональную группу, которая может быть анионной (например, -COOH может представлять собой -COO^-, или -SO₂H может представлять собой -SO₂), то соль основания может быть образована с помощью соответствующего катиона. Примеры подходящих неорганических катионов включают без ограничения катионы металлов, такие как катионы щелочных или щелочно-земельных металлов, катионы аммония и замещенные аммоний-катионы, а также амины. Примеры подходящих катионов металлов включают натрий (Na⁺), калий (K⁺), магний (Mg²⁺), кальций (Ca²⁺), цинк (Zn²⁺) и алюминий (Al³⁺). Примеры подходящих органических катионов включают без ограничения ион аммония (т. е. NH4⁺) и замещенные аммоний-ионы (например, NH₃R⁺, NH₂R₂⁺, NHR₃⁺, NR₄⁺). Примеры некоторых подходящих замещенных аммоний-ионов представляют собой ионы, полученные из этиламина, диэтиламина, дициклогексиламина, триэтиламина, бутиламина, этилендиамина, этаноламина, диэтаноламина, пиперазина, бензиламина, фенилбензиламина, холина, меглумина и трометамина, а также аминокислот, таких как лизин и аргинин. Пример традиционного иона четвертичного аммония представляет собой N(CH₃)₄⁺. Примеры подходящих аминов включают аргинин, N, N'-дибензилэтилендиамин, хлорпрокаин, холин, диэтиламин, диэтаноламин, дициклогексиламин, этилендиамин, глицин, лизин, N-метилглюкамин, оламин, 2-амино-2-гидроксиметилпропан-1,3-диол и прокаин. Обсуждение применимых солей присоединения кислот и солей оснований см. в S. M. Berge et al., J. Pharm. Sci. (1977) 66:1-19; см. также Stahl and Wermuth, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use (2011). Фармацевтически приемлемые соли могут быть получены с помощью различных способов. Например, можно провести реакцию соединения или средства с подходящей кислотой или основанием с получением требуемой соли. Также можно подвергнуть реакции предшественник соединения или средства с кислотой или основанием с удалением кислото- и щелоче-неустойчивой группы или с открытием лактоновой или лактамной группы предшественника. Кроме того, можно превратить соль соединения или средства в другую соль путем обработки соответствующими кислотой или основанием посредством приведения в контакт с ионообменной смолой. Затем после реакции можно выделить соль путем фильтрации, если она осаждается из раствора, или выпаривания с извлечением соли. Степень ионизации соли может варьировать от полностью ионизированной до практически неионизированной.

В другом варианте осуществления средство представляет собой табак-специфичный нитрозамин (TSNA), который представляет собой химическое соединение, образованное с помощью нитрозирования вторичных и третичных аминов алкалоидов табака, в том числе никотина, норникотина, анатабина и анабазина. TSNA встречаются в табаке и табачных изделиях. Предпочтительно TSNA представляет собой N-нитрозоникотин (NNN), 4-(метилнитрозамино)-1-(3-пиридил)-1-бутанон (NNK), N-нитрозоанабазин (NAB), N-нитрозоанатабин (NAT), 4-(метилнитрозамино)4-(3-пиридил)бутаналь (NNA), 4-(метилнитрозамино)-1-(3-пиридил)-1-бутанол (NNAL), 4-(метилнитрозамино)4-(3-пиридил)-1-бутанол (изо-NNAL) или 4-(метилнитрозамино)-4-(3-пиридил)-1-масляную кислоту (изо-NNAC), или их фармацевтически приемлемые соли, или их смеси. Более предпочтительно TSNA представляет собой 4-(метилнитрозамино)-1-(3-пиридил)-1-бутанон (NNK) или его фармацевтически приемлемую соль.

В другом варианте осуществления средство представляет собой органический растворитель, выбранный из насыщенных алифатических углеводородов (например, н-пентана, н-гексана, н-гептана, н-октана); ароматических углеводородов (например, бензола, толуола, ксилолов); алифатических спиртов (например, метанола, этанола, пропан-1-ола, пропан-2-ола, бутан-1-ола, 2-метилпропан-1-ола, бутан-2-ола, 2-метилпропан-2-ола, пентан-1-ола, 3-метилбутан-1-ола, гексан-1-ола, 2-метоксиэтанола, 2-этоксиэтанола, 2-бутоксиэтанола, 2-(2-метоксиэтокси)-этанола, 2-(2-этоксиэтокси)-этанола, 2-(2-бутоксиэтокси)-этанола); простых эфиров, при условии, что простой эфир не представляет собой тетрагидрофуран (например, простой диэтиловый эфир, простой диизопропиловый эфир, простой дибутиловый эфир, 1,2-диметоксиэтан, 1,2-диэтоксиэтан, 1-метокси-2-(2-метоксиэтокси)-этан, 1-этокси-2-(2-этоксиэтокси)-этан, 1,4-диоксан); кетонов (например, ацетона, метилэтилкетона); сложных эфиров (метилацетата, этилацетата); азотсодержащих растворителей (например, формамида, N, N-диметилформамида, ацетонитрила, N-метилпирролидона, пиридина, хинолина, нитробензола); серосодержащих растворителей, при условии, что серосодержащий растворитель не представляет собой диметилсульфоксид (например, дисульфид углерода, тетрагидротиофен-1,1-диоксид); и фосфорсодержащих растворителей (например, гексаметилфосфортриамида).

В одном варианте осуществления органический растворитель представляет собой насыщенный алифатический углеводород (например, н-пентан, н-гексан, н-гептан, н-октан).

В одном варианте осуществления органический растворитель представляет собой ароматический углеводород (например, бензол, толуол, ксилолы).

В одном варианте осуществления органический растворитель представляет собой алифатический спирт (например, метанол, этанол, пропан-1-ол, пропан-2-ол, бутан-1-ол, 2-метилпропан-1-ол, бутан-2-ол, 2-метилпропан-2-ол, пентан-1-ол, 3-метилбутан-1-ол, гексан-1-ол, 2-метоксиэтанол, 2-этоксиэтанол, 2-бутоксиэтанол, 2-(2-метоксиэтокси)-этанол, 2-(2-этоксиэтокси)-этанол, 2-(2-бутоксиэтокси)-этанол).

В одном варианте осуществления органический растворитель представляет собой простой эфир, при условии, что простой эфир не представляет собой тетрагидрофуран (например, простой диэтиловый эфир, простой диизопропиловый эфир, простой дибутиловый эфир, 1,2-диметоксиэтан, 1,2-диэтоксиэтан, 1-метокси-2-(2-метоксиэтокси)-этан, 1-этокси-2-(2-этоксиэтокси)-этан, 1,4-диоксан).

В одном варианте осуществления органический растворитель представляет собой кетон (например, ацетон, метилэтилкетон).

В одном варианте осуществления органический растворитель представляет собой сложный эфир (метилацетат, этилацетат).

В одном варианте осуществления органический растворитель представляет собой азотсодержащий растворитель (например, формамид, N, N-диметилформамид, ацетонитрил, N-метилпирролидон, пиридин, хинолин, нитробензол).

В одном варианте осуществления органический растворитель представляет собой серосодержащий растворитель, при условии, что серосодержащий растворитель не представляет собой диметилсульфоксид (например, дисульфид углерода, тетрагидротиофен-1,1-диоксид).

В одном варианте осуществления органический растворитель представляет собой фосфорсодержащий растворитель (например, гексаметилфосфортриамид).В одном варианте осуществления средство представляет собой никотин или NNK или их комбинацию.

Одна или более переменных величин, которые можно измерить, включают поддающиеся количественному определению элементы клеток, субклеточный материал, субклеточные компоненты или клеточные продукты, в частности, элементы, которые можно точно измерить в высокопроизводительных аналитических системе или устройстве. Выходными данными могут являться признак, условие, состояние или функция любой клетки, клеточного компонента или клеточного продукта, в том числе жизнеспособность, дыхание, метаболизм, детерминанта клеточной поверхности, рецептор, белок или его конформационная, или посттрансляционная модификации, липид, углевод, органическая или неорганическая молекула, ДНК, РНК и т. п. или часть, полученная из такого клеточного компонента. Хотя переменная (переменные) величина (величины) может (могут) обеспечивать количественные считываемые данные, в некоторых случаях можно получить полуколичественный или качественный результат. Считываемые переменные величины могут включать, например, одиночное значение, или среднее значение, или медианное значение, или их дисперсию.

Можно использовать разные способы для измерения переменной (переменных) величины (величин), чтобы определить реакцию клетки, ткани или органа на средство. Одним из способов измерения количества присутствующего средства является мечение средства поддающимся выявлению компонентом, который может быть флуоресцентным, люминесцентным, радиоактивным, ферментативно активным и т. п. Для мечения биомолекулы, структуры или типа клетки доступны флуоресцентные и люминесцентные компоненты. Иммунофлуоресцентные компоненты могут быть направлены на связывание не только с конкретными белками, но и также с конкретными конформациями, продуктами расщепления или сайтами для модификаций, такими как фосфорилировине. Отдельные пептиды и белки могут быть сконструированы для автофлуоресценции. Можно использовать методики иммунологических анализов, такие как иммуногистохимический анализ, радиоиммунологический анализ (RIA) или твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), а также родственные неферментативные методики. В этих методиках используют определенные антитела в качестве репортерных молекул, которые являются особенно применимыми из-за их высокой степени специфичности прикрепления к одной молекулярной мишени. Клеточный ELISA или соответствующие неферментативные или флуоресцентные способы обеспечивают измерение параметров клеточной поверхности.

Результаты скрининговых анализов можно сравнивать с результатами, полученными для эталонных соединений, кривых изменения концентрации, контролей и т. п. Средство может представлять собой аэрозоль, такой как дым или аэрозоль, полученный из дыма.

Аэрозоль

Варианты осуществления настоящего изобретения можно использовать для изучения влияние аэрозоля на клетки, органы или ткани или проницаемость аэрозоля в клетки, органы или ткани. Аэрозоль может быть получен или образован посредством устройства, образующего аэрозоль. Курительные изделия и изделия для курения являются типами устройств, образующих аэрозоль. Примеры курительных изделий или изделий для курения включают без ограничения сигареты, сигариллы и сигары. В определенных устройствах, образующих аэрозоль, табачную композицию или другой материал, образующий аэрозоль, вместо сжигания нагревают с помощью одного или более электрических нагревательных элементов с получением аэрозоля. В другом типе нагреваемого устройства, образующего аэрозоль, аэрозоль образуется в результате передачи тепла от горючего топливного элемента или источника тепла к физически отделенному материалу, образующему аэрозоль, который может быть расположен внутри, вокруг или ниже по потоку относительно источника тепла. Как правило, в нагреваемых курительных изделиях аэрозоль образуется в результате передачи тепла от источника тепла к физически отделенному субстрату или материалу, образующему аэрозоль, который может быть расположен внутри, вокруг или ниже по потоку относительно источника тепла. При курении летучие соединения высвобождаются из материала, образующего аэрозоль, путем передачи тепла от источника тепла и захватываются воздухом, втягиваемым через курительное изделие. По мере охлаждения высвобождаемых соединений, они конденсируются с образованием аэрозоля, который вдыхается пользователем. Используемый в данном документе термин «материал, образующий аэрозоль» используется для описания материала, способного при нагревании высвобождать летучие соединения, которые могут образовывать аэрозоль. Материал, образующий аэрозоль, может быть растительного происхождения. Примеры материалов, образующих аэрозоль, включают без ограничения табачные композиции, виды табака, табачный экстракт, резаный табак, резаный наполнитель, сушеный табак, взорванный табак, гомогенизированный табак, восстановленный табак и виды трубочного табака. Материал, образующий аэрозоль, в качестве альтернативы может содержать материал нерастительного происхождения.

Аэрозоль может присутствовать в виде дыма. Используемый в данном документе термин «дым» используют для описания типа аэрозоля, получаемого при сгорании, например, при курении сигарет, или при сгорании материала, образующего аэрозоль. Дым содержит различные средства, которые в случае необходимости могут быть предоставлены в виде отдельных соединений для исследования. Примеры таких средств включают сухое дисперсное вещество, не содержащее никотина, монооксид углерода, формальдегид, ацетальдегид, ацетон, акролеин, пропионовый альдегид, кротоновый альдегид, метилэтилкетон, бутиральдегид, бензо[a]пирен, фенол, м-крезол, o-крезол, п-крезол, катехол, резорцин, гидрохинон, 1,3-бутадиен, изопрен, акрилонитрил, бензол, толуол, пиридин, хинолин, стирол, N'-нитрозонорникотин (NNN), N′-нитрозоанатабин (NAT), N′-нитрозоанабазин (NAB), 4-(метилнитрозамино)-1-(3-пиридил)-1-бутанон (NNK), 1-аминонафталин, 2-аминонафталин, 3-аминобифенил, 4-аминобифенил, монооксид азота (NO), оксид азота (NOx), цианистоводородную кислоту, аммиак, мышьяк, кадмий, хром, свинец, никель, селен и ртуть.

Планшет для культивирования клеток, описанный в данном документе, можно подвергать воздействию дыма в течение разной продолжительности времени. Дым можно доставлять с помощью модуля воздействия Vitrocell (см. Chem Cent J. (2014) 8(1):62). Можно использовать определенное количество затяжек на сигарету и определенное количество затяжек за минуту воздействия и варьировать количество сигарет для приспособления к времени воздействия. Эталонные сигареты, такие как эталонные сигареты 3R4F, можно использовать в качестве источника дыма и курить на курящем роботе в базовом соответствии с режимом курения, установленным Международной организацией по стандартизации (ISO 2000).

Обработка данных с помощью компьютера

Методики и устройства, описанные в данном документе, могут быть реализованы с помощью любого подходящего аппаратного оборудования, в том числе в программируемой вычислительной системы. Аналогично управление системой или устройством может контролироваться программируемым компьютерным устройством. Настоящее изобретение пригодно к эксплуатации во многих других средах или конфигурациях вычислительных систем общего или специального назначения. Примеры хорошо известных вычислительных систем, сред и/или конфигураций, которые могут быть подходящими для применения в данном документе, могут включать без ограничения персональные компьютеры, серверные компьютеры, переносные или компактные устройства, многопроцессорные системы, микропроцессорные системы, телевизионные приставки, программируемую потребительскую электронику, сетевые ПК, мини-компьютеры, универсальные вычислительные машины, распределенные вычислительные среды или облачные вычислительные среды, которые включают любые из перечисленных выше систем или устройств и т. п. Вычислительная среда может выполнять исполняемые компьютером инструкции, такие как программные модули. Как правило, программные модули включают процедуры, программы, объекты, компоненты, структуры данных и т. д., которые осуществляют конкретные задачи или реализуют конкретные типы абстрактных данных. Настоящее изобретение также можно использовать на практике в распределенных вычислительных средах, где задачи выполняются удаленными устройствами обработки, которые связаны через сеть передачи данных. В распределенной вычислительной среде программные модули могут быть расположены как на локальных, так и на удаленных компьютерных носителях данных, в том числе запоминающих устройствах.

Компоненты компьютера для применения в настоящем раскрытии могут включать без ограничения блок обработки, системную память и системную шину, которая соединяет различные компоненты системы, в том числе системную память, с блоком обработки. Системная шина может представлять собой любой из нескольких типов шинных структур, в том числе шину памяти или контроллер памяти, периферийную шину и локальную шину, использующих любую из множества шинных архитектур. В качестве примера, а не ограничения, такие архитектуры включают шину промышленной стандартной архитектуры (ISA), шину микроканальной архитектуры (MCA), шину усовершенствованной ISA (EISA), локальную шину ассоциации по стандартам в области видеоэлектроники (VESA) и шину взаимодействия периферийных компонентов (PCI), также известную под названием шина расширения.

Обычно компьютер включает множество машиночитаемых носителей. Машиночитаемые носители могут представлять собой любые доступные носители, которые могут быть доступны для компьютера и включают как незапоминающие, так запоминающие среды, как съемные, так и не съемные носители.

Компьютер может функционировать в сетевой среде с помощью логических соединений с одним или более удаленными компьютерами, такими как удаленный компьютер. Удаленный компьютер может представлять собой персональный компьютер, сервер, роутер, сетевой ПК, одноранговое устройство или какой-либо другой сетевой модуль, и обычно включает многие или все из элементов, описанных выше, по отношению к компьютеру.

PEEK

Как описано в данном документе, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что РЕЕК имеет преимущество в том, что он не является поглотителем низкомолекулярных гидрофобных молекул, таких как гидрофобные молекулы с молекулярной массой от 146 г/моль до 207 г/моль или от 146 г/моль до 176 г/моль, или органического растворителя, при условии, что органический растворитель не является галогенизированным органическим растворителем, или диметилсульфоксидом, или тетрагидрофураном. Устойчивость PEEK к поглощению малых гидрофобных молекул или органических растворителей является важным для предупреждения или подавления захвата этих молекул данным материалом. Таким образом, планшеты для культивирования клеток и другие такие устройства, используемые для культивирования клеток, которые изготовлены из полимера, содержащего PEEK или состоящего из него, являются особенно подходящими для тестирования влияния лекарственных средств или других средств на клетки или ткани, расположенные в планшете или другом таком устройстве, с целью устранения или ослабления риска изменения концентрации лекарственного средства или другого средства (или их метаболитов) материалом.

Соответственно, раскрыто устройство для культивирования клеток, содержащее PEEK или состоящее из него.

Соответственно, также раскрыто устройство для культивирования клеток, изготовленного (исключительно) из PEEK.

Также раскрыт планшет для культивирования клеток, содержащий PEEK или состоящий из него.

Также раскрыт планшет для культивирования клеток, изготовленный (исключительно) из PEEK.

Также раскрыта лунка планшета для культивирования клеток, содержащая PEEK или состоящая из него.

Также раскрыта лунка планшета для культивирования клеток, изготовленная (исключительно) из PEEK.

Также раскрыт многолуночный планшет для культивирования клеток, содержащий PEEK или состоящий из него.

Также раскрыт многолуночный планшет для культивирования клеток, изготовленный (исключительно) из PEEK.

Соответственно, устройство для культивирования клеток, планшет для культивирования клеток, лунка или многолуночный планшет для культивирования клеток содержат одну или более гидрофобных молекул, таких как одно или более низкомолекулярных гидрофобных средств. В одном варианте осуществления средство содержит алкалоид табака или состоит из него.

В одном варианте осуществления средство представляет собой структуру формулы 1:

,

или ее фармацевтически приемлемую соль или их смеси;

или более предпочтительно структуру формулы 2:

,

или ее фармацевтически приемлемую соль или их смеси;

при этом:

z равняется 0 или 1;

R₁ представляет собой Н или C₁-C₇алкил;

R₂ представляет собой H, =O или C₁-C₇алкил;

R₃ представляет собой H, галоген или C₁-C₇алкил;

и пунктирной линией представлены либо

(a) одинарные связи;

(b) одна углерод-углеродная или углерод-азотная двойная связь и остальные одинарные связи; или

(c) две конъюгированные двойные связи, независимо выбранные из углерод-азотной двойной связи и углерод-углеродной двойной связи, и остальные одинарные связи.

Соответственно, средство формулы 2 представляет собой:

,

или

,

или ее фармацевтически приемлемую соль или их смеси.

Соответственно, средство формулы 2 представляет собой:

,

или

,

или ее фармацевтически приемлемую соль или их смеси.

Более предпочтительно средство формулы 1 или формулы 2 представляет собой алкалоид табака.

Более предпочтительно средство формулы 1 или формулы 2 представляет собой никотин, анабазин, норникотин, анатабин, котинин, миосмин, или их фармацевтически приемлемую соль, или их смеси.

Термин «алкалоид табака» относится к алкалоиду, который происходит или получен из растения табака, а также может включать синтетический алкалоид табака. Термин «растение табака» относится к растению, принадлежащему к роду Nicotiana, в том числе N. rustica и N. tabacum (например, LA B21, LN KY171, TI 1406, Basma, Galpao, Perique, Beinhart 1000-1 и Petico). Другие виды включают N. acaulis, N. acuminata, N. africana, N. alata, N. ameghinoi, N. amplexicaulis, N. arentsii, N. attenuata, N. azambujae, N. benavidesii, N. benthamiana, N. bigelovii, N. bonariensis, N. cavicola, N. clevelandii, N. cordifolia, N. corymbosa, N. debneyi, N. excelsior, N. forgetiana, N. fragrans, N. glauca, N. glutinosa, N. goodspeedii, N. gossei, N. hybrid, N. ingulba, N. kawakamii, N. knightiana, N. langsdorffii, N. linearis, N. longiflora, N. maritima, N. megalosiphon, N. miersii, N. noctiflora, N. nudicaulis, N. obtusifolia, N. occidentalis, N. occidentalis subsp. hesperis, N. otophora, N. paniculata, N. pauciflora, N. petunioides, N. plumbaginifolia, N. quadrivalvis, N. raimondii, N. repanda, N. rosulata, N. rosulata subsp. ingulba, N. rotundifolia, N. setchellii, N. simulans, N. solanifolia, N. spegazzinii, N. stocktonii, N. suaveolens, N. sylvestris, N. thyrsiflora, N. tomentosa, N. tomentosiformis, N. trigonophylla, N. umbratica, N. undulata, N. velutina, N. wigandioides и N. x sanderae. Предпочтительно, растение табака представляет собой N. tabacum.

Термин «C₁-C₇алкил» относится к прямой цепи и разветвленным насыщенным углеводородным группам, как правило, имеющим от 1 до 7 атомов углерода; более предпочтительно к C₁-C₆алкилу; более предпочтительно C₁-C₃алкилу. Примеры алкильных групп включают метил, этил, н-пропил, изо-пропил, н-бутил, втор-бутил, изо-бутил, т-бутил, пент-1-ил, пент-2-ил, пент-3-ил, 3-метилбут-1-ил, 3-метилбут-2-ил, 2-метилбут-2-ил, 2,2,2-триметилэт-1-ил, н-гексил, н-гептил и т. п. Подходящей алкильной группой является метил.

Термин «галоген» относится к F, Cl, Br или I. Подходящим галогеном является Cl.

В другом варианте осуществления средство представляет собой табак-специфичный нитрозамин (TSNA), который представляет собой химическое соединение, образованное с помощью нитрозирования вторичных и третичных аминов алкалоидов табака, в том числе никотина, норникотина, анатабина и анабазина. TSNA встречаются в табаке и табачных изделиях. Предпочтительно TSNA представляет собой N-нитрозоникотин (NNN), 4-(метилнитрозамино)-1-(3-пиридил)-1-бутанон (NNK), N-нитрозоанабазин (NAB), N-нитрозоанатабин (NAT), 4-(метилнитрозамино)4-(3-пиридил)бутаналь (NNA), 4-(метилнитрозамино)-1-(3-пиридил)-1-бутанол (NNAL), 4-(метилнитрозамино)4-(3-пиридил)-1-бутанол (изо-NNAL) или 4-(метилнитрозамино)-4-(3-пиридил)-1-масляную кислоту (изо-NNAC), или их фармацевтически приемлемые соли, или их смеси. Более предпочтительно TSNA представляет собой 4-(метилнитрозамино)-1-(3-пиридил)-1-бутанон (NNK) или его фармацевтически приемлемую соль.

Соответственно, органический растворитель выбран из насыщенных алифатических углеводородов (например, н-пентана, н-гексана, н-гептана, н-октана); ароматических углеводородов (например, бензола, толуола, ксилолов); алифатических спиртов (например, метанола, этанола, пропан-1-ола, пропан-2-ола, бутан-1-ола, 2-метилпропан-1-ола, бутан-2-ола, 2-метилпропан-2-ола, пентан-1-ола, 3-метилбутан-1-ола, гексан-1-ола, 2-метоксиэтанола, 2-этоксиэтанола, 2-бутоксиэтанола, 2-(2-метоксиэтокси)-этанола, 2-(2-этоксиэтокси)-этанола, 2-(2-бутоксиэтокси)-этанола); простых эфиров, при условии, что простой эфир не представляет собой тетрагидрофуран (например, простой диэтиловый эфир, простой диизопропиловый эфир, простой дибутиловый эфир, 1,2-диметоксиэтан, 1,2-диэтоксиэтан, 1-метокси-2-(2-метоксиэтокси)-этан, 1-этокси-2-(2-этоксиэтокси)-этан, 1,4-диоксан); кетонов (например, ацетона, метилэтилкетона); сложных эфиров (метилацетата, этилацетата); азотсодержащих растворителей (например, формамида, N, N-диметилформамида, ацетонитрила, N-метилпирролидона, пиридина, хинолина, нитробензола); серосодержащих растворителей, при условии, что серосодержащий растворитель не представляет собой диметилсульфоксид (например, дисульфид углерода, тетрагидротиофен-1,1-диоксид); и фосфорсодержащих растворителей (например, гексаметилфосфортриамида).

В одном варианте осуществления органический растворитель представляет собой насыщенный алифатический углеводород (например, н-пентан, н-гексан, н-гептан, н-октан).

В одном варианте осуществления органический растворитель представляет собой ароматический углеводород (например, бензол, толуол, ксилолы).

В одном варианте осуществления органический растворитель представляет собой алифатический спирт (например, метанол, этанол, пропан-1-ол, пропан-2-ол, бутан-1-ол, 2-метилпропан-1-ол, бутан-2-ол, 2-метилпропан-2-ол, пентан-1-ол, 3-метилбутан-1-ол, гексан-1-ол, 2-метоксиэтанол, 2-этоксиэтанол, 2-бутоксиэтанол, 2-(2-метоксиэтокси)-этанол, 2-(2-этоксиэтокси)-этанол, 2-(2-бутоксиэтокси)-этанол).

В одном варианте осуществления органический растворитель представляет собой простой эфир, при условии, что простой эфир не представляет собой тетрагидрофуран (например, простой диэтиловый эфир, простой диизопропиловый эфир, простой дибутиловый эфир, 1,2-диметоксиэтан, 1,2-диэтоксиэтан, 1-метокси-2-(2-метоксиэтокси)-этан, 1-этокси-2-(2-этоксиэтокси)-этан, 1,4-диоксан).

В одном варианте осуществления органический растворитель представляет собой кетон (например, ацетон, метилэтилкетон).

В одном варианте осуществления органический растворитель представляет собой сложный эфир (метилацетат, этилацетат).

В одном варианте осуществления органический растворитель представляет собой азотсодержащий растворитель (например, формамид, N, N-диметилформамид, ацетонитрил, N-метилпирролидон, пиридин, хинолин, нитробензол).

В одном варианте осуществления органический растворитель представляет собой серосодержащий растворитель, при условии, что серосодержащий растворитель не представляет собой диметилсульфоксид (например, дисульфид углерода, тетрагидротиофен-1,1-диоксид).

В одном варианте осуществления органический растворитель представляет собой фосфорсодержащий растворитель (например, гексаметилфосфорный триамид).

В одном варианте осуществления органический растворитель не представляет собой простой петролейный эфир.

В одном варианте осуществления органический растворитель не представляет собой толуол.

В одном варианте осуществления органический растворитель не представляет собой ацетон.

В одном варианте осуществления органический растворитель не представляет собой этанол. В одном варианте осуществления средство представляет собой никотин или NNK или их комбинацию.

Также раскрыт способ культивирования клетки, включающий применение устройства для культивирования клеток, такого как планшет для культивирования клеток или многолуночный планшет для культивирования клеток, содержащий РЕЕК или состоящий из него.

Также раскрыт способ культивирования клетки, включающий применение устройства для культивирования клеток, такого как планшет для культивирования клеток или многолуночный планшет для культивирования клеток, содержащий РЕЕК или состоящий из него.

Также раскрыт способ культивирования клетки, включающий применение устройства для культивирования клеток, такого как планшет для культивирования клеток или многолуночный планшет, изготовленный (исключительно) из РЕЕК.

Также раскрыт способ культивирования клетки, включающий: (i) приведение клетки в контакт с устройством для культивирования клеток, таким как планшет для культивирования клеток или многолуночный планшет для культивирования клеток, содержащий РЕЕК или состоящий из него, и (ii) культивирование клетки.

Также раскрыт способ культивирования клетки, включающий: (i) приведение клетки в контакт с устройством для культивирования клеток, таким как планшет для культивирования клеток или многолуночный планшет для культивирования клеток, изготовленный (исключительно) из РЕЕК; и (ii) культивирование клетки.

Соответственно, способы, обсуждаемые выше, включают дополнительную стадию приведения клетки в контакт с устройством для культивирования клеток с одной (одним) или более малыми гидрофобными молекулами или органическими растворителями, обсуждаемыми выше.

Соответственно, устройство для культивирования клеток может содержать клетку, содержащуюся в среде для культивирования клеток, и необязательно одну (один) или более малых гидрофобных молекул или органических растворителей , обсуждаемых выше.

Также раскрыт способ определения влияния (например, реакции на воздействие) одного или более средств на клетку, включающий: (i) приведение клетки в контакт с устройством для культивирования клеток, таким как планшет для культивирования клеток или многолуночный планшет для культивирования клеток, содержащим PEEK или состоящим из него; (ii) воздействие на клетку одной или более малыми гидрофобными молекулами или органическими растворителями, обсуждаемыми выше; и (iii) определение влияния средства (средств) на клетку.

Также раскрыт способ определения влияния (например, реакции на воздействие) одного или более средств на клетку, включающий (i) приведение клетки в контакт с устройством для культивирования клеток, таким как планшет для культивирования клеток или многолуночный планшет для культивирования клеток, изготовленным (исключительно) из PEEK; (ii) воздействие на клетку одной или более малыми гидрофобными молекулами или органическими растворителями, обсуждаемыми выше; и (iii) определение влияния; малых гидрофобных молекул или органических растворителей, обсуждаемых выше, на клетку.

Также раскрыт способ снижения или ингибирования поглощения одной или более малых гидрофобных молекул или органических растворителей, обсуждаемых выше, в устройстве для культивирования клеток, включающий приведение средства в контакт с устройством для культивирования клеток, содержащим PEEK или состоящим из него.

Также раскрыт способ применения устройства для культивирования клеток, содержащего PEEK или состоящего из него, для снижения или ингибирования поглощения одной или более малых гидрофобных молекул или органических растворителей, обсуждаемых выше, в устройстве для культивирования клеток.

Настоящее изобретение дополнительно описано в примере ниже, который представлен для более подробного описания настоящего изобретения. Данный пример, в котором изложен предпочтительный вариант, предполагаемый в настоящее время для осуществления настоящего изобретения, предназначен для иллюстрации, но не для ограничения настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Проводили исследования различных материалов, используемых для изготовления планшета. Один материал, используемый для планшета, PEEK, представляет собой прочный износостойкий пластмассовый полимер. PEEK является предпочтительным в исследовании лекарственных средств, поскольку он является непоглощающим в отличие, например, от широко используемого поли(диметилсилоксана) (PDMS), который, как известно, удерживает малые гидрофобные молекулы. Неожиданно было обнаружено, что PEEK не удерживает алкалоиды, такие как никотин, или табак-специфические нитрозамины, такие как NNK. Таким образом, планшет является подходящим для тестирования влияния данных средств на ткани, находящиеся в планшете, с целью устранения или снижения риска изменения концентрации средства, обусловленного материалом.

Биосовместимость планшета PEEK тестировали с органотипическими моделями легкого и печени.

Модель легкого состоит из нормальных клеток бронхиального эпителия человека (NHBE), высеянных на вставку Transwell™ и дополнительно культивируемых на поверхности раздела жидкость-воздух с целью обеспечения дифференцировки клеток в бокаловидные или реснитчатые эпителиальные клетки. Используя данные ткани можно продемонстрировать, что ткани легкого могут выживать в течение 4 недель на планшете PEEK, что демонстрируется посредством следующего.

Присутствие реснитчатых и бокаловидных эпителиальных клеток в аналогичной пропорции относительно пропорции, наблюдаемой в контрольных тканях (из той же самой партии), поддерживаемым в 24-луночных поликарбонатных планшетах в течение того же самого периода времени.

Сохраненная морфология. Гистологический анализ тканей, поддерживаемых в планшете, и тканей, поддерживаемых в 24-луночном планшете в течение 4 недель, подтвердил аналогичные результаты морфологического исследования. Толщина эпителия, статус дифференцировки и пропорция бокаловидных, базальных и реснитчатых эпителиальных клеток были аналогичными между тканями, поддерживаемыми в данных двух условиях.

Стабильная концентрация АТФ. АТФ используется для ряда процессов, поэтому все метаболически активные клетки содержат АТФ, что делает измерения содержания АТФ эффективным показателем состояния тканей. Ткани, поддерживаемые в планшете в течение 4 недель, характеризовались аналогичным содержанием АТФ (на приблизительно 10% меньше АТФ) по сравнению с контрольными тканями.

Активное колебательное движение ресничек. Реснитчатые эпителиальные клетки не только присутствовали в той же самой пропорции, что и в контрольных тканях, но также у них по-прежнему осуществлялись колебательные движения ресничек с частой, аналогичной частоте, наблюдаемой в контрольных тканях.

Более высокое трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER). TEER является мерой целостности плотных контактов в эпителиальных тканях, и, следовательно, является эффективным показателем целостности барьера. Ткани, поддерживаемые в планшете PEEK, характеризовались на 50% более высоким значение TEER, чем контрольные ткани.

Сохраненная метаболическая емкость. Индуцируемость цитохромов P450 (CYP), ключевого показателя метаболической емкости, исследовали путем воздействия на ткани специфических индукторов ферментов CYP. Было выявлено, что через 48 часов после воздействия активность CYP 1A1 повышалась в 100 раз, что указывало на сохраненную метаболическую индуцируемость тканей, выращиваемых в планшете.

В качестве модели печени использовали сфероиды, состоящие из клеток HepaRG™. Первые результаты, полученные при использовании данных сфероидов клеток печени после 4 недель культивирования в планшете PEEK, показали следующее.

Стабильная секреция альбумина в циркулирующей среде. Альбумин является основным маркером функции печени. Было обнаружено, что в чипе альбумин был стабильным в течение 4 недель, при этом аналогичные концентрации наблюдали и в случае контрольных тканей.

Сохраненная метаболическая емкость. Индуцируемость цитохромов P450 (CYP), ключевого показателя метаболической емкости, исследовали путем воздействия на ткани специфических индукторов ферментов CYP. Было выявлено, что через 48 часов после воздействия активность CYP 1A1 была аналогичной индуцируемости, наблюдаемой в контрольных тканях.

Тестировали поглощение никотина и NNK материалом PEEK, и выявили, что молекулы не захватывались материалом. На фигуре 22 показаны результаты в виде графика сравнения количества никотина, оставшегося в планшете PEEK и планшете PDMS через 8 часов после инкубации при 4°C. Видно, что приблизительно 100% никотина оставалось в планшете PEEK по сравнению лишь с приблизительно 35% в планшете PDMS. Таким образом, материалы, используемые для коммерчески доступных планшетов с использованием PDMS, будут захватывать малые гидрофобные молекулы.

Пример 2

Чтобы избежать агломерации сфероидов, лунки, разработанные для сфероидов из клеток печени, приспосабливали таким образом, чтобы они содержали концентрические канавки на дне лунки. Целью данных канавок было создание пространственного разделения между тканями для предотвращения их агломерации или слияния друг с другом. Для демонстрации функции канавок 40 сфероиды, каждый из которых содержал приблизительно 25000 клеток, помещали либо в лунку с канавками, либо в лунку с плоским дном (т. е. без канавок). Через 5 дней сфероиды, присутствующие в лунке с плоским дном, начинали агломерировать друг с другом (см. фигуру 21A), образуя агрегаты. Этого не наблюдали в лунке с канавками (см. фигура 21B). Ткань, показанную на фигуре 21A (3 сфероида, агломерировавшиеся или слившиеся с образованием одного скопления), нельзя было использовать для дальнейших экспериментов, обычно проводимых на сфероидах, таких как измерение содержания АТФ, поскольку агломерация или слияние нескольких сфероидов негативно влияли на получаемые результаты. Культивируемая ткань, представленная на фигуре 21B, не подвергалась агломерации или слиянию и ее использовали для дальнейших экспериментов.

Любая публикация, цитируемая или описанная в данном документе, предоставляет соответствующую информацию, раскрытую до даты подачи настоящей заявки. Заявления, сделанные в данном документе, не должны истолковываться как признание того, что авторы настоящего изобретения не имеют оснований для его противопоставления как более ранним таким раскрытиям. Все публикации, упомянутые в вышеприведенном описании, включены в данный документ посредством ссылки. Различные модификации и варианты настоящего изобретения будут очевидны специалистам в данной области техники без отступления от объема и сущности настоящего изобретения. Несмотря на то, что настоящее изобретение описано применительно к конкретным предпочтительным вариантам осуществления, следует понимать, что заявленное изобретение не должно неправомерно ограничиваться такими конкретными вариантами осуществления. В действительности, предполагается, что разные модификации описанных способов осуществления настоящего изобретения, очевидные специалистам в областях генной инженерии, клеточной биологии и молекулярной биологии или в смежных областях, находятся в пределах объема нижеследующей формулы изобретения.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Представлены: планшет для культивирования клеток, содержащий по меньшей мере две последовательно расположенные лунки и канал, приспособленный для сообщения по текучей среде между лунками, где канал соединен или сообщается с первым насосом через отверстия на каждом конце канала, и где указанный первый насос является пригодным для обеспечения циркуляции текучей среды между по меньшей мере двумя лунками. Также раскрыты устройства, включающие планшет для культивирования клеток и способы с его применением. Изобретение позволяет эффективно культивировать одновременно два или более различных типов клеток с наименьшими временными затратами. 6 н. и 11 з.п. ф-лы, 23 ил., 2 пр.

1. Планшет для культивирования клеток, содержащий: по меньшей мере две последовательно расположенные лунки; и канал, выполненный с возможностью сообщения по текучей среде между лунками, где часть канала включает канал для передачи текучей среды, выполненный с возможностью для выведения текучей среды в направлении первого насоса или от него, и другая часть канала включает канал для сообщения лунок, выполненный с возможностью обеспечения сообщения по текучей среде с каждой из по меньшей мере двух последовательно расположенных лунок посредством отверстий в стенке канала для сообщения лунок; где канал соединен или сообщается с первым насосом посредством отверстий на каждом конце канала, и где первый насос выполнен с возможностью обеспечения циркуляции текучей среды между по меньшей мере двумя лунками.

2. Планшет по п. 1, где диаметр канала составляет 3 миллиметра или меньше.

3. Планшет по п. 1, где канал представляет собой микрофлюидный канал.

4. Планшет по любому из предыдущих пунктов, где насос представляет собой перистальтический насос, соответственно, где перистальтический насос содержит шаговый двигатель или бесщеточный двигатель, содержащий энкодер.

5. Планшет по любому из предыдущих пунктов, где канал дополнительно выполнен с возможностью обеспечения выведения текучей среды из планшета для культивирования клеток.

6. Планшет по п. 5, где канал соединен или сообщается со вторым насосом, где второй насос выполнен с возможностью обеспечения выведения текучей среды из планшета для культивирования клеток.

7. Планшет по любому из предыдущих пунктов, где двигатель первого насоса и/или второго насоса помещен в водонепроницаемую камеру.

8. Планшет по любому из предыдущих пунктов, где планшет для культивирования клеток оснащен крышкой.

9. Планшет по любому из предыдущих пунктов, где планшет для культивирования клеток выполнен с возможностью помещения в инкубатор, и/или где планшет для культивирования клеток изготовлен из полиэфирэфиркетона (PEEK).

10. Планшет по любому из предыдущих пунктов, где канал находится в сообщении по текучей среде с планшетом, содержащим один или более резервуаров, способных удерживать текучую среду.

11. Планшет по любому из предыдущих пунктов, где каждая лунка имеет диаметр окружности от приблизительно 6 мм до приблизительно 16 мм.

12. Устройство для культивирования клеток, содержащее планшет для культивирования клеток по любому из пп. 1-11, помещенный в инкубатор.

13. Способ обеспечения циркуляции текучей среды между двумя или более последовательно расположенными лунками, включающий:

(a) обеспечение планшета для культивирования клеток по любому из пп. 1-11 или устройства для культивирования клеток по п. 12;

(b) приведение в контакт по меньшей мере двух лунок с текучей средой; и

(c) обеспечение циркуляции текучей среды через лунки планшета для культивирования клеток.

14. Способ определения влияния средства на клетку, включающий стадии:

(a) обеспечения планшета для культивирования клеток по любому из пп. 1-11 или устройства для культивирования клеток по п. 12;

(b) приведения в контакт по меньшей мере двух лунок планшета для культивирования клеток с клетками и средой для культивирования клеток;

(c) обеспечения циркуляции среды для культивирования клеток через лунки планшета для культивирования клеток;

(d) воздействия на лунки планшета для культивирования клеток по меньшей мере одного средства;

(e) удаления и исследования образца среды для культивирования клеток из последовательно расположенных лунок; и

(f) определения влияния средства на клетки до и после воздействия по меньшей мере одного средства.

15. Устройство для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии, содержащее:

(a) планшет для культивирования клеток по любому из пп. 6-11 и

(b) планшет для образцов, содержащий одну или более лунок для хранения множества образцов, где второй насос выполнен с возможностью обеспечения выведения текучей среды из планшета для культивирования клеток в планшет для образцов.

16. Устройство по п. 15, где многоканальный микродозатор выполнен с возможностью обеспечения сообщения текучей среды с планшетом для образцов.

17. Способ отбора образцов среды для культивирования клеток, подверженной воздействию одного или более средств, включающий стадии:

(a) обеспечения устройства для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии по п. 15 или 16;

(b) приведения в контакт по меньшей мере двух лунок со средой для культивирования клеток, содержащей клетки;

(c) обеспечения циркуляции среды для культивирования клеток через лунки планшета для культивирования клеток;

(d) воздействия на лунки планшета для культивирования клеток по меньшей мере одного средства; и

(e) отбора образцов среды для культивирования клеток из планшета для культивирования клеток, где образцы среды для культивирования клеток необязательно отбирают один или более раз в режиме реального времени во время воздействия средства.