КЛЕТКА-ЕСТЕСТВЕННЫЙ КИЛЛЕР, СОДЕРЖАЩАЯ ЭКЗОГЕННУЮ МИТОХОНДРИЮ, И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ВКЛЮЧАЮЩАЯ ТАКУЮ КЛЕТКУ Российский патент 2022 года по МПК C12N5/783 A61K35/17 A61K9/08 A61P35/00 

Область техники

Настоящее изобретение относится к продуктам для клеточной терапии, и, более конкретно, к клетке-естественному киллеру (далее в настоящем документе, обозначаемой как NK) или мононуклеарным клеткам периферической крови (далее в настоящем документе, обозначаемым как PBMC), которые содержат экзогенные митохондрии, и к фармацевтическим композициям, включающим такие клетки в качестве активного ингредиента.

Предшествующий уровень техники

В настоящее время разработаны биофармацевтические препараты для лечения различных неизлечимых заболеваний. Биофармацевтические препараты включают белковые лекарственные средства, лекарственные средства с антителами и препараты для клеточной терапии. В настоящем документе, препараты для клеточной терапии относятся к фармацевтическим препаратам, применяемым с целью лечения, диагностики и профилактики заболеваний, и препараты для клеточной терапии можно получать через серию действий, таких как проведение выделения ex vivo и пролиферации или путем изменения биологических характеристик клеток другими способами. Препараты для клеточной терапии можно получать из аутологичных, аллогенных или ксеногенных клеток. В зависимости от типа клеток, препараты для клеточной терапии можно классифицировать на препараты для терапии соматическими клетками и препараты для терапии стволовыми клетками.

С другой стороны, в терапии злокачественных опухолей обратили внимание на иммунотерапию с использованием иммунной функции пациента. В иммунотерапии используют свойства иммунных клеток с разнообразными функциями, и злокачественные клетки уничтожаются путем сложных взаимодействий иммунных клеток. PBMC в крови человека представляют собой клетки крови с круглым ядром, такие как лимфоцит или моноцит, и включают B-клетки, T-клетки, макрофаги, дендритные клетки (DC), и NK-клетки. Среди них NK-клетки и цитотоксические T-лимфоциты (ЦТЛ) непосредственно уничтожают злокачественные клетки. Антиген-презентирующие клетки, которые презентируют антигены этим эффекторным клеткам, включают дендритные клетки или B-клетки. Кроме того, в иммунных ответах участвуют хелперные T-клетки и регуляторные T-клетки, которые секретируют различные цитокины, и т.п. Среди них, перспективными и многообещающими иммунными клетками для иммунотерапии являются NK-клетки.

В частности, поскольку было показано, что NK-клетки способны уничтожать злокачественные клетки неспецифическим образом, на NK-клетках было проведено много исследований. На основании этих исследований, терапия NK-клетками при злокачественной опухоли, является перспективным способом для лечения злокачественных клеток. В частности, опубликовано, что NK-клетки играют важную роль во врожденных и приобретенных иммунных ответах за счет секреции цитокинов против патогенов, которые заражают хозяина, или злокачественной опухоли.

Таким образом, авторы настоящего изобретения предприняли усилия для того чтобы найти новый способ для улучшения силы цитотоксичности NK-клеток и PBMC. В результате авторы настоящего изобретения обнаружили способ повышения цитотоксичности NK и PBMC, и, таким образом, создали способ лечения злокачественной опухоли с использованием такой цитотоксичности, и, таким образом, завершили настоящее изобретение.

Техническая проблема

Целью настоящего изобретения является получение NK-клетки с повышенной цитотоксичностью и фармацевтической композиции, включающей такую клетку.

Другой целью настоящего изобретения является получение PBMC с повышенной цитотоксичностью и фармацевтической композиции, включающей такую клетку.

Решение проблемы

Для достижения вышеуказанных целей настоящее изобретение относится к NK-клеткам, содержащим экзогенные митохондрии, и к фармацевтической композиции для профилактики или лечения злокачественной опухоли или инфекционного заболевания, включающей такие клетки.

Кроме того, настоящее изобретение относится к PBMC, содержащим экзогенные митохондрии, и к фармацевтической композиции для профилактики или лечения злокачественной опухоли или инфекционного заболевания, включающей такие клетки.

Полезные эффекты изобретения

NK-клетка и PBMC, в которые были введены экзогенные митохондрии, не только имеют повышенную цитотоксичность, которая приводит к повышенным специфическим цитотоксическим противопухолевым эффектам, но также не демонстрируют побочных эффектов, как иммунные клетки, существующие in vivo. Кроме того, NK-клетка и PBMC улучшены в отношении способности самой клетки, и, таким образом, их можно широко применять для различных заболеваний, в которые вовлечены NK-клетка и PBMC. В результате, ожидается, что фармацевтические композиции, включающие NK-клетку и PBMC, будут иметь высокую коммерческую применимость.

Краткое описание рисунков

ФИГ. 1 показывает результат, полученный путем анализа при помощи ПЦР, для того чтобы исследовать, доставлены ли митохондрии, полученные из здоровых гепатоцитов человека (WRL68), в NK-клетки.

ФИГ. 2 показывает результат, полученный путем анализа при помощи FACS, для того чтобы исследовать, доставлены ли митохондрии, полученные из здоровых гепатоцитов человека, в NK-клетки.

ФИГ. 3 показывает результаты, полученные путем флуоресцентной микроскопии, для того чтобы локализовать митохондрии, полученные из здоровых гепатоцитов человека и доставленные в NK-клетки.

ФИГ. 4A и 4B иллюстрируют результаты анализа дегрануляции CD107a, показывающие противоопухолевую активность NK-клеток, в которые были введены экзогенные митохондрии.

ФИГ. 5 иллюстрирует результат анализа цитотоксичности по отношению к K562, показывающий цитотоксические эффекты NK-клетки, в которые были введены экзогенные митохондрии.

ФИГ. 6 показывает результат, полученный путем анализа при помощи FACS, для того чтобы исследовать, доставлены ли митохондрии, полученные из мезенхимальных стволовых клеток пупочного канатика (UC-MSC), в NK-клетки.

ФИГ. 7 иллюстрирует результат анализа цитотоксичности по отношению к K562, показывающий цитотоксические эффекты NK-клетки, в которые были введены митохондрии, полученные из UC-MSC.

ФИГ. с 8A по 8C иллюстрирует результаты, показывающие терапевтические эффекты NK-клеток, в которые были введены митохондрии, полученные из UC-MSC, на животной модели острого миелогенного лейкоза, в отношении массы тела и коэффициента выживаемости мышей.

ФИГ. 9 показывает результаты распределения экспрессии маркеров опухолей крови на животной модели острого миелогенного лейкоза, которой были введены NK-клетки с митохондриями, полученными из UC-MSC.

ФИГ. 10 иллюстрирует результат анализа цитотоксичности по отношению к K562, показывающий цитотоксические эффекты PBMC, в которые были введены экзогенные митохондрии.

Подробное описание изобретения

Далее в настоящем документе настоящее изобретение будет описано подробно.

В аспекте настоящего изобретения, предлагается NK-клетка, обогащенная экзогенными митохондриями.

Как применяют в настоящем документе, термин «экзогенные митохондрии» относится к митохондриям, введенным экзогенно, а не к митохондриям, присутствующим в NK-клетке. В настоящем документе, экзогенные митохондрии можно получать от того же индивидуума, от которого получают NK-клетку, но можно получать от другого индивидуума. В настоящем документе, экзогенные митохондрии можно получать от млекопитающего, и предпочтительно можно получать от человека. Например, экзогенные митохондрии можно получать из мышечных клеток, гепатоцитов, фибробластов, эпителиальных клеток, нейронов, адипоцитов, остеоцитов, лейкоцитов, лимфоцитов или клеток слизистой, и предпочтительно можно получать из мышечных клеток с превосходной митохондриальной активностью клетки. Кроме того, митохондрии можно получать из клеток, культивируемых ex vivo.

С другой стороны, экзогенные митохондрии можно получать, разрушая клетки и проводя центрифугирование, или культивируя клетки, разрушая клетки и проводя центрифугирование. Для способа получения митохондрий можно использовать общепринятый способ, применяемый для сбора органеллы.

В настоящем документе, NK-клетку, содержащую экзогенные митохондрии, можно получать введением митохондрий в количестве от 0,01 до 500 мкг, от 0,1 до 450 мкг, от 0,5 до 300 мкг, от 1 до 100 мкг, или от 2 до 10 мкг на 10⁵ NK-клеток. В настоящем документе, NK-клетка может содержать от 1 до 10³ или от 10 до 10² экзогенных митохондрий. Конкретно, число экзогенных митохондрий может быть таким, что приблизительно 1, 10, 100, или 500 экзогенных митохондрий содержатся в одной NK-клетке. В настоящем документе, число экзогенных митохондрий, содержащихся в NK-клетках, можно регулировать путем контроля количества экзогенных митохондрий, вводимых в NK-клетки. Каждая отдельная NK-клетка может содержать различное число экзогенных митохондрий.

Кроме того, NK-клетки можно получать у млекопитающего или человека. Предпочтительно, NK-клетки можно получать от индивидуума, которому предполагается проводить терапию NK-клетками. В настоящем документе, NK-клетки можно прямо выделять из крови индивидуума и применять, или можно получать путем дифференцировки незрелых NK-клеток или стволовых клеток, полученных от индивидуума, и применять.

Между тем, для того чтобы вводить экзогенные митохондрии в NK-клетки, экзогенные митохондрии и NK-клетки можно смешивать, а затем смесь можно центрифугировать и, таким образом, эффективно доставлять митохондрии в NK-клетки. Условия во время проведения центрифугирования можно регулировать соответствующим образом для эффективного введения митохондрий без повреждения клеток. В настоящем изобретении, центрифугирование можно проводить при комнатной температуре, и температуру выбирают соответствующим образом для стабильности клеток. В настоящем документе, во время введения экзогенных митохондрий NK-клетки и экзогенные митохондрии можно смешивать в присутствии поверхностно-активного вещества, чтобы повысить проницаемость мембран для проникновения экзогенных митохондрий в NK-клетки, таким образом, повышая эффективность введения экзогенных митохондрий.

В настоящем документе, центрифугирование можно проводить при 100×g, 300×g, 500×g, 800×g, 1000×g, 1200×g, 1500×g, 1800×g, 2000×g, 2400×g, 3000×g, 5000×g или 10000×g. Кроме того, время центрифугирования может составлять от 0,1 минуты до 60 минут, но не ограничивается этим. Конкретно, время центрифугирования может составлять 1 минуту, 2 минуты, 3 минуты, 5 минут, 10 минут, 20 минут или 30 минут. Кроме того, центрифугирование можно проводить при температуре от 0°C до 40°C, от 20°C до 38°C или от 30°C до 37°C.

Таким образом, с применением силы центрифугирования к NK-клеткам и экзогенным митохондриям, можно доставлять митохондрии в NK-клетки с высокой эффективностью с меньшим повреждением NK-клеток.

Кроме того, можно использовать поверхностно-активное вещество для улучшения проникновения экзогенных митохондрий через клеточную мембрану в NK-клетки. Момент времени, в который добавляют поверхностно-активное вещество, может быть до, во время или после смешивания NK-клеток с экзогенными митохондриями. Кроме того, после того как поверхностно-активное вещество добавляют к NK-клеткам, NK-клетки можно инкубировать в течение определенного периода времени для того чтобы повысить проникновение экзогенных митохондрий через клеточную мембрану в NK-клетки. Время инкубации может составлять от 0,1 до 60 минут. Конкретно, время инкубации может составлять 1 минуту, 5 минут, 10 минут, 20 минут или 30 минут, но не ограничивается этим.

Конкретно, поверхностно-активное вещество предпочтительно представляет собой неионное поверхностно-активное вещество, и может быть полоксамером. В настоящем документе, полоксамер представляет собой триблок-сополимер, состоящий из центральной гидрофобной цепи полиоксипропилена, фланкированной двумя гидрофильными цепями полиоксиэтилена. Кроме того, поверхностно-активное вещество в смеси может иметь концентрацию от 1 до 100 мг/мл, от 3 до 80 мг/мл, или от 5 до 40 мг/мл, и может составлять предпочтительно от 10 до 30 мг/мл.

Кроме того, способ может дополнительно включать этап инкубирования смеси при предопреденном времени и температуре. Инкубацию можно проводить при температуре от 0°C до 40°C, от 20°C до 38°C или от 30°C до 37°C. Кроме того, инкубацию можно проводить в течение периода от 0,1 до 4 часов, от 0,5 до 3,8 часов или от 0,8 до 3,5 часов. Кроме того, инкубацию можно проводить в течение предопределенного времени после проведения центрифугирования, чтобы доставить экзогенные митохондрии в NK-клетки. Кроме того, время инкубации можно выбирать соответствующим образом в зависимости от типа клеток и количества митохондрий.

В другом аспекте настоящего изобретения, предлагается фармацевтическая композиция для лечения злокачественной опухоли или инфекционного заболевания, которая содержит в качестве активного ингредиента NK-клетку с экзогенными митохондриями.

В настоящем документе, злокачественная опухоль может быть любой опухолью, выбранной из группы, состоящей из рака желудка, рака печени, рака легких, колоректального рака, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака шейки матки, рака щитовидной железы, рак гортани, острого миелогенного лейкоза, опухоли головного мозга, нейробластомы, ретинобластомы, рака головы и шеи, рака слюнных желез и лимфомы. Кроме того, инфекционное заболевание может быть любым заболеванием, выбранным из группы, состоящей из гепатита B, гепатита C, инфекции вирусом папилломы человека (HPV), инфекции цитомегаловирусом, вирусного респираторного заболевания и гриппа.

Кроме того, фармацевтическая композиция может быть изготовлена в жидкой или замороженной форме. Даже в случае повторного оттаивания после замораживания фармацевтическая композиция не проявляет нарушения клеточной функции и может поддерживать высокую жизнеспособность клеток и способность уничтожать клетки. Таким образом, фармацевтическую композицию можно легко хранить и поставлять в жидком или замороженном виде без дополнительной обработки.

В другом аспекте настоящего изобретения, предлагается способ профилактики или лечения заболевания, включающий этап введения индивидууму фармацевтической композиции, которая содержит в качестве активного ингредиента NK-клетки с экзогенными митохондриями.

Такой способ включает этап введения эффективного количества NK-клетки по изобретению индивидууму с заболеванием или индивидууму, у которого подозревают наличие заболевания. Например, клетку, в которую были введены экзогенные митохондрии, можно вводить индивидууму, предпочтительно млекопитающему, в виде терапевтического препарата. Клетку можно вводить путем внутривенного или подкожного введения. В случае, когда композиция по настоящему изобретению предоставляется парентерально, таким путем введения как внутривенный, подкожный, глазной, интраперитонеальный, или внутримышечный пути, композиция предпочтительно находится в водной форме, или предпочтительно, что композиция включает физиологически применимую биологическую жидкость, суспензию или раствор. Таким образом, носитель является физиологически приемлемым, и его, таким образом, можно добавлять к композиции и доставлять пациенту. Такой носитель не влияет отрицательно на электролиты пациента. Таким образом, как правило, в качестве носителя для препаратов может быть использован физиологический раствор.

Способ для профилактики или лечения заболевания с использованием клетки по настоящему изобретению может также включать введение другого лекарственного средства или физиологически активного вещества с эффектом профилактики или лечения заболевания, в комбинации с клеткой по настоящему изобретению. Путь введения, время и дозу для комбинированного введения можно определять в зависимости от типа заболевания, течения заболевания пациента, цели лечения или профилактики, и другого лекарственного средства или физиологически активного вещества, применяемого в комбинации.

Кроме того, заболевание может быть злокачественной опухолью или инфекционным заболеванием. В настоящем документе, злокачественная опухоль может быть выбрана из группы, состоящей из рака желудка, рака печени, рака легких, колоректального рака, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака шейки матки, рака щитовидной железы, рак гортани, острого миелогенного лейкоза, опухоли головного мозга, нейробластомы, ретинобластомы, рака головы и шеи, рака слюнных желез и лимфомы. Кроме того, инфекционное заболевание может быть любым заболеванием, выбранным из группы, состоящей из гепатита B, гепатита C, инфекции вирусом папилломы человека (HPV), инфекции цитомегаловирусом, вирусного респираторного заболевания и гриппа.

Еще в одном аспекте настоящего изобретения, предлагается PBMC, содержащая экзогенные митохондрии.

Как применяют в настоящем документе, термин «мононуклеарная клетка периферической крови» относится к клетке со сферическим ядром, присутствующей в периферической крови, которая обозначается как моноцит периферической крови или PBMC. Такие PBMC могут включать иммунные клетки, такие как B-клетки, T-клетки, макрофаги, дендритные клетки и NK-клетки. PBMC можно получать из крови индивидуума. В настоящем документе, экзогенные митохондрии можно получать из тканей или клеток индивидуума, как описано выше.

В настоящем документе, PBMC, содержащую экзогенные митохондрии, можно получать путем введения митохондрий в количестве от 0,01 до 500 мкг, от 0,1 до 450 мкг, от 0,5 до 300 мкг, от 1 до 100 мкг, или от 2 до 10 мкг, на 10⁵ PBMC. В настоящем документе, одна PBMC может содержать экзогенные митохондрии в количестве от 1 до 10³ или от 10 до 100. Кроме того, способ введения экзогенных митохондрий в PBMC можно проводить путем центрифугирования, как описано выше. Еще в одном аспекте настоящего изобретения, предлагается фармацевтическая композиция для лечения злокачественной опухоли или инфекционного заболевания, которая содержит в качестве активного ингредиента PBMC с экзогенными митохондриями.

В настоящем документе, как описано выше, злокачественная опухоль может быть выбрана из группы, состоящей из рака желудка, рака печени, рака легких, колоректального рака, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака шейки матки, рака щитовидной железы, рак гортани, острого миелогенного лейкоза, опухоли головного мозга, нейробластомы, ретинобластомы, рака головы и шеи, рака слюнных желез и лимфомы. Кроме того, инфекционное заболевание может быть любым заболеванием, выбранным из группы, состоящей из гепатита B, гепатита C, инфекции вирусом папилломы человека (HPV), инфекции цитомегаловирусом, вирусного респираторного заболевания и гриппа.

Далее в настоящем документе, настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на последующие примеры. Однако следующие примеры приведены только для иллюстрации настоящего изобретения, и не ограничивают объем настоящего изобретения.

I. Получение NK-клеток, в которые были введены экзогенные митохондрии, и определение их функций

Пример 1. Получение NK-клеток, в которые были введены экзогенные митохондрии

Здоровые гепатоциты человека (WRL-68) (CRL 1458, ATCC) высевали в модифицированную Дульбекко среду Игла (DMEM), дополненную 10% эмбриональной телячьей сывороткой (FBS; Gibco), 100 мкг/мл стрептомицина и 100 Ед/мл ампициллина, и культивировали в течение 72 часов. После завершения культивирования клетки отмывали дважды фосфатно-солевым буфером по Дульбекко (DPBS; Gibco). Отмытые клетки обрабатывали 0,25% трипсином-ЭДТА (TE; Gibco) для получения клеток. Для клеток, полученных для выделения митохондрий, использовали гемоцитометр для измерения числа клеток, и собирали клетки в количестве приблизительно 3×10⁶ клеток/мл.

После этого проводили первичное центрифугирование клеточной линии при температуре приблизительно 4°C в течение 10 минут со скоростью 350×g. Полученный осадок собирали, ресуспендировали и гомогенизировали в буферном растворе от 10 до 15 минут. Проводили вторичное центрифугирование композиции, содержащей осадок, при температуре приблизительно 4°C в течение 3 минут со скоростью 1100×g для получения супернатанта. Затем проводили третье центрифугирование супернатанта при температуре приблизительно 4°C в течение 15 минут со скоростью 12000×g для выделения митохондрий из клеточной линии.

Выделенные митохондрии вводили в количестве 1×10⁵ в тестовую пробирку, содержащую отдельные NK-клетки человека (NK92mi) (CRL2408; ATCC), и проводили центрифугирование при температуре приблизительно 4°C в течение 15 минут со скоростью 2500×g. После удаления супернатанта проводили отмывание при помощи PBS и центрифугировали при температуре приблизительно 4°C в течение 5 минут. Отмывание проводили дважды в тех же условиях. В настоящем документе, выделенные митохондрии добавляли в массе 0,05, 0,05, 0,5, и 5 мкг на 1×10⁵ реципиентных клеток.

Пример 2. Определение доставки митохондрий, полученных из здоровых гепатоцитов человека (WRL68), в NK-клетки (способ ПЦР-анализа)

Использовали набор для очистки ДНК (NucleoSpin; MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG) для выделения полного генома из NK-клеток, собранных в примере 1. Выделенную ДНК соразмерно смешивали с праймерами, специфичными для идентификации митохондрий из WRL-68 (F: 5'-CTA TTC TCT GTT CTT TCA TGG-3' (SEQ ID NO: 1), R: 5'-AAG TAT TTA TGG TAC CGT ACG-3' (SEQ ID NO: 2)). Затем добавляли 2× мастермикс для ПЦР (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) и трижды дистиллированную воду таким образом, что общий объем полученной смеси составил 10 мкл, и использовали 96-луночный термоциклер Veriti (Applied Biosystems) для амплификации желаемой части ДНК.

Для получения амплицированной ДНК проводили реакцию ПЦР. Для выявления амплифицированной ДНК проводили электрофорез на 1,5% агарозном геле, а затем окрашивание Loading Star (DYNEBIO INC., Seongnam, Korea). Для выявления полос амплифицированной ДНК использовали УФ-спектрометр (Chemi-Doc XRS; Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). В качестве гена домашнего хозяйства выбирали GAPDH. Для этого использовали праймеры, способные амплифицировать GADPH (F- 5'-GGA AGG TGA AGG TCG GAG-3' (SEQ ID NO: 3), R- 5'-GGC AAC AAT ATC CAC TTT ACC-3' (SEQ ID NO: 4)). Этот результат показан на ФИГ. 1.

ФИГ. 1 указывает на то, что количество экзогенных митохондрий, доставленных в NK-клетки, повышается с увеличением количеств митохондрий (0,005, 0,05, 0,5, и 5 мкг), которые смешивают с NK-клетками.

Пример 3. Определение доставки митохондрий, полученных из здоровых гепатоцитов человека (WRL68), в NK-клетки (способ анализа при помощи FACS)

Проводили анализ с клеточным сортером с активацией флуоресценции (FACS) для того чтобы определить, доставлены ли митохондрии, полученные из гепатоцитов, в NK-клетки. Митохондрии, выделенные из здоровых гепатоцитов человека, обрабатывали 500 нМ красителя Green mitotracker (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA). Полученную смесь оставляли для прохождения реакции на 10 минут в инкубаторе с 5% CO₂ при 37°C, и промывали. Флуоресценцентно-меченные митохондрии, полученные из гепатоцитов, доставляли в иммунные клетки с использованием способа центрифугирования, а затем иммунные клетки ресуспендировали в 1 мл PBS. Затем, доставку митохондрий выявляли и анализировали с использованием проточного цитометра FACS Calibur (BDBiosciences, San Jose, CA, USA). Результат показан на ФИГ. 2.

Из ФИГ. 2, было выявлено, что NK-клетки можно отличать в зависимости от количества (0,005, 0,05, 0,5, и 5 мкг) митохондрий, доставленных в NK-клетки.

Пример 4. Определение доставки митохондрий, полученных из здоровых гепатоцитов человека (WRL68), в NK-клетки (наблюдение путем флуоресцентной микроскопии)

Для того чтобы определить, доставлены ли митохондрии, полученные из здоровых гепатоцитов (WRL-68), в человеческие NK-клетки (NK92mi), митохондрии NK-клеток обрабатывали 500 нМ красителя Green mitotracker (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) и оставляли для прохождения реакции на 10 минут в инкубаторе с 5% CO₂ при 37°C. Митохондрии, выделенные из гепатоцитов, обрабатывали 500 нМ красителя red mitotracker. Полученную смесь оставляли для прохождения реакции на 10 минут в инкубаторе с 5% CO₂ при 37°C, а затем доставляли в NK-клетки. После доставки 5 мкг митохондрий, клетки высевали в 24-луночный планшет и инкубировали в инкубаторе с 5% CO₂ при 37°C. Затем использовали флуоресцентную микроскопию для выявления внутриклеточной доставки в течение 24 часов. В качестве реагента для контроля окрашивания использовали реагент DAPI для окрашивания ядер. Результаты показаны на ФИГ. 3.

Из ФИГ. 3, было выявлено, что экзогенные митохондрии были доставлены в NK-клетки.

Пример 5. Анализ изменений противоопухолевой активности NK-клеток, в которые были доставлены митохондрии (анализ дегрануляции CD107a)

Для того чтобы выявить экспрессию CD107a при помощи дегрануляции, которая является указателем активности NK-клеток, у человеческих NK-клеток (NK92mi) с введенными экзогенными митохондриями, собранных в примере 1, человеческие NK-клетки и клетки-мишени (K562) смешивали в соотношении 10:1, а затем смесь обрабатывали антителом к CD107a, которое было конъюгировано с флуоресцентным веществом. Полученную смесь инкубировали в течение 4 часов. После конъгации смесь обрабатывали антителом к CD56 для окрашивания поверхности и оставляли для проведения реакции в течение 30 минут. Затем проводили анализ с клеточным сортером с активацией флуоресценции (FACS). Результаты показаны на ФИГ. 4A и 4B.

Из ФИГ. 4A и 4B, было выявлено, что противоопухолевая активность NK-клеток повышается с количеством (0,05, 0,5, и 5 мкг) экзогенных митохондрий.

Пример 6: Анализ изменений противоопухолевой активности NK-клеток, в которые были доставлены митохондрии (анализ цитотоксичности по отношению к K562)

Для того чтобы выявить противоопухолевую активность NK-клеток, собранных в Примере 1, собранные NK-клетки смешивали в соотношении 10:1 с клетками-мишенями (K562), меченными зеленым флуоресцентным красителем (CFSE; Invitrogen), а затем смесь инкубировали в течение 4 часов в инкубаторе с 5% CO₂ при 37°C. После инкубации для анализа клеток-мишеней, уничтоженных NK-клетками, смесь обрабатывали красным флуоресцентным красителем (7-AAD; Invitrogen), а затем оставляли для проведения реакции в течение 10 минут. Интенсивность флуоресценции убитых клеток-мишеней анализировали клеточным сортером с активацией флуоресценции (FACS). Результат показан на ФИГ. 5.

Из ФИГ. 5, было выявлено, что цитотоксичность против K562 повышается с количеством (0,05, 0,5, и 5 мкг) доставленных экзогенных митохондрий.

Пример 7. Получение NK-клеток, в которые были введены митохондрии, полученные из мезенхимальных стволовых клеток пупочного канатика

Мезенхимальные стволовые клетки, полученные из плаценты (предоставленные медицинским центром CHA bundang, IRB No. 1044308-201511-BR-022-02) высевали в минимальную поддерживающую среду-Альфа (Альфа-MEM), дополненную 10% эмбриональной телячьей сывороткой (FBS; Gibco), 100 мкгг/мл стрептомицина, и 100 Ед/мл ампициллина, и культивировали в течение 72 часов.

После завершения культивирования клетки отмывали дважды фосфатно-солевым буфером по Дульбекко (DPBS; Gibco). Отмытые клетки обрабатывали 0,25% трипсином-ЭДТА (TE; Gibco) для получения клеток. Для клеток, полученных для выделения митохондрий, использовали гемоцитометр для измерения числа клеток, и собирали клетки в количестве приблизительно 2×10⁷ клеток/мл.

После этого проводили первичное центрифугирование клеточной линии при температуре приблизительно 4°C в течение 10 минут со скоростью 350×g. Полученный осадок собирали, ресуспендировали и гомогенизировали в буферном растворе от 10 до 15 минут. Проводили вторичное центрифугирование композиции, содержащей осадок, при температуре приблизительно 4°C в течение 3 минут со скоростью 1100×g для получения супернатанта. Затем проводили третье центрифугирование супернатанта при температуре приблизительно 4°C в течение 15 минут со скоростью 12000×g для выделения митохондрий из клеточной линии.

Выделенные митохондрии вводили в количестве 1×10⁵ в тестовую пробирку, содержащую отдельные NK-клетки человека (NK92mi) (CRL2408; ATCC), и проводили центрифугирование при температуре приблизительно 4°C в течение 15 минут со скоростью 2500×g. После удаления супернатанта проводили отмывание при помощи PBS и центрифугировали при температуре приблизительно 4°C в течение 5 минут. Отмывание проводили дважды в тех же условиях. В настоящем документе, выделенные митохондрии добавляли в массе 0,3, 1, 3, 5 и 10 мкг на 1×10⁵ реципиентных клеток.

Пример 8. Определение доставки митохондрий, полученных из мезенхимальных стволовых клеток пупочного канатика (UC-MSC), в NK-клетки (способ анализа при помощи FACS)

Проводили анализ с клеточным сортером с активацией флуоресценции (FACS), для того чтобы определить, доставлены ли митохондрии, полученные из мезенхимальных стволовых клеток пупочного канатика, в NK-клетки. Митохондрии, выделенные из мезенхимальных стволовых клеток пупочного канатика, обрабатывали 500 нМ красителя Red mitotracker (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA). Полученную смесь оставляли для прохождения реакции на 30 минут в инкубаторе с 5% CO₂ при 37°C и промывали. Флуоресценцентно-меченные митохондрии, полученные из мезенхимальных стволовых клеток пупочного канатика, доставляли в иммунные клетки с использованием способа центрифугирования, а затем клетки ресуспендировали в 1 мл PBS. Затем, доставку митохондрий выявляли и анализировали с использованием проточного цитометра FACS Calibur (BDBiosciences, San Jose, CA, USA). Результаты показаны на ФИГ. 6.

Из ФИГ. 6, было выявлено, что NK-клетки можно отличать при помощи количества (0,3, 1, 3, 5, и 10 мкг) митохондрий, полученных из UC-MSC и доставленных в NK-клетки.

Пример 9. Анализ изменений противоопухолевой активности NK-клеток, в которые были доставлены митохондрии, полученные из мезенхимальных стволовых клеток пупочного канатика (UC-MSC) (анализ цитотоксичности по отношению к K562)

Для того чтобы выявить противоопухолевую активность NK-клеток, собранных в Примере 7, собранные NK-клетки смешивали в соотношении 10:1 с клетками-мишенями (K562), меченными зеленым флуоресцентным красителем (CFSE; Invitrogen), а затем смесь инкубировали в течение 4 часов в инкубаторе с 5% CO₂ при 37°C. После инкубации для анализа клеток-мишеней, уничтоженных NK-клетками, смесь обрабатывали красным флуоресцентным красителем (7-AAD; Invitrogen), а затем оставляли для проведения реакции в течение 10 минут. Интенсивность флуоресценции убитых клеток-мишеней анализировали клеточным сортером с активацией флуоресценции (FACS). Результат показан на ФИГ. 7.

Из ФИГ. 7, было выявлено, что цитотоксичность против K562 повышается с количествами (0,5, 1, 3, 5, и 10 мкг) доставленных экзогенных митохондрий.

Пример 10. Определение терапевтической оценки на остром миелогенном лейкозе при помощи изменения массы тела и коэффициента выживаемости

Самцов мышей NOD.cg-Prkdcscid IL2rgtm1Sug/JicKoat в возрасте 6-8 недель приобретали у Koatech Co., Ltd. (Gyeonggi-do, Korea). Приобретенные мыши проходили период адаптации в чистой зоне в центре подопытных животных университета CHA, а затем проводили эксперимент. Во время периода адаптации, окружение, в котором находились мыши, имело периоды дня и ночи с интервалом в 12 часов и комнатную температуру 23±2°C, и влажность от 40% до 60%. Мыши проходили такой период адаптации в течение 7 суток, а затем участвовали в эксперименте. Подготовленным таким образом мышам вводили в хвостовую вену (внутривенной (в/в) инъекцией) клетки K562 в количестве 2×10⁵ клеток/100 мкл для того чтобы получить модель острого миелогенного лейкоза.

В настоящем изобретении мышам с индуцированным острым миелогенным лейкозом вводили в хвостовую вену (внутривенной (в/в) инъекцией) NK-клетки (NK92mi), приготовленные в соответствии с примером 7, в количестве 2×10⁶ клеток/100 мкл, для того чтобы получить экспериментальную группу. Таким же образом получали контрольную группу, вводя здоровые NK-клетки (NK92mi), в которые не доставляли митохондрии, в количестве 2×10⁶ клеток/100 мкл. Анализировали изменение массы тела и коэффициент выживаемости в экспериментальной и контрольной группе в течение 24 суток от момента введения клеточной линии с острым миелогенным лейкозом (K562). Результаты показаны на ФИГ. с 8A по 8C.

Из ФИГ. с 8A по 8C, было выявлено, что группа, которой вводили NK-клетки с митохондриями из мезенхимальных стволовых клеток пупочного канатика, демонстрирует приблизительно 5% увеличение массы тела и приблизительно 40% или большее увеличение коэффициента выживаемости по сравнению с группой, которой вводили здоровые NK-клетки без митохондрий из мезенхимальных стволовых клеток пупочного канатика.

Пример 11. Определение терапевтической оценки на остром миелогенном лейкозе при помощи анализа опухоль-ассоциированных маркеров

Для того чтобы выявить распределение экспрессии опухоль-ассоциированных маркеров, p53 и c-Myc, собирали кровь экспериментальной группы и контрольной группы, на которых проводили эксперимент согласно примеру 10, а затем центрифугировали при 12000×g в течение 15 минут для выделения сыворотки. Выделенную сыворотку анализировали на распределение экспрессии p53 и c-Myc при помощи набора для Вестерн-блоттинга (WB; Bio-Rad Laboratories, Inc.). Результаты показаны на ФИГ. 9.

Из ФИГ. 9 было выявлено, что группа, которой вводили NK-клетки с митохондриями из мезенхимальных стволовых клеток пупочного канатика, демонстрирует сниженную экспрессию c-Myc и повышенную экспрессию p53, при этом c-Myc и p53 являются маркерами опухолей крови.

II. Получение PBMC, в которые были введены экзогенные митохондрии, и определение их функций

Пример 12. Получение PBMC, в которые были введены экзогенные митохондрии

Периферическую кровь автора изобретения, взятую врачом (с медицинском центре CHA), обрабатывали Фиколл-Пак (Amersham Biosciences) в соотношении 1:1 в пробирке фирмы Falcon, а затем смесь центрифугировали при 400×g в течение 35 минут длясбора осадка с PBMC. Собранные PBMC отмывали дважды PBS. Затем, полученные из человеческих гепатоцитов (WRL-68) митохондрии, которые были выделены в соответствии с примером 1, доставляли в PBMC в массе 0,05, 0,05, 0,5 и 5 мкг на 1×10⁵ реципиентных клеток.

Пример 13. Выявление изменений противоопухолевой активности PBMC, в которые были доставлены митохондрии (анализ цитотоксичности по отношению к K562)

Для того чтобы выявить противоопухолевую активность PBMC, собранных в Примере 12, собранные PBMC смешивали в соотношении 10:1 с клетками-мишенями (K562), меченными зеленым флуоресцентным красителем (CFSE; Invitrogen), а затем смесь инкубировали в течение 4 часов в инкубаторе с 5% CO₂ при 37°C. После инкубации для анализа клеток-мишеней, уничтоженных NK-клетками, смесь обрабатывали красным флуоресцентным красителем (7-AAD; Invitrogen), а затем оставляли для проведения реакции в течение 10 минут. Интенсивность флуоресценции убитых клеток-мишеней анализировали клеточным сортером с активацией флуоресценции (FACS). Результат показан на ФИГ. 10.

Из ФИГ. 10, было выявлено, что цитотоксичность против K562 повышалась с количествами (0,005, 0,05, и 0,5 мкг) введенных экзогенных митохондрий.

--->

<110> Paean Biotechnology Inc.

<120> КЛЕТКА-ЕСТЕСТВЕННЫЙ КИЛЛЕР, СОДЕРЖАЩАЯ ЧУЖЕРОДНЫЕ МИТОХОНДРИИ, И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ВКЛЮЧАЮЩАЯ ТАКУЮ КЛЕТКУ

<130> PCB711058PBT

<150> KR 10-2016-0151411

<151> 2016-11-14

<160> 4

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер для выявления митохондрий WRL-68

<400> 1

ctattctctg ttctttcatg g 21

<210> 2

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер для выявления митохондрий WRL-68

<400> 2

aagtatttat ggtaccgtac g 21

<210> 3

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер для выявления гена GAPDH

<400> 3

ggaaggtgaa ggtcggag 18

<210> 4

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер для выявления гена GAPDH

<400> 4

ggcaacaata tccactttac c 21

<---

Настоящее изобретение относится к области клеточной биологии и медицины, в частности к цитотоксическим клеткам-естественным киллерам (NK), содержащим экзогенные митохондрии, а также к композиции и способу для лечения злокачественной опухоли, такой как рак желудка, рак печени, рак лёгких, колоректальный рак, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак шейки матки, рак щитовидной железы, рак гортани, острый миелоидный лейкоз, опухоль головного мозга, нейробластома, ренинобластома, рак головы и шеи, рак слюнных желез и лимфома, или инфекционного заболевания, такого как гепатит B, гепатит C, HPV, инфекция цитомегаловирусом, вирусные респираторные заболевания и грипп. Указанные экзогенные митохондрии могут быть получены из мышечных клеток, гепатоцитов, фибробластов, эпителиальных клеток, нейронов, адипоцитов, остеоцитов, лейкоцитов, лимфоцитов, моноцитов, стволовых клеток или клеток слизистых оболочек. Настоящее изобретение позволяет повысить цитотоксичность NK-клеток, способствующую усилению иммунной системы организма человека для улучшения их терапевтического воздействия. 3 н. и 5 з.п. ф-лы, 13 ил., 13 пр.

1. Цитотоксическая клетка-естественный киллер, содержащая экзогенные митохондрии и по меньшей мере одну эндогенную интактную митохондрию,

где экзогенные митохондрии получены из мышечных клеток, гепатоцитов, фибробластов, эпителиальных клеток, нейронов, адипоцитов, остеоцитов, лейкоцитов, лимфоцитов, моноцитов, стволовых клеток или клеток слизистых оболочек.

2. Клетка-естественный киллер по п. 1, где экзогенные митохондрии содержатся в количестве от 1 до 10³ на клетку-естественного киллера.

3. Клетка-естественный киллер по п. 1, где экзогенные митохондрии доставляют в клетку-естественного киллера путем центрифугирования композиции, при котором смешиваются экзогенные митохондрии и клетка-естественный киллер.

4. Фармацевтическая композиция для лечения злокачественной опухоли или инфекционного заболевания, включающая в качестве активного ингредиента эффективное количество цитотоксической клетки-естественного киллера по п. 1,

где злокачественная опухоль выбрана из группы, состоящей из рака желудка, рака печени, рака легких, колоректального рака, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака шейки матки, рака щитовидной железы, рака гортани, острого миелогенного лейкоза, опухоли головного мозга, нейробластомы, ретинобластомы, рака головы и шеи, рака слюнных желез и лимфомы,

где инфекционное заболевание выбрано из группы, состоящей из гепатита B, гепатита C, инфекции вирусом папилломы человека (HPV), инфекции цитомегаловирусом, вирусного респираторного заболевания и гриппа.

5. Фармацевтическая композиция по п. 4, где композиция находится в жидкой или замороженной форме.

6. Способ профилактики или лечения злокачественной опухоли или инфекционного заболевания, включающий этап введения фармацевтической композиции, которая содержит в качестве активного ингредиента цитотоксическую клетку-естественного киллера по п. 1, нуждающемуся в этом индивидууму,

где злокачественная опухоль выбрана из группы, состоящей из рака желудка, рака печени, рака легких, колоректального рака, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака шейки матки, рака щитовидной железы, рака гортани, острого миелогенного лейкоза, опухоли головного мозга, нейробластомы, ретинобластомы, рака головы и шеи, рака слюнных желез и лимфомы,

где инфекционное заболевание выбрано из группы, состоящей из гепатита B, гепатита C, инфекции вирусом папилломы человека (HPV), инфекции цитомегаловирусом, вирусного респираторного заболевания и гриппа.

7. Способ по п. 6, где композицию вводят путем, выбранным из группы, состоящей из внутривенного, подкожного, глазного, интраперитонеального или внутримышечного путей.

8. Способ по п. 6, где способ включает введение другого лекарственного средства или физиологически активного вещества с эффектом профилактики или лечения злокачественной опухоли или инфекционного заболевания в комбинации с клеткой.