УНИВЕРСАЛЬНЫЕ АНТИГЕНПРЕЗЕНТИРУЮЩИЕ КЛЕТКИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2023 года по МПК C12N5/783 A61K35/12 A61K35/17 A61K38/20 

[0001] По настоящей заявке испрашивается приоритет Предварительной патентной заявки США No. 62/633587, поданной 21 февраля 2018 г., полное содержание которой приведено в настоящем описании в качестве ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Список последовательностей, содержащийся в файле, названном «UTFCP1355WO_ST25.txt», который имеет размер кБ (как измерено в Microsoft Windows) и создан 21 февраля 2019 г., подан с настоящим описанием посредством электронной подачи, и его содержание приведено в настоящем описании в качестве ссылки.

1. Область техники

[0003] Настоящее изобретение относится, главным образом, к области медицины и иммунологии. Более конкретно, оно относится к антигенпрезентирующим клеткам и их применениям, таким как размножение клеток естественных киллеров (NK).

2. Описание предшествующего уровня техники

[0004] Клетки естественные киллеры (NK) не нуждаются в предварительном воздействии антигенов для активации, в отличие от T-клеток, что делает их высоко эффективными в иммунологическом надзоре над опухолями. В то время как предварительная активация не является необходимой, огромная активность уничтожения клеток NK требует строго контроля, чтобы препятствовать непреднамеренной цитотоксичности и аутоиммунитету. Получение клинически достаточных количеств и оптимально функционирующих клеток NK является другим затруднением. Таким образом, существует необходимость сфокусироваться на молекулярном аппарате, управляющим биологией клетки NK для установления отличий «устойчивых» от «чувствительных» клеток-мишеней для конструирования клеток-помощников для улучшения опосредованной клетками NK иммунотерапии злокачественных опухолей.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0005] Соответственно, конкретные варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способам и композициям, относящимся к получению, размножению, контролю качества и функциональной характеризации клеток NK клинической квалификации, предназначенных для клеточной и иммунотерапии.

[0006] В первом варианте осуществления, настоящее изобретение относится к универсальной антигенпрезентирующей клетке (UAPC), модифицированной для экспрессии (1) CD48 и/или CS1 (CD319), (2) связанного с мембраной интерлейкина-21 (mbIL-21) и (3) лиганда 41BB (41BBL). В некоторых аспектах, UAPC экспрессирует CD48. В других аспектах, UAPC экспрессирует CS1. В конкретных аспектах, UAPC экспрессирует CD48 и CS1.

[0007] В некоторых аспектах, UAPC по существу не имеет экспрессии эндогенных молекул HLA класса I, II или CD1d. В конкретных аспектах, UAPC экспрессирует ICAM-1 (CD54) и LFA-3 (CD58).

[0008] В конкретных аспектах, UAPC дополнительно определяют как происходящую из клетки лейкоза aAPC. В некоторых аспектах, происходящую из клетки лейкоза UAPC дополнительно определяют как клетку K562.

[0009] В некоторых аспектах, модификацию дополнительно определяют как ретровирусную трансдукцию. В некоторых аспектах, ретровирусную трансдукцию дополнительно определяют как трансдукцию вирусной конструкцией из SEQ ID NO:1 и/или SEQ ID NO:2. В конкретных аспектах, UAPC является облученной.

[0010] В следующем варианте осуществления, настоящее изобретение относится к способу размножения иммуноцитов, включающему культивирование иммуноцитов в присутствии эффективного количества UAPC из вариантов осуществления (например, универсальной антигенпрезентирующей клетки (UAPC), модифицированной для экспрессии (1) CD48 и/или CS1 (CD319), (2) связанного с мембраной интерлейкина-21 (mbIL-21) и (3) лиганда 41BB (41BBL). В некоторых аспектах, иммуноциты и UAPC культивируют в соотношении от 3:1 до 1:3, например, 3:1, 3:2, 1:1, 1:2 или 1:3. В конкретных аспектах, иммуноциты и UAPC культивируют в соотношении 1:2.

[0011] В некоторых аспектах, размножение проводят в присутствии IL-2. В конкретных аспектах, IL-2 присутствует в концентрации 10-500 ед./мл, например, 10-25, 25-50, 50-75, 75-10, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400 или 400-500 ед./мл. В конкретных аспектах, IL-2 присутствует в концентрации 100-300 ед./мл. В конкретных аспектах, IL-2 присутствует в концентрации 200 ед./мл. В некоторых аспектах, IL-2 представляет собой рекомбинантный человеческий IL-2. В конкретных аспектах, IL-2 восполняют каждые 2-3 суток, например, каждые 2 суток или 3 суток.

[0012] В конкретных аспектах, UAPC добавляют по меньшей мере второй раз. В некоторых аспектах, иммуноциты представляют собой клетки NK или T-клетки. В конкретных аспектах, иммуноциты представляют собой клетки NK.

[0013] В конкретных аспектах, иммуноциты происходят из пуповинной крови (CB), периферической крови (PB), стволовых клеток или костного мозга. В конкретных аспектах, стволовые клетки представляют собой индуцированные плюрипотентные стволовые клетки. В некоторых аспектах, иммуноциты получены из CB. В конкретных аспектах, CB пулирована из 2 или более индивидуальных доз пуповинной крови. В конкретных аспектах, CB пулирована из 3, 5 4, 5, 6, 7 или 8 индивидуальных доз пуповинной крови.

[0014] В некоторых аспектах, клетки NK представляют собой мононуклеарные клетки CB (CBMC). В конкретных аспектах, клетки NK дополнительно определяют как CD56⁺ клетки NK.

[0015] В конкретных аспектах, способ осуществляют в бессыровоточной среде.

[0016] В дополнительных аспектах, иммуноциты модифицируют для экспрессии химерного рецептора антигена (CAR). В некоторых аспектах, CAR содержит антигенсвязывающий домен для CD19, CD123, мезотелина, CD5, CD47, CLL-1, CD33, CD99, U5snRNP200, CD200, CS1, BAFF-R, ROR-1 или BCMA. В некоторых аспектах, CAR представляет собой гуманизированный CAR. В некоторых аспектах, CAR содержит IL-15. В конкретных аспектах, CAR содержит ген самоубийства. В некоторых аспектах, ген самоубийства представляет собой CD20, CD52, EGFRv3 или индуцируемую каспазу 9.

[0017] Настоящее изобретение, кроме того, относится к популяции размноженных иммуноцитов, полученной в соответствии с вариантами осуществления (например, культивированием иммуноцитов в присутствии эффективного количества UAPC из вариантов осуществления (например, универсальной антигенпрезентирующей клетки (UAPC), модифицированной для экспрессии (1) CD48 и/или CS1 (CD319), (2) связанного с мембраной интерлейкина-21 (mblL-21) и (3) лиганда 41BB (41BBL)).

[0018] В другом варианте осуществления, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей популяцию размноженных иммуноцитов из вариантов осуществления и фармацевтически приемлемый носитель. Кроме того, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей эффективное количество размноженных иммуноцитов из вариантов осуществления для использования в лечении заболевания или нарушения у субъекта.

[0019] Дополнительный вариант осуществления относится к способу лечения заболевания или нарушения у субъекта, включающему введение терапевтически эффективного количества размноженных иммуноцитов из вариантов осуществления субъекту.

[0020] В некоторых аспектах, заболевание или нарушение представляет собой злокачественную опухоль, воспаление, реакцию трансплантат против хозяина, отторжение трансплантата, аутоиммунное нарушение, иммунодефицитное заболевание, В-клеточное злокачественное новообразование или инфекцию. В конкретных аспектах, злокачественная опухоль представляет собой лейкоз. В некоторых аспектах, лейкоз представляет собой острый лимфобластный лейкоз (ALL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), острый миелогенный лейкоз (AML) или хронический миелогенный лейкоз (CML). В конкретных аспектах, нарушение представляет собой реакцию трансплантат против хозяина (GVHD). В некоторых аспектах, нарушение представляет собой рассеянный склероз, воспалительное заболевание кишечника, ревматоидный артрит, диабет типа I, системную красную волчанку, контактную гиперчувствительность, астму или синдром Шегрена. В некоторых аспектах, субъект представляет собой человека.

[0021] В конкретных аспектах, иммуноциты являются аллогенными. В некоторых аспектах, иммуноциты являются аутологичными. В некоторых аспектах, иммуноциты представляют собой клетки NK или T-клетки.

[0022] В дополнительных аспектах, способ дополнительно включает введение по меньшей мере второго лекарственного средства. В некоторых аспектах, по меньшей мере второе лекарственное средство представляет собой терапевтически эффективное количество противоракового средства, иммуномодулирующего средства или иммуносупрессивного средства. В конкретных аспектах, противораковое средство представляет собой химиотерапию, радиотерапию, генотерапию, хирургию, гормонотерапию, антиангиогенную терапию или иммунотерапию.

[0023] В некоторых аспектах, иммуносупрессивное средство представляет собой ингибитор кальциневрина, ингибитор mTOR, антитело, химиотерапевтическое средство, облучение, хемокин, интерлейкины или ингибитор хемокина или интерлейкина.

[0024] В следующих аспектах, иммуноциты и/или по меньшей мере второе лекарственное средство вводят внутривенно, внутрибрюшинно, интратрахеально, внутрь опухоли, внутримышечно, эндоскопически, внутрь очага, чрескожно, подкожно, местно, или посредством прямой инъекции или перфузии. В некоторых аспектах, второе лекарственное средство представляет собой антитело. В конкретных аспектах, антитело представляет собой моноклональное, биспецифическое или триспецифическое антитело. В некоторых аспектах, антитело представляет собой ритуксимаб.

[0025] Другие цели, признаки и преимущества настоящего изобретения станут очевидными из следующего подробного описания. Следует понимать, однако, что подробное описание и конкретные примеры, в то время как показывают предпочтительные варианты осуществления изобретения, приведены только в качестве иллюстрации, поскольку различные изменения и модификации в пределах содержания и объема изобретения станут очевидными специалисту в данной области из этого подробного описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0026] Следующие чертежи составляют часть настоящего описания и включены для дополнительной демонстрации конкретных аспектов настоящего описания. Настоящее описание можно лучше понять со ссылкой на один или несколько из этих чертежей в сочетании с подробным описанием конкретных вариантов осуществления, представленных в настоящем описании.

[0027] ФИГ. 1: Модель молнии для взаимодействия рецепторов клетки естественного киллера человека и лиганда клетки-мишени. Клетки NK человека взаимодействуют с клетками-мишенями посредством множества рецепторов, включая иммуноглобулиновые рецепторы киллеров (KIR), рецепторы естественной цитотоксичности (NCR), семейство рецепторов NKG2, связывающие нектин рецепторы, рецепторы семейства SLAM и другие. Рецепторы на клетках NK являются активирующими (KIR2DL4, KIR3DS1, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80, CD94-NKG2C, DAP10, NKG2D, DAP10, CRTAM, DNAM, 2B4, NTB-A, CD3-дзета, CD100, CD160) или ингибирующими (KIR2DL1/2/3/5A/5B, KIR3DL1/2/3, CD94-NKG2A, TIGIT, CD96, CEACAM-1, ILT2/LILRB1, KLRG1, LAIR1, CD161, Siglec-3/7/9)

[0028] ФИГ. 2A-2E: (ФИГ. 2A-2B) Кратность размножения свежих или замороженных клеток NK с использованием IL-2 или APC. (ФИГ. 2C) Проточная цитометрия на сутки 0, сутки 7 или сутки 14 для экспрессии CD3 и CD56 в клетках NK. (ФИГ. 2D) Количество клеток NT-NK или клеток SG4-NK, стимулированных с использованием APC. (ФИГ. 2E) Кинетика роста клеток NK, стимулированных с использованием клона 9 APC или UAPC.

[0029] ФИГ. 3A-3D: (ФИГ. ЗА) Проточная цитометрия исходных клеток K562 для указанных маркеров. Не наблюдали экспрессии mb-IL21, 41BBL, CD48 и SLAMF7 (CS1). (ФИГ. 3B) Анализ проточной цитометрии APC после трансдукции клона 46 (mbIL-21, 41BBL). (ФИГ. 3C) Анализ проточной цитометрии APC после трансдукции конструкции uAPC для экспрессии CD48 25 (nmIL-21, 41BBL и CD48). (ФИГ. 3D) Анализ проточной цитометрии APC после трансдукции конструкции uAPC2 для экспрессии CS1 (mbIL-21, 41BBL и CS1).

[0030] ФИГ. 4A-4D: Карты и аннотации конструкций для MMLV-ретровирусного переноса. (ФИГ. 4A) Векторы для ретровирусного переноса для mb-IL21. (ФИГ. 4B) Векторы для ретровирусного переноса для 41BBL. (ФИГ. 4C) Векторы для ретровирусного переноса для CD48-Katushka. (ФИГ. 4D) Векторы для ретровирусного переноса для CS1-EGFP.

ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАТИВНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

[0031] В настоящих исследованиях, клетки NK первоначально охарактеризованы по их противоопухолевым и антиаллогенным цитолитическим функциям, отличным от других компонентов врожденного иммунного компартмента. Множество иммунорецепторов, управляющих поведением клеток NK проиллюстрированы как график типа «молния» на ФИГ. 1. Массив передающих сигналы молекул можно широко категоризировать на 2 большие группы, а именно, активирующие против ингибирующих. По структурным и сигнальным модальностям далее фракционируют категории на родственные семейства иммунорецепторов. Несмотря на то, что мембранный протеом клеток NK еще предстоит полностью выяснить, функциональная избыточность внутри «молнии» клетки NK вносит большой вклад в модуляцию цитолитических функций, в то же время сохраняя комплексный и динамический баланс между комплементарными и антагонистическими путями.

[0032] Соответственно, конкретные варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способам и композициям, относящимся к получению, размножению, контролю качества и функциональной характеризации клеток NK клинической квалификации, предназначенных для клеточной и иммунотерапии. Выращивание и формирование структур клинически значимых количеств клеток NK для инфузии пациентам, в то же время удовлетворяя временным рамкам, являются проблематичными, даже в наилучших условиях. В конкретных аспектах, описанные способы и композиции детализируют технические способы получения клетки NK, детали и кинетику достижимого размножения клетки NK, и молекулярную характеризацию для подтверждения успешного формирования клеточных структур.

[0033] В следующих вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к технологии надежной платформы, воплощенной как универсальные антигенпрезентирующие клетки (UAPC), для кондиционирования, формирования структур и использования клеток естественных киллеров (NK) человека в качестве оружия против опухолей. «UAPC» обозначает в настоящем описании антигенпрезентирующие клетки, сконструированные для оптимизированного размножения иммуноцитов, таких как клетки NK. Настоящие UAPC получены посредством уникальной комбинации костимулирующих молекул для преодоления ингибирующих сигналов и индукции оптимальной и специфической функции уничтожения клетки NK. Обширное тестирование показало для UAPC тонкую регулировку клеточного аппарата NK и улучшение уничтожения опухолей. Настоящие UAPC можно использовать для опосредованной клетками NK иммунотерапии злокачественных опухолей.

[0034] Иллюстративные APC получают посредством вынужденной экспрессии связанного с мембраной интерлейкина 21 (mbIL-21) и лиганда 4-IBB в чувствительной к клеткам NK линии антигенпрезентирующих клеток (APC) K562 (обозначенной как клон 46). В другом варианте осуществления, UAPC получены посредством вынужденной экспрессии mbIL-21, лиганда 4-1BB и CD48 в клетках K562 (названы универсальными APC (UAPC)). В другом варианте осуществления, UAPC получены посредством вынужденной экспрессии mbIL-21, лиганда 4-IBB и CS1 в клетках K562 (названы UAPC2). UAPC могут быть получены для экспрессии mblL-21, 41BBL и специфического для клетки NK антигена, такого как антиген семейства SLAM (таблица 1).

[0035] Платформу UAPC можно также использовать для размножения других иммунных эффекторов, включая T-клетки (например, альфа-бета и гамма-дельта T-клетки). Иммуноциты, такие как клетки NK и T-клетки, могут происходить из периферической крови, пуповинной крови, костного мозга или стволовых клеток (включая индуцированные плюрипотентные стволовые клетки). Эти иммуноциты можно подвергать размножению ex vivo и активации с использованием настоящих UAPC, что является необходимым для культивирования для достижения разумных количеств для клинически значимых применений, таких как иммунотерапия злокачественных опухолей.

[0036] Таким образом, настоящее описание относится к сериям линий клеток-помощников, сконструированных и полученных для кондиционирования, модуляции, примирования и размножения иммуноцитов человека, таких как клетки NK, для иммунотерапии злокачественных опухолей.

I. Определения

[0037] В рамках изобретения, «в основном свободный», в отношении указанного компонента, используют в настоящем описании для обозначения того, что никакое количество указанного компонента намеренно не включено в состав композиции и/или присутствует только в качестве контаминанта или в следовых количествах. Общее количество компонента, образованное в результате любой непреднамеренной контаминации композиции, таким образом, составляет намного ниже 0,05%, предпочтительно, ниже 0,01%. Наиболее предпочтительной является композиция, в которой никакое количество указанного компонента невозможно детектировать с использованием стандартных аналитических способов.

[0038] В рамках изобретения, описание единственного числа может означать один или несколько. В рамках изобретения, в пункте(пунктах) формулы изобретения, при использовании в сочетании со словом «содержащий», слово единственного числа может обозначать один или более одного.

[0039] Использование термина «или» в пунктах формулы изобретения осуществляют для обозначения «и/или», если явно не указано, что он относится только к альтернативам, или альтернативы не являются взаимоисключающими, хотя описание поддерживает определение, которое относится только к альтернативам и к «и/или». В рамках изобретения, «другой» может обозначать по меньшей мере второй или более. Термины «около», «в основном» и «приблизительно» обозначают, как правило, указанное значение плюс или минус 5%.

[0040] «Иммунное нарушение», «связанное с иммунитетом нарушение» или «иммуноопосредованное нарушение» относится к нарушению, при котором иммунный ответ играет ключевую роль в развитии или прогрессирования заболевания. Иммуноопосредованные нарушения включают аутоиммунные нарушения, отторжение аллотрансплантата, реакцию трансплантат против хозяина и воспалительные и аллергические состояния.

[0041] «Иммунный ответ» представляет собой ответ клетки иммунной системы, такой как В-клетка или T-клетка, или врожденный иммуноцит, на стимул. В одном варианте осуществления, ответ является специфическим для конкретного антигена («антигенспецифический ответ»).

[0042] «Аутоиммунное заболевание» относится к заболеванию, при котором иммунная система образует иммунный ответ (например, ответ В-клетки или T-клетки) против антигена, являющегося частью нормального хозяина (то есть, аутоантигена), с последующим повреждением тканей. Аутоантиген может происходить из клетки-хозяина, или может происходить из условно-патогенного организма, такого как микроорганизмы (известные как условно-патогенные организмы), в норме колонизирующие поверхности слизистых оболочек.

[0043] «Проведение лечения» или лечение заболевания или состояния относится к исполнению протокола, который может включать введение одного или нескольких лекарственных средств пациенту, в попытке облегчения признаков или симптомов заболевания. Желательные эффекты лечения включают уменьшение скорости прогрессирования заболевания, облегчение или смягчение состояния заболевания, и ремиссию или улучшенный прогноз. Облегчение может происходить до появления признаков или симптомов заболевания или состояния, так же как после их появления. Таким образом, «проведение лечения» или «лечение» может включать «осуществление предотвращения» или «предотвращение» заболевания или нежелательного состояния. Кроме того, «проведение лечения» или «лечение» не требует полного облегчения признаков или симптомов, не требует излечения, и конкретно включает протоколы, оказывающие только незначительный эффект на пациента.

[0044] Термин «терапевтическое преимущество» или «терапевтически эффективный», как используют на протяжении этой заявки, относится к чему-либо, что стимулирует или улучшает хорошее самочувствие субъекта, применительно к медицинскому лечению этого состояния. Это включает, но без ограничения, уменьшение частоты или тяжести признаков или симптомов заболевания. Например, лечение злокачественной опухоли может включать, например, уменьшение размера опухоли, уменьшение инвазивности опухоли, уменьшение скорости роста злокачественной опухоли или предотвращение метастазирования. Лечение злокачественной опухоли может также относится к продлению выживаемости субъекта с злокачественной опухолью.

[0045] «Субъект» и «пациент» либо относятся к человеку, либо не относятся к человеку, например, приматы, млекопитающие и позвоночные. В конкретных вариантах осуществления, субъект представляет собой человека.

[0046] Фразы «фармацевтически или фармакологически приемлемый» относится к молекулярным сущностям и композициям, не вызывающим неблагоприятную, аллергическую или другую нежелательную реакцию при введении животному, такому как человек, по необходимости. Получение фармацевтической композиции, содержащий антитело или дополнительный активный ингредиент, станет известно специалисту в данной области в свете настоящего описания. Кроме того, понятно, что для введения животному (например, человеку), препараты должны соответствовать стандартам стерильности, пирогенности, общей безопасности и чистоты, как требует Департамент FDA по биологическим стандартам.

[0047] В рамках изобретения, «фармацевтически приемлемый носитель» включает все без исключения водные растворители (например, воду, спиртовые/водные растворы, солевые растворы, парентеральные носители, такие как хлорид натрия, декстроза Рингера и т.д.), неводные растворители (например, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат), диспергирующие среды, покрытия, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, консерванты (например, антибактериальные или противогрибковые средства, антиокислители, хелатирующие агенты, и инертные газы), изотонические средства, замедляющие абсорбцию средства, соли, лекарственные средства, стабилизаторы лекарственных средств, гели, связующие средства, наполнители, дезинтегрирующие средства, смазывающие средства, подстластители, вкусоароматические средства, красители, восполняющие жидкость и питательные вещества средства, такие как подобные материалы и их комбинации, как известно специалисту в данной области. pH и точную концентрацию различных компонентов в фармацевтической композиции корректируют в соответствии с хорошо известными параметрами.

[0048] Термин «гаплотипирование или тканевое типирование» относится к способу, используемому для идентификации гаплотипа или тканевых типов субъекта, например, посредством определения того, какой локус (или локусы) HLA экспрессирован на лимфоцитах конкретного субъекта. Гены HLA локализованы в главном комплексе гистосовместимости (MHC), области на коротком плече хромосомы 6, и вовлечены в межклеточное взаимодействие, иммунный ответ, трансплантацию органов, развитие злокачественных опухолей и чувствительность к заболеванию. Существует шесть генетических локусов, важных для трансплантации, обозначенных HLA-A, HLA-B, HLA-C и HLA-DR, HLA-DP и HLA-DQ. В каждом локусе может присутствовать любой из нескольких различных аллелей.

[0049] В широко используемом способе гаплотипирования используют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для сравнения ДНК субъекта с известными фрагментами генов, кодирующих антигены MHC. Вариабельность этих областей генов определяет тканевой тип или гаплотип субъекта. Серологические способы также используют для детекции серологически определенных антигенов на поверхностях клеток. Детерминанты HLA-A, -B и -C можно измерять известными серологическими способами. Кратко, лимфоциты от субъекта (выделенные из свежей периферической крови) инкубируют с антисыворотками, узнающими все известные антигены HLA. Клетки распределяют в планшете с микроскопическими лунками, содержащими различные виды антисыворотки. Клетки инкубируют в течение 30 минут, с последующей дополнительной 60-минутной инкубацией с комплементом. Если лимфоциты имеют на своей поверхности антигены, узнаваемые антителами в антисыворотке, лимфоциты подвергаются лизису. Можно добавлять краситель, чтобы показать изменения проницаемости клеточной мембраны и гибель клеток. Паттерн клеток, разрушенных посредством лизиса, указывает на степень гистологической несовместимости. Если, например, лимфоциты от индивидуума, тестируемого по HLA-A3, разрушаются в лунке, содержащей антисыворотку для HLA-A3, тест является положительным для этой группы антигенов.

[0050] Термин «антигенпрезентирующие клетки (APC)» относится к классу клеток, способному представлять один или несколько антигенов в форме комплекса пептид-МНС, поддающегося узнаванию специфическими эффекторными клетками иммунной системы, и таким образом, индукции эффективного клеточного иммунного ответа против представляемого антигена или антигенов. Термин «APC» включает интактные цельные клетки, такие как макрофаги, В-клетки, эндотелиальные клетки, активированные T-клетки и дендритные клетки, или молекулы, природные или синтетические, способные представлять антиген, такие как очищенные молекулы MHC класса I в комплексе с β2-микроглобулином.

II. Универсальные антигенпрезентирующие клетки

[0051] Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к получению и применению универсальных антигенпрезентирующих клеток (UAPC). UAPC можно использовать для размножения иммуноцитов, таких как клетки NK и T-клетки. UAPC можно модифицировать для экспрессии связанного с мембраной IL-21 (mbIL-21) и 41BBL (лиганда CD137).

[0052] UAPC можно модифицировать для экспрессии лиганда CD137 и/или связанного с мембраной цитокина. Связанный с мембраной цитокин может представляет собой mIL-21 или mIL-15. В конкретных вариантах осуществления, UAPC модифицируют для экспрессии лиганда CD137 и mIL-21. APC могут происходить из клеток злокачественных опухолей, таких как клетки лейкоза. APC могут не иметь никакой экспрессии эндогенных молекул HLA класса I, II или CDld. APC могут экспрессировать ICAM-1 (CD54) и LFA-3 (CD58). В частности, APC могут представлять собой клетки K562, такие как клетки K562, модифицированные для экспрессии лиганда CD137 и mIL-21. APC могут являться облученными. Конструирование можно осуществлять любым способом, известным в данной области, таким как ретровирусная трансдукция.

[0053] Цитокины осуществляют очень сильный контроль над целыми классами иммуноцитов (включая клетки NK), влияя на судьбу клеток, активность и эффективность ответов клеток. Мощность цитокиновой стимуляции для активации клеток NK подтверждает, что их «естественные» эффекторные функции являются высоко чувствительными к внешнему воздействию, и что примирование может регулировать поведение клетки NK in vivo.

[0054] Для решения проблемы получения клинически значимых количеств клеток NK, в настоящих способах можно использовать интерлейкин (IL-21) в качестве средства, управляющего размножением клеток NK в настоящей технологии платформы UAPC. У человека, стимуляция клетки NK с использованием IL-10 и IL-21 индуцирует экспрессию NKG2D зависимым от STAT3 способом. В то время как рецепторы цитокинов разделяют сходные компоненты передачи клеточных сигналов во множестве иммуноцитов, специфическая для клетки NK передача сигналов зависит от связи рецептор IL-21-STAT3 для пролиферации.

[0055] Передача сигналов цитокинов является важной для поддержания выживаемости и пролиферации лимфоцитов. In vivo, введение IL-2 является единственным одобренным FDA способом размножения клеток NK. IL-15, другой активный активатор клетки NK, подвергают клиническим исследованиям фазы I в качестве возможной альтернативы IL-2, но может иметь значительную токсичность после системного введения. Помимо значительной токсичности, эти цитокины также индуцируют пролиферацию T-клеток, в то же время ограничивая персистенцию клеток NK. Несмотря на то, что они разделяют один и тот же рецептор для передачи сигнала, рецепторы IL-2, IL-4, IL-25 7, IL-9, IL-15 и IL-21 оказывают различные и специфические эффекты на разнообразные клетки.

A. Связанный с мембраной IL-21

[0056] В конкретных вариантах осуществления, для специфической модификации клеток NK, IL-21 можно использовать для получения настоящих UAPC. Рецептор IL-21 (IL21R), близко родственный бета-цепи рецептора IL-2, способный передавать сигналы посредством своей димеризации с общей гамма-цепью (гамма(c) рецепторов цитокинов, подвергается повышающей регуляции в активированных клетках NK человека (клетках, готовых к стимуляции). В то время как IL-21, цитокин типа I, может модулировать функции клетки T-, B- и NK, в настоящих исследованиях обнаружено, что только клетки NK человека подвергаются значительному размножению посредством активации пути передачи сигнала рецептора IL21 (т.е., в 1000 раз в течение 21 суток). И наоборот, IL21 играет важную роль в сокращении количества CD8⁺ T-клеток.

[0057] Передачу сигналов IL21R в основном усиливает STAT3, высоко активный активатор клеточной пролиферации. Связью IL21R-STAT3 управляет индуцированное IL-21 связывание STAT3 с ДНК с GAS и цис-индуцируемыми элементами, как подтверждено посредством иммунопреципитации и Вестерн-блоттинга с использованием антитела против фосфотирозина. Молекулярную основу опосредованной IL21 пролиферации можно специфически проследить до тирозина 510 (Y510) на IL21R, который опосредует индуцированное IL-21 фосфорилирование STAT1 и STAT33. Этот механизм подчеркивается посредством ослабления ответов IL-21 у мышей с двойным нокаутом Statl/Stat3.

[0058] Передача сигналов IL21R является важной для цитотоксичности NK. Недостаточность IL21R у человека связана с нарушенным цитолизом меченных 51Cr клеток-мишеней K562, в то время как антителозависимая клеточная цитотоксичность является не затронутой. Моногенный не летальный для эмбрионов дефект (мутация с потерей функции в IL21R) представляет отличную возможность для установления границ, и таким образом, является полезным для моделирования, усиления и формирования врожденных цитолитических ответов NK.

[0059] Передача сигналов IL-21 избирательно формирует подгруппы клеток NK, даже несмотря на то, что обе популяции клеток CD56^{тусклый} и CD56^яркий несут сходные количества поверхностного IL21R. Индукция посредством IL-21 фосфорилирования STAT1 и STAT3 выше в клетках NK CD56^яркий по сравнению с CD56^{тусклый}. В отличие от этого, IL-21 не оказывает эффекта на активацию STAT5, путь активации IL-2, который также управляет размножением T-клеток. В дополнение к активации STAT3, передача сигналов IL-21 также включает пути МАРК и PI3K, и индуцирует экспрессию генов врожденного иммунного ответа, включая IFN-гамма, T-bet, IL-12Rбета2 и IL-18R, в клетках NK, примируя их для уничтожения клеток опухолей.

[0060] Для эффективного использования IL-21, экспрессию mbIL-21 (ФИГ. 4A) можно использовать для концентрирования и локализации транс-взаимодействия с IL21R на клетках NK. Близость mbIL21 к мембране обеспечивает легкую доступность, когда он необходим, таким образом, он может подкреплять оптимальную пролиферацию клеток без больших количеств и концентраций экзогенно доставляемого IL-21. Совместные культуры с облученными K562-mbl5-41BBL индуцировали размножение с медианной 21,6 кратностью CD56+CD3- клеток NK из периферической крови. Это размножение является более высоким, по сравнению со стимуляцией только растворимыми цитокинами из разделяющего γc семейства, включая IL-2, IL-12, IL-15, IL-21, отдельно или в комбинациях. По сравнению с этим, настоящие UAPC могут размножать клетки NK по меньшей мере в 1000 раз (3-log) в течение 14-21 суток. Экспрессия mbIL21 на UAPC может также устранять необходимость в экзогенном цитокине клинической квалификации.

B. 4-1BBL (лиганд 4-1BB, лиганд CD137, CD137L, TNFSF9)

[0061] В дополнение к пониманию примирования цитокином функции клетки NK, непосредственные физические взаимодействия с активирующими молекулами в клетках NK приводят к усиленным клеточным пролиферативным ответам. CD137 (4-1BB) является членом семейства генов рецепторов факторов некроза опухолей (TNF-R), опосредующего пролиферацию, дифференцировку клеток и программированную гибель клеток (апоптоз). Сначала охарактеризован мышиный рецептор, затем человеческий гомолог, разделяющий 60% идентичность на уровне аминокислот, со значительной консервативностью цитоплазматического домена/домена передачи сигналов. CD137, главным образом, экспрессируется в активированных T-клетках и клетках NK, с различными уровнями, поддающимися детекции в тимоцитах, миелоидных клетках и эндотелиальных клетках в участках воспаления. Физиологическая передача сигналов CD137 опосредована через 1) NF-кВ, который способствует выживаемости посредством активации Bcl-XL, и 2) путь PI3K/ERK1/2, который специфически управляет прохождением клеточного цикла.

[0062] В активированных клетках NK, CD137 представляет собой индуцируемую цитокинами костимулирующую молекулу, которая, в свою очередь, управляет противоопухолевыми ответами в клетках NK посредством увеличения клеточной пролиферации и секреции IFN-γ. Исследования с использованием мышей с нокаутом CD137L-/- выявили важность передачи сигналов CD137/CD137L в развитии противоопухолевых иммуноцитов. Мыши с нокаутом CD137-/- имели в 4 раза более высокую частоту метастазирования опухолей, по сравнению с контрольными мышами.

[0063] Лиганд CD137 (CD137L, лиганд 4-1BB), 34 кДа гликопротеиновый член суперсемейства TNF, детектирован главным образом на активированных антигенпрезентирующих клетках (APC), включая В-клетки, макрофаги и дендритные клетки, так же как временно экспрессирован на низких уровнях на активированных T-клетках. CD137L человека является только на 36% гомологичным, по сравнению с мышиным аналогом. В соответствии с противоопухолевой эффективностью агонистических антител против CD137, показано, что связывание CD137L вызывает активность CTL и противоопухолевую активность.

[0064] Соответственно, настоящие UAPC можно модифицировать для экспрессии лиганда 4-IBB, физиологического контр-рецептора для CD137, для стимуляции.

С. SLAM/CD48

[0065] Помимо цитокинового кондиционирования и костимуляции 4-1BBL, непосредственные физические взаимодействия между NK и клетками-мишенями также влияют на клеточные ответы, т.е. уничтожение клеток-мишеней. Передающие сигналы активирующие лимфоциты молекулы (SLAM, ранее известные также как суперсемейство CD2) семейства гомологичных иммуноглобулинам рецепторов, которые широко экспрессируются и играют критические роли в иммунной системе, являются особенно важными в отношении межклеточных взаимодействий.

[0066] Соответственно, UAPC по настоящему описанию могут экспрессировать один или несколько антигенов семейства SLAM. Члены семейства SLAM включают CD2, CD48, CD58 (LFA-3), CD244 (2B4), CD229 (Ly9), CD319 (CS1 (CD2 подгруппа 1); CRACC (CD2-подобный рецептор, активирующий цитотоксические клетки)) и CD352 (NTB-A (антиген NK-T-B)). В конкретных аспектах, UAPC экспрессируют CD48 и/или CS1. Клетки NK экспрессируют по меньшей мере три члена семейства SLAM (SLAMF). Они представляют собой 2B4, NK, T- и B-клеточный антиген (NTB-A), и CD2-подобный рецептор, активирующий цитотоксические клетки (CRACC), узнающие их соответствующие лиганды CD48, NTB-A и CRACC на клетках-мишенях и, возможно, на других клетках NK. В то время как SLAMF1, 3, 5, 6, 7, 8 и 9 представляют собой гомофильные рецепторы (собственный лиганд), SLAMF2 и SLAMF4 являются контр-рецепторами (гетерофильными) друг для друга. Широкий диапазон (три порядка величины) для известной гомофильной аффинности (константа диссоциации, Kd, от <1 мкМ до 200 мкМ) указывает на механистическое основание для перекрывающихся, но отдельных, механизмов передачи сигналов для гликопротеинов SLAM.

[0067] Таблица 1: Аффинность связывания членов семейства SLAM.

SLAMF CD Наименоваение Альтернативные наименования Взаимодействие Контр-рецептор Аффинность 1 150 SLAM SLAMFl,
CD 150,
CDwl50 гомофильное 200 2 48 CD48 BCM1,
BLAST,
BLASTl,
MEM-102 гетерофильное CD2 (грызуны) >500 гетерофильное 2B4 8 3 229 LY9 hly9,
м-лимфоцитарный антиген 9 гомофильное 4 244 2B4 NAIL,
NKR2B4,
Nmrk гетерофильное CD48 8 5 84 CD84 LY9B гомофильное <1 6 352 NTB-A KALI, KALIb,
Lyl08,
NTBA,
SF2000 гомофильное 2 7 319 CRACC CS1, 19A гомофильное 8 353 BLAME,
SBBI42 гомофильное 9 CD2F10,
CD84H1,
SF2001,
CD2F-10,
CD84-H1 гомофильное

[0068] В конкретных вариантах осуществления, настоящие UAPC модифицируют для экспрессии CD48 для подкрепления межклеточного взаимодействия для усиления ответов клеток NK. CD48 представляет собой заяколренный гликозилфосфатидилинозитолом белок (GPI-AP), обнаруженный на поверхности клеток NK, T-клеток, моноцитов и базофилов, и участвующий в путях адгезии и активации в этих клетках. Несмотря на отсутствие у него внутриклеточного домена, стимуляция CD48 индуцирует переаранжировку факторов передачи сигналов в липидных рафтах, активность Lck-киназы и фосфорилирование тирозина. В качестве молекулы адгезии и костимулирующей молекулы, CD48 индуцирует многочисленные эффекты в В- и T-лимфоцитах, клетках NK, тучных клетках и эозинофилах. В клетках NK человека, CD48 является контр-рецептором для 2B426, важного активатора клеток NK. Считают, что гетерофильное взаимодействие конкурирует за взаимодействие с CD244 с MHC-I. Взаимодействие 2B4/CD48, таким образом, индуцирует сигналы активации в человеческих клетках NK, в то время как в мышиных клетках NK оно посылает ингибирующие сигналы.

[0069] В то время как взаимодействия 2B4-CD48 между клетками из одной и той же популяции, т.е., взаимодействия клетка NK-клетка NK или взаимодействия T-клетка-T-клетка, приводят к усиленной активации, посредством экспрессии CD48 на APC, таких как линия миелоидных клеток K562, в норме лишенных CD48, в UAPC можно запускать активный путь передачи сигнала 2B4 на клетках NK в транс.

D. SLAM/CS1

[0070] В некоторых вариантах осуществления, настоящие UAPC модифицируют для экспрессии CS1, другого члена семейства SLAM, в качестве костимулирующей молекулы для включения уничтожающей активности уничтожения клеток NK. В отличие от CD48, имеющего контр-связывание с 2B4, взаимодействия CS1 являются гомофильными, и могут быть охарактеризованы в контексте цис- против транс- взаимодействий. Клетки K562, которые в норме являются свободными от CS1, можно модифицировать для экспрессии CS1.

E. Доставка нуклеиновых кислот

[0071] mbIL-21, 41BBL и костимулирующий антиген можно конструировать любым из способов, известных в данной области. Нуклеиновую кислоту, как правило, вводят в форме экспрессирующего вектора, такого как вирусный экспрессирующий вектор. В некоторых аспектах, экспрессирующий вектор представляет собой ретровирусный экспрессирующий вектор, аденовирусный экспрессирующий вектор, плазмидный экспрессирующий ДНК-вектор или экспрессирующий вектор AAV. В некоторых аспектах, доставку осуществляют посредством доставки одного или нескольких векторов, одного или нескольких их транскриптов, и/или один или несколько транскибированных с них белков доставляют в клетку.

[0072] Способы введения полинуклеотидной конструкции в клетки животных известны и включают, в качестве неограничивающих примеров, способы стабильной трансформации, где полинуклеотидную конструкцию интегрируют в геном клетки, способы временной трансформации, где полинуклеотидную конструкцию не интегрируют в геном клетки, и опосредованные вирусом способы. В некоторых вариантах осуществления, полинуклеотиды можно вводить в клетку, например, посредством рекомбинантных вирусных векторов (например, ретровирусов, аденовирусов), липосомы и т.п. Например, в некоторых аспектах, способы временной трансформации включают микроинъекцию, электропорацию или бомбардировку частицами. В некоторых вариантах осуществления, полинуклеотиды можно включать в векторы, более конкретно, плазмиды или вирус, с точки зрения экспрессии в клетках.

[0073] Способы невирусной доставки нуклеиновых кислот включаютю липофекцию, нуклеофекцию, микроинъекцию, биолистику, виросомы, липосомы, иммунолипосомы, конъюгаты поликатион или липид:нуклеиновая кислота, голую ДНК, искусственные вирионы и усиленное агентами поглощение ДНК. Липофекция описана (например, в Патентах США No. 5049386, 4946787; и 4897355) и реагенты для липофекции поставляют коммерчески (например, Transfectam™ и Lipofectin™). Катионные и нейтральные липиды, пригодные для эффективной липофекции полинуклеотидов с узнаванием рецепторов, включают липиды из Feigner, WO 91117424; WO 91116024. Доставку можно осуществлять в клетки (например, введение in vitro или ex vivo) или ткани-мишени (например, введение in vivo).

[0074] В некоторых вариантах осуществления, доставку осуществляет посредством использования систем на основе РНК- или ДНК-вирусов для доставки нуклеиновых кислот. Вирусные векторы в некоторых аспектах можно вводить непосредственно пациентам (in vivo) или их можно использовать для обработки клеток in vitro или ex vivo, и затем вводить пациентам. Системы на основе вирусов, в некоторых вариантах осуществления, включают ретровирусные, лентивирусные, аденовирусные, аденоассоциированные векторы и векторы на основе вируса простого герпеса для переноса генов.

III. Иммуноциты

[0075] Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к выделению и размножению иммуноцитов, таких как клетки NK или T-клетки, например, для иммунотерапии злокачественных опухолей.

[0076] В конкретных вариантах осуществления, иммуноциты получают из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) человека, нестимулированных продуктов лейкафереза (PBSC), эмбриональных стволовых клеток (hESC) человека, индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC), костного мозга или пуповинной крови способами, хорошо известными в данной области. Конкретно, иммуноциты можно выделять из пуповинной крови (CB), периферической крови (PB), костного мозга или стволовых клеток. В конкретных вариантах осуществления, иммуноциты выделяют из пулированной CB. CB можно пулировать из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10 или более единиц. Иммуноциты могут являться аутологичными или аллогенными. Выделенные иммуноциты можно подбирать по совпадению по гаплотипу с субъектом, подлежащим проведению клеточной терапии. Клетки NK можно детектировать посредством специфических поверхностных маркеров, таких как CD16, CD56 и CD8, у человека.

[0077] В конкретных аспектах, клетки NK выделяют описанным ранее способом размножения ex vivo клеток NK (Spanholtz et al., 2011; Shah et al., 2013). По этому способу, мононуклеарные клетки CB выделяют посредством центрифугирования в градиенте плотности фиколла. Культуру клеток можно истощать по любым клеткам, экспрессирующим CD3, и можно характеризовать для определения процента CD56⁺/CD3^- клеток или клеток NK. В других способах, пуповинную CB используют для получения клеток NK посредством выделения CD34⁺ клеток. Способ может включать истощение положительных по CD3, CD14 и/или CD19 клеток.

[0078] Выделенные иммуноциты можно размножать в присутствии настоящих UAPC. Размножение может происходить в течение приблизительно 2-30 суток, например, 3-20 суток, в частности, 12-16 суток, например, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19 суток, конкретно, приблизительно 14 суток. Иммуноциты и UAPCS могут присутствовать в соотношении приблизительно 3:1-1:3, например, 2:1, 1:1, 1:2, конкретно, приблизительно 1:2. Размножение культуры может дополнительно включать цитокины для стимуляции размножения, такие как IL-2. IL-2 может присутствовать в концентрации приблизительно 10-500 ед./мл, например, 100-300 ед./мл, конкретно, приблизительно 200 ед./мл. IL-2 можно восполнять в культуре для размножения, например, каждые 2-3 суток. UAPC можно добавлять в культуру по меньшей мере второй раз, например, через приблизительно 7 суток размножения.

[0079] После размножения, иммуноциты можно немедленно вводить посредством инфузии или можно хранить, например, посредством криоконсервации. В конкретных аспектах, клетки можно размножать в течение нескольких суток, недель или месяцев ex vivo, в качестве общей популяции, в течение приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 суток.

[0080] Размноженные клетки NK могут секретировать цитокины I типа, такие как интерферон-γ, фактор некроза опухоли-α и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), которые активируют как врожденные, так и адаптивные иммуноциты так же как другие цитокины и хемокины. Измерение этих цитокинов можно использовать для определения статуса активации клеток NK. Кроме того, другие способы, известные в данной области для определения активации клетки NK, можно использовать для характеризации клеток NK по настоящему описанию.

IV. Химерные рецепторы антигенов

[0081] В конкретных вариантах осуществления, настоящие иммуноциты, такие как T-клетки или клетки NK, генетически модифицируют для экспрессии химерного рецептора антигена (CAR). В некоторых вариантах осуществления, CAR содержит: a) внутриклеточный домен передачи сигналов, b) трансмембранный домен и c) внеклеточный домен, содержащий антигенсвязывающую область.

[0082] CAR узнает опухолеассоциированный антиген поверхности клеток, независимо от человеческого лейкоцитарного антигена (HLA) и использует одну или несколько молекул передачи сигналов для активации генетически модифицированных клеток NK для уничтожения, пролиферации и продукции цитокинов. В конкретных вариантах осуществления, настоящие клетки NK можно генетически модифицировать способами, включающими (i) невирусный перенос генов с использованием устройства для электропорации (например, нуклеофектора), (ii) CAR, передающие сигналы через эндодомены (например, CD28/CD3-ζ, CD137/CD3-ζ или другие комбинации), (iii) CAR с вариабельной длиной внеклеточных доменов, соединяющих узнающий антиген домен с поверхностью клетки, и, в некоторых случаях, (iv) искусственные антигенпрезентирующие клетки (aAPC), полученные из K562, чтобы иметь способность надежно и количественно размножать CAR⁺ клетки NK (Singh et al., 2011).

[0083] Варианты осуществления настоящего изобретения относятся к использованию нуклеиновых кислот, включая нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептид антигенспецифического CAR, включая CAR, гуманизированный для уменьшения иммуногенности (hCAR), содержащий внутриклеточный домен передачи сигналов, трансмембранный домен и внеклеточный домен, содержащий один или несколько мотивов передачи сигналов. В конкретных вариантах осуществления, CAR может узнавать эпитоп, содержащий общее пространство между одним или несколькими антигенами. В конкретных вариантах осуществления, связывающая область может содержать определяющие комплементарность области моноклонального антитела, вариабельные области моноклонального антитела и/или их антигенсвязывающие фрагменты. В другом варианте осуществления, эта специфичность происходит из пептида (например, цитокина), связывающегося с рецептором.

[0084] Предусматривают, что нуклеиновые кислоты человеческого CAR могут представлять собой человеческие гены, используемые для улучшения клеточной иммунотерапии для пациентов-людей. В конкретном варианте осуществления, в настоящих способах используют полноразмерную кДНК CAR или кодирующую область. Антигенсвязывающие области или домен могут содержать фрагмент цепей Vh и Vl одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv), происходящих из конкретного человеческого моноклонального антитела, таких как описанные в Патенте США 7109304, содержание которого приведено в настоящем описании в качестве ссылки. Фрагмент может также представлять собой любое количество различных антигенсвязывающих доменов человеческого антигенспецифического антитела. В более конкретном варианте осуществления, фрагмент представляет собой антигенспецифический scFv, кодируемый последовательностью, оптимизированной для человеческого использования кодонов для экспрессии в клетках человека.

[0085] Аранжировка может являться мультимерной, например, диатело или мультимеры. Мультимеры, наиболее вероятно, формируются посредством перекрестного спаривания вариабельной части легких и тяжелых цепей в диатело. Шарнирная часть конструкции может иметь множество альтернатив, от полной делеции до наличия сохраненного первого цистеина, до замены пролина вместо серина, до укорочения вплоть до первого цистеина. Часть Fc может являться делетированной. Любой белок, который является стабильным и/или димеризуется, может служить этой цели. Можно использовать один из доменов Fc, например, либо CH2, либо CH3 домен из человеческого иммуноглобулина. Можно использовать шарнирную область, область CH2 и CH3 человеческого иммуноглобулина, модифицированные для улучшения димеризации. в других аспектах, можно использовать только шарнирную часть иммуноглобулина или части CD8a.

[0086] В некоторых вариантах осуществления, нуклеиновая кислота CAR содержит последовательность, кодирующую другие костимулирующие рецепторы, такие как трансмембранный домен и модифицированный внутриклеточный домен передачи сигналов CD28. Другие костимулирующие рецепторы включают, но без ограничения, один или несколько из CD28, CD27, OX-40 (CD134), DAP10 и 4-1BB (CD137). В дополнение к первичному сигналу, инициированному посредством CD3ζ, дополнительный сигнал, подаваемый человеческим костимулирующим рецептором, вставленным в человеческий CAR, является важным для полной активации клеток NK и может помочь улучшать персистенцию in vivo и терапевтический успех адоптивной иммунотерапии.

[0087] Внутриклеточный домен передачи сигналов химерного рецептор антигена является ответственным за активацию по меньшей мере одной из нормальных эффекторных функций иммуноцита, в который помещен химерный рецептор антигена. Эффекторная функция представляет собой специализированную функцию дифференцированной клетки, такой как клетка NK. В конкретных вариантах осуществления, внутриклеточные домены передачи сигналов рецептора в CAR включают домены из комплекса T-клеточного рецептора антигена, такие как дзета-цепь CD3, также домены передачи костимулирующих сигналов FcγRIII, CD28, CD27, DAP10, CD137, OX40, CD2, отдельно или в сериях, например, с CD3-дзета. В конкретных вариантах осуществления, внутриклеточный домен (который может быть обозначен как цитоплазматический домен), содержащий, частично или полностью, один или несколько из дзета-цепи TCR, CD28, CD27, OX40/CD134, 4-1BB/CD137, FcεRIγ, ICOS/CD278, IL-2R-бета/CD122, IL-2R-альфа/CD132, DAP10, DAP12 и CD40. Любую часть эндогенного комплекса T-клеточного рецептора можно использовать в внутриклеточном домене. Можно использовать один или несколько цитоплазматических доменов, поскольку так называемые CAR третьего поколения имеют по меньшей мере два или три домена передачи сигналов, например, слитые вместе для аддитивного или синергического эффекта.

[0088] В конкретных вариантах осуществления CAR, антигенспецифическая часть рецептора (которая может быть обозначена как внеклеточный домен, содержащий антигенсвязывающую область) содержит домен, связывающий опухолеассоциированный антиген или патоген-специфический антиген. Антигены включают углеводные антигены, узнаваемые узнающими паттерн рецепторами, такие как дектин-1. Опухолеассоциированный антиген может принадлежать к любому виду, при условии, что он экспрессируется на клеточной поверхности клеток опухолей. Связывающий антиген опухоли домен может быть предназначен, но без ограничения, для CD19, CD20, карциноэмбрионального антигена, альфафетопротеина, CA-125, MUC-1, эпителиального опухолевого антигена, ассоциированного с меланомой антигена, мутантного p53, мутантного ras, HER2/Neu, ERBB2, связывающего фолат белка, оболочечного гликопротеина gp120 HIV-1, оболочечного гликопротеина gp41 HIV-1, GD2, CD123, CD23, CD30, CD56, c-Met, мезотелина, GD3, HERV-K, IL-11R-альфа, каппа-цепи, лямбда-цепи, CSPG4, ERBB2, EGFRvIII или VEGFR2. CAR может содержать гуманизированный scFv, такой как гуманизированный scFv для CD19 или CD123.

[0089] В конкретных вариантах осуществления, CAR можно совместно экспрессировать с цитокином для улучшения персистенции, когда присутствует низкое количество опухолеассоциированного антигена. Например, CAR можно совместно экспрессировать с IL-15.

[0090] Последовательность открытой рамки считывания, кодирующую химерный рецептор, можно получать из источника геномной ДНК, из источника кДНК или можно синтезировать (например, посредством ПЦР), или использовать их комбинацию. В зависимости от размера геномной ДНК и количества интронов, может являться желательным использование кДНК или их комбинации, поскольку обнаружено, что интроны стабилизируют мРНК. Также, может обеспечивать дополнительные преимущества использование эндогенных или экзогенных некодирующих областей для стабилизации мРНК.

[0091] Предусматривают, что химерную конструкцию можно вводить в клетки NK в форме голой ДНК или в подходящем векторе. Способы стабильной трансфекции клеток посредством электропорации с использованием голой ДНК известны в данной области. См., например, Патент США No. 6410319. Голая ДНК, в общем, относится к ДНК, кодирующей химерный рецептор, содержащийся в плазмидном экспрессирующем векторе в правильной ориентации для экспрессии.

[0092] Альтернативно, вирусный вектор (например, ретровирусный вектор, аденовирусный вектор, аденоассоциированный вирусный вектор или лентивирусный вектор) можно использовать для введения химерной конструкции в клетки NK. Подходящие векторы для использования в соответствии со способом по настоящему изобретению не реплицируются в клетках NK. Известно большое количество векторов, основанных на вирусах, где количество копий вируса, поддерживаемое в клетках, является достаточно низким для поддержания жизнеспособности клетки, например, такие как векторы на основе HIV, SV40, EBV, HSV или BPV.

[0093] CAR может экспрессировать ген самоубийства, такой как CD20, CD52, EGFRv3 или индуцируемую каспазу 9.

[0094] CAR может содержать связывающий антиген опухоли домен. Связывающий антиген опухоли домен может быть предназначен, но без ограничения, для CD19, CD20, карциноэмбрионального антигена, альфафетопротеина, CA-125, MUC-1, эпителиального опухолевого антигена, ассоциированного с меланомой антигена, мутантного p53, мутантного ras, HER2/Neu, ERBB2, связывающего фолат белка, оболочечного гликопротеина gp120 HIV-1, оболочечного гликопротеина gp41 HIV-1, GD2, CD123, CD23, CD30, CD56, c-Met, мезотелина, GD3, HERV-K, IL-11-Rальфа, каппа-цепи, лямбда-цепи, CSPG4, ERBB2, EGFRvIII или VEGFR2. CAR может содержать гуманизированный scFv, такой как гуманизированный scFv для CD19, CD123, мезотелина, CD5, CD47, CLL-1, CD33, CD99, U5snRNP200, CD200, CS1, BAFF-R, ROR-1 или BCMA.

V. Способы применения

[0095] Варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способам применения иммуноцитов, таких как клетки NK или T-клетки, представленные в настоящем описании (например, размноженные посредством настоящих UAPC), для лечения или предотвращения медицинского заболевания или нарушения посредством переноса популяции иммуноцитов, вызывающих иммунный ответ. Способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества размноженных иммуноцитов, таким образом, лечение или предотвращение нарушения у субъекта. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения, злокачественную опухоль или инфекцию лечат посредством переноса популяции иммуноцитов, вызывающей иммунный ответ. Благодаря высвобождению из них провоспалительных цитокинов, иммуноциты могут обращать противовоспалительное микроокружение опухолей и увеличивать адаптивные иммунные ответы посредством стимуляции дифференцировки, активации и/или привлечения вспомогательных иммуноцитов к участкам злокачественности.

[0096] Опухоли, для которых можно использовать настоящие способы лечения, включают любой тип злокачественных клеток, такой как обнаруженные в солидной опухоли или гематологической опухоли. Иллюстративные солидные опухоли могут включать, но без ограничения, опухоль органа, выбранного из группы, состоящей из поджелудочной железы, ободочной кишки, слепой кишки, желудка, головного мозга, головы, шеи, яичника, почки, гортани, саркомы, легкого, мочевого пузыря, меланомы, предстательной железы и молочной железы. Иллюстративные гематологические опухоли включают опухоли костного мозга, T- или В-клеточные злокачественные новообразования, лейкозы, лимфомы, бластомы, миеломы и т.п. Дополнительные примеры злокачественных опухолей, которые можно лечить с использованием способов, представленных в настоящем описании, включают, но без ограничения, рак легкого (включая мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого и плоскоклеточную карциному легкого), злокачественную опухоль брюшины, рак желудочно-кишечного тракта или желудка (включая злокачественную опухоль желудочно-кишечного тракта и стромальную злокачественную опухоль желудочно-кишечного тракта), рак поджелудочной железы, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак толстого кишечника, колоректальный рак, карциному эндометрия или матки, карциному слюнной железы, злокачественную опухоль почки или ренальную злокачественную опухоль, рак предстательной железы, рак женских наружных половых органов, рак щитовидной железы, различные типы злокачественной опухоли головы и шеи и меланому.

[0097] Злокачественная опухоль может специфически иметь следующий гистологический тип, хотя и без ограничения: неоплазия, злокачественная; карцинома; карцинома, недифференцированная; гигантоклеточная и веретеноклеточная карцинома; мелкоклеточная карцинома; папиллярная карцинома; плоскоклеточная карцинома; лимфоэпителиальная карцинома; базальноклеточная карцинома; пиломатриксная карцинома; переходноклеточная карцинома; папиллярная переходноклеточная карцинома; аденокарцинома; гастринома, злокачественная; холангиокарцинома; печеночноклеточная карцинома; комбинированная печеночноклеточная карцинома и холангиокарцинома; трабекулярная аденокарцинома; аденокистозная карцинома; аденокарцинома в аденоматозном полипе; аденокарцинома, семейная коли-полипозная аденокарцинома; солидная карцинома; карциноидная опухоль, злокачественная; бронхиоло-альвеолярная аденокарцинома; папиллярная аденокарцинома; хромофобная карцинома; ацидофильная карцинома; оксифильная аденокарцинома; базофильная карцинома; светлоклеточная аденокарцинома; зернистоклеточная карцинома; фолликулярная аденокарцинома; папиллярная и фолликулярная аденокарцинома; неинкапсулированная склерозирующая карцинома; карцинома коры надпочечников; эндометриоидная карцинома; карцинома из придатков кожи; апокринная аденокарцинома; сальная аденокарцинома; церуминозная аденокарцинома; мукоэпидермоидная карцинома; цистаденокарцинома; папиллярная цистаденокарцинома; папиллярная серозная цистаденокарцинома; муцинозная цистаденокарцинома; муцинозная аденокарцинома; перстневидноклеточная карцинома; инфильтрирующая карцинома протоков; медуллярная карцинома; лобулярная карцинома; воспалительная карцинома; болезнь Педжета, молочной железы; ацинарноклеточная карцинома; аденосквамозная карцинома; аденокарцинома с плоскоклеточной метаплазией; тимома, злокачественная; стромальная опухоль яичников, злокачественная; текома, злокачественная; гранулезоклеточная опухоль, злокачественная; андробластома, злокачественная; карцинома из клеток Сертоли; опухоль из клеток Лейдига, злокачественная; липидноклеточная опухоль, злокачественная; параганглиома, злокачественная; экстрамамиллярная параганглиома, злокачественная; феохромоцитома; гломангиосаркома; злокачественная меланома; амеланотическая меланома; поверхностно распространяющаяся меланома; злокачественная меланома типа лентиго; акральные лентигинозные меланомы; нодулярные меланомы; злокачественная меланома в гигантском пигментном невусе; меланома эпителиоидных клеток; синий невус, злокачественная; саркома; фибросаркома; фиброзная гистиоцитома, злокачественная; миксосаркома; липосаркома; лейомиосаркома; рабдомиосаркома; эмбриональная рабдомиосаркома; альвеолярная рабдомиосаркома; стромальная саркома; смешанная опухоль, злокачественная; смешанная опухоль Мюллера; нефробластома; гепатобластома; карциносаркома; мезенхимома, злокачественная; опухоль Бреннера, злокачественная; филлоидная опухоль, злокачественная; синовиальная саркома; мезотелиома, злокачественная; дисгерминома; эмбриональная карцинома; тератома, злокачественная; струма яичника, злокачественная; хориокарцинома; мезонефрома, злокачественная; гемангиосаркома; гемангиоэндотелиома, злокачественная; саркома Капоши; гемангиоперицитома, злокачественная; лимфангиосаркома; остеосаркома; юкстакортикальная остеосаркома; хондросаркома; хондробластома, злокачественная; мезенхимальная хондросаркома; гигантоклеточная опухоль кости; саркома Юинга; одонтогенная опухоль, злокачественная; амелобластическая одонтосаркома; амелобластома, злокачественная; амелобластическая фибросаркома; пинеалома, злокачественная; хордома; глиома, злокачественная; эпендимома; астроцитома; протоплазматическая астроцитома; фибриллярная астроцитома; астробластома; глиобластома; олигодендроглиома; олигодендробластома; примитивная нейроэктодермальная опухоль; мозжечковая саркома; ганглионейробластома; нейробластома; ретинобластома; нейрогенная опухоль органов обоняния; менингиома, злокачественная; нейрофибросаркома; неврилеммома, злокачественная; зернистоклеточная опухоль, злокачественная; злокачественная лимфома; болезнь Ходжкина; парагранулема Ходжкина; злокачественная лимфома, мелкоклеточная лимфоцитарная; злокачественная лимфома, крупноклеточная, диффузная; злокачественная лимфома, фолликулярная; фунгоидный микоз; другие указанные неходжскинские лимфомы; B-клеточная лимфома; неходжскинская лимфома (NHL) низкой степени злокачественности/фолликулярная NHL; мелкоклеточная лимфоцитарная (SL) NHL; NHL промежуточной степени злокачественности/фолликулярная NHL; диффузная NHL промежуточной степени злокачественности; иммунобластная NHL высокой степени злокачественности; лимфобластная NHL высокой степени злокачественности; мелкоклеточная NHL с нерассеченными ядрами высокой степени злокачественности; массивное поражение NHL; лимфома из клеток мантийной зоны; связанная со СПИД лимфома; макроглобулинемия Вальденстрема; злокачественный гистиоцитоз; множественная миелома; саркома тучных клеток; иммунопролиферативное заболевание тонкого кишечника; лейкоз; лимфоидный лейкоз; лейкоз плазматических клеток; эритролейкоз; лейкоз с клетками лимфосаркомы; миелоидный лейкоз; базофильный лейкоз; эозинофильный лейкоз; моноцитарный лейкоз; лейкоз тучных клеток; мегакариобластный лейкоз; миелоидная саркома; волосатоклеточный лейкоз; хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL); острый лимфобластный лейкоз (ALL); острый миелоидный лейкоз (AML); и хронический миелобластный лейкоз.

[0098] Конкретные варианты осуществления относятся к способам лечения лейкоза. Лейкоз представляет собой злокачественную опухоль крови или костного мозга и характеризуется аномальной пролиферацией (образованием посредством умножения) клеток крови, обычно, белых кровяных клеток (лейкоцитов). Он является частью широкой группы заболеваний, называемых гематологическими неоплазиями. Лейкоз является широким термином, покрывающим спектр заболеваний. Лейкоз клинически и патологически разделяется на острые и хронические формы.

[0099] Острый лейкоз характеризуется быстрой пролиферацией незрелых клеток крови. Эта скученность делает костный мозг неспособным образовывать здоровые клетки крови. Острые формы лейкоза могут возникать у детей и молодых взрослых. Немедленное лечение необходимо при остром лейкозе из-за быстрого прогрессирования и накопления злокачественных клеток, которые затем переходят в кровоток и распространяются к другим органам организма. Вовлечение центральной нервной системы (ЦНС) является необычным, хотя это заболевание может иногда вызывать паралич черепных нервов. Хронический лейкоз отличается избыточным образованием относительно зрелых, но все еще аномальных, клеток крови. Как правило, прогрессирование занимает от нескольких месяцев до нескольких лет, клетки образуются с намного более высокой скоростью, чем нормальные клетки, что приводит к множеству аномальных кровяных клеток в крови. Хронический лейкоз в большинстве случаев возникает у более старших людей, однако, теоретически может возникать в любой возрастной группе. В то время как острый лейкоз необходимо лечить немедленно, хронические формы иногда мониторируют в течение некоторого временя до лечения, чтобы обеспечить максимальную эффективность терапии.

[00100] Кроме того, заболевания классифицируют на лимфоцитарные или лимфобластные, что показывает, что злокачественное изменение имеет место в том типе клеток костного мозга, который в норме переходит к формированию лимфоцитов, и миелогенные или миелоидные, что показывает, что злокачественное изменение имеет место в том типе клеток костного мозга, который в норме переходит к формированию красных кровяных клеток, некоторых типов белых кровяных клеток и тромбоцитов.

[00101] Острый лимфоцитарный лейкоз (также известный как острый лимфобластный лейкоз или ALL) является наиболее распространенным типом лейкоза у детей раннего возраста. Это заболевание также поражает взрослых, особенно в возрасте 65 лет и старше. Хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL) наиболее часто поражает взрослых в возрасте старше 55 лет. Он иногда возникает у более молодых взрослых, но почти никогда не поражает детей. Острый миелогенный лейкоз (также известный как острый миелоидный лейкоз, или AML) более часто возникает у взрослых, чем у детей. Этот тип лейкоза ранее называли острым нелимфоцитарным лейкозом. Хронический миелогенный лейкоз (CML) возникает в основном у взрослых.

[00102] Лимфома представляет собой тип злокачественной опухоли, возникающий в лимфоцитах (типе белых кровяных клеток в иммунной системе позвоночных). Существует множество типов лимфомы. Согласно Национальным институтам здравоохранения США, лимфомы насчитывают приблизительно пять процентов из всех случаев злокачественных опухолей в США, и лимфома Ходжкина, в частности, насчитывает менее одного процента из всех случаев злокачественных опухолей в США. Поскольку лимфатическая система является частью иммунной системы организма, пациенты с ослабленной иммунной системой, например, из-за инфекции HIV или из-за определенных наркотических или лекарственных средств, также имеют более высокую встречаемость лимфомы.

[00103] В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения, иммуноциты доставляют нуждающемуся в этом индивидууму, такому как индивидуум, имеющий злокачественную опухоль или инфекцию. Затем клетки усиливают иммунную систему индивидуума для атаки на соответствующие злокачественные или патогенные клетки. В некоторых случаях, индивидууму вводят одну или несколько доз иммуноцитов. В случаях, когда индивидууму вводят две или более доз иммуноцитов, длительность между введениями должна являться достаточной, чтобы обеспечить время для размножения у индивидуума, и, в конкретных вариантах осуществления, длительность между дозами составляет 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или более суток.

[00104] Источник иммуноцитов, которые предварительно активируют и размножают, может принадлежать к любому виду, однако, в конкретных вариантах осуществления, клетки получают, например, из банка пуповинной крови, периферической крови, человеческих эмбриональных стволовых клеток или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Подходящие дозы для терапевтического эффекта могут составлять по меньшей мере 10⁵ или между приблизительно 10⁵ и приблизительно 10¹⁰ клеток на дозу, например, предпочтительно в сериях из циклов дозирования. Иллюстративный режим дозирования состоит из четырех циклов дозирования по одной неделе в увеличивающихся дозах, начиная по меньшей мере при приблизительно 10⁵ клеток на сутки 0, например, с пошаговым увеличением вплоть до целевой дозы приблизительно 10¹⁰ клеток в пределах нескольких недель от начала схемы повышения дозы для одного и того же пациента. Подходящие способы введения включают внутривенный, подкожный, внутриполостной (например, посредством устройства доступа к резервуару), внутрибрюшинный и прямую инъекцию в опухолевую массу.

[00105] В одном иллюстративном способе, клетки NK можно получать из биологического образца, такого как одна или несколько доз пуповинной крови. Доза пуповинной крови может представлять собой замороженную дозу пуповинной крови. Дозу пуповинной крови можно размораживать и подвергать разделению в градиенте фиколла для получения мононуклеарных клеток. Мононуклеарные клетки можно истощать по положительным по CD3, CD14 и CD19, например, посредством CliniMAS. Затем клетки NK после отрицательного отбора можно культивировать в присутствии APC и IL-2 (например, 200 ед./мл). Затем клетки NK можно трансдуцировать с использованием ретровирусного супернатанта, экспрессирующего CAR, и культивировать с γ-облученными APC и IL-2. Наконец, клетки можно сортировать по положительной экспрессии CAR, например, для CD56, CD16, CD3, CD19, CD14 или CD45.

[00106] Иммуноциты, полученные в соответствии с настоящими способами, могут иметь множество потенциальных применений, включая экспериментальные и терапевтические применения. В частности, предусматривают, что такие популяции клеток могут быть необычайно полезными для супрессии нежелательных или ненадлежащих иммунных ответов. В таких способах, небольшое количество иммуноцитов отбирают у пациента и затем подвергают манипуляции и размножению ex vivo перед их повторной инфузией пациенту. Примерами заболеваний, которые можно лечить этим способом, являются аутоиммунные заболевания и состояния, при которых супрессированная иммунная активность является желательной, например, для переносимости аллотрансплантации. Терапевтический способ может включать предоставление млекопитающего, получение иммуноцитов от млекопитающего; размножение иммуноцитов ex vivo в соответствии со способами из настоящих способов, как описано выше; и введение размноженных иммуноцитов млекопитающему, подлежащему лечению.

[00107] Фармацевтическую композицию по настоящему описанию можно использовать отдельно или в комбинации с другими хорошо разработанными средствами, которые можно использовать для лечения злокачественной опухоли. При доставке отдельно или в комбинации с другими средствами, фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно доставлять различными способами и в различные участки в организме млекопитающего, в частности, человека, для достижения конкретного эффекта. Специалисту в данной области известно, что, несмотря на то, что более одного способа можно использовать для введения, конкретный способ может обеспечивать более немедленную и более эффективную реакцию, чем другой способ. Например, внутрикожную доставку можно использовать более преимущественным способом, по сравнению с ингаляцией, для лечения меланомы. Местную или системную доставку можно осуществлять посредством введения, включающего нанесение или инстилляцию состава в полости организма, ингаляцию или инсуфляцию аэрозоля, или посредством парентерального введения, включающего внутримышечное, внутривенное, интрапортальное, внутрипеченочное, перитонеальное, подкожное или внутрикожное введение.

[00108] Конкретные варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способам лечения или предотвращения иммуноопосредованного нарушения. В одном варианте осуществления, субъект имеет аутоиммунное заболевание. Неограничивающие примеры аутоиммунных заболеваний включают: очаговую алопецию, анкилозирующий спондилит, антифосфолипидный синдром, аутоиммунную болезнь Аддисона, аутоиммунные заболевания надпочечника, аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунный гепатит, аутоиммунный оофорит и орхит, аутоиммунную тромбоцитопению, болезнь Бехчета, буллезный пемфигоид, кардиомиопатию, целиакию-дерматит, синдром хронической усталости и иммунной дисфункции (CFIDS), хроническую воспалительную демиелинизирующую полиневропатию, синдром Черджа-Стросс, рубцовый пемфигоид, синдром CREST, болезнь холодовой агглютинации, болезнь Крона, дискоидную волчанку, первичную криоглобулинемию смешанного типа, фибромиалгию-фибромиозит, гломерулонефрит, болезнь Грэйвса, синдром Гийена-Барре, тиреоидит Хашимото, идиопатический пульмонарный фиброз, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру (ITP), IgA невропатию, ювенильный артрит, лишай Вильсона, красную волчанку, болезнь Меньера, смешанное заболевание соединительной ткани, рассеянный склероз, сахарный диабет типа 1 или иммуноопосредованный сахарный диабет, миастению, нефротический синдром (такой как гломерулонефрит с минимальными изменениями, фокальный гломерулосклероз или мембранозная нефропатия), обыкновенную пузырчатку, пернициозную анемию, узелковый полиартериит, полихондрит, полигландулярные синдромы, ревматическую полимиалгию, полимиозит и дерматомиозит, первичную агаммаглобулинемию, первичный биллиарный цирроз, псориаз, псориатический артрит, феномен Рейно, синдром Рейтера, ревматоидный артрит, саркоидоз, склеродермию, синдром Шегрена, синдром мышечной скованности, системную красную волчанку, красную волчанку, язвенный колит, увеит, васкулиты (такие как узелковый полиартериит, артериит Такаясу, височный артериит/гигантоклеточный артериит или герпетиформный дерматит васкулит), витилиго и гранулематоз Вегенера. Таким образом, некоторые примеры аутоиммунного заболевания, которое можно лечить с использованием способов, описанных в настоящем описании, включают, но без ограничения, рассеянный склероз, ревматоидный артрит, системную красную волчанку, сахарный диабет типа I, болезнь Крона; язвенный колит, миастению, гломерулонефрит, анкилозирующий спондилит, васкулит или псориаз. Субъект может также иметь аллергическое нарушение, такое как астма.

[00109] В другом варианте осуществления, субъект является реципиентом трансплантированного органа или стволовых клеток, и иммуноциты используют для предотвращения и/или лечения отторжения. В конкретных вариантах осуществления, субъект имеет реакцию или подвержен риску развития реакции трансплантат против хозяина. GVHD является возможным осложнением для любого трансплантата с использованием или с содержанием стволовых клеток либо от родственного, либо от неродственного донора. Существует два вида GVHD, острая и хроническая. Острая GVHD возникает в пределах первых трех месяцев после трансплантации. Признаки острой GVHD включают красноватую кожную сыпь на руках и ногах, которая может распространяться и становиться более тяжелой, с шелушащейся или пузырящейся кожей. Острая GVHD может также поражать желудок и кишечник, в этом случае присутствуют судороги, тошнота и диарея. Пожелтение кожи и глаз (желтуха) показывает, что острая GVHD поразила печень. Хроническую GVHD ранжируют на основании ее тяжести: стадия/градация 1 является мягкой; стадия/градация 4 является тяжелой. Хроническая GVHD развивается через три месяца или позже после трансплантации. Симптомы хронической GVHD являются сходными с симптомами острой GVHD, но кроме того, хроническая GVHD может также поражать слизистые железы в глазах, слюнные железы во рту, и железы, смазывающие слизистую оболочку желудка и кишечника. Можно использовать любую из описанных популяций иммуноцитов. Примеры трансплантированного органа включают трансплантат солидного органа, такого как почка, печень, кожа, поджелудочная железа, легкое и/или сердце, или клеточный трансплантат, такой как клетки островков, гепатоциты, миобласты, клетки костного мозга, или гематопоэтические или другие стволовые клетки. Трансплантат может представлять собой композитный трансплантат, такой как ткани лица. Иммуноциты можно вводить до трансплантации, во время трансплантации или после трансплантации. В некоторых вариантах осуществления, иммуноциты вводят до трансплантации, например, за по меньшей мере 1 час, по меньшей мере 12 часов, по меньшей мере 1 сутки, по меньшей мере 2 суток, по меньшей мере 3 суток, по меньшей мере 4 суток, по меньшей мере 5 суток, по меньшей мере 6 суток, по меньшей мере 1 неделю, по меньшей мере 2 недели, по меньшей мере 3 недели, по меньшей мере 4 недели или по меньшей мере 1 месяц до трансплантации. В одном конкретном неограничивающем примере, введение терапевтически эффективного количества иммуноцитов проводят за 3-5 суток до трансплантации.

[00110] В конкретных вариантах осуществления, иммуноциты вводят в комбинации с вторым лекарственным средством. Например, второе лекарственное средство может содержать T-клетки, иммуномодулирующее средство, моноклональное антитело или химиотерапевтическое средство. В неограничивающих примерах, иммуномодулирующее средство представляет собой ленолидомид, моноклональное антитело представляет собой ритуксимаб, офатумаб или лумиликсимаб, и химиотерапевтическое средство представляет собой флударабин или циклофосфамид.

[00111] Композиция по настоящему описанию может быть предоставлена в единичной дозированной форме, где каждая единичная доза, например, для инъекции, содержит предопределенное количество композиции, отдельно или в подходящей комбинации с другими действующими веществами. Термин единичная дозированная форма, в рамках изобретения, относится к физически дискретным единицам, пригодным в качестве единичных доз для субъектов-людей и животных, где каждая единица содержит предопределенное количество композиции по настоящему изобретению, отдельно или в комбинации с другим действующим веществом, рассчитанное как количество, достаточное для оказания желательного эффекта, в сочетании с фармацевтически приемлемым разбавителем, носителем или связующим, когда это целесообразно. Характеристики новых единичных дозированных форм по настоящему изобретению зависят от конкретной фармакодинамики, ассоциированной с фармацевтической композицией у конкретного субъекта.

[00112] Желательно, эффективное количество или достаточное количество выделенных трансдуцированных иммуноцитов присутствует в композиции, и его вводят субъекту, таким образом, чтобы вызывать длительные, специфические, противоопухолевые ответы для уменьшения объема опухоли или прекращения роста или повторного роста опухоли, который в ином случае возникает в результате отсутствия такого лечения. Желательно, количество иммуноцитов, повторно введенных субъекту, вызывает уменьшение размера опухоли на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 100%, по сравнению с такими же условиями, когда иммуноциты не присутствуют.

[00113] Соответственно, количество введенных иммуноцитов должно учитывать способ введения и должно являться таким, чтобы вводить достаточное количество иммуноцитов, чтобы достигать желательного терапевтического ответа. Кроме того, количество каждого действующего вещества, включенное в композиции, описанные в настоящем описании (например, количество на каждую клетку, подлежащую приведению в контакт или количество на определенную массу тела), можно менять в различных применениях. Как правило, концентрация иммуноцитов, желательно, должна являться достаточной для предоставления субъекту, подвергаемому лечению, по меньшей мере от приблизительно 1×10⁶ до приблизительно 1×10⁹ иммуноцитов, даже более желательно, от приблизительно 1×10⁷ до приблизительно 5×10⁸ иммуноцитов, хотя можно использовать любое подходящее количество, либо выше, например, более 5×10⁸ клеток, либо ниже, например, менее 1×10⁷ клеток. Расписание дозирования может быть основано на хорошо разработанных видах терапии на основе клеток (см., например, Topalian and Rosenberg, 1987; Патент США No. 4690915), или можно использовать альтернативный способ непрерывной инфузии.

[00114] Эти значения обеспечивают общее руководство по диапазону иммуноцитов для использования практикующим специалистом в данной области при оптимизации способа по настоящему изобретению для практического осуществления изобретения. Перечисление в настоящем описании таких диапазонов никоим образом не препятствует использованию более высокого или более низкого количества компонента, как может потребоваться при конкретном применении. Например, фактические доза и расписание могут меняться, в зависимости от того, вводят ли композиции в комбинации с другими фармацевтическими композициями, или в зависимости от различий между индивидуумами в фармакокинетике, распределении и метаболизме лекарственного средства. Специалист в данной области может легко осуществлять любые необходимые коррекции в соответствии с требованиями конкретной ситуации.

VI. Наборы

[00115] В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к набору, который может включать, например, одну или несколько сред и компонентов для получения UAPC и/или иммуноцитов. Такие составы могут содержать коктейль факторов, в форме, пригодной для комбинации с APC и/или иммуноцитами. Система реагентов может быть упакована либо в водных средах, либо в лиофилизированной форме, когда это целесообразно. Контейнерные средства из наборов могут, в общем, включать по меньшей мере одну ампулу, пробирку, флакон, бутыль, шприц или другие контейнерные средства, в которые компонент может быть помещен, и предпочтительно, подходящим образом аликвотирован. Когда в наборе присутствует более одного компонента, набор также, как правило, содержит второй, третий или другой дополнительный контейнер, в который могут быть отдельно помещены дополнительные компоненты. Однако, различные комбинации компонентов могут содержаться в флаконе. Компоненты набора могут быть представлены в форме высушенного порошка(порошков). Когда реагенты и/или компоненты представлены в форме сухого порошка, порошок можно разводить посредством добавления подходящего растворителя. Предусматривают, что растворитель может также быть представлен в других контейнерных средствах. Наборы также, как правило, включают средства для содержания компонента(компонентов) набора в надежной изоляции для коммерческой продажи. Такие контейнеры могут включать полученные литьем под давлением или формованием с раздувом и растяжением пластиковые контейнеры, в которых удерживают желательные ампулы. Набор может также включать инструкции для использования, например, в печатном или электронном формате, таком как цифровой формат.

VII. Примеры

[00116] Следующие примеры включены для демонстрации предпочтительных вариантов осуществления изобретения. Специалист в данной области должен понимать, что способы, описанные в следующих примерах, представляют способы, которые, как открыто авторами настоящего изобретения, хорошо функционируют для практического осуществления изобретения, и таким образом, можно считать, что они составляют предпочтительные способы для его практического осуществления. Однако, специалист в данной области должен, в свете настоящего описания, понимать, что множество изменений можно вносить в описанные конкретные варианты осуществления и все еще получать подобный или сходный результат без отклонения от содержания и объема изобретения.

Пример 1 - Комбинация mbIL21, 4-1BBL и SLAM (CD48/CS1)

[00117] Универсальные антигенпрезентирующие клетки (UAPC) получали посредством трансдукции клеток K562 с использованием ретровирусных конструкций для связанного с мембраной IL-21 и 41BBL (лиганда CD137) либо с CD48-Katushka, либо с CS1-EGFP. Карты и аннотации MMLV-ретровирусных конструкций показаны на ФИГ. 4A-4D. Клон 46 (ФИГ. 3B) получали в результате вынужденной экспрессии mblL-21 и 41BBL в чувствительных к клеткам NK APC K562 (HLA-A^-, HLA-B^-) (ФИГ. ЗА). UAPC получали посредством вынужденной экспрессии mbIL-1, 41BBL и CD48 в клетках K562 (ФИГ. 3C). UAPC2 получали посредством вынужденной экспрессии mbIL-21, 41BBL и CS1 в клетках K562 (ФИГ. 3D).

[00118] Количественное размножение клеток NK проводили с использованием активации посредством клона 46, UAPC или UAPC2. Пролиферация и размножение клеток NK посредством совместного культивирования с APC показали, что клон 46 являлся превосходным по своей способности к размножению как нетрансдуцированных клеток NK (NT-NK), так и трансдуцированных CAR-10 (SG4-NK), по сравнению с ранее опубликованным клоном 9 (ФИГ. 2B).

[00119] Показано, что размножение клеток NK посредством совместного культивирования с UAPC являлось превосходным по своей способности уменьшать время удвоения клеток NK до 31,38 часов, по сравнению с ранее опубликованным клоном 9 (время удвоения 33 часа), приводя к пролиферативному преимуществу 44% (1671-кратное размножение для UAPC против 1161-кратного размножения для клона 9) в течение 2 недель (ФИГ. 2E). Взаимосвязь между временем удвоения, кратностью размножения и исходной популяцией клеток заключена в следующей формуле:

[00120] где Nf представляет собой конечное количество клеток, Nb представляет собой начальное количество клеток, e=2,71828 (математическая константа, также известная как число Эйлера), T представляет собой длительность культивирования в часах, Td представляет собой время удвоения в часах. Время удвоения влияет на конечное количество клеток экспоненциальным образом, таким образом увеличивая пролиферативное преимущество в течение указанного периода культивирования клеток, позволяя сбор клинически значимых количеств клеток в компактные временные рамки. Таким образом, настоящие способы позволяют эффективное получение клеток NK посредством совместного культивирования с UAPC.

[00121] Технология настоящей платформы принимает преимущество специфических комбинаторных терапевтических путей для предоставления практических способов получения больших количеств высоко функциональных и цитотоксических клеток NK клинической квалификации, предназначенных для иммунотерапии злокачественных опухолей. Размноженные клетки на 100% представляют собой клетки NK, без поддающихся детекции T-клеток, исключая непреднамеренные побочные эффекты трансплантат против хозяина, обычные для многих препаратов иммуноцитов.

* * *

[00122] Все способы, описанные и заявленные в настоящем описании, можно осуществлять и исполнять без излишнего экспериментирования в свете настоящего описания. В то время как композиции и способы по этому изобретению описаны в отношении предпочтительных вариантов осуществления, специалисту в данной области очевидно, что варианты можно применять для способов и в стадиях или в последовательности стадий способа, описанного в настоящем описании, без отклонения от концепции, содержания и объема изобретения. Более конкретно, очевидно, что конкретными средствами, которые являются как химически, так и физиологически родственными, можно заменять средства, описанные в настоящем описании, в то же время можно достигать таких же или сходных результатов. Все такие сходные замены и модификации, очевидные специалисту в данной области, по-видимому, включены в содержание, объем и концепцию изобретения, как определено посредством прилагаемой формулы изобретения.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Содержание следующих ссылок, до той степени, в которой они предоставляют иллюстративные процедурные или другие детали, дополнительные к деталям, указанным в настоящем описании, конкретно приведено в настоящем описании в качестве ссылки.

Czerkinsky et al, J. Immunol. Methods 1988; 110:29-36.

Fast et al., Transfusion 2004;44:282-5.

He Y, et al. Journal of immunology research. 2014;2014:7.

Международная публикация No. PCT/US95/01570

Международная публикация No. WO2000/06588

Международная публикация No. WO2005/035570

Olsson et al. J. Clin. Invest. 1990;86:981-985.

Taitano et al., The Journal of Immunology, 196, 2016.

Патент США No. 5939281

Патент США No. 6218132

Патент США No. 6264951

Патент США No. 7488490

Публикация патента США No. 2007/0078113

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Board of Regents, The University of Texas System

REZVANI, KATY

ANG, SONNY O.T.

LIU, ENLI

SHPALL, ELIZABETH

<120> УНИВЕРСАЛЬНЫЕ АНТИГЕНПРЕЗЕНТИРУЮЩИЕ КЛЕТКИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

<130> UTFC.P1355WO

<150> 62633587

<151> 2018-02-21

<160> 2

<170> PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 8202

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Конструкция CS1

<400> 1

aatgaaagac cccacctgta ggtttggcaa gctagcttaa gtaacgccat tttgcaaggc 60

atggaaaaat acataactga gaatagaaaa gttcagatca aggtcaggaa cagatggaac 120

agctgaatat gggccaaaca ggatatctgt ggtaagcagt tcctgccccg gctcagggcc 180

aagaacagat ggaacagctg aatatgggcc aaacaggata tctgtggtaa gcagttcctg 240

ccccggctca gggccaagaa cagatggtcc ccagatgcgg tccagccctc agcagtttct 300

agagaaccat cagatgtttc cagggtgccc caaggacctg aaatgaccct gtgccttatt 360

tgaactaacc aatcagttcg cttctcgctt ctgttcgcgc gcttatgctc cccgagctca 420

ataaaagagc ccacaacccc tcactcgggg cgccagtcct ccgattgact gagtcgcccg 480

ggtacccgtg tatccaataa accctcttgc agttgcatcc gacttgtggt ctcgctgttc 540

cttgggaggg tctcctctga gtgattgact acccgtcagc gggggtcttt catttggggg 600

ctcgtccggg atcgggagac ccctgcccag ggaccaccga cccaccaccg ggaggtaagc 660

tggccagcaa cttatctgtg tctgtccgat tgtctagtgt ctatgcgact gattttatgc 720

gcctgcgtcg gtactagtta gctaactagc tctgtatctg gcggacccgt gggctggaac 780

tgacgagttc ggaacacccg gccgcaaccc tgggagacgt cccagggact tcgggggccg 840

gctttttgtg gcccgacctg agtcctaaaa tcccgatcgt ttaggactct ttggtgcacc 900

ccccttaggc aggagggata tgtggttctg gtaggagacg agaacctaaa acagttcccg 960

cctccgtctg aatttttgct ttcggtttgg gaccgaagcc gcgccgcgcg tcttgtctgc 1020

tgcagcatcg ttctgtgttg tcgctctgtc tgactgtgtt tctgtatttg tctgaaaata 1080

tgggcccggg ctagcctgtt accactccct gctaagtttg accttaggtc actggaaaga 1140

tgtcgagcgg atcgctcaca accagtcggt agatgtcagc agaagagacg ttgggttacc 1200

ttctgctctg cagaatggcc aacctttaac gtcggatggc cgcgaggcac ggcaccttta 1260

accgagacct catcacccag gttaagatca aggtcttttc acctggcccg catggacacc 1320

cagaccaggt ggggtacatc gtgacctggg aagccttggc ttttgacccc cctccctggg 1380

tcaagccctt tgtacaccct aagcctccgc ctcctcttcc tccatccgcc ccgtctctcc 1440

cccttggcaa cctcctcgtt cgaccccgcc tcgatcctcc ctttatccag ccctcactcc 1500

ttctctaggc gcccccatat ggccatatga gatcttatat ggggcacccc cgccccttgt 1560

aaacttccct gaccctgaca tgacaagagt tactaacagc ccctctctcc aagctcactt 1620

acaggctctc tacttagtcc agcacggcaa gtctggagac ctctggcggc agcctaccaa 1680

gaacaactgg accgaccggt ggtacctcac ccttgcaccg agtcggcgac acagtgtggg 1740

tccgccgaca ccagactaag aacctagaac ctcgctggaa aggcgacctt acacagtcct 1800

gctgaccacc cccaccgccc tcaaagtaga cggcatcgca gcttggatac acgccgccca 1860

cgtgaaggct gccgaccccg ggggtggacc atcctctaga ctgccatgct cgaggccggc 1920

agccccacct gcctgaccct gatctacatc ctgtggcagc tgaccggcag cgccgccagc 1980

ggccccgtga aggagctggt gggcagcgtg ggcggcgccg tgaccttccc cctgaagagc 2040

aaggtgaagc aggtggacag catcgtgtgg accttcaaca ccacccccct ggtgaccatc 2100

cagcccgagg gcggcaccat catcgtgacc cagaacagaa acagagagag agtggacttc 2160

cccgacggcg gctacagcct gaagctgagc aagctgaaga agaacgacag cggcatctac 2220

tacgtgggca tctacagcag cagcctgcag cagcccagca cccaggagta cgtgctgcac 2280

gtgtacgagc acctgagcaa gcccaaggtg accatgggcc tgcagagcaa caagaacggc 2340

acctgcgtga ccaacctgac ctgctgcatg gagcacggcg aggaggacgt gatctacacc 2400

tggaaggccc tgggccaggc cgccaacgag agccacaacg gcagcatcct gcccatcagc 2460

tggagatggg gcgagagcga catgaccttc atctgcgtgg ccagaaaccc cgtgagcaga 2520

aacttcagca gccccatcct ggccagaaag ctgtgcgagg gcgccgccga cgaccccgac 2580

agcagcatgg tgctgctgtg cctgctgctg gtgcccctgc tgctgagcct gttcgtgctg 2640

ggcctgttcc tgtggttcct gaagagagag agacaggagg agtacatcga ggagaagaag 2700

agagtggaca tctgcagaga gacccccaac atctgccccc acagcggcga gaacaccgag 2760

tacgacacca tcccccacac caacagaacc atcctgaagg aggaccccgc caacaccgtg 2820

tacagcaccg tggagatccc caagaagatg gagaaccccc acagcctgct gaccatgccc 2880

gacaccccca gactgttcgc ctacgagaac gtgatcggca gcacctccgg cagcggcgcg 2940

cctggcagcg gcgagggcag caccaagggc atggtgagca agggcgagga gctgttcacc 3000

ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg 3060

tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc 3120

accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag 3180

tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc 3240

gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc 3300

gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac 3360

ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac aagctggagt acaactacaa cagccacaac 3420

gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac 3480

aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc gaccactacc agcagaacac ccccatcggc 3540

gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa 3600

gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc 3660

actctcggca tggacgagct gtacaagtga cgcgtcatca tcgatccgga ttagtccaat 3720

ttgttaaaga caggatatca gtggtccagg ctctagtttt gactcaacaa tatcaccagc 3780

tgaagcctat agagtacgag ccatagataa aataaaagat tttatttagt ctccagaaaa 3840

aggggggaat gaaagacccc acctgtaggt ttggcaagct agcttaagta acgccatttt 3900

gcaaggcatg gaaaaataca taactgagaa tagagaagtt cagatcaagg tcaggaacag 3960

atggaacagc tgaatatggg ccaaacagga tatctgtggt aagcagttcc tgccccggct 4020

cagggccaag aacagatgga acagctgaat atgggccaaa caggatatct gtggtaagca 4080

gttcctgccc cggctcaggg ccaagaacag atggtcccca gatgcggtcc agccctcagc 4140

agtttctaga gaaccatcag atgtttccag ggtgccccaa ggacctgaaa tgaccctgtg 4200

ccttatttga actaaccaat cagttcgctt ctcgcttctg ttcgcgcgct tctgctcccc 4260

gagctcaata aaagagccca caacccctca ctcggggcgc cagtcctccg attgactgag 4320

tcgcccgggt acccgtgtat ccaataaacc ctcttgcagt tgcatccgac ttgtggtctc 4380

gctgttcctt gggagggtct cctctgagtg attgactacc cgtcagcggg ggtctttcac 4440

acatgcagca tgtatcaaaa ttaatttggt tttttttctt aagtatttac attaaatggc 4500

catagtactt aaagttacat tggcttcctt gaaataaaca tggagtattc agaatgtgtc 4560

ataaatattt ctaattttaa gatagtatct ccattggctt tctacttttt cttttatttt 4620

tttttgtcct ctgtcttcca tttgttgttg ttgttgtttg tttgtttgtt tgttggttgg 4680

ttggttaagc ttttttttta aagatcctac actatagttc aagctagact attagctact 4740

ctgtaaccca gggtgagccc ttgaagtcat gggtagcctg ctgttttagc cttcccacat 4800

ctaagattac aggtatgagc tatcgcattt ttggtatatt gattgattga ttgattgatg 4860

tgtgtgtgtg tgattgtgtt tgtgtgtgtg acgctgtgaa aatgtgtgta tgggtgtgtg 4920

tgaatgtgtg tatgtatgtg tgtgtgtgag tgtgtgtgtg tgtgtgtgca tgtgtgtgtg 4980

tgtgactgtg tctatgtgta tgactgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtggctg tgtgtgtgtg 5040

tgtgtgtgtg tgttgtgaaa aaatattcta tggtagtgag agccaacgct ccgggcctca 5100

ggtgtcaggt tggtttttga gacagagtct ttcacttagc ttggaattca ctggccgtcg 5160

ttgcttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc 5220

acatccccct gcttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc 5280

caacagttgc gcagcctggc aatggcgaat ggcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc 5340

atctgtgcgg tatttcacac cgcatagctg gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc 5400

cgcatagtta agccagcccc gacacccgcc aacagccccg ctgacgcgcc ctgacgggct 5460

tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg tcgctccggg agctgcatgt 5520

gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgagacg aaagggcctc gcgtgatacg 5580

cctattttta taggttaatg tcatgataat aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt 5640

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 5700

tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat 5760

gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt 5820

ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg 5880

agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 5940

agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 6000

tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 6060

tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg 6120

cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg 6180

aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 6240

tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 6300

tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc 6360

ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc 6420

ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg 6480

cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac 6540

gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 6600

actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 6660

aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 6720

caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 6780

aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 6840

accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 6900

aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg 6960

ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 7020

agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 7080

accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 7140

gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 7200

tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 7260

cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 7320

cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 7380

cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt 7440

ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 7500

taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 7560

gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 7620

cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct 7680

cactgccatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat gttgtgtgga 7740

attgtgagcg gagctaacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat tacgccaagc 7800

tttgctctta ggagtttcct gcaatacatc ccaaactcaa atatataaag catttgactt 7860

gttctatgcc ctagggggcg gggggaaggc ctaagccagc tttttttaac atttaaaatg 7920

ttaattccat tttaaatgca cagatgtttt tatttcgcat aagggtttca atgtgcatga 7980

atgctgcaat attcctgtta ccaaagctag tataaataaa aatagataaa cgtggaaatt 8040

acttagagtt tctgtcatta acgtttcctt cctcagttga caacataaat gcgcgctgct 8100

gagcaagcca gtttgcatct gtcaggatca atttcccatt atgccagtca tattaattgc 8160

actagtcaat tagttgattt ttatttttga catatacatg tg 8202

<210> 2

<211> 7935

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Конструкция CD48

<400> 2

aatgaaagac cccacctgta ggtttggcaa gctagcttaa gtaacgccat tttgcaaggc 60

atggaaaaat acataactga gaatagaaaa gttcagatca aggtcaggaa cagatggaac 120

agctgaatat gggccaaaca ggatatctgt ggtaagcagt tcctgccccg gctcagggcc 180

aagaacagat ggaacagctg aatatgggcc aaacaggata tctgtggtaa gcagttcctg 240

ccccggctca gggccaagaa cagatggtcc ccagatgcgg tccagccctc agcagtttct 300

agagaaccat cagatgtttc cagggtgccc caaggacctg aaatgaccct gtgccttatt 360

tgaactaacc aatcagttcg cttctcgctt ctgttcgcgc gcttatgctc cccgagctca 420

ataaaagagc ccacaacccc tcactcgggg cgccagtcct ccgattgact gagtcgcccg 480

ggtacccgtg tatccaataa accctcttgc agttgcatcc gacttgtggt ctcgctgttc 540

cttgggaggg tctcctctga gtgattgact acccgtcagc gggggtcttt catttggggg 600

ctcgtccggg atcgggagac ccctgcccag ggaccaccga cccaccaccg ggaggtaagc 660

tggccagcaa cttatctgtg tctgtccgat tgtctagtgt ctatcgactg attttatgcg 720

cctgcgtcgg tactagttag ctaactagct ctgtatctgg cggacccgtg gctggaactg 780

acgagttcgg aacacccggc cgcaaccctg ggagacgtcc cagggacttc gggggccgct 840

ttttgtggcc cgacctgagt cctaaaatcc cgatcgttta ggactctttg gtgcaccccc 900

cttagcagga gggatatgtg gttctggtag gagacgagaa cctaaaacag ttcccgcctc 960

cgtctgaatt tttgctttcg gtttgggacc gaagccgcgc cgcgcgtctt gtctgctgca 1020

gcatcgttct gtgttgtcct ctgtctgact gtgtttctgt atttgtctga aaatatgggc 1080

ccgggctagc ctgttaccac tccctctaag tttgacctta ggtcactgga aagatgtcga 1140

gcggatcgct cacaaccagt cggtagatgt cacagaagag acgttgggtt accttctgct 1200

ctgcagaatg gccaaccttt aacgtcggat ggccgcgagc acggcacctt taaccgagac 1260

ctcatcaccc aggttaagat caaggtcttt tcacctggcc cgcatggaca cccagaccag 1320

gtggggtaca tcgtgacctg ggaagccttg gcttttgacc cccctccctg ggtcaagccc 1380

tttgtacacc ctaagcctcc gcctcctctt cctccatccg ccccgtctct cccccttgca 1440

acctcctcgt tcgaccccgc ctcgatcctc cctttatcca gccctcactc cttctctagg 1500

cgcccccata tggccatatg agatcttata tggggcaccc ccgccccttg taaacttccc 1560

tgaccctgac atgacaagag ttactaacag cccctctctc caagctcact tacaggctct 1620

ctacttagtc cagcacgcaa gtctggagac ctctggcggc agcctaccaa gaacaactgg 1680

accgaccggt ggtacctcac ccttcaccga gtcggcgaca cagtgtgggt ccgccgacac 1740

cagactaaga acctagaacc tcgctggaaa gcgaccttac acagtcctgc tgaccacccc 1800

caccgccctc aaagtagacg gcatcgcagc ttggatacac gccgcccacg tgaaggctgc 1860

cgaccccggg ggtggaccat cctctagact gccatgctcg aggtgggtga ggatagcgtg 1920

ctgatcaccg agaacatgca catgaaactg tacatggagg gcaccgtgaa cgaccaccac 1980

ttcaagtgca catccgaggg cgaaggcaag ccctacgagg gcacccagac catgaagatc 2040

aaggtggtcg agggcggccc tctccccttc gccttcgaca tcctggctac cagcttcatg 2100

tacggcagca aaacctttat caaccacacc cagggcatcc ccgacttctt taagcagtcc 2160

ttccctgagg gcttcacatg ggagaggatc accacatacg aagacggggg cgtgctgacc 2220

gctacccagg acaccagcct ccagaacggc tgcctcatct acaacgtcaa gatcaacggg 2280

gtgaacttcc catccaacgg ccctgtgatg cagaagaaaa cactcggctg ggaggccagc 2340

accgagatgc tgtaccccgc tgacagcggc ctgagaggcc atgcccagat ggccctgaag 2400

ctcgtgggcg ggggctacct gcactgctcc ctcaagacca catacagatc caagaaaccc 2460

gctaagaacc tcaagatgcc cggcttctac ttcgtggacc ggagactgga aagaatcaag 2520

gaggccgaca aagagaccta cgtcgagcag cacgagatgg ctgtggccag atactgcgac 2580

ctgcctagca aactggggca cagcggcagc acctccggca gcggcgcgcc tggcagcggc 2640

gagggcagca ccaagggcga gggcagggga agtcttctaa catgcgggga cgtggaggaa 2700

aatcccgggc ccatgtgcag cagaggctgg gacagctgcc tggccctgga gctgctgctg 2760

ctgcccctga gcctgctggt gaccagcatc cagggccacc tggtgcacat gaccgtggtg 2820

agcggcagca acgtgaccct gaacatcagc gagagcctgc ccgagaacta caagcagctg 2880

acctggttct acaccttcga ccagaagatc gtggagtggg acagcagaaa gagcaagtac 2940

ttcgagagca agttcaaggg cagagtgaga ctggaccccc agagcggcgc cctgtacatc 3000

agcaaggtgc agaaggagga caacagcacc tacatcatga gagtgctgaa gaagaccggc 3060

aacgagcagg agtggaagat caagctgcag gtgctggacc ccgtgcccaa gcccgtgatc 3120

aagatcgaga agatcgagga catggacgac aactgctacc tgaagctgag ctgcgtgatc 3180

cccggcgaga gcgtgaacta cacctggtac ggcgacaaga gacccttccc caaggagctg 3240

cagaacagcg tgctggagac caccctgatg ccccacaact acagcagatg ctacacctgc 3300

caggtgagca acagcgtgag cagcaagaac ggcaccgtgt gcctgagccc cccctgcacc 3360

ctggccagaa gcttcggcgt ggagtggatc gccagctggc tggtggtgac cgtgcccacc 3420

atcctgggcc tgctgctgac ctgacgcgtc atcatcgatc cggattagtc caatttgtta 3480

aagacaggat atcagtggtc caggctctag ttttgactca acaatatcac cagctgaagc 3540

ctatagagta cgagccatag ataaaataaa agattttatt tagtctccag aaaaaggggg 3600

gaatgaaaga ccccacctgt aggtttggca agctagctta agtaacgcca ttttgcaagg 3660

catggaaaaa tacataactg agaatagaga agttcagatc aaggtcagga acagatggaa 3720

cagctgaata tgggccaaac aggatatctg tggtaagcag ttcctgcccc ggctcagggc 3780

caagaacaga tggaacagct gaatatgggc caaacaggat atctgtggta agcagttcct 3840

gccccggctc agggccaaga acagatggtc cccagatgcg gtccagccct cagcagtttc 3900

tagagaacca tcagatgttt ccagggtgcc ccaaggacct gaaatgaccc tgtgccttat 3960

ttgaactaac caatcagttc gcttctcgct tctgttcgcg cgcttctgct ccccgagctc 4020

aataaaagag cccacaaccc ctcactcggg gcgccagtcc tccgattgac tgagtcgccc 4080

gggtacccgt gtatccaata aaccctcttg cagttgcatc cgacttgtgg tctcgctgtt 4140

ccttgggagg gtctcctctg agtgattgac tacccgtcag cgggggtctt tcacacatgc 4200

agcatgtatc aaaattaatt tggttttttt tcttaagtat ttacattaaa tggccatagt 4260

acttaaagtt acattggctt ccttgaaata aacatggagt attcagaatg tgtcataaat 4320

atttctaatt ttaagatagt atctccattg gctttctact ttttctttta tttttttttg 4380

tcctctgtct tccatttgtt gttgttgttg ttctgtttgt ttgtttgttg gttggttggt 4440

taattttttt ttaaagatcc tacactatag ttcaagctag actattagct actctgtaac 4500

ccagggtgac cttgaagtca tgggtagcct gctgttttag ccttccccac atctaagatt 4560

acaggtatga gctatcattt ttggtatatt gattgattga ttgattgatg tgtgtgtgtg 4620

tgattgtgtt tgtgtgtgtg actgtgaaaa tgtgtgtatg ggtgtgtgtg aatgtgtgct 4680

atgtatgtgt gtgtgtgagt gtgtgtgtgt gtgtgtgcat gtgtgtgtgt gtgactgtgt 4740

ctatgctgta tgactgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 4800

ttgtgaaaaa atcattctat ggtagtgaga gccaacgctc cggctcaggt gtcaggttgg 4860

tttttgagac agagtctttc cacttagctt ggaattcact ggccgtcgtt ttacaacgtc 4920

gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg 4980

ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca cccgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc 5040

ctgaatggcg aatggcgcct gatgcggtat tttctccttc acgcatctgt gcggtatttc 5100

acaccgcata tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt taagccagcc 5160

ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc cgcgcatccg 5220

cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat 5280

caccgaaacg cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca 5340

tgatacataa tggtttctta gacgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc 5400

cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc 5460

tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc 5520

gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg 5580

gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat 5640

ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc 5700

acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa 5760

ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc agtcacagaa 5820

aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt 5880

gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct 5940

tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat 6000

gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg 6060

cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg 6120

atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt 6180

attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg 6240

ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca ggcaactatg 6300

gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg 6360

tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa 6420

aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt 6480

tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt 6540

tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt 6600

ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag 6660

ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta 6720

gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat 6780

aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg 6840

ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg 6900

agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac 6960

aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga 7020

aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt 7080

ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta 7140

cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atccccctga 7200

ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac 7260

gcaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc 7320

ctctcccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg 7380

aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag 7440

gctttacact ttatgcttcc gcgctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt 7500

tcacacagga aacagctatg accatgatct acgccaagct ttgctcttag gagtttccta 7560

atacatccca aactcaaata tataaagcat ttgacttgtt ctatgcccta gggggcgggg 7620

ggaagctaag ccagcttttt ttaacattta aaatgttaat tcccatttta aatgcacaga 7680

tgtttttatt tcataagggt ttcaatgtgc atgaatgctg caatattccc tgttaccaaa 7740

gctagtataa ataaaaatag ataaacgtgg aaattactta gagtttctgt cattacacgt 7800

ttccttcctc agttgacaac ataaatgcgc tgctgagcaa gccagtttgc atctgtcagg 7860

atccaatttc ccattatgcc agtcatatta attactagtc aattagttga tttttatttt 7920

tgacatatac atgtg 7935

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Описана антигенпрезентирующая клетка (APC), модифицированная для экспрессии и содержания CD48, связанного с мембраной интерлейкина-21 (mbIL-21) и лиганда 41BB (41BBL). Также описана APC, модифицированная для экспрессии и содержания CS1 (CD319), mbIL-21 и лиганда 41BB (41BBL) и APC, модифицированная для экспрессии и содержания CD48, CS1 (CD319), mbIL-21 и лиганда 41BB (41BBL). Представлен способ размножения иммуноцитов, включающий культивирование иммуноцитов в присутствии эффективного количества любой из указанных APC. Представлена популяция размноженных иммуноцитов, где популяция клеток имеет улучшенное уничтожение опухолей; и, где клетки секретируют цитокины I типа, такие как интерферон-γ, фактор некроза опухоли-α и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF). Описан способ лечения заболевания или нарушения у субъекта, включающий введение терапевтически эффективного количества размноженных иммуноцитов, где терапевтически эффективное количество размноженных иммуноцитов составляет между приблизительно 10⁵ и приблизительно 10¹⁰ клеток на дозу в сериях из циклов дозирования. Изобретение расширяет арсенал средств для лечения заболеваний или состояний, связанных с наличием опухоли. 6 н. и 52 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 1 пр.

1. Антигенпрезентирующая клетка (APC), модифицированная для экспрессии и содержания CD48, связанного с мембраной интерлейкина-21 (mbIL-21) и лиганда 41BB (41BBL),

где:

CD48 для подкрепления межклеточного взаимодействия;

mbIL-21 для концентрирования и локализации транс-взаимодействия с IL21R; и

41BBL для управления противоопухолевыми ответами посредством увеличения клеточной пролиферации и секреции IFN-γ.

2. APC, модифицированная для экспрессии и содержания CS1 (CD319), mbIL-21 и лиганда 41BB (41BBL),

где:

CS1 для включения уничтожающей активности;

mbIL-21 для концентрирования и локализации транс-взаимодействия с IL21R; и

41BBL для управления противоопухолевыми ответами посредством увеличения клеточной пролиферации и секреции IFN-γ.

3. APC, модифицированная для экспрессии и содержания CD48, CS1 (CD319), mbIL-21 и лиганда 41BB (41BBL),

где:

CD48 для подкрепления межклеточного взаимодействия;

CS1 для включения уничтожающей активности;

mbIL-21 для концентрирования и локализации транс-взаимодействия с IL21R; и

41BBL для управления противоопухолевыми ответами посредством увеличения клеточной пролиферации и секреции IFN-γ.

4. APC по любому из пп.1-3, отличающаяся тем, что APC по существу не имеет экспрессии эндогенных молекул HLA класса I, II или CDId.

5. APC по любому из пп.1-3, отличающаяся тем, что APC экспрессирует ICAM-1 (CD54) и LFA-3 (CD58).

6. APC по любому из пп.1-3, отличающаяся тем, что APC представляет собой происходящую из клетки лейкоза APC.

7. APC по п.6, где происходящую из клетки лейкоза APC дополнительно определяют как клетку K562.

8. APC по любому из пп.1-3, отличающаяся тем, что APC модифицирована посредством ретровирусной трансдукции.

9. APC по п.8, где ретровирусную трансдукцию дополнительно определяют как трансдукцию вирусной конструкцией из SEQ ID NO:1 и/или SEQ ID NO:2.

10. APC по любому из пп.1-9, отличающаяся тем, что APC является облученной.

11. Способ размножения иммуноцитов, включающий культивирование иммуноцитов в присутствии эффективного количества APC по любому из пп.1-10.

12. Способ по п.11, где иммуноциты и APC культивируют в соотношении от 3:1 до 1:3.

13. Способ по п.11, где иммуноциты и APC культивируют в соотношении 1:2.

14. Способ по п.11, где размножение проводят в присутствии IL-2.

15. Способ по п.14, где IL-2 присутствует в концентрации 10-500 ед./мл.

16. Способ по п.14, где IL-2 присутствует в концентрации 100-300 ед./мл.

17. Способ по п.14, где IL-2 присутствует в концентрации 200 ед./мл.

18. Способ по п.14, где IL-2 представляет собой рекомбинантный человеческий IL-2.

19. Способ по п.14, где IL-2 восполняют каждые 2-3 суток.

20. Способ по п.11, где APC добавляют по меньшей мере второй раз.

21. Способ по п.11, где иммуноциты представляют собой клетки NK или T-клетки.

22. Способ по п.11, где иммуноциты представляют собой клетки NK.

23. Способ по п.11, где иммуноциты представляют собой T-клетки.

24. Способ по п.11, где иммуноциты происходят из пуповинной крови (CB), периферической крови (PB), стволовых клеток или костного мозга.

25. Способ по п.11, где стволовые клетки представляют собой индуцированные плюрипотентные стволовые клетки.

26. Способ по п.11, где иммуноциты получены из CB.

27. Способ по п.26, где CB пулирована из 2 или более индивидуальных доз пуповинной крови.

28. Способ по п.26, где CB пулирована из 3, 4, 5, 6, 7 или 8 индивидуальных доз пуповинной крови.

29. Способ по п.22, где клетки NK представляют собой мононуклеарные клетки CB (CBMC).

30. Способ по п.22, где клетки NK дополнительно определяют как CD56⁺ клетки NK.

31. Способ по п.11, где способ осуществляют в бессыровоточной среде.

32. Способ по любому из пп.11-31, где иммуноциты модифицируют для экспрессии химерного рецептора антигена (CAR).

33. Способ по п.32, где CAR содержит гуманизированный антигенсвязывающий домен.

34. Способ по п.32, где CAR содержит антигенсвязывающий домен для CD19, CD123, мезотелина, CD5, CD47, CLL-1, CD33, CD99, U5snRNP200, CD200, CS1, BAFF-R, ROR-1 или BCMA.

35. Способ по п.32, где CAR содержит антигенсвязывающий домен для CD19 или CD123.

36. Способ по п.32, где CAR содержит IL-15.

37. Способ по п.32, где CAR содержит ген самоубийства.

38. Способ по п.37, где ген самоубийства представляет собой CD20, CD52, EGFRv3 или индуцируемую каспазу 9.

39. Популяция размноженных иммуноцитов, полученная в соответствии со способами по любому из пп.11-38, где популяция клеток имеет улучшенное уничтожение опухолей; и где клетки секретируют цитокины I типа, такие как интерферон-γ, фактор некроза опухоли-α и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF).

40. Способ лечения заболевания или нарушения у субъекта, включающий введение терапевтически эффективного количества размноженных иммуноцитов по п.39 субъекту, где терапевтически эффективное количество размноженных иммуноцитов составляет между приблизительно 10⁵ и приблизительно 10¹⁰ клеток на дозу в сериях из циклов дозирования.

41. Способ по п.40, где заболевание или нарушение представляет собой злокачественную опухоль, воспаление, реакцию трансплантат против хозяина, отторжение трансплантата, аутоиммунное нарушение, иммунодефицитное заболевание, В-клеточное злокачественное новообразование или инфекцию.

42. Способ по п.41, где злокачественная опухоль представляет собой лейкоз.

43. Способ по п.42, где лейкоз представляет собой острый лимфобластный лейкоз (ALL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), острый миелогенный лейкоз (AML) или хронический миелогенный лейкоз (CML).

44. Способ по п.40, где иммуноциты являются аллогенными.

45. Способ по п.40, где иммуноциты являются аутологичными.

46. Способ по п.40, где иммуноциты представляют собой клетки NK или T-клетки.

47. Способ по п.40, где иммуноциты представляют собой клетки NK.

48. Способ по п.40, где нарушение представляет собой реакцию трансплантат против хозяина (GVHD).

49. Способ по п.40, где нарушение представляет собой рассеянный склероз, воспалительное заболевание кишечника, ревматоидный артрит, диабет типа I, системную красную волчанку, контактную гиперчувствительность, астму или синдром Шегрена.

50. Способ по п.40, где субъект представляет собой человека.

51. Способ по п.40, дополнительно включающий введение по меньшей мере второго лекарственного средства.

52. Способ по п.51, где по меньшей мере второе лекарственное средство представляет собой терапевтически эффективное количество противоракового средства, иммуномодулирующего средства или иммуносупрессивного средства.

53. Способ по п.52, где противораковое средство представляет собой химиотерапию, радиотерапию, генотерапию, хирургию, гормонотерапию, антиангиогенную терапию или иммунотерапию.

54. Способ по п.52, где иммуносупрессивное средство представляет собой ингибитор кальциневрина, ингибитор mTOR, антитело, химиотерапевтическое средство, облучение, хемокин, интерлейкины или ингибитор хемокина или интерлейкина.

55. Способ по п.51, где иммуноциты и/или по меньшей мере второе лекарственное средство вводят внутривенно, внутрибрюшинно, интратрахеально, внутрь опухоли, внутримышечно, эндоскопически, внутрь очага, чрескожно, подкожно, местно, или посредством прямой инъекции или перфузии.

56. Способ по п.51, где второе лекарственное средство представляет собой антитело.

57. Способ по п.56, где антитело представляет собой моноклональное, биспецифическое или триспецифическое антитело.

58. Способ по п.57, где антитело представляет собой ритуксимаб.